UNIVERSIDAD DE CANTABRIA

Facultad de Medicina
Departamento de Biología Molecular

Estudio de la red de
regulación global de R388

Memoria presentada para optar al grado de Doctor por

Irene del Campo Gutiérrez
Santander, Enero 2016
El presente trabajo ha sido realizado en el Departamento de Biología Molecular
de la Universidad de Cantabria, bajo la dirección del Catedrático Fernando de la
Cruz Calahorra, gracias a una beca predoctoral FPI (de Formación de Personal
Investigador) concedida por el Ministerio de Educación y Ciencia durante los
años 2006-2010.
D. Fernando de la Cruz Calahorra, Catedrático de Genética de la Facultad de
Medicina de la Universidad de Cantabria,

CERTIFICA: Que Dña. Irene del Campo Gutiérrez ha realizado bajo mi

dirección el trabajo que lleva por título “Estudio de la red de regulación global de

R388”.

Considero que dicho trabajo se encuentra terminado y reúne los requisitos

necesarios para su presentación como Memoria de Doctorado, al objeto de poder
optar al grado de Doctor por la Universidad de Cantabria.

Santander, 22 de Enero de 2016

Fdo. Fernando de la Cruz Calahorra

 AGRADECIMIENTOS

Durante estos años ha pasado mucha gente por el laboratorio y cada uno de
ellos ha aportado su granito de arena a este trabajo. Por ello sería muy largo dar
las gracias uno a uno y, con lo despistada que soy yo seguro que me dejo a
alguien importante, así que a todos vosotros os digo: ¡muchas gracias!

Eso sí, no puedo pasar sin destacar a las personas que con las que he
compartido trabajo y que son responsables directas de que esta tesis haya salido
adelante. Raúl, mi jefecillo para la familia, que además de un gran compañero
ha sido casi como un codirector de tesis. Ana, que sin ella nunca hubiera
acabado este trabajo, por su ayuda, por sus ánimos, por todo. Carlos y Lillo,
compartir trabajo (y penas) con ellos ha sido un placer. Fernando (el jefe
supremo para la familia) por su ayuda y paciencia, que mira que hace años que
empezamos con esto. Yera por las jornadas maratonianas de laboratorio
compartidas, por todas las conversaciones y cervezas. Y, por supuesto, a Mapi
que siempre está ahí para todo lo que haga falta, desde darte de comer hasta
describirte todos los plásmidos del mundo. He tenido la suerte de compartir el
trabajo con ellos, de tenerles siempre dispuestos para ayudarme y compartir
buenos momentos tanto profesionales como personales. Gracias, de verdad.

Venga va, antes de que me riñan, a mis chicas del café que aunque ya deberían
saber ellas que tengo mil cosas por las que darles las gracias, sé que Sheila lo
primero que va a mirar de la tesis es esta página. Y a mi familia, que no tengo ni
que decírselo, pero si no fuese por ellos esto ni siquiera habría empezado.
A mi familia
INTRODUCCIÓN 3
1. CONJUGACIÓN BACTERIANA Y PLÁSMIDOS 3
1.1. Transferencia genética horizontal 3
1.2. La conjugación bacteriana 5
1.3. Plásmidos y grupos de incompatibilidad 8
1.4. El esqueleto IncW 13
1.5. El plásmido R388 como prototipo de la familia IncW 15
2. REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL 18
2.1. Motivos de red (Alon, 2007) 18
2.2. Redes de regulación en plásmidos 23
2.3. Estudio de la regulación transcripcional de R388 25
3. MEDIDA DE LA EFICIENCIA DE CONJUGACIÓN 29
OBJETIVOS 35
MATERIALES Y MÉTODOS 39
A. MATERIALES 39
1. CEPAS 39
2. MEDIOS DE CULTIVO, SELECCIÓN Y CONSERVACIÓN 40
3. OLIGONUCLEÓTIDOS 41
4. PLÁSMIDOS 43

B. MÉTODOS 47
1. MÉTODOS GENERALES DE BIOLOGÍA MOLECULAR 47
1.1. Extracción y purificación de DNA 47
1.2. Transformación 47
1.3. Amplificación de DNA: PCR 48
1.4. Digestiones enzimáticas 49
1.5. Ligaciones 49
1.6. Secuenciación de DNA 50
1.7. Electroforesis de DNA 50
1.8. Fijación de células 51
2. CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDOS 51
3. MÉTODO DE WANNER Y DATSENKO 53
4. CONJUGACIONES 55
4.1. Conjugaciones en filtro 55
4.2. Conjugaciones en placa 55
5. ENSAYOS CON FLUORESCENCIA 56
5.1. Determinación de la actividad transcripcional 56
5.2. Citometría de flujo 58
6. ENSAYOS DE ESTABILIDAD 59
7. MEDIDA DEL NÚMERO RELATIVO DE COPIAS DE PLÁSMIDO 60
8. TEORÍA: ESTIMACIÓN DE LA TASA DE CONJUACIÓN A TIEMPO FINAL (γ) 61
9. OBTENCIÓN DE CURVAS DE CRECIMEINTO Y CÁLCULO DEL TIEMPO DE
GENERACIÓN 63
10. PURIFICACIÓN DE ResP DE R388 64
11. ENSAYOS DE RETARDO EN GEL CON RESP (EMSA) 65

RESULTADOS 69
1. ESTUDIO DE LA REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DEL PLÁSMIDO R388 69
1.1. Determinación de la actividad transcripcional de los promotores de R388 69
1.2. Actividad de los promotores en presencia de R388 73
1.3. Obtención de un sistema de expresión controlada para los reguladores 75
1.4. Búsqueda combinatoria de reguladores transcripcionales en R388 77
1.5. Deleciones de R388 82
1.6. Aproximación a la caracterización de resP 85
1.7. Efecto de perturbaciones ambientales en la red 91
1.8. Actividad de los promotores en presencia de otros plásmidos genéticamente
parecidos a R388 97
2. APROXIMACIÓN AL ESTUDIO DEL FENOTIPO DE LOS IncW 100
2.1. Funcionamiento de la replicación: medida del número de copias por
cromosoma. 100
2.2. Ensayos de estabilidad del plásmido R388, plásmidos IncW y derivados
R388 102
2.3. Ensayos de conjugación 106
3. SISTEMATIZACIÓN DE LA MEDIDA DE LA CONJUGACIÓN 112
3.1. Puesta a punto de un ensayo de conjugación en el citómetro 112
3.2. Estimación de la cinética de conjugación del oriT de R388 117
3.3. Medida de la conjugación de plásmidos modelo por citometría 121
3.4. Comparación de la capacidad de propagación de los plásmidos modelo 124
DISCUSIÓN 131
1. LA RED DE REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DE R388 131
2. EFECTO DE LA VARIACIÓN EN EL GENOMA DE LOS IncW EN LA
REGULACIÓN Y EL FENOTIPO 138
3. MEDIDA DE LA CONJUGACIÓN EN EL CITÓMETRO 140

CONCLUSIONES 145
BIBLIOGRAFÍA 149
ANEXO PUBLICACIONES 159
INTRODUCCIÓN
 INTRODUCCIÓN

1. CONJUGACIÓN BACTERIANA Y PLÁSMIDOS

1.1. Transferencia genética horizontal

La transferencia genética horizontal (HGT) se define como la transmisión no-

genealógica de material genético de un organismo a otro (Goldenfeld & Woese, 2007).
Constituye un fenómeno más versátil que la propia reproducción ya que puede
producirse entre organismos que no se encuentren estrechamente emparentados
evolutivamente hablando, por lo que hace accesible al individuo gran cantidad de
información genética más allá del acervo genético propio de su especie. Debido a esta
versatilidad, la HGT constituye un fenómeno significativo, con gran importancia desde
el punto de vista genético, ecológico y evolutivo.

La HGT puede tener lugar entre distintos reinos en una u otra dirección,
habiéndose descrito este proceso entre bacterias (Jain, et al., 1999), desde bacterias a
arqueas y viceversa (Rest & Mindell, 2003) (Gophna, et al., 2004), desde arqueas a
eucariotas (Andersson, et al., 2005), desde bacterias a eucariotas (Watkins & Gray,
2006), desde eucariotas a bacterias (Guljamow, et al., 2007) e incluso entre eucariotas
(Nedelcu, et al., 2008).

Sin embargo, es en el mundo procariota donde los fenómenos de HGT cobran

especial importancia ya que contribuye a generar la diversidad genética de la que este
reino carecería por la falta de sexualidad, constituyendo el principal mecanismo de
evolución de los genomas como se deduce de los análisis filogéneticos (Jain, et al.,
1999). Por tanto, la presencia de procesos HGT tiene un papel importante en los
fenómenos de adaptación, especiación y evolución bacteriana (Gogarten & Townsend,
2005). La existencia de este flujo de información genética, por ejemplo, permite a los
procariotas compartir un pangenoma manteniendo un pequeño “core” genómico
conservado dentro de cada especie (Tettelin, et al., 2008). Hay datos que indican que
hasta un 24% del genoma de E.coli se ha obtenido por transferencia genética horizontal
(Lawrence & Ochman, 2002).

3
 Desde un punto de vista aplicado, hoy en día la HGT cobra especial importancia
debido a que estos mecanismos son responsables de la diseminación de los genes de
resistencia a antibióticos algo que actualmente se ha convertido en un importante
problema de salud a nivel mundial (de la Cruz & Davies, 2000).

Existen tres mecanismos principales por los que tiene lugar la HGT en el mundo
bacteriano que se resumen en la figura I1. Son los siguientes:

* Transformación. Se refiere a la entrada de DNA libre desde el medio ambiente a la

célula. La transformación no es un fenómeno ubicuo pero se produce de forma natural
en muchos géneros bacterianos (Acinetobacter, Synechocystis, Bacillus, Neisseria, o
Helicobacter). Para que tenga lugar, las bacterias deben estar en un estado de
competencia que puede ser inducido bajo ciertas condiciones ambientales. La
recombinación homóloga entre el DNA transformado y el genoma de la bacteria pueden
conducir a la adquisición de un nuevo fenotipo.

* Conjugación. Este proceso implica la transferencia de DNA (normalmente DNA

plasmídico) de una célula a otra mediante la formación de una estructura proteica entre
ambas llamada pilus conjugativo. Este mecanismo se explica con más detalle en el
apartado 2 de la introducción.

* Transducción. Es la transferencia de DNA mediante la infección por un bacteriófago.

En condiciones normales el fago solo contiene DNA vírico pero en ocasiones, cuando
se encapsidan los nuevos fagos, DNA del huésped es empaquetado en la cápsida vírica
dando lugar a un fago que transporta DNA bacteriano. Este fago puede entonces infectar
otra célula bacteriana e insertar el DNA celular que por recombinación homóloga puede
establecerse en el nuevo genoma bacteriano.

Figura I1. Mecanismos de transferencia

genética horizontal.
Se representan en esta figura los tres principales
mecanismos por los que se produce intercambio
de material genético en el mundo procariota: 1.
Transformación. Captación de DNA libre del
entorno. 2. Conjugación. Paso de una molécula
de DNA entre dos células que están en contacto.
3. Transducción. Transferencia de DNA por
medio de virus bacteriófagos.
Tomada de (Levy, 1998)

4
 Generalmente en los fenómenos de HGT, la transferencia de información
genética está mediada por lo que se conoce como “elementos genéticos móviles”
(MGEs). La primera referencia a los vehículos de transferencia genética horizontal la
encontramos en los años 40, cuando Barbara McClintock descubrió la existencia de
genes capaces de saltar de un cromosoma a otro, algo sorprendente porque rompía con
el dogma de la genética que predicaba que los cromosomas se heredan como unidades
discretas y estables. Por este descubrimiento Barbara McClintock, recibió el premio
Nobel en 1983. Distinguimos diferentes tipos de elementos:

a) Elementos transponibles. Son los “genes saltarines” descubiertos por Barbara

McClintock. Son segmentos de DNA capaces de moverse de una localización
genómica a otra. Incluye los transposones propiamente dichos y las secuencias de
inserción. En muchos casos estas regiones codifican genes de resistencia a
antibióticos, a metales pesados, o proteínas de degradación de compuestos
xenobióticos.

b) Plásmidos. Son moléculas de DNA extracromosómico de tamaño variable, que se

replican y transmiten de forma independiente al cromosoma. Están presentes
principalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como
las levaduras. La mayoría de los plásmidos son moléculas circulares de DNA de
doble cadena, aunque existen algunos casos de plásmidos lineales.
Aproximadamente la mitad de los plásmidos descritos en proteobacterias hasta la
fecha son capaces de transferirse de unas bacterias a otras, siendo la mitad de ellos
conjugativos (son capaces de movilizarse por sí mismos) y la otra mitad movilizables
(necesitan de la maquinaria de los plásmidos conjugativos para transferirse) (Smillie,
et al., 2010).

c) Fagos. Los fagos son los virus que infectan a las bacterias. Fueron descubiertos en
1913 por Frederick Twort y son los responsables de los procesos de transducción. A
pesar de ser ubicuos, se considera que la aportación que hacen a los fenómenos de
transferencia en su globalidad es la menos significativa.

1.2. La conjugación bacteriana

La conjugación bacteriana es un proceso de transferencia genética horizontal

mediante el cual se transfiere un plásmido trasmisible desde una célula donadora a una
célula receptora a través de un contacto célula-célula mediado por una estructura
proteica conocida como pilus. Este proceso está muy extendido entre las bacterias y va

5
más allá del mundo procariota, pudiendo ocurrir incluso entre especies muy alejadas
filogenéticamente. Por ejemplo, en condiciones de laboratorio se ha observado
transferencia de DNA conjugativo de bacterias a levaduras o a células de plantas
(Heinemann & Sprague, 1989). En la naturaleza un buen ejemplo de la versatilidad de
este proceso es el sistema de transferencia de DNA del género bacteriano
Agrobacterium al núcleo de células vegetales, mediante una maquinaria de
transferencia muy similar al aparato conjugativo de las bacterias Gram-negativas (Lessl
& Lanka, 1994).

Se sabe que la conjugación es el mecanismo de transferencia genética horizontal

que en mayor medida contribuye al reservorio de genes móviles en el mundo procariota
(De la Cruz y Davies, 2000) (Halary, et al., 2010). El DNA transferido por medio de la
conjugación puede recombinar e integrarse en el cromosoma si no es capaz de replicar
pero también puede ser autónomo, siendo capaz de replicar en la célula receptora, y
entonces no requiere de la existencia de un fenómeno de recombinación posterior para
estabilizarse en la célula que recibe la molécula, lo que aumenta la eficiencia de la
conjugación con respecto a los otros mecanismos de transferencia genética horizontal.
(Guglielmini, et al., 2011)

Las bases moleculares del proceso conjugativo han sido ampliamente estudiadas
debido a su importancia biológica. Por un lado este fenómeno presenta importantes
implicaciones desde el punto de vista evolutivo constituyendo un mecanismo que genera
variabilidad genética; por otro lado contribuye de manera determinante a la diseminación
de factores de virulencia (Ziebuhr, et al., 1999) y la propagación de genes de resistencia
a antibióticos (Mazel & Davies, 1999). Además, debido al peculiar procesamiento del
DNA que tiene lugar en la conjugación, se especula sobre la posibilidad de utilizar los
elementos que participan en este mecanismo como herramienta biotecnológica (Llosa
& de la Cruz, 2005).

La conjugación bacteriana fue descubierta por Lederberg y Tatum en 1946,

cuando al realizar estudios en E.coli con diversas auxotrofías observaron que los
caracteres podían transmitirse de unas a otras, revertiendo las dobles mutaciones a una
frecuencia mucho mayor de lo esperado por procesos puramente mutacionales
(Lederberg & Tatum, 1946). Por sus descubrimientos en este campo Tatum y Beadle
compartieron con Lederberg el premio nobel de medicina en 1958. El mecanismo
subyacente en este fenómeno no se descubrió hasta años después, cuando en 1953 se
propuso que esta transmisión estaba asociada a un factor que se denominó F (de
fertilidad) (Cavalli, et al., 1953) (Hayes, 1953). Este fue el primer plásmido conjugativo

6
que se descubrió, y se considera el prototipo de los estudios de conjugación. Pasaron
muchos años hasta que se descubrió que la conjugación es un mecanismo extendido
en la naturaleza, y que los plásmidos conjugativos están presentes en prácticamente
todos los microorganismos conocidos. Actualmente el número de plásmidos
conjugativos o movilizables que se descubren sigue creciendo día a día.

Hoy en día, se contempla la conjugación como la asociación de dos mecanismos

comunes en el entorno bacteriano, como son la replicación por círculo rodante (RCR) y
la presencia de un sistema de secreción de macromoléculas tipo IV (T4SS) (Llosa, et
al., 2002). Este modelo, conocido como “shoot and pump”, se ha convertido en poco
tiempo en el modelo aceptado para explicar este proceso biológico (figura I2). Implica la
participación de dos complejos proteicos multifuncionales, codificados por dos clusters
de genes: el responsable del procesamiento conjugativo del DNA (Dtr) y el de formación
del pilus conjugativo (Mpf); la conexión entre ambos sistemas se produce por medio de
la proteína acopladora (T4CP).

El modelo propone que el DNA es transportado a la célula receptora en dos pasos

diferenciados. Comienza con el reconocimiento de una secuencia de corte (sitio nic) en
una cadena del origen de transferencia del plásmido por la proteína conocida como
relaxasa, formándose el complejo nucleoproteico denominado relaxosoma en el origen
de transferencia. La relaxasa cataliza un corte sitio específico en el sitio nic del oriT y se
queda covalentemente unida al extremo 5’ de la cadena cortada. El complejo relaxasa-
ssDNA interacciona con la proteína denominada acopladora que actúa como una bomba
de DNA y guía la transferencia de la hebra a través del sistema de secreción hasta la
célula receptora. (figura I2)

1 2 3

4 5 6

7
 Figura I2. Conjugación bacteriana (modelo “shoot and pump”).
(1) La conjugación comienza cuando se ponen en contacto dos células bacterianas y una
de ellas lleva un plásmido conjugativo. (2) Se estabiliza el par conjugativo. (3) La relaxasa
corta una cadena del plásmido y se pone en contacto con el sistema de transporte. (4) El
complejo covalente relaxasa-ssDNA es transportado a la célula receptora. (5) Se
recirculariza el plásmido y se sintetiza la cadena complementaria. También en la célula
donadora se sintetiza la hebra desplazada por RCR. (6) Como resultado, cada una de las
células se queda con una copia del plásmido original.

A pesar de ser un fenómeno ampliamente estudiado, actualmente aún

permanecen sin respuesta varias cuestiones fundamentales sobre el proceso
conjugativo como por ejemplo las señales que desencadenan el comienzo de la
transferencia conjugativa, la coordinación espaciotemporal del procesamiento del DNA
o su reclutamiento hacia el poro conjugativo, etc.

1.3. Plásmidos y grupos de incompatibilidad

El estudio de la conjugación bacteriana ha llevado siempre parejo el estudio de

los plásmidos. Como hemos visto, un plásmido es generalmente una molécula circular
de DNA extracromosómico de tamaño variable que tiene capacidad de replicación
autónoma. Del puñado de plásmidos que se estudiaban inicialmente hemos pasado a
más de 6000 totalmente secuenciados. Están presentes en la práctica totalidad de los
géneros bacterianos conocidos y presentan una enorme variedad.

Dentro de esta variedad, desde un punto de vista fisiológico los plásmidos

comparten una serie de funciones que, aunque no son universales, podemos decir que
son comunes. Las funciones que habitualmente se asignan a los plásmidos son:

* Replicación: La función de replicación es la función común que comparten todos los

plásmidos, de hecho está implícito en su propia definición. En general, los elementos
genéticos necesarios para la replicación de un plásmido y el control de su número de
copias se encuentran agrupados en una misma región del genoma, a la que se
denomina replicón. Diferenciamos tres tipos básicos de mecanismos de replicación:
replicación por círculo rodante, replicación por desplazamiento de hebras o replicación
Tetha (θ) (del Solar, et al., 1998).

* Mantenimiento estable: Replicarse dentro del citoplasma de un hospedador a

menudo no es suficiente para sobrevivir. La división celular trae consigo el problema de
la segregación (hay que dotar a las dos células hijas de copias de plásmido) y para ello
los plásmidos han desarrollado varias estrategias. Los plásmidos con bajo número de

8
copias suelen codificar sistemas de estabilidad destinados a asegurar una correcta
segregación entre las células hijas, mientras que los plásmidos con alto número de
copias muchas veces confían en una distribución estocástica. Los sistemas de
mantenimiento o herencia estable constituyen un conjunto de herramientas moleculares
que los plásmidos utilizan para asegurarse de que la probabilidad de que se generen
bacterias libres de plásmido en la división celular sea muy baja o de que las pocas que
se generen sean eliminadas de la población. Existen tres grupos de mecanismos de
herencia estable: los sistemas de resolución de multímeros, los sistemas de adicción
molecular y los sistemas de partición activa (Zielenkiewicz & Ceglowski, 2001).

* Transferencia: Además de ser capaces de replicarse y mantenerse de forma estable

dentro de un hospedador muchos plásmidos son capaces de transferirse, esto es, de
pasar de un hospedador a otro. Como ya se ha dicho, el modelo actual del mecanismo
conjugativo se basa en la confluencia de dos procesos distintos: un sistema de
transporte de macromoléculas y un sistema de movilización del DNA plasmídico.
Podemos diferenciar entre plásmidos conjugativos, en los que las proteínas encargadas
del proceso de transporte del plásmido son codificadas por él mismo, plásmidos
denominados movilizables que solo contienen la región de movilización y utilizan el
sistema de secreción codificado por otros plásmidos y plásmidos no movilizables.

Además de estas tres funciones generales, los plásmidos a menudo confieren a

sus hospedadores características fenotípicas tales como resistencias a antibióticos o la
capacidad de metabolizar compuestos que en determinadas circunstancias constituyen
una ventaja adaptativa para células que contienen el plásmido.

Como ya se ha comentado, no todos los plásmidos poseen los mismos sistemas

para el desarrollo de sus funciones fisiológicas existiendo plásmidos conjugativos,
movilizables o no conjugativos, plásmidos con amplio rango de hospedador o
específicos de un solo género o especie bacteriana, plásmidos con alto número de
copias o bajo, etc. Por ello, a medida que ha ido aumentando el número de plásmidos
conocidos clasificarlos de alguna forma que permita hacer generalizaciones ha sido uno
de los problemas fundamentales de la biología de plásmidos.

Los primeros intentos de clasificación de los plásmidos se basaron en su

capacidad de conferir al hospedador propiedades como la resistencia a antibióticos,
sensibilidad a fagos, o la producción de bacteriocinas. La incapacidad de analizar sus
características genéticas hacía imposible distinguir, a comienzos de la investigación en
genética bacteriana, más allá de unas pocas características fenotípicas.

9
 El primer criterio aplicado en la clasificación de plásmidos estaba relacionado con
la transferencia conjugativa. En sus investigaciones sobre los factores de resistencia a
antibióticos Watanabe descubrió que ciertos plásmidos eran capaces de inhibir la
transferencia de F cuando corresidían en la misma célula donadora. Suponiendo que
ésta era una propiedad fundamental, dividió a los plásmidos en dos grupos (fi+ y fi-) en
función de si inhibían o no la fertilidad del plásmido F (Watanabe, 1963). Más adelante
Meynell y Datta demostraron que esta característica estaba relacionada con el tipo de
pilus sexual que producía el plásmido (Datta, et al., 1966), designando los dos primeros
grupos de incompatibilidad: la clase F (fi+) y la clase I (fi-). La aparición de nuevos tipos
de pili sexual y el descubrimiento de plásmidos no conjugativos hicieron que la
clasificación basada en la inhibición de la fertilidad de F quedase obsoleta, por lo que
se buscó un método alternativo.

Se definió entonces el término incompatibilidad, para designar la incapacidad de

ciertos plásmidos de corresidir en el mismo hospedador. Se suponía que la
incompatibilidad era un signo de proximidad: la presencia de mecanismos comunes de
control de la replicación o de partición hacen que dos plásmidos sean incompatibles. La
clasificación basada en la incompatibilidad fue desarrolla principalmente por Datta y
Hedges a comienzo de los años 1970s. Aquellos plásmidos que resultaban ser
incompatibles entre sí se asignaron a un mismo grupo de incompatibilidad, llegando a
establecerse hasta 27 grupos de incompatibilidad en enterobacterias, 14 en
Pseudomonas y unos 15 en Staphylococcus (Shintani, et al., 2015).

Que dos plásmidos incompatibles tienden a ser más cercanos es una regla que
generalmente se cumple, no obstante, el fenómeno de la incompatibilidad es complejo:
los mecanismos por los que se produce son variados y en ocasiones mutaciones
puntuales en los orígenes de replicación hacen a dos plásmidos compatibles, aunque
compartan una extensa identidad de secuencia (Wilson & Figurski, 2002). Los
problemas asociados con la definición de plásmidos incompatibles (distintos
mecanismos de incompatibilidad, exclusión de superficie, plásmidos con varios
replicones, etc…) y sus dificultades técnicas, han hecho que el método tradicional de
clasificación esté actualmente en desuso, habiendo sido sustituido por el tipado del
replicón o la comparación directa entre las secuencias de DNA (Couturier, et al., 1988).
No obstante, la terminología de grupos de incompatibilidad sigue siendo usada
habitualmente en la literatura, especialmente en aquellos grupos en los que existe una
buena correlación entre la identidad de secuencia y el grupo de incompatibilidad (grupos
IncF, IncP, IncN, IncW, etc...).

10
El complejo IncF

El complejo IncF comprende siete grupos de incompatibilidad (IncFI-IncFVII) que

agrupan una serie de plásmidos propios de enterobacterias. Originalmente formaron un
único grupo de incompatibilidad, debido a que todos mostraban sensibilidad a los
mismos fagos. Dicha sensibilidad está producida por el pilus conjugativo, por lo que
todos los plásmidos del complejo de F comparten un sistema conjugativo común. El pilus
sexual producido por los plásmidos F es flexible y fino, retráctil y capaz de mediar la
conjugación en medio líquido. Poseen sistemas Dtr similares a los de los grupos de
incompatibilidad IncN e IncW.

Respecto al resto de caracteres, los plásmidos de tipo F constituyen un conjunto

heterogéneo y, con la salvedad de los grupos IncFI e IncFII, poco caracterizado. Su
mecanismo de replicación es variable, pudiendo tener más de un replicón, y lo mismo
ocurre con los sistemas de herencia estable.

El grupo de incompatibilidad IncN

La clase IncN comprende varios plásmidos de amplio rango de hospedador que

comparten una gran homología de secuencia (Konarska-Kozlowska & Iyer, 1983) y que
tienen un sistema conjugativo muy similar al de los plásmidos IncW, aunque difieren de
estos en sus funciones de replicación y herencia estable. La replicación de los plásmidos
IncN es de tipo Theta, su prototipo, pCU1, contiene tres orígenes de replicación distintos,
uno pol-I dependiente y otros dos independientes (Zoueva, et al., 2003). No se ha
descrito ningún sistema de partición activa, aunque cuentan con un sistema de adicción
molecular de tipo C (ccgC) (Belogurov, et al., 1992) y un sistema de resolución de
multímeros del grupo de las serín-recombinasas (per). Además, en pKM101 se ha
descrito la participación en estabilidad del locus stbABC (Paterson, et al., 1999)

El grupo de incompatibilidad IncP

El grupo de incompatibilidad IncP de enterobacterias, que se corresponde con el

grupo IncP-1 en Pseudomonas, comprende una gran cantidad de plásmidos de amplio
rango de hospedador. En este grupo se han descrito actualmente hasta doce
subdivisiones (α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ, κ) (Norberg, et al., 2014) aunque las más estudiadas
son IncPα e IncPβ, cuyos representantes principales son RP4/RK2 y R751,
respectivamente. Ambas subfamilias comparten los mecanismos de replicación,
partición y transferencia, presentando diferencias en los transposones y marcadores de

11
resistencia que portan así como en algunas funciones de la región de herencia estable
(Schluter, et al., 2007).

Los plásmidos IncP son capaces de replicar en la práctica totalidad de las

bacterias Gram-negativas, siendo capaces de transferirse por conjugación a bacterias
Gram-positivas y a células eucariotas (Heinemann & Sprague, 1989). Sus mecanismos
de replicación, partición, transferencia y red de regulación han sido exhaustivamente
estudiados, por lo que constituyen uno de los grupos de incompatibilidad mejor
conocidos. Tienen un bajo número de copias (5-7) y su replicón es de tipo Theta pol-
independiente. Los plásmidos IncPα poseen sistemas de partición activa, resolución de
multímeros y adicción molecular, mientras que los IncPβ carecen de los dos últimos
sistemas. En cuanto a su sistema de transferencia, los plásmidos IncP codifican un pilus
sexual grueso y rígido, y solo conjugan con buena eficiencia sobre medio sólido.
(Bradley, 1980)

El grupo IncW

Los plásmidos IncW toman su nombre de su descubridor, T. Watanabe, quien

describió el primer miembro de este grupo, el plásmido pSa (Watanabe, et al., 1968).

El grupo de incompatibilidad IncW engloba dos tipos básicos de plásmidos que,

además de mantener un sistema común de replicación (y probablemente por ello ser
incompatibles) tienen poco que ver a nivel evolutivo. Por un lado encontramos plásmidos
“tipo pSa/R388”, que mantienen una identidad de secuencia cercana al 100% en el
armazón genético básico, diferenciándose en los transposones y secuencias de
inserción presentes en sus genomas. Por otro lado encontramos plásmidos cuya
homología respecto a R388 se restringe a la proteína Rep. Estos plásmidos pertenecen
al grupo de incompatibilidad porque son de hecho, incompatibles con los plásmidos “tipo
R388”, pero desde un punto de vista evolutivo no pueden considerarse miembros de
una misma familia (Fernandez-Lopez, et al., 2006).

Los plásmidos IncW reunían algunas características que los hacían un interesante
modelo de estudio: fueron durante mucho tiempo los plásmidos conjugativos conocidos
de menor tamaño, tienen un amplio rango de hospedador y en el caso de pSa se
demostró que posee la habilidad inusual de inhibir la oncogenicidad del plásmido pTi de
Agrobacterium tumefaciens (Close & Kado, 1991).

Estudios tempranos en pSa, R388 y R7K (Bradley & Cohen, 1976) determinaron
que los pili IncW son filamentos rígidos, de 10–12nm de ancho, con una longitud media

12
de unos 450 nm. En los géneros Escherichia, Salmonella, Shigella y Pseudomonas, el
pilus W está presente a una frecuencia media de hasta 3 pili por célula. Junto a los
plásmidos IncP e IncN se los considera a los IncW prototipo de los plásmidos
conjugativos que conjugan preferentemente sobre medio sólido, presentando baja
eficiencia de conjugación en líquido (a diferencia de las clases IncF, IncH e IncI, que son
capaces de conjugar con alta eficiencia en medio líquido).

1.4. El esqueleto IncW

T. Watanabe describió en 1968 el primer miembro de la familia IncW, el plásmido

pSa aislado de Shigella (Watanabe, et al., 1968). Algo después, Hedges & Datta (Datta
& Hedges, 1971) en E. coli y Kontomichalou (Kontomichalou, 1971) en Providencia
rettgeri aislaron R388 y R7K respectivamente. Aunque posteriormente se fueron
describiendo otros plásmidos pertenecientes al grupo IncW ((Datta & Hedges, 1972);
(Coetzee, et al., 1972); (Pattishall, et al., 1977); (Shinagawa, et al., 1982); (Dorokhina &
Korotiaev, 1984)) solo estos tres fueron caracterizados físicamente y son los integrantes
“clásicos” de la familia IncW.

De los tres plásmidos IncW caracterizados originalmente tan solo pSa y R388
fueron estudiados posteriormente. Los estudios sobre el mecanismo de conjugación de
esta familia se llevaron a cabo principalmente en R388, mientras que el plásmidos pSa
fue utilizado fundamentalmente en estudios sobre el mecanismo de inhibición de la
oncogenicidad del pTi y del replicón IncW. Actualmente R388 es el miembro del grupo
estudiado en más detalle y su secuencia completa se ha empleado para inferir muchas
de las características de la familia (Fernandez-Lopez, et al., 2006).

Aunque sus principales representantes fueron identificados en enterobacterias, se

han encontrado plásmidos IncW en gran cantidad de géneros de proteobacterias
(Fernandez-Lopez, et al., 2006), aunque su distribución natural y epidemiología ha sido
poco estudiada, por lo que se desconoce su incidencia en poblaciones naturales.

La realización de experimentos de producción de heteroduplex y análisis por

microscopía electrónica, junto con el mapeo por enzimas de restricción, pusieron de
manifiesto la existencia de una alta identidad de secuencia entre estos plásmidos,
excepto por la existencia de ciertas zonas no homólogas que fueron atribuidas a los
distintos determinantes de resistencia a antibióticos que poseen (Gorai, et al., 1979).
Más adelante, la comparación de las secuencias disponibles en la bases de datos para
pSa ((Close & Kado, 1991), (Close & Kado, 1992); (Okumura & Kado, 1992); (Belogurov,

13
et al., 2000)), R7K (GeneBank AM901564) y R388 (GeneBank BR000038) puso de
manifiesto que los plásmidos IncW mantienen una identidad a nivel de secuencia del
DNA superior al 95%.

El análisis de secuencia y la utilización de un array desarrollado en el laboratorio

han permitido el estudio de la evolución y diversidad del armazón IncW. Los datos
obtenidos muestran un alto grado de conservación de secuencia y la presencia de
inserciones recientes de elementos genéticos móviles, lo que parece indicar que el
grupo IncW es una familia homogénea y relativamente joven de plásmidos. (Revilla, et
al., 2008)

En este trabajo se analizaron las secuencias de pSa, R7K y R388 disponibles en

las bases de datos, junto con los datos obtenidos de la secuenciación y análisis de dos
IncW aislados más recientemente, pIE321 y pIE522. De los cinco plásmidos analizados
R388, pSa y pIE522 son plásmidos prácticamente idénticos, con un 100% de homología
de secuencia en las zonas de armazón analizadas y un integrón insertado exactamente
en el mismo punto, mostrando diferencias únicamente en los genes de resistencia
incluídos en dicho integrón. R7K y pIE321, sin embargo, evolutivamente hablando,
debieron separarse antes, no tienen integrón sino otros MGEs insertados en su genoma
y muestran una homología de secuencia un poco más baja, de alrededor del 97%, con
pequeñas pero significativas diferencias en el armazón, las más llamativas en la zona
correspondiente a trwA (Revilla, et al., 2008).

14
 Figura I3. Estructura del armazón y diferentes inserciones de MGEs en los cinco
IncW analizados (R388, pSa, pIE522, pIE321 y R7K).

Los distintos elementos que componen el armazón IncW se muestran en blanco y negro,
mientras que los genes específicos de cada uno de los plásmidos aparecen destacados
en colores. Tomado de (Revilla, et al., 2008).

Como se muestra en la figura I3, todas estas inserciones de MGEs en los distintos
plásmidos se encuentran en la zona correspondiente a las funciones identificadas como
de mantenimiento estable del plásmido, no afectando en ningún momento a los genes
de la región tra. Además, estas inserciones no producen grandes reorganizaciones en
el armazón, conservándose en todos los casos la sintenia. En el caso de los plásmidos
con el integrón In1 (R388/pSa/pIE522) éste se encuentra insertado en el CDS36. En el
caso de los otros dos plásmidos, en R7K las inserciones afectan a los genes nuc, osa y
klcB, mientras que en pIE321 las inserciones afectan al extremo terminal de ardK.

1.5. El plásmido R388 como prototipo de la familia IncW

R388 constituye el elemento central de trabajo de nuestro grupo y de este trabajo.

Es un plásmido perteneciente al grupo de incompatibilidad IncW que fue aislado
originalmente en E. coli (Datta & Hedges, 1971). Se trata de un plásmido de amplio
rango de hospedador, habiéndose comprobado la transferencia de R388 a diferentes
especies de proteobacterias como Salmonella typhimurium, Shigella flexneri,
Pseudomonas aeruginosa (Bradley & Cohen, 1976) y A. tumefaciens (Loper & Kado,
1979). Codifica para las resistencias a sulfonamida y trimetoprim (Datta & Hedges, 1972)
y produce unos pili rígidos (Bradley, 1980) que hacen que se transfiera mejor en medio
sólido que en líquido.

Se conoce la secuencia completa del plásmido (GenBank accession no.

BR000038), lo que ha permitido el estudio detallado de su organización genética. Es
uno de los plásmidos conjugativos más pequeños estudiados, consta de 33913 pb y se
han identificado 43 hipotéticos ORFs mayores de 50 aminoácidos (Fernandez-Lopez, et
al., 2006). En base a la homología con bases de datos y/o datos experimentales, se ha
atribuido una función a cada uno de estos ORFs excepto a 6 de ellos. La estructura
genética del plásmido es compacta, con una pronunciada ausencia de regiones no
codificantes excepto por dos repeticiones directas de 558 pares de bases (Ldr1 y Ldr2).

15
 korA orf34 korB orf5 qacEdelta1
trwN sulI
trwL orfA
dhfr
trwM int
intI1
trwK tnpM
resP
trwJ repA
eex
OriV Integrón, resistencia a antibióticos
trwI kfrA
Replicación
trwH nuc1
trwG R388 Estabilidad y mantenimiento
nuc2
trwF 33926 pb osa Orígenes de transferencia y replicación
Ldr1 Procesamiento conjugativo del DNA (Dtr)
trwE
ardC Formación del pilus conjugativo (Mpf)
trwD orf7
orf8
orf9
ssb
trwC
ardK
trwB Ldr2
trwA stbA orf14 orf12
klcb Región replicación
Región conjugación oriT stbB
stbC y mantenimiento

Figura I4. Mapa genético del plásmido R388.

Se representan los genes identificados en R388 (con una flecha que indica el sentido de
la transcripción). Los orígenes de replicación (oriV) y transferencia (oriT) están
representados como rectángulos. Se ha dividido el plásmido en regiones funcionales, y se
le ha asignado un color a cada una de ellas. En la leyenda se detalla el código de colores
que se ha utilizado. Modificado de (Fernandez-Lopez, et al., 2006).

En base a las funciones asignadas a los ORFs, los genes de R388 se dividen en
5 grupos funcionales que se localizan en regiones discretas del genoma que
denominamos módulos. Estos módulos se organizan en dos sectores mayores: un
sector contiene las funciones de mantenimiento general del plásmido (fondo azul en la
figura I4) y el otro contiene los genes dedicados a la conjugación (fondo rojo en la figura
I4); en gris se acota la región correspondiente al integrón.

Las funciones de mantenimiento general están dedicadas a la supervivencia del

plásmido en el hospedador y se encuentran divididas en tres módulos principales:
replicación, estabilidad y establecimiento en el hospedador. La zona de conjugación
ocupa 14,9 Kb, está dividida en la región de transferencia y replicación del DNA (Dtr)
que contiene los ORFs implicados en el metabolismo conjugativo del DNA, y la de
formación del poro conjugativo (Mpf) que incluye los genes implicados en formar el pilus
de conjugación.

El análisis filogenético de los ORFs del plásmido revela la existencia de un gran

mosaicismo genético. En los módulos de la región de mantenimiento estable, nos
encontramos con ORFs de distinto origen agrupados dentro del mismo operón, dando
lugar organizaciones genómicas no conservadas en ningún otro grupo de plásmidos

16
fuera de los IncW. Cada gen presenta historias evolutivas distintas y se habrían
incorporado al genoma a tiempos diferentes, procedentes de fuentes diferentes
(Fernandez-Lopez, et al., 2006).

R388 es un plásmido de bajo número de copias, que presenta de 2 a 3 copias por

célula. El replicón de R388 está formado por oriV más un operón que contiene dos ORFs
resP y repA. resP codifica para una proteína de 218 aa homóloga de la resolvasa del
transposón Tn21 (24% identidad), mientras que RepA, de 323 aa, corresponde a la
proteína iniciadora de la replicación (Fernandez-Lopez, et al., 2006). La replicación de
R388 funciona de manera bidireccional desde el origen lo que, junto con la presencia de
una zona de iterón en oriV compuesta por 6 repeticiones directas de 15 bp, sugieren un
mecanismo θ de replicación (del Solar, et al., 1998).

Dado que R388 tiene solo 2-3 copias por célula, parece poco probable que el
plásmido carezca de sistemas que garanticen su correcta segregación, sin embargo, en
el análisis de la secuencia no se identificaron ATPasas características de ninguno de
los principales sistemas de estabilidad, ni tampoco ninguna evidencia de locus toxina-
antitoxina, encontrándose únicamente un sistema de resolución de dímeros codificado
por la resolvasa ResP. Se han identificado algunos genes sueltos que codifican para
homólogos de proteínas conocidas por jugar un papel secundario en distintos sistemas
de herencia estable (kfrA, nuc1, nuc2 y osa) y que se encuentran agrupados en un
mismo operón (Chen & Kado, 1994) y sería posible que estos genes junto con algunos
situados en su vecindad constituyan algún tipo de sistema de herencia estable aun no
conocido. En los últimos años, el trabajo llevado a cabo por Guynet et al (Guynet, et al.,
2011) sugiere que el operón stbABC de R388 tiene un papel importante en la estabilidad
del plásmido, constituyendo un sistema atípico de estabilidad ligado a la transferencia
conjugativa. StbA es una proteína de unión al DNA (ParB-like) que es estrictamente
necesaria para la estabilidad de R388. Se une a una serie de iterones presentes en el
plásmido (IT-B) y se cree que podría actuar emparejando el plásmido al cromosoma
para utilizar de forma indirecta el sistema de partición bacteriano. StbB tiene un motivo
ATPasa de tipo Walker (ParA-like) pero no parece ser necesaria para la estabilidad del
plásmido, sin embargo, se ha visto que favorece la conjugación. Se ha propuesto que el
sistema StbA-StbB pueda actuar como un interruptor entre los mecanismos de
transferencia vertical y horizontal, constituyendo la primera evidencia de interrelación
entre los procesos de segregación y conjugación plasmídica (Guynet, et al., 2011).

17
2. REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL

De los distintos pasos en los que es controlado el flujo de información desde un

gen a su correspondiente proteína, la regulación transcripcional es un mecanismo
fundamental observado en todos los organismos. Esta forma de regulación, típicamente
está mediada por una proteína de unión al DNA (factor de transcripción) que se une a
sitios de unión en el genoma (operadores) y, ya sea solo o en combinación con otros
factores, regula la expresión de uno o más genes diana. La suma total de las
interacciones transcripcionales en un organismo pueden ser conceptualizadas en forma
de red, es a lo que se denominada red de regulación transcripcional. En dicha red los
nodos representan los genes y los vectores representan las interacciones regulatorias
(de activación o represión) que ejerce el producto de un gen sobre otro.

Las entradas (inputs) a la red son señales que llevan información de condiciones
del medio externo o de la concentración de los propios componentes de la red, mientras
que las salidas (outputs) son respuestas, producidas por variaciones en la tasa de
transcripción de un conjunto de genes dado. En definitiva, la red es un sistema de
procesamiento de la información, tanto interna como externa, que se encuentra
continuamente ajustando la tasa de síntesis de los componentes de la maquinaria
celular en base a las señales que recibe (Albert, 2005).

Se ha encontrado que las redes de transcripción presentan en sus interacciones

una serie de circuitos recurrentes a los que se ha denominado motivos de red. Se
describieron por primera vez en la red de regulación de E. coli, donde se detectó que
existían patrones que se repetían con mucha más frecuencia de lo que sería esperable
en una organización aleatoria (Shen-Orr, et al., 2002). Posteriormente los mismos
motivos han sido encontrados en distintos organismos, desde bacterias y levaduras
(Eichenberger, et al., 2004) (Lee, et al., 2002) a plantas y animales (Boyer, et al., 2005)
(Milo, et al., 2004). Cada motivo de red presenta distintas funciones de procesamiento
de la información que han sido analizadas mediante el empleo de modelos matemáticos
y experimentos en célula viva.

2.1. Motivos de red (Alon, 2007)

a) Regulación simple.

El ejemplo más sencillo de interacción transcripcional tiene lugar cuando un factor

de transcripción Y, normalmente activado por una señal S, regula un gen X sin

18
interacciones adicionales. Cuando comienza la transcripción, la concentración del gen
X aumenta hasta alcanzar un estado estacionario cuyo nivel será igual a la proporción
entre las tasas de producción y degradación del sistema. El tiempo de respuesta del
sistema, que es definido como el tiempo que lleva alcanzar la mitad entre los niveles
inicial y final, es igual a la vida media del producto génico de manera que cuanto mayor
sea la tasa de degradación menor será el tiempo de respuesta. En el caso de proteínas
que no sean activamente degradadas, el tiempo de respuesta será el correspondiente
a un tiempo de generación.

Dentro de los sistemas de regulación simple existen otros motivos en los que el
factor de transcripción actúa controlando su propia producción estableciéndose una
autorregulación que podrá ser positiva o negativa según se trate de un activador o un
represor.

Figura I5. Motivos de regulación simple.

Representación esquematizada de los tipos de regulación simple: a) regulación simple, b)
autorregulación negativa y c) autorregulación positiva. La gráfica d) muestra las
diferencias en el tiempo de respuesta de cada uno de los motivos esquematizados: en azul
la regulación simple, en verde autorregulación negativa y en rojo autorregulación positiva.
Tomado de (Alon, 2007).

* Autorregulación negativa (NAR): en este caso un factor de transcripción X reprime

su propia síntesis (Figura I5). Este motivo de red se encuentra aproximadamente en la
mitad de los represores en E. coli así como en muchos represores eucariotas. Presenta
dos propiedades importantes: acelera el tiempo de respuesta de los circuitos genéticos
y reduce las variaciones célula - célula de los niveles de producción de la proteína. Una
demostración de la aceleración del tiempo de respuesta en un contexto natural se llevó
a cabo en el sistema SOS de reparación del DNA de E. coli cuyo regulador central LexA
reprime su propio promotor (Camas, et al., 2006).

19
* Autorregulación positiva (PAR): tiene lugar cuando un factor de transcripción activa
su propia producción (Figura I5). Los efectos en este caso son los contrarios a los del
NAR: los tiempos de respuesta se ralentizan y se aumenta la variabilidad, pudiendo
producirse distribuciones bimodales.

b) Feedfoward loops (FFL)

La segunda familia de motivos de red consiste en un circuito con tres genes: un

regulador X que regula a otro regulador Y y un gen Z regulado por ambos (X e Y). Dado
que cada una de las interacciones del circuito puede ser de activación o represión, hay
8 posibles tipos de FFL (4 coherentes y 4 incoherentes) (Figura I6). En las redes de
regulación de E. coli y levaduras, se ha encontrado que dos de los 8 FFL posibles
ocurren con mucha más frecuencia que los otros seis: el FFL coherente 1 (C1-FFL) y el
FFL incoherente 1 (I1-FFL).

Figura I6. Feedforward loops.

a) Representación esquematizada de los 8
tipos de FFL. En los coherentes, el signo
de la interacción directa X-Z es el mismo
que el signo global de la interacción
indirecta a través de Y, mientras que en los
incoherentes presentan signos contrarios.
b) Representación del C1-FFL con lógica
AND y el I1-FFL también con lógica AND.
Tomado de (Alon, 2007).

* C1-FFL: en este caso X e Y actúan como activadores transcripcionales del gen Z.

Cuando funciona con una función de entrada AND, el C1-FFL actúa como un filtro de
activación mientras que cuando la función es OR ocurre al contrario y funciona como un

20
filtro de desactivación. La presencia de un filtro de activación producirá un retraso en el
desencadenamiento de la respuesta tras la aparición de la señal S (adición de S; señal
ON) pero no habrá ningún retraso cuando ésta se elimina (eliminación de S; señal OFF)
lo que permite evitar que se produzca la respuesta ante pequeños pulsos espurios de
señal. Un filtro de desactivación, por el contrario, no genera retraso tras la aparición de
la señal sino al desaparecer ésta, evitando en este caso que el sistema se desactive en
respuesta a pérdidas momentáneas de la señal.

Las propiedades de este motivo han sido demostradas experimentalmente en el sistema

de utilización de arabinosa de E. coli (Mangan & Alon, 2003) donde se observa un
retraso de unos 20 minutos en la activación del sistema tras la administración de la señal
cAMP pero no tras su eliminación. El estudio del sistema con una lógica OR se ha
llevado a cabo en el sistema del flagelo de E. coli (Kalir, et al., 2005); en este caso se
comprobó que el FFL prolongaba la expresión de los genes del flagelo un tiempo
después de desaparecer la señal.

* I1-FFL: este motivo presenta las propiedades de actuar como un generador de pulsos
y acelerador de respuesta. En este caso los dos brazos del FFL actúan en oposición de
manera que X activa Z pero al mismo tiempo lo reprime a través de Y.

Su capacidad para generar pulsos ha sido demostrada mediante la construcción de un

I1-FFL sintético, donde el activador LuxR (X) producía la activación de un reportero GFP
(Z) y el represor λ C1 (Y) que, a su vez, reprimía el promotor Z (Basu, et al., 2004). La
capacidad para acelerar respuestas de este motivo se ha observado experimentalmente
en el sistema de utilización de galactosa de E. coli (Mangan, et al., 2006).

Los FFL ocasionalmente pueden integrar motivos NAR y PAR, generalmente en el

regulador Y. La presencia de estos lazos regulatorios puede contribuir a acelerar o
retrasar el tiempo de respuesta, potenciando de esta manera el comportamiento del
FFL. También podemos encontrar FFL con salida múltiple, en los que X e Y regulan
simultáneamente a varios Z. En este caso se pueden llegar a generar patrones
temporales de activación e inactivación de los genes mediante el establecimiento de
una jerarquía en los umbrales de respuesta de los distintos promotores, algo que se
comprobó experimentalmente en los genes del flagelo de E. coli (Kalir & Alon, 2004).

c) Módulos de entrada simple (SIM)

En un motivo SIM un regulador X controla la transcripción de un grupo de genes

diana y además, normalmente X regula su propia síntesis (Figura I7). La principal

21
función de este motivo de red es permitir la expresión coordinada de un grupo de genes
con función compartida, pudiendo generar programas de expresión temporal de manera
similar al FFL de salida múltiple.

Figura I7. El módulo de entrada simple (SIM)

Representación esquemática de un SIM y un ejemplo, la regulación del sistema de
biosíntesis de arginina. Tomado de (Alon, 2007).

La propiedad más interesante de este motivo es su capacidad para generar un

programa de expresión temporal, con un orden definido de activación para cada
promotor diana. De acuerdo a las distintas constantes de unión que el factor de
transcripción X tenga por cada uno de los promotores, activará o desactivará sus genes
diana en un orden concreto, a medida que su concentración aumenta. De manera
inversa, cuando la señal desaparece y las concentraciones de X comienzan a decrecer,
la inactivación comienza por los promotores con una mayor constante de disociación y
termina por el promotor con la constante más baja. A este tipo de orden se le denomina
last-in-first-out (LIFO): el último que entra, es el primero que sale (Alon, 2006). Este
diseño participa en la regulación de la transcripción de rutas metabólicas (Zaslaver, et
al., 2004) y de procesos de reparación del daño al DNA como la respuesta SOS (Ronen,
et al., 2002).

d) Regulones densamente solapados (DOR)

Constan de varios reguladores que controlan varios promotores de manera

combinatoria. Su principal característica es la integración de varias señales en una
respuesta (Figura 8). Cada gen Z responderá a los distintos reguladores de acuerdo a
una función de entrada multidimensional: su activación o desactivación dependerá de la
presencia o ausencia de muchos factores distintos y con frecuencia alcanzará niveles
de actividad distintos (Yuh, et al., 1998), (Setty, et al., 2003). Los DOR elaboran
respuestas complejas que dependen de múltiples factores, y la propia red transcripcional

22
de E. coli que conocemos se organiza en torno a unos cuantos DOR fundamentales,
que engloban centenares de genes distintos (Shen-Orr, et al., 2002).

Figura I8. El motivo DOR.

Representación esquemática de un motivo DOR y un ejemplo, el sistema de respuesta a
estrés de E. coli. Tomado de (Alon, 2007).

2.2. Redes de regulación en plásmidos

Una pregunta importante en la biología de plásmidos es si los éstos deben ser

considerados como genomas coherentes o como una colección aleatoria de genes
útiles. Un factor importante a determinar en este aspecto es el estudio de la existencia
o no de una regulación global, lo que indicaría si los genomas tienden a comportarse de
forma integrada o si, por el contrario, cada módulo funciona de manera independiente.

Los plásmidos parecen estar a medio camino entre los fagos y los cromosomas
en su organización genética y la existencia de una regulación coordinada podría ser una
consecuencia de la existencia de esqueletos plasmídicos estables. El estudio de las
redes de regulación de los distintos plásmidos conjugativos vendría a confirmar la
existencia de una organización global estable en sus genomas frente a la mera
yuxtaposición de módulos independientes.

Estudios detallados en varios genomas plasmídicos en busca de circuitos

regulatorios, han revelado la presencia de redes regulatorias complejas. Este es el caso,
por ejemplo, de la red CUP en pKM101 (Delver & Belogurov, 1997) o el regulón kil-kor
de los plásmidos IncP (Kornacki, et al., 1990).

23
* Regulación CUP de pKM101:

Controla la expresión de nueve ORFs implicados en el establecimiento del

plásmido. Los elementos CUP consisten en 8 secuencias repetidas situadas
inmediatamente antes de cada ORF regulado (figura I9). La proteína
ArdK_pKM101, que se une a la secuencia consenso en los elementos CUP, que
se piensa que tienen un papel tanto en recombinación e incorporación de nuevos
genes, como en el establecimiento de una red de regulación coordinada (Delver &
Belogurov, 1997).

Figura I9. Modelo para la regulación de los genes ccg controlados por
elementos CUP en pKM101.
Las proteínas regulatorias ArdK and ArdR (en los círculos) se unirían a las regiones
CUP de los promotores inhibiendo la expresión de los genes ccg que llevan estas
secuencias. Los dos reguladores (ArdK y ArdR) actúan como represores de su
propia síntesis. Tomado de (Delver & Belogurov, 1997).

* Regulación global en RP4

En el genoma IncP encontramos cuatro reguladores globales (korA, korB, korC y

trbA) que ejercen una regulación coordinada de las funciones de transferencia y
conjugación del plásmido (Zatyka, et al., 1994) (Macartney, et al., 1997) (figura
I10)

Figura I10: Regulación global de las funciones plasmídicas en RK2.

Se muestran los 4 reguladores globales del plásmido (KorA, KorB, KorC y TrbA) y
la localización de las 6 secuencias de unión que se ha comprobado
experimentalmente que tienen actividad reguladora. Los tonos de gris indican el tipo
de funciones codificadas en cada región: las zonas punteadas contienen las
funcionas de transferencia; en gris claro las de replicación; en gris más oscuro las

24
 funciones de mantenimiento y en negro se representa un transposón. Las flechas
horizontales indican los promotores. Tomado de (Bingle & Thomas, 2001).

El regulador central de este sistema es KorB que reconoce 12 secuencias

palindrómicas de 13 pb distribuidas por el genoma plasmídico (Balzer, et al., 1992)
(Dostal, et al., 2003). Seis de estos sitios están en o cerca de promotores de genes
requeridos para la replicación (trfA), herencia estable (kfrA y klc) y transferencia
conjugativa (trbB y traG). A través de estos sitios KorB reprime la transcripción de
estos genes, trabajando cooperativamente con KorA o TrbA.

La existencia de una red de regulación integrada puede ser anticipada por la

abundancia de secuencias de DNA repetidas en las regiones intergénicas, algo que
también se ha puesto de manifiesto en R388 y otros plásmidos, lo que parece indicar la
presencia también en ellos de redes de regulación coordinadas. Siguiendo los
paradigmas pKM101 y RP4 se llevó a cabo el análisis de secuencia de R388 en busca
de señales con un potencial rol regulatorio en las regiones intergénicas, encontrándose
distintos tipos de secuencias repetidas en diferentes regiones del plásmido, que
sugerían la existencia de una red de regulación global (Fernandez-Lopez, et al., 2006).

Aunque se encontraron posibles secuencias regulatorias en todo el genoma de

R388, se observa una diferencia en su distribución entre el módulo de conjugación y el
resto del plásmido, no encontrándose sitios de unión compartidos entre la región tra y
otras regiones del plásmido (Fernandez-Lopez, et al., 2006).

2.3. Estudio de la regulación transcripcional de R388

a) Señales de regulación

Mediante el análisis informático de la secuencia genética de R388 se identificaron

cinco familias de señales de secuencia, cuya posición en el genoma así como su
secuencia y conservación se muestran en la figura I11. De las cinco familias
identificadas dos son grupos de iterones (IT-A, IT-B), mientras que las otras tres
corresponden a repeticiones directas (SDR-A, SDR-B, SDR-C) (Fernandez-Lopez, et
al., 2006)

25
 Figura I11. Señales de regulación en R388.
En la figura se muestran las señales de regulación identificadas en R388 mediante el
análisis informático de la secuencia y su localización en el plásmido. En el alineamiento
de las secuencias, los residuos invariables se muestran en rojo sobre fondo amarillo
mientras que los residuos conservados se muestran en negro sobre fondo azul. Tomado
de (Fernandez-Lopez, et al., 2006).

La primera señal de secuencia la constituye un iterón (IT-A) localizado en el oriV

del plásmido. Está compuesto por seis repeticiones de 16 pb, que constituyen los sitios
de unión de la proteína RepA que ya fueron descritos por Close y Kado para pSa (Close
& Kado, 1992).

La segunda familia de señales de secuencia la constituyen los iterones de la

familia IT-B. Está formada por cinco iterones que presentan un número variable de
repeticiones (2 a 10) y se encuentran distribuidos en la zona de establecimiento del
plásmido:

- IT-B1: formado por tres repeticiones, está presente en la región intergénica

situada entre la primera LDR y ardC.

- IT-B2: formado por tres repeticiones, presente en la región intergénica entre ardC
y ORF7.

- IT-B3: formado por cinco repeticiones, situado entre la segunda LDR y ORF12.

26
 - .IT-B4: formado por dos repeticiones, situado en la región intergénica entre klcB
y ORF14.

- IT-B5, formado por 10 repeticiones, situado en la región oriT del plásmido

adyacente al operón stbABC.

La familia SDR-A se compone de cuatro repeticiones de 24 pb presentes en cuatro

regiones intergénicas de la zona de establecimiento: entre la primera LDR y ardC (SDR-
A1); entre ardC y orf7 (SDR-A2); entre ORF9 y ssb (SDR-A3) y entre la segunda LDR y
ORF12 (SDR-A4).

La familia SDR-C se compone de ocho repeticiones de 14 pb presentes en los

módulos de mantenimiento y establecimiento: entre la primera LDR y ardC; entre ORF7
y ORF8; entre ORF8 y ORF9; entre ORF9 y ssb; entre la segunda LDR y ssb; entre klcb
y ORF14 y dos de ellas entre el oriV y kfrA.

Por último, la familia SDR-B se compone de cinco repeticiones de 20 bp presentes

en las regiones promotoras de los operones implicados en la expresión y ensamblaje
del pilus conjugativo. Se localizan entre kikA y korB; dos de ellas entre trwN y korA y
otras dos entre trwI y trwH.

b) Proteínas reguladoras en R388

Al menos 6 de los ORFs identificados en la secuencia de R388 (ardK, klcB, stbA,

trwA, korA y korB) fueron designados como posibles reguladores transcripcionales
(Fernandez-Lopez, 2007), aunque cabe la posibilidad de que entre los ORFs pequeños
sin función conocida pueda haber otros que presenten función reguladora.

Se ha comprobado experimentalmente que ArdK se une y reprime la transcripción

de promotores que contienen las secuencias SDR-A, no presentando ningún efecto
sobre promotores que no contenían dichas secuencias. Esto, junto a los datos obtenidos
de la comparación con ArdK_pKM101, llevó a proponer su función como represor
transcripcional de los promotores con secuencias SDR-A. El circuito de regulación de
ArdK (figura I12) adquiere la configuración típica de un módulo SIM en el que el
regulador reprime su propia síntesis y la del resto de promotores diana. (Fernandez-
Lopez, 2007)

27
 Figura I12. Esquema de la red de regulación propuesta para ArdK y alineamiento de
las secuencias de la familia SDR-A.
Las flechas coloreadas en verde indican los ORFs detectados en esta región. Las flechas
marcadas en rayas representan las dos repeticiones directas largas presentes en el
genoma de R388. Se indica la posición de ArdK (flecha roja) así como su circuito de
represión. En la parte inferior se muestra un alineamiento de las secuencias SDR-A.
Tomado de (Fernandez-Lopez, 2007).

También se ha comprobado in vitro que la proteína StbA de R388 es capaz de

unirse al DNA de los promotores que contienen los iterones IT-B (Fernandez-Lopez,
2007), por lo que probablemente las secuencias que forman los iterones de la familia
IT-B constituyen el sitio de unión de esta proteína. En base a estos resultados, el circuito
de regulación de StbA sería el mostrado en la figura I13. Como puede observarse,
corresponde a un represor transcripcional autorregulado negativamente, que a su vez
reprime la expresión de una serie de operones, diseño que corresponde también a un
módulo SIM.

Figura I13. Esquema del módulo SIM de StbA.

A la izquierda se muestra un alineamiento de los iterones de la familia IT-B, junto a los
promotores en los que se sitúan. En el dibujo de la derecha se muestra la organización
general del circuito de StbA. Los ORFs mostrados en verde corresponden a genes con un
papel asignado dentro de la fisiología del plásmido, y regulados por StbA. Los ORFs en

28
 azul corresponden a genes regulados por StbA, pero que no tienen una función conocida.
Los genes de la región en los que no se detectó la presencia de iterones IT-B y que por
tanto no estarían regulados por StbA, se muestran en color anaranjado Las flechas
transparentes con fondo de cuadros indican las dos repeticiones largas (LDRs) presentes
en el genoma de R388. Tomado de (Fernandez-Lopez, 2007).

Por último, se ha determinado que las secuencias SDR-B corresponden a sitios

de unión de KorA estableciéndose como regulador transcripcional de los operones de la
región Mpf, al comprobarse que su presencia es capaz de reprimir la expresión de los
promotores que contienen estas secuencias (Fernandez-Lopez, 2007).

Además de estos circuitos más complejos, en R388 está descrita la función

reguladora de trwA, primer gen del operón trwABC que codifica las funciones de
procesamiento conjugativo del DNA. La proteína TrwA se une a dos sitios en el oriT,
formados por una repetición directa (sbaA) y otra invertida (sbaB) del hexanucleótido
CACTAC y actúa como represor transcripcional del operón estableciendo un circuito de
autorregulación negativa (Moncalian, et al., 1997).

3. MEDIDA DE LA EFICIENCIA DE CONJUGACIÓN

Como ya se comentado anteriormente, la conjugación es una de las fuerzas

principales que contribuyen al modelado de los genomas bacterianos (de la Cruz &
Davies, 2000), pero además es la responsable de la rápida propagación de las
resistencias a antibióticos entre las bacterias patógenas, algo que en los últimos años
ha sido responsable de un importante aumento en la mortalidad de pacientes afectados
por enfermedades infecciosas (Boucher, et al., 2009). El análisis de los elementos
móviles presentes en las poblaciones bacterianas (plásmidos, bacteriófagos,
transposones, etc) así como del flujo de genes de resistencia entre ellas, requiere de
métodos que permitan una determinación cuantitativa precisa de las tasas de
conjugación (Levin, et al., 1997). Estos datos cuantitativos proporcionarán los
parámetros esenciales para el desarrollo de modelos matemáticos que expliquen la
diseminación de las resistencias a antibióticos entre las poblaciones bacterianas y el
efecto de la conjugación en la propagación de las resistencias (Garcillan-Barcia, et al.,
2011).

Se han utilizado diferentes aproximaciones para tratar de determinar la eficiencia

de la transferencia de los plásmidos. El indicador más extendido actualmente es la

29
frecuencia de conjugación, esto es, la tasa entre el número de transconjugantes (T)
respecto al número de donadores (D) o receptores (R).

En un intento por establecer un parámetro universal de la tasa de transferencia,

independiente del procedimiento experimental utilizado, Levin et al. (Levin, et al., 1979)
describieron un método para estimar la llamada tasa de la transferencia conjugativa (γ).
Este trabajo demostró que, en unas condiciones ideales, la dinámica de conjugación se
puede ajustar a un modelo de acción de masas. En su realización más simple, un
quimiostato bacteriano, la tasa de conjugación γ puede ser definida si se hacen algunas
asunciones: las conjugaciones son eventos aleatorios entre células en suspensión; no
hay pérdida del plásmido por segregación; los transconjugantes recién formados actúan
como donadores inmediatamente; y todas las células tienen la misma velocidad de
crecimiento. Posteriormente, Simonsen et al (Simonsen, et al., 1990) adaptaron este
modelo (sin solución analítica) para poder obtener datos que describiesen la
transferencia plasmídica a partir de datos experimentales en cultivo discontinuo,
desarrollando el llamado “End-point method” (o método de punto final) para el cálculo
de la tasa de conjugación.

Este método ha sido ampliamente utilizado debido a que permite una estimación
robusta de la tasa de conjugación, que es insensible a factores como la densidad celular
inicial, la proporción inicial D/R y el tiempo al que se obtienen las muestras de
conjugación, al menos en poblaciones bien mezcladas como las conjugaciones en
líquido (Simonsen, et al., 1990); (Zhong, et al., 2012). Según este modelo la estimación
de punto final de la tasa de conjugación (γep) viene dada por la siguiente ecuación:

𝑇𝑇. 𝑁𝑁
𝛾𝛾𝑒𝑒𝑒𝑒 = 𝜓𝜓𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 (𝑁𝑁 − 𝑁𝑁0 )−1 ln (1 + )
𝐷𝐷. 𝑅𝑅

donde γep es la tasa de transferencia (ml cel-1 h-1), ψmax es la tasa de crecimiento
bacteriano (h-1), y D, R, T y N son las densidades en un tiempo concreto (cel ml-1) de
donadores, receptores, transconjugantes y el total de las células de cultivo
respectivamente.

Aunque la estimación de punto final originalmente fue desarrollada para cultivos

líquidos, debido a su independencia de los cambios en algunas de las condiciones
experimentales y a su simple implementación, el método ha sido usado para medir tasas
de transferencia incluso en condiciones experimentales de conjugación asociada a
superficies (Licht, et al., 1999) (Lilley & Bailey, 2002) (Normander, et al., 1998).

30
 Recientemente, Zhong et al. (Zhong, et al., 2012) analizaron la posibilidad teórica
de aplicar este método a la conjugación en superficie, usando datos simulados de un
modelo basado en un sistema interactivo de partículas. Concluyeron que las tasas de
transferencia (γ) eran medidas más robustas que las frecuencias de transferencia (T/D
o T/(R+T)), tanto en conjugación en líquido como en conjugación asociada a superficies,
pero solo si las poblaciones de donadores y receptores constituían una capa confluyente
bien formada. Se demostró que, a diferencia de los ratios T/D, T/R o T/N la estimación
de punto final de γ es insensible a la proporción D/R y, hasta cierto punto, al tiempo de
muestreo. (Zhong, et al., 2012).

31
32
OBJETIVOS
 OBJETIVOS

R388 es el plásmido conjugativo de menor tamaño de los estudiados hasta el

momento. Pertenece a la familia de plásmidos IncW, es un plásmido de amplio rango
de hospedador, y su mecanismo de trasferencia ha sido objeto de estudio por parte de
nuestro grupo de investigación durante los últimos veinte años.

En un trabajo previo se ha llevado a cabo el estudio de la organización general del

genoma y la filogenia de R388, así como una primera aproximación al estudio de la
regulación transcripcional del plásmido. Esta tesis tiene como objetivo continuar con el
trabajo iniciado por Fernandez-López y profundizar en estudio de la red de regulación
transcripcional del plásmido R388.

En este contexto, los objetivos de esta tesis son los siguientes:

1. Determinar cuantitativamente el efecto de los reguladores transcripcionales del

plásmido R388 e identificar sus promotores diana.

2. Profundizar en la caracterización de uno de sus reguladores, ResP.

3. Caracterizar la organización global de la red de regulación transcripcional del

plásmido.

4. Estudiar las diferencias en la familia IncW respecto a la regulación.

A partir del estudio de la regulación del plásmido nos planteamos además otros
objetivos:

5. Aproximación a la caracterización del fenotipo de los IncW: replicación, rango de

hospedador y conjugación.

6. Puesta a punto de un sistema de citometría de flujo para medir conjugación de

manera más precisa.

35
36
MATERIALES Y
MÉTODOS
 MATERIALES Y MÉTODOS

A. MATERIALES

1. CEPAS

En la tabla MM1 se resumen las cepas utilizadas en este trabajo. La herramienta

principal de trabajo empleada han sido cepas de Escherichia coli todas derivadas de E.
coli K-12.

Tabla MM1. Cepas empleadas en este trabajo.

Escherichia coli
Cepa Características/Genotipo Referencia
F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG
DH5α Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- (Grant, et al., 1990)
mK+), λ–
lacIq rrnB3 ΔlacZ4787 hsdR514 DE(araBAD) 567
BW27783 (Khlebnikov, et al., 2001)
DE(rhaBAD) 568 DE(araFGH) Φ(ΔaraEp PCP8-araE)

BW-Rif Mutante espontáneo de BW27783 (del Campo, et al., 2012)

BW-Nx Mutante espontáneo de BW27783 (del Campo et al., 2012)

DY380 SmR λ Cl857 (cro-bioA) tet (DH10B) (Lee, et al., 2001)

Otras bacterias

Cepa Características/Genotipo Referencia

Gammaproteobacteria Enterobacteriales
K. pneumoniae subsp. pneumoniae. Aislado clínico
Klebsiella
del Medical College of Virginia, 1994. ATCC 700603
pneumoniae K6
ApR KmR, CmR

Salmonella Salmonella enterica subsp. enterica serovar

ATCC 700720
typhimurium LT2 typhimurium str. LT2
Gammaproteobacteria Pseudomonadales
Acinetobacter
SmR ApR ATCC 19606
baumannii
Pseudomonas (Bagdasarian et al.
ApR CmR. P. putida mt-2 sin pWWO
putida KT2440 1981)
Gammaproteobacteria Vibrionales

39
 Vibrio cholerae
N16961 RifR. Biovar Eltor, serovar O:1 CIP106855
CIP106855
Vibrio cholerae
N16961 SmR. Biovar Eltor, serovar O:1 CIP106851
CIP106851
Alfaproteobacteria
Agrobacterium
Derivada de C58 curada de sus plásmidos naturales (Rosenberg and
tumefaciens
(pTi-, pAT-) Huguet, 1984)
GMI9023

2. MEDIOS DE CULTIVO, SELECCIÓN Y CONSERVACIÓN

Para el cultivo rutinario de bacterias se utilizó medio LB Lennox comercial para el

cultivo en líquido (triptona 10 g, extracto de levadura 5 g, NaCl 5 g por litro, Pronadisa)
y el mismo medio suplementado con agar 1,5% (p/v) para el cultivo en medio sólido. Los
medios de cultivo se esterilizaron autoclavándolos a 121˚C durante 20 min.

Para los ensayos de fluorescencia el medio rico LB fue sustituido por medio
mínimo M9 preparado utilizando sales M9 comerciales de Sigma (6,8 g/L Na2HPO4; 3
g/L KH2PO4; 1 g/L NH4Cl; 0,5 g/L NaCl), esterilizadas mediante autoclave 121 ºC durante
20 min, a las que posteriormente se añadió 2 mM MgSO4 estéril. El medio se suplementó
con casaminoácidos (0,2% p/v) y glicerol (0,5% p/v).

Para la conservación de cepas, los cultivos en fase estacionaria se centrifugaron

y se resuspendieron en una mezcla 50% peptona 1,5% (p/V) y 50% glicerol. Las cepas
se almacenaron a -20 ˚C y -75 ˚C.

Según necesidad, se añadieron antibióticos a los medios de cultivo para hacerlos

selectivos. A continuación se incluye la tabla MM2 con los distintos antibióticos y
concentraciones utilizados:

Tabla MM2: Antibióticos utilizados

Antibiótico Concentración Producto comercial Preparación

A. Nalidíxico Ácido nalidíxico
20 µg/ml En agua (añadir NaOH)
(Nx20) (Apollo)
Ampicilina Ampicilina sódica
100 µg/ml En agua
(Ap100) (Apollo)
Cloranfenicol
25 µg/ml Cloranfenicol (Apollo) En etanol
(Cm25)
Kanamicina Sulfato de kanamicina
50 µg/ml En agua
(Km50) (Apollo)
Trimetoprim Trimetoprim 98.8%
20 µg/ml En DMSO
(Tp20) (Apollo)

40
 Tetraciclina Clorhidrato de
10 µg/ml En etanol 50%
(Tc10) tetraciclina (Apollo)
Estreptomicina Sulfato de
300 µg/ml En agua
(Sm300) estreptomicina (Apollo)
Rifampicina Rifampicina 99%
50 µg/ml En DMSO
(Rif50) (Apollo)
Dihidrocloruro de
Espectinomicina
20 µg/ml espectinomicina En agua
(Sp100)
pentahidratada (Apollo)

3. OLIGONUCLEÓTIDOS

Todos los oligonucleótidos fueron sintetizados por Sigma-Aldrich y purificados por

HPSF (alta pureza sin sal) y están recogidos en la tabla MM3.

Tabla MM3. Oligonucleótidos utilizados en este trabajo

Nombre Secuencia (5’→3’) Descripción/Uso

resPdir GCTATCTCGAGGACCCACATCATGCTAT Construcción pGP1

resPrev GGCTGGGATCCGCCTCATTCTAGCGCAG Construcción pGP1
KfrAdir AGCTCTCGAGGGCAAGTAGTTACAGCAAGT Construcción pGP2

KfrArev CGTAGGATCCGTTTAGTGATTGCCATTCTT Construcción pGP2

nucdir AGGTCACTCGAGGCCACGAACTGACACC Construcción pGP3
nucrev GTTATAGGATCCATCGTGTCAAGCTCGCT Construcción pGP3

ardCdir TCGGCGCTCGAGGGAAATGCAAGGGTTAAG Construcción pGP4

ardCrev CATCAGGGATCCGCGAGAGTTCCAAAAC Construcción pGP4
orf7dir AGCTCTCGAGGCTGCGTGCTTTGAAGGACG Construcción pGP5
orf7rev CGTAGGATCCACGATGACTCGGACTTGCAT Construcción pGP5
orf8dir AGCTCTCGAGCTCATCGAGAATGCGGCCGA Construcción pGP6
orf8rev CGTAGGATCCGGCACTTCGTACTCGTTGCCTTTC Construcción pGP6
orf9dir AGCTCTCGAGGAAACCGTCGAGCCAGATCACC Construcción pGP7
orf9rev CGTAGGATCCGGCTTGTTGCTTCTGTTCGT Construcción pGP7
ssbdir GTCGTCCTCGAGGAAACAGGTTCGCGCCACACT Construcción pGP8
ssbrev GTCGTCGGATCCTCGGCTTCAAAACGATTGCT Construcción pGP8
ardkdir GTCGTCCTCGAGGTCATCGACCCCATCACTTA Construcción pGP9
ardkrev GTCGTCGGATCCTTTTGTTTTCGTCCATCGGT Construcción pGP9
orf12dir GTCGTCCTCGAGAAATGCGACGAAACAAGCA Construcción pGP10
orf12rev GTCGTCGGATCCTTTGCGCTTCATAGCTTTGA Construcción pGP10

41
 orf14dir GTCGTCCTCGAGACAAACCATCTACCAAGAAG Construcción pGP11
orf14ev GTCGTCGGATCCTCATGTGTGACTCCTGCTTT Construcción pGP11
trwAdir GTCGTCCTCGAGCGTCCGTTTCATTCACTTGT Construcción pGP12
trwArev GTCGTCGGATCCTACTTGGATGGGGTCGCCTA Construcción pGP12

stbAdir GTCGTCCTCGAGTACTTGGATGGGGTCGCCTA Construcción pGP13

stbArev GTCGTCGGATCCCGTCCGTTTCATTCACTTGT Construcción pGP13
trwHdir GTCGTCCTCGAGCAATATGGCGAAAACCGTTG Construcción pGP14
trwHrev GTCGTCGGATCACAATAGCCCCGTCATCAAA Construcción pGP14

korAdir CGTTGCGGATCCCCTTGATCGCATGTTTAATC Construcción pGP15

korArev TACCTAGGATCCTAATGCAAGCGACGCCTTTT Construcción pGP15
korBdir TCGCCTCGAGAAACGACGGTC Construcción pGP16
KorBrev TCGCGGATCCGGTCATTCACTT Construcción pGP16
kikAdir TCGCCTCGAGGGTCATTCACTT Construcción pGP17
kikArev TCGCGGATCCAAACGACGGTCA Construcción pGP17
intdir GCTATCTCGAGGTTGGCTTCATCGCTACTTTGACCC Construcción pGP18
intrev GGCTGGGATCCACTGTAATGCAAGTAGCGTATGCGC Construcción pGP18

antdir GCTATGGATCCGTTGGCTTCATCGCTACTTTGACCC Construcción pGP19

antrev GGCTGCTCGAGGAACCCAGTTGACATAAGCCTGTTC Construcción pGP19

pGhosdir CTAGCTCGAGTTTCGGGCCTGTCAGGCTTGCT Construcción pGP20

pGhosrev GATCGGATCCCAAGGGGCACTCGCTCGAAGAACT Construcción pGP20
Amplificación de las
pRAFd_EcoRI GCTATGAATTCAAAAGTGCCACCTGACGTCTGAAGG
proteínas fluorescentes
Amplificación de las
pRAFr_SalI GCTATGTCGACTTCATATGGACCATGGCTAATTCCC
proteínas fluorescentes
GATTGAACCACTACAGTAACACTACGGGAGAGGACA
Construcción de
TrwAKamiK1 TGGCACTAGGCGACGGTACCATCAAGAGACAGGATG
R388ΔtrwA
AGGATCGT
TGACCTTTCTTTGATCGTCTGGATGCATCTCAATCCT
Construcción de
TrwAKamiK2 CCTTCCCCTCCGGGGTACCAACCCCAGAGTCCCGCT
R388ΔtrwA
CAG
TGAGGTTTGGACACCGGAGGGGAAGGAGGATTGAG
Construcción de
TrwBKamiK1 ATGCATCCAGACGATGGTACCATCAAGAGACAGGAT
R388ΔtrwB
GAGGATCGT
CTGTCGGGTCAATACCATGTGACTGAGCATTAGATA
Construcción de
TrwBKamiK2 GTCCCCTCAACAAAGGTACCAACCCCAGAGTCCCGC
R388ΔtrwB
TCAG
AACCGGCAACCGGCCTTTGTTGAGGGGACTATCTAA
Construcción de
TrwCKamiK1 TGCTCAGTCACATGGGTACCATCAAGAGACAGGATG
R388ΔtrwC
AGGATCGT
AGCACGCGCTACGGGCTTTTTCTTGTCCCTGCTTAC
Construcción de
TrwCKamiK2 CTTCCGGCCTCCATGGTACCAACCCCAGAGTCCCGC
R388ΔtrwC
TCAG
TCATACAACATACTACAGTACAGAGGCCCGCAAGAA Construcción de
KfrAKamiK1 TGGCAATCACTAAAGGTACCATCAAGAGACAGGATG R388ΔkfrA-osa y
AGGATCGT R388ΔkfrA-orf14

42
 CGCGACCGCGCGAAGGGCGGCAAGGGCGCTTTTCA
Construcción de
KfrAKamiK2 TTGTTTGCCTCCTGT
R388ΔkfrA-osa
GGTACCAACCCCAGAGTCCCGCTCAG
AACCGCCCGGCCAGATCAATGCAGGAGTCAAAGCTA
Construcción de
Orf12KamiK1 TGAAGCGCAAATTTGGTACCATCAAGAGACAGGATG
R388Δorf12
AGGATCGT
TGGTGCTTTCTGCTCACGGCGTCGGCTCCGGCTCAA
Construcción de
Orf12KamiK2 TACTCGTGGGGCAGGGTACCAACCCCAGAGTCCCG
R388Δorf12
CTCAG
GGAAAGGGCGGGTTCCCCCGCCCTCCCCTCGGTCA Construcción de
Orf14KamiK2 AATGTGCGCGGCGGTGGTACCAACCCCAGAGTCCC R388Δorf14 y
GCTCAG R388ΔkfrA-orf14
CATCCGCAATTCTAGTGTAGAAGGAGAGTAGAAAAG
Construcción de
KorBKamiK1 TGAATGACCTCAAGGGTACCATCAAGAGACAGGATG
R388ΔkorB
AGGATCGT
GTTCCTCCTGGCCTTACGGCCCGATCTTCAATTCATG
Construcción de
KorBKamiK2 ATACTTCCAGTTCGGTACCAACCCCAGAGTCCCGCT
R388ΔkorB
CAG
Oligo directo para clonar
ResPNdeI GGCTGCATATGCCAAAATACTATGCCTA
resP_R388 en pET29C
Oligo reverso para clonar
ResPXhoI GCTATCTCGAGGGCATGTTGTTCCCTCCCCG
resP_R388 en pET29C
Secuenciación del MCS
pZE05 CCAGCTGGCAATTCCGA
en pUA66
Secuenciación del MCS
GFPseq GGGACAACACCAGTG
en pUA66
Secuenciación del MCS
pBAD1 CTGTTTCTCCATACCCGTT
en pBAD33
Secuenciación del MCS
pBAD2 CTCATCCGCCAAAACAG
en pBAD33
Secuenciación clones
pRODseq1 CTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACG
pAC

4. PLÁSMIDOS

La tabla MM4 contiene la lista de plásmidos empleados o construidos en esta tesis.

En el apartado B2 de Materiales y Métodos puede encontrarse una explicación más
detallada de la construcción de las principales librerías de clones desarrolladas para
este trabajo.

Tabla MM4. Plásmidos utilizados en este trabajo

Nº Acceso o
Plásmido Resistencia Replicón Descripción
referencia
Plásmido reportero GFP, para
pUA66 Km pSC101 (Zaslaver, et al., 2006) clonar una secuencia controlando la
transcripción de gfpmut2
Expresión controlada por ParaBAD,
pBAD33 Cm p15A (Guzman, et al., 1995)
inducible por arabinosa
Sobreexpresión de proteínas con
pET29c Km pBR322 Novagen cola de histidinas, controlada por el
promotor de T7.

43
 Plásmido que expresa mCherry
pROD17 Ap, Km ColE1 (Shaner, et al., 2004) controlada por Plac
BR000038 Plásmido silvestre. Representante
R388 Tp, Su IncW
Datta 1972 de los IncW.
Martinez & de la Cruz,
pSU2007 Tp, Su, Km IncW Derivado KmR de R388
1988
Cm, Gm,
EU419764
pSa Km, Sm, Sp, IncW Plásmido silvestre. Familia IncW.
Watanabe 1968
Su
AM901564
R7K Ap, Sm, Sp IncW Plásmido silvestre. Familia IncW.
Coetzee 1972
EF633507
pIE321 Sm, Tc IncW Plásmido silvestre. Familia IncW.
(Gotz, et al., 1996)
EU247928
Gm, Km,
pIE522 IncW (Gotz, et al., 1996) Plásmido silvestre. Familia IncW.
Su, Tob
Derivado no movilizable de R388 al
pAP711∆ que se le ha eliminado el oriT y
Tc IncW (Demarre, et al., 2005)
OriT::tet sustituído por una resistencia a
tetracicilina (tetA)
pOX38Km marcado con un cassette
pAR109 Cm IncFI (Reisner, 2002)
cat-pLac-yfp* en el locus aph
pLG221 marcado con un cassette
pAR111 Cm IncI1 (Reisner, 2002)
cat-pLac-yfp* en el locus aph
pLG272 marcado con un cassette
pAR113 Cm IncI1 (Reisner, 2002)
cat-pLac-yfp* en el locus aph
RP4 marcado con un cassette cat-
pAR115 Cm IncP (Reisner, 2002)
pLac-yfp* en el locus aph
R1 marcado con un cassette tetRA-
pAR118 Cm IncFII (Reisner, 2002)
pLac-yfp* en el locus cat
R1drd19 marcado con un cassette
pAR120 Tc IncFII (Reisner, 2002)
tetRA-pLac-yfp* en el locus cat
pSU2007 marcado con un cassette
pAR145 Tc IncW (Reisner, 2002)
cat-pLac-yfp* en el locus aph

Vector
Plásmido Resistencia (sitios de Inserto Descripción
clonaje)
Clon de la región promotora del
pUA66 234 pb (del 4214
pGP1 Km operón resP-repA controlando la
(XhoI-BamHI) al 4447 de R388)
expresión de gfpmut2
Clon de la región promotora del
pUA66 302 pb (del 6502
pGP2 Km operón kfrA-osa controlando la
(XhoI-BamHI) al 6803 de R388)
expresión de gfpmut2
Clon de la región intergénica entre
pUA66 203 pb (del 7957
pGP3 Km parB y nuc controlando la expresión
(XhoI-BamHI) al 8159 de R388)
de gfpmut2
Clon de la región promotora del
pUA66 155 pb (del 9911
pGP4 Km operón ardC controlando la
(XhoI-BamHI) al 10065 de R388)
expresión de gfpmut2
Clon de la región promotora del
pUA66 169 pb (del 10959
pGP5 Km operón orf7-orf9 controlando la
(XhoI-BamHI) al 11127 de R388)
expresión de gfpmut2
Clon de la región intergénica entre
pUA66 86 pb (del 11287
pGP6 Km orf7 y orf8 controlando la expresión
(XhoI-BamHI) al 11367 de R388)
de gfpmut2

44
 Clon de la región intergénica entre
pUA66 52 pb (del 11548
pGP7 Km orf8 y orf9 controlando la expresión
(XhoI-BamHI) al 11599 de R388)
de gfpmut2
Clon de la región promotora del
pUA66 258 pb (del 12353
pGP8 Km operón ssb-ardK controlando la
(XhoI-BamHI) al 12610 de R388)
expresión de gfpmut2
Clon de la región intergénica entre
pUA66 106 pb (del 12903
pGP9 Km ssb y ardK controlando la expresión
(XhoI-BamHI) al 13008 de R388)
de gfpmut2
Clon de la región promotora del
pUA66 181 pb (del 13911
pGP10 Km operón orf12 y KlcB controlando la
(XhoI-BamHI) al 14092 de R388)
expresión de gfpmut2
Clon de la región promotora del
pUA66 200 pb (del 14973
pGP11 Km operón orf14 controlando la
(XhoI-BamHI) al 15172 de R388)
expresión de gfpmut2
Clon de la región promotora del
pUA66 496 pb (del 17076
pGP12 Km operón stbA-stbC controlando la
(XhoI-BamHI) al 17571 de R388)
expresión de gfpmut2
Clon de la región promotora del
pUA66 496 pb (del 17571
pGP13 Km operón trwA-trwC controlando la
(XhoI-BamHI) al 17076 de R388)
expresión de gfpmut2
Clon de la región promotora del
pUA66 240 pb (del 26252
pGP14 Km operón trwH-trwD controlando la
(XhoI-BamHI) al 26491 de R388)
expresión de gfpmut2
Clon de la región promotora del
pUA66 190 pb (del 31741
pGP15 Km operón korA-trwI controlando la
(XhoI-BamHI) al 31930 de R388)
expresión de gfpmut2
Clon de la región promotora del
pUA66 171 pb (del 33121
pGP16 Km operón kikA-trwN controlando la
(XhoI-BamHI) al 33291 de R388)
expresión de gfpmut2
Clon de la región promotora del
pUA66 171 pn (del 33291
pGP17 Km operón korB controlando la
(XhoI-BamHI) al 33121 de R388)
expresión de gfpmut2
pUA66 389 pb (del 2013 Clon del promotor Pint del integrón
pGP18 Km
(XhoI-BamHI) al 3001 de R388) controlando la expresión de gfpmut2
pUA66 355 pb (del 2613 Clon del promotor Pant del integrón
pGP19 Km
(XhoI-BamHI) al 2967 de R388) controlando la expresión de gfpmut2
pUA66
pGP20 Km
(XhoI-BamHI)
pBAD33 Clon del ORF resP de R388 bajo el
pAR1 Cm resP_R388
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD
pBAD33 Clon del ORF repA de R388 bajo el
pAR2 Cm repA_R388
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD
pBAD33 Clon del ORF kfrA de R388 bajo el
pAR3 Cm kfrA_R388
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD.
pBAD33 Clon del ORF ardK de R388 bajo el
pAR4 Cm ardK_R388
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD
pBAD33 Clon del ORF orf7 de R388 bajo el
pAR5 Cm orf7_R388
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD
pBAD33 Clon del ORF orf8 de R388 bajo el
pAR6 Cm orf8_R388
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD.
pBAD33 Clon del ORF orf9 de R388 bajo el
pAR7 Cm orf9_R388
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD
pBAD33 Clon del ORF orf12 de R388 bajo el
pAR8 Cm orf12_R88
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD
pBAD33 Clon del ORF klcB de R388 bajo el
pAR9 Cm klcB_R388
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD
pBAD33 Clon del ORF orf14 de R388 bajo el
pAR10 Cm orf14_R388
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD

45
 pBAD33 Clon del ORF stbA de R388 bajo el
pAR11 Cm stbA_R388
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD
pBAD33 Clon del ORF trwA de R388 bajo el
pAR12 Cm trwA_R388
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD
pBAD33 Clon del ORF korA de R388 bajo el
pAR13 Cm korA_R388
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD
pBAD33 Clon del ORF korB de R388 bajo el
pAR14 Cm korB_R388
(XbaI-HindIII) control del promotor ParaBAD
pBAD33 Clon de gfpmut2 bajo el control del
pAR15 Cm gfpmut2 (pUA66)
(XbaI) promotor ParaBAD
pIC1 Tp R388 trwA- R388ΔtrwA
trwA- (Km R388ΔtrwA (Km insertada en el sitio
pIC2 Tp Km R388
insertion) de trwA)
pIC3 Tp R388 trwB- R388ΔtrwB
trwB- (Km R388ΔtrwB (Km insertada en el sitio
pIC4 Tp Km R388
insertion) de trwB)
pIC5 Tp R388 trwC- R388ΔtrwC
trwC- (Km R388ΔtrwA (Km insertada en el sitio
pIC6 Tp Km R388
insertion) de trwC)
pIC7 Tp R388 korB- R388ΔkorB
R388 korB- (Km R388ΔkorB (Km insertada en el sitio
pIC8 Tp Km
insertion) de korB)
R388
pIC9 Tp kfrA-orf14- R388ΔkfrA-orf14
R388 kfrA-orf14- (Km
pIC10 Tp Km R388ΔkfrA-orf14 (Km insertada)
insertion)
R388 R388Δorf12 que también ha perdido
pIC11 Tp orf12– LDRs-
la región entre las LDRs
orf12- LDRs- (Km R388Δorf12 (Km insertada en el
pIC12 Tp Km R388
sitio de orf12)
insertion)
Derivado KmS de pROD17.Contiene
pAC1 Ap pROD17 -
mCherry controlado por Plac
Derivado KmS de pROD17.Contiene
pAC2 Ap pROD17 dsred2
dsred2 controlado por Plac
Derivado KmS de pROD17.Contiene
pAC3 Ap pROD17 gfpmut2
gfpmut2 controlado por Plac
Derivado KmS de pROD17.Contiene
pAC4 Ap pROD17 mKate2
mkate2 controlado por Plac
Derivado KmS de pROD17.Contiene
pAC5 Ap pROD17 cfp
cfp controlado por Plac
Derivado KmS de pROD17.Contiene
pAC6 Ap pROD17 citrus
citrus controlado por Plac

46
B. MÉTODOS

1. MÉTODOS GENERALES DE BIOLOGÍA MOLECULAR

1.1. Extracción y purificación de DNA

Para las extracciones y purificaciones de DNA se emplearon kits comerciales.

La extracción de DNA plasmídico se realizó utilizando el kit GenElute Plasmid

Miniprep Kit de Sigma. Para la purificación de DNA a partir de bandas extraídas de gel
de agarosa, se utilizó GenElute Gel Extraction Kit de Sigma y, por último, para limpiar
DNA o cambiarle el tampón se utilizó GenElute PCR Clean-Up Kit, también de Sigma.

En todos los casos el procedimiento se realizó siguiendo los protocolos

proporcionados por el fabricante.

Para determinar la concentración de las muestras de DNA se utilizó un

espectrofotómetro para la cuantificación de ácidos nucleicos Nano-Drop
Spectrophotometer ND-1000.

1.2. Transformación

a) Transformaciones por TSB

La transformación de DNA por medio de TSB (LB pH 6,1, con 10% de PEG, 5%
DMSO, 10 mM de MgCl2 y 10 mM de MgSO4) (Chung & Miller, 1988), es una técnica
sencilla y barata que permite conseguir frecuencias de hasta 2x108 transformantes por
µg de DNA. Además, las células que han adquirido competencia por este método
pueden ser congeladas para ser transformadas en otro momento sin una pérdida
significativa de eficiencia.

Para realizar la transformación, se crece en LB un cultivo bacteriano de la cepa

que se quiere transformar hasta una DO600 de 0,3-0,6, y se recogen las células por
centrifugación a 4,000 g. Las células se resuspenden en un volumen de TSB equivalente
a 1/10 del volumen inicial (típicamente 1 ml de TSB a 4 ˚C) y se incuban en hielo durante
10 min. Manteniéndolo todo en frío, se preparan alícuotas de 0,1 ml a las que se añaden
10-100 pg del plásmido que se quiere transformar, y se mantienen en hielo durante 5-
30 min. A continuación, se añaden 0,9 ml de TSB-glucosa (TSB con 20 mM de glucosa)

47
y se ponen a crecer las células a 37 ºC con agitación durante 1h para permitir la
expresión del marcador de selección. Posteriormente se siembran los cultivos en placas
de LB-agar con el antibiótico adecuado para seleccionar los transformantes.

b) Transformaciones por electroporación

Otro método de transformación empleado en este trabajo ha sido la utilización de

células electrocompetentes. Éste fue el método de elección cuando la frecuencia de
transformación necesaria era muy alta, ya que con él se consiguen frecuencias de hasta
1010 transformantes por µg de DNA (Dower, et al., 1988).

Para preparar células competentes para electroporar se crecen los cultivos en LB

hasta una DO600 de 0,5-0,7 y se dejan en hielo durante 30 minutos. A continuación, se
realizan varios lavados con agua milliQ estéril a 4 ºC mediante centrifugación a 3000 g
durante 10 min y resuspensión en agua. Se realiza un último pase resuspendiendo las
células en glicerol 10% (p/v) a 4 ºC y, por último, se vuelven a centrifugar y se
resuspenden en un 2% del volumen inicial de glicerol 10% frío. Estas células se reparten
en alícuotas de 60 µl y se conservan a -80 ˚C para su posterior utilización.

Para llevar a cabo las transformaciones por electroporación el DNA se dializa en

filtros Millipore GS de 0,05 µm de tamaño de poro, colocados sobre una placa Petri con
agua MilliQ durante 30 min. Se recoge el DNA del filtro y se añaden de 1 a 50 pg a una
alícuota de las células competentes. La mezcla se deposita en el fondo de una cubeta
de electroporación de 0,2 cm (Gene Pulser de BioRad) previamente enfriada en hielo,
manteniendo siempre las células a 4 ºC. Utilizando un electroporador MicropulserTM de
BioRad se realiza la electroporación en las siguientes condiciones: 2,5 kV, 25 µF y 200
Ω. Inmediatamente después, se añade 1 ml de LB estéril a la cubeta para recuperar las
células, que se incuban a 37 ºC con agitación durante, al menos, 1h para permitir la
expresión del marcador de selección (el tiempo puede ser mayor en función del
antibiótico que se utilice para seleccionar). Posteriormente el cultivo se siembra en
placas de LB-agar con el antibiótico de selección correspondiente.

1.3. Amplificación de DNA: PCR

La amplificación de fragmentos de DNA se llevó a cabo por la técnica de PCR.

Siempre que se requirió una alta fidelidad en la polimerización, como en el caso de los
procesos de clonación, se utilizó una polimerasa con actividad correctora de errores
como la polimerasa Vent (BioLabs) o BioXact (Bioline). Para otras amplificaciones, como

48
en el caso de la comprobación de colonias, se utilizó la polimerasa Biotaq (Bioline).
Generalmente las reacciones de PCR se hicieron en un volumen final de 50 µl, y las
concentraciones de cada reactivo se eligieron según la recomendación de cada
fabricante.

Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador UNO II (Biometra). El

programa utilizado rutinariamente consta de los siguiente pasos: un primer paso de
desnaturalización de 5 min a 94 ˚C; 25 ciclos compuestos por 30 segundos a 94 ˚C para
desnaturalizar la doble hebra del DNA, 30 segundos a la temperatura de hibridación
adecuada, y 1 min por kb de DNA a 72 ˚C para la elongación del DNA; después de los
25 ciclos se añade un último paso de 10 min a 72 ˚C para favorecer que se complete la
elongación de los fragmentos. Una vez terminada la reacción se mantienen las muestras
en frío.

Para calcular la temperatura de hibridación a utilizar en las distintas

amplificaciones, se calcula la Tm de los cebadores y a la más baja de las dos se le
restan 5 ˚C.

1.4. Digestiones enzimáticas

Las digestiones enzimáticas se llevaron a cabo con enzimas de restricción de

Fermentas (Ontario, Canadá), siguiendo las instrucciones dadas por la casa comercial.
El volumen habitual utilizado en estas reacciones fue de 20 µl, el tiempo de reacción
una hora y la temperatura a la que se llevaron a cabo de 37 ˚C (siempre que no se
indique lo contrario). Para inactivar las reacciones se siguieron las recomendaciones
específicas para cada enzima (típicamente calentamiento a 65 ˚C durante 20 min, salvo
excepciones).

1.5. Ligaciones

Los vectores de clonación y los fragmentos de PCR a ligar se digirieron con los
enzimas de restricción seleccionados según el método que se ha indicado
anteriormente. Para aumentar la eficiencia de la ligación y disminuir el número de falsos
positivos, se introduce un paso de desfosforilación en el vector utilizando fosfatasa
alcalina (Roche) que elimina los fosfatos terminales. Siguiendo las instrucciones del
fabricante se utilizan 10 U por reacción y se mantiene 1 hora a 37 ˚C. La reacción se
inactiva mediante incubación a 65˚C 10 min.

49
 Para las reacciones de ligación se utilizó la ligasa del fago T4 (Fermentas). Las
reacciones se llevaron a cabo poniendo una relación vector/inserto 1:5 en 20 µl de
volumen final, implicando típicamente 50 - 100 ng de DNA y 4 U de enzima. Las
reacciones de ligación se llevaron a cabo a 22 ˚C durante toda la noche. Como control
negativo de las ligaciones se utilizó la misma reacción sin inserto, añadiendo el volumen
equivalente de agua en este caso hasta completar los 20 µl.

1.6. Secuenciación de DNA

Para comprobar la secuencia de los clones obtenidos, las muestras de DNA se

enviaron al “Servicio de secuenciación de DNA HUMV-UNICAN” (Unidad de Genética
Molecular, Hospital de Valdecilla, Santander), o al “Servicio de Secuenciación de DNA
del CIB” (SECUGEN S.L. Madrid). Posteriormente se pasó a trabajar con el servicio de
secuenciación MACROGEN Inc. DNA Sequencing Service (Seul, Korea).

1.7. Electroforesis de DNA

Para la separación de fragmentos de DNA se utilizó la electroforesis en geles de

agarosa disuelta en TBE 0,5x, en porcentajes (p/v) del 1, 1,5 o 2% dependiendo del
tamaño del DNA que se pretendiese resolver. Para la visualización del DNA se añadió
a la agarosa bromuro de etidio a 0,25 mg/L que en las últimas etapas de este trabajo se
sustituyó por Red Safe (Intron Biotechnology 20.000x fabricante) en una relación
1:100.000.

Para cargar las muestras en el gel se mezclan con 1/10 de su volumen de tampón
de carga (azul de bromofenol 0,25% (p/v), glicerol 30% (v/v)). Como marcador de peso
molecular se utilizó el patrón HyperLadder (Biolabs) o 100 bp para bajos pesos
moleculares (Amersham), en función del tamaño del DNA que se estaba analizando.

La electroforesis se llevó a cabo en cubetas horizontales (BioRad) con tampón

TBE 0.5x (Tris-HCl 45 mM, ácido bórico 45 mM, EDTA 0,5 mM pH 8,2) a voltajes entre
80-120 V, durante un tiempo variable según el voltaje y tamaño de los fragmentos
empleados. Las imágenes de los geles se obtuvieron utilizando un transiluminador de
luz ultravioleta GelDoc 2000 de BioRad y se analizaron con el programa Quantity One
(BioRad).

50
 1.8. Fijación de células

Para la fijación de células para citometría se utilizó un protocolo de fijación en

paraformaldehído (PFA) al 4%.

Se prepara una disolución de PFA al 7,4% en agua (22,2 g PFA; 200 µl NaOH
10N. Disolver en agua milliQ caliente a 60 ºC, enrasar a 300 ml y filtrar con filtros de
0,22 µm que se hacen alícuotas y se congela. Cuando vamos a trabajar con el fijador,
las alícuotas se descongelan en un baño seco a unos 60-70 ºC.

Para fijar los cultivos, se tomaron 400 µl del cultivo o de la conjugación y se lavaron
con 1 ml de PBS 1x. Posteriormente se centrifugó 3 min a 8000 r.p.m. para precipitar
las células y el pellet se resuspendió en 200 µl de PBS 2x. A esta suspensión se añadió
200 µl del PFA 7,4% y se mezcló suavemente. La mezcla se incubó a temperatura
ambiente durante 15 min. en agitación para evitar que las células se agregasen en el
fondo del tubo. Pasado el tiempo de fijación, la mezcla se centrifugó 3 min a 8000 rpm
para eliminar el sobrenadante, se lavó con 1 ml de PBS 1x y finalmente las células se
resuspendieron en 500 µl de PBS 1x y se conservaron a 4 ºC.

2. CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDOS

A continuación se detalla la construcción de los principales plásmidos utilizados

en este trabajo. La descripción de los plásmidos obtenidos aparece en la tabla MM4 y
la secuencia de los oligonucleótidos utilizados en la tabla MM3.

a) Librería pGP

Para analizar la capacidad de las regiones intergénicas del plásmido R388 de actuar
como promotores se construyó una librería clonando estas regiones en el vector
reportero pUA66. El vector pUA66 es un vector de bajo número de copias que
contiene el ORF de la proteína GFPmut2, con su propio sitio de unión al ribosoma,
precedida de dos dianas de restricción XhoI y BamHI. Al clonar secuencias de DNA
entre estas dianas puede ensayarse su actividad transcripcional valorando la
capacidad de promover la transcripción de GFP.

Utilizando los oligonucleótidos indicados en la tabla MM3 se amplificaron las

regiones intergénicas de R388. Estos fragmentos de DNA fueron purificados y

51
clonados en las dianas de restricción XhoI - BamHI del plásmido. Los clones
obtenidos fueron analizados por secuenciación, utilizando para ello el
oligonucleótido pZE05.

b) Librería pAR

Los ORFs de R388 que codificaban para posibles reguladores transcripcionales

fueron clonados en el vector pBAD33. Este plásmido contiene el promotor AraBAD
seguido de un MCS con los sitios de restricción XbaI y HindIII. Al clonar los ORFs
precedidos de un sitio de unión al ribosoma entre estas dianas, su expresión queda
controlada por el promotor araBAD inducible por arabinosa.

Para realizar la librería, los ORFs de los posibles reguladores fueron obtenidos por
digestión usando las enzimas XbaI – HindIII de una librería preexistente de clones
de los ORFs de R388 en el vector pET3a. Los fragmentos obtenidos fueron
purificados y clonados en las dianas del plásmido. Los clones obtenidos fueron
analizados por secuenciación usando los oligonucleótidos pBAD1 y pBAD2. Así
mismo se comprobó la correcta sobreexpresión de las proteínas tras la inducción
con arabinosa mediante geles de tricina.

c) Plásmidos pIC

Se trata de una serie de deleciones de distintos ORFs del plásmido R388 realizadas
mediante recombinación homóloga. Para ello se utilizó un protocolo derivado del
método descrito por Wanner y Datsenko, que se describe en el apartado B3. Los
genes se sustituyeron por un gen de resistencia Km amplificado del vector pUA66,
que posteriormente fue eliminado mediante digestión con KpnI.

Los oligos y los plásmidos generados se encuentran recogidos en las tablas MM3 y
MM4 respectivamente.

d) Plásmidos pAC

Son plásmidos que contienen los genes de distintas proteínas fluorescentes

clonados bajo el control del promotor Plac. Estos plásmidos se construyeron a partir
del pROD17.

Inicialmente se eliminó el gen de resistencia a Km mediante digestion BglII – BamHI,

obteniéndose el derivado ApR KmS pAC1.

52
 Posteriormente pAC2, pAC3, pAC4 y pAC5 se obtuvieron por digestion EcoRI - SalI
de pAC1, lo que elimina el gen correspondiente a la mcherry, que fue sustituido por
un amplicón obtenido por PCR de los genes correspondientes a otras proteínas
fluorescentes: dsred2 (Bevis & Glick, 2002), mkate2 (Shcherbo, et al., 2009), venus
(Nagai, et al., 2002) y cfp (Rizzo, et al., 2004). Los clones se comprobaron por
secuenciación con el oligo pRODseq1.

3. MÉTODO DE WANNER Y DATSENKO

Una modificación de este método basado en el sistema recombinativo RED

(Datsenko & Wanner, 2000) fue utilizado para realizar construcciones por deleción de
genes en R388, mediante la inducción de fenómenos de recombinación homóloga entre
un plásmido determinado y un producto de PCR con secuencias homólogas a dicho
plásmido. El proceso se encuentra esquematizado en la figura MM1.

Este sistema ha demostrado ser altamente eficiente para realizar construcciones

por recombinación homóloga entre DNA cromosómico o plasmídico y un fragmento
lineal de PCR, utilizando secuencias de homología cortas de 30 a 50 pares de bases.

Gen diana
R388

Recombinación
KmR
Cassette de PCR

KpnI KpnI

KmR
R388Δgen_diana::Km

KpnI KpnI

Residuo gen eliminado

R388Δgen_diana
KpnI

Figura MM1. Esquema de los pasos seguidos para la eliminación de ORFs en R388
siguiendo una modificación del método desarrollado por Wanner y Datsenko.

53
 Para preparar las células electrocompetentes y generar recombinantes se
procedió según el método descrito por Lee et al. (Lee, et al., 2001). Se utilizó la cepa de
E.coli DY380 que contiene los genes implicados en la recombinación RED clonados bajo
el control de un represor sensible a temperatura, de manera que cuando la bacteria se
expone a una temperatura de 42 ºC, se induce la expresión de los genes recombinativos,
junto con un inhibidor de las nucleasas RecBCD que impide el ataque al DNA lineal
electroporado. Todo el trabajo rutinario con esta cepa se realizó a 30 ºC para evitar la
expresión innecesaria del sistema de recombinación.

Se diseñaron oligos (tabla MM3) para amplificar por PCR el gen de la resistencia
a Km de pAU66, añadiendo a ambos lados regiones de 30-50 pb de homología con el
gen que se quería eliminar. Una vez obtenida la banda correspondiente a la
amplificación del gen de resistencia, ésta se purificó.

Por otro lado, se introdujo el plásmido R388 por conjugación en la cepa DY380 y
se creció un cultivo del transconjugante a 30 ºC con agitación hasta DO600 0,5-0,7. A
continuación, se incubó el cultivo durante 15 minutos a 42 ºC para inducir la expresión
del sistema de recombinación y tras ese tiempo se procesaron las células para hacerlas
electrocompetentes (apartado B1.2 de materiales y métodos).

Para llevar a cabo la transformación, se añadió 100 ng del producto de PCR

purificado y se transformó de acuerdo a lo descrito previamente. Puesto que nuestro
fragmento de PCR contenía extremos homólogos a las secuencias diana en R388, el
sistema de recombinación podía reconocer y recombinar el DNA introducido con el del
plásmido, resultando en la obtención de un R388 con la sustitución de los genes
deseados por el del gen de resistencia a Km flanqueado por las secuencias de
homología.

Tras una incubación de 2h a 30 ºC, la transformación se sembró en placas de LB

Agar con Km y se dejó crecer a 30 ºC durante toda la noche. Se comprobaron las
colonias obtenidas por PCR para verificar la sustitución de los genes deseados.

Una vez aislado y comprobado el mutante, se eliminó el gen de resistencia a Km

mediante digestión del DNA con la enzima KpnI.

54
4. CONJUGACIONES

4.1. Conjugaciones en filtro

Las conjugaciones se realizaron tal y como se describe en Grandoso et al.

(Grandoso, et al., 2000).

Los cultivos de donadoras y receptoras se crecieron hasta fase estacionaria con

los antibióticos adecuados. En un tubo eppendorf se mezclaron 100 µl de células
donadoras con 100 µl de células receptoras y se lavaron centrifugando y
resuspendiendo en el mismo volumen de LB estéril para eliminar los restos de
antibióticos. Tras una nueva centrifugación el pellet se resuspendió en 20 µl de LB. Las
conjugaciones se realizaron en placas de LB-Agar, ya que se ha descrito que tanto el
plásmido R388 como sus derivados conjugan mejor en sólido que en líquido (Bradley,
1980). Para ello, se preincubó la placa de Petri LB-Agar a 37 ˚C con un filtro de
nitrocelulosa de 0,22 μm de tamaño de poro y 25 mm de diámetro (GS Millipore). Los
20 µl de mezcla conjugativa se extendieron sobre dicho filtro, y se mantuvo la placa a
37 ºC durante 60 min. En ese momento, se recogió el filtro con pinzas estériles y se
introdujo en 1 ml de LB estéril, donde se resuspendió por medio de vórtex para
desprender las células y parar la conjugación. Este tubo constituyó la dilución cero.

Se prepararon diluciones seriadas 1/10 y se sembraron en placas de LB-Agar con

el antibiótico apropiado para seleccionar células donadoras, las células receptoras y los
transconjugantes. Las frecuencias de conjugación se determinaron calculando el
número de transconjugantes por donador o por receptor.

Teniendo en cuenta que las frecuencias de conjugación siguen una distribución

de Poisson se calcularon los logaritmos en base 10 de las frecuencias para obtener las
medias y desviaciones estándar utilizando los valores logarítmicos. El rango de las
frecuencias se consiguió sumando y restando la desviación estándar a la media
logarítmica y calculando a continuación el antilogaritmo de los valores resultantes.

4.2. Conjugaciones en placa

Los ensayos de conjugación en placa se pusieron a punto en placas de 24 pocillos,

en las que se añade 1 ml de LB-agar por pocillo.

55
 Los cultivos de donadores y receptores se crecieron a partir de colonia puntual en
medio LB con antibiótico y 0,5 mM IPTG (cuando quisimos activar la expresión del
promotor Plac), durante toda la noche a 37 ºC con agitación. Al día siguiente los cultivos
saturados se lavaron para eliminar los restos de antibiótico, centrifugando y
resuspendiendo en LB fresco, se midió la OD600 y se mezclaron donadores y recipientes
en las proporciones adecuadas en función de la OD obtenida, para conseguir la relación
donador:recipiente deseada en cada caso. La mezcla se centrifugó 5 min a 4000 g y se
resuspendió en 1/10 del volumen inicial de LB con 0,5 mM IPTG.

Una vez preparada la mezcla, 15 µl (correspondiente a una OD600= 0.6

(aproximadamente 6 x 108 células)) se extendieron sobre la superficie de cada pocillo
relleno con agar y la placa se incubó a 37 ºC. Transcurrido el tiempo deseado en cada
caso, la mezcla de conjugación del pocillo se resuspendió en 1 ml de PBS y se
prepararon diluciones seriadas para plaquear en medio de selectivo para donadores,
recipientes y transconjugantes. Alternativamente, cuando se llevó a cabo análisis por
citometría, se fijó una muestra con paraformaldehído al 4% (siguiendo el protocolo
descrito en el apartado B1.8) y se guardó a 4 ºC hasta que fue utilizada.

En el caso de tiempos de incubación muy largos (24h), el exterior de la placa

multipocillo se rellenó con agua para evitar que el agar se secase demasiado durante la
incubación.

Para plaquear las conjugaciones se preparó una batería de diluciones 1/10. En

placas con los antibióticos correspondientes se sembró una gotita de 10 µl de cada
dilución (desde la 0 a la -6) por triplicado. De esta manera se preparó una placa para
donadores, una para recipientes y otra para transconjugantes que se crecieron a 37 ºC
toda la noche. Al día siguiente se contaron las colonias en la dilución contable que tenga
mayor número de colonias y el resultado obtenido para las tres réplicas de la misma
dilución se promedió. Con el resultado obtenido se calculó la frecuencia de conjugación
por donador o por receptor.

5. ENSAYOS CON FLUORESCENCIA

5.1. Determinación de la actividad transcripcional

Para el análisis de la actividad transcripcional se realizaron perfiles de expresión

de GFP, midiéndose la fluorescencia emitida por el cultivo a lo largo del tiempo. Para

56
ello se siguió el método descrito en (Zaslaver, et al., 2006) con algunas modificaciones.
Las medidas se llevaron a cabo usando un lector de placas Victor3 de Perkin Elmer con
dispensador, equipado con filtros de excitación y emisión adecuados para leer
fluorescencia de GFP (485 ± 15; 535 ± 25) y absorbancia a 600 nm.

Los cultivos con el plásmido reportero deseado se crecieron en medio M9

suplementado con glicerol y casaminoácidos, con el antibiótico de selección
correspondiente, a 37 ºC con agitación hasta que se obtuvo un cultivo saturado. Éste se
diluyó 1:10.000 en el mismo medio y se prepararon placas de 96 pocillos, añadiendo
150 µl por pocillo. Las placas se pusieron a crecer en el lector de placas Victor 3
programado para incubar a 37 ºC con agitación orbital durante 12 h, tomando medidas
de fluorescencia y absorbancia de cada pocillo aproximadamente cada 5 minutos. Para
compensar la evaporación durante la incubación, cada tres pasos de lectura se inyectó
agua en los pocillos (la evaporación en nuestro lector de placas se calculó que era de
0,28 µl por minuto y por pocillo).

El procesado de los datos obtenidos se llevó a cabo como en (Zaslaver, et al.,

2006) con algunas modificaciones (Fernandez-Lopez, et al., 2010). A los puntos de OD
se les restó el fondo, calculado a partir de un pocillo que contenía únicamente medio de
cultivo. El fondo para las lecturas de fluorescencia se obtuvo de las medidas de cultivos
con el pUA66 sin ningún promotor clonado (vector vacío) y se restó a los valores
obtenidos para la librería de clones pGP en la misma OD.

Para obtener los perfiles de expresión de cada promotor se representó el valor de

fluorescencia obtenido partido por la OD, frente al crecimiento del cultivo calculado a
partir de la OD medida transformada a valores equivalentes de OD600 para cubetas de
1 cm de lado. La actividad promotora se determinó a partir de los valores de
fluorescencia/OD cuando el sistema adquiría el estado de régimen o estado
estacionario.

Este método se comprobó que era equivalente al método descrito por el

laboratorio de U. Alon de medida de (dGFP/dt/OD) y cálculo del máximo, con la ventaja
de promediar varios datos alrededor del estado estacionario del promotor (Fernandez-
Lopez, et al., 2010).

57
 Figura MM2. Representación del sistema utilizado para determinar la actividad
transcripcional de promotores.
Los fragmentos que contienen los posibles promotores se clonan en el vector pUA66,
controlando la expresión de gfpmut2, de manera que si existe actividad promotora se
transcribirá el gen produciendo proteína fluorescente GFP. Los cultivos de células
conteniendo estas construcciones se miden utilizando un lector de placas Victor3, con
filtros para medir OD y fluorescencia. Con los datos obtenidos se obtiene el perfil de
expresión del promotor representando la fluorescencia por célula (GFP/OD) frente al
crecimiento de los cultivos (OD600), se identifica el estado estacionario y se calcula la
actividad del promotor promediando los valores.

5.2. Citometría de flujo

Los ensayos de citometría de flujo se realizaron utilizando un citómetro

FACScanto II (Beckton Dickinson) equipado con un láser de estado sólido de 488 nm,
un láser HeNe de 633 nm y un láser de diodo de estado sólido de 405 nm.

La detección de la fluorescencia se llevó a cabo utilizando los siguientes filtros:

- 530/30 nm band pass (FL1) para fluorescencia de GFP e YFP

- 585/42 nm band pass (FL2) o 670 nm long pass (FL3) para la fluorescencia roja
- 450/50 nm band pass para la fluorescencia CFP

Todos los datos se recogieron en escala logarítmica, incluyendo FSC y SSC. En

una representación FSC vs. SSC se estableció la población de bacterias que se
seleccionó como P1. En todos los experimentos se recogieron al menos 20.000 eventos
en P1 que se analizaron en los canales de fluorescencia adecuados según las proteínas
fluorescentes utilizadas en cada experimento.

58
 En los experimentos de conjugación, los datos recogidos en P1 se analizaron
utilizando gráficos GFP vs. RFP o bien YFP vs. CFP, donde se establecen cuadrantes
para delimitar las regiones correspondientes a los cuatro tipos de poblaciones (figura
MM3)

Figura MM3. Representación de los datos en los experimentos de citometría.

En la figura se muestran la acotación de poblaciones en los datos obtenidos por citometría
de flujo. En un gráfico FSC vs. SSC (gráfico de la izquierda) se identifica, por tamaño y
complejidad, la población correspondiente a E. coli que será la población de trabajo P1.
Los datos contenidos en P1 se representan en un gráfico YFP vs. CFP (gráfico del medio)
donde se lleva a cabo el estudio de las distintas poblaciones en relación a la expresión de
los marcadores fluorescentes: Q1 corresponde a los eventos YFP-CFP+; Q2 los dobles
positivas YFP+CFP+; Q3 son YFP+CFP-; Q4 los dobles negativos. Por último a la derecha
se muestran histogramas de cada uno de los parámetros fluorescentes representados
individualmente (arriba CFP y abajo YFP).

En cada experimento de citometría de flujo se utilizaron los controles adecuados

en función de los datos a adquirir. En todos los casos se utilizó un control negativo (o
blanco) y controles simples positivos para cada uno de los fluoróforos presentes en el
ensayo. Cuando fue posible se utilizaron también controles dobles positivos para las
fluorescencias utilizadas.

6. ENSAYOS DE ESTABILIDAD

Se realizaron adaptando el protocolo descrito por De Gelder (De Gelder, et al.,

2007). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado partiendo de tres colonias
aisladas que se inocularon en 5 ml de LB con los antibióticos correspondientes y se
crecieron hasta saturación a 30 ºC o 37 ºC con agitación. 1 ml de los cultivos saturados,
se centrifugó y se resuspendió en LB fresco para eliminar cualquier resto de antibiótico

59
y 5 µl se tranfieron a un matraz con 5 ml de LB fresco. Una muestra de este cultivo
recién inoculado se diluyó y se sembró en placas de LB-agar para obtener el valor a
tiempo 0, el resto del cultivo se puso a crecer a 30 ºC o 37 ºC con agitación durante 12h.
Una vez que el cultivo ha vuelto a saturarse se transfieren de nuevo 5 µl a un matraz
con 5 ml de LB fresco, que se pone a crecer a 30 ºC o 37 ºC con agitación otras 12h.

Este mismo esquema se repitió cada 12h hasta obtener unas 100 generaciones.
Se consideró que cada paso de dilución 1/1000 daba lugar a 10 generaciones antes de
que el cultivo volviese a alcanzar la saturación (12h). Cada 20 generaciones los cultivos
fueron diluidos y plaqueados en LB-agar. La determinación de la fracción de células libre
de plásmido se hizo replicando 100 colonias de cada placa de LB-agar en placas de LB-
agar con el antibiótico de selección del plásmido y de LB-agar sin antibiótico. Las células
que han perdido en plásmido no crecen en la placa con el antibiótico de selección.

7. MEDIDA DEL NÚMERO RELATIVO DE COPIAS DE PLÁSMIDO

Los experimentos para obtener el número de copias de los plásmidos IncW se

llevaron a cabo siguiendo el protocolo descrito en Lee et al. (Lee, et al., 2006) para la
cuantificación relativa. Este método permite la cuantificación del número de copias
mediante PCR tiempo real cuantitativa, comparando la amplificación obtenida para un
gen diana (gen del plásmido) respecto a un gen de referencia presente en el cromosoma
bacteriano.

Se crecieron cultivos de DH5α con pIE321, R388 y R7K, a 37 ºC durante toda la

noche. Estos cultivos se diluyeron y se crecieron hasta una OD600 de 0,4 – 0,6 y se
extrajo el DNA total de cada uno de ellos utilizando el kit QIAamp DNA Mini kit (Qiagen)
siguiendo el protocolo descrito por el fabricante para células bacterianas. La
concentración de DNA extraído de E. coli se midió y se normalizo a 2 ng/l con agua
desionizada y destilada (ddW). Este DNA molde preparado se utilizó para cuantificar el
número de copias mediante experimentos de PCR tiempo real, llevados a cabo por
triplicado.

El ensayo de PCR tiempo real se realizó utilizando cuatro parejas de oligos que
amplifican regiones diana conservadas en los tres plásmidos y dos parejas de oligos
para amplificar dos genes de referencia en el cromosoma bacteriano, rho y dxs (ver
tabla MM5). La amplificación y análisis por qPCR se llevó a cabo usando un equipo iQ5
de Bio-Rad, determinándose el ciclo umbra (Ct) utilizando el software del equipo.

60
Previamente a los experimentos se comprobó que la eficiencia de todos los oligos era
equivalente utilizando cuatro diluciones 1/10 de la muestra y aplicando la fórmula
(E=10^(-1/pendiente)-1).

Nombre Secuencia (5’→3’) Producto

orf7left GAAGGCCGCGAGAACTGAC
orf7-8
orf8right ATGTCGGGCACTTCGTACTC
klcbleft ATAAAGCCCCGTTTGCATC
klcB-orf14
orf14right GTTTCCGCCTTGTCGAAATA
trwCleft CAACAGCCCGCGCATGATC
trwC-D
trwDright TTCAAAGATCGGAAGCTGGT
int14right GCCTTCGTTAGGTGCTGAA
oriV
respleft CGAGCAAACCGTATTTTTGG
rhodir AAATATGGGGCTGGAAAACC
rho
rhorev GTAGGAGCTGTCTGCGGAAC
dxsdir CGAGAAACTGGCGATCCTTA
dxs
dxsrev CTTCATCAAGCGGTTTCACA

Tabla MM5. Oligonucleótidos utilizados en los experimentos PCR tiempo real.

En la tabla se recogen las parejas de oligos y las dianas amplificadas en los en los
experimentos de cuantificación relativa de los plásmidos. Los cuatro primeros (orf7-8; klcB-
orf14; trwC-D; oriV) corresponden a marcadores del plásmido, mientras que los dos
últimos (rho; dxs) son genes los genes del cromosoma utilizados como referencia.

La mezcla de QPCR se preparó en un volumen de 20 µl usando IQ SYBER Green

Supermix y el protocolo de amplificación utilizado fue: 10 min a 95 ºC de
desnaturalización inicial, seguido de 40 ciclos de 10 s a 95 ºC, 10 s a 62 ºC y 10 s a 72
ºC. La señal de fluorescencia se midió al final de cada paso de extensión a 72 ºC. Tras
la amplificación, se llevó a cabo el análisis de la curva de melting para confirmar que
solo se hubiese producido amplificación de los productos específicos.

Para la obtención del número de copias relativo se calculó ΔCt (Ct cromosoma -
Ct plásmido) para cada uno de los plásmidos, obteniéndose el número de copias como
2ΔCt.

8. TEORÍA: ESTIMACIÓN DE LA TASA DE CONJUACIÓN A TIEMPO FINAL

(γ)

61
 Con el fin de obtener un indicador robusto de la transferencia plasmídica,
seguimos el modelo propuesto por Levin (Levin, et al., 1979) según las adaptaciones de
Simonsen (Simonsen, et al., 1990) y Zhong et al. (Zhong, et al., 2012) para estimar la
tasa de conjugación γ.

Debido a las características de nuestro procedimiento experimental, que transfiere

únicamente el oriT en lugar de un plásmido tra+ completo y la utilización de la citometría
de flujo para obtener los datos, adaptamos la ecuación para el cálculo de γep descrita en
el modelo anterior según se expone a continuación.

Mantenemos las asunciones de las citadas referencias: i) la conjugación ocurre

de manera aleatoria, ii) no hay pérdida significativa del plásmido por segregación, iii)
todas las células bacterianas tienen la misma velocidad de crecimiento y, a diferencia
del modelo original, la cuarta asunción es que: iv) los transconjugantes no son capaces
de transferir el plásmido a nuevos receptores.

Con estas restricciones iniciales, el sistema de ecuaciones diferenciales para las

densidades dependientes del tiempo de los tres tipos celulares (D, R y T) y la
concentración de nutrientes (C) vendría dado por:

𝑅𝑅̇ =̇ 𝜓𝜓(𝐶𝐶). 𝑅𝑅 − 𝛾𝛾(𝐶𝐶). 𝑅𝑅. 𝐷𝐷

𝐷𝐷̇ = 𝜓𝜓(𝐶𝐶). 𝐷𝐷

𝑇𝑇̇ = 𝜓𝜓(𝐶𝐶). 𝑇𝑇 ̇ + 𝛾𝛾(𝐶𝐶). 𝑅𝑅. 𝐷𝐷

𝐶𝐶̇ = −𝜓𝜓(𝐶𝐶). (𝑅𝑅 + 𝐷𝐷 + 𝑇𝑇). 𝑒𝑒

donde ψ denota la tasa de crecimiento (h-1), γ la tasa de conjugación (ml cel-1 h-1) y e
(µg) es la cantidad de recurso requerido para producir una nueva célula.

Según establece Simonsen et al. (Simonsen, et al., 1990), el crecimiento y las

tasas de transferencia son iguales para todos los tipos celulares (D, R y T) y funciones
de Monod (Monod, 1949) de la concentración de nutrientes:

𝜓𝜓(𝐶𝐶) = 𝜓𝜓𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 𝐶𝐶/(𝐶𝐶 + 𝐾𝐾)

𝛾𝛾(𝐶𝐶) = 𝛾𝛾𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 𝐶𝐶/(𝐶𝐶 + 𝐾𝐾)

donde γmax es el valor estimado por el método de punto final (desde ahora γep) y K es la
constante de media saturación (µg mL-1). De las asunciones sobre dependencia de
nutrientes de las constantes de crecimiento y conjugación, se puede inferir que
γ(C)/ψ(C) = γep/ψmax es una constante. Esta apreciación es crucial en la derivación de

62
las ecuaciones para calcular γ, como se explica en Levin et al. (1979) y Simonsen et al.
(1990). Simonsen demostró mediante simulaciones complejas que estas estimaciones
son bastante robustas y que las diferencias en las tasas de crecimiento de D, R y T
tienen poco efecto en el resultado (excepto cuando las células que llevan el plásmido
tienen ventaja en el crecimiento).

Del desarrollo posterior de las ecuaciones puede ser deducido que la estimación
de la tasa de conjugación de punto final cuando los transconjugantes no son capaces
de volver a transferir el plásmido vendría dada por:

𝑇𝑇
𝛾𝛾𝑒𝑒𝑒𝑒 = 𝜓𝜓𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 (𝐷𝐷 − 𝐷𝐷0 )−1 ln( + 1)
𝑅𝑅

donde D sería la densidad a tiempo final de los donadores y D0 la densidad inicial (cel
mL-1). Dado que en nuestro modelo experimental la frecuencia de conjugación viene
dada Y = T/(R + T), entonces la ecuación (2) se puede convertir en:

1
𝛾𝛾𝑒𝑒𝑒𝑒 = 𝜓𝜓𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 (𝐷𝐷 − 𝐷𝐷0 )−1 ln( )
1 − 𝑌𝑌

De esta manera, la primera ecuación usaría los parámetros T y R obtenidos en los

ensayos de citometría de flujo mientras que la segunda usa las frecuencias de
conjugación obtenidas en los experimentos por el método tradicional de plaqueo.

9. OBTENCIÓN DE CURVAS DE CRECIMEINTO Y CÁLCULO DEL TIEMPO

DE GENERACIÓN

La obtención de curvas de crecimiento bacteriano se llevó a cabo utilizando un

lector de placas Victor3 (Perkin Elmer) equipado con un filtro de 600 nm y placas
microtiter de 96 pocillos.

Los cultivos de interés se crecieron a partir de colonias puntuales toda la noche a

37 ºC en medio LB con los correspondientes antibióticos. Una vez crecidos los cultivos
se diluyeron 1:1000 en LB fresco y se pusieron a crecer en placas de 96 pocillos en el
Victor3 programado para incubar a 37 ºC con agitación orbital durante 8h, midiendo la
absorbancia de los pocillos cada 5 min. Para contrarrestar la evaporación se introdujo
un paso de inyección de agua en los pocillos.

63
 Los valores de absorbancia contenidos en el equipo se transformaron en
equivalentes de OD600 usando una curva calibrada con medidas realizadas en cubetas
de 1cm de lado en un espectrofotómetro convencional. Cada experimento consta de 8
réplicas de cada cultivo, que se promediaron obteniéndose también la desviación
estándar de las medidas, que se representa en las gráficas como barras de error de
cada punto de la curva.

El tiempo de generación en fase exponencial se calculó de los datos de OD600.

Se obtuvo el ln de los valores de OD600 entre 0,2 y 0,5, y se calculó la tasa de
crecimiento (α) por regresión lineal. El tiempo de generación se calculó aplicando la
ln(2)�
fórmula 𝑔𝑔 = 𝛼𝛼

10. PURIFICACIÓN DE ResP DE R388

Para su purificación, ResP se expresó como una proteína recombinante unida a

una cola de histidinas y se purificó por cromatografía de afinidad utilizando una columna
HisTrap HP (GE healthcare) y un segundo paso de cromatografía de gel filtración con
Superdex S75 (GE healthcare).

El gen resP de R388 se amplificó utilizando los oligos resPNdeI y resPXhoI (tabla
MM3 de materiales y métodos) que añaden sitios de corte para las enzimas NdeI (en el
extremo 3’ del fragmento) y XhoI (en el 5’) y se clonó en el vector de expresión pET29c
(Novagen) utilizando los sitios de corte del vector. La construcción se introdujo por
electroporación en la cepa E. coli C41 (Miroux and Walker 1996) para su sobreexpresión
y purificación.

Se creció un preinóculo de C41 (pET29c-resP) a 37 ºC en 25 ml de LB con Km.

Con este cultivo se inoculó un matraz de 1 litro de medio LB y se creció hasta una OD600
de 0.6 momento en el que se añadió 0.5 mM de IPTG y se incubaron las células a 37
ºC durante 3h más para permitir la expresión. Transcurrido este tiempo, las células se
recogieron por centrifugación y el pellet se congeló a -80 ºC.

Para proceder a la purificación, el pellet de células se resuspendió en 45 ml de

buffer A (50 mM Tris pH 7.5, 1M NaCl) con 0.002% PMSF. Las células se lisaron por
sonicación usando un sonicador Vibra Cell (Sonic & Materials Inc.) y el lisado se
centrifugó a 40,000 g durante 20 minutos at 4 °C.

64
 El sobrenadante obtenido se cargó en una columna His trap HP (GE healthcare)
previamente equilibrada con buffer A (50 mM Tris pH 7.5, 1M NaCl). Tras pasar la
muestra, las proteínas unidas a la columna fueron eluídas en un gradiente lineal de
imidazol (0–500 mM) utilizando buffer B (50 mM Tris pH 7.5, 1 M NaCl, 500 mM
imidazol).

Las fracciones en las que eluyó ResP se cargaron en una columna de gel filtración
Superdex 75 (GE healthcare) equilibrada con buffer C (Tris 50 mM pH 7.5, 150 mM
NaCl, 1 mM EDTA) y eluída con el mismo buffer. Se identificaron las fracciones con
ResP-His purificada y se guardaron a -80 ºC añadiendo 20% glicerol.

Para comprobar el adecuado progreso de cada uno de los pasos de la purificación,

se guardaron muestras que se corrieron en geles SDS-PAGE 10%. Las muestras se
mezclaron 1/5 en tampón de carga (SAB 5x: Tris-HCl pH 6,8 250 mM, SDS 5 % (p/v),
glicerol 50 % (p/v), azul de bromofenol 0,05 % (p/v), DTT 250 mM) y se calentaron
durante 2 minutos a 95 ºC. La electroforesis se llevó a cabo en tampón Tris 25mM,
glicina 192mM, SDS 0,1% (p/v) a 100V. Tras la electroforesis, los geles se tiñeron con
tinción de Coomassie.

11. ENSAYOS DE RETARDO EN GEL CON RESP (EMSA)

Utilizando una batería de oligos (tabla MM3) se generaron distintos fragmentos de

dsDNA mediante PCR sobre el plásmido R388.

En un ensayo EMSA estándar, se mezclaron 0.2-0.5 pmol de los fragmentos de

DNA con concentraciones crecientes de ResP-His purificada, en un volumen final de 20
μl de reacción (50mM Tris pH7.5, 50mM NaCl, 1mM DTT, 0.1 mM EDTA, 5% glicerol) y
se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente.

Tras la incubación, las mezclas de reacción se cargaron en un gel nativo de

poliacrilamida al 5%. La electroforesis se desarrolló a 100V durante 45 min en tampón
TBE. Para revelar el gel, éste se tiñó usando una solución 1x de SYBR Gold y se
escanearon usando un sistema de análisis de imagen FLA-5100 (Fujifilm) con un láser
de 473 nm.

65
66
RESULTADOS
 RESULTADOS

1. ESTUDIO DE LA REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DEL PLÁSMIDO

R388

Numerosos estudios a nivel bioquímico han hecho del plásmido R388 uno de los
modelos fundamentales en el estudio de la transferencia conjugativa en enterobacterias.
Sin embargo, a pesar del conocimiento detallado de la bioquímica de las proteínas
implicadas en la conjugación, al comienzo de esta tesis existía un desconocimiento
general sobre otros aspectos fundamentales de la biología del plásmido. Estudios de
secuenciación revelaron la presencia de un gran número de secuencias repetidas en el
genoma del plásmido (Fernandez-Lopez, et al., 2006). Estos mismos estudios y otros
datos obtenidos en nuestro laboratorio (Fernandez-Lopez, 2007) indicaban la presencia
de al menos 5 reguladores transcripcionales y apuntaban la posible existencia de una
red global de control transcripcional en el plásmido.

En base a estos resultados preliminares, uno de los objetivos fundamentales de

esta tesis consistió en la caracterización cuantitativa de la red de regulación
transcripcional del plásmido.

1.1. Determinación de la actividad transcripcional de los promotores

de R388

La primera tarea en el estudio de la red transcripcional de R388 fue caracterizar

la actividad transcripcional de sus promotores hipotéticos. Basándonos en la secuencia
genética del plásmido R388 (nº acceso BR000038) clonamos las regiones intergénicas
incorporando fragmentos de unos 200 pb en el vector reportero de bajo número de
copias pUA66. Este procedimiento se llevó a cabo siguiendo lo descrito en materiales y
métodos para la construcción de la librería pGP (apartado B2). . Estas regiones fueron
clonadas de forma que el fragmento controlaría la transcripción de un gen gfpmut2
precedido de un RBS fuerte. GFPmut2 (Cormack, et al., 1996) es una proteína
fluorescente verde que madura en 5 minutos, es estable y no tóxica en E. coli, de manera
que la producción y acumulación de fluorescencia en las células nos permitiría detectar
la presencia de actividad transcripcional en los fragmentos clonados. (Zaslaver, et al.,
2006).

69
 Los clones de los posibles promotores se introdujeron en la cepa de E. coli
BW27783, que es la cepa utilizada preferentemente en prácticamente todos los
experimentos de este trabajo. Se trata de un derivado de E. coli K12, con la mutación
lacIq, con el sistema de transporte de arabinosa modificado y capaz de crecer en medio
mínimo, por lo que se ajusta muy bien a las necesidades de nuestros experimentos.

Se midió la producción de fluorescencia de la librería pGP utilizando un lector de

placas Victor3, siguiendo el método descrito en la sección B5.1 de materiales y métodos
para la determinación de la actividad transcripcional. De esta manera, los plásmidos
reporteros construidos nos permiten inferir la actividad transcripcional de las regiones
intergénicas clonadas en ellos.

Para llevar a cabo estas medidas, se decidió sustituir el medio LB utilizado de

manera rutinaria para crecer los cultivos de E. coli por un medio mínimo M9
suplementado con casaminoácidos y glicerol. La elección de este medio de cultivo se
debe a que presenta varias características que resultan ventajosas para nuestros
experimentos. Por un lado, es un medio con poca autofluorescencia, de manera que
permite reducir mucho la señal fondo y aumentar la sensibilidad de los ensayos. Por otro
lado, es un medio definido (a diferencia del LB) lo que nos permite mantener unas
condiciones de cultivo uniformes en los distintos ensayos. La utilización de un medio
mínimo con glicerol como fuente carbono contribuyó a aumentar la sensibilidad de los
ensayos ya que al aumentar los tiempos de generación nos permitió alargar la duración
de la fase exponencial en las medidas en el lector de placas. Además, la utilización de
glicerol como fuente de carbono nos proporciona un medio donde podemos utilizar
arabinosa y glucosa para trabajar con el sistema de expresión araBAD.

La actividad transcripcional de la librería pGP se midió de acuerdo a lo descrito en

Materiales y Métodos, y los resultados recogidos en la tabla R1 y figura R1, representan
el promedio y la desviación estándar de al menos 10 experimentos independientes.

Tabla R1. Actividad transcripcional obtenida para los distintos clones pGP en unidades
arbitrarias de fluorescencia.

Actividad transcripcional SD
Plásmido Promotor
2
(u.a.f) (x10 ) (x102)
pGP1 432 43 PresP
pGP2 230 16 PkfrA
pGP3 <1 2 -
pGP4 1136 425 PardC

70
 pGP5 808 96 PORF7
pGP6 <1 3 -
pGP7 <1 3 -
pGP8 758 59 Pssb
pGP9 <1 3 -
pGP10 465 53 PORF12
pGP11 197 32 PORF14
pGP12 859 77 PstbA
pGP13 161 29 PtrwA
pGP14 628 63 PtrwH
pGP15 578 54 PkorA
pGP16 672 80 PkikA
pGP17 9 5 PkorB
pGP18 4 9 Pint
pGP19 945 94 Pant
pGP20 <1 2 -

Figura R1. Actividad transcripcional calculada para cada uno de los posibles
promotores de R388 contenidos en la librería pGP.
Las medidas se realizaron en un lector de placas Victor3 según el procedimiento indicado
en materiales y métodos (B5.1), realizándose al menos 10 medidas independientes de
cada dato. Las columnas del gráfico representan el promedio de la actividad obtenida para
cada uno de los posibles promotores y las barras de error corresponden a la desviación
estándar. La actividad transcripcional se expresa como cantidad de fluorescencia por
célula (GFP/OD600).

71
 De todas las regiones clonadas en la librería pGP, se consideró que contenían un
promotor aquellas que manifestaron una expresión de fluorescencia de, al menos, dos
veces la medida para el vector pUA66 vacío. Así, de las 20 regiones seleccionadas
inicialmente se determinó que 15 de ellas contendrían un promotor, mientras que las
otras no parecían manifestar actividad transcripcional significativa.

Como las medidas de actividad transcripcional obtenidas en el lector de placas

son medias poblacionales, los cultivos se pasaron por citometría de flujo para comprobar
la uniformidad de la población, comprobándose en todos los casos que se obtenía un
solo pico de fluorescencia con una distribución uniforme (datos no mostrados).
Únicamente se encontró un comportamiento diferente en el caso de pGP4, que ya había
mostrado un comportamiento bastante variable en las medidas en el lector de placas.
Recién aislado este promotor presenta un pico de fluorescencia muy alta bien definido,
pero con el tiempo la población se va disgregando apareciendo varios picos en el
citómetro con una fluorescencia intermedia o baja. Cuando hemos aislado y
secuenciado estas poblaciones todas ellas contienen el pGP4 pero se han producido
algunas deleciones en la región de promotora. Por lo que hemos observado esto solo
ocurre cuando el promotor está desregulado.

Dado que los perfiles de expresión producen unos valores de transcripción en

unidades arbitrarias de fluorescencia, para tratar de establecer la fuerza de los
promotores de R388 decidimos medir la actividad de dos promotores estándar,
ParaBAD y PlacZ. En el caso de ParaBAD se midió la actividad del promotor con
concentraciones crecientes de arabinosa en el medio hasta alcanzar una actividad
máxima de 1*105 unidades de GFP/OD (figura R4 en el apartado 1.3) valor se tomó
como referencia de actividad promotora alta. Como referencia para un promotor
reprimido o en estado de mínima actividad, se midieron los niveles de PlacZ en una
cepa lacIq, donde el represor de PlacZ (LacI) se expresa constitutivamente, en ausencia
de inductor, obteniendose valores de 1*103 GFP/OD.

Estos valores de referencia nos permiten analizar los resultados en UAF

obtenidos para los promotores de R388. De las medidas obtenidas para los promotores
de R388 aislados, 13 de los 15 mostraron niveles equivalentes o superiores al valor
máximo mostrado por ParaBAD por lo que consideramos que los promotores de R388
en ausencia de regulación presentan una actividad promotora fuerte. Únicamente PkorB
y Pint presentan actividades muy bajas, que se encuentran prácticamente en el nivel del
ruido de fondo de nuestros experimentos.

72
 1.2. Actividad de los promotores en presencia de R388

Una vez determinada la actividad transcripcional de los distintos promotores de

forma aislada, se quiso establecer el estado en el que se encuentran cuando están
integrados en la red del plásmido, para lo que se midieron todos los clones de la librería
pGP en presencia del plásmido R388 completo. Se pasó R388 por conjugación a las
células BW27783 que contenían la librería pGP, seleccionándose los transconjugantes
como células KmRTpR. Igual que en el caso anterior, los cultivos se midieron en medio
mínimo M9 utilizando el lector de placas Victor3 y siguiendo el protocolo descrito en
materiales y métodos (apartado B5.1).

Los resultados obtenidos se muestran en la figura R2. Como se puede observar,

en presencia de R388 13 de los 15 promotores identificados mostraron un descenso
muy significativo en los niveles de fluorescencia, mientras que los dos restantes
mantuvieron prácticamente el mismo nivel de expresión que cuando estaban aislados.
Los índices de represión obtenidos van desde 5 para PresP hasta más de 500 en el
caso de Porf7.

Figura R2. Actividad transcripcional de los promotores de R388 solos y con el

plásmido completo.
Las medidas se realizaron en un lector de placas Victor3 según el procedimiento indicado
en materiales y métodos, realizándose al menos 10 medidas independientes de cada dato.
En verde se representa la actividad de los promotores aislados y en negro la actividad
medida en presencia del plásmido R388. La actividad transcripcional se expresa como
cantidad de fluorescencia por célula (GFP/OD600).

Nos encontramos con que seis de los promotores de R388 (PardC, Porf7, Porf14,
Porf12, PkorB, PtrwH) bajaron sus niveles de expresión hasta el nivel del ruido de fondo,

73
mostrando valores por debajo de los obtenidos en las medidas de PlacZ reprimido (1*103
GFP/OD) que habíamos tomado como referencia de un promotor apagado. Otros siete
promotores (PresP, PkfrA, PssB, PstbA, PtrwA, PkorA, PkikA) mostraron valores
alrededor del mismo orden de magnitud de PlacZ reprimido (entre 1 y 7*103 GFP/OD).

Los dos promotores restantes, Pint y Pant, no mostraron cambios significativos en

su nivel de expresión al ensayarse en presencia de R388, manteniendo los niveles de
expresión correspondientes al promotor desregulado (figura R3). Se da la circunstancia
de que estos dos promotores no forman parte del esqueleto plasmídico propiamente
dicho sino que se encuentran dentro de un integrón In-1 que se encuentra insertado en
R388 y que parece que evolutivamente ha sido la adquisición más reciente del plásmido
(Revilla, et al., 2008).

Pint Pant
120000
3000
100000
2500
Promotor solo
80000
GFP/OD600

+ R388
GFP/OD600

2000 Promotor solo

60000 + R388
1500

40000
1000

20000
500

0 0
0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8 0,95 0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8 0,95

OD600 OD600

Figura R3. Perfiles de expresión transcripcional del Pint y el Pant de R388.

Las medidas se realizaron en un lector de placas Victor3 según el procedimiento indicado
en el apartado B5.1 de materiales y métodos. En verde se representa el perfil de actividad
transcripcional de los promotores aislados y en negro la actividad medida en presencia del
plásmido R388. La actividad transcripcional se representa como cantidad de fluorescencia
por célula (GFP/OD600) frente al crecimiento del cultivo (OD600).

También se ensayaron en presencia de R388 los clones de la librería pGP para

los que no se había detectado actividad transcripcional al medirlos aislados, con el fin
de descartar que estuviésemos obviando algún promotor que pudiese necesitar de un
activador presente en el plásmido. En ninguno de los cinco casos se observó ningún
cambio en presencia de R388.

En conjunto estos resultados indican:

i) Que los promotores de R388 muestran una gran actividad intrínseca: en

ausencia de regulación producen altos niveles de transcripción.

74
 ii) Que la presencia de la red de regulación del plásmido mantiene estos
promotores altamente reprimidos, de lo que se deduce que la regulación en
el plásmido R388 esta mediada fundamentalmente por represores
transcripcionales.

iii) Que las diferencias entre el estado activado y el estado reprimido de los
promotores del plásmido son, de forma general, muy altas. Decimos por tanto
que los promotores de R388 tienen una alta ganancia.

1.3. Obtención de un sistema de expresión controlada para los

reguladores

Para poder estudiar el efecto de los posibles reguladores sobre los promotores,
era necesaria la utilización de un sistema que permitiese inducir la expresión del
regulador de manera controlada y medible.

Para ello se optó por el sistema de expresión dependiente de arabinosa araBAD,

utilizándose el vector desarrollado por Guzman et al. (Guzman, et al., 1995) pBAD33,
que permite clonar los ORFs bajo el control de dicho promotor.

La elección del sistema araBAD se basó fundamentalmente en la capacidad de

inducir de manera muy controlada la expresión a partir del promotor. En la mayor parte
de los promotores inducibles existe un circuito de feedback positivo que genera una
biestabilidad en el efecto del inductor. En el caso de araBAD esta biestabilidad está
causada porque AraE, un transportador activo de arabinosa, se encuentra bajo el control
del propio sistema. Como consecuencia la inducción por arabinosa cierra un feedback
positivo que resulta en una inducción biestable (Santillan, et al., 2007).

Para superar este problema, Keasling et al., construyeron la cepa E.coli Bw27784,
que contiene el gen araE bajo un promotor de expresión constitutiva (Khlebnikov, et al.,
2001). De este modo se consigue una inducción de la expresión progresiva y controlable
de ParaBAD al añadir al medio de cultivo cantidades crecientes de arabinosa. Para
poner a prueba este funcionamiento utilizamos una construcción ParaBAD::gfpmut2 en la
cepa E.coli BW27783. Indujimos su expresión mediante cantidades crecientes de
arabinosa y medimos la actividad transcripcional mediante citometría de flujo (Figura
R4). Como se muestra en la figura, nuestros resultados no mostraron rastro de bi-
estabilidad, sino que toda la población se desplaza homogéneamente a lo largo del eje
X a medida que aumenta la concentración de arabinosa. Tras comprobar el

75
comportamiento homogéneo de la población, se midió también la respuesta poblacional
al incremento de las concentraciones de arabinosa mediante la realización de perfiles
de expresión del promotor a concentraciones crecientes de arabinosa, siguiendo el
procedimiento descrito en el apartado B5.1 de materiales y métodos.

[Arabinosa]
Eventos

Intensidad de fluorescencia

Figura R4. Respuesta de pBAD::gfpmut2 en la cepa BW27783 a la inducción por

arabinosa.
La figura de la izquierda muestra los histogramas de distribución de fluorescencia en la
población obtenidos por citometría para cultivos inducidos con concentraciones crecientes
de arabinosa (cada color corresponde a un cultivo). La figura de la derecha muestra los
perfiles de expresión obtenidos en el lector de placas de los cultivos BW27783 con
pBAD33::gfpmut2. Cada curva corresponde a una concentración de arabinosa del rango
indicado en la derecha de la imagen. El gráfico enfrenta los niveles de fluorescencia por
células (GFP/OD600) frente al crecimiento del cultivo (OD600), en gris se destaca la zona en
la que se alcanza el estado estacionario.

Los datos obtenidos en las medidas de expresión de GFP se ajustaron a una

función Michaelis-Menten (R2=0.99), obteniéndose una expresión matemática que
permitiría inferir el nivel de expresión de ParaBAD como una función de la concentración
de arabinosa añadida al medio (figura R5). De esta manera, el sistema nos permitiría
inferir el cambio relativo en las concentraciones de regulador producido en estado
estacionario para los clones pAR en BW27783, de acuerdo a la curva standard obtenida
para ParaBAD::gfpmut2.
Fluorescencia por célula

FL1

% (p/v)

76
 Figura R5. Ajuste de la curva de respuesta a la inducción por arabinosa de
pBAD33::gfpmut2 en BW27783.
En el gráfico de la izquierda se representan los valores medios de fluorescencia obtenidos
para los cultivos de BW27783 (pBAD33::gfpmut2) inducidos, frente al rango de
concentraciones de arabinosa utilizado. En la parte superior del gráfico se muestran los
parámetros del ajuste (en el cuadro interior se muestra lo mismo utilizando los valores de
arabinosa en escala logarítmica).

1.4. Búsqueda combinatoria de reguladores transcripcionales en

R388

Para tratar de identificar todos los posibles reguladores transcripcionales

presentes en R388 así como individualizar su efecto regulatorio sobre la actividad
transcripcional de cada promotor, se llevó a cabo una estrategia combinatoria. Se
construyó una librería de clones de los ORFs del plásmido identificados como posibles
reguladores, o aquellos sin función asignada, clonados en un vector pBAD33 (librería
pAR) y se ensayó cada uno de los reguladores con toda la librería pGP (figura R6).

arabinosa arabinosa

PBAD PBAD

Regulador pBAD33 vacío

Promotor gfpmut2
Promotor gfpmut2

Figura R6. Esquema del diseño experimental utilizado para identificar los posibles
reguladores.
Por un lado se mide la actividad transcripcional de los distintos clones de la librería pGP
en BW27783 con pBAD33 vacío para obtener la actividad del promotor sin regulador (a la
derecha de la figura). Por otro, se mide la actividad de los mismos clones en BW27783
con cada uno de los plásmidos de la librería pAR que contienen los posibles reguladores
de R388 (a la izquierda de la figura). Los perfiles de expresión se obtuvieron según el
procedimiento descrito en el aparatado B5.1 de MM, añadiendo al medio de cultivo
arabinosa para inducir la expresión de los reguladores clonados en pBAD33.

77
 Se determinó la actividad transcipcional de cada uno de los promotores mediante
la obtención del perfil de expresión de fluorescencia en presencia del vector pBAD33
vacío y se comparó este resultado con el obtenido al medirlos en presencia de cada uno
de los posibles reguladores de R388. Los resultados obtenidos se encuentran recogidos
en la tabla R2.

Actividad del promotor (x102) (GFP/OD)

+ pBAD33 + pAR1 + pAR3 + pAR4 + pAR11 + pAR12 + pAR13 + pAR14
P resP 350 ± 8 <1 406 ± 6 355 ± 6 368 ± 11 369 ± 12 344 ± 7 323 ± 7
P kfrA 188 ± 17 206 ± 2 4±3 201 ± 7 187 ± 4 165 ± 6 206 ± 9 204 ± 5
P ardC 1662 ± 352 * * 10 ± 1 43 ± 4 * * *
P ORF7 690 ± 79 614 ± 13 637 ± 16 3 ± 0,7 6±2 607 ± 17 619 ± 14 700 ± 9
P ssb 857 ± 127 938 ± 12 821 ± 97 <1 801 ± 67 777 ± 12 718 ± 15 942 ± 18
P ORF12 403 ± 47 398 ± 12 390 ± 13 30 ± 3 9±1 395 ± 14 396 ± 17 406 ± 4
P ORF14 170 ± 12 158 ± 6 155 ± 6 6 ± 0,3 9±2 165 ± 5 155 ± 4 154 ± 6
P stbA 915 ± 52 990 ± 17 959 ± 72 945 ± 24 17 ± 4 872 ± 88 1044 ± 21 1120 ± 310
P trwA 144 ± 9 179 ± 48 129 ± 5 133 ± 10 146 ± 3 <1 170 ± 8 184 ± 4
P trwH 662 ± 69 634 ± 15 530 ± 14 590 ± 15 264 ± 8 567 ± 9 2 ±1 558 ± 34
P korA 526 ± 57 481 ± 18 490 ± 6 492 ± 13 56 ± 3 479 ± 7 17 ± 1 577 ± 32
P kikA 707 ± 73 666 ± 15 ND 767 ± 14 204 ± 8 ND 11 ± 2 739 ± 31
P korB 8±2 7±2 ND 8±1 5±2 10 ± 2 <1 12 ± 1

Tabla R2. Resultados obtenidos en la búsqueda combinatoria de reguladores

transcripcionales en R388.
En la tabla se recogen los valores medios de actividad transcripcional medidos para los
promotores de R388 en el estado estacionario, acompañados de la desviación estándar.
Cada fila corresponde a un promotor clonado en la librería pGP y cada columna a un clon
pAR, excepto la primera que contiene los valores de los promotores con el vector pBAD33
vacío. Los colores utilizados tratan de indicar la región/función en la que se encuentran
implicados los distintos genes (azul: replicación, gris y verde: zona de mantenimiento
estable; morado y rosa: genes implicados en conjugación). Los valores que aparecen
señalados en amarillo corresponden a la interacción de un regulador con promotores de
otro módulo funcional distinto. Los valores representados son los obtenidos para la
máxima inducción de regulador sin afectar al crecimiento de los cultivos (normalmente
arabinosa 10-3%).

Además de los mostrados en la tabla, se ensayaron también otros ORFs de R388

que consideramos que podrían actuar como reguladores transcripcionales: repA, klcB,
orf7, orf8, orf9, orf12, orf14. En ninguno de estos casos se encontró evidencia de
actividad reguladora sobre los promotores de sus correspondientes operones (o los de
regiones próximas o relacionadas).

Cuando se determinó la actividad del promotor PresP (plásmido pGP1) en

presencia del plásmido pAR1 que codifica para la resolvasa resP, observamos un
descenso de la actividad transcripcional de dos logaritmos respecto al valor obtenido en

78
presencia del vector pBAD33 vacío mientras que ningún otro regulador transcripcional
mostró un efecto significativo en PresP.

El promotor PkfrA fue reprimido por la proteína KfrA, como mostró la comparación
entre los perfiles de expresión de fluorescencia en presencia (+pAR3) y en ausencia
(+pBAD33) de KfrA. Al igual que para PresP, ningún otro regulador transcripcional alteró
la expresión de PkfrA, ni KfrA afectó a ningún otro promotor de R388.

Como era de esperar, se confirmó el rol regulador de TrwA sobre el operón trwABC
(Moncalian, et al., 1997), observándose una disminución de 150 veces en la expresión
del promotor PtrwA (pGP12) cuando se indujo la expresión de trwA con el plásmido
pAR12. No se detectó ningún efecto por parte de ningún otro regulador sobre este
promotor.

De esta manera, encontramos que las proteínas ResP, KfrA y TrwA regulan sus
propios operones y no muestran efecto sobre otros promotores, estableciéndose en
cada caso un circuito de feedback loop negativo simple. En la figura R7 se muestran los
perfiles de expresión se estos promotores en presencia y ausencia de regulación.

PresP PkfrA PtrwA

50000 30000
14000
25000
40000 12000
20000
GFP/OD600

10000
GFP/OD600

GFP/OD600

30000 Promotor solo

15000 8000 + R388
Promotor solo + pAR12 (ara-)
Promotor solo + R388
20000 6000 + pAR12 (ara+)
+ R388 10000 + pAR3 (ara-)
+ pAR1 (ara-) + pAR3 (ara+) 4000
10000 + pAR1 (ara+) 5000
2000
0 0 0
0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8 0,95 0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8 0,95 0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8 0,95
OD600 OD600 OD600

Figura R7. Perfiles de expresión transcripcional de los promotores PresP, PkfrA y

PtrwA de R388.
En la figura se recogen los perfiles de expresión obtenidos según se describe en el
apartado B5.1 de materiales y métodos. En verde se representa el perfil de actividad
transcripcional de los promotores aislados y en negro la actividad medida en presencia del
plásmido R388. En rojo y naranja se representan los perfiles obtenidos en presencia de
sus reguladores, a máxima y mínima inducción con arabinosa, respectivamente. La
actividad transcripcional se representa como cantidad de fluorescencia por célula
(GFP/OD600) frente al crecimiento del cultivo (OD600).

Como ya se había establecido en trabajos previos, los promotores PardC, Porf7,

Pssb, Porf12 y Porf14 contienen repeticiones de la familia denominada SDR-A
(Fernandez-Lopez, et al., 2006) y estos promotores parecen responder a la actividad
reguladora de ArdK (Fernandez-Lopez, 2007). Para analizar este posible efecto,

79
determinamos que una cantidad de arabinosa de 10-3% (p/v) añadida al medio de cultivo
producía la inducción máxima de ardK sin llegar a alterar la velocidad de crecimiento de
las células. Al inducir ArdK con esta concentración de arabinosa encontramos que las
tasas de transcripción de PardC, Porf7, Pssb y Porf14 caen hasta los niveles de fondo
(1*102 unidades de GFP/OD). En el caso de Porf12, que también es reprimido por ArdK,
el índice de represión es menor, disminuyendo la actividad unas 2 veces cuando la
expresión de ardK no está inducida y unas 10 cuando está inducido con 10-3 % de
arabinosa (tabla R2). No se detectaron efectos de ArdK en los promotores que no
contenían los sitios de unión SDR-A.

De manera similar, existían indicios de que las repeticiones denominadas IT-B,

identificadas en (Fernandez-Lopez, et al., 2006) y que están presentes en los
promotores PardC, Porf7, Porf12, Porf14 y PstbA son sitios de unión del regulador StbA
(Fernandez-Lopez, 2007). Los perfiles de expresión de los plásmidos reporteros que
contienen estos promotores (pGP4, pGP5, pGP10, pGP11 y pGP13, respectivamente)
muestran un decremento entre 20 y 100 veces cuando la proteína StbA es expresada
desde el plásmido pAR11 respecto a los valores medidos con pBAD33 vacío.

En la figura R8 se representan los perfiles de expresión obtenidos para los

promotores de la región de mantenimiento.

PardC Porf7 Pssb

225000 70000 120000
200000
60000 100000
175000
GFP/OD600

50000
150000 80000
125000 40000
60000
100000 30000
75000 40000
20000
50000
20000
25000 10000

0 0 0
0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8 0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8 0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8
OD600 OD600 OD600

Porf12 Porf14 PstbA

14000 25000 140000

12000 120000
20000
10000 100000
GFP/OD600

8000 15000 80000

Promotor solo
6000 60000 + R388
10000
+ pAR4 (ara-)
4000 40000 + pAR4 (ara+)
5000 + pAR11 (ara-)
2000 20000 + pAR11 (ara+)
0 0 0
0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8 0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8 0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8
OD600 OD600 OD600

Figura R8. Perfiles de expresión transcripcional de los promotores regulados por

ArdK y StbA.

80
 En la figura se recogen los perfiles de expresión de los promotores PardC, Porf7, Pssb,
Porf12, Porf14 y PstbA obtenidos según se describe en el apartado B5.1 de materiales y
métodos. En verde se representa el perfil de actividad transcripcional de los promotores
aislados y en negro la actividad medida en presencia del plásmido R388. En tonos rojos
los perfiles obtenidos en presencia del regulador ArdK a mínima y máxima inducción, y en
azules los obtenidos en presencia de StbA a mínima y máxima inducción. La actividad
transcripcional se representa como cantidad de fluorescencia por célula (GFP/DO600)
frente al crecimiento del cultivo (OD600).

Sin embargo, tres promotores pertenecientes al módulo de transferencia del

plásmido (PtrwH, PkorA y PkikA) para los que no estaba descrita la presencia de sitios
de unión IT-B, mostraron también una disminución en sus tasas de transcripción cuando
stbA era expresado a máxima inducción (Figura R9, tabla R2 señalado en amarillo). En
presencia de pAR11 inducido con 10-3 % (p/v) de arabinosa, las tasas de transcripción
de los promotores PtrwH, PkorA y PkikA cayeron 2, 9 y 3 veces respectivamente. En
principio estos promotores no contienen iterones IT-B sino que contienen repeticiones
SDR-B. Al mirar en detalle la secuencia consenso de estas otras repeticiones
encontramos que contienen el pentanucleótido TTGCA que forma parte de las
repeticiones IT-B, lo que podría estar produciendo la respuesta observada. De esta
manera, aunque PtrwH, PkorA y PkikA no contienen los iterones consenso implicados
en la represión por StbA, parece que la proteína también es capaz de interferir en su
actividad transcripcional cuando se expresa a niveles altos.

Por último, en la región del plásmido que codifica para la formación del pilus
conjugativo existen 4 promotores: PtrwH, PkorA, PkikA y PkorB (pGP14, pGP15, pGP16
y pGP17, respectivamente). Está descrito que estos promotores contienen repeticiones
de la familia SDR-B, identificadas como sitios de unión del regulador KorA (Fernandez-
Lopez, 2007). Así, la actividad transcripcional de estos promotores medida en presencia
de pAR13, que codifica para KorA, muestra un descenso significativo respecto a la
actividad obtenida en ausencia del regulador (con pBAD33 vacío), con índices de
represión que van desde 30 en el caso de PkikA a 90 en el caso de PtrwH.(Figura R9,
tabla R2).

81
 PtrwH PkorA
80000 70000
70000
60000
60000
GFP/OD600 50000

GFP/OD600
50000
40000
40000
30000
30000
20000
20000

10000 10000

0 0
0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8 0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8
OD600 OD600

PkikA PkorB
100000
3000
Promotor solo
80000 2500 + R388
+ pAR13 (ara-)
+ pAR13 (ara+)
GFP/OD600

GFP/OD600
2000
60000 + pAR11 (ara-)
+ pAR11 (ara+)
1500
40000
1000

20000 500

0 0
0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8 0,05 0,2 0,35 0,5 0,65 0,8

OD600 OD600

Figura R9. Perfiles de expresión transcripcional de los promotores del Mpf.

En la figura se recogen los perfiles de expresión obtenidos según se describe en el
apartado B5.1 de materiales y métodos. En verde se representa el perfil de actividad
transcripcional de los promotores con pBAD33 vacío y en negro la actividad medida en
presencia del plásmido R388. En tonos rojos los perfiles obtenidos en presencia del
regulador korA a mínima y máxima inducción, y en azules los obtenidos en presencia de
stbA a mínima y máxima inducción. La actividad transcripcional se representa como
cantidad de fluorescencia por célula (GFP/DO600) frente al crecimiento del cultivo (OD600).

1.5. Deleciones de R388

Para tratar de ampliar el conocimiento sobre el funcionamiento de la red de

regulación transcripcional del plásmido se quiso seguir una estrategia complementaria
a la aplicada en la búsqueda de reguladores aplicada en el apartado 1.4. Para ello se
inició la construcción de una librería de “knock-out” de distintos genes en el plásmido
R388 mediante el método de recombinación homóloga, siguiendo el procedimiento
derivado del método Wanner y Datsenko (Datsenko & Wanner, 2000) que aparece
descrito en el apartado B3 de materiales y métodos. Los derivados de R388 resultantes
(librería pIC) obtenidos hasta el momento se ensayaron en la cepa de E. coli BW27783
en presencia de la librería de plásmidos reporteros (pGP) para comprobar si se
producían efectos inesperados en la red que pudiesen revelar la presencia de
reguladores ocultos en el genoma de R388.

82
 Sin embargo, este planteamiento experimental resultó ser más complicado de lo
esperado inicialmente. En muchos casos no fue posible aislar derivados del plásmido
que fuesen knock-out puros, lo que sugiere que la deleción de ciertas partes del genoma
del plásmido resulta en plásmidos tóxicos o inestables. Por ejemplo, las deleciones de
stbA resultaron en un plásmido altamente inestable, que fuimos incapaces de aislar
adecuadamente. Una forma de evitar estos efectos deletéreos fue realizar deleciones
de grandes regiones u operones completos, obteniendo de esta manera, por ejemplo,
la deleción de kfrA con todo el operón (R388Δkfra-osa).

Los mutantes de R388 obtenidos hasta el momento se ensayaron en presencia

de la librería de promotores de R388 siguiendo el protocolo descrito en el apartado B5.1
de materiales y métodos para la medida de la actividad transcripcional y los resultados
obtenidos se recogen en la tabla R3.

Con la red pIC7 pIC1 pIC3 pIC5 pIC9 pIC11 pIC13

Desregulado
completa (ΔKorB) (ΔTrwA) (ΔTrwB) (ΔTrwC) (ΔArdK) (ΔArdK + ΔKfrA) ( ΔKfrA)
P resP 432 ± 43 64 ± 7 60 ± 6 61 ± 5 56 ± 6 43 ± 5 60 ± 7 51 ± 4 46 ± 5
P kfrA 230 ± 16 32 ± 4 31 ± 4 25 ± 2 27 ± 3 23 ± 3 29 ± 2 215 ± 13 261 ± 35
P ardC 1136 ± 425 5±2 5±2 3±2 3±2 2±2 190 ± 247 393 ± 370 4±2
P ORF7 808 ± 96 <1 <1 <1 <1 <1 93 ± 4 78 ± 5 <1
P ssb 758 ± 59 36 ± 4 36 ± 7 33 ± 2 31 ± 1 23 ± 2 995 ± 29 1120 ± 74 27 ± 3
P ORF12 465 ± 53 1±2 3±2 <1 <1 <1 49 ± 4 33 ± 3 <1
P ORF14 197 ± 32 2±2 3±2 2±2 <1 <1 35 ± 2 84 ± 9 <1
P stbA 859 ± 77 39 ± 12 31 ± 3 43 ± 5 27 ± 3 31 ± 3 83 ± 7 85 ± 19 36 ± 13
P trwA 161 ± 28 12 ± 4 12 ± 6 213 ± 20 9±6 152 ± 3 13 ± 9 23 ± 6 7±3
P trwH 628 ± 63 <1 41 ± 3 2±2 <1 <1 <1 <1 <1
P korA 578 ± 54 33 ± 5 12 ± 3 31 ± 3 30 ± 3 25 ± 2 25 ± 2 23 ± 1 25 ± 1
P kikA 672 ± 80 59 ± 9 36 ± 3 55 ± 3 51 ± 3 43 ± 4 44 ± 2 40 ± 2 44 ± 3
P korB 9±5 2±2 2±1 2±1 1±1 1±1 <1 <1 3±2
P int 4±5 2±2 4±2 3±1 1±2 <1 <1 <1 2±2
P ant 945 ± 94 1006 ± 74 1005 ± 57 1061 ± 52 986 ± 47 958 ± 27 929 ± 25 836 ± 20 940 ± 66

Tabla R3. Actividad transcripcional de los promotores de R388 en presencia de los

mutantes knock-out.
En la tabla se recogen los valores medios de actividad transcripcional medidos para los
promotores de R388 en el estado estacionario, acompañados de la desviación estándar.
Cada fila corresponde a un promotor clonado en la librería pGP y cada columna a un
mutante por deleción del plásmido R388, excepto la primera que contiene los valores de
los promotores desregulados y la segunda que se corresponde a la presencia de R388
silvestre. Los colores utilizados tratan de indicar la región/función en la que se encuentran
implicados los distintos genes (azul: replicación, gris y verde: zona de mantenimiento
estable; morado y rosa: genes implicados en conjugación).

Las deleciones de la región de conjugación, pIC1, pIC3 y pIC5, (columnas 4, 5 y

6 de la tabla R3) confirman el efecto represor de trwA únicamente sobre su propio
promotor, observándose una desregulación del promotor del operón trwABC en

83
presencia del knock-out de trwA,(pIC1). La deleción de trwB, no mostró ningún efecto
sobre la actividad transcripcional de los promotores, obteniéndose el mismo resultado
que con R388 silvestre. Sin embargo, el mutante sin trwC sorprendentemente, produjo
una desregulación de PtrwA, lo que sugeriría un papel regulador de trwC hasta ahora
desconocido.

En el caso de los plásmidos pIC11, pIC9 y pIC13, los resultados obtenidos se

correlacionan bien con los obtenidos en los ensayos con los reguladores (apartado 1.4).
En el plásmido pIC13 se ha eliminado el operón kfrA-osa por lo que el regulador kfrA se
encuentra ausente. Al igual que ocurría en la deleción de trwA, únicamente se ve
afectado su propio promotor, PkfrA, (columna 9 de la tabla R3) que presenta un nivel de
expresión equivalente al medido para el promotor desregulado (valores de la columna
1). pIC11 corresponde a una deleción del gen orf12 de R388 pero en el que se ha
perdido, además, toda la zona contenida entre las LDRs, donde se encuentra el
regulador ardK. Así, se ven afectados todos los promotores regulados por este represor,
aunque sin estar totalmente desregulados ya que stbA continua presente en el plásmido,
y no se observa ningún cambio inesperado que podamos atribuir a la ausencia del resto
de genes eliminados (valores de la columna 7 en la tabla R3). En pIC9 se ha eliminado
toda la región de R388 comprendida entre oriV y el operón stbABC de manera que, de
los reguladores previamente identificados, no están presentes ardK ni kfrA. En este
caso, nos encontramos con unos valores de expresión muy similares a los producidos
por pIC11, sumando la desregulación del promotor del operón kfrA (columna 8 de la
tabla R3). En los dos mutantes carentes de ardK (pIC11 y pIC9), se observa un cambio
en el promotor de stbA que, sin encontrarse desregulado, da valores de más del doble
que los obtenidos en presencia de R388 silvestre. Por lo que sabemos hasta el
momento, este promotor se encuentra regulado únicamente por StbA, proteína que
debería estar presente en la célula en ambos casos.

Un resultado interesante es el obtenido al ensayar el plásmido pIC7, en el que se

ha eliminado el gen correspondiente a korB. Mientras que en los ensayos en busca de
reguladores del apartado 1.4, la expresión de korB, no parecía afectar a ningún promotor
diana, el mutante por deleción de korB (pIC7) muestra una cambios en la expresión de
los promotores regulados por KorA. Esto indica que KorB podría actuar como un co-
regulador de estos promotores, necesitando la presencia de KorA para ejercer su
acción.

84
 1.6. Aproximación a la caracterización de resP

Estudios genómicos previos (Fernandez-Lopez, et al., 2006) habían demostrado

la presencia de secuencias repetidas en las regiones intergénicas del plásmido R388.
Como hemos visto, estas repeticiones constituyen, con gran probabilidad, los sitios de
unión de los reguladores transcripcionales del plásmido ArdK, StbA y KorA. Tres
reguladores, sin embargo, mostraron acción represora exclusivamente sobre sus
propios promotores (TrwA, ResP, KfrA), lo que hace que no podamos asociar la acción
represora a la presencia de ninguna secuencia repetida. En el caso de TrwA, estudios
bioquímicos previos habían desvelado sus operadores (Moncalian, et al., 1997). Sin
embargo, existían dos reguladores, ResP y KfrA, para los que no teníamos forma de
asignar sitios de unión hipotéticos. Por ello, en este trabajo se optó por hacer una
primera aproximación al estudio de la proteína ResP mediante la purificación y la
realización de ensayos de retardo en gel.

ResP es una proteína de 218 aminoácidos, que presenta homología con las serín-
recombinasas sitio específicas de tipo 2. Su homólogo más cercano caracterizado es la
resolvasa del Tn21 con un 24% de identidad (Fernandez-Lopez, et al., 2006). El gen
resP está acoplado transcripcionalmente a repA formando el operón replicación de R388
y parece ser responsable de la regulación transcripcional de este operón (figura 10).

-35 SDR-C1
-10
'orf46
SDR-C2
+1
RBS1 RBS2

Integrón

PresP resP repA oriV

Figura R10. Replicón de R388. En la figura se representan los componentes del operón
de replicación (resP-repA) junto con el oriV de R388.

La realización del primer extension de la región promotora PresP por Carlos

Revilla, ha permitido el establecimiento del inicio de la trascripción y se han identificado
las posibles regiones -10 y -35 del promotor.

a) Purificación de ResP

Para su purificación, ResP se expresó como una proteína recombinante unida a

una cola de histidinas y se purificó por cromatografía de afinidad utilizando una columna

85
HisTrap HP (GE healthcare) y un segundo paso de cromatografía de gel filtración con
Superdex S75 (GE healthcare). El protocolo de purificación se encuentra recogido en
materiales y métodos en el apartado B9.

Para comprobar el adecuado progreso de cada uno de los pasos de la purificación,

se guardaron muestras que se corrieron en geles SDS-PAGE. Tras la purificación se
cuantificó la concentración y las alícuotas de la proteina se guardaron a -80 ºC en glicerol
20%.

b) Búsqueda del sitio de unión de resP en el promotor PresP mediante EMSA

Mediante ensayos de retardo en gel se ha tratado de acotar la zona de unión de ResP

en la región promotora PresP. Para ello, utilizando una batería de oligos (tabla MM3) se
generaron distintos fragmentos de dsDNA mediante PCR sobre el plásmido R388. Los
fragmentos obtenidos se encuentran descritos en la tabla R4 y representados en la
figura R11

Nombre Oligonucleótidos Descripción Tamaño (pb)

S2 resPdir_2 + resPrev_2 PRESP 333
S3 IRdir + IRrev extremo 3' del integrón 149
S4 orf7dir + orf7rev DNA inespecífico (PORF7) 169
S5 resPdir_2 + resPrev_3 fragmento 5' PRESP 164
S6 resPdir_3 + resPrev fragmento 3' PRESP 154

R388 PresP
backbone +1
-10 resP
'orf46 -35

S3
S2
S5
S6

Tabla R4 y figura R11. Sustratos de dsDNA para los ensayos EMSA.

En la figura se representan los sustratos utilizados en los ensayos de retardo en gel con
ResP. La información de los distintos sustratos se encuentra recogida en la tabla en la que
para cada sustrato aparecen los oligos empleados en su obtención, el tamaño y una breve
descripción.

Los ensayos se llevaron a cabo como se describe en el apartado B10 de

materiales y métodos. Concentraciones crecientes de ResP-His se incubaron con los

86
distintos sustratos y los geles se tiñeron con SYBR Gold, escaneándose con un láser de
473 nm.

Los resultados obtenidos en los ensayos se encuentran recogidos en las

imágenes de la figura R12.

PRESP (S2) DNA inespecífico (S4)

ResP (ng) - 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ResP (ng) - 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Región anterior a PRESP (S3)

ResP (ng) 20 30 40 50 60 70 80 90 100

región 5’ de PRESP (S5) región 3’ de PRESP (S6)

ResP (ng) - 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ResP (ng) - 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Figura R12. Resultados EMSA de ResP.

Fotos de los geles de acrilamida de los ensayos de retardo en gel por ResP de los distintos
sustratos recogidos en la figura R11: S2, S5 y S6 corresponden a la región promotora del
operón resP-repA, mientras que S3 contiene la región inmediatamente anterior a PresP,
incluyendo el extremo 3’ del integrón; por último, S4 es un sustrato de DNA inespecífico.
Se llevó a cabo un ensayo EMSA estandar, donde 0.2-0.5 pmol de los fragmentos de DNA
se incubaron con concentraciones crecientes de ResP-His6 en un volumen final de 20 μl
de reacción. Tras la electroforesis el gel se tiñó con SYBR Gold 1x y se escaneó usando
un láser de 473 nm en un equipo FLA-5100 de Fujifilm.

87
 Encontramos que ResP retarda de forma específica al fragmento S2
correspondiente a la región promotora del operón resP-repA, no así la región
inmediatamente anterior correspondiente al sustrato S3 que se comporta igual que el
sustrato inespecífico S4. El sustrato S3 corresponde a la zona inmediatamente anterior
a PresP incluyendo el extremo 3’ del integrón In1. Este sustrato se generó para
descartar que ResP pudiese tener un sitio de unión solapando con el extremo del
integrón, como está descrito para la resolvasa upv1 del plásmido R46 (Tosini, et al.,
1998).

El fragmento S2 retardado por ResP de forma específica se dividió dos

fragmentos, los sustratos S5 y S6, correspondientes a la región 5’ y la región 3’ de PresP
respectivamente. Al ensayar estos fragmentos encontramos que ResP se une de
manera específica el sustrato S6 que contiene la región 3’ del promotor mientras que el
fragmento S5 se comporta como un sustrato inespecífico. Por tanto, el sitio de unión de
ResP se encuentra contenido en los 150 pb correspondientes a la zona del promotor
situada inmediatamente antes del comienzo de resP (figura R13), aunque no hemos
identificado las secuencias de reconocimiento. Para establecer con precisión la
secuencia de unión de ResP será necesario la realización de ensayos de footprinting.

-35 -10 +1

Figura R13. Secuencia de la región PresP.

En la figura se recoge la secuencia de la región promotora PresP contenida en el
fragmento S2. El cuadro rojo enmarca la zona, incluida en el fragmento S6, donde tiene
que estar contenido el sitio de unión para la proteína según indican los resultados de los
EMSA. Los recuadros señalan las regiones +1, -10 y -35 identificadas para el promotor.

c) Actividad resolvasa de ResP

88
 En base a los datos de homología de secuencia, es presumible que ResP sea una
resolvasa y por tanto desempeñe un papel en la estabilidad plasmídica evitando la
formación de dímeros de plásmido (Fernandez-Lopez, et al., 2006). Para investigar la
habilidad de ResP para resolver cointegrados se construyeron dos plásmidos con el
replicón de R388 (figura R14 A y B). Uno de ellos (A) contiene el replicón W sin resP
mientras que el otro contiene el replicón completo (B). Además, estos plásmidos llevan
un cassette de resistencia cloranfenicol flanqueado por repeticiones directas (DR) que
contenían la región promotora de resP.

Al plaquear en Km para aislar las construcciones, el plásmido A se recuperó

fácilmente. Sin embargo, no fuimos capaces de obtener el plásmido B, excepto
seleccionando para el Cm contenido entre las DR. Esto parecía indicar que el sitio de
resolución de ResP estaba contenido en ellas y se estaba perdiendo el cassette.

Figura R14: Plásmidos construidos para probar la actividad resolvasa de ResP.

Los plásmidos A y B tienen un cassette con una resistencia a Cm situado entre dos
repeticiones que contienen el hipotético sitio de resolución para ResP y el replicón de
R388, sin resP en el plásmido A y el silvestre en el plásmido B.
El plásmido C contiene el replicón de R388 sin resP (como el del plásmido A) pero en este
caso el cassette situado entre las DR contiene dos marcadores: un gen de resistencia a
Ap y un gen gfpmut2.

Decidimos entonces construir un tercer sustrato (Figura R14, plásmido C) para

poder estudiar la actividad de resolución. En este caso, al igual que en el plásmido A
utilizamos un replicón W sin resP pero esta vez se incluyeron dos marcadores entre las
DR, un gen de resistencia a Ap y un gen gfp. De esta manera, añadiendo ResP en trans
se podría medir la actividad de resolución tanto por plaqueo como por citometría de flujo.

El plásmido C se introdujo en una cepa recA- de E. coli (DH5α), tanto en presencia

como en ausencia de ResP. Para producir ResP en trans se utilizó un plásmido

89
pBAD::resP (pAR1). Se crecieron cultivos de DH5α (plásmido C), DH5α (plásmido C +
pBAD33 vacío) y DH5α (plásmido C + pAR1) en LB con Km en el primer caso o LB con
Km/Cm/glucosa para los que contenía un pBAD. Los cultivos crecidos se diluyeron en
LB, sin antibiótico para la que solo llevan el plásmido C, y con Cm y arabinosa para las
que llevan el pAR1 (o el pBAD33). A continuación, se crecieron a 37 ºC durante unas 5
generaciones.

Muestras iniciales (0 generaciones) y finales (5 generaciones) de los distintos

cultivos se analizaron por citometría de flujo y por plaqueo. En el citómetro se recogieron
20.000 eventos que se representaron en gráficas enfrentando CFP vs. GFP. Las células
con el plásmido C original se recogen como evento CFP+GFP+ mientras que aquellas
en las que ResP ha eliminado en cassette se transforman en eventos CFP+GFP-, al
eliminarse el marcador de fluorescencia verde. En los ensayos de plaqueo, se replicaron
100 colonias de cada muestra en placas Ap, Km y Cm. Aquellas células en la que el
plásmido C está intacto crecerán tanto en Km como en Ap, pero aquellas en las que se
ha eliminado el cassette entre las DR crecerán en Km pero no en Ap.

Figura R15: Experimentos de citometría para el análisis de la actividad resolvasa de

ResP.
Izquierda: representación de las células con el sustrato de resolución C: solo (arriba), con
el pBAD vacío (en medio) y con el pAR1 (abajo). En el sustrato de resolución las
resistencias a antibióticos están representadas con flechas grises; los marcadores
fluorescencia con flechas verdes gfp o azules para cfp; las DRs se representan como
óvalos verdes. Se muestra el estado del sustrato de resolución al inicio (t=0) y al final (t=5).

90
 Derecha: gráficas de citometría de flujo correspondientes al resultado obtenido para los
cultivos se representa en los dibujos. En rojo de representas las dobles negativas; en azul
las CFP+GFP-, que corresponde a aquellas células en las que se ha eliminado el cassette;
en morado los eventos dobles positivos, que corresponden a las células con el plásmido
C intacto.

Los resultados obtenidos por citometria de flujo y confirmados por el plaqueo,

indican que ResP es eficiente resolviendo cointegrados. Esto se ve claramente en las
citometrías mostradas en la figura R15, donde la población representada en morado
(células CFP+GFP+) corresponde a las células con el sustrato sin resolver, mientras que
la población en azul (CFP+GFP-) corresponde con las que tienen el sustrato sin el
cassette. En presencia de resP en trans (células con el pAR1), incluso al inicio del
experimento (t=0) cuando la expresión de resP no estaba inducida, solo el 5% de las
células presentan el sustrato en la configuración sin resolver y tras 5 generaciones son
<1% Sin embargo en el caso de las células que no tienen resP (las que solo tienen el
sustrato o las que tienen el sustrato más el pBAD vacío) el porcentaje de células con el
sustrato sin resolver al inicio se conserva a las 5 generaciones.

En conjunto, nuestros datos indican que ResP constituye una “moonlight protein”
(Jeffery, 1999) capaz de ejecutar dos acciones diferentes. Por un lado ResP actúa como
regulador transcripcional de los genes implicados en la replicación del plásmido. Por
otra parte, ResP mantiene su actividad resolvasa, siendo capaz de resolver
cointegrados.

1.7. Efecto de perturbaciones ambientales en la red

El hecho de que los promotores del plásmido sean intrínsecamente fuertes, pero
se encuentren completamente silenciados por la acción de represores transcripcionales,
sugería que podrían existir situaciones en las cuales esta represión fuese levantada. Por
esta razón, decidimos analizar si el plásmido era capaz de responder a perturbaciones
ambientales. Para ello, se ensayó tanto la librería de promotores pGP solos como en
presencia de R388 (pGP+R388) en distintas condiciones, midiendo los perfiles de
expresión transcripcional en el lector de placas según el protocolo descrito en materiales
y métodos (apartado B5.1).

Se probaron varias condiciones: temperatura, inducción de respuesta SOS,

concentraciones subinhibitorias de antibióticos y presencia de potenciales receptores
conjugativos.

91
 a) Temperatura

Se probó el crecimiento de los cultivos a 3 temperaturas de cultivo diferentes: 30,

37 y 42 ºC. Para ello, se procedió según el protocolo descrito para los ensayos de
actividad transcripcional, programando la incubación en el Victor 3 a las temperaturas
deseadas, habiendo calculado previamente los ajustes adecuados para la inyección de
agua durante las medidas de manera que no se viese afectado el volumen de los
pocillos. Los resultados obtenidos se muestran en la figura R16.

PresP PkfrA PardC PORF7

100000 100000 1000000 100000

10000 10000 100000 10000

GFP/OD600

10000
1000 1000 1000
1000
100 100 100
100
10 10 10 10

1 1 1 1

Pssb PORF12 PORF14 PstbA

100000 100000 100000 100000

10000 10000 10000 10000

GFP/OD600

1000 1000 1000 1000

100 100 100 100

10 10 10 10

1 1 1 1

PtrwA PtrwH PkorA PkikA

100000 100000 100000 100000

10000 10000 10000 10000

GFP/OD600

1000 1000 1000 1000

100 100 100 100

10 10 10 10

1 1 1 1

PkorB Pint Pant

10000 10000 1000000

100000
1000 1000
GFP/OD600

10000
Temperatura 30ºC
100 100 1000
Temperatura 37ºC
100
10 10 Temperatura 42ºC
10

1 1 1

Figura R16. Efecto de la temperatura sobre los promotores de R388.

En la figura se muestran los resultados de las medidas de la actividad transcripcional de
los promotores tanto solos como en presencia de R388 a tres temperaturas de cultivo
distintas (30, 37 y 42 ºC). Los datos son el promedio de 3 medidas independientes y las

92
 barras de error muestran la desviación estándar de las medidas. El eje Y se muestra en
escala logarítmica para facilitar la representación de los datos.

En ningún caso parecen encontrarse diferencias significativas más allá de los

efectos derivados de los cambios en la velocidad de crecimiento a las distintas
temperaturas. Debe tenerse en cuenta que el eje Y se muestra en escala logarítmica
para facilitar la visualización de todos los datos pero esto puede magnificar en algunos
casos diferencias en los valores pequeños (por debajo de 100 u.a.f.). Estos valores se
encuentran muy influenciados por el ruido de fondo y en ellos no podemos discriminar
si se producirían variaciones pequeñas, únicamente detectaríamos si se producen
activaciones importantes.

b) Respuesta SOS

Otra condición que se decidió probar fue si alguno de los promotores presentaba
respuesta SOS. La repuesta SOS se produce en condiciones de estrés celular, por
ejemplo cuando tiene lugar daño en el DNA. Su activación da lugar al
desencadenamiento de cambios en la expresión de genes mediado por LexA
produciendo la activación de mecanismos de reparación del DNA. Se sabe que la
entrada de cadena sencilla en la célula puede desencadenar la respuesta SOS
(Baharoglu, et al., 2010), por lo que parece interesante comprobar si en un plásmido
conjugativo alguno de sus promotores puede verse afectado por esta respuesta de
estrés.

Para desencadenar la respuesta SOS en las células se probaron tres protocolos

diferentes. Tras la dilución de los cultivos en la placa microtiter, se expusieron las células
a luz UV (254 nm, 15W) durante 5 o 10 segundos, y a continuación se midió el perfil de
expresión de los promotores en el lector de placas siguiendo el protocolo de medida de
la actividad transcripcional (MM B5.1). Además de la exposición a luz UV, también se
probó como inductor de la respuesta SOS un tratamiento con Mitomicina C a una
concentración de 5 µg/ml. Los resultados obtenidos en los tres casos se muestran en la
figura R17.

93
 PresP PkfrA PardC PORF7
100000 100000 1000000 100000
100000
GFP/OD600

10000 10000 10000

10000
1000 1000 1000
1000
100 100 100
100
10 10 10 10
1 1 1 1

Pssb PORF12 PORF14 PstbA

100000 100000 100000 100000
GFP/OD600

10000 10000 10000 10000

1000 1000 1000 1000
100 100 100 100
10 10 10 10
1 1 1 1

PtrwA PtrwH PkorA PkikA

100000 100000 100000 100000
GFP/OD600

10000 10000 10000 10000

1000 1000 1000 1000
100 100 100 100
10 10 10 10
1 1 1 1

PkorB Pint Pant

100000 100000 100000
GFP/OD600

10000 10000 10000

Promotores solos
1000 1000 1000
Promotores +R388
100 100 100
10 10 10
1 1 1

Figura R17. Medida del efecto de la respuesta SOS en los promotores de R388
En la figura se muestran los valores de actividad transcripcional en estado estacionario
para los promotores de R388 tanto solos (en gris) como en presencia de R388 (en negro),
tras inducir la respuesta SOS en las células. Las medidas se realizaron según el protocolo
B5.1 de materiales y métodos. Para desencadenar la respuesta SOS, tras 2h de
crecimiento de los culivos, las células se expusieron a luz UV 5 seg., UV 10 seg. o bien se
añadió 5 µg/ml de mitomicina C al medio y se pusieron a medir en el lector de placas. El
eje Y se muestra en escala logarítmica.

No se encontraron cambios importantes en ningún promotor a la respuesta SOS,

únicamente PtrwA podría mostrar un discreto incremento de la actividad (3 veces) (casi
3000 u.a.f. frente a unas 1000 u.a.f. en el control) en la exposición a UV durante 10 seg.
pero solo en la medida del promotor en presencia de R388. Este efecto podría ser un

94
 artefacto experimental y para confirmarlo haría falta hacer más medidas. En el caso de
Pint podría observarse una respuesta SOS tanto por mitomicina C como por radiación
UV, pero al tratarse de valores de muy bajos están demasiado influenciados por el ruido
de fondo como para poder considerarlos significativos. Para obtener unos datos más
robustos sería necesario repetir los experimentos para tener más réplicas y poder
analizar los datos en profundidad.

c) Concentraciones subinhibitorias de antibióticos:

Se ha observado que concentraciones subinhibitorias de antibióticos que afectan

a los procesos de transcripción/traducción pueden producir fuertes respuestas
transcripcionales (Davies, et al., 2006). Dado el papel que los plásmidos conjugativos
tienen en la dispersión de las resistencias a los antibióticos, decidimos analizar el posible
efecto de concentraciones subinhibitorias de rifampicina y cloranfenicol en la red de
regulación del plásmido. Para ello, se utilizaron concentraciones de 3 µg/ml de
rifampicina y de 0,2 – 0,4 µg/ml de cloranfenicol, midiéndose la actividad transcripcional
de los promotores según el procedimiento habitual. Las concentraciones de antibiótico
se eligieron mediante la realización de curvas de crecimiento en diluciones seriadas de
antibiótico, eligiéndose aquellas concentraciones a partir de las cuales el crecimiento de
los cultivos empezaba a verse afectado. Los resultados obtenidos se recogen en la
figura R18.
Promotores con R388
Promotores solos Control Control
140000 Cm 0,25 µg/ml 100000 Cm 0,25 µg/ml
Cm 0,4 µg/ml Cm 0,4 µg/ml
120000
Rif 3 µg/ml 80000 Rif 3 µg/ml
100000
GFP/OD600
GFP/OD600

80000 60000

60000 40000
40000
20000
20000

0 0

Figura R18. Efecto de concentraciones subinhibitorias de antibiótico sobre los

promotores de R388.
En la figura se muestra la actividad transcripcional media en estado estacionario para los
promotores de R388, tanto solos (izquierda) como en presencia del plásmido completo
(derecha), creciendo en medio de cultivo con concentraciones subinhibitorias de Cm (0,2
y 0,4 µg/ml) y Rif (3 µg/ml).

95
 Ninguna de las concentraciones de antibiótico parece desencadenar una
respuesta específica en ninguno de los promotores. En el caso del cloranfenicol no se
observa ningún efecto sobre el perfil de expresión de los promotores de R388, ni solos
ni en presencia de R388. En el caso de la rifampicina, su presencia en el medio produce
una reducción general de los niveles GFP/OD de los promotores, que se observa tanto
en ausencia como en presencia de R388, pero no parece desencadenarse ningún efecto
específico llamativo sobre alguno de los promotores en concreto.

d) Presencia de posibles receptores:

Otro factor que pensamos que podría ser importante para el plásmido es la
presencia en el medio de posibles receptores para la transferencia por conjugación. Por
ello, se obtuvieron los perfiles de expresión de los promotores de R388 en presencia de
potenciales receptores conjugativos, mezclando el cultivo de las células con la librería
pGP con células BW27783 vacías. Para ello se crecieron cultivos de BW27783 con los
promotores solos y con los promotores + R388, y se mezclaron en un ratio 1:1 con un
cultivo de células BW27783 justo antes de comenzar las medidas de los perfiles de
expresión. Para mantener la misma cantidad de células productoras de GFP en los
cultivos control y en los mezclados con receptores, se optó por doblar el volumen a
medir en cada pocillo (en vez de 150 µl se pusieron 300 µl) en el caso de los cultivos
con receptores. Los perfiles de expresión obtenidos para cada uno de los promotores
se muestran en la figura R19.

100000 50000 50000

190000
80000 40000 40000
60000 140000
30000 30000
40000 20000 20000 90000
20000 10000 10000 40000
0 0 0 0
0.05 0.25 0.45 0.65 0.05 0.25 0.45 0.65 0.05 0.25 0.45 0.65 0.05 0.25 0.45 0.65

100000 90000
40000
90000
80000
30000
60000
40000 20000
40000 40000
20000 10000
GFP/OD600

0 0 0 0
0.05 0.25 0.45 0.65 0.05 0.25 0.45 0.65 0.05 0.25 0.45 0.65 0.05 0.25 0.45 0.65

40000 90000 90000 50000

30000 70000
30000
20000 50000 40000
30000 10000
10000
10000 0
0 0
0
0.05 0.25 0.45 0.65 0.05 0.25 0.45 0.65
0.05 0.25 0.45 0.65
0.05 0.25 0.45 0.65

15000 5000 200000

10000 3000 Control, solo
150000
1000 Recipientes, solo
5000
0 100000
0 Control, con R388
0.05 0.25 0.45 0.65 50000
0.05 0.25 0.45 0.65 Recipientes, con R388
0
0.05 0.25 0.45 0.65

OD600

96
 Figura R19. Perfiles de expresión de los promotores de R388 en presencia de
posibles receptores.
Se muestran los perfiles de expresión de los promotores R388 obtenidos según el
protocolo de medida de la actividad transcripcional descrito en materiales y métodos
(apartado B5.1). El cultivo con la librería de promotores se mezcló 1:1 con un cultivo de
BW27783 vacío (recipientes potenciales). Para cada promotor se muestra la curva en
ausencia y en presencia de R388, para un experimento control y para el experimento en
presencia de posibles receptores conjugativos.

En ninguno de los promotores se detectó un efecto significativo, únicamente se

observa una reducción general de la señal de fluorescencia medida, que probablemente
sea un efecto inespecífico debido al apantallamiento de la señal producido por las
células no fluorescentes del cultivo.

1.8. Actividad de los promotores en presencia de otros plásmidos

genéticamente parecidos a R388

R388 es el prototipo del grupo de incompatibilidad IncW, un grupo de plásmidos

conjugativos próximamente relacionados que comparten un esqueleto genético común
con 97% de identidad de secuencia (Revilla, et al., 2008). Para probar el efecto en la
red de R388 de un background (fondo) genético similar pero con mutaciones puntuales
y distintas inserciones de elementos genéticos móviles, analizamos la actividad
transcripcional de los promotores de nuestra librería, en presencia tanto del plásmido
R7K como el plásmido pIE321, dos miembros del grupo de incompatibilidad IncW.

Los plásmidos R7K y pIE321 fueron transferidos por conjugación a cultivos de E.

coli BW27783 que contenían la librería pGP y se obtuvieron los perfiles de expresión de
los promotores como se describe en el apartado B5.1 de materiales y métodos. Los
resultados obtenidos se compararon con los obtenidos en presencia de R388 y se
encuentran recogidos en la tabla R5 y representados en la figura R20.

97
 Actividad promotor (x10 2 )
R388 R7K pIE321
P resP 64 ± 9 58 ± 7 38 ± 5
P kfrA 32 ± 4 26 ± 6 24 ± 2
P ardC 5 ±1 13 ± 4 3 ±2
P ORF7 1 ±1 <1 7 ±2
P ssb 35 ± 2 39 ± 3 5 ±2
P ORF12 2 ±2 4 ±3 19 ± 4
P ORF14 4 ±3 1 ±2 17 ± 2
P stbA 48 ± 9 117 ± 19 86 ± 9
P trwA 16 ± 3 185 ± 16 37 ± 10
P trwH <1 <1 6 ±2
P korA 36 ± 3 44 ± 2 87 ± 6
P kikA 59 ± 7 61 ± 3 77 ± 4
P korB 2 ±1 2 ±1 2 ±2
P int 1 ±1 2 ±2 1 ±3
P ant 1045 ± 66 917 ± 37 819 ± 67

Figura R20. Actividad transcripcional de los promotores de R388 en presencia de

plásmidos IncW.
Las medidas se realizaron en un lector de placas Victor3 según el procedimiento descrito
en el apartado B5.1 de materiales y métodos, realizándose al menos 10 medidas
independientes de cada dato. Las columnas corresponden al promedio de los distintos
experimentos y las barras de error representan la desviación estándar de las medidas. En
negro se representa la actividad de los promotores en presencia de R388, en rojo en
presencia de R7K y en azul la actividad medida en presencia de pIE321. La actividad
transcripcional se expresa como cantidad de fluorescencia por célula (GFP/DO600).

98
 A pesar de que el esqueleto del plásmido es un 97.5% idéntico entre R388 y R7K,
y 97% entre R388 y pIE321, encontramos bastantes variaciones en la actividad de los
promotores de R388 en presencia de la red de transcripcional de estos plásmidos.
Cuando la librería de promotores se probó en células que contenían R7K, los
promotores PtrwA, PstbA y PardC mostraron un aumento de actividad transcripcional
respecto a la medida en presencia de R388 mientras que el resto de promotores no
mostraron cambios significativos. El promotor que mostró una mayor variación fue PtrwA
con un incremento de unas 10 veces, obteniéndose un nivel de actividad similar al
medido para el promotor solo (ver tabla R1, apartado 1.1). Esto indicaría que, aunque
R7K tiene un gen trwA, su producto no es capaz de reprimir PtrwA de R388. En el caso
de PstbA y PardC, los niveles obtenidos no fueron tan altos como en el plásmido
reportero solo, por lo que parece que los reguladores del plásmido R7K aún son capaces
de reprimir estos promotores aunque solo parcialmente.

Los resultados obtenidos con el plásmido pIE321 indican que 9 de los 13

promotores del esqueleto plasmídico muestran variaciones significativas respecto a los
resultados obtenidos en presencia de R388. Los promotores PresP y Pssb muestran
actividades transcripcionales menores, lo que sugiere que los reguladores
transcripcionales del pIE321 ejercen una mayor represión sobre ellos que R388. Por
otro lado, los promotores Porf12, Porf14 y los 4 promotores implicados en la
transferencia conjugativa (PtrwA, PtrwH, PkorA and PkikA) mostraron mayores
actividades transcripcionales. Aunque la presencia del pIE321 altera los niveles
transcripcionales de más promotores que en presencia de R7K, la intensidad de la
perturbación ejercida es menor. Los mayores cambios se observaron en los promotores
Pssb (baja 7 veces) y Porf7 (sube 7 veces), mientras que el resto solo mostró
variaciones entre 2 y 4 veces.

99
2. APROXIMACIÓN AL ESTUDIO DEL FENOTIPO DE LOS IncW

Los estudios genómicos sobre la familia de los plásmidos IncW revelaron la

existencia de un grupo de plásmidos caracterizados por una alta identidad genética
(97%) y que estaban presentes en distintos hospedadores bacterianos (Revilla 2008).
Al analizar el efecto de estos genomas sobre los promotores de R388, observamos, sin
embargo, importantes diferencias pese a la alta conservación de la secuencia. Esto nos
llevó a preguntarnos si esta similitud a nivel de secuencia se traduciría en un fenotipo
similar, o si por el contrario, existirían diferencias fenotípicas importantes, como el
impacto sobre la red de regulación parecía sugerir.

Por estas razones decidimos analizar el fenotipo de varios miembros de la familia

IncW, atendiendo a las tres características básicas del fenotipo de un plásmido: su
capacidad de replicar, de conjugar a nuevos hospedadores y de mantenerse estable en
ellos.

2.1. Funcionamiento de la replicación: medida del número de copias

por cromosoma.

Para determinar si las diferencias genéticas entre los plásmidos IncW tenían un
impacto sobre la capacidad replicativa del plásmido, se determinó el número de copias
de los plásmidos R388, R7K y pIE321. Para ello empleamos PCR cuantitativa,
normalizando los valores obtenidos frente al cromosoma para obtener así el número de
equivalentes plasmídicos por copia cromosómica. El protocolo utilizado se describe en
el apartado B7 de materiales y métodos. Se utilizaron cuatro parejas de oligos que
hibridan en secuencias 100% conservadas en los tres plásmidos, utilizándose como
referencia cromosómica los genes rho y dxs del cromosoma bacteriano. El número de
copias relativo se determinó comparando el ciclo umbral obtenido para el plásmido y el
cromosoma (nº copias = 2ΔCt; ΔCt = Ct cromosoma - Ct plásmido). En la tabla R6 se
recogen los valores de Ct medidos y en la figura R21 se han representado los resultados
obtenidos al calcular el número de copias de plásmido por cromosoma de cada una de
las réplicas.

100
 Dianas plásmido Cromosoma
orf7left-orf8right klcbleft-orf14right trwCleft-trwDright int14right-resPleft rho dxs
R388 13,36 13,4 13,1 13,53 15,52 15,33
R388 (dil. 1/2) 14,07 14,55 14,32 14,02 15,99 16,21
R388 (dil. 1/4) 15,12 14,69 14,32 14,39 16,76 16,5
R7K 14,25 13,81 13,27 13,46 15,72 15,51
R7k (dil. 1/2) 15,47 15,58 14,85 14,61 16,92 17,16
R7K (dil 1/4) 16,94 16,55 15,89 16,21 18,1 18,08
pIE321 18,48 18,68 17,36 17,74 17,41 17,48
pIE321 (dil 1/2) 21,16 20,73 20,64 20,04 19,42 19,56
pIE321 (dil 1/4) 21,59 21,99 20,93 21,16 20,18 20,38

6
Copias de plásmido por cromosoma

0
pIE321
R388

R7K

Tabla R6 y figura R21. Cálculo del número de copias de plásmido por cromosoma.
En la tabla se recogen los valores Ct obtenidos en los experimentos de PCR tiempo real
para las cuatro dianas plasmídicas y las dos cromosómicas, en las muestras de DNA total
extraído para R388, R7K y pIE321. En la figura se representa el número de copias por
cromosoma obtenido para las distintas réplicas de cada uno de los plásmidos (R388 en
blanco, R7K en azul y pIE321 en rojo).

El resultado obtenido muestra que existe una diferencia en el número de copias,

encontrándonos con que mientras R388 y R7K tienen alrededor de 4 copias por
cromosoma, el número de copias de pIE321 es más bajo obteniéndose un valor medio
de entre 0,5 y 1 copia por cromosoma.

Debido a estas diferencias, analizamos en detalle la región de replicación de estos

plásmidos. El análisis de la secuencia puso de manifiesto la presencia en pIE321 de una
repetición adicional del iterón de unión de RepA en el oriV (Tait, et al., 1983). En la figura
R22 se muestra el resultado del alineamiento de la secuencia IT-A de R388, R7K y
pIE321, destacándose de forma esquematizada la inserción presente en pIE321.

101
 AGGGTACGTGAAATCGCTAATC pIE321

Figura R22. Secuencias IT-A en oriV de los plásmidos IncW. En la figura se muestra
un alineamiento de la secuencia oriV de R388, R7K y pIE321, donde se observa como
pIE321 presenta una repetición más en el iterón de unión de repA (IT-A) que sus
compañeros. En la parte de arriba de la figura se destaca la secuencia extra encontrada
en pIE321 de manera más clara.

2.2. Ensayos de estabilidad del plásmido R388, plásmidos IncW y

derivados R388

Como se recoge en la introducción, la transferencia genética horizontal por

conjugación de plásmidos de amplio rango de hospedador (BHR) ha demostrado ser un
factor muy importante en la propagación de resistencias a antibióticos entre bacterias,
dado que estos plásmidos pueden transferirse y replicarse en un amplio rango de
especies diferentes. Para ser capaces de establecer el rango real de hospedador de un
plásmido, además de la capacidad de conjugación y replicación, una tercera
característica que debería ser considerada es la capacidad de los plásmidos para
mantenerse en el hospedador en ausencia de selección.

En el artículo de Fernandez-Lopez (Fernandez-Lopez, et al., 2006) se presenta

una tabla con todas aquellas especies bacterianas en las que se ha descrito la presencia
de R388 o alguno de sus homólogos IncW, estableciéndose un rango de hospedador
que abarca una amplia variedad de proteobacterias. Sin embargo, al igual que en ocurre
en la mayoría de los plásmidos considerados BHR, esta tabla se basa
fundamentalmente en información sobre conjugación o replicación y se dispone de muy
poca información sobre la estabilidad a largo plazo de los distintos IncW en estos
hospedadores.

Para abordar el estudio de la estabilidad de los plásmidos IncW, inicialmente

decidimos comprobar su estabilidad en E. coli. Para ello, introdujimos R388, pSa, R7K,
pIE321 y pIE522 en E. coli BW-RifR y seguimos la estabilidad durante 100 generaciones,

102
siguiendo el protocolo descrito en el apartado B6 de MM adaptado de (De Gelder, et al.,
2007). Se añadió también en los experimentos el pSU5000 que es una construcción que
contiene únicamente el replicón de R388 con una resistencia a Cm (Fernandez-Lopez,
2007).

Los resultados obtenidos en este experimento se encuentran recogidos en la tabla

R7 y representados en la figura R23.

Número de generaciones
0 20 40 60 80 100
R388 100 100 100 100 99 100
R7K 94 83 76 75 68 57
pIE522 98 97 96 96 96 96
pSa 100 99 99 98 95 96
pIE321 100 100 100 100 100 100
Replicón R388 91 78 65 54 44 29

100
% Células con plásmido

80

60

R388
40
pSa
pIE522
20 pIE321
R7K
Replicon R388 (pSU5000)
0
0 20 40 60 80 100
Generaciones

Figura R23. Estabilidad de los plásmidos IncW en E. coli BW-RifR.

En la figura se muestra el % de células que mantienen el plásmido tras 100 generaciones
creciendo sin selección, para cada uno de los plásmidos IncW (y para el replicón de R388
aislado). El procedimiento experimental seguido se encuentra recogido en MM. Cada dato
es el promedio de, al menos, 3 experimentos independientes con 3 réplicas cada uno. Los
antibióticos de selección utilizados en cada caso son los siguientes: R388 (Tp), pSa (Km),
pIE522 (Km), pIE321 (Sm), R7K (Ap o Sp), (pSU5000 (Cm)).

103
 Como se puede observar, con excepción de R7K todos los plásmidos IncW
ensayados se mantienen completamente estables en E. coli durante las 100
generaciones, obteniéndose valores del 100% de la población en el caso de R388 y
pIE321 o de alrededor del 95% en pSa y pIE522. Sin embargo, en el caso de R7K el
plásmido parece que no es capaz de mantenerse estable y se va perdiendo, aunque
más lentamente que el pSU5000 que contiene solo el replicón y que se pierde de forma
constante.

El hecho de que no todos los plásmidos IncW exhibiesen el mismo nivel de

estabilidad en E. coli nos llevó a preguntarnos si el plásmido modelo de este grupo,
R388, estable en E. coli, podría tener un fenotipo de estabilidad diferente en otros
hospedadores. Para comprobarlo se ensayó R388 en varias gammaproteobacterias y
una alfaproteobacteria a las que pudimos tener acceso:

Gammaproteobacteria Enterobacteriales
Klebsiella pneumoniae K6 ATCC700603
Salmonella typhimurium LT2
Gammaproteobacteria Pseudomonadales
Acinetobacter baumannii ATCC19606
Pseudomonas putida KT2440
Gammaproteobacteria Vibrionales
Vibrio cholerae CIP106855
Vibrio cholerae CIP106851
Alfaproteobacteria
Agrobacterium tumefaciens GMI9023

Según los marcadores de resistencia de cada especie, en los ensayos se utilizó

R388 o pSU2007 (derivado de R388 con un marcador de resistencia a Km), que se
introdujeron mediante conjugación desde E. coli BW27783. La figura R24 muestra los
resultados obtenidos para los ensayos de estabilidad llevados a cabo siguiendo el
protocolo descrito en el apartado B6 de materiales y métodos.

P.putida A.tumefaciens A.baumanii

100 100 100
90 90
% células con plásmido
% células con plásmido

90
% células con plásmido

80 80 80
70 70 70
60 60 60
50 50 50
40 40 40
30 30 30
20 20 20
10 10 10
0 0 0
0 50 100 0 50 100 0 50 100
Generaciones Generaciones Generaciones

104
 K.pneumoniae V.cholerae
100
S. typhimurium
100 100
90
% células con plásmido

90

% células con plásmido

% células con plásmido

90
80 80 80
70 70 70
60 60 60
50 50 50
40 40
40
30 30
30
20 20
20
10 10
10
0 0
0
0 50 100 0 50 100
0 50 100
Generaciones Generaciones
Generaciones

Figura R24. Estabilidad de R388 en distintos hospedadores.

En la figura se muestra el % de células que mantienen el plásmido (R388/pSU2007) tras
100 generaciones creciendo sin selección, obtenidos según el protocolo descrito en el
apartado B6 de materiales y métodos. Cada gráfico muestra las distintas réplicas llevadas
a cabo en cada hospedador. Según las resistencias a antibióticos de cada hospedador se
utilizó R388 o un derivado KmR, pSU2007. Los antibióticos de selección utilizados fueron
Tp para R388 o Km en el caso pSU2007.

Como se ve en la figura R21, el plásmido R388 se mantiene completamente

estable durante 100 generaciones en todas las enterobacterias ensayadas. En
Agrobacterium, una alfa-proteobacteria, la inestabilidad plasmídica es baja, y no parece
incrementarse con el tiempo; tras las primeras 20 generaciones el 99% de las células
conservan el plásmido y tras 80 el 93% de las células de Agrobacterium continúan
teniendo plásmido. Por el contrario, Pseudomonas y Vibrio muestran dramáticas
pérdidas del plásmido. Las células de Vibrio con plásmido pasan a ser alrededor del 40
% de la población tras solo 20 generaciones, no detectándose prácticamente el plásmido
tras 80 generaciones. En Pseudomonas solo el 73% de las células mantienen el
plásmido tras 20 generaciones no habiendo células con plásmido a las 80 generaciones.

Las dos especies en las que R388 resultó más inestable, V. cholerae y P. putida,
se seleccionaron para ensayar en ella la estabilidad del resto de plásmidos IncW.
Añadimos también al experimento los dos mutantes de R388 con deleciones en la región
de establecimiento y mantenimiento estable del plásmido, construcciones pIC10 y
pIC12, para ver si el cambio en esta región producía algún efecto sobre en la estabilidad
del plásmido. Se decidió meter en el ensayo estos dos mutantes por presentar
modificaciones en la región de establecimiento y mantenimiento del plásmido y por ser
esta zona es donde se concentran las principales diferencias entre los IncW. Los
plásmidos se introdujeron en las cepas de V. cholerae y P. putida por conjugación desde
E. coli BW27783 y se siguió la estabilidad durante 100 generaciones, de acuerdo al

105
protocolo descrito en el apartado B6 de MM. En el caso de P. putida se dejó fuera del
experimento R7K debido a la falta de un marcador de selección eficaz para llevar a cabo
el ensayo. En cada caso se realizaron 3 experimentos con 3 réplicas cada uno, los
resultados obtenidos se encuentran representados en la figura R25.

Estabilidad IncW en V.cholerae Estabilidad IncW en P.putida

100 R388 100
pSU2007
pSa
pIE522
80 80
% Células con plásmido

% Células con plásmido

pIE321
R7K
R388DkfrA-orf14
60 60

pSU2007
40 40 R388DkfrA-orf14
pSa
pIE522
20 20
pIE321
R388DOrf12DLDRs
0 0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
Generaciones Generaciones

Figura R25. Estabilidad de los plásmidos IncW en V. cholerae y P. putida. En la figura

se muestra el % de células que mantienen el plásmido tras 100 generaciones creciendo
sin selección, para cada uno de los plásmidos IncW (y para el replicón de R388 aislado).
El procedimiento experimental seguido se encuentra recogido en el apartado B6 de MM.
Cada dato es el promedio de, al menos, 3 experimentos independientes con 3 réplicas
cada uno. Los antibióticos de selección utilizados en cada caso son los siguientes: R388
(Tp), pSa (Km), pIE522 (Km), pIE321 (Sm), R7K (Ap o Sp), pIC9 (Km) y pIC10 (Km).

El resultado de los experimentos muestra que en V. cholerae todos los plásmidos

parecen comportarse de manera muy similar, desapareciendo prácticamente de la
población a las 100 generaciones. En P. putida, sin embargo, encontramos que el
comportamiento es más heterogéneo, destacando el plásmido pIE321 que parece
mantenerse estable a lo largo de las 100 generaciones. También parece mostrar un
comportamiento más estable en P. putida el derivado de R388 que carece de todos los
genes de la región de mantenimiento, desde kfrA hasta el orf14 (pIC10), pero no sucede
lo mismo con aquel que carece de los genes ubicados entre las LDRs y el orf12 (pIC12).

2.3. Ensayos de conjugación

El tercer aspecto básico de la fisiología plasmídica es la transferencia conjugativa.

Para analizar el impacto de las diferencias genéticas sobre la capacidad conjugativa de
los plásmidos IncW comparamos las frecuencias obtenidas utilizando distintas especies
como donadoras y receptoras.

106
 En primer lugar, llevamos a cabo experimentos de conjugación con R388 desde
E. coli a las distintas especies de proteobacterias ensayadas en los experimentos de
estabilidad (apartado 2.2) así como de éstas a E. coli como cepa receptora. Las
conjugaciones se llevaron a cabo siguiendo el protocolo de conjugación descrito en el
apartado B4.2 de MM, incubando a 30 ºC (P. putida y A. tumefaciens) o 37 ºC (el resto),
con tiempos de conjugación de 1h excepto en V. cholerae y A. baumanii que fue de 4h.
Cada dato es el promedio de al menos 9 experimentos (la columna N recoge el número
de datos promediados en cada dato), calculado a partir de la media de los logaritmos.
En la tabla R8 se recoge las frecuencias de conjugación obtenida para el plásmido R388
entre E.coli y otras especies bacterianas.

F. conjugación por F. conjugación por

donador receptor
Donador Receptor (media ± desvest) (media ± desvest) N
S. typhimurium(R388) BW-Nx 2,6E-02 3,2E-01 7,6E-02 6,9E-01 9
K. pneumoniae (R388) BW-Nx 2,2E-03 4,9E-02 2,4E-03 3,8E-02 18
P. putida (pSU2007) BW-Nx 3,4E-01 3,7E+00 4,3E-02 1,5E+00 15
A. baumanii (pSU2007) BW-Nx 2,8E-04 2,5E-03 1,8E-03 1,8E-02 9
V. cholerae (pSU2007) BW-Nx 1,6E-05 1,2E-04 3,7E-05 9,0E-04 9
A. tumefaciens (pSU2007) BW-Nx 1,4E-02 1,7E-01 6,5E-02 8,0E-01 9
E.coli (R388) BW-Nx 5,0E-01 1,8E-01 6,2E-01 2,0E-01 20
BW-Nx (R388) S. typhimurium 1,1E-03 2,6E-05 1,3E-04 8,0E-06 9
BW-Nx (R388) K. pneumoniae 2,5E-01 4,1E-02 1,5E-01 2,6E-02 18
BW-Nx (pSU2007) P. putida 4,1E-02 9,6E-04 3,8E-01 1,2E-02 18
BW-Nx (pSU2007) A. baumanii 1,6E-05 4,9E-07 8,5E-06 4,4E-08 20
BW-Nx (pSU2007) V. cholerae 9,9E-04 6,8E-05 1,8E-02 3,4E-04 15
BW-Nx (pSU2007) A. tumefaciens 2,4E-01 3,2E-02 2,3E-02 1,8E-03 15

Fc de R388 entre E. coli y otras bacterias

1E+00 Desde E. coli
A E. coli
1,1E+00
Frecuencia de conjugación

3,0E-01

1E-01
3,0E-01

6,7E-02
6,2E-02
9,1E-02

4,9E-02

1E-02
3,3E-05

4,4E-05

6,4E-03
1,0E-02

1E-03
2,5E-03
8,3E-04

1E-04

1E-05

1E-06

107
 Tabla R8, Figura R26. Frecuencias de conjugación de R388.
En negro se representan las frecuencias de conjugación obtenidas para R388 desde E.
coli hacia otras bacterias (ver eje) y en gris se representan las frecuencias obtenidas en la
conjugación inversa (desde las bacterias hacia E. coli). Los cálculos para obtener las
medias y desviaciones se han hecho utilizando los logaritmos de las frecuencias.

Encontramos que R388 es capaz de conjugar a todas las especies utilizadas

aunque con frecuencias de conjugación bastante diferentes. Pseudomonas putida es la
especie que muestra las mayores tasas de transferencia (como donador y como
receptor) mientras que Acinetobacter y Vibrio son los que muestran peores frecuencias.
En ambos se utilizaron tiempos de conjugación de 4h (frente a 1h en el resto) y en el
caso de A. baumanii apenas fuimos capaces de recuperar transconugantes.

Repetimos los experimentos de conjugación utilizando el mutante por deleción de

R388 que carece de los genes de la zona de establecimiento desde kfrA al orf14 (pIC12).
Al probar la capacidad de conjugación de este plásmido entre las cepas de E. coli de
laboratorio no encontramos diferencias en la frecuencia con respecto a la obtenida para
el R388 silvestre por lo que quisimos comprobar si al utilizar como receptores otras
bacterias distintas se observaría algún efecto en el comportamiento del plásmido al
carecer de todos los genes de esta región. Las conjugaciones se llevaron a cabo
siguiendo el mismo procedimiento que en el caso de R388, así como en el procesado
de los datos. Los resultados obtenidos en las se encuentran recogidos en la tabla R9 y
en la figura R27 aparecen comparadas las frecuencias de R388 y del mutante.

F. conjugación por F. conjugación por

donador receptor
Donador Receptor (media ± desvest) (media ± desvest) N
BW-Nx (pIC12) E.coli 8,2E-01 5,8E-01 9,0E-01 4,3E-01 9
BW-Nx (pIC12) S. typhimurium 1,6E-03 9,5E-04 1,2E-03 3,0E-04 9
BW-Nx (pIC12) K. pneumoniae 7,4E-01 2,8E-01 4,5E-01 1,8E-01 9
BW-Nx (pIC12) P. putida 3,2E-05 2,1E-06 2,4E-04 1,6E-05 18
BW-Nx (pIC12) A. baumanii 1,8E-05 2,2E-06 2,5E-05 1,7E-06 18
BW-Nx (pIC12) V. cholerae 6,8E-04 6,9E-05 2,7E-03 1,6E-04 12
D1210 (pIC12) A. tumefaciens 1,2E-02 3,7E-04 2,8E-04 3,2E-05 18

108
 R388
Fc de E.coli a otras bacterias
R388DkfrA-orf14
Frecuencia de conjugación 1E+00

6,9E-01
3,6E-01

4,5E-01
1E-01

1,2E-03

1,0E-01

8,7E-02
1,7E-04

2,6E-04
2,2E-04
1E-02

1E-03

8,1E-06
6,3E-03

6,3E-06
2,8E-06

2,1E-03
1E-04

1E-05

1E-06

Tabla R9, Figura R27. Frecuencias de conjugación de R388 y pICG12 desde E. coli a
otras bacterias. En negro se representan las frecuencias de conjugación obtenidas para
R388 desde E. coli hacia otras bacterias (ver eje) y en gris las obtenidas para el mutante
que carece de los genes de la zona de establecimiento (desde kfrA a orf14, ambos
incluidos). Las columnas corresponden a la media de las frecuencias de conjuagación
obtenidas en los distintos experimentos y las barras de error a la desviación estandar de
los datos. Los cálculos para obtener las medias y desviaciones se han hecho utilizando
los logaritmos de las frecuencias y calculando después el antilogaritmo de la media.

Los valores obtenidos son similares en todos los casos excepto para P. putida, en
que la frecuencia de conjugación de R388 es considerablemente mayor que la del
mutante sin los genes de la zona de establecimiento. Curiosamente este mutante
también mostró un comportamiento diferente al de R388 en los ensayos de estabilidad
en P. putida.

Se obtuvieron las frecuencias de conjugación de los distintos plásmidos IncW

usando como receptores E. coli, V. cholerae y P. putida (en este caso todos menos R7K
que por los marcadores de resistencia no pudo ser seleccionado en Pseudomonas). Las
conjugaciones se llevaron a cabo siguiendo el protocolo recogido en el aparatado B4.2
de MM y los cálculos de las frecuencias medias se realizaron utilizando logaritmos. Los
resultados obtenidos se encuentran recogidos en la tabla R10 y representados en la
gráfica R28. En las gráficas se ha añadido también el mutante de R388, pIC12
(R388ΔkfrA-orf14), que carece de toda la zona de establecimiento.

109
 F. conjugación por F. conjugación por
donador recipiente
Donador Receptor (media ± desvest) (media ± desvest) N
BW-Nx
(pSU2007) BW-Rif 6,2E-01 2,0E-01 5,0E-01 1,8E-01 20
BW-Nx (pSa) BW-Rif 1,5E-02 1,1E-04 6,3E-03 7,4E-05 15
BW-Nx (R7K) BW-Rif 2,9E-02 1,1E-02 3,7E-02 9,0E-03 9
BW-Nx (pIE321) BW-Rif 2,5E-01 4,5E-02 1,6E-01 3,4E-02 9
BW-Nx (pIE522) BW-Rif 6,1E-05 3,3E-06 5,5E-05 2,9E-06 18
BW-Nx (pIC11) BW-Rif 8,2E-01 5,8E-01 9,0E-01 4,3E-01 9
BW-Nx
(pSU2007) V. cholerae Rif 9,9E-04 6,8E-05 1,8E-02 3,4E-04 15
BW-Nx (pSa) V. cholerae Rif 4,3E-04 1,8E-05 6,6E-03 3,0E-04 13
BW-Nx (R7K) V. cholerae Rif 7,1E-04 3,0E-05 2,3E-03 2,8E-04 13
BW-Nx (pIE321) V. cholerae Rif 4,1E-04 2,0E-04 3,3E-03 2,5E-04 13
BW-Nx (pIE522) V. cholerae Rif 9,5E-05 6,2E-06 4,4E-04 3,1E-05 13
BW-Nx (pIC11) V. cholerae Rif 4,1E-04 2,0E-04 2,7E-03 1,6E-04 12
BW-Nx
(pSU2007) P. putida 4,1E-02 9,6E-04 3,8E-01 1,2E-02 18
BW-Nx (pSa) P. putida 9,9E-06 3,7E-07 1,0E-04 5,0E-06 9
BW-Nx (R7K) P. putida - - - - -
BW-Nx (pIE321) P. putida 1,9E+00 8,3E-05 3,5E+00 1,4E-03 9
BW-Nx (pIE522) P. putida 3,3E-06 6,1E-07 5,3E-05 2,5E-05 9
BW-Nx (pIC11) P. putida 3,2E-05 2,1E-06 2,4E-04 1,6E-05 18

E. coli x P. putida
Fc de los plásmidos IncW E. coli x V. cholerae
E. coli x E. coli
1E+00
Frecuencia de conjugación

1E-01

1E-02

1E-03

1E-04
6,7E-02
2,5E-03

2,3E-05
1,4E-03

8,1E-04

7,0E-02
9,0E-04

3,6E-05
1,2E-04

6,2E-05
6,6E-04
3,0E-01

6,8E-04

1,8E-02

7,3E-02

6,2E-01
1,3E-05

1E-05

1E-06

Tabla R10, Figura R28. Frecuencias de conjugación de los plásmidos IncW a P.

putida, E. coli y V. cholerae. En negro se representan las frecuencias de conjugación a
E. coli; en gris claro las frecuencias conjugando a V. cholerae; en gris las frecuencias a P.
putida. Las columnas corresponden a la media de las frecuencias de conjuagación
obtenidas en los distintos experimentos y las barras de error a la desviación estandar de

110
 los datos. Los cálculos para obtener las medias y desviaciones se han hecho utilizando
los logaritmos de las frecuencias y calculando después el antilogaritmo de la media.

Como se ve en la figura, todos los plásmidos se comportan de manera muy similar

en las conjugaciones a V. cholerae, con frecuencias de alrededor de 10-4 en 4h de
conjugación. Sin embargo en los otros hospedadores (E. coli y P. putida) observamos
diferencias en el funcionamiento de los distintos IncW. pIE321 muestra un
comportamiento bastante similar a R388 en todos los hospedadores ensayados,
mientras que pSa y pIE522 muestran frecuencias de conjugación considerablemente
más bajas.

Los resultados globales de esta sección indican que, pese a su alto nivel de
identidad genética, los plásmidos del grupo IncW muestran diferencias fenotípicas en
las funciones de replicación, estabilidad y conjugación.

111
 3. SISTEMATIZACIÓN DE LA MEDIDA DE LA CONJUGACIÓN

3.1. Puesta a punto de un ensayo de conjugación en el citómetro

Además de caracterizar la red de regulación y la diversidad fenotípica de los

plásmidos IncW, un objetivo paralelo de esta tesis fue la sistematización de un ensayo
de conjugación. El protocolo standard de conjugación requiere situar la mezcla de
células donadoras y células receptoras sobre filtros de conjugación colocados en placas
de agar, que son incubadas a la temperatura adecuada durante un tiempo determinado.
Para Escherichia coli y los plásmidos IncW, la temperatura es de 37 ºC y el tiempo es
de 1 hora. Una vez incubada la mezcla, se realizan diluciones seriadas de la misma y
se plaquea en medio selectivo para donadores, receptores y transconjugantes. Tras el
plaqueo, se deja a las células desarrollar colonias mediante incubación o/n, se cuentan
las colonias y se calcula la proporción de transconjugantes frente a los donadores o
receptores.

Este método es el mismo que el utilizado hace 20 años, es un medio válido pero
tedioso, lo que dificulta la realización de experimentos con muchas muestras o la
obtención de datos estadísticamente robustos. Por otra parte, la conjugación es un
proceso que transcurre de manera geométrica (los transconjugantes actúan como
donadores), por lo que las medidas de conjugación están sometidas a una alta
variabilidad. Por estas razones, decidimos poner a punto un ensayo sistemático que no
requiriese del plaqueo para medir las frecuencias conjugativas, para lo que elegimos la
citometría de flujo.

Como se describe en Maksimow et al. (Maksimow, et al., 2002) la expresión de

GFP y RFP puede ser detectada simultáneamente en bacterias individuales, mediante
el uso de un citómetro de flujo convencional. Por ello, decidimos tratar de monitorizar la
transferencia de un plásmido usando la proteína fluorescente GFPmut2 y tres proteínas
fluorescentes rojas diferentes: DsRed2, mCherry y mKate2.

Diseñamos un sistema basado en E.coli en el que un plásmido que contiene la

región oriT de R388 es movilizado por un derivado de R388 no trasmisible, desde una
célula donadora a una receptora. Decidimos utilizar un sistema en el que el plásmido
completo no es capaz de transferirse entre los receptores para intentar que fuera lo más
simple posible de analizar. De esta manera, se evita que pueda haber conjugación
desde los transconjugantes recién formados, que podrían conjugar a una velocidad

112
diferente (probablemente mayor) a la de los donadores primarios (Jacob & Wollman,
1956).

Así, utilizamos como donadores células BW-RifR que contienen el derivado no

movilizable de R388 pAP711ΔoriT::Tet; (Demarre, et al., 2005) y, como elemento
transmisible el clon pGP12 (pUA66::PstbA). pAP711ΔoriT es una construcción que
carece de oriT funcional pero contiene el sistema conjugativo completo de R388, por lo
que es capaz de movilizar construcciones que contienen la región oriT de R388. El
plásmido pGP12 contiene el oriT del plásmido R388 clonado delante del gen reportero
gfpmut2 orientado de tal manera que la expresión de GFP es controlada por el promotor
del operón stbABC que, como se ha visto antes, está reprimido en presencia de la
proteína de StbA de R388.

De esta manera, R388ΔoriT es capaz de movilizar el plásmido pGP12 pero él

mismo no se transfiere a los receptores. Además en los donadores, en presencia de la
red de regulación de R388, la transcripción a partir del promotor PstbA de pGP12 está
reprimida al estar presente StbA. Una vez que pGP12 es transferido a los receptores
StbA ya no está presente en la célula por lo que el promotor se encuentra desreprimido
dando lugar a la expresión y acumulación de GFPmut2 en los transconjugantes.

Las células receptoras utilizadas son BW-NxR que contienen un plásmido que
codifica para una proteína fluorescente roja, cuya expresión es controlada por Plac. Se
probaron tres construcciones similares pAC1, pAC2 y pAC4, cada uno de ellos
codificando una proteína roja distinta (tabla MM4), obteniéndose en los tres casos
resultados similares (datos no mostrados). La expresión de fluorescencia roja se utilizó
como marcador de células receptoras manteniéndose de forma permanente la
expresión desde Plac mediante la adición de 0,5 mM IPTG al medio de cultivo. Aunque
el pico máximo de excitación para estas proteínas difiere bastante de la longitud máxima
de emisión del láser (488 nm), comprobamos que son suficientemente excitadas dando
resultados reproducibles mediante la detección en los canales FL2 para DsRed2 o en
FL3 para mCherry y mKate2.

De esta manera se estableció un sistema en el que identificar fácilmente las tres

poblaciones presentes en la conjugación en el citómetro, mediante un gráfico que
enfrente los canales de fluorescencia verde y roja. Las células receptoras pueden ser
identificadas en él como eventos RFP+, los transconjugantes mostrarán un fenotipo
GFP+RFP+ mientras que los donadores se recogen como células dobles negativas
(figura R29).

113
 Figura R29. Esquema del diseño experimental para la medida de la conjugación en
el citómetro de flujo.
En la figura se muestran esquemáticamente los distintos componentes del ensayo de
conjugación por citometría. Representados en gris, los donadores contienen el plásmido
pAP711ΔoriT::Tet (que codifica para todos los genes de R388 pero carece de oriT) junto
con el pAR12 (PstbA-gfpmut2) y se recogen como eventos Q3 en el citómetro (dobles
negativos); los receptores, representados en rojo, contienen pAC1,2 o 4 (Plac-rfp) y se
detectan como eventos Q1 (RFP+GFP-); por último los transconjugantes, representados
en naranja, contendrán el plásmido pAC1,2 o 4 (Plac-rfp) junto con pAR12 (PstbA-
gfpmut2) por lo que se detectan como eventos Q2 (dobles positivos RFP+GFP+).

Para realizar los experimentos, las conjugaciones se llevaron a cabo en medio

sólido utilizando placas de 24 pocillos, en las que la mezcla de conjugación se extiende
directamente en la superficie de 1 ml de agar depositado en un pocillo, tal y como se
describe en el apartado B4.1 de materiales y métodos.

Para analizar las cinéticas de transferencia de oriT_R388, se midió la conjugación

simultáneamente por citometría y por el método tradicional de plaqueo en medio
selectivo, de forma que pudiésemos verificar los resultados obtenidos en la citometría
con el protocolo estándar de medida de la conjugación.

Se preparó una mezcla de conjugación 1:1 (D/R) y se extendió en pocillos

individuales de una placa de 24 pocillos que se incubaron a 37 ºC (ver materiales y
métodos). A distintos tiempos se fueron resuspendiendo las mezclas de conjugación en

114
LB y una muestra se fijó con PFA 4% para el análisis por citometría y otra se plaqueó
en placas con los antibióticos de selección para donadores, receptores y
transconjugantes.

En las medidas de citometría de flujo, se seleccionó la población bacteriana por

tamaño y complejidad, denominándola P1. Se recogieron 20.000 eventos en P1 que se
analizaron en gráficos FL1-GFP vs. FL2-RFP (o FL3) donde se establecen las distintas
poblaciones: las células donadoras se identificaron como eventos no fluorescentes; los
receptores son células RFP+GFP- y son detectadas en Q1 (eventos RFP+GFP-); los
transconjugantes son dobles positivos RFP+GFP+ que son detectados en Q2 (eventos
RFP+ GFP+). En la figura R30 se muestra una serie temporal de medidas en el citómetro.

0.5 h 1h 2h 4h
RFP

GFP GFP GFP GFP

6h 8h 10 h 24 h
RFP

GFP GFP GFP GFP

Figura R30. Serie temporal de un experimento de conjugación medido mediante

citometría de flujo.
En la figura se muestran los gráficos FL1 (GFP) vs.FL3 (RFP) obtenidos a diferentes
tiempos de conjugación con los cuadrantes delimitando las distintas poblaciones. La
población Q1 corresponde a los eventos RFP+GFP- que serían los receptores; Q3 serían
los dobles negativos donde se recogerían los donadores; Q2 sería la población de dobles
positivos correspondiente a los transconjugantes. Como se puede observar, la población
Q2 (transconjugantes) aumenta con el tiempo de conjugación, mientras que
simultáneamente la población Q1 (receptores) va disminuyendo.

Para verificar la validez los resultados obtenidos en los experimentos de citometría

de flujo, las mismas muestras de conjugación fueron analizadas por plaqueo en medio
selectivo. Mediante citometría de flujo calculamos la frecuencia de conjugación por
receptor como T/(T+R), que se corresponde con el cociente Q2/(Q1+Q2). En los

115
experimentos de plaqueo obtenemos la proporción T/(T+R) al dividir el número de
colonias con fenotipo (NxApKm)R entre las colonias obtenidas con fenotipo (NxAp)R

En la figura R31 se muestran las frecuencias de conjugación por célula receptora

obtenidas por ambos métodos para los distintos tiempos de conjugación. Como se
puede observar en el gráfico las frecuencias obtenidas por citometría de flujo se
corresponden perfectamente con las obtenidas por el método tradicional de plaqueo.
Además, las barras de error obtenidas en los datos de los experimentos de citometría
son consistentemente menores que la obtenidas en los ensayos de plaqueo, lo que
podría ser de esperar dado que los ensayos de citometría se analizan muestras con
muchas más células (20.000) que en los de plaqueo (unos cientos).

Figura R31. Comparación de las

frecuencias de conjugación
obtenidas por citometría y por
plaqueo.
La curva gris (círculos) se corresponde
a los datos obtenidos por plaqueo
mientras que la negra (triángulos)
corresponde a las frecuencias
calculadas por citometría.
Las frecuencias de conjugación están
calculadas como número de
transconjugantes por receptor y cada
punto corresponde a la media de al
menos 9 experimentos independientes;
las barras de error muestran la
desviación estándar de los datos.

Basándonos en los resultados obtenidos, concluimos que las medidas de

citometría son comparables a las obtenidas por el método tradicional de plaqueo en
medio selectivo, presentando menor variablidad.

También quisimos comprobar si la fijación con PFA4% puede tener algún efecto
sobre los resultados obtenidos en el análisis por citometría respecto al uso de muestras
frescas sin fijar. Para ello, obtuvimos las frecuencias de conjugación en el citómetro a
distintos tiempos de conjugación de las mismas muestras frescas y fijadas con PFA 4%.
La figura R32 confirma que la fijación de las células con PFA4% y conservación a 4 ºC
antes de la citometría no tiene efectos medibles en el ensayo. Dada la similitud de los
resultados cuando se miden células frescas o fijadas, el uso de la fijación permite
simplificar el ensayo, al poder conservar las muestras y procesarlas todas juntas en el
citómetro.

116
 Figura R32. Efecto de la fijación de las
muestras en los ensayos de
citometría de flujo.
Comparación de las frecuencias de
conjugación obtenidas por citometría de
flujo para la misma muestra de células
medidas directamente o tras la fijación
con 4% PFA y mantenimiento a 4 ºC
durante 24h. La muestras se tomaron a
0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 4.0 h de
conjugación. Cada punto corresponde a
la media de 4 experimentos individuales.

3.2. Estimación de la cinética de conjugación del oriT de R388

Para comprobar la capacidad de nuestro método experimental, decidimos utilizarlo

para estimar la cinética de movilización de un plásmido que portaba el origen de
transferencia (oriT) de R388. De acuerdo al ensayo teórico publicado por Zhong et al.
(Zhong, et al., 2012), la tasa de movilización debería ser un parámetro robusto,
resistente a los cambios en las condiciones experimentales iniciales, de la proporción
D/R y, hasta cierto punto, del tiempo. Para comprobar estos postulados, obtuvimos la
cinética de movilización del oriT de R388.

Para ello se prepararon distintas mezclas de conjugación, variando la proporción

de donadores y receptores. Se utilizaron cantidades del 2,5%, 5%, 10% o 50% de
donadores, pero manteniendo constante la concentración total de células. Las mezclas
conjugativas se dispusieron en placas de 24 pocillos a 37 ºC, según el protocolo B4.1
(materiales y métodos). Se obtuvieron muestras a distintos tiempos (0,5h, 1h, 2h, 4h,
6h, 8h, 10h y 24h) resuspendiendo los pocillos correspondientes y fijando las células
con 4% PFA. Las células fijadas se almacenaron a una temperatura de 4 ºC hasta que
se analizaron por citometría de flujo, según se describe en el apartado 2.1.

El resultado del experimento aparece recogido en la figura R33 que muestra las
frecuencias de conjugación por receptor (T/(R+T)) obtenidas a cada tiempo para cada
mezcla de conjugación.

117
 A 1,0

0,9

Frecuencia de conjugación por 0,8

recipiente (Y) 0,7

0,6
50%
0,5 10%
0,4 5%
2,5%
0,3

0,2

0,1

0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Tiempo (h)

B C
11 11
10,5 10,5
log10 densidad recipientes
log10 densidad donadores

10 10
9,5 9,5
9 9
8,5 8,5
8 50% 8 50%

10% 90%
7,5 7,5
95%
5%
7 7 97,5%
2,5%
6,5 6,5
0 4 8 12 16 20 24 0 4 8 12 16 20 24

Tiempo (h) Tiempo (h)

Figura R33. Determinación de las frecuencias de conjugación a distintos tiempos y

diferentes ratios D/R.
Cada color representa una mezcla de conjugación distinta con diferente proporción D/R
(ver leyenda). (A) Serie temporal de frecuencia de conjugación por receptor (Y = T/(R +
T)) obtenida para las diferentes mezclas de conjugación mediante citometría de flujo. Las
muestras se tomaron tras 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0 y 24 h de conjugación.
(B)(C) Crecimiento de los donadores y receptores, respectivamente, en la superficie del
agar durante el experimento de conjugación estimados por plaque en medio selectivo.

Como se observa en la figura, la aparición de transconjugantes aumenta con el

tiempo de conjugación hasta las 6-8h de conjugación, en que prácticamente se detiene.
Como reflejan las gráficas (B) y (C) el momento en el que la frecuencia deja de aumentar
coincide con la ausencia de crecimiento en las poblaciones de donadores y recipientes
(alrededor de las 8h), por lo que la conjugación en medio sólido parece progresar hasta
que se detiene la multiplicación celular.

Con los datos obtenidos calculamos los valores de tasa de conjugación (γ)
mediante el método “End point” descrito por Simonsen (Simonsen, et al., 1990),

118
modificado como se describe en el aparatado B7 de materiales y métodos para poder
aplicarlo a conjugaciones llevadas a cabo en una superficie sólida. Al representar los
valores γ en vez de las frecuencias de conjugación, obtenemos el gráfico representado
en la figura R34 (A). En los cuatro ratios D/R ensayados la tasa de conjugación (γ)
disminuye ligeramente con el tiempo. Este descenso se muestra más claramente en la
figura R34 (B) en la que se ha representado una sola curva con la media de los valores
de los distintos ratios D/R.

Sin embargo, si promediamos γ en los distintos tiempos para cada concentración

de donadores (figura R34C), podemos ver que el valor medio para la tasa de
conjugación se mantiene para los distintos ratios D/R ensayados.

A B -8,5
-8,5
50%
-9 -9
10%
5% -9,5
-9,5
2,5%
log10 γep
log10 γep

-10 -10

-10,5 -10,5

-11 -11

-11,5 -11,5
0 2 4 6 8 0 2 4 6 8

Tiempo (h) Tiempo (h)

Figura R34. Estimación de la tasa de

conjugación en punto final (γ).
C -9
(A) Representación de la tasa de
-9,5 conjugación γ obtenida para cada ratio D/R
-10 a distintos tiempos de conjugación. (B)
Curva promedio de las tasas calculadas
log10 γep

-10,5
para los distintos ratios D/R. (C) Valor de la
-11 tasa de conjugación para cada ratio D/R
-11,5
obtenido promediando las tasas a
obtenidas para los distintos tiempos. Cada
-12 color corresponde a un ratio D/R: 50% en
50% 10% 5% 2,5%
azul; 10% en verde; 5% en rojo y 2,5% en
D/R ratio
morado.

En la tabla R11 se encuentran recogidos los datos representados en las figuras. Con
ellos, obtenemos un valor medio de γ para oriT_R388 de 8*10-11 (-10,10 ± 0,45 (tabla))
que no cambia prácticamente con el ratio D/R y que presenta poca variación con el
tiempo de conjugación. La media varía en una desviación standard según el punto
temporal en el que se tomen los datos. Este indicador es claramente más robusto que

119
las proporciones de la frecuencia de conjugación que se ven muy influenciadas por las
condiciones experimentales.

Tabla R11. Valores de tasa de conjugación en punto final (γ) obtenidos para las distintas
proporciones de donadores (izquierda) y para los distintos tiempos (derecha).

Para tratar de determinar si la disminución de la conjugación (Y, γ) observada en

las muestras tomadas en tiempos largos de conjugación (más de 6h) puede ser debida
a un efecto derivado de la estructuración de la población, llevamos a cabo experimentos
resuspendiendo las mezclas de conjugación a las 6h en LB fresco y volviendo a poner
a conjugar la misma cantidad de células en una nueva superficie de agar hasta las 24h
desde el inicio del experimento. Los resultados obtenidos se muestran en la figura R35
que muestra las frecuencias de conjugación por receptor (Y) para las distintas mezclas
de conjugación a las 24h del comienzo del experimento, comparando los resultados
obtenidos para la mezcla inicial frente a los obtenidos para la resuspendida y
remezclada a las 6h.

1,0
no mixed Figura R35. Efecto de la mezcla en
0,9 mixed at 6h la conjugación.
Frecuencia conjugación

0,8
Se representan las frecuencias de
0,7
conjugación (Y = T/(R + T)) a las 24h,
0,6
de experiementos con diferentes ratios
0,5
D/R. En negro se representan las
0,4 frecuencias obtenidas a las 24h (no
0,3 mezcladas) y en gris se representa Y
0,2 medido a las 24h pero tras un paso
0,1 intermedio de resuspensión y mezcla
0,0 en LB fresco a las 6h de conjugación
50 10 5 2,5 (mezcladas a las 6h).
% donadores

Como se puede ver, las frecuencias de conjugación aumentan sustancialmente

tras este proceso de refresco, alcanzándose en todos los casos valores máximos de Y,
sin que se observen diferencias entre las distintas proporciones iniciales de donadores.

120
 3.3. Medida de la conjugación de plásmidos modelo por citometría

Una vez puesto a punto el sistema de medida de la conjugación en el citómetro

decidimos analizar un grupo de plásmidos conjugativos marcados con fluorescencia
proporcionados por el laboratorio de Ellen Zechner (Reisner, 2002). Estos plásmidos
están marcados con una proteína fluorescente amarilla (yfp), clonada bajo un promotor
Plac. Para poder determinar su frecuencia de conjugación utilizando el citómetro de flujo,
adaptamos el protocolo anterior para poder aplicarlo a células que expresaran la
proteína YFP.

Como donadores se utilizaron células BW-RifR que contienen el correspondiente

plásmido conjugativo marcado con yfp (Reisner, 2002), cuya fluorescencia nos permite
detectarlos en el canal FL1 del citómetro. Dado que este fluoróforo tiene un espectro de
emisión muy amplio que interfiere con el de las proteínas fluorescentes rojas, decidimos
marcar las células receptoras con un plásmido que expresase la proteína fluorescente
CFP cuyo uso es habitual en combinación con YFP. Por tanto, en este caso como
receptores se utilizaron células BW-NxR transformadas con el plásmido pAC5 que
codifica para la proteína fluorescente cian, cuya expresión es controlada por un Plac. La
expresión de fluorescencia cian se utilizó como marcador de la población de receptores
manteniéndose inducida permanentemente la expresión mediante la adición al medio
de cultivo de 0,5 µM IPTG. En este caso, las células transconjugantes se identifican en
el citómetro como una población de células dobles positivas YFP+CFP+ (figura R36).

D R T
R388::yfp Plac::cfp Plac::cfp
Plásmido Plásmido
conjugativo conjugativo

Figura R36. Esquema del diseño experimental para la medida de la conjugación en

el citómetro de flujo.
En la figura se muestran esquemáticamente los distintos componentes del ensayo de
conjugación por citometría. Los donadores, representados en amarillo, contienen el
plásmido conjugativo marcado con yfp y se recogen como eventos Q4 en el citómetro

121
 (CFP-YFP+); los receptores, representados en azul, contienen pAC5 (Plac-cfp) y se
detectan como eventos Q1 (CFP+YFP-); por último los transconjugantes, representados
en verde, contendrán el plásmido pAC5 (Plac-cfp) junto con el plásmido conjugativo
marcado con yfp por lo que se detectan como eventos Q2 (dobles positivos CFP+YFP+).

Para realizar los experimentos, llevamos a cabo las conjugaciones en sólido

utilizando placas microtiter de 24 pocillos, tal y como se describe en materiales y
métodos B4.1. Se prepararon dos mezclas de conjugación con diferente proporción D:R,
una con ratio 1:20 y otra 1:1, manteniendo en ambos casos la misma concentración
inicial de células. Cada mezcla se repartió en pocillos individuales de una placa de 24
pocillos que se incubaron a 37 ºC (ver materiales y métodos). A distintos tiempos las
conjugaciones se resuspendieron en PBS, se fijaron y se almacenaron a 4 ºC para el
análisis posterior por citometría, midiéndose la proporción de células D, R y T a cada
tiempo.

En todos los casos se analizaron 20.000 eventos en P1 mediante gráficos YFP vs.
CFP donde establecemos las distintas poblaciones: las células donadoras se
identificaron como eventos YFP+CFP- (Q3); las receptoras son células YFP-CFP+ y son
detectadas en Q1; los transconjugantes son dobles positivos YFP+CFP+ que son
detectados en Q2. En la figura R37 se muestra un ejemplo de un experimento con varios
tiempos en el que se puede ver cómo a medida que aumenta el tiempo de conjugación
la población de dobles positivos (P3), correspondiente a los transconjugantes, va
aumentando al mismo tiempo que disminuye la población de receptores (P2).

Tiempo
CFP

YFP YFP YFP YFP YFP

Figura R37. Serie temporal de un experimento de conjugación medido mediante

citometría de flujo.
En la figura se muestran los gráficos YFP vs.CFP obtenidos a diferentes tiempos de
conjugación con los cuadrantes delimitando las distintas poblaciones. La población P3
corresponde a los eventos CFP+YFP- que serían los receptores; P5 serían los CFP-YFP+
donde se recogerían los donadores; P4 sería la población de dobles positivos
correspondiente a los transconjugantes.

En la figura R38 se representan las frecuencias de conjugación calculadas a partir de

los datos de citometría para el plásmido R388 (pSU2007-yfp). Junto a la gráfica

122
correspondiente a R388 se ha colocado la obtenida en el apartado 2.1 para oriT_R388
(derecha).

1,0 pSU2007-yfp 1,0 oriT_R388-gfp

0,9 oriT_R388 50%
Frecuencia conjugación

0,9

Frecuencia conjugación
0,8 0,8 oriT_R388 5%
0,7 0,7
(T/(R+T))

(T/(R+T))
0,6 0,6
0,5 0,5
0,4 0,4
0,3 0,3
pSU2007 50%
0,2 0,2
0,1 pSU2007 5%
0,1
0,0 0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

Figura R38. Determinación de las frecuencias de conjugación a distintos tiempos

para pSU2007-yfp.
Serie temporal de frecuencia de conjugación por receptor (Y = T/(R + T)) obtenida para
una mezcla de conjugación D/R 1:1 (en negro) y 1:20 (en gris) mediante citometría de flujo,
para el plásmido R388 completo (gráfico de la izquierda) y para oriT_R388 del apartado
2.2 (gráfico de la derecha). Las muestras se tomaron tras 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0,
8.0 y 24 h de conjugación.

Como se puede observar las cinéticas de las curvas son ligeramente diferentes.
El plásmido conjugativo (panel izquierdo) conjuga hasta frecuencias un poco más altas
(0.8 frente a 0.7 T/(R+T)) y de forma más rápida: su cinética es de tipo sigmoideo,
mientras que el plásmido movilizable muestra una cinética de tipo parabólico. Esta
diferencia se aprecia de manera mucho más clara cuando reducimos la concentración
inicial de donadores del 50% al 5%. En este caso, las frecuencias alcanzadas con el
plásmido conjugativo son de 0,8-0,9 (T/(R+T)) frente a 0,3 (T/(R+T)) en el movilizable.

Usando la misma estrategia descrita para R388, aplicamos citometría de flujo para
monitorizar la cinética de conjugación de representantes de los principales grupos de
incompatibilidad, que incluían los plásmidos RP4 (IncP), pOX38 (IncFI), R1 (IncFI) y
ColIbp-9 (IncI). Además, para estos dos últimos plásmidos contábamos con dos
mutantes des-reprimidos para la expresión de las funciones de transferencia: R1drd19
(IncFII) y ColIbp-9dr (IncI). Los distintos grupos de incompatibilidad plásmidicos
muestran diferentes estructuras genómicas, preferencias de hospedador y prevalencia
en poblaciones naturales, lo que plantea la pregunta de si su potencial conjugativo
también será también diferente.

Las frecuencias de conjugación por receptor calculadas por citometría de flujo

para estos plásmidos están representadas en la figura R39.

123
 1,0 RP4-yfp 1,0 pOX38Km-yfp
Frecuencia conjugación 0,9 0,9

Frecuencia conjugación
0,8 0,8
0,7 0,7
(T/(R+T))

(T/(R+T))
0,6 0,6
0,5 0,5
0,4 0,4
0,3 0,3
RP4 50% pOX38 50%
0,2 0,2
0,1 RP4 5% 0,1 pOX38 5%
0,0 0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

1,0 R1drd19-yfp 1,0 R1-yfp

0,9 0,9
Frecuencia conjugación

Frecuencia conjugación
0,8 R1 50%
0,8
0,7 0,7 R1 5%
(T/(R+T))

(T/(R+T))
0,6 0,6
0,5 0,5
0,4 0,4
0,3 0,3
R1drd19 50%
0,2 0,2
0,1 R1drd19 5% 0,1
0,0 0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

1,0 pLG221-yfp 1,0 pLG272-yfp

Frecuencia conjugación

0,9
Frecuencia conjugación

0,9
0,8 0,8 pLG272 50%
0,7 0,7
pLG272 5%
(T/(R+T))
(T/(R+T))

0,6 0,6
0,5 0,5
0,4 0,4
0,3 0,3
pLG221 50% 0,2
0,2
0,1 pLG221 5% 0,1
0,0 0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

Figura R39. Frecuencias de conjugación de distintos plásmidos modelo a distintos

tiempos y diferentes ratios D/R.
Serie temporal de frecuencia de conjugación por receptor (Y = T/(R + T)) obtenida para
una mezcla de conjugación D/R 1:1 (en negro) y 1:20 (en gris) mediante citometría de flujo,
para varios plásmidos modelo marcados con fluorescencia: RP4-yfp, pOX38-yfp, R1drd19-
yfp, R1-yfp, ColIbp9dr-yfp y ColIbp-yfp. Las muestras se tomaron tras 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0,
3.0, 4.0, 6.0, 8.0 y 24 h de conjugación.

3.4. Comparación de la capacidad de propagación de los plásmidos

modelo

124
 La conjugación permite a los plásmidos invadir nuevos receptores, por lo que
resulta un mecanismo fundamental en la propagación de estos elementos genéticos. Al
objeto de comparar la capacidad de propagación de los distintos plásmidos modelo
analizados, comparamos su cinética prestando atención a dos variables importantes: la
proporción de células que llevaban el plásmido (P+ = (T + D)/ (D+T+R)) y la proporción
de células donadoras (D/(D+T+R)). Con los datos obtenidos en el apartado anterior,
representamos la cinética de estas variables para cada uno de los plásmidos analizados.

Comenzamos por las conjugaciones en las que la tasa inicial de donadores y

receptores fue del 50%. Estos resultados se muestran en la figura R40.

Figura R40. Proporción de células P+ y D en los ensayos de conjugación (1:1) para

los distintos plásmidos conjugativos.
Utilizando los datos obtenidos en las cinéticas de conjugación analizadas por citometría
de flujo, calculamos para cada instante de tiempo (t), la proporción de células que
contenían el plásmido (en naranja) y la proporción de donadoras (en azul). Los valores de
ambas proporciones, así como sus desviaciones estándar se muestran en la figura para

125
 cada muestreo temporal. Cada gráfico representa los resultados obtenidos para uno de
los plásmidos (RP4, R388, F, etc.) en conjugaciones en las que se utilizó un 50% de
donadores (D) iniciales.

Los resultados obtenidos para los plásmidos R388 (IncW), RP4 (IncP) y F (IncFI)
(figura R40, paneles A) indican que estos plásmidos lograron ocupaciones de la
población bacteriana cercanas al 100%. Sin embargo, los plásmidos ColIbp-9 y R1,
representantes respectivamente de los grupos de incompatibilidad IncI e IncFII,
incrementaron su prevalencia de manera más discreta (Figura R40, B y C, paneles
izquierdos). La comparación entre P+ y D nos permite, además, cuantificar el efecto que
el crecimiento de los donadores tiene sobre la prevalencia del plásmido en la población.
Como se aprecia en la figura, en los casos de ColIbp-9dr y R1 el incremento en la
prevalencia se debe, fundamentalmente, al crecimiento de los donadores. En el caso de
las variantes des-reprimidas de estos plásmidos (Figura R40 B y C, paneles derechos),
la prevalencia del plásmido llegó a niveles cercanos al 100%, siendo la contribución de
los donadores proporcionalmente mucho menor.

Para separar el efecto de donadores y transconjugantes en la expansión del

plásmido en la población experimental, analizamos del mismo modo que en el caso
anterior los resultados de las cinéticas obtenidos para conjugaciones en las que la
proporción inicial de donadores se limitó a un 5% del total. Los resultados se muestran
en las gráficas de la figura R41.

126
 Figura R41. Proporción de células P+ y D en los ensayos de conjugación (1:20) para
los distintos plásmidos conjugativos.
Utilizando los datos obtenidos en las cinéticas de conjugación analizadas por citometría
de flujo, calculamos para cada instante de tiempo (t), la proporción de células que
contenían el plásmido (en naranja) y la proporción de donadoras (en azul). Los valores de
ambas proporciones, así como sus desviaciones estándar se muestran en la figura para
cada muestreo temporal. Cada panel representa los resultados obtenidos para
conjugaciones en las que se utilizó un 5% de D iniciales. Los recuadros verdes indican
aquellos valores para los que P+ > 50%.

Los resultados de la figura R41 permiten discriminar mejor la contribución de la

conjugación a la propagación de cada uno de los plásmidos modelo estudiados. Así,
encontramos que los plásmidos RP4, R388 y R1drd19 alcanzaron los mayores niveles
de prevalencia, con valores superiores al 70% al final de la cinética. Calculando el
tiempo requerido por estos plásmidos para alcanzar valores de P+ > 50% pudimos
determinar que RP4 (IncP) alcanzó estos niveles a las 3h desde el inicio de la
conjugación, mientras que R1drd19 y R388 lo hicieron a las 4 y a las 5 h
respectivamente.

En conjunto, estos datos nos permitieron establecer que RP4 mostró las mayores
tasas de conjugación, seguido de R1drd19 y R388. Los plásmidos F y ColIb-p9
mostraron valores intermedios, mientras que R1 y ColIbp-9dr incrementaron su
prevalencia debido, fundamentalmente al crecimiento de los donadores, sin que la
conjugación mostrase contribución aparente alguna.

127
128
DISCUSIÓN
 DISCUSIÓN

1. LA RED DE REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DE R388

Los plásmidos conjugativos son vehículos esenciales para la transferencia

genética horizontal en bacterias. Sin embargo, los plásmidos exceden su papel
instrumental para las bacterias ya que ellos mismos son unidades genéticas con
genomas estructurados capaces de mostrar una fisiología en sí mismos.

Tal y como habían establecido los experimentos llevados a cabo en nuestro grupo,
el plásmido R388 presenta distintas familias de motivos de repetición de secuencia en
las zonas intergénicas (Fernandez-Lopez, et al., 2006). Estudios preliminares sugerían
estos sitios podrían corresponder a operadores para los distintos reguladores
transcripcionales plasmídicos (Fernandez-Lopez, 2007), mostrando que, en cuatro de
estas repeticiones era posible asociar un regulador transcripcional dado que:

- Los promotores con repeticiones IT-B eran reprimidos por StbA.

- Los promotores con repeticiones SDR-A eran reprimidos por ArdK.
- Los promotores con repeticiones SDR-B eran reprimidos por KorA.

Nuestros resultados identificaron, además, dos reguladores adicionales que

actúan exclusivamente sobre su propio promotor (ResP y KfrA) y confirmaron el papel
de TrwA en la regulación de su propia síntesis (Moncalian, et al., 1997). Por otra parte,
los resultados con el mutante R388ΔkorB indicaron que KorB parece actuar como un
co-represor de los promotores con repeticiones IT-B, si bien requiere la presencia de
otro factor plasmídico, posiblemente KorA, para ejercer su acción. No encontramos, sin
embargo, ningún regulador específico asociado a las repeticiones SDR-C. Por lo tanto,
es posible que estas secuencias correspondan a sitios de unión de algún regulador
celular o bien se trate de sitios de unión de proteínas con otro tipo de función.

El estudio del genoma de R388 puso de manifiesto que se encuentra dividido en

distintos módulos funcionales basándonos en el papel atribuido a los genes localizados
en cada región (Fernandez-Lopez, et al., 2006). Tras el estudio de la red de regulación
del plásmido, encontramos que la mayoría de los circuitos de regulación identificados
en la red involucran reguladores y promotores pertenecientes al mismo modulo funcional

131
(figura D1), con la única excepción de StbA cuyo circuito englobaría genes de los
módulos de mantenimiento y transferencia. Esta situación podría hacer pensar que cada
módulo funcional constituiría un “bloque de construcción”, tratándose de una unidad
funcional, regulatoria y filogenética. Sin embargo, la estructura filogenética del plásmido
pone de manifiesto una situación donde reguladores y dianas presentan orígenes
filogenéticos completamente distintos (Fernandez-Lopez, et al., 2006). Por tanto, la red
de regulación transcripcional del plásmido es capaz de integrar este mosaico genético,
dando lugar al establecimiento de módulos funcionales con una regulación coordinada.

Figura D1. Módulos funcionales del plásmido R388 y su regulación.

La figura esquematiza en distintos colores los distintos módulos funcionales del plásmido,
indicando de forma abreviada la regulación de cada módulo. No se muestra la interacción
de StbA sobre el módulo de transferencia.

En general, la regulación transcripcional de R388 consiste exclusivamente en

represores transcripcionales, está basada en circuitos de autorregulación negativa en
los que cada regulador reprime su propia síntesis, y la mayoría de los promotores
presentan altos índices de represión tratándose de promotores fuertes que encuentran
muy reprimidos en presencia de R388. Esto contrasta con lo descrito en las redes de
los cromosomas bacterianos como, por ejemplo, en la red de regulación de E. coli donde
el número de activadores transcripcionales es aproximadamente igual al de los
represores (Shen-Orr, et al., 2002). Sin embargo esta tendencia a la regulación negativa
aparece también en otros plásmidos BHR estudiados, como pKM101 (Paterson, et al.,
1999) o RP4 (Kostelidou & Thomas, 2002), lo que hace pensar que este diseño pueda

132
presentar algunas propiedades intrínsecas que favorecen la supervivencia y
propagación para un plásmido BHR.

Arquitectura de la red transcripcional del plásmido R388

La red de regulación transcripcional del plásmido R388 aparece esquematizada

en la figura D2. Inspeccionando su topología destacan varias características
interesantes: todos los reguladores identificados parecen funcionar como represores
transcripcionales autorregulados; la mayoría de los circuitos de regulación identificados
involucran reguladores y promotores pertenecientes al mismo modulo funcional; todos
los promotores del backbone son regulados por al menos un represor y cuando dos
reguladores actúan sobre el mismo promotor, se aplica una lógica OR, por lo que no es
necesaria la presencia simultánea de ambos sino que la presencia de uno u otro es
capaz de reprimir al promotor.

Figura D2. Arquitectura de la red de regulación transcripcional de R388.

La figura representa la estructura de la red de regulación transcripcional identificada en
R388. Los genes plasmídicos se representan en distintos colores según el módulo
funcional al que pertenecen: arriba aparece la región de mantenimiento general del
plásmido con el módulo de replicación representado en verde y en azul los genes
implicados en establecimiento y estabilidad; en la parte de abajo está la región que
contiene los módulos implicados en la transferencia conjugativa representados en amarillo;
las flechas rojas representan los promotores. Sobre el plásmido, en negro, se representan
las interacciones de la red de regulación con sus correspondientes reguladores, excepto
la regulación de StbA sobre el módulo de conjugación que se representa en rosa.

133
 Esto se ve claramente en el caso de los promotores de la zona de establecimiento
en el hospedador, que se encuentran regulados tanto por StbA como por ArdK
constituyéndose un motivo de regulación de tipo DOR. Éste contiene dos reguladores
que actúan sobre los mismos promotores pero no interfieren entre sí. Como se ha visto
experimentalmente la presencia de uno de los dos reguladores produce una fuerte
represión en los promotores, de manera que para que los promotores se activen es
necesario que ambos reguladores se despeguen. La presencia de este motivo de red
mantiene PardC, Porf7, Porf12 and Porf14 completamente reprimidos, como se observa
en los perfiles de expresión en presencia del plásmido R388, y sugiere que el plásmido
será capaz de mantener reprimidos estos genes frente a desuniones transitorias de uno
de los dos represores. La medida de los perfiles de expresión en presencia de los R388
knock-out para ardK (pIC9 y pIC11) pone de manifiesto que los promotores permanecen
reprimidos en ausencia de ArdK pero manifestándose un aumento en la actividad
transcripcional cuando únicamente está regulados por StbA.

El circuito que regularía los promotores responsables de la síntesis y ensamblaje

del pilus estaría integrado por los reguladores KorA y StbA y también presentaría una
lógica OR, aunque su arquitectura se presenta más complicada. El principal regulador
del circuito es KorA, que establece un motivo tipo SIM mediante su unión a las
secuencias SDR-B que mantiene reprimidos PkorA, PkikA, PtrwH y PkorB. StbA parece
ser capaz de reprimir los mismos promotores, pero no completamente incluso a máxima
inducción del regulador. La conservación parcial en los sitios SDR-B de una secuencia
análoga a un IT-B, el sitio de unión de StbA, podría ser la causa de este fenómeno. Así,
StbA y KorA formarían un circuito complejo que topológicamente representa un motivo
de tipo Feedforward loop de salida múltiple (MO-FFL). En R388, StbA reprime
directamente los promotores de la región de conjugación pero también reprime la
expresión de KorA que es el represor principal de estos promotores. Este FFL
pertenecería al tipo incoherente de clase 2, un motivo de red escasamente representado
en las redes de E.coli o S.cerevisiae y cuyas capacidades computacionales no han sido
experimentalmente estudiadas.

El análisis de mutantes por deleción de R388 nos ha permitido encontrar que la

eliminación del gen korB produce un efecto sobre varios promotores de la red, a pesar
de que KorB no había mostrado actividad como regulador transcripcional en la búsqueda
combinatoria de reguladores. Cuando el mutante carente de korB es ensayado con la
librería de promotores se observa un efecto en los promotores regulados por korA, que
pone de manifiesto la existencia de otro nivel de regulación aún sin estudiar.

134
Previamente se habían hecho algunos experimentos coexpresando KorB y KorA desde
distintos vectores (Fernandez-Lopez, 2007), tratando de observar un efecto de KorB
sobre los promotores de R388 pero no se había conseguido ningún resultado que
indicase una función reguladora de KorB, obteniéndose los valores esperados por la
presencia de KorA. Este resultado señala a korB como un posible punto de interés para
un trabajo posterior, al tiempo que pone de manifiesto el interés de conseguir nuevos
knockout de R388, especialmente de ORFs sin función asignada o con homología con
reguladores, para tratar de ampliar el conocimiento sobre la regulación de las funciones
plasmídicas.

Además de estos circuitos más complejos, en el plásmido se han identificado tres

motivos simples de autorregulación negativa. Así, tal y como previamente había sido
caracterizado, TrwA actúa como represor transcripcional de sistema Dtr, mediante el
reconocimiento de dos sitios de unión caracterizados en la región promotora del operón
trwABC, situada dentro del oriT de R388 (Moncalian, et al., 1997). La resolvasa ResP
ha resultado ser el regulador transcripcional responsable del control del operón resP-
repA que contiene los genes implicados en la replicación plasmídica, actuando como
represor transcripcional de su propia síntesis. Por último, se ha encontrado un tercer
circuito de autorregulación en el operón kfrA-osa que se encuentra reprimido por KfrA.

Dentro de la red de regulación identificada hasta el momento StbA parece

destacarse como un regulador central del plásmido ya que conectaría la regulación de
dos módulos funcionales, uniendo la regulación de los promotores de conjugación con
los del módulo de mantenimiento, mientras que el resto de las interacciones regulatorias
identificadas involucran promotores y represores pertenecientes al mismo módulo
funcional. Además, los trabajos de Guynet et al. sobre el operón stbABC sugieren que
estos genes pueden desempeñar un papel regulador en el balance entre la transmisión
vertical y horizontal del plásmido (Guynet, et al., 2011).

El trabajo con las deleciones de R388 nos deja un resultado a priori

desconcertante, que es el obtenido al ensayar el mutante que carece de trwC. En este
caso nos encontramos con que el promotor PtrwA aparece prácticamente desregulado
cuando, en principio, la regulación de este promotor se lleva a cabo únicamente por
TrwA y no se conoce que TrwC ejerza ningún papel regulatorio en el plásmido. Sin
embargo TrwC se une a secuencias específicas en el oriT situadas adyacentes a los
sitios de unión de TrwA (Llosa, et al., 1991) por lo que existiría la posibilidad de que
pueda tener alguna función regulatoria secundaria aún por explorar. Este resultado es

135
en cualquier caso preliminar y, aunque se ha comprobado que el gen trwA se encuentra
en el plásmido, habría que descartar que se haya visto afectado de alguna manera.

Considerando el estado reprimido de la red, se sometió el plásmido a distintos

estímulos ambientales que pudieran desencadenar alguna respuesta en el plásmido. Se
cambiaron las condiciones de crecimiento: medio LB, medio M9, distintas temperaturas
(30, 37 y 42 ºC) y se probó la presencia de agentes estresantes como concentraciones
subinhibitorias de antibióticos (Cm y Rif) o inductores de la respuesta SOS (UV,
mitomicina). A juzgar por los resultados obtenidos en los perfiles de expresión de los
promotores, ninguna de estas señales parece generar pertubaciones específicas en la
red. Dado que una característica fundamental para la dispersión del plásmido en las
poblaciones es la transferencia conjugativa y aún se desconoce si existe alguna señal
responsable de desencadenar el proceso conjugativo se probó si la presencia de
posibles receptores en el medio podía producir alguna respuesta en la regulación
transcripcional del plásmido. Para ello, se co-cultivaron de las células con los
promotores de R388 junto con células sin plásmido, igualmente sin obtenerse una
respuesta en los promotores.

Propiedades de la red: minimización de la carga para el hospedador y producción

de fuertes respuestas transcripcionales puntuales

Aunque no se conoce un estudio cuantitativo sistemático, la red de regulación del

plásmido RP4 es posiblemente la más estudiada. A pesar de que la red de regulación
global descrita en R388 y en RP4 tienen organizaciones distintas, ambas comparten dos
características fundamentales: se basan únicamente en represores transcripcionales y
contienen promotores con un alto índice de represión (Thomas, 2006). Tanto R388 como
RP4 son plásmidos de amplio rango de hospedador pero pertenecen a grupos de
incompatibilidad diferentes y no se encuentran relacionados filogenéticamente
(Pansegrau, et al., 1994) (Fernandez-Lopez, et al., 2006) (Sen, et al., 2013). Esto parece
indicar que habrían evolucionado de manera independiente hacia redes de regulación
basadas en los mismos principios lo que podría deberse a encontrarse ambos sometidos
a presiones selectivas presumiblemente similares.

El estudio de las propiedades de los distintos motivos de red, ha puesto de

manifiesto que los motivos de feedback negativo presentan la propiedad de acelerar los
tiempos de respuesta (Alon, 2007) y de mantener un control robusto frente a
activaciones espurias transitorias (Alon, 2007). Los altos índices de represión que
presentan los promotores de R388 combinado con la abundancia de circuitos de

136
autorrepresión, favorecería la generación de respuestas transitorias rápidas y fuertes en
situaciones específicas, permitiendo al mismo tiempo que el plásmido se mantenga
fuertemente reprimido el resto del tiempo. De esta manera, la red transcripcional de
R388 parece estar diseñada para permanecer apagada la mayoría del tiempo pero
teniendo la capacidad de producir respuestas fuertes transitorias cuando es necesario.
Estas características podrían resultar útiles para la dispersión del plásmido dado que la
selección impone demandas opuestas a la fisiología plasmídica. Así, el plásmido
requiere de un delicado equilibrio entre la expresión de los genes necesarios para su
adecuado mantenimiento y propagación en la población y la carga metabólica causada
al hospedador (Paulsson, 2002).

El mantenimiento de niveles de expresión basales muy bajos favorece que el

plásmido ejerza una baja carga metabólica sobre el hospedador lo que supone un
beneficio para el plásmido. Aquellos que ejercen alta presión sobre el hospedador
reducen el fitness bacteriano y en ausencia de presión selectiva serán desplazados de
la población por las células libres de plásmido o plásmidos con bajo coste para el
hospedador (Paulsson, 2002).

Por otro lado, como muestran los modelos teóricos y las simulaciones, es
esperable que tras un evento de conjugación los circuitos de feedback negativo
experimenten overshooting transitorio, que será mayor cuanto más fuerte sea el
promotor. El plásmido conjugativo al entrar en un nuevo hospedador se encuentra en
una situación en donde está presente la maquinaria transcripcional pero la red de
regulación se encuentra temporalmente ausente, lo que provocaría la expresión de los
genes plasmídicos hasta que se alcancen las concentraciones de reguladores
necesarias para volver a reprimirlos.

Un análisis mediante RT-qPCR llevado a cabo en el laboratorio por Fernandez-

López muestra que se produce un incremento de transcripción en varios promotores de
R388 sujetos a NFLs cuando el plásmido es transferido por conjugación a una nueva
célula mientras que genes que no están bajo el control de ningún regulador (dhfR) no
mostraron cambios similares (Fernandez-Lopez, et al., 2014). Los resultados obtenidos
en estos experimentos corresponden a grandes rasgos lo predicho por las simulaciones
teóricas. Además, han puesto de manifiesto que el pico de expresión producido tras la
conjugación parece tener un impacto considerable sobre el crecimiento de las células
presentando una reducción medible en la tasa de crecimiento bacteriano, posiblemente
causado por la transcripción y traducción de los genes plasmídicos. Si, a pesar de que
este efecto negativo temporal sobre el crecimiento del huésped, R388 y otros plásmidos

137
similares ha evolucionado redes basadas en feedback loops negativos, está claro que
este diseño debe presentar alguna propiedad adaptativa interesante para el estilo de
vida plasmídico.

Tras la conjugación, el plásmido que ha entrado en la célula está sometido a un

proceso de selección intracelular en el que necesita conseguir establecerse en el
hospedador, bloquear la entrada de otros plásmidos y alcanzar el número de copias de
estado estacionario lo antes posible. Es posible que el overshooting transcripcional tras
la conjugación permita al plásmido producir una respuesta trascripcional vigorosa en un
momento en el que la selección intracelular es más fuerte que la intercelular. Sin
embargo, la naturaleza transitoria de esta respuesta permitiría que a largo plazo, donde
la selección intercelular se impone a la intracelular, los efectos que causa el plásmido
en la célula sean mínimos. Así, al alcanzarse las concentraciones necesarias de
reguladores, se mantendría la actividad de los promotores prácticamente apagados
para ejercer la mínima carga posible sobre el huésped, favoreciendo su supervivencia
frente a los fenómenos de selección intercelular.

2. EFECTO DE LA VARIACIÓN EN EL GENOMA DE LOS IncW EN LA

REGULACIÓN Y EL FENOTIPO

Efectos del cambio en el genotipo sobre la red de regulación

La comparación de la actividad transcripcional de los promotores de R388 con dos

plásmidos 97% idénticos a R388 revela que, a pesar de su simplicidad, la red muestra
importantes e inesperadas respuestas a pequeñas variaciones genéticas. Más aún,
muestra que la intensidad de estos cambios podría no ser predicha a priori a partir del
nivel de identidad de secuencia, indicando una relación no linear entre las velocidades
de evolución del genoma y la de la red.

Las diferencias detectadas pueden deberse a dos razones principales: por un lado
a que la concentración intracelular de los reguladores transcripcionales es distinta o que
hay una variación en las secuencias de los represores o sus sitios de unión. Variaciones
en la concentración intracelular suelen a su vez ser producidas por distintos
mecanismos, incluyendo modificaciones en el número de copias del plásmido,
variaciones en la fuerza del promotor, en la estabilidad de los RNA o proteínas, etc.

138
 De todas las diferencias observadas en las actividades de los promotores, solo en
el caso del pTrwA somos capaces de identificar su causa inmediata. Las variaciones de
secuencias en la región PtrwA-trwA entre R7K y R388 es considerablemente más alta
que en el resto del armazón (12.5% respecto a 2.5%). Un análisis más detallado revela
que los residuos de TrwA implicados en el reconocimiento del sitio del DNA, así como
los sitios de unión son diferentes (Tena, 2013) (Revilla, et al., 2008), lo que explicaría lo
observado en las actividades transcripcionales, donde TrwA_R7K resulta incapaz de
reprimir PtrwA_R388. El resto de variaciones en las actividades promotoras podrían
deberse a distintos mecanismos actualmente aún sin caracterizar. Es llamativo que
pIE321 modifica los niveles de expresión de 9 de los 13 promotores del armazón
mientras que R7K modifica la actividad de tres. pIE321 muestra solo un 0,5% más de
variación respecto a R388 lo que sugiere que una relación no-lineal entre el grado de
homología del genoma y su impacto en la red de regulación.

.Cambios en el fenotipo en los plásmidos IncW

La variación en la actividad transcripcional observada en los promotores de R388

en presencia de la red de regulación de otros IncW lleva a plantearse si podría haber
también diferencias fenotípicas entre estos plásmidos. Tras estudiar las principales
funciones plasmídicas encontramos que, a pesar de la alta identidad de secuencia,
existen importantes diferencias fenotípicas entre ellos, desde el número de copias a la
estabilidad en distintos hospedadores. Por ejemplo, la determinación del número de
copias de plásmido respecto al cromosoma revela que pIE321 se encuentra en menor
cantidad en la célula que R388 o R7K, con una media de 0,5 copias por cromosoma en
el caso de pIE321 frente 4 en los otros dos. Los ensayos llevados a cabo para determinar
el rango de hospedadores en que los plásmidos son capaces de mantenerse estables,
también muestran diferencias. En E. coli encontramos que frente a una estabilidad del
100% para el resto de los IncW ensayados, R7K resulta inestable recuperándose el
plásmido en un 60% de las células tras 100 generaciones; también encontramos que en
un hospedador como P. putida donde R388 resulta altamente inestable (0% de células
con plásmido tras 80 generaciones) pIE321 parece ser capaz de mantenerse estable
(98% de células mantienen el plásmido en 80 generaciones). Estos resultados ponen
de manifiesto que la presencia de pequeños cambio en el genoma no solo tiene un
efecto considerable en el ajuste de la regulación sino que es capaz de producir
importantes cambios en el fenotipo plasmídico.

139
 Los plásmidos R388, R7K y pIE321 fueron aislados de diferentes especies
bacterianas, representando el establecimiento exitoso del mismo core plasmídico en
tres entornos genómicos diferentes (Revilla, 2008). La conservación de un core
genómico común con distintas variantes, aisladas de distintas especies, es también una
característica común de otros plásmidos BHR como es el caso de los plásmidos IncP
(Schluter, et al., 2007). Basándonos en los datos obtenidos para R388 y sus variantes,
sugerimos que tras este aparentemente bajo grado de variación en la secuencia, los
plásmidos esconden una sorprendente habilidad para ajustar sus redes regulatorias sin
hacer grandes cambios en su estructura genómica. Esto contrasta con los estudios
hechos recientemente en E. coli que muestran que cambios en la conectividad o en la
expresión de los reguladores globales tienen poco efecto en el perfil transcripcional de
la red de regulación (Isalan, et al., 2008). Esta susceptibilidad al cambio genético
conferiría a los plásmidos la habilidad de adaptarse rápido a nuevos ambientes
genéticos facilitándoles la colonización de distintos tipos de células. Esta sería una
característica favorable para los plásmidos BHR que necesitan sobrevivir en un amplio
abanico de huéspedes.

3. MEDIDA DE LA CONJUGACIÓN EN EL CITÓMETRO

Establecer la importancia de la transmisión en la persistencia de los plásmidos

conjugativos en las poblaciones es muy importante para entender y poder llegar a
controlar la dispersión de resistencias a antibióticos (Levin, et al., 1997). Esta tarea
conlleva determinar los factores que promueven o limitan esta transmisión, lo que hace
importante el desarrollo de protocolos experimentales que permitan medir
eficientemente la conjugación posibilitando la obtención de mayor cantidad de datos de
una forma relativamente sencilla.

La citometría de flujo es una herramienta potente que permite obtener mucha

información de una manera relativamente rápida y sencilla. Presenta múltiples
aplicaciones en microbiología (Alvarez-Barrientos, et al., 2000); (Davey & Kell, 1996);
(Porter, et al., 1997) y el desarrollo de citómetros más baratos y la mejora de resolución
hacen que sea una herramienta de trabajo cada vez más accesible en los laboratorios
de investigación.

En este trabajo se ha validado un método que permite el análisis de la conjugación

en el citómetro mediante el empleo de marcadores fluorescente que permiten

140
discriminar las distintas poblaciones presentes en la mezcla conjugativa. Gracias a la
capacidad de procesado de esta técnica (Shapiro, 2005), el protocolo permite la
obtención de manera rápida de gran cantidad de datos obteniéndose estimaciones de
las frecuencias de conjugación equivalentes a las obtenidas mediante los protocolos de
plaqueo tradicionales, pero menos ruidosas. La obtención de datos más robustos y el
aumento de la velocidad de procesado de las muestras hacen de esta técnica una
herramienta interesante para el estudio de la conjugación.

Utilizando el método citométrico puesto a punto se ha analizado la conjugación de

oriT de R388 demostrando experimentalmente que el cálculo de la tasa de conjugación
mediante el método “End point” (Simonsen, et al., 1990) (Zhong, et al., 2012) es
insensible al ratio D/R y hasta cierto punto del tiempo de conjugación, a diferencia de la
frecuencia de conjugación que resulta muy dependiente de las condiciones
experimentales lo que hace difícil la comparación de valores. Aunque la conjugación en
superficies solidas se desvía de las condiciones ideales para este método en las que las
células están continuamente mezclándose, los resultados obtenidos muestran que en
condiciones de alta concentración inicial de células y tiempos de conjugación cortos, el
método “End point” proporciona medidas robustas de la tasa de conjugación.

Las cinéticas realizadas con plásmidos conjugativos representativos de los

principales grupos de incompatibilidad en enterobacterias nos permitieron asignar de
manera semi-cuantitativa la transmisibillidad de estos plásmidos. Así, el plásmido RP4
demostró una mayor capacidad conjugativa, llegando a invadir completamente la
población experimental en pocas horas incluso cuando la prevalencia inicial del
plásmido fue tan solo de un 5%. Este resultado sugiere que la prevalencia de los
plásmidos IncP en muestras ambientales, donde constituyen el grupo dominante, está
asociada a una gran eficiencia conjugativa (Yano, et al., 2013) (Suzuki, et al., 2010).
Por otra parte, resultó llamativa la baja capacidad de propagación de los plásmidos R1
y ColIbp-9, en los que sólo se obtuvo evidencia de propagación conjugativa en el caso
de sus mutantes des-reprimidos. ColIb-p9 y R1 son los prototipos de los grupos de
incompatibilidad IncI e IncFI, grupos ampliamente diseminados en las enterobacterias
de origen clínico, y frecuentemente asociados a la propagación de resistencias a los
antibióticos (Lanza, et al., 2014). Esto plantea la cuestión de si la propagación natural
de estos plásmidos se debe a variantes des-reprimidas, o por el contrario la conjugación
tiene un papel secundario en las causas de la gran prevalencia epidemiológica de estos
grupos.

141
142
CONCLUSIONES
 CONCLUSIONES

A.- El plásmido R388 presenta una red global caracterizada por:

i) Promotores fuertes, pero silenciados por la acción de reguladores específicos

del plásmido.

ii) Una arquitectura basada exclusivamente en represores transcripcionales.

iii) Insensibilidad a las perturbaciones ambientales ensayadas.

B.- La red de regulación del plásmido R388 se basa en el motivo de autoregulación

negativa con altos índices de represión. Su arquitectura aparece formada principalmente
por motivos de tipo NAR, SIM y DOR. Específicamente:

i) Tres motivos de autorregulación negativa controlan la expresión de PresP,

PkfrA y PtrwA.

ii) Un DOR controlado por ArdK y StbA regula los operones de la zona de
establecimiento en el receptor mientras que un SIM controlado por KorA regula
los promotores del Mpf.

iii) StbA establece un FFL sobre los promotores regulados por KorA,
colocando a StbA como regulador central del plásmido.

C.- La eliminación de korB en el plásmido R388 tiene un efecto sobre los promotores
del Mpf. KorB no actúa directamente sobre los promotores por lo que debe estar
actuando a través de otro factor. Esto pone de manifiesto la existencia de otro nivel de
regulación aún por caracterizar.

D- Los experimentos con ResP indican que constituye una “moonlight protein” capaz
de ejecutar dos acciones diferentes: actúa como regulador transcripcional de los genes
implicados en la replicación del plásmido y mantiene su actividad resolvasa, siendo
capaz de resolver cointegrados.

145
E.- A pesar de que los plásmidos IncW están caracterizados por una alta identidad a
nivel de secuencia, los distintos plásmidos muestran efectos diferentes sobre la red de
regulación y presentan importantes diferencias fenotípicas. Esto indica que pequeñas
variaciones a nivel de secuencia pueden tener importantes consecuencias sobre la
fisiología y rango de hospedador del plásmido.

F.-Hemos logrado poner a punto un protocolo rápido y preciso para la medida de la

conjugación bacteriana utilizando citometría de flujo. Este método ha permitido
cuantificar la tasa de conjugación de distintos plásmidos, permitiendo una comparación
sistemática de su capacidad para propagarse horizontalmente.

146
BIBLIOGRAFÍA
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PUBLICACIONES
Problems and paradigms DOI 10.1002/bies.200900164

Numbers on the edges: A simplified and

scalable method for quantifying the
Gene Regulation Function
Raul Fernandez-Lopez,1,2 Irene del Campo,1 Raúl Ruiz,1 Val Lanza,1
Luis Vielva,3 and Fernando de la Cruz1*
1
Instituto de Biomedicina y Biotecnologı́a de Cantabria (IBBTEC), Universidad de Cantabria-CSIC-IDICAN,
Cardenal Herrera Oria s/n, 39011 Santander, Spain
2
Department of Systems Biology, Harvard Medical School, 200 Longwood Ave, Boston, MA, USA
3
Departamento de Ingenierı́a de Comunicaciones, Universidad de Cantabria, Avda. de Los Castros, 39005 Santander, Spain

The gene regulation function (GRF) provides an opera- encodes proteins involved in catalytic or scaffolding activities;
tional description of a promoter behavior as a function of these were called structural genes. Genes of the second kind
the concentration of one of its transcriptional regulators. are involved in controlling in what amounts and under what
Behind this apparently trivial definition lies a central
concept in biological control: the GRF provides the circumstances structural proteins are produced; they were
input/output relationship of each edge in a transcrip- therefore called regulatory genes. Transcriptional regulation
tional network, independently from the molecular inter- was recognized at that time as a core process of cell
actions involved. Here we discuss how existing methods physiology,(2) and has been a central topic of biological
allow direct measurement of the GRF, and how several research ever since. Our perspective on how transcriptional
trade-offs between scalability and accuracy have hin-
dered its application to relatively large networks. We activity is regulated has changed substantially over the past
discuss the theoretical and technical requirements for 60 years.(3) Today there are two, apparently paradoxical,
obtaining the GRF. Based on these requirements, we research trends on transcriptional control. On the one hand,
introduce a simplified and easily scalable method that analysis of transcriptional regulation has become ‘‘global’’.
is able to capture the significant parameters of the GRF. Originally, transcriptional regulators were thought to control
The GRF is able to predict the behavior of a simple
genetic circuit, illustrating how addressing the quantita- the production of a certain set of proteins in response to a
tive nature of gene regulation substantially increases our specific stimulus.(4) Now we know that regulators are
comprehension on the mechanisms of gene control. interconnected in intricate transcriptional networks,(5–9) and
that the outcomes of these networks to changes in the
Keywords: gene regulation function; network parameteri- environment are often complicated to assess. On the other
zation; plasmid regulatory network; transcriptional regulator hand, transcriptional control has become ‘‘individual.’’ The
original description of the lacþ/
phenotype consisted of a
Abbreviations: a, growth rate; b, production rate for graph showing how a bacterial population smoothly switched
repressor-free promoter; b0, production rate for repressor- its lac phenotype in response to a diauxic shift.(10) This
bound promoter; 3(-UTR, 3( untranslated region; AFU, behavior is still referred in textbooks as the canonical example
arbitrary fluorescent units; ara, arabinose; aTc, anhydrotetra- of deterministic control: a culture of E. coli grown with glucose
cycline; CFP, cyan fluorescent protein; GFP, green fluorescent and lactose as carbon sources will always exhibit diauxie.
protein; GRF, gene regulation function; K, dissociation However, at the single cell level, a culture of genetically
constant; OD, optical density; RBS, ribosome binding site; X, identical cells grown in the same culture medium often exhibits a
concentration of transcriptional repressor; Xss, concentration mixture of lacþ and lac
phenotypes, and the transition between
of transcriptional repressor at the steady state; Y, product of them is purely stochastic.(11) Transcriptional regulation is
the target promoter; YFP, yellow fluorescent protein. therefore a probabilistic process, and this fact has many
implications for cell adaptation and differentiation.(12–14)
Introduction Although this situation might seem contradictory, actually it
is not: regulatory networks are holistic, but cells within a
In their seminal work on adaptation, Jacob and Monod population show strong individualism, based on the probabil-
proposed that there are two kinds of genes.(1) The first kind istic nature of control processes. There is a common
dimension in both aspects of transcriptional regulation. The
*Correspondence to: Dr. F. de la Cruz, C. Herrera Oria s/n, Santander,
Cantabria, 39011 Spain final outcome of a regulatory network or stochastic switch
E-mail: [email protected] within the cell depends not only on which factors are produced

346 BioEssays 32:346–355, ß 2010 Wiley Periodicals, Inc.

R. Fernandez-Lopez et al. Problems and paradigms

but also on the amounts of that factor. To understand how cells large networks it is usually complicated to measure every
self-regulate, we need to describe quantitatively the nature of relevant biochemical parameter, like dissociation constants or
cell responses.(15) While it remains technically challenging to cooperativity indexes. Moreover, it is even more complicated
assess how many mRNAs and proteins a cell produces as a to establish how parameters measured in vitro reflect the
response to a certain input,(16,17) it is feasible to determine in vivo behavior.(20) A systematic method for measuring the
how much a promoter activity changes as a consequence of a GRF simplifies the task of assessing the relevant parameters
change in the concentration of its regulators. of a given network, and also provides an in vivo framework to
The gene regulation function (GRF) indicates the relation- interpret in vitro results. One of the ultimate goals of synthetic
ship between the intracellular concentration of a given biology is to generate a repertoire of standard biological parts
regulator and the transcriptional activity of its target that can be used in the design of higher order devices.(21) One
promoter.(18) Ideally, it is a continuous bijective function that important set of such parts should be a series of well-
renders a certain promoter activity for any given regulator characterized transcriptionally regulated promoters.(22) With-
concentration. This function is characteristic for a regulator/ out a precise description of the response dynamics of each
promoter pair and each promoter has as many GRFs as the component, the integration of complex devices becomes a
number of transcriptional regulators acting on it. The GRF is trial-and-error instead of a design-based process.
an input/output relationship that depends on a number of
intermediate biochemical events (regulator oligomerization,
binding site searching kinetics, DNA binding, interactions with Precise measurement of the GRF:
RNApol, etc. . .). Therefore, it can be considered a metafunc- The l-cascade method
tion: a mathematical abstraction that has no real process
counterpart, but represents the convolution of many. This is in The gold standard for measuring the GRF is the method
fact its main value, since it provides a complete description of developed by Rosenfeld et al.(18) In this work the authors
the regulator/promoter response space regardless of the measured the GRF for the PR promoter of bacteriophage
underlying mechanism. Disentangling how each intervening lambda in response to variations in the concentration of
molecular process contributes to the final observable GRF is protein cI, its transcriptional repressor. Regulator concentra-
a quintessential problem of transcriptional regulation,(19) and tion (input) was monitored by translational fusion of gene cI
has attracted extensive research efforts. A detailed analysis to the YFP (yellow fluorescent protein) gene. The transcriptional
of the molecular mechanisms of transcriptional regulation is activity of PR (output) was determined using a transcriptional
beyond the scope of the present work. We do not discuss how fusion with the CFP (cyan fluorescent protein) gene (Fig. 1).
to predict the GRF from our knowledge of each individual The regulator concentration was modulated by making its
molecular step, but instead on how to measure it experimen- expression dependent upon an upstream Tet promoter in a
tally. Specifically, we describe how existing methods for tetRþ background strain. Cells were grown in the presence of
accurate expression profiling and controlled protein expres- anhydrotetracycline to achieve full induction of repressor cI.
sion allow a direct inference of the GRF. Then the inducer was washed away, so that Tet promoter
The GRF is a powerful tool for systems and synthetic activity decreased over time to a final off state. Consequently,
biology. The behavior of a given network depends not only on the levels of cI-YFP were shown to decrease analogically due
its topology but also on its parameterization. For relatively to protein degradation and dilution in growing cells. The

Figure 1. The l-cascade method developed by Rosenfeld and Alon. A: Ideal representation of the GRF. Repressor concentration is decreased
analogically (x-axis), and the GFP production rate (y-axis) is measured as an indicator of target promoter transcriptional activity. B: Scheme of the
l-cascade regulatory circuit. The transcriptional repressor cI is tagged by translational fusion with YFP and expressed from the Ptet promoter.
TetR (constitutively produced) blocks Ptet expression. Repression can be lifted by the action of aTc. The target promoter (PR) transcriptional
activity is tracked by following the CFP fluorescence. C: Plot showing cI-YFP (red line, regulator) and CFP (green line, target promoter) dynamics
in a single cell. The inducer aTc is kept at high concentration for 2 h (gray area) and then washed away (white area). Concentration of cI starts to decrease
as judged by the decrease in YFP fluorescence. Simultaneously, CFP fluorescence increases. Figure modified from Rosenfeld et al. (18)

BioEssays 32:346–355, ß 2010 Wiley Periodicals, Inc. 347

Problems and paradigms R. Fernandez-Lopez et al.

decrease in cI-YFP levels and the subsequent variation of PR- precisely measure promoter activities over time and to control
driven CFP expression were tracked over time for each the induction levels of a given regulator. In this work we
individual cell by real-time fluorescence microscopy, thus illustrate how existing methods can lead to a simplified
obtaining the GRF for the PR/cI promoter/regulator pair. The procedure to measure the GRF. We will show that important
biological meaning of the GRF and its predictive power were trade-offs exist between the exactness of the measurement
demonstrated later,(23) when the behavior of a simple circuit and the scalability of the procedure. In this respect, the
was predicted upon the measurement of the component’s method that we propose here must be considered optimized
GRF. The main advantage of the l-cascade method was its for scalability, as the l-cascade is optimized for accuracy. In
ability to make single-cell measurements in real time. This terms of scalability, the l-cascade paradigm was complemen-
allowed an accurate evaluation of the contribution of ted by efforts to determine quantitative kinetic parameters using
stochasticity in the dynamics of the system and prevented bulk culture measurements in model regulatory networks.(24)
underestimation of the cooperativity index, a problem that We propose a variation of the Rosenfeld method, based on
bulk population measurements might cause.(18) As pointed a two-plasmid system (one for expressing the regulator and
out by the authors, the only caveat was that its applicability to one for measuring the target promoter response) (Fig. 2). The
other regulatory systems might be complicated by the system consists of an arabinose inducible expression vector
refinement of the required measurements.(23) Nevertheless, (the input plasmid) and a GFP reporter plasmid to precisely
it served as a powerful proof of concept that it is possible to obtain determine the response in the target promoter (the output plasmid).
quantitative models of biological systems with predictive power. This method presents two main differences with respect to the
original parameterization of the GRF in the l-cascade system:

A scalable method for obtaining the GRF: (i) Single-cell measurements are replaced by bulk population
The two-plasmid method averages: This allows the use of simple equipment such
as fluorescence plate readers and flow cytometers as
The main obstacle for the applicability of the l-cascade measuring instruments, instead of time-lapse microscopy
method is that it requires both extensive genetic manipulation facilities, which are of limited availability. On the other
and technically demanding measurements. Regulators need hand, it decreases the precision of the measurement,
to be translationally fused with fluorescent reporters, which since the population GRF might show differences to
often results in non functional proteins. Quantifying each single-cell GRF due to underestimation of cooperativity
interaction, even in small networks with a discrete number of indexes (see Trade-offs and limitations in experimental
arrows, would be challenging. Nevertheless, the l-cascade measurements of the GRF below).
method demonstrated that the fundamental bases for (ii) Regulator concentrations are estimated, not directly mea-
resolving the GRF are apparently simple, i.e., the ability to sured: the major handicap for extending the l-cascade

Figure 2. Scheme of the two-plasmid measuring system. The input plasmid consists of an expression vector (pBAD33) in which the desired
regulator is cloned under the control of ParaBAD promoter (and thus is arabinose inducible). The output plasmid is a pSC101 derivate (pUA66)
engineered for analyzing the activity of a given promoter. The target promoter is cloned so that it drives expression of the GFPmut2 gene.

348 BioEssays 32:346–355, ß 2010 Wiley Periodicals, Inc.

R. Fernandez-Lopez et al. Problems and paradigms

method to the analysis of other regulatory systems is the protocol described in Refs.(24–26) Promoters are cloned in the
need for a fluorescent protein/transcriptional regulator pUA66 reporter vector, which contains the GFP-mut2 gene
translational fusion. Translational fusions often result in downstream of a strong ribosomal binding site. Fluorescence
non-functional proteins. To overcome this limitation we production and cell growth (OD600) are simultaneously
avoided the direct measurement of the regulator concen- tracked so it is possible to determine the GFP/OD change
tration. For this purpose, the regulator gene was cloned rate. Since GFP-mut2 is a stable protein, the death rate can
under the inducible promoter of the arabinose operon be assumed to be caused exclusively by dilution in the
PARABAD. Expression from this promoter is inducible, growing cells. Under these conditions, promoter activity
so increasing concentrations of arabinose in the culture becomes equivalent to the maximum of the time derivative of
medium produce increasing levels of PARABAD expres- GFP levels per OD unit [(dGFP/dt)/OD].(24,25,27) To ensure
sion. Regulators were cloned so they always shared a that promoter activities were measured during steady-state
strong consensus ribosomal binding site and a common conditions, several modifications were applied to the original
30 -UTR. This was intended to minimize differential trans- procedure (Box 1). Cells were grown for longer times, starting
lational efficiencies when different regulators were cloned. from low OD levels (0.01). This ensures that the culture
Since it is still possible that post-translational modifica- undergoes a number of replication events that dilute the GFP
tions and protein degradation rates have an important levels originating from previous growth. Under our conditions,
effect on regulator concentrations, measurements were GFP/OD levels reach a plateau in which d(GFP/OD)/dt ¼ 0,
made during steady state. Under steady-state conditions indicative of the steady-state regime (Fig. 3A). GFP levels at
an invariant average concentration of regulator can be that point equal, by definition, the production rate divided by
assumed. Steady-state levels depend on production and
degradation rates. These rates are assumed to be inde-
pendent from each other, at least under a range of non-
extreme conditions (e.g., extremely high protein produc-
tion could saturate the protein degradation machinery).
Although degradation rates are unknown, they can be
considered constant for a given regulator on a given
genetic background. Variation in the steady-state concen-
tration for two different ara induction levels therefore
depend only on differences in production rates. Since it
is possible to measure the response of PARABAD to
increasing ara concentrations, changes in the regulator
concentration can be inferred. Thus, the two-plasmid
method measures relative changes: the regulator concen-
tration is changed in a known proportion and the relative
response of the target promoter is then measured.

Measuring the GRF I: Determining

promoter activities
The first technical requisite for determining the GRF is to
precisely measure promoter activities. An additional require-
ment for this simplified method is that these measurements
must be done during steady state. Fluorescent expression Figure 3. Expression profiling. A: Expression profiles of cultures
containing pBAD33::GFPmut2 exposed to different arabinose con-
profiling allows tracking promoter activity along time with error centrations. Fluorescence levels per OD unit (GFP/OD600) are plotted
levels below 20%, accuracy unmatched by any other trans- against cell growth (OD600). Each dot line represents one arabinose
cription estimation technique.(25–27) Moreover, it measures promoter concentration, indicated by the scale at the right of the figure. After several
activities, not RNA concentrations. This makes the technique rounds of replication, cells reach steady state (gray box). B: Comparison
insensitive to differences in mRNA processing or degradation between promoter activities (b) estimated by taking the time derivative of
the GFP signal per OD unit [y-axis, b ¼ Max (dGFP/dt/OD)] plotted
of the natural transcript, focusing on the rate that is effectively against the promoter activities calculated as the product of growth rate
modulated by repressors or activators. Fluorescent expres- by steady-state concentration (x-axis, b ¼ Xssa). Linear regression
sion profiling for bulk E. coli cultures follows the general yielded an r square value of 0.99 and a slope of 0.79.

BioEssays 32:346–355, ß 2010 Wiley Periodicals, Inc. 349

Problems and paradigms R. Fernandez-Lopez et al.

the degradation/dilution rate. Since the protein is stable and Measuring the GRF II: Inducing the
the dilution rate can be obtained from the OD600 growth regulator
curves, promoter activities can thus be directly estimated:

   The second technical challenge was to induce expression of
d GFP
OD GFP
¼b
a (1.1) the transcriptional regulator in a controlled and measurable
dt OD
way. This was achieved by cloning the regulator under the

GFP   control of an inducible promoter. However, not every inducible
d OD GFP
¼b
a ¼0 (1.2) promoter is suitable for this purpose. Population measure-
dt SS OD SS
  ments of dose/response curves for inducible promoters yield
GFP
b¼a an apparently continuous curve, indicative of an analogical
OD SS
increase in the output as the inducer concentration increases.
where GFP are the fluorescence levels, b the production rate However, in many cases these curves do not reflect the single-
per OD unit, and a the growth rate. This method yields promoter cell dynamics, and the apparent analogical behavior is the
activities equivalent to those described in Refs.(24,25,27)(Fig. 3B). product of the averaging of different proportions of cells being
The advantage is that, since the steady-state phase can be moni- either in on or in off state.(28) This is a relevant issue for
tored precisely, many data points can be averaged to estimate promoters that respond to a certain chemical modulator (an
steady-state levels more precisely. The reproducibility of these inducer or a corepressor). On many occasions the intracel-
measurements in different experiments was better than SD < 15%. lular concentration of the modulator is dependent on active
transport and the transporter is often activated by the
transported metabolite. Transporter activation creates a
Box 1:
positive feedback loop that drives system bi-stability.(29) To
Experimental protocol for expression profiling
overcome this issue, we took advantage of the engineered
Step 1: Cell growth PARABAD system developed by Keasling and coworkers,
Reporter strains were inoculated in M9 Medium plus which uses an E. coli strain (BW27783) that constitutively
kanamycin (25 mg/mL), casaminoacids (0.2%) and gly- expresses araE, the arabinose transporter.(30) The PARABAD
cerol (0.5%). Cells were grown for 16 h, at 37 8C with promoter can be induced by adding different concentrations of
vigorous aeration. arabinose to the growing medium. Since the transporter is no
longer under the control of the transported metabolite, the
Step 2: Measurement positive feedback is broken. The quasi-analogical dynamics of
Cultures were diluted 1:10 000 in the same medium in this system was confirmed by measuring the expression
96-well plates and incubated in a Victor3 fluorimeter at levels of E. coli BW27783 bearing a PARABAD::GFP
37 8C with orbital shaking for about 6 h. Fluorescence and transcriptional fusion by flow cytometry (Fig. 4A). As shown
absorbance were determined for each well every 5 min. To in Fig. 4, the whole population displaces along the X-axis as
counterbalance evaporation, water was injected after each the ara concentration is increased. The population response
three steps of fluorescence and absorbance measure- to increasing ara concentrations was measured by expression
ment. Water evaporated in the Victor3 multiplate reader at profiling as indicated in the previous section. Results are
37 8C was 0.28 mL/min/well. shown in Fig. 3B. PARABAD::GFP fluorescence values were
plotted against the corresponding ara concentrations (Fig.
Step 3: Data processing 4B). Data were fitted to a Michaelis–Menten function
Absorbance data points had background (data obtained (R2 ¼ 0.99), thus obtaining an expression that infers the
from culture medium with no cells) subtracted. Absor- PARABAD expression level as a function of the arabinose
bance values were transformed into OD600 equivalents concentration. When a transcriptional regulator is cloned in
using a calibrated curve between Victor 3 readouts and a the pBAD33 vector under expression of PARABAD, relative
regular spectrophotometer (width 1 cm). Fluorescence changes in steady-state concentrations can be inferred
background was obtained from cells containing the according to the standard curve obtained for the GFP.
promoter-less plasmid pUA66. Fluorescence background
was subtracted from the values obtained for the reporter
strains at the same OD600 (not necessarily at the same
time points). Growth rate (a) was calculated from Mathematical framework for determining
the OD600 data. Fluorescence/OD600 was plotted the GRF
against OD600 and the steady-state level was obtained
by averaging values during the steady-state. Since the GRF is a metafunction that does not represent a
single process, different levels of abstraction can be applied to

350 BioEssays 32:346–355, ß 2010 Wiley Periodicals, Inc.

R. Fernandez-Lopez et al. Problems and paradigms

Figure 5. Model for repressor-promoter binding. Reporter gene Y

production is assumed to be a one-step process with birth rate b or b0
depending on the occupancy of the promoter. Binding of repressor X
to its target promoter is considered to be in equilibrium, with dissocia-
tion constant K.

transcriptional repressor (X ) follows:

dY K X
¼b þ b0
aY (2.1)
dt K þX
|fflfflffl{zfflffl
ffl} K þX
|fflfflffl{zfflffl
ffl}
X free X bound
promoter promoter
fraction fraction

Figure 4. Response of the input plasmid to arabinose induction. where b and b0 correspond respectively to the activity rates for
A: Fluorescence distributions (x-axis indicates fluorescence, y-axis
repressor-free and repressor-bound promoters, K stands for
indicates cell number) obtained by flow cytometry analysis of a culture
of E. coli BW27783 containing pBAD33::GFPmut2. Each color indi- the dissociation constant and a indicates the growth rate of
cates a different arabinose concentration. B: Median fluorescence the culture. In steady state (dY/dt ¼ 0):
values obtained from the distributions shown above plotted against
the Ara concentration used (in % w/v). Inner chart: arabinose con-
centrations indicated in log scale (% w/v). bK þ b0 XSS
YSS ¼ (2.2)
aðK þ XSS Þ

If the concentration goes to zero, Y reaches a maximum

obtain the significant parameters that conform it. The
simplest model that, in our hands, successfully captured
bK b
the GRF dynamics is illustrated in Fig. 5. Three Ymax ðx Þ ¼ Yðx !0Þ ¼ ¼ (2.3)
aK a
assumptions were made to implement the model: constant
growth rate (cells are in steady-state exponential growth),
If the concentration of repressor is sufficiently high, Y
separation of timescales (protein binding to operators
reaches a minimum
and promoters is much faster than transcription), and an
invariant relationship between mRNA and protein production
(since proteins are translated from the same RBS and b XSS b0
Y min ðx Þ ¼ Yðx !1Þ ¼ 0 ¼
30 -UTR). aXSS a
 (2.4)
Under these assumptions, the dynamics of the product of bK þ b0 XSS  b0 XSS ; b0 XSS  bK
the target promoter (Y ) response to the concentration of aðK þ XSS Þ  aXSS ; XSS  K

BioEssays 32:346–355, ß 2010 Wiley Periodicals, Inc. 351

Problems and paradigms R. Fernandez-Lopez et al.

We define R as the regulatory rank of a given promoter Y general constant K to the power of n (Kn). Therefore, the
for a given repressor X: generalized expression follows:

Ymax ðx Þ Ymax K n þ XSSn

RYX ¼ (2.5) ¼ n  (2.9)

Ymin ðx Þ YSS K n þ XSS R X
Y

This parameter is promoter/repressor dependent, and It should be noticed that a value of n > 1 in the GRF does
indicates the expression space that a certain repressor can not imply that the number of binding events is precisely n. It
produce when acting upon a target promoter. Therefore, a only indicates, as in the Hill function, the apparent
given promoter with two repressors will show different R cooperativity grade in the final observable dynamics.
values depending on the ability of each repressor to interfere
with transcription initiation.
Introducing Ymax ¼ b/a and Ymin ¼ b0/a into Eq. (2.2) we
obtain
A case study: Determining the GRF for
the transcriptional repressor KorA
Ymax K þ Ymin XSS
YSS ¼ (2.6) To demonstrate the validity of the two-plasmid method, we
K þ XSS
obtained the GRF for KorA, a transcriptional repressor from
the broad host range plasmid R388.(31) KorA is the major
This expression indicates how the target promoter Y
transcriptional modulator for the conjugative mating system, a
responds to changes in the repressor X, and therefore can be
multiprotein secretion system that mediates DNA transfer
considered directly proportional to the GRF. However, it is
during plasmid conjugation.(32) KorA represses four promo-
probably easier to interpret the relative change of Y from its
ters in the plasmid, binding to a conserved sequence called
Ymax levels for each X concentration; this expression also
the KorA box. KorA controls its own expression, therefore
renders a dimensionless value. The transformation follows:
establishing a negative feedback loop.(32) We analyzed the
GRF of KorA on its own promoter (PkorA) using the procedures
YSS K þ Ymin=Ymax XSS
¼ (2.7) described above. Briefly, korA gene was PCR-amplified and
Ymax K þ XSS
cloned in expression vector pBAD33, under the control of
PARABAD promoter. To monitor PkorA expression levels, the
Ymax K þ XSS
¼  (2.8) promoter was PCR-amplified and cloned in the reporter
YSS K þ XSS R X vector pUA66. Maximal PkorA promoter activity (Ymax) was
Y
measured by expression profiling of E. coli BW27783
containing pUA66::PkorA, thus measuring the promoter
This expression is fairly intuitive: given an X concentration
activity in absence of its cognate regulator. Minimal PkorA
of repressor, the target promoter is Ymax/Y times repressed.
promoter activity (Ymin) was measured by introducing
Parameters Ymax and Ymin (and therefore R) can be
pBAD33::KorA and inducing KorA expression at saturating
experimentally measured. For measuring Ymax the promoter
concentrations of arabinose. Saturating concentrations were
activity is determined in a regulator-defective genetic back-
attained at 3.5E-5% w/v. Higher ara concentrations impaired
ground. Ymin can in turn be measured by inducing the
cell growth (data not shown). PkorA expression levels (Y) were
regulator expression to maximal levels [so X/(X þ K) ! 1]. For
measured as indicated in Box 1 under different concentrations
this model to work, Ymin must be attained within the
of arabinose. KorA levels were estimated by running in parallel
experimental rank of concentrations of X. Although the former
a set of E. coli BW27783 cultures containing pBAD33::GFP-
expression was derived for the case of a transcriptional
mut2 subjected to the same ara concentrations. Ymax/Y levels
repressor, the derivation for a transcriptional activator is trivial
were plotted against estimated concentrations of KorA (X)
taking into consideration that:
expressed in GFP fluorescence equivalents (Fig. 6A), and
bK
Ymin ðx Þ ¼ Yðx¼0Þ ¼ aK ¼ b=a data were adjusted to Eq. (2.9) using the Levenberg–
b
Ymax ðx Þ ¼ Yðx¼1Þ ¼ 0=a Marquardt algorithm for non-linear regression. Regression
yielded K ¼ 22  10 arbitrary fluorescent units (AFU). The
The former expressions assume a unique binding event of regulatory rank was R ¼ 33, indicating that KorA was able to
the regulator to the promoter. For the more general case in repress PkorA 33-fold from its native promoter activity. This
which n regulator molecules bind the promoter, we can use value was in accordance to the experimental determination of
the Hill approximation to say that the product of n different R (Ymax/Ymin). The cooperativity index was n ¼ 1.3  0.4,
dissociation constants (K1K2K3. . .Kn) can be made equal to a indicating a slight cooperative effect of KorA in PkorA

352 BioEssays 32:346–355, ß 2010 Wiley Periodicals, Inc.

R. Fernandez-Lopez et al. Problems and paradigms

Figure 6. Measurement and performance of the GRF for KorA regulator acting on PkorA promoter. A: Repression ratio (Ymax/Y) of PkorA
promoter (y-axis) as a function of apparent KorA repressor concentration (x-axis). KorA concentrations is modified by inducing pBAD33::korA
with different levels of arabinose, and apparent KorA concentrations are calculated from calibrating curves (pBAD33::GFP) obtained in parallel.
Maximal steady-state fluorescence level achieved by PkorA promoter (Ymax, [KorA] ¼ 0) is divided by steady-state fluorescence levels achieved by
PkorA (Y ), and plotted in ordinates. Error bars indicate the standard deviation of eight independent experiments. Data were fitted to Eq. (2.9) with
R2 ¼ 0.98. B: A comparison between the predicted behavior of PkorA-KorA feedback loop (black crosses) with an experimental measurement of
PkorA-KorA dynamics (red dots). Experimental measurements were done in E. coli BW27783 cultures containing plasmid R388 (that contributes
the PkorA-KorA feedback loop) and pUA66: PkorA-GFP (reporter plasmid that infers PkorA expression levels). Predicted dynamics were obtained
from Eq. (2.1) using GFP/OD measured at OD600 ¼ 0.2 as initial X value. All parameters in the simulation were determined experimentally [K and
n obtained from data from (A), growth rate (a) obtained from growth curve and production rates b and b0 obtained from expression profiles without
KorA and at maximal KorA concentration, respectively].

transcriptional activity. The R2 value of the adjusted curve was Trade-offs and limitations in experimental
R2 ¼ 0.980. measurements of the GRF
To check the predictive power of the KorA/PkorA GRF
we simulated the time behavior of the negative feedback As we have shown, the two-plasmid method is able to extract
loop. We measured the behavior of this feedback loop sufficient information to determine the GRF using simple
experimentally by introducing plasmid R388 (that carries KorA measurement techniques and a basic mathematical treat-
under PkorA expression) into an E. coli BW27783 strain ment. It is based on two previously reported experimental
containing also pUA66::PkorA and profiling the expression procedures(25,30) and might be useful for systematic para-
levels along time. We fed the computational simulation with meterization of relatively large networks. However, as stated
the initial fluorescence value experimentally obtained above, several caveats should be taken into consideration
at OD600 ¼ 0.2. We then compared how the theoretical when applying this method. The fundamental one refers to
prediction and the experimental measurement behave as the bulk averaging in contrast with single-cell measurements. Cell
culture grew (Fig. 6B). The OD600 start point was chosen heterogeneity is a possible source of conflict: population
because fluorescence values for OD600 < 0.2 were found to measurements tend to underestimate cooperativity indexes
be extremely noisy. As shown in the figure, the computational due to convolution of the regulator concentration distribution
prediction based on the measured GRF follows the dynamics and the promoter response.(33) The two-plasmid method
of the experimental data until the cell culture enters stationary alleviates this problem using an induction system that exhibits
phase (OD600 ¼ 1). At this point both curves separate sharply, a unimodal distribution (Fig. 4A). However, since both
indicating that the GRF performs well as a dynamical regulator concentration and promoter activity distributions
predictor for cells in constant growth but not in stationary are averaged, the method will still underestimate the
cultures. This was to be expected since one of the steepness of the curve. To overcome this problem, a
assumptions of our model was that cells were in exponential simultaneous measurement at the single-cell level of both
growth. regulator concentration and promoter activity must be carried

BioEssays 32:346–355, ß 2010 Wiley Periodicals, Inc. 353

Problems and paradigms R. Fernandez-Lopez et al.

out. Flow cytometry can determine both distributions if the display mutual interactions, so the function of regulators A and
transcriptional regulator and target promoter are tagged with B is not equal to the sum of their independent GRFs. Since the
fluorescent proteins with enough spectral separation and GRF is a function, and function orthogonality is strictly
similar maturation timescales. However, due to the small size defined, it can be used to test for this principle. It has been
and bacillary shape of E. coli, this technique is unsuitable for demonstrated that the multiple input functions for sugar
assessing bacterial size. As a consequence flow cytometry metabolism in E. coli can sometimes be separated,(36) so it
retrieves a convoluted distribution of ill-defined cell sizes and seems that, at least in some cases, biological control systems
fluorescence values. If a higher level of accuracy is desired, are orthogonal. The circumstances and the kinds of promoter
measurements can be made by fluorescence microscopy, architectures with which orthogonality in the GRF is allowed
which would render an equivalent procedure to the l-cascade still need to be elucidated.
method. Scalability and precision in the measurement are Parameterizing global regulatory networks is a formidable
therefore inversely related. According to the size of the task, and massive parallel efforts are needed. In that sense,
network and the level of refinement needed, the researcher the development of a standard unit system for promoter
will have to decide which method to use. In that respect, activities is urgently needed so that results obtained by
further research is needed to assess the comparative different methods and in different laboratories can be
performances of both methods. compared. Efforts are being made to obtain absolute scales
Common to any GRF determination method is the need for based on the effective counting of mRNAs and proteins,(17)
a regulator-defective genetic background. In the l-cascade, and to establish a set of reference promoters.(37) Developing
the authors used a phage protein so the host bacteria were standard scales would be useful for Systems Biology and is
naturally cI
.(18) Similarly, we have used a plasmid- probably essential for the development of standardized parts
borne regulator, so the host strain is naturally KorA defective. in synthetic biology. It is difficult to envisage how a new
If one wants to determine the GRF for a chromosomally engineering discipline can be founded without an operational
encoded regulator, a knockout background is always needed, metric system.
since the full possible range of regulator concentrations Another crucial question is to determine what forces shape
must be sampled. If the two-plasmid method described the GRF. Cost-benefit theory for the GRF identifies three
here were to be used, this mutation must be introduced distinguishable levels of selection: efficiency, economy, and
into the E. coli BW27783 strain, since this genetic noise adaptation.(38) Efficiency indicates the ability of the GRF
background is needed for appropriate induction of to sense and respond in an appropriate timescale to changes
the ParaBAD promoter.(30) For that purpose, extensive in the input. Economy refers to the ability to produce
knockout libraries that allow P1 transduction, like the Keio responses only when the benefits for the bacterial fitness
collection,(34) can be used. exceed the cost of producing the response. Noise adaptation
indicates the capacity of the GRF to suppress or enhance cell-
to-cell variation to achieve efficient and economic responses.
Conclusions and prospects Interestingly, there are severe trade-offs between these three
levels.(38) As an example, a strict GRF with a high
Despite its abstract nature, the GRF has proven predictive cooperativity index would be efficient (the cell would respond
power.(23) Although we have focused on methods used according to a certain threshold) and economic (no
for estimating the GRF in prokaryotes, similar approaches suboptimal responses under the threshold), but it would be
have been successfully employed in eukaryotes, where extremely vulnerable to input noise, since noise transmission
chromatin remodeling was found to be an essential increases linearly with cooperativity indexes.(38) Network
player determining the GRF.(35) These results illustrate the topology comes to play at this point, since network motifs such
possibility of calculating the output of a certain regulatory as negative feedback and feed-forward loops can decrease
network if we know the transfer functions of its individual noise.(38–40) In other cases, in which input fluctuations are fast
components. or undetectable (so the cell has to rely on ‘‘blind’’ decisions),
Besides being a powerful tool for network analysis, the noise in gene expression can not be deleterious but
GRF opens the possibility to analyze a burning question in beneficial.(41) Selective landscapes will be the ultimate force
synthetic biology: How do promoters integrate the action of shaping the GRF,(38) a function in which topological proper-
two or more regulators? It might happen that the signals ties, noise in gene expression, and response time require-
deployed from two different transcription factors to the same ments concur. Therefore, the GRF exceeds any utilitarian view
target promoter act independently from each other, so the final for design purposes: it is the keystone of gene regulation. It
function can be calculated as the sum of the individual establishes how inputs and outputs are computed by the cell,
contributions. This is usually referred to as orthogonality and how these responses are modified and evolve by
between two inputs. It is also possible that both regulators environmental constraints.

354 BioEssays 32:346–355, ß 2010 Wiley Periodicals, Inc.

R. Fernandez-Lopez et al. Problems and paradigms

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 Plasmid 67 (2012) 174–182

Contents lists available at SciVerse ScienceDirect

Plasmid
journal homepage: www.elsevier.com/locate/yplas

Determination of conjugation rates on solid surfaces

Irene del Campo a, Raúl Ruiz a, Ana Cuevas a, Carlos Revilla a, Luis Vielva b, Fernando de la Cruz a,⇑
a
Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria (IBBTEC), Universidad de Cantabria-CSIC-IDICAN, Cardenal Herrera Oria s/n, 39011 Santander, Spain
b
Departamento de Ingeniería de Comunicaciones, Universidad de Cantabria, Avda. de Los Castros, 39005 Santander, Spain

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: A cytometric method for the estimation of end-point conjugation rates is developed and
Received 19 December 2011 adapted to surface conjugation. This method improves the through-put of conjugation
Accepted 5 January 2012 assays based on replica-plating and results in less noisy experimental data. Although con-
Available online 24 January 2012
jugation on solid surfaces deviates from ideal conditions in which cells are continuously
Communicated by Dr. Dhruba K. Chattoraj
mixed, results show that, within the limits of high initial population densities and short
mating times, end-point estimates of the conjugation rates are robust measurements. They
Keywords:
are independent of the donor/recipient ratios and, to some extent, of the sampling time.
Bacterial conjugation
Surface mating
Remixing the mating population in the course of a conjugation experiment results in a
Flow-cytometer boost in the frequency of transconjugants.
GFP Ó 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.
Conjugation rate

1. Introduction Different approaches have been used to determine the

efficiency of plasmid transfer. The most widely used indi-
Conjugation is a mechanism of DNA transfer among cator is the transfer frequency, that is, the ratio of the num-
bacteria (de la Cruz et al., 2010; Smillie et al., 2010). It is ber of transconjugants (T) to either the number of donors
one of the main forces contributing to shape bacterial gen- (D) or of recipients (R). In an aim to establish a universal
omes (de la Cruz and Davies, 2000). Perhaps more impor- parameter of transfer rate, independent of the experimen-
tantly, it is responsible for the rapid spread of antibiotic tal procedure involved, Levin et al. (1979) described a
resistance (AbR) among human bacterial pathogens. In method to estimate the rate constant of conjugative trans-
fact, the mortality rate of patients afflicted with infectious fer. That work demonstrated that, in an ideal setting, con-
diseases has shown a steady increase during the last years jugation dynamics fits a simple mass action model. In its
(Boucher et al., 2009). Analyses of the mobile platforms simplest realization, a bacterial chemostat, a conjugation
(plasmids, bacteriophages, transposons, etc.) that operate rate (c) could be defined, if some assumptions were made:
in bacterial populations, and the fluxes of AbR genes within matings are random events between cells in suspension;
them, requires precise quantitative determination of con- there is no loss of plasmids by segregation; newly formed
jugation rates (Levin et al., 1997). These quantitative data transconjugants act like donors immediately; and every
will provide essential parameters for the development of cell has the same growth rate. Simonsen et al. (1990)
mathematical models to explain AbR dissemination among adapted this model to describe plasmid transfer in batch
bacterial populations and the effect of conjugation on the culture. Importantly, the end-point method for estimating
spread of AbR (Garcillan-Barcia et al., 2011). This knowl- transfer rates is ideal because it is insensitive to initial cell
edge, in turn, could suggest strategies to control the spread density, initial D/R ratio and mating time (see Simonsen,
of AbR to human pathogens by using specifically designed 1990 for a more detailed analysis). The end-point estimate
drugs (Baquero et al., 2011). of the conjugation rate is given by the equation:
 
T N
⇑ Corresponding author. Fax: +34 942 201945. cep ¼ wmax ðN  N0 Þ1 ln 1 þ ð1Þ
DR
E-mail address: [email protected] (F. de la Cruz).

0147-619X/$ - see front matter Ó 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.plasmid.2012.01.008
 I. del Campo et al. / Plasmid 67 (2012) 174–182 175

Table 1
Plasmids.

Plasmid Replicon Marker Description Reference

pAP711DoriT::tet R388 Gm, Tc Non-mobilizable R388 derivative in which oriT was deleted and substituted by tetA Demarre et al.
(coding for TcR) (2005)
a
pGP12 pSC101 Km Derivative of plasmid pUA66 that contains R388_oriT with its promoter PstbA This work
controlling gfp-mut2 expression
pROD17 ColE1 Ap Km Plasmid containing mCherry gene (Shaner et al., 2004) under Plac control Gift of D.
Sherratt
b
pAC1 ColE1 Ap Km-sensitive pROD17 derivative. Contains mCherry gene under Plac control This work
b
pAC2 ColE1 Ap Km-sensitive pROD17 derivative. Contains DsRed2 gene under Plac control This work
b
pAC4 ColE1 Ap Km-sensitive pROD17 derivative. Contains mKate2 gene under Plac control This work
a
Plasmid pGP12 was constructed as follows: plasmid pUA66 (Zaslaver et al., 2006) DNA was digested with endonucleases XhoI and BamHI. This fragment
was ligated to a PCR amplicon of R388_oriT (Llosa et al., 1991) obtained using oligonucleotides stbAdir (50 -GTCGTCCTCGAGTACTTGGATGGGGTCGCCTA) and
stbArev (50 -GTCGTCGGATCCCGTCCGTTTCATTCACTTGT).
b
Plasmids containing the different RFP genes were constructed as pROD17 derivatives. pROD17 KmR gene was eliminated by digestion with endonu-
cleases BglII and BamHI to obtain a ApR Km-sensitive derivative (called pAC1). pAC2 and pAC4 were obtained by EcoRI + SalI endonuclease digestion of
pROD17 and ligation of a PCR amplicon of genes dsred2 (Bevis and Glick, 2002) or mkate2 (Shcherbo et al., 2009), respectively. Amplicons were obtained by
PCR amplification using the same oligonucleotide primers rfp_EcoRI (50 -GCTATGAATTCAAAAGTGCCACCTGACGTCTGAAGG) and rfp_SalI
(50 -GCTATGTCGACTTCATATGGACCATGGCTAATTCCC).

where cep is the transfer rate (mL cell1 h1), wmax is the bac- hsdR514 DE(araBAD)567 DE(rhaBAD)568 DE(araFGH)
terial growth rate (h1), and D, R, T and N are the densities u(DaraEp PCP8-araE) (Khlebnikov et al., 2001). Two
(cells mL1) of donors, recipients, transconjugants and total BW27783 spontaneous mutants, one resistant to nalidixic
culture cells, respectively, at any given time. Although the acid (BW-NxR) and another one resistant to rifampicin
end point estimate was originally developed for liquid cul- (BW-RfR) were obtained for this work by plating out
tures, due to its independence from changes in some exper- BW27783 in LB-agar containing the relevant antibiotic.
imental conditions and to its simple implementation, the Spontaneous mutants arose at a frequency of roughly
method has been used to measure transfer rates even in 108. The mutants were not further characterized. Bacteria
experimental set-ups involving surface-associated conjuga- were grown in Luria–Bertani broth (LB) or LB-agar at 37 °C
tion (Licht et al., 1999; Lilley and Bailey, 2002; Normander supplemented with the appropriate antibiotics. Plac
et al., 1998). More recently, Zhong et al. (2011) analyzed expression was induced by adding 0.5 mM IPTG to culture
the theoretical feasibility of application of the method to media. Antibiotics were used at the following concentra-
surface conjugation, using simulated data from an interac- tions: tetracycline (Tc) = 10 mg/L; ampicillin
tive particle system model. They concluded that transfer (Ap) = 100 mg/L; kanamycin (Km) = 25 mg/L; nalidixic acid
rates (c) were more robust measurements than transfer fre- (Nx) = 20 mg/L and rifampicin (Rf) = 50 mg/L.
quencies (T/D or T/(R + T)) both in liquid conjugation and in
surface-associated conjugation but only if the donor and re- 2.2. Plasmid construction
cipient populations are forming a well-mixed confluent
layer. It was shown that, unlike the T/D, T/R or T/N ratios, Plasmids used and details of their construction are
the end-point estimate of c is insensitive to the D/R ratio shown in Table 1. They were constructed by using standard
and, to some extent, to the sampling time. recombinant DNA technology (Sambrook and Russell,
In this work we develop a simplified method of measur- 2001). DNA inserts were obtained by endonuclease diges-
ing conjugation rates under laboratory conditions (on the tion or PCR amplification with specific oligonucleotides
surface of agar plates) by analyzing conjugation of simple and subsequent ligation to the appropriate plasmid vector.
oriTs. In this way, transconjugants are not converted to The integrity of all constructions was confirmed by DNA
new donors and we measure the transfer rates of the donor sequencing.
population sensu stricto. By using a cytometric analysis of
the mating populations, we can estimate c directly from 2.3. Conjugation assays
the cytometer readings. We provide experimental evidence
that supports the statement of Zhong et al. (2011) that c is Plate-mating experiments were carried out in 24-well
a robust parameter, resistant to changes in the initial plates containing 1.0 mL LB-agar per well. Donor and reci-
experimental conditions. We further demonstrate that pient strains were grown o/n from single colonies in LB
conjugation frequencies can be boosted by remixing the medium at 37 °C with the appropriate antibiotics. After
mating populations. washing, fresh suspensions from stationary phase cultures
of donor and recipient strains were mixed in appropriate
volumes according to their OD600 to get the desired pro-
2. Materials and methods portion of donor and recipient. The mixture was centri-
fuged for 5 min at 4000g and resuspended in 1/10
2.1. Bacterial strains and culture conditions volume of LB medium. Fifteeen microliters of this cell mix-
ture (corresponding to a total OD600 of 0.6 units (roughly
All experiments were carried out using the Escherichia 6  108 cells)) were placed directly onto an agar surface
coli K12 derivative BW27783 (lacIq rrnB3 DlacZ4787 within a 24 well plate (previously filled with 1.0 mL
176 I. del Campo et al. / Plasmid 67 (2012) 174–182

LB-agar) and incubated at 37 °C. At appropriate time R_ ¼ wðCÞ  R  cðCÞ  R  D

points, the mating mixture of a well was resuspended in
D_ ¼ wðCÞ  D
1.0 mL of fresh LB medium. Serial dilutions were plated
on selective media for counting cell concentrations of do- T_ ¼ wðCÞ  T þ cðCÞ  R  D
nor (Rf + Tc + Km), recipient (Nx + Ap) and transconjugant C ¼ wðCÞ  ðR þ D þ TÞ  e
bacteria (Km + Ap + Nx). Alternatively, for cytometric as-
where (x)_ denotes differentiation with respect to time and
says, samples of the mating mixtures were fixed using 4%
paraformaldehyde in 1% phosphate buffered saline for e (lg) is the amount of resource required to produce a new
15 min and stored at 4 °C until needed. Conjugation fre- cell.
quencies were expressed as the number of transconjugants As established by Simonsen et al. (1990) growth and
per recipient cell (T/(R + T)), transconjugants per donor cell plasmid transfer rates are Monod functions (Monod,
(T/D), or by calculating the transfer rate (c), following 1949) of nutrient concentration:

Eq. (3). wðCÞ ¼ wmax C=ðC þ KÞ
cðCÞ ¼ cmax C=ðC þ KÞ
2.4. Flow cytometric analysis
where cmax is the value estimated by the end-point method
Flow cytometry measures were carried out using a (from now cep) and K is the half saturation constant
FACScanto II flow cytometer (Becton Dickinson) equipped (lg mL1).
with a 488 nm solid state laser for excitation. Fluorescence From the assumptions about nutrient dependence of
was detected using a FL1 filter (530/30 nm band pass) for growth and conjugation constant it can be inferred that
green fluorescence and either FL2 (585/42 nm band pass) c(C)/w(C) = cep/wmax is a constant. This appreciation is cru-
or FL3 (670 nm long pass) filters for red fluorescence. In or- cial in the derivation of the equations to calculate c, as pre-
der to establish fluorescence compensations, negative, viously explained by Levin et al. (1979) and Simonsen et al.
(GFP+ RFP) and (GFP RFP+) controls were used (Maksi- (1990). Further developing the equations, it can be de-
mow et al., 2002). All data were collected using logarithmic duced that the end-point estimate of conjugation rate
plots. A FSC and SSC plot was used to gate the bacterial when transconjugants do not further transfer the plasmid
population (gate P1). Twenty-thousand P1 events were is given by:
 
collected and additional regions were defined in a FL1 vs. T
FL2 (or FL3) plot in order to quantify recipient and trans- cep ¼ wmax ðD  D0 Þ1 ln þ1 ð2Þ
R
conjugant populations. Bacteria collected inside region
Q1 correspond to RFP+ cells and were defined as recipients where D is the end-point density (cells mL1) of donors
(R), region Q2 contains RFP+ GFP+ events, defined as trans- and D0 is the density at time zero.
conjugants (T) and donor cells were included in Q3 region, Let the frequency of conjugation be Y = T/(R + T). Hence,
which correspond to non-fluorescent events. Conjugation Eq. (2) converts to:
frequency was obtained as the number of Q2 (GFP+RFP+)
 
1
events per total red events (Q1 + Q2). c was calculated di- cep ¼ wmax ðD  D0 Þ1 ln ð3Þ
1Y
rectly from the cytometer readings following Eq. (2).
Eq. (2) uses the parameters T and R that result from the
3. Theory: end-point estimate of conjugation rate cytometric analysis, while Eq. (3) uses the frequencies of
conjugation that are obtained in the replica-plating
In order to obtain a robust indicator of plasmid transfer, method.
we followed the model of (Levin et al., 1979) as adapted by
Simonsen et al. (1990) and Zhong et al. (2011) to estimate 4. Results
the conjugation rate. Because of our specific experimental
procedure, which used the oriT instead of the whole 4.1. A cytometer-based conjugation assay
Tra + plasmid and flow-cytometer counts to obtain data,
we adapted the equation as explained below. We main- An assay was designed to calculate conjugation rates (c)
tained the assumptions of the cited references, namely on solid surfaces. Classically, conjugation rates are esti-
we assume that (1) mating occurs randomly, (2) plasmid mated by plating on filters placed on the surface of agar
loss by segregation is negligible and (3) all bacterial cells plates. Cells are allowed to develop colonies by o/n incuba-
have the same growth rate (The growth rates of D, R and tion and the proportion of transconjugants calculated by
T were verified by growing the strains in LB at 37 °C in replica-plating of those colonies. This is a cumbersome pro-
96-well microtiter plates. Their exponential phase genera- tocol. In our updated plate-mating experiments, conjuga-
tion times (wmax) were found to be 51.4 min for D and R tion assays were carried out directly on the agar surface
and 52.9 for T, indicating that, within experimental error, of 24 well plates. After the appropriate conjugation periods,
the three strains grow at similar rates). In contrast to the the dynamics of the mating populations were calculated
original model, (4) transconjugants are not able to transfer either by replica-plating (for comparative purposes), or di-
the plasmid to new recipient cells. Following these rectly by flow cytometry, as shown in Figs. 1 and 2.
assumptions, the differential equations for the time- In order to measure plasmid conjugation using flow
dependent densities of the three types of cells and the cytometry, a dual fluorescent marker assay was set up.
nutrient concentration (C) would be given by: As previously described, GFP and RFP expression can be
 I. del Campo et al. / Plasmid 67 (2012) 174–182 177

detected simultaneously in individual bacterial cells by (Demarre et al., 2005)) and the oriT-containing plasmid
using a standard flow cytometer (Maksimow et al., 2002). pGP12. As pAP711DoriT::tet lacks a functional oriT but con-
In the present work, we monitored plasmid transfer by tains the full conjugative system of R388, it is able to mobi-
using the green fluorescent protein GFPmut2 (Cormack lize pGP12 oriT but it is not transferred itself to the
et al., 1996) and three different red fluorescent proteins: recipients. Once pGP12 reaches the recipient, PstbA be-
DsRed2, mCherry and mKate2 (Table 1). We designed an comes de-repressed (by lack of StbA) and gfpmut2 expres-
E. coli-based system in which a plasmid containing the oriT sion takes place. Recipients were BW-NxR cells containing
region of plasmid R388 is mobilized to a recipient cell by a pAC1, pAC2 or pAC4 (Table 1), plasmid constructions in
non-mobilizable derivative of plasmid R388 (Fig. 1). We which rfp expression is driven by the lac promoter (Plac).
reasoned that a system in which the transferred plasmid The three different red fluorescent proteins were used with
is not able to conjugate among recipients would be a sim- similar results (data not shown). Although the major exci-
pler system to analyze. This is due to the fact that newly tation peak for these proteins differs from the laser maxi-
acquired plasmids in transconjugants might conjugate at mum emission wavelength (488 nm), they were excited
different, probably significantly higher rates, a phenome- efficiently, giving reproducible results by detection with
non called zygotic induction (Jacob and Wollman, 1956). the FL2 filter for DsRed2 or with the FL3 filter for mCherry
Plasmid pGP12 (Table 1) contains the oriT of plasmid and mKate2. RFP proteins were used as markers for the re-
R388 cloned upstream of the gfpmut2 reporter gene, so that cipient cells by maintaining high levels of Plac expression
GFP expression is controlled by the stbABC operon pro- by the addition of 0.5 mM IPTG. In such a system, recipient
moter. In the presence of R388, PstbA transcription is re- cells could be identified as RFP+ events while transconju-
pressed by the presence of the StbA repressor protein gants show a GFP+ RFP+ phenotype.
coded by plasmid R388DoriT. Donors were BW-RfR cells To analyze the kinetics of R388_oriT transfer to recipi-
containing the non-mobilizable R388 (pAP711DoriT::tet; ent cells, conjugation was measured using both flow

Fig. 1. Scheme of the cytometric conjugation assay. Donor cells (D) were derivatives of strain BW-RfR carrying the non-mobilizable plasmid R388DoriT and
pGP12 (carrying an oriT:: construction); they appear in the cytometer as the grey population in Q3. They were mated with recipient BW-NxR cells (R)
containing a Plac::RFP construction, appearing as the red population in Q1. In donor cells, GFP expression is repressed by the presence of R388DoriT. When
pGP12 is transfer to the recipient cell, the PstbA::GFP promoter is induced, therefore producing GFP in the transconjugants (T), identified as the RFP+ GFP+
orange population in Q2.
178 I. del Campo et al. / Plasmid 67 (2012) 174–182

Fig. 2. Time series of a representative conjugation experiment as measured by flow cytometry. FL1 vs. FL3 plots showing gated populations. FL3+
population correspond to recipient cells (Q1). The FL3+FL1+ population (Q2), corresponding to transconjugants, increases with time. The Q3 population
corresponds to non-fluorescent events and contains donor cells.

cytometry and the traditional replica-plating method. A points were obtained by averaging at least nine indepen-
1:1 (D/R) conjugative mixture was prepared, spread on dent experiments. Error bars represent the standard devia-
individual wells of 24 well plates and incubated at 37 °C tion for each data point. The same result was obtained at
(Section 2). At different time points, mating mixtures were all four tested D/R ratios (data not shown). Interestingly,
resuspended in LB and a sample either fixed using parafor- as shown in Fig. 3, the error bars of the cytometer experi-
maldehyde for cytometry or plated on antibiotic-contain- ments were consistently smaller than those of the replica-
ing plates for selection for donors, recipients or plating assays. This is to be expected, since we are sam-
transconjugants. In flow cytometric measurements, the pling a much larger number of cells by cytometry (about
bacterial population was gated in a SSC vs. FSC plot and 20,000) than be replica-plating (a few hundred). Based on
set as P1. Twenty-thousand P1 events were collected and these results, we conclude that flow cytometry measures
FL1 vs. FL2 (or FL3) plot was used to study the different
populations. Donor cells were collected as non-fluorescent 1.0
events while recipient cells expressing RFP protein were
0.9
detected in gate Q1 corresponding to FL3+ events. As con-
Conjugation frequency

jugation proceeds, transconjugants can be detected as 0.8

(FL3+ FL1+) events, gated in region Q2. 0.7
0.6
4.2. Cytometric analysis vs. replica-plating 0.5
0.4
Fig. 2 shows flow cytometry FL1 vs. FL3 plots at differ-
0.3
ent conjugation times with populations gated. As can be
seen, the Q2 population (corresponding to transconju- 0.2
gants) increases as a function of conjugation time, while 0.1
the Q1 population (containing recipient cells) decreases. 0.0
In order to confirm flow cytometric assay results, the same 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
conjugation samples were analyzed by the replica-plating
Time (h)
assay, as shown in the plot of Fig. 3, in which the conjuga-
tion frequencies per recipient cell obtained at different Fig. 3. Comparison of conjugation frequencies as estimated by flow
time points are shown. Using flow cytometry, the conjuga- cytometry and replica-plating. Transfer frequencies are expressed as the
tion frequency is obtained as T/(R + T) (that is, Q2/ number of transconjugants per recipient cell (T/(R + T)). Data points were
(Q1 + Q2)). In plating experiments, the conjugation fre- obtained by averaging at least 9 independent experiments. Green
circles = replica-plating frequency data; red triangles = flow cytometry
quency corresponds to T/(R + T) = (Nx Ap Km)/(Nx Ap). As frequency data. Error bars show the standard deviation of the data. (For
can be seen, the frequency plot obtained by flow cytometry interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader
nicely overlaps that obtained by replica-plating. Data is referred to the web version of this article.)
 I. del Campo et al. / Plasmid 67 (2012) 174–182 179

0.6 A 1.0
0.9

Conjugation frequency (Y)

Conjugation frequency

0.5
0.8
0.4 0.7
(fixed cells)

0.6
0.3 0.5
0.4
0.2
0.3
0.1 0.2
0.1
0
0.0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0 4 8 12 16 20 24
Conjugation frequency (fresh cells) Time (h)
Fig. 4. Effect of cell fixation on the estimation of cytometric-assayed B 11
conjugation frequencies. Comparison of the conjugation frequencies
obtained by flow cytometry (as described in Section 2) for the same
10.5

log10 Donor density

samples measured either directly (fresh cells) or after 4% paraformalde- 10
hyde fixation and storage at 4 °C for 24 h (fixed cells). Samples were taken
9.5
after 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 and 4.0 h of conjugation. Each point corresponds
to the mean value of four individual experiments. 9
8.5
were comparable to those obtained with the traditional 8 50%
method of replica-plating on selective media, but with bet- 10%
7.5
ter statistics. Besides, results shown in Fig. 4 confirmed 5%
that cell fixation before cytometric analysis had no mea- 7
2,5%
surable effect on the assay. Given the similarity of results 6.5
when fresh or fixed cells were measured, this finding im- 0 4 8 12 16 20 24
plies that the assay can be simplified since the different Time (h)
time points in an experiment (or from several experi-
ments) could be processed together in the cytometer. Fig. 5. Determination of conjugation frequencies at different times and
D/R ratios. (A) Temporal series of transfer frequencies (Y = T/(R + T)) for
different D/R ratios, as estimated by flow cytometry (see Section 2).
4.3. Estimation of conjugation rates Samples were taken after 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0 and 24 h
of conjugation. (B) Growth of donor cells on the surface of agar plates
during the conjugation experiment, as calculated by replica-plating for
According to the theoretical analysis of Zhong et al. different D/R ratios (specified in the inset).
(2011), c should be independent of the D/R ratio and, to a
certain extent, of the end-point time. Thus, we decided to
change significantly with the D/R ratio and the mean varies
analyze those two parameters in our assay, since a confir-
within one standard deviation according to the time point
mation of their robustness will be of great use in the esti-
at which data were collected. This is clearly more robust
mation of conjugation rates by different laboratories or in
than conjugation frequency proportions (see Fig. 5A). To
different experiments. The result of such an experiment
further confirm that the decrease in c at longer time sam-
is represented in Fig. 5A. It shows the transfer frequencies
plings (more than 6 h) was due to population structuring,
(T/(R + T)) observed at different D/R ratios, while keeping
we interrupted matings at 6 h, resuspended the cells in
the total cell concentration constant. As can be observed,
fresh medium and plated them out again. Fig. 7 shows
the frequency of appearance of transconjugants is a func-
how transfer frequencies increase substantially after mix-
tion of the concentration of donors, as expected. The pro-
ing and plating again on fresh medium. This result indi-
portion of transconjugants increases with time until 6–
cates that conjugation on the plates stops after 6 h
8 h of mating, when it stops. As can be seen in Fig. 5B,
because of lack of bacterial multiplication. Alternatively,
the same happens for the populations of donors. Therefore,
the number of transconjugants in a plate experiment might
conjugation on plates occurs for 6–8 h and then stops to-
also plateau because of a structuring effect due to the con-
gether with cell multiplication. If, instead of transfer fre-
strained mobility of cells on the plate surface, which leads
quencies, we represent the c values for the same
to an increasing proportion of donors being surrounded by
experiment, we obtain the graph of Fig. 6A. At all four D/
sister donor cells and their transconjugants.
R ratios, c decreases slightly with time. This is averaged
and shown more clearly in Fig. 6B. On the other hand, if
we average c over the time points, we can see that its value 5. Discussion
does not change significantly over the D/R ratios tested
(Fig. 6C). The results are presented numerically in Table 2. An accurate determination of conjugation rates is
Thus, the mean value of c was 10.26 ± 0.45. It does not important for several purposes. First, as explained in the
180 I. del Campo et al. / Plasmid 67 (2012) 174–182

A -8.5 1.0
not mixed
50% 0.9 mixed at 6h

Conjugation frequency
-9 10%
5% 0.8
-9.5 2,5% 0.7
log10 γ ep

-10 0.6
0.5
-10.5
0.4
-11 0.3
-11.5 0.2
0 2 4 6 8 0.1
Time (h) 0.0
B -8.5
50 10 5 2.5
-9 Donor %
-9.5 Fig. 7. Effect of population mixing. The figure represents frequencies
log10 γ ep

(Y = T/(R + T)) of 24 h conjugation experiments at different D/R ratios. Blue

-10 bars represent Y measured after 24 h conjugation (defined as not mixed).
Red bars represent Y measured after 24 h conjugation after a previous 6 h
-10.5 conjugation step, resuspension in fresh LB-medium and plated out again
(mixed at 6 h). (For interpretation of the references to colour in this figure
-11 legend, the reader is referred to the web version of this article.)

-11.5
0 2 4 6 8 for the control of the dissemination of AbR (Andersson
Time (h) and Hughes, 2011; Baquero et al., 2011; Bonten et al.,
C -9 2001). Second, plasmids are the workhorses of genetic
engineering and, nowadays, systems and synthetic biology.
-9.5 In fact, plasmids are biological substrates that can be in-
-10 volved in biological processes to encode, store and manip-
log10 γ ep

ulate information. The plasmid ‘‘components’’ may be

-10.5 combined together within a cell to form simple logical cir-
cuits. These components may be exchanged between indi-
-11
vidual bacteria via the process of conjugation. This is the
-11.5 basis for the EU project BACTOCOM (http://www.bacto-
com.eu/index.html). An accurate estimation of transfer
-12 rates is essential to model the behavior of such a system,
50% 10% 5% 2.5% to optimize D/R cell ratios, duration of the conjugation
D/R ratio steps, etc. Third, conjugation rates should be more intrinsic
and robust descriptors of the efficiencies of conjugation
Fig. 6. End-point estimates of the conjugation efficiency rate (c). (A)
mutants in biochemical or genetic analysis of conjugative
Effect of the end-point time. (B) Effect of variation of D/R ratio (using the
averages of the data points in (A). (C) Effect of variation of the end-point systems. We suggest they should be used in these types
time (using the averages of the data points in (A)). of analyses instead of conjugation frequencies.
Simonsen (Simonsen, 1990; Simonsen et al., 1990) pro-
posed the existence of an expression called the end-point
Table 2
estimate of the conjugation rate (cep). cep provides a rate
End-point estimate of the conjugation efficiency rate at different time
points. that is independent of the initial conditions of the reaction
and thus it is a useful estimate of ‘‘intrinsic’’ conjugation
Time (h) Mean log 10 c SD
rates. Later on, Zhong et al. (2011) analyzed how c could
1.5 9.73 0.29 be used to estimate transfer rates in surface associated
2 9.82 0.32
conjugation. They showed that, while c seemed to remain
4 10.27 0.15
6 10.6 0.08
independent of some initial conditions (D/R ratio and con-
8 10.74 0.12 jugation time) it was not independent of others (spatial
Total average 10.26 0.45 clustering and initial cell density). In our experimental
set-up, we took care to use high initial cell densities, which
result in short effective conjugation times (as shown in
introduction, it can help in the design of models that Fig. 5). As a result, in the time periods allowed for conjuga-
account for the dissemination characteristics of AbR plas- tion to occur in our experimental set-up there is relatively
mids in hospital or environmental settings. This, in turn, little bacterial growth and therefore, not substantial
will provide the theoretical ground for mathematical mod- ‘‘structure effect’’ (bacteria develop microcolonies that,
els to assess the outcomes of new intervention strategies when sufficiently grown, touch adjacent colonies and elicit
 I. del Campo et al. / Plasmid 67 (2012) 174–182 181

conjugative transfer). Rather, the populations of donors the repressed version of R1 gave a c = 2  1012 (Levin
and recipients are mixed well enough, so they effectively et al., 1979). These values are higher but consistent to
behave as if they were in solution. Interestingly, the fact those obtained in our surface mating experiments. The
that our transconjugants continue to act as recipients does possibility that liquid-mating is more efficient than sur-
not seem to affect the transfer rates either (it is included in face-conjugation as a general rule should be rigorously
the ‘‘structure effect’’, which becomes significant only after tested. The 3-log rate difference between R1 and its de-re-
long mating times). In fact, if any donor bacterium is going pressed version underlines the potential ‘‘interfering’’ ef-
to engage in conjugation less than one time per experi- fect of zygotic induction on the calculation of c, as
ment on average, the ‘‘structure effect’’ should not be rele- discussed in this work. The values of c obtained in other
vant. This is what appears to happen in the experiments, as publications analyzing surface conjugation cannot be com-
shown in Fig. 6. Cells multiply and conjugate for about 8 h. pared directly with ours since they use surface areas in-
Little else occurs afterwards. stead of volumes. When the c of oriT_R388 is converted
Each well in a 24-well plate has a surface of 177 mm2 to these units, it gives 4.76  109 cm2 cell1 h1. Then, it
and was filled with about 1.0 mL of LB-agar. Therefore, a can be compared to that of plasmid pQBR11, which was
confluent E. coli monolayer (if each bacterium occupies 1  1011 in surface conjugation experiments between
1 lm2 – a cylinder 2.0 lm long and 0.5 lm base diameter) two Pseudomonas putida strains, or 4  1014 from P. putida
will consist of approximately 2  108 bacteria. According to Pseudomonas fluorescens (Lilley and Bailey, 2002). Signif-
to our estimates, we place roughly 3–6  108 bacteria/ icantly higher transfer rates were observed by Normander
plate well at the start of each conjugation experiment. This et al. (1998) in surface conjugation of the TOL plasmid
number was calculated, to get a maximal conjugation fre- (ranging from 7  1011 to 1  107). It is difficult to con-
quency (T/D) in a set of preliminary experiments that used clude anything from this scanty data. Certainly, a more
1:1 D/R ratio and 1 h mating periods (C. Revilla, data not extensive analysis with different plasmids and conditions
shown). Therefore, the bacterial cells are already in close is needed before we can extract general conclusions about
contact at the beginning of the mating experiment, form- plasmid conjugation rates.
ing at least a one-cell layer on the agar surface. Assuming In summary, we propose that Eqs. (2) and (3) could be
a height of 0.1 mm for the water column above the agar useful as a rule to estimate c and thus compare the transfer
surface, the resulting volume will be roughly 0.02 mL/well dynamics of different plasmids (or mutants of conjugation
(that is, 5  1010 cells/mL). These high cell concentrations genes). In this way significant differences can be discov-
seem to be essential for the close contacts needed for con- ered in the kinetic parameters that are related to different
jugation to happen at optimal rates. According to the mea- plasmid designs. As proof of principle, we analyzed the
surements in Fig. 5, the number of bacteria in the mating mobilization of a plasmid containing just the oriT region
mixtures remains constant for about 1 h and then in- of plasmid R388, instead of the native plasmid itself. Since
creases by a factor of 10 to 100-fold in the next 4–6 h (cor- the oriT cannot transfer from primary transconjugants to
responding to 4–7 doublings), growing little afterwards. new recipients, we were sure to deal with a single conjuga-
The lag phase is to be expected since experiments start tion rate. Experiments such as those detailed in this work
from stationary phase cultures, grown the previous day. should be extended to different systems and conditions
Besides, the mating plates have to adjust to the mating to adequately describe and quantify the conjugation kinet-
temperature. In summary, it seems that the surface of ics of the most common transmissible plasmids.
the plates can accumulate several layers of growing bacte-
ria in close contact. This crowded environment seems to be
6. Conclusions
optimal for surface conjugation.
The purpose of this work was not to analyze the theo-
We have developed a cytometric protocol for the esti-
retical aspects of conjugation kinetics on solid surfaces
mation of end-point conjugation rates. Our method is fas-
(as rigorously examined, for instance, by Zhong et al.
ter and less noisy than the classical replica-plating method.
(2011)). We rather wanted to provide a simple protocol
Using the cytometric method for the analysis of conjuga-
to estimate conjugation rates (that can be used in models
tion of the oriT of plasmid R388 we demonstrate that the
of conjugation kinetics) for the type of experiments that
end-point method is insensitive of D/R ratios and, to a cer-
are usually performed in a bacterial genetics laboratory.
tain extent, of the time of data collection. Conjugation fre-
We ended up with two equations, one that fits datasets ob-
quencies are significantly increased by re-mixing the
tained by cytometric analysis (Eq. (2)) and a second one
mating populations, until most recipients are converted
that is adapted to replica-plating datasets (Eq. (3)). Due
to transconjugants.
to its speed and simplicity, and the fact that the cytometric
estimates are less noisy (see Fig. 3), we favor the use of the
cytometric method. Acknowledgments
Under these experimental conditions, our estimate for c
of oriT_R388 was 5.46  1011 mL cell1 h1. It should be This work was supported by Grants BFU2008-00995/
emphasized that this value considers a volume of 20 lL BMC from Ministerio de Ciencia e Innovación (MCINN,
for the mating mixture, as discussed above. This value of Spain), RD06/0008/1012 from Instituto de Salud Carlos
c can be compared to estimates in liquid mating experi- III, and 248919/FP7-ICT-2009-4 from the European VII
ments of E. coli plasmid F and of the derepressed plasmid Framework Program. Ms. María Aramburu is also acknowl-
R1-drd-19 (both giving c = 2  109 mL cell1 h1), while edged by her expert assistance with the flow cytometer.
182 I. del Campo et al. / Plasmid 67 (2012) 174–182

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Negative Feedback and Transcriptional Overshooting in
a Regulatory Network for Horizontal Gene Transfer
Raul Fernandez-Lopez, Irene del Campo, Carlos Revilla, Ana Cuevas, Fernando de la Cruz*
Instituto de Biomedicina y Biotecnologia de Cantabria (IBBTEC), Santander, Spain

Abstract
Horizontal gene transfer (HGT) is a major force driving bacterial evolution. Because of their ability to cross inter-species
barriers, bacterial plasmids are essential agents for HGT. This ability, however, poses specific requisites on plasmid
physiology, in particular the need to overcome a multilevel selection process with opposing demands. We analyzed the
transcriptional network of plasmid R388, one of the most promiscuous plasmids in Proteobacteria. Transcriptional analysis
by fluorescence expression profiling and quantitative PCR revealed a regulatory network controlled by six transcriptional
repressors. The regulatory network relied on strong promoters, which were tightly repressed in negative feedback loops.
Computational simulations and theoretical analysis indicated that this architecture would show a transcriptional burst after
plasmid conjugation, linking the magnitude of the feedback gain with the intensity of the transcriptional burst.
Experimental analysis showed that transcriptional overshooting occurred when the plasmid invaded a new population of
susceptible cells. We propose that transcriptional overshooting allows genome rebooting after horizontal gene transfer, and
might have an adaptive role in overcoming the opposing demands of multilevel selection.

Citation: Fernandez-Lopez R, del Campo I, Revilla C, Cuevas A, de la Cruz F (2014) Negative Feedback and Transcriptional Overshooting in a Regulatory Network
for Horizontal Gene Transfer. PLoS Genet 10(2): e1004171. doi:10.1371/journal.pgen.1004171
Editor: Ivan Matic, Université Paris Descartes, INSERM U1001, France
Received May 13, 2013; Accepted December 26, 2013; Published February 27, 2014
Copyright: ß 2014 Fernandez-Lopez et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits
unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: Work was financed by the Spanish Ministry of Economy and Competitivity (BFU2011–26608) and the European Seventh Framework Program (289326/
FP7-KBBE-2011-5 and 282004/FP7–HEALTH-2011-2.3.1–2) to FdlC. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or
preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected]

Introduction copies within a given cell favors plasmids with higher copy
number, superior partition systems and higher transfer rates [9].
Horizontal gene transfer (HGT) is ubiquitous in bacteria. However, these processes come to a cost, since plasmid
Because its important role in bacterial adaptation, HGT has been consumption of resources imposes a metabolic burden that
traditionally compared to sexual reproduction in higher eukary- hampers host fitness. Competition between plasmid-containing
otes. In bacteria, however, HGT is not mediated by specific cells, on the contrary, selects for plasmids that minimize the
intracellular mechanisms, but it is the byproduct of the pervasive burden imposed onto the host. Both selection levels are thus
movement of a myriad of mobile genetic elements. These include intrinsically in conflict, and an adequate regulation of gene
transposons, phages, ICEs and, most notably, plasmids [1]. expression becomes essential to ensure plasmid survival [10].
Among them, broad host range (BHR) plasmids of Proteobacteria Transcriptional regulation is common in plasmids, and virtually
stand out because of their ability to colonize a wide range of all functions in plasmid physiology have been found to be under
bacterial species. This ability makes BHR plasmids efficient transcriptional control [11]. In some cases, this control is exerted
shuttles for HGT, clearly illustrated in the last decades by their in sophisticated and apparently redundant layers. For example,
leading role in the spread of antibiotic resistance genes among plasmid R1 replication is controlled simultaneously by an antisense
microbial populations [2]. RNA and a transcriptional repressor [12] [13]. In other cases, like
Bacterial plasmids are agents for HGT, but they themselves are in the broad host range plasmid RP4, transcriptional regulation is
genetic replicons with their own, idiosyncratic, evolutionary organized under a global network that coordinates all functions in
history [3,4]. Plasmid fitness depends on two basic physiological the plasmid’s physiology [14]. Unfortunately, despite our knowl-
functions: maintenance within the bacterial host and transfer into edge of the molecular biology of transcriptional regulation, our
new hosts; functions that are encoded in the plasmid genome. understanding of the signals that plasmid regulatory circuits
However, since plasmids can only exist inside a bacterial cell, their respond to is scarce. Plasmids from Gram+ bacteria regulate
fitness is also host dependent. Plasmids impose a burden on host conjugation according to external cues about the abundance of
fitness [5,6,7,8], which is dependent on the collective effect of the possible receptors. These cues are communicated in the form of
plasmid population within a given cell. The overall fitness of a specific pheromones [15]. Such systems are generally not found in
plasmid replicon therefore depends not only on its own phenotype, plasmids from Proteobacteria, with the remarkable exception of Ti-
but also on the phenotype of other co-residing plasmid copies. like plasmids from Alpha-Proteobacteria, which monitor external
This dependency on the group phenotype puts plasmids under conditions via a quorum sensing mechanism[16] [17]. Apart from
multilevel selection [9]. Multilevel selection forces plasmids to these and a few other cases, the input information that plasmid
confront a paradoxical situation. Competition between plasmid regulatory circuits monitor remains elusive.

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 Negative Feedback in Horizontal Gene Transfer

Author Summary to background, and another six (PresP, PkfrA, PssB, PstbA, PkorA,
PkikA) showed values similar to those of repressed PlacZ (1*103
In the environment, bacteria often evolve by the acquisi- GFP/OD). The only promoters that showed no changes in the
tion of new genes from different species. Plasmids are presence of plasmid R388 were Pint and Pant. Interestingly, these
small DNA molecules that mediate horizontal gene transfer promoters do not belong to the plasmid backbone: they are part of
in bacteria, thus they are fundamental agents for the the In-3 integron platform, which incorporated recently, in
spread of antibiotic resistances. Plasmids replicate inside evolutionary terms, into the plasmid genetic structure [20].
the bacterial cytoplasm, and propagate infectiously by Therefore, when the full regulatory network was present, all
contact. Plasmids control these two ways of multiplication, promoters from the plasmid backbone were repressed, and kept at
but like many other symbionts they suffer from a tradeoff. levels lower or similar to LacI-repressed PlacZ.
If plasmids become very infective, they can spread fast and
To determine the transcriptional units of the plasmid, mRNA
successfully, but this damages the bacterial hosts they
levels during exponential growth were analysed by RT-qPCR.
depend upon. If, on the contrary, plasmids become very
mild, the host is able to grow better but the ability of Relative mRNA abundance was measured using a set of 66 primer
plasmids to infect new hosts is hampered. We have pairs, designed to cover the entire plasmid genome. From these 66
studied the regulatory mechanisms plasmids use to primer pairs, 60 showed efficiencies in the interval 0.9,E,1.2
overcome this paradox. We discovered that negative (Figure 2A, left upper panel) and were considered suitable for
feedback, a regulatory motif ubiquitous in the plasmid quantification. mRNA was extracted from cells growing in rich
network, allows transient activation of plasmid functions media at mid-exponential phase, and retrotranscribed into cDNA
immediately after plasmids invade a new host. This might as described in Materials and Methods. Using 300 ng total RNA,
be an adaptive strategy for plasmids to be highly infective we obtained an average threshold cycle (Ct) of 19.9 with cv = 0.12.
without damaging their hosts, and it illustrates a natural Results for each primer pair were normalized measuring the Ct
mechanism for DNA transplantation that could be imple- corresponding to 5 ng of purified plasmid DNA. Results
mented in synthetic genomic transplants. (Figure 2A, left lower panel), showed a tight distribution with an
average Ct of 14.2 and cv = 0.034. Relative abundances of
mRNAs were expressed as DCt = CtcDNA-CtDNA [21] and a
Trying to understand the fundamental principles of plasmid representation of the average DCt obtained for each primer pair in
transcriptional control, we analyzed the regulatory network of three independent experiments is shown in figure 2B. Known
plasmid R388. Plasmid R388 is the smallest BHR conjugative untranscribed regions, like the plasmid origin of transfer (between
plasmid found in Proteobacteria [3]. It shows an extensive host range, PstbA and PtrwA), yielded DCt = 28, while the most actively
which overlaps with that of plasmid RP4, another model BHR transcribed region corresponded to the integron cassettes, with
plasmid [18]. Remarkably, plasmid RP4 is phylogenetically DCt = 2. Overall, the transcriptional profile clearly delimitated the
unrelated to plasmid R388 [3]. This situation allowed us to boundaries between transcriptional units (Figure 2.B). A compar-
compare two plasmid networks that evolved independently, but ison between promoter strengths, determined by fluorescence
under similar selective constraints. Using fluorescence expression profiling, and mRNA abundances, measured by RT-qPCR
profiling and quantitative PCR, we found a global regulatory (figure 2A, left lower panel), showed that both measurements
network that controlled plasmid R388 transcription. Unlike the were not linearly correlated (r2 = 0.49), indicating that mRNA
archetypical plasmids from Gram+ bacteria or Ti-like plasmids, the processing and degradation also played significant roles in
network seemed to be unresponsive to environmental changes, or determining plasmid levels of expression.
quorum signals. The network was based on a basic regulatory To determine the topology of the plasmid regulatory network,
motif: a strong promoter controlled by a tight negative feedback we tried to ascribe each plasmid promoter to its cognate
loop (NFL). We show, computationally and experimentally, that regulators. ORFs from the plasmid genome that were either
this architecture induces transcriptional overshooting after hori- orphan, or showed homology to known transcriptional regulators,
zontal transfer of the plasmid. were considered potential candidates to encode a plasmid
regulator. These ORFs were cloned in expression vector pBAD33,
Results and the transcriptional activity of plasmid promoters was
measured in the presence of all putative regulators. Expression
Intergenic regions in plasmid R388 DNA were PCR-amplified profiles are shown in supporting figures S1 and S2, and steady-
and cloned in the low copy number reporter vector pUA66 [19] to state levels are indicated in Supporting Table S1. Results allowed
drive transcription of gfpmut2 after a strong ribosomal binding site. the identification of six plasmid proteins (ResP, KfrA, ArdK, StbA,
Out of the 19 intergenic regions cloned, 15 showed transcriptional TrwA and KorA) able to repress at least one of the plasmid
activities at least two-fold higher than the promoter-less vector, promoters. (Supporting Table S1 and Supporting figure S1).
and were considered to contain a promoter (Figure 1). To Among the regulators identified, we did not find any transcrip-
compare the transcriptional strength of these promoters against a tional activator. All regulators were repressors involved in negative
known standard, the activity of ParaBAD was measured at different feedback loops (Figure 3A). Three of them controlled only their
arabinose concentrations. ParaBAD promoter reached 105 GFP/ own promoter, thus constituting simple negative feedback loops
OD units at maximal induction, and 13 out of 15 R388 promoters (ResP, KfrA and TrwA). Another three (ArdK, StbA and KorA)
showed levels similar to this value (Figure 1, Supporting Table S1). controlled more complicated circuits. Protein ArdK repressed
Therefore R388 promoters, when assayed in the absence of the expression from PardC, Porf7, Porf12, Porf14 and Pssb, its own
plasmid network, have strong transcriptional activities. promoter (Supporting fig. S1). All these promoters direct the
Transcriptional activity decreased sharply when the promoters transcription of genes involved in the stable maintenance of the
were assayed in cells that also contained plasmid R388 (Figure 1, plasmid [3]. Therefore, ArdK seems to regulate the vegetative
Supporting Table S1). The repression fold exerted by the plasmid maintenance of plasmid R388. Similarly, protein KorA was found
ranged from 5 (PresP) to more than 500 fold (Porf7). Six promoters to regulate PtrwH, PkorA, PkikA, PkorB and its own promoter,
(PardC, Porf14, Porf12, PkorB, PtrwH, Porf7) dropped to levels close PkorA (Supporting Fig. S2). All these promoters are responsible for

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 Negative Feedback in Horizontal Gene Transfer

Figure 1. Promoters in plasmid R388. The figure shows the location and transcriptional activity of promoters detected in plasmid R388 genome.
The location of each promoter is indicated by an arrow on the red circle. Each promoter receives the name of the first gene encoded in the
transcriptional unit. Bar charts indicate the expression levels when the promoter activity was measured alone (black columns) or in cells that also
contained plasmid R388 (grey columns). The expression levels (,GFP/OD.) represent the average GFP/OD (6102) level achieved by cells growing in
exponential phase. Each column represents the average and standard deviation of at least five independent experiments.
doi:10.1371/journal.pgen.1004171.g001

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 Negative Feedback in Horizontal Gene Transfer

Figure 2. Transcriptional units in plasmid R388. (A) Statistics of the 66 primer pairs used to measure transcriptional levels in plasmid R388
(Upper right) Histogram showing the efficiency (calculated as indicated in materials and methods) of the primer pairs. (Upper right) Histogram
showing the Ct obtained in qPCR amplifications from plasmid cDNA. (Lower left) Histogram showing the Ct obtained in qPCR amplifications from
purified plasmid DNA. (Lower right) Scatter plot showing the relationship between the promoter activity (obtained from figure 1, in GFP/OD unit on
the y axis) and the mRNA levels measured by RT-qPCR (DCt, x axis). (B) Transcriptional landscape of plasmid R388. The graph shows the relative
abundance of mRNA, indicated as DCt = CtcDNA-CtDNA) along the plasmid genome. Each unit in the y axis corresponds to a 2 fold increase in mRNA.
Peaks correspond to highly transcribed regions and valleys correspond to non-transcribed regions. The highlighted blue lines indicate the
overlapping of the transcriptional units and the plasmid promoters identified in figure 1.
doi:10.1371/journal.pgen.1004171.g002

expression of the Type IV secretion system, involved in plasmid involved in a complex regulatory circuit was StbA. Gene stbA is part
conjugation. Therefore, KorA acted as the main transcriptional of an operon responsible for plasmid segregation [22] and was found
regulator for expression of the conjugative pilus. The third protein to decrease PstbA transcription 50-fold (Figure 3A, Supporting

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 Negative Feedback in Horizontal Gene Transfer

Table S1). StbA also repressed transcription from promoters PardC, environmental changes. We modified growth medium (LB,
Porf7, Porf12 and Porf14; indicating that its target repertoire minimal M9), temperature (30, 37 and 42uC) and tested the
overlaps with that of ArdK (Supporting Fig. S1). Similarly, StbA presence of stressing agents, like sub-inhibitory concentrations of
repressed the promoters targeted by KorA, although the level of antibiotics and common triggers of the SOS response (Materials
repression exerted was significantly lower (2 to 10-fold decrease and Methods). As judged from fluorescent expression profiling,
compared to the 90-fold decrease produced by KorA on PtrwH) none of these signals was found to specifically activate any
(Supporting Fig. S2). Interestingly, previous work on StbABC promoter in the network (Supporting figures S3, S4 and S5). The
showed that this operon balances plasmid partition and conjugation possible effect of Escherichia coli recipient cells was also tested by co-
[23]. Results presented here indicate that StbA acts as a common culture in liquid media with plasmid free cells (Supporting figure
regulator for genes involved in the vegetative and conjugative S6). Since plasmid R388 can only conjugate on solid surfaces [24],
functions of the plasmid. these conditions prevented horizontal transfer of the plasmid,
These results allowed us to determine the topology of plasmid while allowing the donors to sense any potential signal from the
R388 transcriptional network, which is depicted in Figure 3B. The recipient cells. Again, the regulatory network was unresponsive
network is completely dominated by negative repression, and (Supporting figure S6), indicating that, in the conditions tested, the
promoter activation will depend on signals levering the action of network did not respond to any diffusible signal from the recipient
plasmid repressors. In order to identify the signals that the network cells. Altogether these results indicated that plasmid R388 does
responded to, we challenged the plasmid with a plethora of neither respond to pheromones (unlike many plasmids from Gram

Figure 3. Negative feedbacks and topology of plasmid R388 transcriptional network. (A). Each panel shows the transcriptional activity
(GFP/OD) (6102) of a given promoter, either alone or in the presence of each of the six transcriptional repressors (ResP, KfrA, ArdK, StbA, TrwA and
KorA). Repressors were produced from a co-residing expression vector pBAD33, and the negative control indicates the GFP/OD (6102) values
obtained in the presence of the empty vector. The upper diagrams show the location of each regulator with respect to its cognate promoter in
plasmid R388 (B) A graphical representation of expression profiling data (shown in Supporting figures S3 and S4) unveils the topology of the
regulatory circuitry. Coloured arrows indicate the position of transcriptional regulators within plasmid R388 genome (ResP in orange, KfrA in blue,
ArdK in purple, StbA in green, TrwA in red and KorA in navy blue). The regulatory links are coloured according to the same code. Red lines shown
over the ORF map correspond to the transcriptional units identified in Figure 2.
doi:10.1371/journal.pgen.1004171.g003

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+ bacteria [15]), nor quorum sensing signals (unlike Ti plasmids the value of X at steady state (Xss), simulations showed that
from Agrobacterium [16,17]) nor SOS inducing agents (like many increasing the promoter strength (l) or decreasing K (increasing
phages and ICEs [25]) the strength of the repression, i.e. the affinity of the regulator for its
The absence of responses against environmental challenges, cognate site) increased correspondingly the size of the transcrip-
DNA damage or quorum signals suggested that plasmid regulation tional overshoot (Figure 4A). This dependency strongly suggested
is disconnected from the main sensory circuitry of the host cell. that there should be a correlation between the overshoot and the
However, sensing is not the only function that transcriptional relative strength of the repression exerted by the NFL. The relative
regulation can undertake; generating temporal programs, or strength of the feedback can be expressed in terms of feedback
guarding the cell homeostasis are also adaptive functions that gain (G) (Figure 4B). We define G as the ratio between the steady
arise purely from the internal dynamics of regulatory systems. In states shown by the open loop (without the repressor) and the
order to study the internal dynamics of the plasmid network, we closed loop (with the repressor)
used a simple quantitative model. Since all transcriptional
regulators in the plasmid were self-repressors (Figure 3), we used   n
l1 l2 nz1
a simple ordinary differential equations (ODE) model of a negative G~ ð2Þ
feedback loop. Let X denote the mRNA and Y the protein b1 b2 k
concentrations for a given feedback loop, the system of differential
equations that describe the system follows:
This expression indicates that the feedback gain is directly
dependent on the transcriptional/translational strength (l1 l2) and
dx kn inversely correlated to the feedback constant k. Similarly, the
~ l1 n { b1 x
dt
|{z} k zyn |{z} overshoot (O) can be expressed as the ratio between the maximum
|fflfflfflfflfflffl{zfflfflfflfflfflffl} degradation
mRNA production value on X divided by its steady state. Then, by linearizing X
turnover
ð1Þ before the onset of the repression loop we can approximate O as:
dy
~ l2 x { b2 y  
dt |{z} |{z}
|{z} production degradation Ox % 1{e{b1 tx~xmax G ð3Þ
protein
turnover

This approximation indicates that the stronger the gain (G) the
This equation is based on the assumption that, in the absence of higher the overshoot will be. This approximation holds for highly
repressor binding, mRNA is transcribed at rate l1, and translated non-linear systems, with high values of n (Figure 4C, left panel).
at rate l2. Repressor binding is modelled following simple mass- However, if we introduce a dimerization step where two monomers
action kinetics. This binding is characterized by a half maximal of repressor Y need to interact to form an active dimer, the
binding constant k, which is the ratio between the dissociation and approximation holds for all n (Figure 4C, right panel). The fact that
binding constants (k = koff/kon). The model allows cooperative nearly all transcription factors from Prokaryotes act as multimers
binding, with cooperativity index n (n = 1 for non cooperative indicates that this is a conservative assumption [28]. Equation 3
binding). Parameters b1 and b2 correspond to the degradation indicates that O is proportional to the gain G, and to the time to
rates of mRNA and the regulator, respectively. This simple ODE reach the maximal value of X (in the limit t = = .‘, e2bt<0 and
model has been extensively used in the literature, and was shown O<G). This means that O increases with higher delays, and the
to confer different properties, such as decrease the response time higher the feedback gain, the more prominent the transcriptional
and increase the stability of transcriptional sensory systems[26,27]. overshoot will be. Previous computational analysis of other feedback
These properties are characteristic of negative feedback loops loops showed similar dependencies between the intensity of the
whose components (mRNAs and proteins) are in steady state. overshoot and the strength of the feedback gain [29]. Therefore,
However, apart from these and other steady-state properties, simulations and theory predicted that a network architecture based
NFLs are known to exhibit transient behaviours while adjusting to on strong promoters, tightly repressed in negative feedback loops,
the steady-state. In electrical engineering it is well known that would exhibit significant transient overshooting after HGT. For
NFLs can overshoot before reaching steady-state when they start more complex circuits of the plasmid network that are under the
from initial zero conditions (x = 0 , y = 0 at t = 0). In biological control of two transcriptional regulators, transient overshooting is
contexts, this property has received little attention, the reason also expected (Supporting figure S7). Due to the OR logic that rules
being that daughter cells inherit not only the chromosome but also these circuits, the overshooting was dependent on the transcrip-
a proportional part of its regulatory elements. Thus, in the normal tional regulator that first achieved its effective values. This, in turn,
life of bacteria, transcriptional NFLs do not usually experience will depend of its affinity for the target promoter (k) and its own
situations with zero concentration of its constituents. However, transcriptional/translational strength, as in simple NFLs.
conjugative plasmids have a specific mechanism of invasion, To test whether this transcriptional overshoot could be detected
entering a cell in the form of ssDNA, without accompanying experimentally, we determined mRNA expression levels during
mRNAs or transcriptional regulators. Simulations of Eq 1. conjugative transfer of the plasmid. Conjugative mixes with 1:1
mimicking these conditions produced an overshoot, showing that donor/recipient cell ratio were allowed to mate for 0, 30, 60, 90
both the mRNA and the protein experienced a transitory burst and 120 min. Total RNA was extracted from time samples, and
and then relaxed to their steady state values (Figure 4A). While expression levels from the main plasmid operons were measured
mathematical analysis indicated that a temporal lag between the by RT-qPCR. Expression levels were normalized by the results
mRNA and the protein was enough to produce overshooting obtained from a constitutive chromosomal gene (dxs). In order to
(Supporting Text S1), computational analysis indicated that the check for possible mRNA increases due to conjugative replication
magnitude of this overshoot is heavily dependent on the of the plasmid, we measured the relative increase in non-
parameters of the system. Defining the magnitude of the overshoot transcribed regions (oriT), and also in promoters that were not
as the ratio between the maximal levels reached by X (Xmax) and negatively regulated (dhfR gene, controlled by Pant). Experimental

PLOS Genetics | www.plosgenetics.org 6 February 2014 | Volume 10 | Issue 2 | e1004171

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PLOS Genetics | www.plosgenetics.org 7 February 2014 | Volume 10 | Issue 2 | e1004171

 Negative Feedback in Horizontal Gene Transfer

Figure 4. Transcriptional overshooting and its relationship with feedback gain. (A) Numerical simulations showing the effect of increasing
feedback gain on the magnitude of the transcriptional overshoot. Left panels show the relative abundance of mRNA (X) normalized by its steady-
state value (Xss) along time. Right panels show the phase-plane portrait of the system, where the x axis corresponds to the normalized mRNA values
(variable X in Ec.1) and the y axis corresponds to the normalized regulator levels (variable Y in Ec.1). Values were normalized by their respective
steady-state levels. Upper panels show the effect of increasing the feedback gain by decreasing the feedback constant K. Simulations were performed
with l1 = 10, b2 = 0.2, l2 = 10, b1 = 1 and n = 1. Lower panels show the effect of increasing the feedback gain by increasing the intrinsic transcription
rate l1. Simulations were performed with l1 = 0.01, b2 = 0.2, l2 = 10, b2 = 1 and n = 1. The figure shows that the maximal values of X and Y grow as
the feedback gain is increased, either by decreasing K or increasing l1 (B) Scheme showing the theoretical time evolution of an open loop (blue) and
a closed negative feedback loop (red). The feedback gain (G) corresponds to the ratio between the steady states of both systems, being all
parameters equal (blue dashed line). The overshoot (O) corresponds to the transient production above the steady-state levels experienced by the
closed loop when starting from initial conditions t = 0, x = 0, y = 0 (red dashed line) (C) Performance of the theoretical approximation described in Ec.
4 , compared to numerical simulations. Both panels show results obtained by numerical integration of Ec.1 (white dots) and predicted overshoots
obtained from Ec. 4 (black dots). All simulations and calculations were done in a system with parameters k = 0.01, l1 = 10, b2 = 0.2, l2 = 10, b1 = 1 and
changing the cooperativity of the repression (n, x axis). The left panel corresponds to a system where regulator Y is allowed to repress its own
synthesis immediately after translation, while the right panel corresponds to the same system but including the requirement of Y dimerization before
binding to DNA. Dimer formation is simulated by a simple ODE with Ka = 0.1 and Kd = 0.01. The inner graphs on the right chart show the phase-
portrait of the system, with mRNA on the x axis and regulator concentration on the y axis. As shown in the figure, when the number of binding sites is
higher than n = 10 the system becomes cyclostationary, opening the possibility of periodical bursts of transcription.
doi:10.1371/journal.pgen.1004171.g004

procedures are detailed in materials and methods. Results, shown (trwF, ardC, ssb and klcB) corresponded to promoters with the
in figure 5, indicated that the expression levels of oriT and dhfR higher gains (PtrwH, PardC, Pssb and Porf12). On the other
showed limited changes, while genes controlled by negative hand, those promoters with lower gains (PtrwA and PresP) also
regulation (resP, ardC, ssb, klcB, trwA and trwF) increased their yielded lower overshoots (trwA, repA in fig. 5), as predicted by
relative abundance immediately after conjugation. Experimental theory. Since conjugation is inherently asynchronous (newly
results showed that those genes that showed the highest induction formed transconjugants become donors and infect new receptors),

Figure 5. Promoter induction after horizontal transfer of the plasmid. RT-qPCR was used to measure mRNA levels. Bars indicate the relative
ratio of mRNA at each time point compared to the values obtained in the absence of conjugation (time 0). Asterisks indicate the statistical
significance of the differences observed * = p,0.1, ** = p,0.05 Experimental procedures and calculations are detailed in Materials and Methods and
expanded results are shown in Supporting Figure S4. Measurements represent the average of three independent mRNA extractions.
doi:10.1371/journal.pgen.1004171.g005

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 Negative Feedback in Horizontal Gene Transfer

our population measurements resolved poorly the actual kinetics of selection imposes opposing demands on plasmid physiology that
the overshoot. Also, the kinetics of the overshoot for individual require a delicate equilibrium between the expression of plasmid
NFLs will depend critically on the mRNA half-life (Eq.3), which is functions and the burden imposed on the host cell [9].
also likely to be variable from gene to gene. As a consequence, the Understanding the regulatory mechanisms of plasmid transcrip-
decrease in the overshoot is only observable in some of the genes tional control might shed light on the way plasmids conciliate these
tested (ardC, ssb,trwH trwA). However, steady-state measurements requirements.
(equivalent to time 0 in figure 5) indicated that all promoters would In this work we describe the topology and dynamics of the
eventually return to basal levels. For the klcB gene, controlled by transcriptional network of plasmid R388, the smallest BHR
Porf12 promoter, which yielded no observable overshoot, it is not plasmid from Proteobacteria. The network consisted exclusively of
possible to state at this point whether the overshoot was obscured transcriptional repressors. This preference for transcriptional
by population effects, or the parameters of this promoter did not repression is in contrast with the situation described for the
yield any significant overshoot. regulatory networks of bacterial chromosomes. For example, in
This transient induction could have phenotypic effects on the host E.coli the number of transcriptional activators roughly equals the
cell. Plasmids impose a burden on the host, meaning that, in the number of repressors [33]. However, other transcriptional
absence of positive selection for plasmid-encoded traits like networks from BHR plasmids, like plasmid RP4, were also found
antibiotic resistances, plasmids must survive as parasitic entities to depend solely on transcriptional repressors [11]. In plasmid
[30,31,32]. It is conceivable that a transient increase in plasmid gene R388, transcriptional repression was exerted mainly in the form of
expression will translate into a higher burden to the host cell. To test negative feedback loops. These feedback loops showed high gains
whether any effect on host fitness could be observed, we measured (defined as the ratio between the expression levels of the open and
the growth rates of donor, recipient and transconjugant cells, the closed feedback loops). Although we are not aware of any
immediately after conjugation. We used two spontaneous Rifr and systematic, quantitative study of a plasmid regulatory network,
Nxr mutants of E.coli strain Bw27783, which showed no observable several independent studies have reported that the regulatory
differences in growth rate (figure 6A). Cells from both strains that network of plasmid RP4 contains strong promoters that are kept
had carried the plasmid for at least 10 generations exhibited a 17% tightly repressed by the plasmid regulators [14,34,35,36,37,38].
increase in the generation time when compared to plasmid free cells Remarkably, plasmids R388 and RP4 show similar broad host
(Figure 6A). This indicated that the plasmid exerted a measurable ranges, but they are not phylogenetically related [3,4,39]. This
burden on the host Plasmid conjugation assays were performed on indicates that both plasmids, which presumably suffer from
LB agar surfaces in a 1:1 donor/recipient ratio, and cells were analogous selective constrains, have independently evolved tran-
allowed to mate for 30 min. Conjugation was stopped by scriptional networks with analogous topologies.
resuspending cells from the solid surface, cells were diluted to Simulations and theory indicate that whenever a negative
OD600<0.01 in fresh LB, placed in agitation at 37 C and allowed to feedback loop has a gain higher than 1 and a certain time delay
grow for 5 h (Figure 6B). Growth rates were measured by plating on between the mRNA and the regulatory protein, the system would
selective antibiotics (materials and methods). Plasmid R388 does not show transient overshooting (Eq 3 and figure 4A). The actual
conjugate in liquid media, thus any variation in the proportion of production of the overshoot requires the system to begin with zero
donors, recipients and transconjugants must be due to relative initial concentration of transcriptional repressors (t = 0, x = 0,
differences in growth rates. Results, shown in figure 6C, indicated y = 0, in Eq 1), allowing the separation of timescales to produce a
that transconjugant cells suffered a remarkable decrease in growth period of repressor-free transcription. For conjugative plasmids,
rate immediately after conjugation, showing a first generation time this situation is met every time the plasmid enters into a new cell
of about 2.56times that of donor cells. However, after this long first by conjugation. In fact, any negative feedback loop that undergoes
generation, transconjugant cells recovered, achieving the same conjugation is likely to experience transient overshooting. It has
number of divisions as donor cells for the total duration of the been known for a long time that a lysogenic phage transferred by
experiment (7 generations). Similar results were obtained when Hfr conjugation (an artificial system that allows the horizontal
donor and recipient strains were reversed (Supporting Figure S8). transfer of the entire chromosome), can become lytic when
The observed growth deficit in the transconjugants could be a by- entering into a new host [40]. A similar behavior was also observed
product of the conjugation mechanism, which requires the piercing when an RFP-TetR autogenously regulated cassette was inserted
of the recipient cell by the transfer apparatus. To test whether this in the E.coli chromosome and transferred by Hfr conjugation into a
was the case, we carried out a similar experiment with a mobilizable new cell [41]. Transient overshooting is therefore an epiphenom-
plasmid. In this case, a small cloning vector carrying just the origin enon associated to negative feedback loops that experience some
of transfer (oriT) of plasmid R388 was mobilized into recipient cells sort of ‘‘genome rebooting’’, a condition where the transcription-
by means of an oriT2 mutant of plasmid R388. Under these al/translational machinery is present, but the regulatory network is
conditions, plasmid R388 does not move itself, but is still able to transitory absent.
produce a conjugative pilus and thus mobilize the small vector into Simulations and theory also indicated that the overshoot is
the recipient cells. Results show that vector mobilization did not expected to be higher whenever the feedback loop has a high gain.
produce a significant decrease in the growth rate of transconjugant Plasmid promoters were shown to contain feedback loops with
cells (Supporting Figure S8). This indicated that the transitory characteristic high gains. RT-qPCR analysis showed a transcrip-
deficit in growth rate was not due to cell injuries produced by the tional burst in 5 out of 6 plasmid promoters subjected to NFLs,
mechanism of conjugation, but was a consequence of the entry of when the plasmid transferred horizontally into a new population
the conjugative plasmid inside the recipient cell. (Figure 5). Untranscribed regions (oriT), or plasmid genes that were
not under the control of a negative regulator (dhfR), did not show
Discussion similar increases (Figure 5). This indicates that the observed effect
is not due to conjugation increasing the abundance of plasmid
The intensity of HGT in the microbial world, and the molecules within the population. Moreover, given that the
prevalence of plasmids in nature indicate that plasmids are conjugative mix contained a 50% ratio of donor/recipient cells,
successful in colonizing microbial populations. Yet multilevel the maximal increase that conjugation could cause is 2-fold. The

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Figure 6. Transconjugants experience a growth deficit immediately after conjugation. (A) Generation times (in minutes) of E.coli Bw27783
with or without plasmid R388. Results represent the average and standard deviation of 12 experiments. (B)Scheme showing the experimental design
to test the effect of plasmid conjugation in early transconjugants. Donor and recipient cells were grown in LB broth in the presence of selective
antibiotics and mixed in 1:1 conjugations on LB-Agar. Conjugation was allowed to take place for 30 minutes and cells were resuspended in fresh LB.
Plate counting was used to determine de number of donors (D) recipients (R) and transconjugants (Tc). (C) Results of the competition experiments
between D, R and Tc cells. (Left panel) Absolute numbers (cells/ml) of each species along the time course of the experiment. Each data point was
measured by triplicate. (Right panel) Proportion of plasmid containing cells that are transconjugants along the time course of the experiment. Since
plasmid R388 does not conjugate in liquid media, all variations in the relative proportions of Tc cells to D and R cells must be due to differences in
growth. Results show a decrease in the relative abundance of Tc cells compared to D cells, that recovers after t = 90 minutes. The lower bars indicate
the apparent generation times for each cell type calculated from data shown on the left panel.
doi:10.1371/journal.pgen.1004171.g006
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 Negative Feedback in Horizontal Gene Transfer

increase of mRNA abundance was not due to cell growth either, compete with its neighbours [9], and thus the plasmid experiences
since results were normalized by the increase experienced by a lower vertical transmission rates. Although both selection processes
constitutively expressed chromosomal gene (dxs). Gene dxs showed are intrinsically in conflict, the timescales involved in each of them
a maximal increase of 2-fold, indicating that cell growth is a minor are different. The decrease on host fitness imposed by the plasmid
contributor to the observed bursts in mRNA levels. These results metabolic burden is usually low (% in the case of plasmid R388),
cannot be considered absolute quantifications of the transcrip- meaning that intercellular selection acts by the accumulation of
tional overshooting, because our measurements involved entire small fitness deficits over long periods of time [5,6,8]. On the other
populations (which contained donor and recipient cells), and hand, intracellular selection is more pronounced in the initial
bacterial conjugation is an asynchronous process. However, stages of infection, since a cell that has received the plasmid is still
although our quantitative results might be blurred by population susceptible to superinfection until the surface exclusion systems
effects, the general trend predicted by theory and simulations was have been deployed [9] [47]. Therefore, it is in the interest of the
sound: those promoted that showed higher gains also showed the first plasmid that enters into a cell to block the entrance of other
higher overshoots. plasmid copies, and to reach the steady-state copy number as soon
Plasmids are known to produce fitness deficits on their hosts. as possible. Transcriptional overshooting after HGT would allow
This effect has been usually ascribed to the metabolic burden the plasmid to produce a vigorous transcriptional response when
imposed by expression of plasmid genes. Therefore, any increase intracellular selection is more acute. The transient nature of this
in expression levels caused by transient overshooting might have response would guarantee that the long-term effects on intercel-
its counterpart in the growth rate of the host cell. We measured the lular selection are minimized. Indeed competition experiments
growth rates of newly formed transconjugants and found that the showed that, despite the severe initial effect on the host growth
plasmid induced a deficit that was transitorily high (250% increase rate, transconjugants recovered quickly and were able to achieve
in generation time), relaxing later to a 17% increase compared to the same number of cell divisions as the original donors. Note also
plasmid free cells. This was not caused by any physical damage that since transconjugants are able to act as donors, conjugation
produced by the mechanism of conjugation, and correlates in time results in an infectious process that proceeds geometrically in the
with the induction of plasmid genes after transfer. Altogether, population. If overexpression of conjugative functions results in
these results strongly suggest that overshooting after HGT has a increased transfer efficiency, a transient overshoot would provide
measurable impact on the host growth rate. Although this kind of the invading plasmids with higher infectivity. This property will be
effect has been traditionally ascribed to metabolic burden, it is also maintained as long as new cells are infected. If the availability of
possible that the toxic effects of specific plasmid proteins could possible receptors decreases, the overshoot transient nature
contribute. Since the growth deficit roughly corresponds to the guarantees that the plasmid population relaxes to a ‘‘silent’’ state,
time of overshoot decay (figure 5 and figure 6C) the most plausible minimizing the burden on the host and improving vertical
explanation is that growth deficit be caused by the transcription/ transmission. Such a mechanism would provide the plasmid
translation of the plasmid genes. This would also explain why, population with a mechanism to switch from horizontal to vertical
when the recipient cells recover, they grow as fast as recipient cells reproduction modes depending on the availability of susceptible
for a few generations. receptors. Other lines of evidence also point to this possibility. The
One intriguing question then is why has the plasmid evolved a stbABC operon of plasmid R388 has been shown to balance the
network based exclusively on NFLs, when this motif is likely to requirements for vegetative stability and conjugative transfer [23]
overshoot after conjugative transfer, temporarily hampering the The fact that transient overshooting is linked to genome
host growth rate? Other broad host range plasmids show rebooting is also interesting from a synthetic biology perspective.
convergent architectures, suggesting that despite this temporary Plasmids are nature counterparts of genomic transplantations. In
fitness deficit, negative feedback might have some adaptive fact, they can be considered as genetic devices for the unidirec-
property for the plasmid lifestyle. Indeed, negative feedback has tional injection of genomes into suitable recipient cells. So far,
been shown to exhibit a number of adaptive properties, speeding efforts to transplant whole chromosomes have been restricted to
up the response time of sensory regulatory networks [27], reducing species that share a high degree of genomic identity [48]. A close
transcriptional noise [42,43], driving noise to higher frequencies phylogenetic relationship implies that the regulatory networks of
and allowing easier filtering [44]. Speeding up the response is a both species might show some cross-reactivity, which could be
property associated to sensory systems, and so far the plasmid necessary to control the transplanted chromosome until it has built
network has not shown responses to any specific signals. Noise up its own regulatory system. Distantly related species, however,
control might be more interesting for plasmids, given that plasmid might show no cross-reactivity between their regulatory networks.
replication is extremely sensitive to fluctuations [45,46]. However Broad host conjugative plasmids are able to invade a wide variety
this problem is restricted mainly to replication, and does not of distantly related species. If we want to expand the range of
explain why the same regulatory strategy is widespread in the possible transplants, we need to deal with problems identical to
entire plasmid backbone. those faced by conjugative plasmids. In particular, how can a
It is also possible that transient overshooting provides an genome start up from just DNA and the transcriptional/
adaptive benefit for the particular lifestyle of conjugative plasmids. translational machinery? Negative regulation, with high feedback
Plasmids spread horizontally, by invading new cells, and vertically, gains and transient overshooting might be the solution evolved by
as the host cell reproduces. Like many other parasites that share natural plasmids.
this double reproductive strategy, plasmids suffer from opposing
selective forces, summarized in the observation that increased Materials and Methods
infectivity usually results in increased virulence. This inverse
relationship is well known in plasmids and phages [30,31,32], and Promoter library construction
if a given plasmid increases the expression levels of its own plasmid Strains used were Escherichia coli C41 (ompT hsdSB (rB2 mB2) gal
products (especially those that are cis-acting), it would also increase dcm (DE3)), E. coli Bw27783 (lacIqrrnB3 DlacZ4787 hsdR514
its intracellular fitness, at the cost of penalizing the host [9]. D(araBAD)567 D(rhaBAD)568 D(araFGH) W(DaraEp PCP8-araE))
Penalizing the host, in turn, decreases the ability of the host cell to [49] and E. coli JM109 (recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17, supE44,

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relA1, D(lac-proAB)/F9 [traD36, proAB+, lacIq, lacZDM15]) Primer harvested at OD600 = 0.5 and RNA was extracted using
oligonucleotides (Supporting table S2) were designed to flank each RNAEasy kit (Quiagen). Total RNA concentration was quantified
R388 intergenic region longer than 30 bp, according to R388 using Experion RNA StdSens Analysis kit (Biorad). cDNA was
genomic sequence (Genbank accession number BR000038) and obtained by reverse transcriptase (Omniscript, Qiagen) and the
purchased from Sigma. R388 plasmid DNA was extracted using relative concentration of the target genes was determined by
Sigma GenElute Miniprep kit and used as template for PCR qPCR (ICycler, Biorad) using the IQ SYBR Green Supermix kit
amplification. PCR amplification was carried out with Vent DNA (Biorad). To determine the cDNA abundance, the threshold cycle
polymerase (Biolabs) and consisted of 95uC for 10 min, then 28 (Ct) was determined using the ICycler software. A total of 66
cycles of 95uC for 30 s, 55uC for 30 s, 72uC for 30 s and a final primer pairs were manually designed to cover the entire genome of
step of 72uC for 5 min. PCR products were digested with XhoI and the plasmid, and the efficiency of each primer pair was determined
BamHI at 37uC for 2 h and the products purified using QIAquick measuring the Ct obtained from 3 different DNA concentrations
Gel Extraction Kit (Qiagen). Digested and purified fragments were (2.5, 5 and 10 ng). The sequence and efficiencies of each primer is
ligated into pUA66 plasmid DNA using T4 ligase (Roche) with shown in Supporting table S2. cDNA reactions were performed
overnight incubation at 16uC. Transformation was accomplished from 300 ng total RNA concentration and results were normalized
by electroporation into Bw27783 strain. Transformants were by the Ct obtained from 5 ng of plasmid DNA purified by alkaline
selected in LB-agar plates containing 25 mg/ml kanamycin. lysis.
Positive colonies were detected by PCR using pZE0.5 and
pZE0.6 primers. DNA from positive colonies was extracted and RT-qPCR measurements of gene expression during
insertions sequenced using the same primers as above. The set of conjugation
reporter plasmids obtained is indicated in Supporting table S2. To determine the relative expression of plasmid genes during
Plasmid R388 was transferred to the reporter strains by conjugation, 1 ml samples of donor (E.coli Bw27783 +R388
conjugation. Donor bacteria were E. coli JM109 containing plasmid) and recipient (E.coli Bw27783) cultures were mixed in a
plasmid R388 and recipient bacteria were E. coli BW27783 1:1 ratio, pelleted and resuspended in 100 l of fresh LB. Cells were
containing the corresponding reporter plasmid. Conjugations were then spread on LB-Agar and incubated at 37C for 30, 60 or
carried out as previously described [50]. 90 min. After each conjugation period, cells were resuspended in
2 ml of fresh LB and total RNA was extracted as described in the
Fluorescent expression profiling previous paragraph. Primer pairs used are shown in supporting
Transcriptional activity was determined by GFP expression table. S2 For each independent experiment measurements were
profiling as described in [51]. Reporter strains were inoculated performed in duplicate, and a total of 4 independent experiments
into enriched M9 Medium (M9 + casaminoacids 0.2%+ glycerol were performed for each time point. In order to avoid artefacts
0.5%) to which kanamycin (25 mg/ml) was added. To test the introduced by cell manipulation, the RNA concentration at time 0
effect of subinhibitory concentrations of antibiotics, we used was determined following the same manipulation procedure, but
rifampicin and chloramphenicol following the protocol described cells were immediately resuspended after being plated in LB-Agar.
in [52]. Results represent the average of at least 4 independent The relative concentration of target RNAs (r) was determined by
measurements. The S.O.S. response was induced exposing the r = E(DCt) where E is the efficiency of the primer pair, calculated as
cells to 5 or 10 seconds of UV light (254 nm, 15W). Mitomycin C in [21], and DCt = CtT = t2CtT = 0. Results were normalized to the
was used at a final concentration of 5 mg/ml. increase experienced by a chromosomal gene (dxs) using the DCt
method, where DCt = (CtT = t2CtT = 0)probe [21]. Relative error
Effects of regulatory proteins was propagated using the standard propagated error formula. For
Selected R388 ORFs containing potential transcriptional the relative amount of a test mRNA (Ct) with respect to a given
regulators were PCR amplified with primers indicated in table standard (Ctdxs) the aforementioned formula yields sx/,x.
S1. The resulting DNA segments were cloned in plasmid pET3a = ln(2) (var(Ct)+var(Ctdxs)22cov(Ct,Ctdxs))22 , where var stands for
(Addgene). The genetic manipulation techniques were the same as the variance and cov for the covariance. The statistical significance
those described above, except that NdeI and BamHI restriction was ascertained using a one handed t test.
endonucleases were used for cloning PCR products in pET3a
expression vector. After transforming to Escherichia coli C41 strain, Competition after conjugation experiments
protein expression was induced by adding 0.1 mM IPTG to Two spontaneous mutants resistant to rifampicin and nalidixic
exponentially growing cultures and visualized by denaturing acid from E.coli Bw27783 were obtained by plating in selective
polyacrylamide gel electrophoresis (data not shown). Then each antibiotics. The stability of the mutation was tested and the strains
gene was subcloned in plasmid pBAD33 using XbaI-Hind III were used as donor/recipients in conjugation experiments.
endonucleases. Plasmids obtained (table S2) were transformed to Growth rates were determined from cells growing in LB broth
E. coli Bw27783 containing the corresponding reporter plasmids at 37 C with agitation, and results showed that both strains had
for further analysis. To determine the effect of potential regulatory indistinguishable division times in such conditions (n = 12). In
proteins, pAR expression plasmids (Supporting table S2) were order to measure the growth rate of donor, recipient transconju-
transformed into E. coli Bw27783 containing the corresponding gant cells, we performed conjugations for t = 30 minutes. Saturat-
reporter plasmid. Protein expression was induced by adding ed cultures, grown overnight in LB at 37C, were and diluted 1/
appropriate concentrations of arabinose [51] to M9-broth and 1000 in fresh LB until cells reached an OD600 of 0.1. Donor and
fluorescence per OD unit (GFP/OD) was determined and recipient cells were mixed in a 1:1 ratio and concentrated 1000
compared to that produced by the same reporter strain when times. A total of 15 microliters were deposited onto a LB agar plate
containing the empty expression vector pBAD33. and let at 37C for 30 minutes to allow plasmid transfer. Cells were
then resuspended in 3 ml of LB broth and allowed to grow at 37C
Quantification of mRNA levels with agitation. Time samples were obtained every 30 min, and
Total RNA was extracted from E.coli Bw27783 containing cells were diluted in 16PBS to count the number of donor,
plasmid R388 and grown in LB media at 37C. Cells were recipients and transconjugants by plating in selective antibiotics.

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 Negative Feedback in Horizontal Gene Transfer

Plating of early time points was performed 30 minutes after PBS expression profiles obtained with a co residing pAR13 vector
resuspension, to allow the antibiotic markers to express to (pBAD33::korA). Although PkorB fluorescence levels decreased in
adequate levels. We checked that this treatment did not artificially response to KorA the profile is not shown since the difference was
increased the number of cells due to growth in the PBS dilution. not statistically significant. C) Expression profiles of cultures
We plated dilutions from 1021 to 1026. The error introduced by containing Pint and Pant reporter vectors alone (black lines) and
the dilution was measured obtaining values typically around in the presence of R388 (red lines). Data shown represents the
cv = 0.1–0.2. This error was propagated to the actual number of average of at least four independent experiments.
cells and accounts for most of the variability observed in the (DOCX)
results.
Figure S3 Effects of sub-inhibitory concentrations of rifampicin
on plasmid promoters. (A) Expression profiles of plasmid R388
Computational analysis promoters, measured as described in Materials and Methods, in
Numerical integration of the ODE system was performed in the presence of rifampicin 3 mg/ml. Rifampicin produced a
Matlab (Mathworks) using the ODE23 algorithm. ODE23 is a general decrease in GFP/OD levels, either in the presence or the
Runge-Kutta algorithm with automatic step size. The absolute absence of plasmid R388. (B) Effect of rifampicin 3 mg/ml on
and relative tolerances were set at 10210 , tspan = 1000. bacterial growth rate. Growth curves were determined measuring
OD600 at different time points. The upper panel shows the
Supporting Information complete growth curve in a linear scale. The lower panel shows
the exponential growth phase in a semi-logarithmic scale. As
Figure S1 Expression profiles of the replication and mainte-
shown by the figure, rifampicin 3 mg/ml produced no detectable
nance promoters in the presence or absence of their transcriptional
effect on the growth rate, while the presence of plasmid R388
regulators. Each panel shows the expression profile of the reporter
decreased it significantly.
plasmid indicated above the panel (cloned promoter indicated in
(DOCX)
brackets). Expression profiles correspond to promoter alone (black
lines), in the presence of plasmid R388 (red lines), or when Figure S4 Effects of SOS response on plasmid promoters.
different regulators are expressed from a co residing pBAD33 Charts show the GFP/OD values achieved in steady-state by the
expression vector (blue and green lines). The effect of the promoters indicated in the figure. Expression profiling was
transcriptional regulators was tested without arabinose (darker performed as described in Materials and Methods. Cells were
lines, ara 2) and with maximum arabinose induction (lighter lines, treated with uv irradiation (254 nm, 15W) for 5 or 10 seconds.
ara +). Some transcriptional regulators were found to decrease the Mitomycin C was used at a concentration of 5 mg/ml. Those
growth rate when induced above a certain threshold. To discard promoters that were induced by SOS response were marked with
effects produced by impaired growth rate we measured, for each an asterisk (*). Pint showed a clear response to S.O.S induction
regulator, the rank of arabinose concentration that did not impair either by Mitomycin C or by UV irradiation. PtrwA showed a
bacterial growth (data not shown). Therefore maximum arabinose discrete 5 fold increase when the promoter was assayed alone, but
induction stands for the maximum concentration that did not that response could not be reproduced with co-residing plasmid
produce a measurable effect on growth rate, and it is variable for R388.
each regulator (ranging from 1023 to 1024% (w/v)). A) Expression (DOCX)
profiles from PresP and PkfrA promoters and response to ResP and
Figure S5 Temperature effects on plasmid promoters. Charts
KfrA respectively. B) Expression profiles from PardC, Porf7, Pssb,
show the GFP/OD values achieved in steady-state by the
Porf12, Porf14 and PstbA promoters and response to ArdK and
promoters indicated in the figure. Expression profiling was
StbA. Data shown represents the average of at least four
performed as described in Materials and Methods. Cells were
independent experiments.
grown at 37 C overnight, then diluted 1:10000 in fresh media, and
(DOCX)
then grown at the indicated temperatures.
Figure S2 Expression profiles of conjugation region and (DOCX)
response to their transcriptional regulators. Panels show the
Figure S6 Presence of potential receptors. Expression profiles of
expression profiles (obtained as in Materials and Methods) from
plasmid R388 promoters, obtained as described in Materials and
cultures containing the reporter plasmids indicated above each
Methods. The effect of potential recipients for horizontal transfer
panel (corresponding promoter indicated in brackets). Profiles
was tested by co-culture with empty E.coli Bw27783. Cells were
obtained with the reporter plasmid alone are indicated by black
mixed at 1:1 ratio before the measurement started. To obtain the
lines and by red lines when plasmid R388 was also present. Green
same amount of GFP-producing cells, the volume of recipient-
and blue lines indicate profiles obtained in the presence of a given
containing cultures was doubled. The only effect observed was a
regulator expressed from a co residing pBAD33 expression vector.
general decrease in fluorescence signal in those cultures that
The effect of the regulators was determined both with arabinose
contained recipients. Cell quenching probably caused this
induction (lighter lines, ara+) and without (darker lines, ara2). A)
unspecific effect.
Expression profiles of PtrwA containing reporter vector and
(DOCX)
response to R388 (red line) and TrwA (blue lines). B) Expression
profiles from reporter plasmids containing PtrwH, PkorA, PkikA Figure S7 Transient overshooting in StbA/KorA Incoherent
and PkorB and response to KorA and StbA transcriptional Feed Forward Loop (IFFL). In order to test whether the transient
regulators. Black lines represent expression profiles obtained from overshooting would also happen in more complex architectures
cultures containing the corresponding reporter vectors (indicated apart from simple NFLs, we simulated the behavior of the KorA-
above each panel) and red lines indicate the profiles of the same StbA IFFL loop present in the conjugation region (Upper panel).
reporter vector in the presence of a co residing R388. Green lines The parameters were introduced according to the results depicted
show the profile obtained when expression vector pAR12 in Table S1, which indicate the order of promoter strengths
(pBAD33::stbA) was present with (light green, ara+) and without (PstbA.PtrwH.PkorA) and indicated also the relative strengths
arabinose induction (dark green, ara2). Blue lines indicate the of repression exerted by the two regulators (KStbA_PkorA ..

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 Negative Feedback in Horizontal Gene Transfer

KKorA_PkorA and KStbA_PtrwH..KKorA_PtrwH). Results shown in ratio and allowed to conjugate for 30 min at 37 C, on LB agar
the lower panel indicate that this IFFL architecture will also plates. Donors were E.coli Bw27783 Rifr containing plasmid
exhibit a transient overshoot. R388Dnic, and the mobilizable vector pSU4910 (Cmr). R388Dnic
(DOCX) encodes for the entire transfer system, but lacks the nic site needed
in cis for a DNA to be transferred by conjugation. Thus this strain
Figure S8 Growth rate deficit after horizontal gene transfer A.
is able to mobilize pSU4910 without transferring plasmid R388.
Growth rate after conjugation. (Left panel) Growth rate of
Recipients were E.coli Bw27783 Nxr. Experiments were performed
Recipients (R), Donors (D) and Transconjugants (T). Cells were
as in conjugation assays.
mixed at a 1:1 ratio and allowed to conjugate for 30 min. at 37 C,
(DOCX)
on LB agar plates. Donors were E.coli Bw27783 Rifr containing
plasmid R388, and recipients were E.coli Bw27783 Nxr. Cells Table S1 Promoter activities in the presence of plasmid R388
were then resuspended in liquid LB and allowed to grow. Cell and plasmid transcriptional regulators.
numbers were obtained by plating on appropriate antibiotic (DOCX)
combinations, as indicated in materials and methods. (Right
Table S2 Oligonucleotides and plasmids used in this study.
panel) Proportion of plasmid-containing cells that are transcon-
(XLSX)
jugants along time. The x axis indicates the timespan since cells
were taken out from conjugation mixtures. The y axis indicates the Text S1 Calculations on the Gain-Overshoot relationship.
proportion of transconjugants over plasmid-. containing cells (PDF)
(donors + transconjugants). Plasmid R388 does not conjugate in
liquid, thus any change in this proportion was due to growth Author Contributions
differences. Lower bars indicate the apparent generation times for Conceived and designed the experiments: RFL IdC CR AC FdlC.
each species, calculated from the data shown in the left panel. B. Performed the experiments: RFL IdC CR AC. Analyzed the data: RFL
Growth rate after mobilization. Growth rate of Recipients (R), IdC CR FdlC. Contributed reagents/materials/analysis tools: RFL IdC
Donors (D) and Transconjugants (T). Cells were mixed at a 1:1 CR FdlC. Wrote the paper: RFL FdlC.

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