Arthritis & Rheumatism

Vol. 50, No. 11, noviembre de 2004, pp 3504-3515

DOI 10.1002 / art.20626
© 2004 American College of Rheumatology

Antiartrıtico Efecto del veneno de abejas

Inhibición de la inflamación Mediador Generación por la supresión de NFkB mediante la

interacción con la subunidad p50

Hye Ji Park,1 Seong Ho Lee,1 Dong Ju Hijo,1 Ki Wan Oh,1 Ki Hyun Kim,2 Ho Sueb Song,2 Goon
Joung Kim,2 Goo Taeg Oh,3 Hacer Yoon Young,4 y Jin Tae Hong1
Presentado para su publicación el 2 de febrero de 2004; aceptó en
forma revisada 10 agosto, 2004.
Objetivo. Para investigar los Mecanismos
moleculares de los efectos antiartríticos de veneno de
abeja (BV) y la melitina (un componente principal de
BV) en una línea celular macrophage murino (Raw
264.7) y en sinoviocitos CONTENIDAS-ob de pacientes
con artritis reumatoide.
Métodos. Se evaluaron los efectos antiartríticos
de BV en un modelo de rata de edema agudo inducido
por carragenina en la pata y en un modelo de rata de
artritis crónica inducida por adyuvante. Los efectos
inhibidores de BV y la melitina en la expresión de genes
inflamatorios se mea-Sured por transferencia de
Western, y la generación de pros-taglandin E2 (PGE2) Y
el óxido nítrico (NO) y el nivel de calcio intracelular se
ensayaron. B ADN NF-unión y la actividad
transcripcional se determinaron por ensayo de cambio
de movilidad en gel o por ensayo de luciferasa. unión
directa de BV y melitina a la subunidad p50 de NF-B se
determinó con una resonancia de plasmón de superficie
ana-Lyzer.
Resultados. BV (0,8 y 1,6 g / kg) redujo los
efectos de la artritis carragenina y inducida por
adyuvante. Este efecto de reducción fue consistente con
los efectos inhibitorios de BV (0,5, 1 y 5 g / ml) y
melitina (5 y 10

Con el apoyo de una beca del Programa de Investigación Básica

de la Fundación Coreana de Ciencia e Ingeniería (R05-2002-000-00644-
0), y por el Proyecto Cerebro Corea 21 en 2003.
1
Hye Ji Park, BS, Seong Ho Lee, PhD, Dong Ju Hijo, MS, Ki
Wan Oh, PhD, Jin Tae Hong, PhD: Universidad Nacional de Chungbuk,
Chungbuk, Corea del Sur;2Ki Hyun Kim, MD, PhD, Ho Sueb Song, PhD,
Goon Joung Kim, MS: Universidad Kyungwon, Gyeonggii, Corea del Sur;
3
Goo Taeg Oh, PhD: Universidad de Mujeres de Ewha, Seúl, Corea del
Sur;4Hacer Yoon Young, PhD: Instituto Coreano de Investigación de Bio-
ciencia y la biotecnología, Taejon, Corea del Sur.
Dirección para la correspondencia y solicitudes de reimpresión a
Jin Tae Hong, MD, Facultad de Farmacia, Universidad Nacional de
Chungbuk, 48, Gaesin-dong, Heungduk-gu, Cheongju, Chungbuk 361-
763, Corea del Sur. E-mail: [email protected].
 PGs han demostrado que aumenta la fosfolipasa citosólica 2
g / ml) en lipopolisacárido (LPS; 1 g / ml) inducida por (la cPLA2) Y los niveles de la ciclooxigenasa (COX), y de
la expresión de la ciclooxigenasa 2, la fosfolipasa ese modo amplificar su propia producción y aumentar la
citosólica A2, NO sintasa inducible, la generación de síntesis de las citoquinas inflamatorias (3,4). Los niveles
PGE2y NO, y el nivel de calcio intracelular. BV y elevados de PGs se encontraron en células sinoviales
melitina impidieron inducida por LPS actividad bind- tratados con mediadores de la inflamación o en pacientes
ing transcripcional y el ADN de NF-B a través de la con AR (5,6). En macrófagos activados, grandes cantidades
inhibición de la liberación IB y la translocación de p50. de NO son generados por la NO sintasa inducible (iNOS)
6
BV (afinidad [Kre] 4.6 10 METRO) Y la melitina (Kre (7). Muchos efectores de NO de ejecución de producción a
8 la liberación simultánea de otros mediadores de la
1.2 10 METRO) Unido directamente a p50.
inflamación, tales como la prostaglandina E 2 (PGE2) Y la
Conclusión. inactivación Target de NF-B por di- prostaglandina I2, De la vía de la COX
rectamente unión a la subunidad p50 es un mecanismo (6), y la inducción de iNOS puede ser modificado por la
importante de los efectos antiartríticos de BV. cPLA2(8,9). Estos efectos sinérgicos pueden ser uno mech-
nismo operativa entre iNOS y COX-2, así como entre iNOS
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad y la cPLA2, Por el que las respuestas fisiológicas o
crónica, inflamatoria destruc-tiva caracterizada por la patológicas se amplifican en la reacción inflamatoria
liberación de numerosos mediadores proinflamatorios tales (10,11). intracelular de calcio también juega un papel
como Prosta glandins (PGs) y óxido nítrico (NO) (1,2). fundamental, ya que está implicada en la generación del
superóxido
INTERACCIÓN BEE VENOM CON subunidad p50 de NFksegundo 3505

anión y NO, la producción de factor de necrosis tumoral un charide (LPS), reactivo de Griess, anti-segundo-actina anti-cuerpo
monoclonal, MTT, y melitina fueron adquiridos de Sigma (St.
(TNFun) (12), y la la cPLA2la liberación mediada de ácido
Louis, MO). Todos los demás reactivos fueron adquiridos de
araquidónico (13,14). Por lo tanto, los elementos que Sigma a menos que se indique lo contrario. BV se compró a
pueden suprimir la generación de estos inflamación media- Usted-Miel BV (Hwasoon, Corea del Sur). La composición de la
tores y agentes que reducen los niveles de calcio BV fue la siguiente: 45-50% melitina, 2,5-3% apamina, 2-3%.
intracelular potencialmente pueden ser utilizados como MCD pep-marea, 12% PLA2, 1% liso-PLA, 1-1,5% histidina, 4-
terapias en el tratamiento de la artritis. 5% 6pp lípidos, 0,5% secarpin, 0,1% tertiapin, 0,1% procamine,
1,5-2% de hialuronidasa, 2-3% amina, 4-5% de carbohidratos, y
Estos inflammator Y representativos genes (COX-2, 19-27% de otros, incluyendo inhibidores de la proteasa,
la cPLA2, INOS y TNFun) Parecen ser altamente regulada glucosidasa, invertasa, fosfomonoesterasa ácido, dopamina,
por un número de factores de transcripción, en par-ticular norepinefrina, y los aminoácidos de la ONU conocido, con 99,5%
NF-kB, que se expresa de forma ubicua y puede ser de pureza.
artritis inducida por adyuvante (AIA). Ratas macho
activado por una serie de estímulos inflamatorios y pato- Sprague-Dawley (Samtako, Osan, Kyungki, Corea) eran-principal
lógicos, incluyendo citoquinas, estrés oxidativo, la luz contenida en conformidad con las directrices para el cuidado y uso
ultravioleta, y productos bacterianos y virales. Accord vez de animales de laboratorio del Instituto Nacional de Investigación
más, los agentes que modulan la actividad de NFkB tiene Toxicológica de la Administración de Alimentos y Medicamentos
un efecto pronunciado sobre iNOS, COX-2, y la de Corea. Para determinar la dosis aproximada de BV, la actividad
cPLA2expres-sion en respuesta a diferentes estímulos antiinflamatoria de BV se evaluó primero con la prueba de edema
de carragenina en pata de acuerdo con los métodos de Sugishita et
inflamatorios. estudios SEV-eral han demostrado que la al (22). BV (0.4, 0.8, 1.6, y 3.2metrog / kg) o vehículo (solución
inhibición de NF-agenteskB, la activación puede ser salina) fue adminis-cados directamente en la superficie plantar de
tratamientos potenciales para enfermedades anti- la pata trasera derecha de 30 minutos antes de la inyección de
inflamatorias (15-17). carragenina (0,05 ml; 3% [peso / volumen] en solución salina) en
el área subplantar de la derecha pata trasera. Los volúmenes de las
El veneno de abeja (BV) contiene una variedad de patas inyectadas y contralateral se midieron con un pletismómetro
diferentes péptidos, entre ellos la melitina (un componente de agua Letica (Panlab, Bar-celona, España) 1, 3, y 5 horas
principal de BV), apamina, adolapin, y el mástil péptido después de la inducción de edema. El máximo (3,2metrog / kg)
dosis de BV no provocó una respuesta tóxica, y en gran medida
desgranulación celular (18,19). Unos pocos estudios han reducida edema de la pata (reducción del 40% en comparación
demostrado que la terapia BV atenúa la AR en seres con las patas contralaterales). Por ello, utilizó 0,8 o 1,6metrog / kg
humanos (18) y en animales de experimentación (20), y que de BV en el modelo animal.
BV tiene un efecto antiinflamatorio (20,21). Sin embargo, AIA se obtuvo en ratas Sprague-Dawley mediante la
no se han reportado experimentos sistemáticos demonio- inyección de 0,1 ml de Mycobacterium butyricum (10 mg / ml)
trando los mecanismos moleculares de los efectos en aceite mineral
antiartrıticos de BV. Para obtener una mejor comprensión en la base de la cola. los volúmenes de la pata se midió con un
pletismómetro al comienzo del experimento. Los animales con
de estos mecanismos, lo primero que reevaluado los efectos
edema valores de 1,1 ml mayor que las patas normales fueron
antiartríticos de BV en modelos de rata de artritis, y luego aleatorizados en grupos de tratamiento. BV (0,8 o 1,6metrog / kg)
se investigaron los mecanismos antiartríticos de BV y la o vehículo (solución salina) se administró directamente en la
melitina en una línea celular de macrófagos murinos (RAW superficie plantar de la pata trasera derecha desde 1 día después
264.7) y en sinoviocitos obtenidos a partir de pacientes con de AIA inducción a día 14. La magnitud de la respuesta
AR. Nos centramos en blanco de interrupción NFkB por inflamatoria se evaluó midiendo el volumen de ambas patas
BV o melitina como un posible mecanismo de efectos traseras. En el día 15, las ratas se anestesiaron y se colocaron en
una caja radiográfica a una distancia de 90 cm desde la fuente de
antiinflamatorios. rayos x (BLD-150RK; FOMA Bohemia, Hradec Kra'love',
República Checa), y las patas traseras artríticos fueron expuestos
para el haz de rayos x para 0,01 segundos a 40 kW. Patas estaban
orientadas horizontalmente con respecto al detector. Las
MATERIALES Y MÉTODOS
radiografías se puntuaron por un investigador (HJP) que
Productos químicos. Anticuerpos policlonales de conejo desconocía la información de tratamiento, utilizando la siguiente
a cPLA2 (dilución 1: 500), anticuerpo de cabra policlonal para escala: 0 sin daño óseo, hinchazón 1 tisular y edema, 2 erosión
COX-2 (1: 500), y TNFun (1: 500), p50 (1: 500), p65 (1: 500), articular, y 3 la formación de la erosión ósea y osteo-phyte.
Iksegundoun (1: 500), fosfo-Iksegundoun(1: 200), policlonal de Cultivo de células. RAW 264.7, una línea celular similar
ratón anticuerpo para iNOS (1: 500), y todos los anticuerpos a macrófagos de ratón, y THP-1, una línea celular de monocitos
secundarios utilizados en el análisis de transferencia Western se humanos, se obtuvieron de la American Type Culture Collection
adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). T4 (Manassas, VA). medio de Eagle modificado por Dulbecco
polinucleótido quinasa se obtuvo de Promega (Madison, WI). Poli (DMEM), penicilina, estreptomicina y suero fetal bovino (FBS)
(dI-dC), rábano picante de burro anti-conejo anticuerpo fueron adquiridos de Gibco Life Technologies (Rockville, MD).
secundario marcado con peroxidasa, y reactivo de detección ECL Las células RAW 264.7 se cultivaron en DMEM con 10% de
se obtuvieron de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). FBS, 100 unidades / ml de penicilina, y 100metrog / ml de
Reactivos para dodecil sulfato de sodio electroforesis en gel estreptomicina a 37 ° C en 5% de CO2 humidificada de aire.
(SDS) poliacrilamida se adquirieron de Bio-Rad (Hercules, CA).
Lipopolysac-
células THP-1 fueron cultivadas en RPMI 1640 conL-glutamine y
25 mMETRO HEPES solución salina tamponada (Gibco Life
3506 Park et al
Technologies) suplementado con 10% FBS, 100 unidades / ml de Ersham Pharmacia Biotech). Las transferencias se bloquearon
penicilina, y 100 metrog / ml de estreptomicina a 37 ° C en 5% de durante 2 horas a temperatura ambiente con 5% (w / v) de leche
CO2 humidificada de aire. sin grasa seca en solución salina tamponada con Tris (10
la cultura de sinoviocitos. Se obtuvieron tejidos mMETRO Tris, pH 8,0, 150 mMETRO NaCl) que contiene
sinoviales, con el consentimiento, de 9 pacientes con AR que 0,05% de Tween 20. La membrana se incubó durante 5 horas a
fueron sometidos a reemplazo total de rodilla o sinovectomía temperatura ambiente con anticuerpos específicos: policlonal de
artroscópica. A partir de estas muestras, se estudiaron 3 líneas cabra COX-2, TNFun, Y el anticuerpo p50 (1: 1000), y el ratón
celulares. Para evitar los efectos de los esteroides en las células cPLA2 mono-clonal y los anticuerpos de iNOS (1: 500) (Bio-
sinoviales, los pacientes fueron instruidos para cesar el uso de la tecnología de Santa Cruz). A continuación, la transferencia se
medicación de esteroides durante 2 meses antes de la cirugía. incubó con el conjugado anti-IgG de conejo-peroxidasa de rábano
Todos los pacientes cumplieron con el American College of picante corresponden-ing (Santa Cruz Biotechnology). Las
Reuma-logía (anteriormente, la American Rheumatism proteínas inmunorreactivas se identificaron con el sistema de
Association) 1987 revisó los criterios para la AR (23). Tejido detección por transferencia ECL Western. Las bandas de proteínas
sinovial se picaron y se trataron durante 4 horas con 4 mg / ml de fueron escaneados por densitometría usando MyImage (SLB,
colagenasa 1 (Worthington, Freehold, NJ) en DMEM a 37 ° C en Seúl, Corea del Sur) y se cuantificaron con Labworks 4.0 suave-
5% de CO2. Las células disociadas se sembraron en DMEM mercancías (UVP, Upland, California).
suplementado con 10% FBS, penicilina (100 unidades / ml) y Preparación de extractos nucleares y ensayo de
estreptomicina (100metrog / ml). Las células se utilizaron entre la cambio de movilidad electroforética (EMSA). ensayos de
tercera y quinta pasajes. cambio de gel se realizaron de acuerdo con las recomendaciones
Determinación de NO. Las células se cultivaron en del fabricante (Promega). Brevemente, 1 106 células / ml se
placas de 24 pocillos y después se incubaron durante 72 horas con lavaron dos veces con 1 tampón fosfato salino (PBS) seguido de
o sin LPS (1metrog / ml) en ausencia o presencia de diversas la adición de 1 ml de PBS, y se rasparon las células en un tubo
concentraciones de BV (0,5-5 metrog / ml) o la melitina (5 o 10 Eppendorf frío. Las células se centrifugaron a
metrog / ml). La acumulación de nitrito en el sobrenadante fue 15.000gramodurante 1 minuto, y el sobrenadante resultante se
evaluada por Griess reac-ción (24). cada 100metrol de retiró. Solución A (50 mMETRO HEPES, pH 7,4, 10 mMETRO
sobrenadante de cultivo se mezcló con un volumen igual de KCl, 1 mMETRO EDTA, 1 mMETRO EGTA, 1 mMETRO
reactivo de Griess y se incubó a temperatura ambiente durante 10 ditiotreitol [TDT], 0,1 metrog / ml fluoruro de fenilmetilsulfonilo,
minutos. La absorbancia a 550 nm se midió en un lector de 1 metrog / ml pep-estatina A, 1 metrog / ml de leupeptina, 10
microplacas automatizado, y se utilizó una serie de metrog / ml de inhibidor de tripsina de soja, 10 metrog / ml de
concentraciones conocidas de nitrito de sodio como un estándar. aprotinina, y 0,5% Nonidet P40) se añadió al sedimento en una
Determinación de PGE2.Las células se cultivaron proporción de 2: 1 (v / v) y se dejó incubar en hielo durante 10
durante 24 horas, y luego se trataron con LPS (1metrog / ml) en
minutos. La solución C (solución A de glicerol al 10% y 400
ausencia o presencia de diversas concentraciones de BV (0,5-5
mMETROKCl) se añadió al sedimento en una proporción de 2: 1
metrog / ml) o la melitina (5 o 10 metrog / ml) en presencia de
tritiada ácido araquidónico (0,4 metroCi / ml; Perkin Elmer, (v / v) y se agitó en hielo durante 20 minutos. Las células se
Boston, MA) durante 48 horas. Brevemente, PGs se extrajeron y centrifugaron a 15.000gramodurante 7 minutos, y el sobrenadante
se separaron por cromatografía de capa fina sobre una placa G de extracto nuclear resultante se recogió en un tubo Eppendorf
gel de sílice usando desarrollar-ment solución (acetato de etilo / enfriada. Consenso oligonucleo-mareas eran utilizando
isooctano / ácido acético / agua [110: polinucleótido quinasa de T4 marcado en el extremo ygramo32P-
50: 20: 100 volumen / volumevolume / volumen]). El área ATP durante 10 minutos a 37 ° C. Las reacciones de
correspondiente a cada PG se raspó y el radioactiv-dad se desplazamiento en gel eran ensamblado y se dejó incubar a
determinó con un contador de centelleo líquido (Perkin Elmer). temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido por la adición
Del mismo modo, la liberación de ácido araquidónico fue de 1 metrol (50.000-200.000 cuentas por minuto) de
disuadir-extrae en el medio después de la extracción y separación oligonucleótido marcado con 32P y otros 20 minutos de
usando éter de petróleo / ácido éter dietílico / ácido acético (40: incubación a temperatura ambiente. Posteriormente, 1metrol de
40: 1 [v / v / v]) como la solución de desarrollo (25). tampón de carga de gel se añadió a cada reacción y se coloca en
Medición del calcio intracelular. El calcio intracelular 4% en geles no desnaturalizantes y a electroforesis hasta que el
se midió por la relación de fluorescencia de imagen del colorante colorante era de tres cuartas partes del camino hacia abajo del gel.
indicador de calcio Fura 2 de acuerdo con los métodos de El gel se secó a 80 ° C durante 1 hora y exponerse a una película
Grynkiewicz et al (26). Brevemente, las células (1,3 106 células / durante la noche a 70 ° C. La densidad relativa de las bandas de
ml) se cargaron con 5metroMETROFura 2 a 37 ° C durante 30 proteína fue escaneada por densitometría usando MyImage (SLB)
minutos y la imagen con un sistema de Delta Scan (Photon y se cuantificó con Lab-funciona el software 4.0 (UVP).
Technology, Prince-ton, NJ). Los datos promedio de Transfección y ensayo de la actividad luciferasa. Las células
concentración de calcio se expresaron como una proporción de las RAW 264.7 o THP-1 se transfectaron con pNF-kB-Luc-plas mitad
emisiones de fluorescencia obtenidos usando 2 longitudes de onda
(5 NFkSEGUNDO; Stratagene, La Jolla, CA) usando una mezcla
de excitación diferentes (340 y 380 nm).
de plásmido y Lipofectamine Plus en Opti-MEM, de acuerdo con
Análisis de Western Blot. Las células se
las especificaciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). El
homogeneizaron con tampón de lisis (50 mMETRO Tris, pH 8,0,
150 mMETRO NaCl, 0,02% NaN3, 0,2% de SDS, 1 mMETRO pCMV de controlsegundo(Clontech, Palo Alto, CA) fue Cotrans-
fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 metrol / ml de aprotinina, 1% fected para controlar la eficacia de transfección. Después de 24
igapel 630 [Sigma], 10 mMETRO NaF, 0,5 mMETRO EDTA, horas, las células fueron entonces cotreated con BV (o melitina) y
0,1 mMETRO EGTA, y 0,5% de desoxicolato de sodio) y centri- LPS. La actividad de luciferasa se midió usando un kit de ensayo
fuged a 23.000gramodurante 1 hora. Cantidades iguales de de luciferasa (Promega) y el software WinGlow, de acuerdo con
proteínas (80metrog) se separaron en geles de poliacrilamida-% las instrucciones del fabri-Türer (Berthold, Wildbad, Alemania).
12 SDS y luego se transfiere a una membrana de nitrocelulosa resonancia de plasmón superficial (SPR) análisis. BIAcore
(Hybond ECL; Am- 2000 y un chip sensor CM5 fueron ambos suministrados or
BIAcore (Uppsala, Suecia). HEPES solución salina tamponada (pH 7,4, contención
INTERACCIÓN BEE VENOM CON subunidad p50 de NFksegundo ducción máxima de NO y PGE 2fue visto 12 o 24 horas
ing 10 mMETRO HEPES, 1 mMETRO EDTA, 0,001% de después de la estimulación en un estudio de evolución en el
Tween 20, y 0,15METRONaCl) se utilizó como tampón de flujo tiempo (datos no mostrados). Nosotros
constante a menos que se indique lo contrario. Todos los
tampones y soluciones que se utilizan durante el análisis BIA-
núcleo fueron creados usando agua ultrapura, a continuación, se
desgasificó y se filtró estéril. Activado matriz CM-dextrano
coche-ried a cabo mezclando etil-NORTE-(Dimetilaminopropil)
carbodiimida y norte-hydroxysuccimide fue aparecido en el chip
sensor. proteína p50 recombinante o melitina a continuación, se
estratificó sobre el chip sensor CM-dextrano, seguido por el
bloqueo del chip usando 1METROetanolamina, pH 8,5.
Diluciones seriadas de BV, melitina, o anticuerpo p50 se
prepararon usando HEPES solución salina tamponada, y después
fluyó secuencialmente con concentraciones crecientes. La
regeneración de la interacción proteína se probó cambiando el pH
de la solución y se encontró que se produzca de manera óptima a
pH 12. El sistema BIAcore 2000 continu-ormente controló el
cambio en la masa en la superficie del sensor, y la cinética de
interacción de proteínas se analizó con BIAevalu-ación de
software 3.0 (BIAcore).

La inmunocitoquímica. Para determinar si la melitina

podría abordarse en las células, las células (1 105 cm2) se
cultivaron en un portaobjetos de cámara (sistema de control
deslizante cámara Lab-Tak II; Nalge Nunc International,
Naperville, IL) y después se trató con melitina marcado con Alexa
superiores Fluor 488 colorante (Molecular Probes, Eugene, OR).
Las células se incubaron durante 24 horas a 37 ° C y luego se
fijaron en paraformaldehído al 4%. La membrana se
permeabilizaron mediante exposición durante 5 minutos a 0,2%
de Triton X-100 en PBS, y se colocaron las células en suero de
bloqueo (5% caballo o suero de cabra en PBS). imágenes
Immuno-fluorescencia se adquirieron usando un microscopio
confocal de barrido láser (exploración de doble longitud de onda,
MRC1024; Bio-Rad) con un objetivo de inmersión en 60 aceite.
Análisis estadístico. Los datos se analizaron utilizando el
análisis unidireccional de varianza seguido por el test de Tukey
como una prueba post hoc.PAG los valores inferiores a 0,05 se
consideraron significativos.
RESULTADOS
Efectos de la BV en AIA. De acuerdo con estudios
anteriores de modelos de rata de crónica AIA, BV (0,8 y
1,6metrog / kg) redujo significativamente el edema de la
pata trasera (Figura 1A). Consistente con los efectos
inhibitorios sobre el volumen de la pata hinchazón, la
puntuación clínica también se redujo en animales tratados
con BV (Figura 1B). Radiográfica Examina-ción de las
patas traseras reveladas resorción ósea matriz, hinchazón de
tejidos blandos, y la formación de osteofitos en el margen
conjunta de las ratas 15 días después de la inyección
adyuvante, todos los cuales se redujeron notablemente por
el tratamiento BV (datos no mostrados). tratamiento BV no
afectó a la progresión de peso corporal y produjo ninguna
alteración del comportamiento (datos no presentados), lo
que sugiere que en sí BV no causó ninguna respuesta
tóxica.
Efectos inhibidores de BV y la melitina en PGE
inducida por LPS2 y la generación de NO. La pro-
Figura 1. Efectos de veneno de abeja (BV) sobre la artritis inducida por
adyuvante en ratas. BV se administró diariamente en la superficie plantar
de la pata trasera derecha durante 14 días, comenzando 1 día después de la
inyección de adyuvante. A, volumen de la pata Hind y B, se determinaron
la puntuación clínica como se describe en Materiales y Métodos. Los
valores son la media y la SEM de 10 animales por grupo.PAG 0,05 en
comparación con el grupo de control artritis inducida por adyuvante.

por lo tanto, determina la producción de NO a las 12 horas

y PGE2a las 24 horas después de la estimulación. La
concentración de nitrito (metroMETRO) En el
sobrenadante celular después del tratamiento con LPS (1
metrog / ml) solo o con varias dosis de BV (0,5-5 metrose
determinó g / ml) usando el reactivo de Griess.
Significativo, inhibición dependiente de la dosis de PGE
inducida por LPS2fue inducida por el tratamiento con BV
tanto en células RAW 264.7 (Figura 2A, Parte A) y en
sinoviocitos (Figura 2A, parte b). También se observó que
la producción de NO de una manera dependiente de la dosis
BV significativamente inhibidos inducida por LPS en
ambas células RAW 264.7 (Figura 2B, parte a) y
sinoviocitos (Figura 2B, parte b). El efecto inhibidor de la
melitina en la producción de PGE2 y NO fue similar o
ligeramente mayor en comparación con BV tanto en Raw
264.7
3508 Park et al

Figura 2. Efectos de veneno de abeja (BV) y la melitina en lipopolisacárido (LPS) inducida por la prostaglandina E 2 (PGE2) Y el óxido
nítrico (NO) generación y el nivel de calcio intracelular en las células RAW 264.7 y sinoviocitos. A, La inhibición de PGE inducida por
LPS2producción por BV y la melitina en células RAW 264.7 (a) y en sinoviocitos (b). B, la inhibición de liberación de nitrito por BV y
melitina. Las células RAW 264.7 (A) y sinoviocitos (B) fueron tratados con LPS con o sin 0,5-5 metrog / ml BV o 5 o 10 metrog / ml
melitina a 37 ° C durante 24 horas. La cantidad de NO o PGE 2en medio se midió como se describe en Materiales y Métodos. Los valores
son la media y la SEM de 3 experimentos independientes realizados por triplicado.PAG0,05 en comparación con LPS solo. C, las células
RAW 264.7 se cargaron con 5metroMETRO Fura 2 durante 30 minutos, luego 0,5-5 metrog / ml BV (a) o 5 o 10metrose añadió g / ml
melitina (b) en ausencia o presencia de LPS. [California 2 ]yose controló por imágenes de relación de fluorescencia, utilizando la relación
de excitación a 340 y 380 nm (F340 / 380). Las huellas son de un solo experimento, y son representativos de 3 preparaciones de células
separadas.

las células y los sinoviocitos. Sin embargo, la VB o Curiosamente, no se encontró respuesta de calcio a LPS y
melitina solo no tuvo ningún efecto citotóxico y no sodio ni-troprusside en sinoviocitos (datos no mostrados).
afectaron la producción basal de PGE 2 y NO (datos no La insensibilidad de sinoviocitos también fue encontrado
mostrados). después del tratamiento con tapsigargina, un agente bien
2
Efectos inhibidores de BV y la melitina en los conocido que libera calcio por la activación de Ca -
niveles de calcio intracelulares mejoradas-LPS. Los ATPasa. Por lo tanto, no se pudo determinar el cambio en
experimentos se llevaron a cabo para investigar el efecto de la concentración de calcio intracelular-ular después del
BV y la melitina en la movilización de calcio intracelular tratamiento con BV y la melitina en sinoviocitos.
en las células RAW 264.7. BV o melitina solo no Efectos inhibidores de BV y la melitina en LPS
cambiaron significativamente la movilización del calcio en inducida por la COX-2, la cPLA2, Y la expresión de
las células RAW 264.7 (datos no mostrados). La respuesta iNOS. Para verificar si la inhibición de PGE2 y la
a LPS fue rápida, y el nivel de calcio intracelular se generación de NO se debe a la disminución de expresión de
incrementó significativamente. El nivel de calcio la proteína, los efectos de BV y la melitina en la COX-2, la
intracelular elevada se redujo de una manera dependiente cPLA2, Y la expresión de proteína iNOS se determinó por
de la dosis mediante el tratamiento con BV en células transferencia Western. La máxima expresión de la COX-2,
RAW 264.7 (Figura 2C). La reducción de calcio la cPLA2Y iNOS era
intracelular con melitina fue similar a la con BV.
INTERACCIÓN BEE VENOM CON subunidad p50 de NFksegundo 3509

Figura 3. Efectos de la BV y la melitina en la expresión génica inflamatoria inducida por LPS en células RAW 264.7 y sinoviocitos. A,
las células RAW 264.7 se trataron con 0,5-5metrog / ml BV o 5 o 10 metrog / ml melitina en presencia de LPS a 37 ° C durante 24 horas.
B, sinoviocitos fueron tratados con 0,5-5metrog / ml BV o 5 o 10metrog / ml melitina en presencia de LPS a 37 ° C durante 6 horas. Igual
cantidad de proteínas totales (80metrog / carril) se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al
10%, y la expresión de la ciclooxigenasa 2 (COX-2), citosólica fosfolipasa A 2 (la cPLA2), Óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), y
segundo-actina (como control interno) se detectó por transferencia Western utilizando anticuerpos específicos. La cuantificación de las
intensidades de banda de 3 resultados experimentales independientes se determinó por densitometría. Los valores son la media y la SEM
de 3 experimentos realizados por triplicado.
PAG0,05 comparado con el grupo LPS-tratada. Véase la Figura 2 para otras definiciones.

transitoria con un gen de fusión que contiene el promotor

visto 24 horas después del tratamiento con LPS en células SV40, 5 repeticiones de la con-
RAW 264.7 pero 6 horas después del tratamiento en
sinoviocitos (resultados no mostrados). Por lo tanto, los
patrones de expresión se de-termined en esos momentos
designados con la misma con-centración de BV y melitina
que causó una reducción de PGE2y la generación de NO.
LPS inducida por la COX-2, la cPLA 2, Y expresión de la
proteína iNOS en las células RAW 264.7 (figura 3A) y en
sinoviocitos (Figura 3B) fue inhibida por BV y la melitina
en una forma dependiente de la dosis, consistente con la
reducción de los efectos en la generación de PGE2 y no.
La inhibición de NF-B dependiente de luciferasa
activ-dad. Regulación transcripcional que implica la
activación de NFkB ha sido implicado en la inducida por
LPS expres-sion de la COX-2, la cPLA 2Y iNOS (7). Para
determinar el papel de NF-BVkB dependiente de la
transcripción de genes, se realizó un ensayo de transfección
consenso NFksecuencia de unión a B, y el gen indicador de
luciferasa. Las células RAW 264.7 y THP-1 fueron trans-
fected con este promotor-reportero construcción génica, y
se midieron las actividades transcripcionales después estim-
ción de las células con LPS, con o sin BV o melitina. Como
se muestra en la Figura 4, el cotratamiento de las células
transfectadas con BV inhibió significativamente la
actividad de la luciferasa inducida por los diferentes
agentes en las células RAW 264.7 (figura 4A) y en
sinoviocitos (Figura 4B). LPS en-ducido un aumento de 7-8
veces en la actividad de la luciferasa; sin embargo, en
presencia de BV y melitina, el aumento de la actividad de
la luciferasa se redujo notablemente en células RAW 264.7
y células THP-1. La actividad de luciferasa inducida por
TNFun o TNFuncon LPS (aumento 8-11 veces) también se
redujo en BV o melitina. En comparación con el efecto de
BV (5metrog / ml), el efecto inhibidor de la melitina (10
metrog / ml) sobre la actividad de la luciferasa fue mayor
después de la estimulación con LPS, TNFunO TNFun con
LPS.
3510 Park et al

Figura 4. Efectos de la BV y la melitina en NF inducida por LPSkla actividad de luciferasa B dependiente en células RAW 264.7 y células
THP-1. Las células RAW 264.7 (A) y células THP-1 (B) se transfectaron con pNF- kB-Luc plásmido (5 NF-kB) y luego se activa con LPS o
factor de necrosis tumoral un (TNFun) En ausencia o presencia de 0,5-5 metrog / ml BV o 5 o 10 metrog / ml melitina durante 2 horas, y
luego se determinó la actividad de luciferasa. Los valores son la media y la SEM de 3 experimentos independientes realizados por triplicado.
El nivel de inducción se calculó con relación a la actividad de la luciferasa en células transfectadas no estimuladas. PAG 0,05 en comparación
con el LPS, TNFun-, o TNF LPSungrupo tratado. unidades relativas de luciferasa RLU;segundo-galón segundogalactosidasa (véase la Figura
2 para otras definiciones).
La inhibición de la activación de NF-B. NFka B. La liberación de la I inhibidoraksubunidad B y trans
continuación, la actividad de unión de ADN B se midió nuclear
mediante EMSA en extractos nucleares de células RAW
264.7 y sinoviocitos tratados con LPS solo, o en
combinación con BV o melitina durante 1 hora, que era el
tiempo para inducir NF-kB, la activación máxima
(resultados no mostrados). BV inhibió la NF-específica
inducida por LPSkactividad de unión a ADN B de una
manera dependiente de la dosis tanto en células RAW
264.7 y en sinoviocitos (Figura 5A, partes A y B). Melitina
también redujo significativamente NFkB, la activación por
LPS. La especificidad de unión al ADN se evidenció ya sea
mediante ensayo supershift usando anticuerpos para los
componentes p65 y p50 de NFkB (Figura 5A, parte c) o
mediante el ensayo de compe-tencia con la adición de
exceso de oligonucleótidos no marcados / fría (Figura 5A,
parte d).
Inhibición de la liberación inducida por LPS de
IB y la translocación nuclear de la subunidad p50 de NF
ubicación de la p65 o p50 subunidad están involucrados en
la activación de NFkB. La cinética de Ikversión B se
estudió mediante análisis de transferencia Western. Como
se muestra en la Figura 5B, LPS inducida Ikliberación B
fue marcadamente inhibida por BV y melitina tanto en
células RAW 264.7 (Figura 5B, la parte a) y en
sinoviocitos (Figura 5B, parte b). A continuación, el
estudio de la translocación de las subunidades de NFkB en
el núcleo durante NF-kB activación, se determinó la
aparición de la subunidades p50 y p65 de NFkB en los
extractos nucleares. BV y tratamiento melitina dosis-
dependiente como resultado el retraso y la reducción de la
translocación nuclear de la subunidad p50, pero no tuvo
ningún efecto sobre la translocación de p65. El efecto
inhibidor de la melitina en la liberación de IkB
translocación nuclear y de la subunidad p50 de la melitina
fue similar a la de la VB. Para examinar aún más el
mecanismo de la Primerakversión B, la fosforilación de
IkSe investigó B. fosforilación de I LPS inducidakB tanto
en las células se redujo por tratamiento con BV o melitina.
INTERACCIÓN BEE VENOM CON subunidad p50 de NFksegundo 3511

Figura 5. Efectos de la BV y la melitina en NF inducida por LPSkB, la activación, la liberación de IkB, y la translocación nuclear de la
subunidad p50 de NFkB en células RAW 264.7 y sinoviocitos. A, la activación de NFkB se determinó por ensayo de cambio de movilidad
electroforética (EMSA), como se describe en Materiales y Métodos. Los extractos nucleares de las células RAW 264.7 (A) y sinoviocitos (b)
trataron con LPS solo o con BV (0,5-5metrog / ml) o la melitina (5 o 10 metrog / ml) se incubaron en reacciones de unión 32oligonucleótido
P-marcado que contiene el ksecuencia B. NFkactividad de unión a ADN B se determinó mediante EMSA. Cada panel es representativo de 3
experimentos similares a cabo por triplicado. Para los ensayos de supershift, extractos nucleares de células tratadas con LPS se incubaron
durante 1 hora antes de EMSA con anticuerpos específicos contra el p50 y p65 NF- kisoformas B (C). El asterisco indica ensayo supershift
usando anticuerpo p50. Para ensayos de competición, los extractos nucleares de células tratadas con LPS se incubaron durante 1 hora antes de
EMSA con no marcado NFkoligonucleótido B marcado o proteína estimulante de 1 y activador de la proteína 1 (d). B, las células RAW 264.7
(a) se trataron con 0,5-5metrog / ml BV o 5 o 10 metrog / ml melitina en presencia de LPS a 37 ° C durante 24 horas. Nuclear, citosólica, y
las proteínas totales (50metrog) extraído 24 horas después del tratamiento se utilizaron para determinar la expresión de p50, p65, IkB, y
segundo-actina (como control interno). Los sinoviocitos (b) se trataron con 0,5-5metrog / ml BV o 5 o 10 metrog / ml melitina en presencia de
LPS a 37 ° C durante 6 horas. Igual cantidad de proteínas totales (80metrog / carril) se sometieron a electroforesis en 10% de dodecil sulfato
de sodio-gel de poliacrilamida, y la expresión de p50, p65, IkB, y segundoproteínas actina se detectó por transferencia Western utilizando
anticuerpos específicos. C, Niveles de pIkproteína B en lisados citosólicos de células RAW 264.7 (A) y sinoviocitos (b) tratado con 0,5-
5metrog / ml BV o 5 o 10 metrog / ml melitina en presencia de LPS con o sin inhibidor de fosfato (H-7). Las inmunotransferencias se
realizaron con un pIk-B específica de anticuerpos. Cada panel es representativo de 3 experimentos similares realizados por duplicado. Véase
la Figura 2 para otras definiciones.

interacción BV y melitina con la subunidad p50

de NF B.Para determinar si p50 puede ser un objetivo para
el efecto inhibidor de BV y / o la melitina en NF-ksegundo

Por otra parte, el efecto inhibidor de BV o melitina en la

Ikfosforilación B en células RAW 264.7 (figura 5C, la parte
a) y en sinoviocitos (Figura 5C, parte b) se invirtió
parcialmente por el inhibidor de fosfatasa H-7 de una
manera dependiente de la dosis.
actividad, se estudió la interacción entre p50 y BV o
melitina en un sistema libre de células. p50 La proteína se
incu-contenida con la NFkB ADN elemento de unión en
ausencia o presencia de BV o melitina, y luego EMSA se
realizó para determinar la capacidad de p50 para unirse a la
NFkB elemento de unión. Un efecto inhibidor de BV y la
melitina en la capacidad de p50 para unirse a la
NFkelemento de unión B se observó (Figura 6A).
3512 Park et al

La Figura 6. La captación de la melitina en las células y la interacción entre el veneno de abeja (BV) o melitina y p50. A, p50 humana
recombinante se incubó con el NFkADN B elemento de unión en ausencia o presencia de BV o melitina, y capacidad de unión se determinó
por ensayo de cambio de movilidad electroforética. B-E, resonancia de plasmón superficial Representante de unión trazas cinéticos a partir de
2 experimentos independientes con resultados similares. B y C, los datos cinéticos conjunto completo de la capacidad de BV (B) y la melitina
(C) que se unen a p50 inmovilizado. D y E, los rastros cinéticos representativos para la interacción entre la melitina inmovilizado sobre un
chip de superficie y p50 extraído de la fracción nuclear con cada tratamiento de las células RAW 264.7 (D) o articulación sinovial (E). F, la
captación de la melitina en la membrana y el núcleo de las células RAW 264.7 (aumento original 360). unidades de resonancia
RU;Kreafinidad de unión; células negativas tratadas con melitina no marcado; células positivas tratadas con melitina marcado con Alexa Fluor
488.

El análisis radiográfico ha definido la presencia de unido a la subunidad p50 de NFkB inmovilizada sobre la
residuos de cisteína en la estructura del p50 del dominio de superficie de un chip sensor, y dosis crecientes de BV y
unión de ADN, y algunas investigaciones han demostrado melitina claramente mostró un aumento de la actividad de
que la interrupción de destino de los residuos de cisteína de unión con p50 (Figuras 6B y C). La afinidad de unión (Kre)
la subunidad p50 pueden inhibir NFkB activación (27). 6
De BV y melitina a p50 fue de 4,6 10 METRO y 1.2 10
Para explorar esta posibilidad, p50 y NFkADN B mezclas 8
de elementos de unión se incubaron con BV o melitina en METRO, Respectivamente. La afinidad de unión (Kre) De
10
presencia de DTT, y luego la actividad de unión de ADN se p50 con el anticuerpo anti-p50 fue de 2,4 10 METRO
midió por EMSA. TDT revirtió el efecto inhibidor de BV o bajo las condi-ciones estudiadas.
melitina en la capacidad de unión de una manera A continuación, la interacción entre la melitina
dependiente de la dosis de ADN p50 (resultados no immobi-Lized en un chip sensor y p50 extraído de una
mostrados). Para investigar más la unión directa de BV o fracción nuclear de las células tratadas con LPS solo o LPS
melitina con p50, se realiza entonces un análisis de con BV o melitina se estudió inmunoprecipitó. La
resonancia de plasmón de superficie. El análisis demostró
claramente que BV o melitina
interacción entre la melitina y p50 inmunoprecipitado
extraído de una fracción nuclear de
INTERACCIÓN BEE VENOM CON subunidad p50 de NFksegundo 3513

las células tratadas con LPS con BV o melitina se redujo los tejidos afectados producen grandes cantidades de NO
mucho más que la interacción con p50 immunoprecipi- que podría actuar como una
tated extraído de la fracción nuclear de células tratadas con
LPS solo. Este efecto inhibidor era dependiente de la dosis
(Figura 6D). Una interacción reducida similar también se
encontró en la interacción entre la melitina y p50 en una
fracción nuclear extraída de las articulaciones sinoviales
tratados con la combinación de LPS y BV (Figura 6E).
También monitoreamos la captación de melitina en las
células. Hemos marcado melitina con Alexa Fluor 488
utilizando un kit de proteína-etiquetado, y se incubaron las
células RAW 264.7 se trataron con la melitina conjugado
con Alexa Fluor. La absorción de la melitina marcado en
las células se observa bajo un microscopio de escaneo láser
confocal. Como se ve en la Figura 6F, BV se recogió en la
membrana y el núcleo de las células.

DISCUSIÓN
Para obtener una mejor comprensión de los
mecanismos moleculares de los efectos antiinflamatorios de
BV en RA, se reevalúa el efecto inhibidor de BV en un
modelo de rata de la AR aguda y crónica. De acuerdo con
otros hallazgos (20-23,28), el efecto antiartrítico de BV
también se encontró en el presente estudio. El tratamiento
con BV dio como resultado una gran reducción en la
inflamación del tejido y la formación de osteofitos en el
modelo de la artritis crónica, así como la formación de
edema en el modelo de artritis aguda en este estudio. Estos
efectos se observaron en nuestro estudio con una dosis
mucho más baja de BV (metrog / kg) que las dosis
utilizadas en otros estudios (mg / kg) (20). Diferentes
fuentes, los métodos de extracto o purificación de BV y
composi-ción, diferentes modelos animales, u otros factores
desconocidos pueden causar esta discrepancia. Aunque se
necesitan más estudios para la determinación de una dosis
eficaz, nuestros datos muestran que los efectos de
antiartrıticos BV están relacionados con sus efectos
antiinflamatorios.

Las propiedades antiinflamatorias de BV y la acción

molecular de este compuesto se demostraron. En este
estudio, 0,5-5metrog / no citotóxica BV inhibida inducida
por LPS-ml PGE2y la producción de NO en células RAW
264.7. La acción inhibidora de la VB en la generación de
mediadores de la inflamación también fue eficaz en
synovio-citos de pacientes con AR. El efecto inhibidor de
BV fue consistente con la de un conocido inhibidor de la
COX-2, la indometacina (10 mMETRO) (datos no
mostrados). Así, los efectos inhibidores sobre la BV en la
reacción inflamatoria en AIA pueden deberse, al menos en
parte, a la inhibición de COX-2 expresión. En la artritis
inflamatoria, también ha habido evidencia que indica que
agente proinflamatorio para causar lesión tisular (29,30). A
este respecto, el efecto reductor de BV en NO también
puede contribuir al efecto antiartrítico de BV. El NO
también puede influir en las acciones de TNFun, Que está
implicado de manera significativa en la afluencia de células
inflamatorias, la erosión del cartílago articular y la
destrucción ósea en la artritis inflamatoria (31,32). BV
presenta importantes efectos inhibidores sobre la
generación de mediadores de la inflamación, incluyendo
TNFun, Y su expresión de la enzima (datos no mostrados).
También se encontró que BV tiene un efecto inhibidor
sobre la generación inducida por LPS especies reactivas de
oxígeno (ROS) (datos no mostrados), así como la
liberación de calcio. Por lo tanto, los efectos antiartríticos
de BV pueden estar relacionados con los múltiples efectos
inhibitorios sobre la generación de mediadores de la
inflamación tales como PGE2, NO, y TNFun así como
sobre la liberación de ROS y calcio intracelular (33).
NFkB es uno de los reguladores más importantes de
la expresión de genes proinflamatorios, tales como COX-2,
la cPLA2, INOS y TNFun(34,35). En el presente estudio,
hemos demostrado que BV inhibe la unión del ADN y la
actividad transcripcional de NF-kB de una manera
dependiente de la dosis en ambas células RAW 264.7 y
sinoviocitos. Este efecto también se encuentra en las
células THP-1, lo que sugiere que el efecto inhibidor de BV
puede ser no específico de célula. La región promotora del
gen que codifica murino iNOS y COX-2 contiene NFksitios
de unión B (5,36). El efecto inhib-itory fue consistente con
la reducción de la liberación de IkB detectada en el citosol
por la supresión de la fosforilación de IkB, y la disminución
de transloca-ción de la subunidad p50 de NFkB, pero no
p65. El inhibidor de fosfatasa específica H-7 invierte este
efecto inhibi-toria de BV o melitina.
Estos resultados sugieren que BV o melitina inhib-
itado la actividad de unión a ADN de NFkB a través de
inhibi-ción de Ikfosforilación B, inhibiendo de ese modo la
translocación de p50, lo que resulta en la reducción de la
expresión de genes inflamatorios. Nuestros datos muestran
el efecto inhibidor de BV o melitina en apoyo dos
perspectivas posibles de generación de ROS inducida por
LPS. redox celular equili-brium ha demostrado ser un
factor crítico en NF-kB, la activación a través de la
interrupción de las vías que en-volve ya sea p50
homodímero-DNA de unión, por una parte, o la
fosforilación de IkB en el otro (37,38).
La interacción directa entre BV y la melitina y p50 se
evidenció mediante análisis de SPR. La afinidad de unión
6
de BV (Kre 4,6 10 METRO) O melitina (Kre 1.2 10
8
METRO) Para p50 es 50-500 veces más débil que la
afinidad de unión de p50 a anti-p50 (Kre 2.4 10
10
METRO). Sin embargo, la afinidad de unión es
comparable con o mucho más fuerte que la afinidad de
8
unión de p50 al ADN (Kre 3-5,4 METRO) (37,39,40).
También se encontró que p50
3514 Park et al

extraído de las células tratadas con LPS solo unido a la 4. Xie QW, Kashiwabara Y, Nathan C. El papel del factor de
melitina que había sido inmovilizado sobre la superficie del transcripción NFkB / Rel en la inducción de la óxido nítrico sintasa. J
Biol Chem 1994; 269: 4705-8.
chip sensor con mucha mayor afinidad que se p50 extrae de 5. Longo WE, Panesar N, Mazuski J, Kaminski DL. Contribución de la
las células tratadas con la combinación de LPS y BV o ciclooxigenasa-1 y la ciclooxigenasa-2 para la formación de
melitina. Además, los efectos inhibitorios de BV y la prostanoides por los enterocitos humanos estimulados por ionóforo de
calcio y agentes Inflam-Matory. Las prostaglandinas otro lípido
melitina en la capacidad de p50 para unirse a la Mediat 1998; 56: 325-9.
NFkTambién se encontraron B elemento de ADN en un 6. Williams JA, Shacter E. Regulación de la producción de citocinas de
sistema libre de células. Hemos encontrado que la melitina los macrófagos por la prostaglandina E2: Distintos papeles de la
ciclooxigenasa-1 y -2. J Biol Chem 1997; 272: 25693-9.
se recogió en las células y se transloca al núcleo, donde p50 7. Chen CC, Chiu KT, Sun YT, Chen WC. Papel de la AMP-cíclico
se transloca al NFkB se activa. Por lo tanto, es posible que proteína quinasa A vía en la expresión de la sintasa de óxido nítrico
BV o melitina se une directamente a p50, ya sea en el inducida por lipopolisacárido en macrófagos RAW 264.7: la
participación de la ciclooxigenasa-2. J Biol Chem 1999; 274: 31559-
citosol o en el núcleo, lo cual inhibe NFkB activación. 64.
La estructura radiográfica de p50 ha demostrado la 8. Baek SH, Kwon TK, Lim JH, Lee YJ, Chang HW, Lee SJ, et al.
presencia de residuos de cisteína, que son críticos para las fosfolipasa A secretora2expresión sintasa de óxido nítrico inducible -
potentiated por los macrófagos requiere NF-kB activación. J Immunol
interacciones óptimas de ADN-proteína (38,41), y los 2000; 164: 6359-65.
residuos de cisteína de p50 se han considerado para ser una 9. Baek SH, Yun SS, Kwon TK, Kim JR, Chang HW, Kwak JY, et al.
diana para la regulación redox (42). Otras pruebas Los efectos de los dos nuevos antagonistas de secretora PLA 2en TNF,
iNOS y COX-2 expresión en macrófagos activados. Choque 1999; 12:
demuestran que la TDT invierte la capacidad de p50 para 473-8.
unirse a la NFkelemento de ADN B, así como la unión 10. Tintinger GR, Anderson R, Ker JA. La regulación de la homeostasis
directa de la melitina. Estos resultados muestran que BV o del calcio en los neutrófilos humanos activados: dianas potenciales
para las estrategias terapéuticas anti-inflamatorias. S Afr Med J 2002;
melitina pueden modificar un grupo sulfhidrilo de la 92: 990-6.
proteína p50 (43), lo que obstaculiza afinidad p50 a la
NFkB ADN elemento vinculante. 11. Devaux Y, Seguin C, Grosjean S, de Talance N, Camaeti V, Burlet A,
et al. aumento inducida por lipopolisacárido de la prostaglandina
Actualmente se está realizando un experimento para E2está mediada por inducible nítrico activación de sintasa de óxido de
identificar el sitio de unión de p50 con melitina. Ha habido la ciclooxigenasa constitutiva y la inducción de ado-membrana-associ
búsquedas intensivas para las moléculas que inhiben la del prostaglandina E sintasa. J Immunol 2001; 167: 3962-71.
12. Chen aC, Hsieh SL, Lin WW. Implicación de proteínas quinasas en la
activación de NFkB, aunque varios modos de acción potenciación de me- inflamatoria inducida por lipopolisacárido
(15,34,41,44). El presente estudio demuestra que la diator formación por thapsigargina en peritoneal macrófagos.
inhibición de NFkB, la activación por BV, a través de la J Leukoc Biol 2001; 69; 280-8.
13. Stephenson DT, Manetta JV, White DL, Chiou XG, Cox L, Gitter B,
capacidad directa de BV y / o la melitina de unirse a p50, et al. Sensible al calcio de la fosfolipasa citosólica A 2 (la cPLA2) Se
puede ser un mecanismo molecular importante en el expresa en astrocitos cerebrales humanos. Brain Res 1994; 637: 97-
105.
supresor ef-fect de BV en reacciones inflamatorias. La
14. Kramer RM, sostenido JD. Estructura, función y regulación de Ca 2
potencia de BV (o melitina) en la inhibición de la respuesta fosfolipasa citosólica -sensible A2 (la cPLA2) [revisión]. FEBS Lett
inflamatoria puede ser de gran beneficio en enfermedades 1997; 410: 49-53.
15. Cernuda-Morollón E, Pineda-Molina E, Canadá FJ, Pérez-Sala D. 15-
degenerativas e inflamatorias tales como RA. La extensión desoxi- 12,14-prostaglandin J2 inhibición de NFkB-ADN se unen-ing
de los efectos inhibidores de la melitina en la mayoría de través de la modificación covalente de la subunidad p50. J Biol Chem
los parámetros de disuadir extrae-en el presente estudio es 2001; 276: 35530-6.
16. Yadav PN, Liu Z, Rafi MM. A diarylheptanoid de menor galanga
similar o mayor que los de la propia BV, lo que sugiere que (Alpinia officinarum) inhibe mediadores proinflamatorios a través de
la melitina puede ser un componente importante causante la inhibición de la mitogen-activated proteína quinasa, p44 / 42, y
de los efectos farmacológicos de BV. factor nuclear factor de transcripciónkB. J Pharmacol Exp Ther 2003;
305: 925-31.
17. Banerjee T, Valacchi G, Ziboh VA, van der Vliet A. Inhibición de
TNFuninducida por la ciclooxigenasa-2 expresión de amentoflavona
través de la supresión de NFkB, la activación en las células A549.
Referencias Mol Cell Biochem 2002; 238: 105-10.
18. Precio JH, Hillman KS, ME Toral, Newell S. Percep-ciones y
1. Ribardo DA, SE Crowe, Kuhl KR, Peterson JW, Chopra AK. los percepciones erróneas de la artritis del público. Arthritis Rheum 1983;
niveles de prostaglandinas en los macrófagos estimulados son 26: 1023-8.
controlados por la fosfolipasa A2activador de la proteína y por la 19. Jentsch J, Mucke HW. El veneno de abeja péptidos. XVIII. Péptido-m
activación de fosfo-lipasa C y D. J Biol Chem 2001; 276: 5467-75. y mcd-péptido: aislamiento y caracterización. Int J Pept Protein Res
2. Guastadisegni C, Nicolini A, Balduzzi M, Ajmone-Cat MA, Ming- 1977; 9: 78-9.
Hetti L. La modulación de PGE 2 y TNFunpor el óxido nítrico en 20. Kwon YB, Lee HJ, Han HJ, Mar WC, Kang SK, Yoon OB, et al. La
reposo y LPS-activado células RAW 264.7. Citoquinas 2002; 19: 175- fracción soluble en agua de veneno de abeja produce efectos
80. antinociceptivos y antiinflamatorios en la artritis reumatoide en ratas.
3. Cho KJ, Han SH, Kim BY, Hwang SG, Parque KK, Yang KH, et al. Life Sci 2002; 71: 191-204.
supresión clorofilina de la producción de óxido nítrico inducida por 21. Kwon YB, Lee JD, Lee HJ, Han HJ, Mar WC, Kang SK, et al.
lipopolisacárido en células RAW 264.7. Toxicol Appl Pharmacol inyección de veneno de abeja en un punto de acupuntura reduce la
2000; 166: 120-7. artritis edema Asso-ciados y las respuestas nociceptivas. Dolor 2001;
90: 271-80.
INTERACCIÓN BEE VENOM CON subunidad p50 de NFksegundo 3515

22. Sugishita E, Amagaya S, métodos de prueba Ogihara Y. Anti- suprime la expresión de la sintasa inducible-óxido nítrico por el
inflamatorios: evaluación comparativa de ratones y ratas. J Pharmaco- bloque-ing p38 quinasa y factor nuclearkB / Rel en los macrófagos
Biodyn 1981; 4: 565-75. estimulados por lipopolisacáridos. J Pharmacol Exp Ther 2000; 294:
23. Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper 548-54.
NS, et al. El Reumatismo Asociación Americana de 1987 revisada 35. Surh YJ, Chun KS, Cha HH, Han SS, Keum YS, Parque KK, et al.
criterios para la clasificación de la artritis reumatoide. Arthritis Mecanismos moleculares actividades quimiopreventivos subyacentes
Rheum 1988; 31: 315-24. de fitoquímicos anti-inflamatorios: baja regulación de la COX-2 y
24. Grisham MB, Johnson GG, Lancaster JR Jr. La cuantificación de iNOS través de la supresión de NFkB activación [revisión]. Mutat Res
nitrato y nitrito en los fluidos extracelulares. Methods Enzymol 1996; 2001; 480-481: 243-68.
268: 237-46. 36. Geller DA, Lowenstein CJ, Shapiro RA, Nüssler AK, Di Silvio M,
25. Akiba S, Hatazawa R, Ono K, Kitatani K, Hayama M, Sato T.
Wang SC, et al. La clonación molecular y la expresión de óxido
secretora fosfolipasa A2 media la generación de prostaglandinas nítrico sintasa inducible de los hepatocitos humanos. Proc Natl Acad
cooperativa por factor de crecimiento y de citoquinas
Sci EE.UU. 1993; 90: 3491-5.
independientemente de pre-cedentes citosólica fosfolipasa A 2la 37. Phelps CB, Sengchanthalangsy LL, Malek S, Ghosh G. Mecanismo de
expresión en células epithe-lial rata gástrico. J Biol Chem 2001; 276:
21854-62. kB unión al ADN por Rel / NF-kB dímeros. J Biol Chem 2000; 275:
26. Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. Una nueva generación de 24392-9.
Ca2indicadores con propiedades de fluorescencia en gran medida 38. Pineda-Molina E, Klatt P, Vázquez J, Marina A, Garcia de Lacoba M,
mejoradas. J Biol Chem 1985; 260: 3440-50. Pérez-Sala D, et al. Glutationilación de la subunidad p50 de NFkB: un
27. Lee JH, Koo TH, Hwang POR, Lee JJ. Kaurane diterpeno, kame- mecanismo para la inhibición inducida por redox de ADN bind-ing.
bakaurin, inhibe NFkB por la orientación directamente la actividad de Bioquímica 2001; 40: 14134-42.
unión al ADN de p50 y bloquea la expresión de NF- 39. Garcia-Piñeres AJ, Castro V, Mora G, Schmidt TJ, Strunck E, Pahl
antiapoptóticokgenes diana B. J Biol Chem 2002; 277: 18411-20. HL, et al. La cisteína 38 en p65 / NF-kB juega un papel crucial en la
28. Billingham ME, Morley J, Hanson JM, Shipolini RA, Vernon CA. Un inhibición de la unión de ADN por lactonas sesquiterpénicas. J Biol
péptido anti-inflamatoria de veneno de abeja [carta]. Naturaleza 1973; Chem 2001; 276: 39713-20.
245: 163-4. 40. Kim IY, Stadtman TC. La inhibición de NFkADN B de unión y la
29. Abramson SB, Amin AR, Clancy RM, Attur M. El papel del óxido inducción de óxido nítrico en las células T humanas y células de
nítrico en la destrucción del tejido [revisión]. Mejor Res Clin Pract adenocarcinoma de pulmón mediante tratamiento selenito. Proc Natl
Reuma-tol 2001; 15: 831 a -45. Acad Sci EE.UU. 1997; 94: 12904-7.
30. Abramson SB, Attur M, Amin AR, Clancy R. óxido nítrico e
inflamatorias mediadores en la perpetuación de la osteoartritis 41. Haridas V, Arntzen CJ, Gutterman JU. Avicins, una familia de
[revisión]. Curr Rheumatol Rep 2001; 3: 535-41. saponinas triterpenoides de Acacia victoriae (Bentham), inhiben la
31. RS Hotchkiss, Bowling WM, Karl IE, Osborne DF, Flye MW. Los activación del factor nuclearkB mediante la inhibición tanto de su
antagonistas del calcio inhiben la explosión oxidativa y la formación localización nuclear y la capacidad de unirse al ADN. Proc Natl Acad
de nitrito en macrófagos peritoneales de rata estimulados por Sci EE.UU. 2001; 98: 11557-62.
lipopolisacáridos. Choque 1997; 8: 170-8. 42. Toledano MB, Leonard WJ. Modulación del factor de transcripción
32. Meador R, E Hsia, Kitumnuaypong T, HR Schumacher. participación NFkB actividad de unión por oxidación-reducción in vitro. Proc Natl
TNF y la terapia anti-TNF de la artritis reactiva y no clasificados Acad Sci EE.UU. 1991; 88: 4328-32.
[revisión]. Clin Exp Rheumatol 2002; 20 Suppl 28: S130-4. 43. Haddad JJ, Safieh-Garabedian B, Saade NE, Lauterbach R. La
33. Nakade S, Rhee SK, Hamanaka H, fosforilación Mikoshiba K. El inhibición de enzimas relacionadas con glutatión-aumenta la
AMP cíclico dependiente de una purificado por inmunoafinidad biosíntesis de citoquinas LPS-medi-ado: participación de un IkB /
homo-tetramérica inositol receptor 1,4,5-trifosfato (tipo I) aumenta NFkvía B-sensible en el epitelio alveolar. Int Immunopharmacol
Ca2flujo en vesículas lipídicas reconstituidas. J Biol Chem 1994; 269: 2002; 2: 1567-1583.
6735-42.
44. Majumdar S, Aggarwal BB. La adenosina suprime la activación del
34. Jeon YJ, Kim YK, Lee H, Parque SM, SB Han, Kim HM. radicicol factor nuclearkB inducida selectivamente por el factor de necrosis
tumoral en diferentes tipos de células. Oncogene 2003; 22: 1206-18.