Grado en Químicas

Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas Técnicas y Métodos en Bioquímica

Tema 1. Procedimientos generales en la experimentación bioquímica

Tabla de contenidos

I. La investigación bioquímica

II. Seguridad en la experimentación

Riesgos de los Productos Químicos y los Materiales Biológicos

III. Registro del desarrollo experimental y resultados: el

cuaderno de laboratorio

IV. Resultados: análisis estadístico

Medidas y errores experimentales: resultado, un rango de
incertidumbre
Exactitud y Precisión: Tratamiento Estadístico de Datos
Evaluación de la precisión
Evaluación de la exactitud

V. Comunicación: artículos y presentaciones científicas.

Los textos científicos
La introducción
Materiales y métodos
Los resultados
La discusión
Referencias bibliográficas
Las revistas científicas
La presentación oral
El póster científico

VI. Niveles de experimentación en bioquímica: animales

intactos, órganos, tejidos o células.
Cultivos celulares
El laboratorio de cultivo celular e instrumentación
Las campanas de cultivo
Incubadoras de CO2
Microscopios
Otros equipos
Contaminación de los cultivos
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VII. Manejo de disoluciones y reactivos bioquímicos.

El agua en el laboratorio: sistemas de purificación de agua
Tipos de agua purificada
Técnicas de purificación del agua
Destilación
Intercambio iónico
La Ósmosis Inversa (RO, Reverse Osmosis)

Limpieza del material de laboratorio

Disoluciones: concentración y cálculos
Preparación y almacenaje de disoluciones
Transferencia cuantitativa de líquidos
Pipetas y micropipetas
(R. Boyer, Capítulo 1, Sección C y D)

VIII. Métodos generales en la preparación y manejo de

muestras. (R. Boyer, Capítulo 3, Sección A y D)
pH, disoluciones tampón, electrodos y biosensores
Técnicas para la preparación de muestras
Dialisis
Ultrafiltración
Liofilización y concentración por vacío

IX. Radioisótopos en Bioquímica.

(R. Boyer, Capítulo 3, Sección E)

Términos y conceptos clave

Seguridad en el Laboratorio; Sistema de Identificación de Materiales Peligrosos;
Cuaderno de Laboratorio; Comunicación de Resultados; Artículos Científicos; Posters
y Comunicaciones Orales; Medidas, Exactitud y Precisión; Tratamiento Estadístico de
Datos; Sistemas de Purificación de Agua; Disoluciones; Pipetas; pH; Electrodos;
Biosensores; Disoluciones Tampón/Buffers; Cuantificación de Ácidos Nucleicos y
Proteínas; Diálisis; Ultrafiltración; Liofilización; Isótopos; Radioisótopos.
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I. La investigación en Bioquímica
Como en el resto de las áreas de las Ciencias, los avances en Bioquímica y Biología
Molecular son el resultado de cuidadosos diseños y desarrollos experimentales y de
minuciosos análisis de los datos obtenidos, dirigidos a resolver cuestiones o hipótesis
concretas. En todo este proceso hay una serie de pasos comunes, independientemente
del objeto de la investigación, entre los que podemos destacar:
- La evaluación del estado del conocimiento en el área, fundamentalmente
mediante revisiones bibliográficas.
- La identificación del objeto de la investigación y planteamiento de la hipótesis de
trabajo.
- El diseño experimental, en el que serán piezas clave la selección de la forma y del
medio en el que se va a trabajar (especies, in vivo, in vitro…); la identificación de
las variables en estudio y de las variables que tienen que ser controladas; y la
valoración de los materiales e instrumental con los que se va a trabajar, incluyendo
los aspectos de seguridad a tener en cuenta en su manejo.
- El desarrollo de los experimentos, incluyendo las calibraciones y controles
necesarios, y el registro por escrito, tanto de todo lo que sucede durante el trabajo
como de los resultados obtenidos. Será importante planificar la repetición de los
experimentos para poder obtener resultados significativos.
- El análisis estadístico y evaluación de los resultados.
- El planteamiento de las principales conclusiones a las que se puede llegar en
función de los resultados obtenidos, y de las nuevas hipótesis y futuros trabajos a
realizar.

Los resultados y conclusiones de los trabajos realizados son puestos a disposición de la

comunidad científica en Congresos, Conferencias y, principalmente, a través de su
publicación en revistas científicas.
Teniendo como hilo conductor este proceso de “hacer ciencia”, en este primer tema nos
planteamos recordar, de forma introductoria, algunos aspectos de la seguridad en la
experimentación, el registro de información durante nuestro trabajo, el análisis de
resultados y las publicaciones científicas.
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II. Seguridad en la experimentación

En el laboratorio existen unas normas básicas que nos permitirán minimizar los riesgos
y desarrollar nuestras tareas con la máxima seguridad posible. En la experimentación en
Bioquímica y Biología Molecular habrá que prestar especial atención a la forma de
manejar los productos químicos y biológicos y, como en el resto de los laboratorios,
conocer la forma correcta de desechar los residuos para garantizar la protección de
nuestro entorno y el medio ambiente en general. El manejo de cualquier compuesto
químico y material biológico siempre implica, en mayor o menor medida, algún tipo de
riesgo. Durante nuestro trabajo no tenemos ni que quitar importancia a estos riesgos ni
actuar con un temor excesivo. Lo realmente importante es actuar con sentido común y
conocer las condiciones y formas de actuar para realizar una manipulación correcta y
segura del producto, hecho que podemos extender a cualquier instrumento o
dispositivo con el que nos encontremos.
Existen diferentes fuentes que nos resultarán muy útiles para recabar la información
necesaria sobre las normas, reglamentaciones, procedimientos y riesgos potenciales
que permitirán que nuestro trabajo se realice en las condiciones más seguras posible.
En nuestro caso nos resulta interesante la información que podemos encontrar a través
del Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo (INSHT), de la Red Española
de Seguridad y Salud en el Trabajo, de la Occupational Safety and Health Administration
europea (EU-OSHA) y de la Occupational Safety and Health Administration americana
(OSHA). Además, en grandes empresas encontraremos unidades o secciones específicas
preocupadas de la salud laboral que velarán por la formación e información de los
trabajadores en estos aspectos de seguridad.

Riesgos de los Productos Químicos y los Materiales Biológicos

Además de las normas de comportamiento personal en un laboratorio: vestimenta
apropiada, utilización de la protección personal necesaria, hábitos adecuados, como por
ejemplo el tratar de no trabajar sólo, o no ingerir comidas o bebidas,… es importante
tener presente las normas de seguridad relativas al uso de productos químicos, que
pasan por consultar y entender la información e indicaciones que obligatoriamente
deben aparecer en las etiquetas de cualquier producto que manejemos. Los peligros de
cada producto químico se comunican a través de indicaciones y pictogramas
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normalizados en las etiquetas y las fichas de datos de seguridad, de acuerdo con el

Sistema Mundialmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos
Químicos o GHS (Global Harmonized System), en el que se basa el reglamento CLP de la
Unión Europea, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas.
Existen normas específicas, mucho más estrictas, y condiciones de protección especial
para la manipulación de sustancias radiactivas. En España, tanto las instalaciones en las
que se trabaja con radiactividad como el personal que trabaje en ellas, están bajo la
vigilancia, supervisión y/o control del Consejo de Seguridad Nuclear
(http://www.csn.es/). En los laboratorios de Biología Molecular y Bioquímica, el uso de
radiactividad en la experimentación se va sustituyendo, cada vez más, por otros
métodos o técnicas que impliquen menos efectos negativos y riesgos.
En relación con los agentes biológicos y los peligros potenciales del trabajo en los
laboratorios de Bioquímica y Biología Molecular, los principales riesgos a considerar son
los derivados de las infecciones, alergias y contaminaciones provocadas por la
manipulación de microorganismos, virus y cultivos celulares. Existen medidas
preventivas específicas en relación con estos riesgos, como son el uso de cabinas de
seguridad microbiológicas, medidas para reducir el polvo y aerosoles, áreas de trabajo
de acceso restringido y etiquetado de bioseguridad. Ya en 1983, la Organización Mundial
de la Salud (OMS) apreció la importancia de la seguridad biológica y, desde entonces,
viene publicando su Manual de Bioseguridad en el laboratorio, con el objetivo general
de ofrecer una orientación práctica especializada en materia de bioseguridad. Este
manual es una buena referencia para todo aquel que necesite información y/o esté
interesado en este tema (ver lectura complementaria LC1.1).

III. Registro del desarrollo experimental y resultados: el cuaderno de

laboratorio
Siempre que nos enfrentamos a un trabajo experimental hemos de recordar la
importancia de llevar un registro de todo lo que sucede en el laboratorio. En este
registro, que realizamos en el ampliamente conocido cuaderno de laboratorio, es
importante incluir todos los detalles del procedimiento que se va a realizar, la
preparación de todos los reactivos, la puesta a punto y calibrados de los equipos, los
datos que se obtienen y las observaciones personales que consideremos relevantes
realizar durante el experimento. Es importante que este cuaderno de anotaciones sea
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un cuaderno real, no papeles sueltos que se puedan perder fácilmente. Todo esto
resulta muy tópico y es muy habitual escucharlo una y otra vez durante la etapa
formativa, pero realmente es muy frecuente tener que recurrir a estas anotaciones y
sorprende comprobar la utilidad de tener reflejadas determinadas informaciones y
comentarios que, mientras los escribíamos podíamos pensar que no eran tan relevantes.
Los contenidos de un cuaderno de laboratorio pueden responder al siguiente esquema
general (de acuerdo con R. Boyer):

I. Introducción
a. Objetivo o propósito
b. Teoría
II. Experimental
a. Tabla de materiales y reactivos
b. Listado de instrumentación
c. Diagrama de flujo
d. Registro del procedimiento
III. Datos y Cálculos
a. Registro de todos los datos obtenidos
b. Métodos de cálculos con análisis estadístico
c. Presentación final de datos en tablas, gráficos o figuras.
IV. Resultados y Discusión
a. Conclusiones
b. Comparación de resultados con valores conocidos
c. Discusión sobre el significado de los resultados
d. ¿Se consiguió el objetivo original?
e. Referencias bibliográficas

IV. Resultados: análisis estadístico

Medidas y errores experimentales: resultado, un rango de incertidumbre
Durante nuestra investigación en el campo de la bioquímica tendremos que realizar de
continuo diversas determinaciones cuantitativas, es decir, medidas, de distintas
variables, como por ejemplo: la concentración o la cantidad de un componente concreto
en una muestra, la medida del pH de una disolución, la determinación de la velocidad
de una reacción enzimática, la radiactividad asociada a una molécula, etc. Somos
conscientes de que cualquier medida que realicemos es, en realidad, una estimación del
valor verdadero de la magnitud medida, que llevará un determinado grado de
imprecisión implícito. Esta imprecisión es lo que denominamos error experimental
asociado a nuestra medida, y es la diferencia entre el valor “real” y el valor determinado
experimentalmente por nosotros.
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Tradicionalmente, clasificamos a los errores experimentales en dos tipos: los

sistemáticos y los aleatorios. Los errores aleatorios son, como su nombre indica, de
naturaleza impredecible e incontrolable, al contrario que los errores sistemáticos,
normalmente producidos por un error metodológico o instrumental que puede ser
determinado y eliminado o, al menos, reducido en gran medida. Los errores sistemáticos
siempre influyen de la misma manera en las medidas, debiéndose generalmente a la
mala calibración de los instrumentos o a errores metodológicos del experimentador. En
el ámbito de la bioquímica, se suelen destacar como errores sistemáticos más
frecuentes los producidos por el uso inadecuado de las pipetas y las micropipetas, la
preparación incorrecta de disoluciones stock y la mala calibración y uso de los pH-
metros. El uso de muestras estándar, muestras-blanco, la utilización de otros métodos
en paralelo para realizar las mismas mediciones o contrastar nuestros resultados con los
resultados obtenidos por otros grupos permitirán detectar estos posibles errores
sistemáticos, que pueden ser calculados y corregidos numéricamente sobre los
resultados.
En cualquier caso, nuestro deseo siempre será identificar todos los posibles errores y
corregirlos, en la medida que nos sea posible. Los que no podemos eliminar por ser
inherentes a nuestra medida, como son los errores relacionados directamente con la
resolución y precisión del instrumental o del método empleado, tendremos que
estimarlos y tenerlos en cuenta en nuestro resultado: determinarán el rango de
incertidumbre con el que expresamos nuestro resultado. Otro aspecto muy importante
de nuestro análisis consiste en evaluar como de fiables son estos resultados, tanto para
nuestro propio conocimiento, como para informar al resto de la comunidad científica
cuando divulguemos nuestro trabajo. La realización de réplicas de los experimentos
ayuda, por un lado, a detectar posibles errores sistemáticos o accidentales, y por otro
nos permitirá hacer esta necesaria estimación del rango de incertidumbre resultante y
la fiabilidad de esta determinación. Como veremos a continuación, la evaluación de dos
indicadores, la exactitud y la precisión, serán de gran utilidad en este sentido.
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Exactitud y precisión: tratamiento estadístico de datos

Existen diferentes indicadores que nos permiten hacer una evaluación de cómo funciona
un determinado método en cada trabajo de medición concreto, entre los que podemos
destacar:
- La precisión: indicador de la reproducibilidad de las medidas. Realizando la misma
medición varias veces, la distribución en un rango más amplio de los valores
obtenidos implica menor precisión del método.
- La exactitud: después de realizar un conjunto de mediciones sobre una misma
muestra, la diferencia entre la media de todas las medidas obtenidas y el valor
“verdadero” refleja la exactitud de nuestro método.
Por tanto, al hablar de precisión estamos hablando de cómo de iguales son las distintas
medidas que obtenemos al realizar la misma operación de medición, un número
determinado de veces. Cuando hablamos de exactitud estamos hablando de cómo de
cercano está al “valor real” el valor que nosotros damos como resultado de nuestra
medida (normalmente la media de los valores obtenidos después de realizar la medición
varias veces). Varias medidas experimentales pueden ser muy precisas (es decir,
obtenemos valores muy próximos entre sí siempre), pero pueden ser muy poco exactas.
La evaluación de la precisión y la exactitud de nuestros datos van a resultarnos
fundamental tanto para ser conscientes de cómo son nuestros resultados y el grado de
incertidumbre asociado a ellos, como para poder aportar información sobre la calidad
de nuestro trabajo. Para estas evaluaciones recurrimos al análisis estadístico, cuya
utilidad práctica, significado y limitaciones resumiremos a continuación.

Evaluación de la precisión
La determinación de la precisión de una medida, o lo que es lo mismo, conocer la
reproducibilidad del experimento, lógicamente implica realizar nuestra medición varias
veces. Cuando repetimos muchas veces una determinación experimental, normalmente
los resultados obtenidos se ajustan a lo que denominamos distribución normal o
gaussiana, caracterizada por ser una distribución simétrica en torno a un valor central,
que se repite más frecuentemente, y al que denominamos media (Tabla 1). El rango en
el que se distribuyen los valores obtenidos será un reflejo del error aleatorio. Si
asumimos que el conjunto de datos que manejamos se ajusta a una distribución normal,
hay tres parámetros estadísticos que nos pueden resultar de utilidad para cuantificar la
precisión: la desviación estándar, el coeficiente de variación y la varianza (ver Tabla 1).
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Figura 1. Distribución normal y significado de la desviación estándar. En el intervalo 𝑥𝑥̅ ± 𝑠𝑠 se encuentra el 68,3 % de los
resultados, en el intervalo 𝑥𝑥̅ ± 2𝑠𝑠 se encuentra el 95,5 % de los resultados y en e intervalo 𝑥𝑥̅ ± 3𝑠𝑠 se encuentra el 99,7%
de los resultados.

Estos tres parámetros son formas alternativas de expresar cómo es la dispersión de los
valores obtenidos dentro del conjunto de datos que manejamos, alrededor de la media,
𝑥𝑥̅ . En general, los tres están relacionados con la anchura de la curva que representa la

distribución, de forma que cuanto más estrecha sea, más pequeño será el valor del
parámetro, y mayor será la precisión. La desviación estándar (SD, s) es una medida de
la variabilidad del conjunto de datos. La naturaleza matemática de la curva de una
distribución normal es tal que el 68,3% de su área, y por tanto el 68,3 % de los valores
del conjunto de datos en estudio, se encuentran en un rango de una desviación estándar
a cada lado de la media; el 95,5% del área bajo la curva está dentro de dos desviaciones
estándar y el 99,7% dentro de tres desviaciones estándar. La precisión del conjunto de
datos se expresa normalmente como ±SD de la media.
La desviación estándar es a menudo transformada en la desviación estándar de la media
o error estándar, 𝑠𝑠/√𝑛𝑛, (Tabla 1), dónde n es el número de medidas. El error estándar
de la media es una medida de la precisión de la media de la muestra. A diferencia de la
desviación estándar, el error estándar depende del tamaño de la muestra (irá
disminuyendo según aumente éste). Estos dos parámetros pueden resultar confusos. En
esencia, usaremos la desviación estándar para conocer cómo de dispersas se
encuentran las medidas y el error estándar para indicar la incertidumbre de la media de
nuestras medidas.
El coeficiente de variación (CV) de un conjunto de datos, también conocido como
desviación estándar relativa, es la desviación estándar expresada como un porcentaje
de la media. El interés de este parámetro reside en que mientras que la media y la
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desviación estándar tiene las mismas unidades, con el coeficiente de variación estamos
hablando en porcentajes, por lo que permite comparar fácilmente varios métodos,
independientemente de la unidad de medida.
La varianza es el cuadrado de la desviación estándar, s2, y su interés se centra en la
comparación estadística de dos conjuntos de datos.

Evaluación de la exactitud
La exactitud describe lo próximo que están los valores medidos al valor verdadero de
una determinada magnitud. Para obtener el valor verdadero de un determinado
parámetro tendremos de medirlo experimentalmente y, como bien sabemos, toda
medida experimental lleva asociada un error que tendremos que tratar de minimizar,
pero nunca podremos anular completamente. Resulta obvio que en muchas ocasiones
no vamos a poder comparar nuestras mediciones con el “valor verdadero” de la variable
que estamos determinando porque, sencillamente, no sabremos cuál es este “valor
verdadero”. Para ello recurrimos al concepto de población en estadística, que implica
contar con un número muy grande de datos – infinito, o lo que es lo mismo, realizar la
medición un número infinito de veces, de forma que minimicemos los errores aleatorios.
En este supuesto, la frecuencia con la que aparece cada valor, en cada medición, se
ajustará en muchos de los casos a una distribución normal, tal y como mencionábamos
antes, y la media del conjunto de datos, que designamos como media de la población,
µ, y la desviación estándar de la población, designada con la letra griega sigma, σ, serán
la mejor estimación de los “valores reales” de la población.
En la práctica, por razones obvias, resulta difícil (imposible en muchos casos) realizar un
número muy grande de medidas. De hecho, la mayoría de las medidas sobre sistemas
biológicos se pueden realizar por duplicado, triplicado o incluso cuadruplicado, pero
sería impracticable, y una pérdida de tiempo y material, hacer numerosas
determinaciones de la misma medida. Por lo tanto, normalmente trabajaremos con
muestras de la población de un tamaño más o menos pequeño; eso sí, cuanto mayor
sea el tamaño de la muestra, más cerca estarán el valor de la media muestral y el de la
media poblacional entre sí, y más se acercará la distribución de resultados a una
distribución normal (campana de Gauss).
Aceptando que la media de la población es la mejor estimación del “valor verdadero”, y
que no vamos a poder trabajar con los parámetros de una población estadística, sino de
una o varias muestras de esa población, cada una con un número de datos pequeño, el
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tamaño muestral será demasiado pequeño como para que se encuentre normalmente
distribuido. De acuerdo con esto nos puede surgir una pregunta: ¿en qué medida la
media de la muestra es representativa de la media poblacional? o, dicho de otro modo,
¿cómo puedo relacionar la media de mi muestra experimental con la media poblacional?
Para responder a esta pregunta recurrimos al concepto de confianza. De la misma
manera que cuando trabajamos con una distribución normal sabemos que tendremos
un nivel de confianza del 95,5% fijando un intervalo de confianza de 𝑥𝑥̅ ±2s, o un nivel de
confianza del 99,7% si fijamos un intervalo de 𝑥𝑥̅ ±3s, cuando analicemos una muestra de
esta población tendremos que encontrar esos rangos/intervalos de valores en los que
podemos aseguran que la media de la población se encuentra con una determinada
probabilidad, es decir, con un determinado nivel de confianza. En estas situaciones hay
un parámetro estadístico que nos permite fijar esos intervalos: la t de Student. En
definitiva lo que queremos, después de realizar nuestro experimento un número no muy
grande de veces, es poder determinar un intervalo en torno a la media muestral en el
que sepamos que, con una determinada probabilidad, se va a encontrar la media
poblacional (mejor estimación del “valor verdadero”). Este intervalo de confianza es
proporcional al error estándar de la muestra en un factor conocido como t de Student.
Los valores para el factor t de Student están tabulados, en función del número de datos
de la muestra, para determinados niveles de confianza (Tabla 2). Desde un punto de
vista práctico lo que haremos es definir el nivel de confianza con el que queramos
trabajar y según el número de datos que tenga nuestra muestra, buscamos el valor para
el parámetro t de Student, con el que directamente podremos definir nuestro intervalo
de confianza. El nivel de confianza se puede establecer en cualquier valor, hasta el 100%.
Por ejemplo, establecer un nivel de confianza del 50% implica que la media muestral no
es una estimación aceptable de la media poblacional en uno de cada dos casos; un nivel
de confianza del 95% implica que no se ha conseguido una buena estimación en un caso
de cada 20 (5 de cada 100 no serán buenas estimaciones); o con un nivel de confianza
del 99%, la media de una muestra de cada 100 no será una buena estimación de la media
poblacional. En la práctica, en bioquímica analítica lo más común es establecer el nivel
de confianza entre el 90 y 99%, y resulta una buena y habitual práctica en el análisis de
resultados informar del número de medidas en las que se basa la media y la desviación
estándar que obtenemos, ya que esto será una clara indicación de la calidad de nuestros
resultados.
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Tabla 1.
Parámetros estadísticos Definición
𝑥𝑥̅ = media aritmética
𝑛𝑛 𝑥𝑥𝑖𝑖 =valor para una medida concreta
∑ 𝑥𝑥𝑖𝑖
Media (𝑥𝑥̅ ) 𝑥𝑥̅ = 𝑛𝑛 = número total de determinaciones
𝑛𝑛 experimentales

𝑛𝑛 = número total de determinaciones

(𝑥𝑥𝑖𝑖 − 𝑥𝑥̅ )2
𝑠𝑠 = �� experimentales
Desviación estándar (𝑠𝑠) 𝑛𝑛 − 1 𝑛𝑛 − 1 = grados de libertad del conjunto de
datos
𝑠𝑠
𝑠𝑠𝑚𝑚 =
Error estándar (𝑠𝑠𝑚𝑚 ) √𝑛𝑛

Coeficiente de variación 𝑠𝑠 100%

𝐶𝐶𝐶𝐶 =
(CV) 𝑥𝑥̅

𝑥𝑥̅ = media de las medidas

Relación entre media 𝑡𝑡𝑡𝑡 𝜇𝜇 = media de la población
poblacional (𝜇𝜇) y media 𝜇𝜇 = 𝑥𝑥̅ ± = 𝑥𝑥̅ ± 𝑡𝑡𝑠𝑠𝑚𝑚 𝑠𝑠 = desviación estándar de las medidas
muestral (𝑥𝑥̅ ) √𝑛𝑛 𝑛𝑛 = número de medidas
𝑡𝑡 = factor t de Student

Tabla 2. Valores de la t de Student para niveles de confianza del 90, 95, 98 y 99%
Niveles de confianza
Grados de 50% 90% 95% 98% 99%
Libertad Probabilidad Probabilidad Probabilidad Probabilidad Probabilidad
n-1* 0.5 0.1 0.05 0.02 0.01
2 0.816 2.920 4.303 6.965 9.925
3 0.765 2.353 3.182 4.541 5.841
4 0.741 2.132 2.776 3.747 4.604
5 0.727 2.015 2.571 3.365 4.032
6 0.718 1.943 2.447 3.143 3.707
7 0.711 1.895 2.365 2.998 3.499
8 0.706 1.860 2.306 2.896 3.355
9 0.703 1.833 2.262 2.821 3.250
10 0.700 1.812 2.228 2.764 3.169
15 0.691 1.753 2.131 2.602 2.947
20 0.687 1.725 2.086 2.528 2.845
30 0.683 1.697 2.042 2.457 2.750
*𝑛𝑛 = número total de determinaciones experimentales; 𝑛𝑛 − 1 = grados de libertad del conjunto de datos
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De esta forma, la estadística nos ofrece herramientas para aceptar conclusiones que
tienen alta probabilidad de ser correctas y rechazar las que tiene una probabilidad alta
de ser incorrectas. A modo de resumen de lo visto, podemos indicar que si pudiésemos
realizar un experimento un número muy elevado de veces y los errores son únicamente
aleatorios, esperaríamos que nuestras medidas tiendan a distribuirse simétricamente
en torno a un valor medio, ajustándose la distribución de los valores obtenidos a una
distribución normal o gaussiana. En estas circunstancias la desviación estándar nos
permite tener una idea de la precisión de nuestras medidas (mayor precisión, menor
desviación estándar). Para una serie infinita de datos, hablamos de media poblacional
(µ) y designamos a la desviación estándar con la letra griega “σ”. En las situaciones
reales nos encontraremos con un número limitado de medidas, sobre las que
determinar el valor medio (𝑥𝑥̅ ) y la desviación estándar (𝑠𝑠). Para ofrecer una estimación
de cómo de próximas están la media muestral y la media poblacional definiremos un
intervalo de confianza que nos ofrezca encontrar con una determinada probabilidad el
valor de la media poblacional (considerado valor verdadero) incluido en él.
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V. Comunicación: artículos y presentaciones científicas

Como mencionábamos al principio, algo indispensable es la puesta a disposición de la
comunidad científica de los resultados y conclusiones de los trabajos realizados. Esta
comunicación se realiza fundamentalmente de dos formas: o bien en reuniones
científicas, congresos y conferencias, en las que los participantes exponen sus trabajos
más recientes, lo que se realiza normalmente mediante comunicación orales o
mediante posters explicativos; o bien, mediante la publicación en revistas científicas,
lo que suele ser habitual, una vez que el contenido del trabajo tiene la suficiente entidad
e interés. Aunque el contenido de los trabajos es esencial, en investigación no es menos
importante el cómo mostrarlo y demostrarlo. Todo ello, junto con costumbres basadas
en la tradición, hace que los textos científicos tengan algunas características
particulares, que introduciremos a continuación.

Los textos científicos

En general, los textos científicos deben tratar de ser breves y concisos. Antes de empezar
a escribir conviene estar seguro de saber que se pretende transmitir. En un trabajo
científico encontraremos diferentes apartados que desarrollan el planteamiento del
tema o la hipótesis, la presentación, validación y evaluación de la validez de las
soluciones dadas al problema planteado y la exposición de las principales conclusiones.
La mayoría de las revistas solicitan que los artículos científicos tengan una determinada
estructura, sujeta a algunas variaciones según los requisitos editoriales de la revista en
la que se publica, pero que en general incluye: el resumen (abstract), la introducción,
fundamentos y objetivos del trabajo planteado, los materiales y métodos utilizados, los
resultados, la discusión, las conclusiones, las referencias bibliográficas, y las Tablas y
Figuras y sus leyendas descriptivas. Existen otros tipos de publicaciones que no
responden estrictamente a esta estructura. En concreto, mencionaremos las revisiones
o reviews, importantes publicaciones científicas en las que se realiza una recopilación
de los principales conocimientos y aportaciones existentes en un campo (por lo que
suelen ser puntos de partida muy buenos para introducirse en él), y que sirven para
poder establecer el estado actual y las líneas de trabajo abiertas o a desarrollar sobre
un tema concreto.
A continuación detallamos algunos de los contenidos básicos que deben incluir algunas
de las secciones antes mencionadas:
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La introducción
El objetivo de una introducción es encuadrar nuestro trabajo en el conocimiento
científico del momento, haciendo referencia inicialmente a los antecedentes generales
y el conocimiento actualizado del tema, para ir progresivamente dando información
conocida más específica que consideremos relevante para comprender nuestro
planteamiento, y resumiendo la bibliografía más importante. También es necesario en
la introducción explicar de forma clara y concisa el propósito del estudio, cómo se ha
realizado, el porqué del planteamiento del problema y del procedimiento diseñado para
resolverlo.

Materiales y Métodos
Se deben describir de forma muy pormenorizada todas las condiciones en las que se ha
realizado nuestro trabajo, detallando muy minuciosamente los materiales utilizados y
las características del instrumental y de los métodos aplicados, tanto en la obtención de
los datos como en su tratamiento, de forma que cualquiera fuese capaz, con esa
información, de reproducir completamente nuestro experimento.

Los resultados
Los datos obtenidos se suelen describir en el texto de forma breve pero completa.
Además se hace uso de figuras o tablas para mostrar de forma gráfica, esquematizada u
organizada esos resultados, con el fin de que sea más fácil ver las tendencias o patrones
que se han observado. Tanto el texto, como las tablas y figuras deben ser
autoexplicativas. Es decir, debemos ser capaces de entender lo que se muestra
únicamente leyendo el texto, pero también debemos ver claramente lo que muestra
una figura o lo que contiene una tabla, con la ayuda de las leyendas que se incluyen en
las cabeceras o los pies explicativos que acompañan a cada uno de estos elementos. Hay
que ser muy riguroso en la elaboración de las tablas y figuras, incluyendo todos los
textos explicativos necesarios, unidades de las medidas y cualquier otra información que
ayude a aclarar el contenido.

La discusión
En la discusión se engarzan los antecedentes conocidos del tema, nuestro
planteamiento de trabajo y los resultados obtenidos. De esta forma, es la parte más
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importante del trabajo, ya que nos conducirá directamente a poder extraer una serie de
conclusiones con las que terminaremos nuestro trabajo.

Referencias bibliográficas
Todo trabajo debe incluir una relación de todos los trabajos previamente publicados
relevantes y de todas las fuentes bibliográficas consultadas. En cada una de las
referencias bibliográficas se detalla toda la información que hace posible el poder
localizarla. Cada editorial y revista demandará un formato concreto para la relación de
bibliografía pero, en general, siempre deberán incluir el nombre del autor o autores, el
año de la publicación, la revista o libro y el número de las páginas en las que aparece. Si
se trata de un libro se menciona también la Editorial y los Editores. Muy frecuentemente
se acompaña también del Título de la publicación.
Las referencias bibliográficas son los fundamentos sobre los que se construye el trabajo:
aportan la base científica que justifica la investigación y los métodos que se han decidido
utilizar, suministran el contexto en el que se realiza la interpretación e discusión de los
resultados obtenidos, … Una búsqueda de bibliografía y la lectura de las referencias más
importantes es, por tanto, el punto de partida esencial de cualquier proyecto o trabajo
de investigación. De la misma manera, en cualquier faceta del trabajo científico resulta
esencial realizar revisiones periódicas para conocer la información nueva que exista. Por
ello, las bases de datos y los rastreos bibliográficos son un aspecto clave en el trabajo
científico. Actualmente, gracias a las nuevas tecnologías de la información, el acceso las
fuentes bibliográficas en muy sencillo. Hablaremos de ello en el tema dedicado a la
Bioinformática (Tema 2).

Las revistas científicas

Existen cientos de revistas que aceptan manuscritos en el campo de la bioquímica unas
más generales y otras más específicas. Seleccionaremos para publicar aquellas en las
que encaja nuestro tema de trabajo. La versión final de nuestro trabajo tendrá que
adaptarse al formato y requisitos que exige la revista, y que estarán especificados en las
“Instrucciones a los autores", que todas las revistas facilitan a través de su sitio Web. A
la hora de nuestra elección, además de los temas de interés, podremos tener en cuenta
el prestigio de la revista. Actualmente uno de los más parámetros más extendido y
utilizado para valorarlo es el denominado “índice de impacto”, relacionado
directamente con el número de citas que reciben los artículos en ella publicado. En la
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mayoría de las revistas, antes de aceptarse la publicación de un trabajo, este se somete

a un proceso de revisión independiente “por pares” (peer review). Este método de
evaluación consiste en una revisión pormenorizada del trabajo a publicar por un grupo
de expertos con perfil y cualificación similar a los autores del trabajo. Los revisores
(referees) destacarán los puntos fuertes y débiles del trabajo, las posibles mejoras y
sugerencias a los autores, etc. y recomendarán a los editores de la revista la
conveniencia o no de publicar ese trabajo en su medio. En la última temporada otra
característica a la que se van incorporando muchos medios es el Open Access, que
implica que el contenido de la revista será de libre acceso, sin necesidad de suscripción,
ni de ningún pago. En medios con este sistema el autor tendrá que correr con gastos
para la publicación de su trabajo, que variarán según la revista.

La presentación oral
Las contribuciones a las reuniones científicas suelen realizarse o bien en forma de
comunicaciones orales o bien en forma de póster (de los que hablaremos en la sección
siguiente). La organización de una charla es similar a la de mencionada anteriormente
para los artículos científicos: Introducción, Métodos experimentales, Resultados,
Discusión y Conclusiones, con la ventaja del contacto directo con el público, que implica
la oportunidad de recibir preguntas y comentarios.
El tiempo con el que se cuenta para la presentación estará fijado por los organizadores,
oscilando normalmente entre los 15 minutos (comunicaciones orales) y los 60 minutos
(conferencias). Actualmente, lo más frecuente es utilizar la ayuda de medios digitales
multimedia en las presentaciones. Está establecido como valor óptimo de referencia
para la dinámica de las presentaciones utilizar una media de una o dos diapositivas por
minuto.

El póster científico
En las reuniones científicas, la mayoría de las presentaciones suelen realizarse mediante
unos paneles explicativos en forma de póster, con texto e imágenes organizados de
forma autoexplicativa. Los carteles normalmente estarán expuestos durante toda la
conferencia o congreso, si bien se fijarán unas horas en las que los autores de los
trabajos expuestos estarán accesibles para que se pueda discutir con ellos los detalles
de sus investigaciones. En la Figura 2 se puede ver un ejemplo de un Póster presentado
a un Congreso Internacional.
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Técnicas y Métodos en Bioquímica
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Figura 2. Póster presentado a la 13th European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules (2009, Palermo).

Quien desee conocer más detalles sobre las publicaciones científicas, le recomendamos
leer la lectura complementaria LC1.2 y visitar los distintos enlaces seleccionados en la
Guía de Recursos en Internet del Bloque 1 (documento:
“Recursos_Internet_Bloque1.pdf”).
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VI. Niveles de experimentación en bioquímica: animales

intactos, órganos, tejidos, células o estudios moleculares in
vitro
Las investigaciones en bioquímica se pueden plantear a muy distinto nivel, desde
estudios realizados sobre el ser vivo entero in vivo, hasta los que se realizan in vitro a
nivel subcelular o molecular, pasando por el trabajo con órganos aislados o con cultivos
de tejidos y células.
En cada nivel contaremos con determinados condicionantes que implicarán distintas
ventajas e inconvenientes. Los estudios que podemos realizar sobre el ser vivo completo
serán, por supuesto, los más acercados a la realidad, pero nos resultará imposible
controlar todas las variables, por lo que la interpretación de los resultados resulta más
compleja. Una alternativa puede ser el diseño de experimentos in vitro o in situ sobre
órganos aislados, que nos permitirá hacer un control más fino de las condiciones
experimentales. Los estudios in vitro con órganos se realizan mediante la extirpación de
un órgano concreto que se mantendrá en un medio de incubación controlado. En los
estudios in situ el trabajo se realiza sobre un órgano concreto mantenido dentro del
animal. En cualquier caso y, al margen de los problemas técnicos, generalmente existen
problemas jurídicos, morales y éticos asociados con la experimentación animal. El
desarrollo de técnicas para trabajar con cultivos celulares ha supuesto una muy valiosa
herramienta para los científicos, ofreciendo un sistema fácil, relativamente barato de
mantener y con condiciones muy controlables para el trabajo in vitro sobre sistemas
vivos. Introduciremos a continuación los aspectos técnicos fundamentales de los
cultivos celulares.

Cultivos celulares
El cultivo celular es una técnica que implica el aislamiento y mantenimiento in vitro de
células aisladas desde tejidos u órganos completos de animales, microorganismos o
plantas. Independientemente de los tipos celulares, para trabajar con un cultivo estéril
de células puras necesitaremos adoptar las técnicas asépticas apropiadas, así como
utilizar las condiciones adecuadas en el medio para el crecimiento óptimo y el
mantenimiento de las células. En general, las células animales tienen unas necesidades
nutricionales más complejas y unas condiciones más estrictas que los cultivos de
microorganismos o células vegetales, que resultan más fáciles de mantener.
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
20

La utilización de los cultivos celulares en investigación es muy variada. Sus aplicaciones

en estudios de procesos intracelulares, mecanismos de transducción de señales,
metabolismo de fármacos, efectos farmacológicos y toxicológicos, mecanismos de
acción de drogas, interacciones célula-célula, genética, estudios con virus, etc., hace de
ellos una herramienta muy importante no sólo para la investigación básica, sino también
para desarrollar interesantes aplicaciones médicas e industriales. En este sentido es
interesante destacar el potencial de los cultivos celulares en (A) el tratamiento de
enfermedades asociadas a genes defectuosos que puedan ser sustituidos en las propias
células del huésped y posteriormente trasplantados; (B) en los cultivos de células madre,
especialmente importantes para la regeneración de tipos celulares y tejidos enfermos o
dañados dentro del organismos y con los que, en un futuro, se pueda dar una alternativa
al trasplante de órganos; o (C) en la producción de vacunas virales, de anticuerpos y
proteínas recombinantes. También se utilizan cultivos de bacterias en la industria
agrícola y alimentaria, en la bioconversión de residuos, o en estudios toxicológicos, en
los que los microorganismos van reemplazando a los animales en diferentes pruebas.

Laboratorio de cultivo celular: instrumentación

Un laboratorio de cultivo celular debe ser diseñado de tal manera que garantice el
trabajo en condiciones de esterilidad, libres de microorganismo contaminantes.
Garantizar condiciones de asepsia es uno de los aspectos más importantes a tener en
cuenta, ya que el crecimiento descontrolado de microorganismos puede hacer que las
células cultivadas incluso desaparezcan del medio, tanto por la posible acumulación de
toxinas procedentes de los organismos infectantes, como por el agotamiento de los
nutrientes. Por este motivo, además de trabajar con materiales perfectamente
esterilizados, es importante que en el lugar de trabajo las superficies sean no porosas y
fáciles de limpiar, de forma que se pueda eliminar cualquier residuo que evite generar
posibles caldos de cultivo para microorganismos. Los residuos generados deben ser
eliminados inmediatamente, siendo necesario, en ocasiones, un tratamiento previo con
autoclave para eliminar microorganismos en los desechos.
Entre los equipos esenciales para el cultivo celular se incluyen: (A) una campana de
cultivo, (B) la incubadora, (C) una autoclave o medio de esterilización y (D) un
microscopio. Describiremos a continuación algunas características de estos equipos.
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21

Las campanas de cultivo

La campana de cultivo es la pieza central donde se realiza la manipulación de células y
está diseñada tanto para proteger al cultivo del operario, como al operario del cultivo.
Normalmente se habla de campanas de flujo laminar, ya que generan un flujo
aerodinámico suave e ininterrumpido de aire estéril que ha sido filtrado a través de un
filtro de partículas de alta eficiencia (High-Efficiency Particulate Air, HEPA). Hay dos tipos
de campana de flujo laminar: las verticales y las horizontales. Las campanas de flujo
horizontal permiten que el aire fluya directamente al operador, por lo que se utilizan
generalmente para la preparación de los medios de cultivo o cuando se trabaja con
materiales no infecciosos. Las campanas verticales (también conocido como cabinas de
seguridad biológica) son las mejores para trabajar con organismos peligrosos, ya que el
aire de dentro de la campana se filtra antes de pasar al exterior. Actualmente podemos
diferenciar tres clases diferentes de campanas, según el nivel de protección que
ofrezcan (que está en función del intercambio que hay entre el interior y el exterior): las
campanas de tipo I son las más adecuadas para trabajar con organismos de bajo riesgo
y cuando sólo se necesita protección para el operador; las campanas de tipo II son las
más comunes en los laboratorios de cultivo de tejido, y son adecuadas para el cultivo de
células animales con poco riesgo de agentes tóxicos o infecciosos, pero no son
adecuadas para su uso con agentes patógenos de alto riesgo; y las campanas de tipo III,
que son campanas completamente aisladas en las que el operario puede trabajar a
través de dos guantes que, desde el exterior, permiten manipular el material del interior.
Estas últimas son las que se utilizan cuando se necesita el nivel más alto de protección,
tanto del operario como del cultivo.

Incubadoras de CO2
Para mantener las condiciones óptimas de crecimiento para las células (normalmente
una temperatura constante de 37°C y una atmósfera de aire con el 5-10 % de CO2) se
utilizan las incubadoras de CO2. El dióxido de carbono sirve para garantizar que el medio
de cultivo se mantiene en el pH fisiológico necesario (normalmente pH 7,2 - 7,4), ya que
los iones bicarbonato que habrá en el medio reaccionarán con los protones,
procedentes del metabolismo celular, formando ácido carbónico que, de acuerdo con
su constante de disociación, estará en equilibrio con el CO2 y el H2O. De esta forma, para
garantizar que el pH se mantiene a aproximadamente pH 7.2, se suministra CO2 al
interior del incubador mediante una válvula que se dispara cuando los niveles bajan por
debajo del 5% o del 10%, según se determine. La evaporación en el medio de cultivo se
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22

evita con un sistema de humidificación, consistente en una bandeja de agua estéril en

la parte inferior de la incubadora.
Como alternativa a este sistema de mantenimiento del equilibrio de pH están las
incubadoras que trabajan en seco sin gases, que utilizan sistemas de tamponamiento
alternativos, como son el 4(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico (Hepes) o el ácido
morfolinopropano sulfónico (Mops). Con ello se eliminan posibles contaminaciones
procedentes de la bandeja de agua utilizada para humidificar pero, en contraprestación,
el medio de cultivo se evapora más rápidamente, por lo que hay que buscar algún
mecanismo que garantice la humedad.
En el caso de utilizar incubadoras con humidificación es esencial aplicar agentes
desinfectantes, como Roccal al 1% (p/v), Thimerosal o SigmaClean de Sigma–Aldrich y,
en cualquier caso, es importante la desinfección regular del interior de la incubadora.
En este sentido, recientemente se han desarrollado incubadoras con revestimiento de
cobre, debido a las propiedades antimicrobianas de este metal.

Microscopios
Para obtener información sobre el estado y morfología de las células, resulta necesaria
la visualización de los cultivos mediante microscopía. Se utilizan los microscopios
invertidos, en los que la fuente de iluminación se sitúa por encima de las células a
observar y los objetivo por debajo, al contrario que en los convencionales, ya que al
encontrase las muestras en recipientes con un cierto grosor, la arquitectura óptica
convencional no es adecuada. Además, como lo que tenemos que visualizar son
muestras vivas, poco coloreadas y con muy poco contraste, se hace necesario utilizar un
dispositivo de contraste de fases, que aumenta el contraste y la calidad en la imagen.

Otros equipos
Otros instrumentos necesarios en un laboratorio de cultivo celular son: las centrífugas;
la autoclave, para la esterilización por calor tanto de sólidos como de líquidos; los baños
termostáticos, para descongelar las muestras congeladas y calentar los medios de
cultivo; los frigoríficos y congeladores, para al almacenamiento de medios de cultivo y
otros materiales; y los recipientes especiales en los que se realiza el cultivo celular, que
suelen ser de plástico con distintas formas: frascos, placas de Petri o placas con múltiples
pocillos.
 Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas
23

Contaminación de los cultivos

Con el fin de poder garantizar un cultivo celular limpio y seguro, en todo momento se
deben utilizar técnicas de asepsia y esterilización adecuadas. Ya hemos mencionado la
necesidad de mantener el lugar de trabajo limpio y las superficie de trabajo
debidamente esterilizadas, lo que se hace extensible a las condiciones de higiene del
operario (de hecho, las fuentes más comunes de infección en los cultivos por bacterias,
levaduras y hongos se originan en el trabajador). También se ha hablado de las
campanas, en las que deben realizarse todos los procedimientos relacionados con los
cultivos, incluyendo la preparación de medios y la manipulación de las células. Como en
el resto del trabajo en laboratorio, e incluso si cabe más, debe prestarse especial
atención a evitar hablar, estornudar o toser sobre el sistema con el que estamos
trabajando (medios, cultivos…), y a utilizar siempre material de laboratorio limpio (en
muchas ocasiones se utiliza material desechable como, por ejemplo, las puntas de
pipetas). A pesar de tomar todas las precauciones oportunas, es posible encontrarse con
contaminación en los cultivos. Un cultivo contaminado habrá que retirarlo cuanto antes,
procediendo a desinfectarlo y esterilizarlo (en ningún caso se abrirá el cultivo infectado
dentro de la incubadora o dentro de la campana). En cualquier caso, todos los materiales
y residuos contaminados deben ser esterilizados en autoclave antes de ser desechados
o incinerados. Por otra parte, todos los residuos generados también deben ser
inactivados con desinfectantes antes de su eliminación.
Es importante conocer cuáles son las infecciones más posibles en cada tipo de cultivo,
para poder hacerles frente. En cultivos de células animales, las infecciones bacterianas
y fúngicas son relativamente fáciles de identificar y aislar, incluso en las primeras etapas.
Este tipo de contaminación es visible a simple vista, ya que la infección normalmente
produce un aumento de la turbidez y un cambio de color en el medio de cultivo, lo que
es originado por un cambio de pH. Bajo el microscopio las bacterias se observarán como
pequeños cuerpos redondos móviles, y los hongos se distinguirán por sus largas hifas y
por las colonias difusas que originan en su crecimiento. En las primeras etapas, la
infección se puede tratar de eliminar mediante lavados e incubaciones con antifúngicos
o antibióticos, aunque lo más recomendable es retirar el cultivo contaminado, antes de
que se propague.
Un tipo de contaminación muy común y no tan fácil de detectar, ni siquiera con ayuda
del microscopio, es la originada por micoplasma, pequeños procariotas, de
aproximadamente 0,3 mm de diámetro, sin pared celular, que generalmente infectan el
citoplasma de las células de mamíferos. Si no se controla, la contaminación por
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
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micoplasma provoca efectos sutiles, pero adversos, como cambios metabólicos,

alteraciones en la síntesis del ADN, del ARN y proteínas o cambios en la morfología y en
el crecimiento, todos ellos cambios que conducirán a resultados experimentales no
fiables ni reproducibles, y a productos biológicos no seguros. Hasta hace poco, la
detección sólo se podía realizar en laboratorios especializados, pero actualmente ya
existen técnicas aplicables directamente en los laboratorios de cultivo, como la tinción
indirecta de ADN con una sonda fluorescente, la realización de cultivos microbiológicos,
la detección mediante inmunoensayos con ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
o la detección mediante PCR (Polymerase Chain Reaction).

Quien desee conocer más detalles sobre el cultivo celular, o tener una imagen física de
los instrumentos y materiales con los que se trabaja, le recomendamos leer las lecturas
complementarias (LC1.3 y LC1.4) y visitar los distintos enlaces seleccionados en la Guía
de Recursos en Internet del Bloque 1 (documento: “Recursos_Internet_Bloque1.pdf”).

VII. Manejo de disoluciones y reactivos bioquímicos.

En la Sección C de la referencia básica (R. Boyer, 2012) encontrará los aspectos básicos
generales sobre el manejo de reactivos y disoluciones de interés en el laboratorio de
Bioquímica (preparación de disoluciones, almacenamiento, …), así como de la limpieza
y manejo del material que utilizaremos (material de vidrio y pipetas). También se
recogen algunas direcciones interesantes en la Guía de Recursos en Internet del Bloque
1 (documento: “Recursos_Internet_Bloque1.pdf”). Aquí vamos a ampliar la información
que se aporta en nuestra referencia básica sobre la sustancia más utilizada en el
laboratorio de bioquímica: el agua. En concreto, a continuación mencionaremos los
tipos de contaminantes que podemos encontrar en el agua, desde el punto de vista de
su utilización en el laboratorio, los distintos grados de purificación de agua con los que
es conveniente trabajar y los sistemas desarrollados para poder realizar esta
purificación.

El agua en el laboratorio: sistemas de purificación del agua

El agua es la sustancia más utilizada en un laboratorio de bioquímica. Su utilización va
desde el lavado del material, hasta su uso como disolvente en la preparación de mayoría
de las disoluciones (reactivos, tampones o buffers, medios de cultivo celular…), ya que
 Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas
25

es el medio fundamental en el que se encuentra los sistemas biológicos. Por tanto,

resulta esencial para nuestro trabajo tener en cuenta tanto la cantidad como la calidad
del agua disponible.
El agua del grifo es de calidad baja desde el punto de vista experimental, ya que contiene
gran cantidad de impurezas, que aunque no sean nocivas para la salud, interfieren en
nuestros estudios. Hay cinco clases principales de contaminantes que pueden interferir
en nuestro trabajo:
• Iones inorgánicos entre los que destacan los cationes sodio, calcio, magnesio o
hierro y los aniones bicarbonato, cloro y sulfato, ya que es fácil encontrarlos en
el agua del grifo.
• Sustancias orgánicas, fundamentalmente de origen biológico, como los ácidos
húmicos, los taninos y la lignina, productos derivados de la descomposición
vegetal. En el agua del grifo también pueden detectarse contaminantes
producidos por el hombre, como por ejemplo los plastificadores a base de
ésteres de ftalatos de los tubos de PVC.
• Partículas en suspensión, tanto de residuos vegetales como de arena y roca, y
coloides.
• Microorganimos: bacterias, virus, protozoos y algas, así como subproductos
derivados de su degradación (lipopolisacárido, fosfatasa alcalina…). Con la
cloración se garantiza la eliminación de las bacterias dañinas, pero en el agua
siguen quedando microorganismos no patógenos.
• Gases disueltos, como nitrógeno, oxígeno y dióxido de carbono.

Tipos de agua purificada

Por tanto, en la mayoría de los procedimientos que realizamos en un laboratorio de
bioquímica no utilizaremos el agua del grifo, sino agua purificada, en mayor o menor
medida, en función de la aplicación. En general, la calidad del agua va a ser valorada en
función de tres parámetros:
• La resistividad o conductividad eléctrica: directamente relacionada con la
cantidad de iones disueltos,
• El índice TOC (Carbono Orgánico Total), indicador de la contaminación
orgánica del agua, y
• La ausencia /presencia de partículas grandes, coloides y microorganismos.
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
26

Existes diferentes métodos de purificación del agua, que nos permitirán obtener agua
más o menos pura. Lógicamente, cuanto más pura sea, más costoso nos resultará. Por
tanto, con el objetivo de garantizar una calidad del agua adecuada para cada aplicación
concreta, y teniendo en cuenta tanto las necesidades técnicas como las económicas, se
han establecido tres tipos generales de agua purificada:

• Agua tipo 1 (ultrapura) para aplicaciones con mayor exigencia de purificación:

fase móvil de HPLC (High-Pressure Liquid Chromatography); ensayos en blanco
y dilución de muestras en cromatografía de gases, HPLC, AA (Atomic
Absorption), espectrometría de masas con ICP (Inductively Coupled Plasma)…;
preparación de disoluciones tampón y medios de cultivo para células de
mamíferos; preparación de reactivos en biología molecular: secuenciación de
ADN, PCR…; preparación de disoluciones para electroforesis y transferencia
(blotting)…
• Agua tipo 2 (purificada), la utilizada en las aplicaciones generales de
laboratorio, como preparación de disoluciones tampón y medios de cultivo
microbiológico, en los incubadores de cultivo celular, reactivos en general… y
para alimentar a los sistemas de purificación de agua de tipo 1.
• Agua tipo 3, el grado más bajo de agua purificada, que se utiliza para el
enjuagado de recipientes de vidrio, en los baños termostatizados y autoclaves,
y para alimentar los sistemas de agua de tipo 1.

La siguiente tabla muestra las especificaciones para los distintos tipos de agua (de
acuerdo con la empresa especializada en sistemas de purificación de agua para
laboratorio Millipore-Merck, http://www.millipore.com/):

Contaminante Parámetro y unidad Tipo 3 Tipo 2 Tipo 1

Iones Resistividad (MΩ.cm a >0,05 >1,0 >18,0
25°C)
Orgánicos TOC (ppb) <200 <50 <10
Lipopolisacárido (EU/ml) NA NA <0,03
Partículas Partículas > 0,2 µm NA NA <1
(unidades/ml)
Coloides Sílice (ppb) <1000 <100 <10
Bacterias Bacterias (ufc/ml) <1000 <100 <1
Tabla. Especificaciones para los distintos tipos de agua purificada (Millipore-Merck, http://www.millipore.com/)
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Técnicas de purificación del agua

Fundamentalmente, existen cinco formas de purificar agua: la destilación, el
intercambio iónico, la ósmosis inversa (RO), la adsorción en carbón activo, y la filtración
en membrana. Las tres primeras son las más aplicadas; a continuación, describiremos
brevemente sus fundamentos.

Destilación
La destilación es el método más antiguo, menos eficiente y del que se obtiene agua
menos pura (se llega a una resistividad de 1 MΩ⋅cm). Además, necesita bastante
mantenimiento, especialmente en zonas con agua dura, y debe ser almacenada
adecuadamente para evitar contaminación por microorganismos.
Consiste en provocar la evaporación del agua, pasando en forma de vapor a través de
un condensador en el que, gracias al agua de refrigeración, se enfría, condensa y se
recoge como agua líquida. Entre las principales limitaciones de este método destaca
que, además de no eliminar muchos de los iones inorgánicos, ni los compuestos
orgánicos con punto de ebullición inferior a 100°C, emplea grandes cantidades de agua
y energía, que hace que sea poco sostenible, tanto desde el punto de vista económico
como medioambiental.

Intercambio iónico
El proceso de intercambio iónico implica hacer pasar el agua a través de unas resinas
porosas, las resinas de intercambio iónico, en las que los iones del agua se intercambian
por los iones de la resina. Los dos métodos más frecuentes de intercambio iónico son la
descalcificación y la desionización. En la descalcificación se utilizan resinas que liberan
dos iones de sodio por cada ion calcio o magnesio que se retira del agua. Este método
se utiliza fundamentalmente como pretratamiento para reducir la dureza del agua que
se va a purificar mediante ósmosis inversa (RO). Las resinas de desionización
intercambian los cationes (Na+, Ca++, Al+++,…) y aniones (Cl− , NO3− , SO2−
4 , …) del agua por

iones de hidrógeno e hidroxilo respectivamente.

La desionización nos permite obtener agua pura en la que se han eliminado los iones en
gran medida, pero no es eficaz en la retirada de la mayoría de los compuestos orgánicos
y los microorganismos.
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
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La Ósmosis Inversa (RO, Reverse Osmosis)

Elimina eficazmente todo tipo de contaminantes, eliminando prácticamente (∼99%)
todas las partículas, microorganismos y moléculas con peso molecular por encima de los
200 Daltons. Los sistemas de purificación de agua mediante ósmosis inversa utilizan una
membrana semipermeable que además rechaza el paso de iones, a un lado de la cual se
coloca el agua a purificar, aplicando una presión hidráulica sobre el agua que hace que
esta pase a través de la membrana con un caudal proporcional a la presión aplicada. Una
de las limitaciones es precisamente el bajo caudal de salida que se puede conseguir. Es
necesario el pretratamiento del agua a purificar para evitar el daño de la membrana por
acumulación de depósitos de contaminantes rápidamente, o su rotura por la presencia
de partículas duras.

En general, tendremos que conocer las necesidades específicas en cada aplicación, y

utilizar el tipo de agua que mejor se adapta a esas necesidades. La empresa Merck
Millipore, parte de la compañía farmacéutica y química Grupo Merck, tiene una sección
especializada en la purificación de aguas. Podemos encontrar en su web información
muy útil sobre los sistemas actuales disponibles en el mercado, así como información
más general para ayudarnos a decidir el tipo de agua purificada que necesitamos
(http://www.merckmillipore.com/). Generalmente utilizaremos agua purificada o
ultrapura, con alguna una etapa final de filtración selectiva, de forma que se asegure la
eliminación de partículas, coloides y microorganismos, según las necesidades.

Antes de terminar este Tema 1, no olvide recordar los fundamentos sobre métodos
básicos de laboratorio que utilizaremos para la preparación y manejo de nuestras
muestras (R. Boyer, 2012. Capítulo 3, Sección A: pH, disoluciones tampón y biosensores,
y R. Boyer, 2012. Capítulo 3, Sección D: técnicas generales para la preparación de
muestras: diálisis, filtración, liofilización…), así como revisar el uso de radioisótopos en
bioquímica (R. Boyer, 2012. Capítulo 3, Sección E).

Dejamos para más adelante, cuando trabajemos con ácidos nucleicos y proteínas en el
Bloque 4, los métodos que podemos utilizar para su cuantificación en nuestras muestras
(R. Boyer, 2012. Capítulo 3, Sección B y C).
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Referencias utilizadas

- Rodney Boyer, 2010; Biochemistry Laboratory: Modern Theory and

Techniques (Second Edition); Editorial Pearson-Prentice Hall.
- David Freifelder, 1982; Physical Biochemistry. Applications to
Biochemistry and Molecular Biology, W. H. Freeman and Company.
- Keith Wilson & John Walker (Editores), 2010; Principles and Techniques
of Biochemistry and Molecular Biology (Seventh Edition); Editorial
Cambridge University Press.
- Pilar Roca, Jordi Oliver y Ana Mª Rodríguez, 2003; Bioquímica. Técnica y
Métodos; Editorial Hélice.
- How to Write and Publish a Scientific Paper. Rober A. Day & Barbara
Gastel (2011), 7th Ed., Greenwood.
- Cómo escribir y publicar trabajos científicos. Robert A. Day (2005) 3ª Ed.
en español. Organización Panamericana de la Salud (OMS). Publicación
Científica y Técnica No. 598.
- How to Write a Paper. Editado por G. M. Hall (2008). Blackwell Publishing.
BMJ Books, Wiley.
- Sistema de purificación de agua para aplicaciones de laboratorio;
Millipore-Merck, https://www.merckmillipore.com/.