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1. Bioinformática
Según la definición del Centro Nacional para la Información Biotecnológica “la Bioinformática”
es un campo de la ciencia que se ocupa de la adquisición, almacenamiento, procesamiento,
distribución, análisis e interpretación de información biológica, mediante la aplicación de técnicas
y herramientas procedentes de las matemáticas, la biología y la informática, con el propósito de
comprender el significado biológico de una gran variedad de datos.

Base de Datos de Secuencias Biológicas

Una base de datos biológica es una biblioteca de información sobre ciencias de la vida, recogida
de experimentos científicos, literatura publicada, tecnología de experimentación de alto
rendimiento, y análisis computacional que incluye funciones, estructura y localización (tanto
celular como cromosómica) de genes, efectos clínicos de mutaciones, así como similitudes de
secuencias y estructuras biológicas. Estas son de libre acceso, se actualizan periódicamente, son
estructuradas y poseen referencias cruzadas.
Las principales bases de datos de secuencias biológicas de nucleótidos son:

• GenBank • EMBL • DDBJ

Si bien son mantenidas por distintos organismos en distintos países, existe una coordinación entre
las distintas bases, es decir que, una secuencia enviada a cualquiera de las bases se verá reflejada
en las otras dos en aproximadamente una semana.
Estas bases de datos tienen un sistema por el cual se le asigna un Accession Number (número de
acceso) a cada secuencia única y a través de este número es posible identificar de manera
inequívoca una secuencia dada. Una típica “entrada” (hoja de datos) de cualquiera de estas bases
de datos consta de:
1. Número de acceso
2. Nombre del gen en cuestión
3. Lista de publicaciones relacionadas con el gen
4. Secuencia propiamente dicha
5. Número de “features” (características) o “anotaciones” que pueden ser útiles al lector.
Para acceder a la información de estas bases de datos, las dos herramientas principales son SRS
(EMBL) y ENTREZ (GenBank), dos portales web que nos permiten hacer búsquedas en estas
bases de datos y encontrar secuencias que sean de interés
De manera similar, las principales bases de datos de secuencias proteicas son tres:

• TREMBL: incluye la traducción de todas las secuencias codificantes derivadas del

EMBL que todavía no han podido ser anotadas en Swissprot.
• PIR: está dividida en cuatro sub-bases que tienen un nivel de anotación decreciente.
• Swissprot: contiene secuencias anotadas o comentadas, es decir, cada secuencia ha sido
revisada, documentada y enlazada a otras bases de datos.
Las tres se combinan para formar Uniprot, la cual es una base de datos central de proteínas a nivel
mundial y contiene información “curada” manualmente (revisada y corregida de manera manual
luego de una predicción bioinformática automatizada).
Las bases de datos proteicas suelen contener más información y predicciones bioinformáticas que
las bases de datos de secuencias de ácidos nucleicos. También contienen gran cantidad de

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referencias cruzadas con otras bases de datos proteicas y clasificaciones de las proteínas en
familias, así como referencias cruzadas con bases de datos especializadas.
También existen bases de datos cuyas secuencias corresponden a un solo genoma, y son
extremadamente útiles si necesitamos realizar una búsqueda relacionada solo con un organismo.

Bases de Datos Especializadas

Las principales que se pueden nombrar son las bases de datos que acumulan información sobre
“dominios” proteicos, es decir, porciones de secuencia proteica que tienden a cumplir una misma
función, aunque su estructura y secuencia varíen ligeramente entre diferentes proteínas que lo
contengan. Entre las cuales podemos nombrar a PFAM, PRINTS y SMART. Una base de datos
que acumula la información de todas ellas en conjunto y nos permite alimentar una secuencia que
será analizada por todas estas bases de datos en busca de dominios conservados es llamada
INTERPRO.
Otra sección importante de las bases de datos especializadas es aquellas que intentan clasificar
y/o ubicar cada proteína en mapas bioquímicos.
Un tipo de base de datos cuyo crecimiento es cada vez más acelerado e importante es la de
estructuras tridimensionales de proteínas, resueltas por cristalografía de rayos x o por resonancia
magnética nuclear.

Formato de Secuencias
Los principales formatos de secuencias “flat” o “plain text” (solo texto) que son necesarios
conocer son:
o FASTA: consta de una primera línea donde se observa el carácter “>” que indica el
comienzo de una “entrada”, el accession number y el nombre de la secuencia, y a partir
de la segunda línea solo se observa la secuencia.
o NCBI: al principio de cada línea se observa la posición que ocupa el primer
aminoácido/nucleótido de esa línea con respecto al comienzo del gen y estos se
encuentran agrupados en columnas de a diez.
Aunque el formato NCBI puede ser más fácil de visualizar para el ojo humano, la mayoría de los
programas bioinformáticos utilizan secuencias en formato FASTA.

Alineamiento de Secuencias
Un alineamiento de secuencias es una forma de representar y comparar dos o más secuencias o
cadenas de ADN, ARN o estructuras primarias proteicas para resaltar sus zonas de similitud, que
podrían indicar relaciones funcionales o evolutivas entre los genes o proteínas consultados. Las
secuencias alineadas se escriben con las letras en filas de una matriz en las que, si es necesario,
se insertan espacios o gaps para que las zonas con idéntica o similar estructura se alineen.
Generalmente son creados por programas bioinformáticos, aunque algunos alineamientos
requieren “curación” manual.
A partir de esto se pueden obtener secuencias homologas. La homología es la relación que existe
entre dos partes orgánicas diferentes cuando sus determinantes genéticos tienen el mismo origen
evolutivo. Y de esto podemos encontrar:

− Genes Ortólogos: dos genes homólogos que son semejantes por pertenecer a dos especies
que tienen un antepasado común. generalmente los genes ortólogos cumplen funciones
equivalentes. Son producto de la especiación.

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− Genes Parálogos: dos genes homólogos que son semejantes por pertenecer a dos especies
que tienen un antepasado común, pero una de estas especies sufrió una fuerte presión
evolutiva para mutar duplicándose y cambiando su función.

BLAST
Es un programa que utiliza algoritmos matemáticos para buscar de manera rápida y eficiente
alineamientos entre la secuencia “query” que nosotros suministramos al programa y una base de
datos de secuencias. Esto no significa que todas las secuencias que obtenemos como resultado de
un blast son ortólogos o parálogos a la secuencia ingresada.
El programa funciona tanto con secuencias nucleotídicas (BLASTn) como con secuencias
proteicas (BLASTp). Excepto para realizar finos análisis genéticos, siempre se usa BLASTp
porque es de mayor utilidad y más fácil interpretación, además de que, al comparar organismos
distantes en el sentido evolutivo, las mutaciones sin sentido disminuyen las similitudes a nivel
nucleotídico, pero no afectan el nivel de homología proteico.
Este programa contiene una serie de datos:

• Score (puntaje): es un valor normalizado y comparable que nos dice cuan “bueno” es ese
alineamiento.
• Expect Value (valor de probabilidad): es la probabilidad de que el alineamiento sea
solamente producto del azar, y no de una verdadera homología entre las dos secuencias.
Por regla general un resultado se considera significativo si el valor de expect es igual o
menor a 0.001, es decir, mientras menor es el valor de expect, más significativa es la
homología entre la secuencia ingresada y la secuencia resultado.
• Identities (identidades): porcentaje de aminoácidos o nucleótidos exactamente iguales en
la secuencia “query” y en la secuencia “subject” (secuencia que nos arroja como
resultado).
• Positives (positivos): porcentaje de aminoácidos exactamente iguales en ambas
secuencias sumados a los aminoácidos de características fisicoquímicas similares.
• Gaps (espacios vacíos): mientras mayor es el número de gaps y mientras más largos sean,
menor es la significancia biológica del resultado.

Bancos de Publicaciones
Las diferentes revistas científicas se han agrupado en varios bancos que facilitan encontrar la
información que cada investigador necesite, y en ellos se encuentran clasificadas por temática,
tipo de revista, o autor entre otros, lo que unido a poderosos buscadores facilita enormemente su
manejo. algunos permiten acceder a sus publicaciones después de 6 meses sin restricción, pero
otros solicitan un pago por artículo. PUBMED es el banco de publicaciones del NCBI.

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2. PCR y RT-PCR
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Es la síntesis in vitro de secuencias específicas de ADN por medio de la polimerización en cadena
de nucleótidos, para así obtener muchas copias de un fragmento de ADN. Se caracteriza por ser
simple, rápida, especifica y sensible, es decir, se necesita muy poca cantidad de molde.

Ingredientes
✓ ADN molde: puede ser ADN monocatenario (ADNss), bicatenario (ADNds), lineal, circular
o cerrado (menos efectivo).
✓ Cebador o Primer: son muy importantes porque dan la eficiencia y especificidad al proceso,
ya que delimitan la porción de ADN a amplificar. Primero tenemos que saber la secuencia
que va a tener, la cual la podemos sacar de programas de computación, o si bien la
queremos hacer nosotros mismos tenemos que tener en cuenta varias cosas:
o Longitud entre 18 y 24 pb (mayor innecesario y menor poca especificidad).
o Ambos tienen que tener una temperatura de hibridación similar.
o C-G= 50% y A-T=50%.
o Extremos con bases G o C
o Extremo 3´ libre de estructura secundaria.
o Evitar secuencias repetidas y complementariedad entre las bases de los primers
(para que no se unan entre ellos, dando dímeros).
✓ ADN polimerasa: son utilizadas las termoestables porque resisten los cambios de
temperatura.
✓ dNTP´s: los cuatro tipos deben ser agregados en cantidades iguales.
✓ Buffer: para poder asemejar las condiciones en que se da la replicación en la célula.
✓ Sales: que contengan el ion Mg, necesario como cofactor de la enzima ADN polimerasa.
✓ Termociclador: aparato que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de
forma exacta.

Procedimiento
Un ciclo consta de tres etapas:
1. Desnaturalización: se calienta el ADN molde hasta la separación de las dos hebras. La
temperatura de fusión (Tm) es la temperatura a la cual la mitad del ADN este desnaturalizado,
y es directamente proporcional a la longitud y cantidad de C-G que tenga el ADN molde. La
temperatura suele ser entre 93-97° y el tiempo es de un minuto.
Formula de Wallace
De todas maneras, en el primer ciclo se busca alargar este paso a
cinco minutos para asegurarse de que el 100% del ADN molde se Tm= 4 (G+C) + 2 (T+A)
haya desnaturalizado, y así evitar errores.
2. Hibridación: se disminuye la temperatura para lograr que los cebadores se unan a las zonas
3´ complementarias específicos del fragmento de interés. La temperatura óptima de
hibridación (T° annealing) debe ser aproximadamente 5 °C menor que la Tm calculada para
los primers. Si la temperatura es muy alta el primer no se pega directamente, y si es muy baja
voy a forzarlo a que se pegue en cualquier parte, quitándole la especificidad. El extremo
5´puede quedar colgando, en cambio, el extremo 3´tiene que estar bien pegado, porque censa
a la polimerasa para unirse.
3. Elongación o Extensión: se busca una temperatura adecuada para que la ADN polimerasa
incorpore los desoxinucleotidos fosfatos a la nueva cadena en dirección 5’ a 3’, por lo general
es una temperatura mayor (72°), si es más alta desnaturaliza la enzima y si es más baja

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disminuye su actividad. El tiempo se estima que es 1 minuto por 1000 pares de bases. Al
último de los ciclos se busca alargar este paso a unos cinco minutos para asegurar que no
queden cadenas incompletas
Este ciclo debe repetir entre 30 y 35 veces. A mayores ciclos el crecimiento exponencial del ADN
se detiene, y entra en un estado de meseta, en donde no se aumenta el número de ADN porque se
acabaron los reactivos o porque los ADN se empiezan a aparear entre ellos. También puede hacer
que los primers se peguen mal, lo que genera amplificación de productos no deseados.
Hay que tener en cuenta que, durante el segundo ciclo de síntesis, estas cadenas hijas servirán a
su vez como moldes, generándose en este caso fragmentos cuyo tamaño será el del fragmento que
engloba los extremos de ambos primers. Estas nuevas cadenas hijas servirán de molde a su vez
para sucesivos ciclos de síntesis. La cantidad de estos “productos cortos” se duplica con cada
ciclo, por lo que se van acumulando de forma exponencial. Los productos largos se desprecian.
La detección del producto de la Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza normalmente
mediante una corrida electroforética. Si no aparece ninguna banda es porque la PCR no se dio,
por falta de reactivos o por temperatura de hibridación alta que imposibilito el pegamiento de los
primers, en este caso entonces se baja la temperatura. Si salen varias bandas es porque se
amplificaron varios productos, porque los primers se pegaron en cualquier lado, entonces en este
caso se sube la temperatura de hibridación.
En este proceso pueden producirse errores durante la polimerización del ADN o puede
contaminarse la muestre, por lo que es necesario siempre hacer controles:
o Control Negativo: consiste en poner todos los reactivos de la PCR pero sin el molde, por
ende, no me tendría que dar ninguna banda en electroforesis. Si me da alguna banda es porque
hubo algún tipo de contaminación.
o Control Positivo: consiste en poner todos los reactivos, pero como molde pongo una muestra
que si o si tendría que dar positivo. Si da negativo es porque me falto poner algún reactivo.

Aplicaciones
− Detección de agentes infecciosos.
− Huella genética o dactilares.
− Amplificación de microsatélites o STRs o repeticiones cortas en tándem: son repeticiones
aleatorias de pares de bases de cromosomas que heredamos de nuestros padres.
− Diagnóstico de enfermedades hereditarias.
− Clonación de genes.
− Mutagénesis dirigida (cambios en la información contenida a través de cebadores con
mutaciones)
− Análisis de ADN fósil.
− Genotipo de mutaciones específicas
− Genoma Humano.

Transcripción Reversa – Reacción en Cadena de la Polimerasa

La RT-PCR permite la amplificación de una cantidad pequeña de moléculas diana de ARN
(mRNA o ARN total) con gran especificidad, mediante la transcripción reversa del ARN a ADN,
que es posteriormente amplificado por PCR. Primero se utilizan transcriptasas reversas
termoestables, que transforman el ARN a ADN. En general, la transcripción reversa se logra en
unos 30 minutos a 60° C.

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3. Manipulación de Ácidos Nucleicos

Las procariotas no poseen la maquinaria capaz de reconocer y procesar intrones, por lo que va a
transformar en proteína a todo el mensaje incluido los intrones, generando así una proteína
defectuosa. Por esto es que no nos sirve un ADN o ARN inmaduro, siempre se usa ARN maduro.

Purificación de ARN
Cualquier técnica de purificación de ARN se basa en la rápida inactivación de las ribonucleasas
(ARNasas), porque si no se degrada el ADN. La técnica que se verá, utiliza el reactivo trizol que
purifica todos los ARN: ARNr (80 85%), ARNt (10%) y ARNm (1-5%).
1. Obtención del tejido: se sacrifica el animal y se extrae el tejido que posee las células que
demuestren el tipo de ARNm que deseamos, y lo colocamos en un recipiente adecuado.
2. Homogenizado químico en trizol: el trizol está formado por dos reactivos. Uno es el tiocianato
de guandino, que es un agente caotrópico y desnaturalizante que actúa rompiendo la estructura
que adoptan ciertas moléculas (proteínas y lípidos) en el solvente, por ende, rompe
membranas celulares y enzimas (ARNasas). El otro componente es el fenol que es un
compuesto no polar que ayuda a la separación de ARN de ADN. El pH en el cual se trabaja
depende de lo que queremos aislar, si es ADN tiene que ser neutro, y si es ARN tiene que ser
acido. En este caso trabajamos en un pH de 4,5, el cual genera que en el medio haya muchos
protones que buscan cargas negativas con las cuales neutralizarse. Estas cargas negativas son
los fosfatos del esqueleto carbonado de los ácidos nucleicos. El ARN al tener un OH más en
el carbono 2 lo hace más soluble que el ADN. Esto genera que en nuestra muestra que
contiene dos solventes, fenol y agua (obtenida de la célula), el ARN vaya al agua y el ADN
al no ser soluble en ninguno de los dos queda aislado.
3. Separación de fases por agregado de cloroformo: el cloroformo se usa para exagerar la
separación entre las fases orgánica (fenol) y la acuosa (ARN con agua), ya que se mezcla muy
bien con el fenol, pero no con el agua. Cuando el cloroformo se mezcla con el fenol se forma
una solución mucho más densa que permite la separación de fases:
a. Fase Orgánica: lípidos, proteínas desnaturalizadas, fenol y cloroformo.
b. Interfase: ADN.
c. Fase Acuosa: agua y ARN.
4. Extracción de la fase acuosa: se busca no tocar ninguna de las otras fases para evitar arrastrar
contaminantes.
5. Precipitación del ARN con isopropanol: el isopropanol nos ayuda a separar el ARN de
posibles restos de fenol y de sales. Actúa disminuyendo la constante dieléctrica del solvente,
y el apantallamiento de cargas del agua, es decir las cargas negativas del ARN (fosfatos)
quedan expuestos y tienden a neutralizarse con cationes, por ende, se transforma en un ARN
neutro (apolar). Esto lo vuelvo insoluble en agua por lo que se empieza a unir entre sí mismo,
volviéndose tan grande que termina precipitando. Al final nos quedamos con una sustancia
seca gelatinosa que es el ARN, y un solvente que es el agua con el alcohol que es desechado.
6. Lavado del ARN con etanol: si bien el ARN no es soluble en etanol, las sales que lo
neutralizaron en el paso anterior si lo son. Entonces al disolver la muestra en etanol logramos
separar los cationes del ARN, que queda finalmente limpio por completo.
7. Resuspension del ARN en agua o buffer: se le puede agregar agua, pero no sola porque
probablemente este contaminada con ARNasas, por lo que se le pone un reactivo llamado
DEPC (dietil pirocarbonato) que se une a residuos de proteínas sobre todo las ARNasa
inactivándolas. O podemos poner un buffer con EDTA que saca los metales bivalentes
necesarios por la ARNasas.
8. Visualización de la integridad del ARN: se siembra la muestra en un gel de agarosa y se
realiza una corrida electroforética. El ARN se mueve hacia el ánodo debido a la carga negativa
que posee porque esta disuelto en un buffer neutro. Si todo salió bien, deberíamos ser capaces
de observar 2 bandas correspondientes a las subunidades 60S y 40S. El ARNm al estar en
menor cantidad no puede ser visto. Si aparece una banda como en degrade algo hicimos mal.

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Purificación del ADN Plasmídico

Los plásmidos son moléculas circulares de ADN extracromosómico bacteriano que se replican de
forma autónoma. La información genética que portan los plásmidos no es generalmente vital para
la supervivencia celular, pero puede resultar imprescindible en determinadas circunstancias
ambientales (por ejemplo, en alguna resistencia contra antibióticos). Hay distintos procedimientos
para la purificación de ADN plasmídico, aunque todos incluyen los siguientes tres pasos:
I. Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo, lo cual solo permite la división de
aquellas células que llevan el plásmido.
II. Lisis de las bacterias para la liberación del plásmido.
III. Purificación del DNA plasmídico.
El principal problema de la técnica de purificación es la separación del ADN plasmídico del ADN
cromosómico. En esta práctica hemos elegido el método de “lisis alcalina”, por su simplicidad,
bajo costo y reproducibilidad. Este método se basa en las diferencias de las propiedades de
desnaturalización y renaturalización entre el ADN plasmídico y el ADN cromosómico. Los
plásmidos se ven menos afectados por su pequeño tamaño y estructura superenrollada.
1. Crecimiento de las bacterias
2. Centrifugación del cultivo: nos quedamos solo con las células.
3. Resuspension de las bacterias que contienen el plásmido de interés: se coloca un buffer de
resuspension adecuado a las células secas, lo que nos permite tener a las células en un
ambiente más limpio y seguro que el brindado por el medio de crecimiento para ahora si
proceder a la lisis de estas. Este buffer tiene:
a. Glucosa: para mantener la presión osmótica constante de las células y que estas no
estallen hasta que nosotros lo deseemos.
b. TRIS: actúa como buffer manteniendo constante el pH de 8 del medio hasta que
queramos modificarlo
c. EDTA: secuestra los metales bivalentes que son necesarios para el funcionamiento
de ciertas enzimas como las ADNasas, y también ayudan a desestabilizar la
membrana plasmática ya que las cabezas hidrofílicas de los fosfolípidos buscan
metales bivalentes para neutralizarse.
d. ARNasas: degrada ARN, en este caso no nos interesa
4. Lisis de las bacterias que contienen el plásmido de interés: se pone un buffer de lisis que
provoca la desnaturalización. Contiene:
a. SDS: detergente aniónico, debido a su naturaleza anfipática puede intercalarse en la
membrana celular y destruirla para luego desnaturalizar las proteínas celulares.
b. NaOH: base fuerte que rompe el apareamiento de bases entre las hebras del ADN, ya
que roba los H+ que participan en los puentes de hidrogeno.
5. Neutralización o Renaturalización: se reduce a un pH de 4.8. Esto sucede porque se le agrega
acetato de potasio que vuelve a dar los H+ al medio para la formación de puentes de
hidrógenos y su consecuente renaturalización del ADN plasmídico, Además al tener carga
positiva va y se une con el SDS que es una sal insoluble por lo tanto precipita con todo lo que
estaba unido al SDS (ADN g, proteínas lípidos). Por último, con una centrifugación
separamos lo insoluble de lo soluble (plásmido).
6. Limpieza del plásmido: todavía quedan el EDTA, ARNasas y sales que son eliminados por
el etanol.
7. Resuspension del plásmido en buffer TE.
8. Visualización de la integridad del ADN plasmídico: se siembra la muestra en un gel de
agarosa y se realiza una corrida electroforética. El ADN se mueve hacia el ánodo debió a la
carga negativa que posee porque esta disuelto en un buffer neutro. Si todo salió bien,
deberíamos ser capaces de observar solamente 2 bandas, una correspondiente al plásmido
superenrollado y otra a una configuración más larga del mismo (circular).

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4. Vectores y Sistemas de Expresión

La tecnología del ADN recombinante hace referencia a la unión de moléculas de ADN
provenientes de especies diferentes, para luego ser introducidas en un organismo hospedador,
llamada transgénico, con el objeto de producir nuevas combinaciones. La técnica de clonación de
ADN pudo desarrollarse gracias al descubrimiento de dos tipos de enzimas:

• Enzimas de Restricción: son endonucleasas que reconocen secuencias específicas del

ADN y realizan cortes entre las dos hebras de la molécula del ácido nucleico, en presencia
de un buffer adecuado. Se encuentran naturalmente en bacterias para darles inmunidad,
aunque no actúan siempre ya que existe una enzima llamada metilaza que metila la
secuencia de restricción (inactiva), para evitar que se degrade su propio ADN. En el
diseño de los primers para realizar la reacción de RT-PCR, se añaden en ambos extremos
las secuencias que son reconocidas por estas enzimas, las cuales también son utilizadas
en el corte del vector a usar.
• ADN ligasas: generalmente se obtienen del bacteriófago T4 y sirven para unir dos
fragmentos de ADN. La reacción requiere de ATP y iones Mg dando lugar a la formación
de un enlace fosfodiéster entre el grupo fosfato presente en el extremo 5´y el extremo 3,
donde se encuentra expuesto un grupo hidroxilo.

Vectores
Es el vehículo que transporta la secuencia de interés hacia la célula hospedadora y es responsable
de su replicación. Poseen cuatro características importantes:
• Replicación Autónoma: pueden replicarse independientemente a través de una secuencia
que tienen que se llama origen de replicación (ori), ricas en T y A, y son conocidas en
procariotas y levaduras únicamente. Gracias a esta secuencia nos permite que la ADN
polimerasa de la célula hospedadora reconozca ese origen y pueda unírsele, junto con los
factores de replicación, para así replicar completamente al vector.
• Sitio de Múltiple Clonado (MCS): es un segmento de ADN presente en el vector que
contiene una alta concentración de secuencias que pueden ser reconocidas por enzimas de
restricción, y que a su vez no se repiten en ningún otro lugar del vector. Esto permite tener
muchas opciones a la hora de elegir que enzimas de restricción utilizar, y a la vez limitan
que el gen de interés pueda ser introducido solamente en una región pequeña del vector y
no en cualquier sitio del mismo.
• Marcador de Selección (ATB): sirve para diferenciar células que poseen el vector de las que
no. Pueden ser genes que codifican para resistencia a antibióticos o alguna enzima que no
se encuentre en una célula normal. También es utilizado como marcador de selección la α-
complementación. Esta técnica no puede ser realizada con cualquier cepa bacteriana, tiene
que ser con una mutada que tenga dos genes, uno llamado LacZ (gen reportero) y otro
llamado LacA. La bacteria cuando convierte esos genes en proteínas, forma un dímero que
le permite a la célula transformar la beta-galactosa (incolora) en X-galactosa (azul). Nuestro
vector se mete en medio de ambos genes. Por ende, si está cargado va a inhibir la reacción
dando células incoloras, y si este vacío va a permitir la reacción dando un color azul.

Existen dos tipos de vectores. Los vectores de expresión son los que se usan para expresar la
secuencia de interés en la célula hospedadora que además de tener las características básicas de
los vectores de clonado, poseen ciertas secuencias que permiten la expresión del gen de interés,
como las secuencias promotoras. Los vectores de clonado son los que se usan para producir
grandes cantidades de la secuencia de interés, entre los cuales podemos encontrar:
➢ Plásmidos: son convenientes para clonar pequeños fragmentos de ADN (hasta 10kb). Por lo
general, portan unos cuantos genes, entre ellos aquellos que confieren resistencia a ATB, los
cuales pueden ser usados como marcadores de selección.

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➢ Bacteriófago: el λ (lambda) es uno de los más estudiados, su capacidad de transporte es de

alrededor de 40kb. Los genes involucrados en la integración al genoma no son esenciales
por lo que pueden ser reemplazados por nuestras secuencias de interés.
➢ Cósmidos: se obtienen luego de la adicción de dos secuencias COS perteneciente al fago λ
a un plásmido de clonación para E. coli, que flanquea el sitio de clonación donde pueden ser
insertados fragmentos de interés. Tiene una capacidad de transporte de aproximadamente
45kb. Además del COS, tienen un ORI y una resistencia a los antibióticos. Los mismos
deben ser empaquetados en una reacción in vitro utilizando la enzima viral encargada de
este proceso y las cubiertas víricas vacías. Se introducen en la célula bacteriana por un
proceso de infección. En el interior de la bacteria, el cósmido, adopta una forma circular y
comienza a multiplicarse al igual que un plásmido.
➢ Cromosomas Artificiales: son de gran utilidad cuando es necesario el proceso de clonación
de genes de grandes fragmentos de ADN. Los más utilizados son:
o YAC (levadura): capacidad de transporte de Mb y posee las secuencias de ADN
lineal, secuencias centroméricas, teloméricas, de autorreplicación, MCS y ATB.
o BAC (bacterias): no son realmente cromosomas artificiales, sino que están basados
en el plásmido de fertilidad la bacteria E. coli. Pueden transportar hasta 500kb de
ADN, por lo que son útiles en el proceso de secuenciación del genoma humano.
Sistema de expresión en procariotas
Se puede dar de tres maneras:
➢ Proteínas de fusión: se añaden letras que codifiquen para una etiqueta (Tag) que permita
identificar y localizar la proteína dentro de la célula y, además, poder facilitar la purificación.
➢ Proteínas secretadas que se acumulan en el periplasma o MEC: se le agrega una secuencia de
secreción para que la célula hospedadora entienda que tiene que ser secretada. Esto genera
disminución en la degradación proteica por parte de las proteasas del hospedador y un proceso
de purificación simplificado.
➢ Cuerpos de inclusión: muchas proteínas se unen y van formando un bollo que termina
precipitando. Protegen de la degradación por proteasas, pero la purificación es muy laboriosa.
Por lo general se utiliza E. coli, en sus dos formas mutadas. Una es la DH5α que es adecuada
para clonar debido a su gran eficiencia de transformación, deficiencia en enzimas de
recombinación y mutación que permite alfa complementación. Y la otra es la BL21 que es
adecuada para expresar debido a su alto nivel de expresión de genes bajo el control del promotor
T7 y deficiencia en proteasas intracelulares.
Las desventajas de expresar una proteína eucariota en una célula procariota son:

− Ausencia de modificaciones post-traducionales (conformación y actividad perjudicadas)

− Retención de Met N-terminal (estabilidad e inmunogenicidad)
− Ausencia de chaperonas apropiadas
− Preferencia de codones (eficiencia de traducción)
− Proteasas bacterianas (rendimiento)

Sistema de expresión en eucariotas

Aquí tenemos la ventaja de utilizar vectores mixtos, es decir que replican tanto en procariotas
como en eucariotas. Una vez transfectado el organismo hospedador, promotores fuertes
garantizan un alto nivel de expresión del gen de interés, proceso llamada transfección. La
expresión puede ser regulada gracias a la presencia de proteínas represoras o activadoras. La
Saccharomyces cerevisiae es una levadura que se usa mucho por bioseguridad, aunque también
se utilizan células de mamíferos (COS y CHO). Sus ventajas son:
− Simplicidad de cultivo, crecimiento rápido y bajo costo.
− Algunas bacterias sintetizadas pueden ser secretadas al espacio extracelular.
− Modificaciones postraduccionales.
− Ausencia de endotoxinas y oncogenes (bioseguridad).

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5. Transformación-Transfección
Tanto la transformación como la transfección, hace referencia a la introducción de material
genético foráneo adentro de una célula hospedadora. La diferencia es que la transformación es
para células procariotas y levaduras, y la transfección es para células eucariotas superiores. Ambas
tienen múltiples aplicaciones como:

− Expresión de proteínas para su purificación y estudio de su efecto en el fenotipo celular.

− Estudio de promotores y elementos regulatorios.
− Clonado.
− Terapia génica.

Transfección
Existen dos tipos:

• Transitoria: el ADN recombinante es introducido, pero sin unirse al genoma. Si bien es

bueno para producir grandes cantidades del producto de manera temporal, lo malo es que
a medida que las células se dividen el plásmido se va perdiendo, ya que no todas las
células lo heredan.
• Estable: el ADN recombinante se une al genoma de la célula huésped. Si bien pasa a la
descendencia, es un proceso muy laborioso en donde no todas las células reciben el
plásmido, por lo que 3 meses luego de la transfección se debe hacer una selección de las
células, para asegurarse de que el cultivo que crece tiene el plásmido.
Hay que tener en cuenta que la célula está cargada negativamente y, además, presenta barreras
(membranas plasmática y nuclear) y obstáculos (enzimas) que el ADN recombinante debe superar
para poder realizar una transfección exitosa. Para esto se fueron realizando distintos métodos que
buscan mejorar la eficacia del proceso y además reducir su toxicidad:

• Métodos Químicos: se utiliza un compuesto químico que condense el ADN y disminuya la

carga negativa de la célula, y así poder internalizar el plásmido por endocitosis o fusión con
la membrana plasmática. Existen varios tipos de métodos:
o Transfección mediada por agregados inorgánicos: se utiliza el fosfato de calcio, que
junto con el ADN forma un precipitado que es fácilmente endocitado por las células.
Es una técnica de bajo costo, fácil de realizar y eficaz en muchos tipos de células. Sin
embargo, carece de reproducibilidad y es toxica, ya que existen muchos factores que
pueden afectar la formación de un precipitado ideal (concentración del ADN,
temperatura y tiempo de la reacción de precipitación).
o Transfección mediada por polímeros catiónicos: consiste en mezclar el ADN con el
polímero catiónico y luego de 5 horas limpiar el medio de cultivo para evitar que la
cantidad de cationes sea citotóxica. Se suele utilizar dietilaminoetil (DEAE)-dextrano
o PEI. Esta técnica es simple, reproducible y de bajo costo, pero puede resultar toxica.
o Lipofección: se utilizan liposomas o lipoplex (con cargas +), es decir lípidos que
envuelven al ADN en una bicapa lipídica, para su posterior internalización por fusión
o endocitosis. Es la mejor técnica porque es simple, eficiente, reproducible, apta para
muchas células y de baja toxicidad, pero tiene alto costo.
• Métodos Físicos: se basan en el uso de instrumentos especializados que crean poros en las
membranas celulares permitiendo la introducción mecánica de las moléculas de ADN en el
interior de la célula. Puede ser utilizado también en transformación. Hay varias técnicas:
o Electroporación: se pone a las células y al ADN en una solución conductora, y luego
con un electroporador se descarga un pulso eléctrico que dura microsegundos. Esto

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genera poros temporales en la bicapa lipídica por donde puede ingresar el ADN.
Existen distintos factores que pueden afectar la técnica como la magnitud del campo
eléctrico aplicado, la duración del pulso eléctrico, la temperatura, la composición
iónica y la concentración y el tipo de ADN. Es aplicable a todas las células, pero tiene
altos costos, además de los riegos de causar muerte celular.
o Microinyección directa de ADN en el núcleo de células: se utiliza un microscopio
invertido con un micromanipulador, que consiste en una micropipeta de sujeción
que fija la célula y una microaguja que inyecta el ADN al núcleo. Tiene alta eficacia,
aplicación a todas las células y evita la degradación citoplasmática, pero es muy
costoso y laborioso. Se utiliza para generar animales transgénicos.
o Biolística: se basa en el bombardeo de micropartículas de oro o tungsteno que son
unidas al ADN de interés, y luego impulsadas a gran velocidad por liberación de He
o N2 a gran presión. El oro es más caro y menor eficiente, pero es menos toxico que
el tungsteno.
• Vectores Virales: se basa en virus modificados que hacen de vehículos para introducir
material genético exógeno en el núcleo de una célula. Para construirlo se modifica la cápside,
el material genético (para eliminar los elementos que causan enfermedad) y se agrega una
proteína que sirva de receptor para las células blanco. Los virus que más se han utilizado en
terapia génica como vectores han sido los retrovirus y los adenovirus, virus adenoasociados,
lentivirus, poxvirus y virus del herpes.

Transformación
Se llama células competentes a aquellas que tienen la capacidad para tomar ADN del medio, de
manera natural o artificial. Un método de generación de bacterias competentes artificiales es el
tratamiento químico con CaCl2. La membrana bacteriana es permeable al Cl, por ende, ingresan
a la célula acompañados con H2O provocando que la célula se hinche. Esta célula hinchada tiene
una membrana más débil que permite la posterior entrada del ADN. El Ca sirve para neutralizar
las cargas negativas del ADN y de la pared celular.
Luego se lleva a cabo la trasformación propiamente dicha. Para ello, el ADN de interés es
mezclado con las células y las mismas son expuestas a un aumento brusco y breve de temperatura
o choque térmico, se genera una diferencia de presión entre el medio extra e intracelular lo cual
induce la formación de poros a través de los cuales pueden ingresar las moléculas del plásmido.
Al retornar las células a la temperatura original la pared celular se vuelve a cerrar. Otra manera
de realizar la transfección es por electroporación
Para asegurarse de que los materiales estén bien, se utilizan 4 tubos con sustancias distintas:
1. Contiene el plásmido con inserto ligado
2. Contiene solo las bacterias competentes (hinchadas) con el antibiótico solamente, funciona
como un control negativo. En teoría no tiene que crecer nada, si algo crece es porque ya tenia
un gen de resistencia o porque el antibiótico que use estaba mal
3. Contiene el plásmido ligado, pero sin inserto, sirve para ver si las enzimas de restricción
funcionaron.
4. Contiene el plásmido de concentración conocida para calcular la eficiencia de transformación,
funciona como un control positivo en donde se espera encontrar muchas bacterias.
Por último, para ver que células contienen el gen se pone a prueba la α-complementación, si es
que la tiene. Sino se realiza a cada colonia bacteriana un Colony PCR, que es similar a la PCR
convencional, con la diferencia de que la desnaturalización es más larga (para lisar la célula y
evitar tener que aislar el ADN previamente). Es más rápida, fácil, específica y precisa, pero no se
sabe la secuencia específica del gen.

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6. Inducción
Los vectores de expresión se pueden dividir en dos:

• Vectores de Expresión Constitutiva: presentan componentes que aseguran la expresión de

manera continua de los productos génicos en ellos clonados, de gran utilidad para la expresión
a gran escala y de manera rápida de proteínas recombinantes.
• Vectores de Expresión Regulada: solo cuando están expuestos a un compuesto químico
llamado inductor, se expresan el gen

Inducción de expresión y preparación de muestras

El vector para la α-amilasa pancreática, es de expresión regulada ya que el gen se encuentra bajo
un tipo de regulación negativa. En este vector existe un gen que codifica constantemente la
proteína Lac I, la cual actúa uniéndose a nuestro gen de interés, impidiendo su transcripción. Para
contrarrestar el efecto de la Lac I, se agrega isopropil tiogalactosido (IPTG) el cual se une a la
proteína represora provocando la liberación de esta de nuestro gen de interés. También se puede
utilizar lactosa en vez de IPTG, pero es menos efectiva porque como la bacteria puede degradarla,
tiene que agregarse una vez que se acabe, en cambio IPTG no se degrada nunca.
Antes de agregar el IPTG, se agrega 200ml de un inductor de crecimiento para que la colonia
crezca exponencialmente. Luego, se saca solo 1 ml de esto y se lo congela (T0), y al resto se le
agrega IPTG, sacando cada hora una muestra (T1, T2 y T3). Esto sirve para saber en qué momento
hay mayor producción, lo cual no es siempre al mayor tiempo porque la producción puede ser
contrarrestada con la degradación de esta.
Hay que tener en cuenta que el vector utilizado no libera la proteína de interés al espacio
extracelular. Por ende, le agregamos a los tubos un buffer de lisis con alto contenido de
detergentes que inhibe proteasas, rompe la célula y homogeniza su contenido. Todo esto debe ser
realizado en hielo para evitar la degradación de proteínas.
Luego de realizado el proceso de homogenización de la muestra, la misma debe ser fraccionada
en dos partes, una de ellas se constituirá en la muestra a utilizar para la separación electroforética
de proteínas en geles de poliacrilamida y la fracción restante se utilizará para la purificación de la
proteína recombinante mediante cromatografía de afinidad

Electroforesis de proteínas totales y tinción para visualización de proteínas

inducidas
Se somete una muestra a electroforesis de poliacrilamida (PAGE) que separa nuestra proteína de
interés de las naturales que produce la bacteria, en función del tamaño, forma y carga. El soporte
se prepara a partir de acrilamida, que forma largas cadenas lineales determinando el tamaño del
poro, y con bisalcrilamida que va entrecruzando a las cadenas de la acrilamida.
Si a esto se le suma una electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) genera un apantallamiento
de las cargas propias de las proteínas y queda solo la carga negativa del SDS (detergente
aniónico), por ende, la separación se da solamente en función de tamaño y forma.
Si la SDS-PAGE se realiza en condiciones reductoras produce la desnaturalización y pérdida de
estructuras en las proteínas presentes en la muestra. Entonces ahora las proteínas se moverán solo
en función de su tamaño.
Por último, se tiñen las proteínas en solución de azul de coomassie. La intensidad del azul
resultante es proporcional a la cantidad de proteína presente.

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7. Purificación de Proteínas
Consiste en una serie de procesos que permiten aislar un solo tipo de proteína a partir de una
mezcla compleja. La cantidad total a purificar y el nivel de pureza dependerán del propósito.
Consta de pasos preliminares que son:

• Extracción: solubiliza las proteínas. Si estas están es el espacio intracelular o en la

membrana, tengo que romper la célula y luego solubilizar (extraer). En cambio, si la
proteína está en el medio extracelular, directamente la extraigo de ahí.
• Clarificación: elimina partículas grandes que dificultan los demás pasos. Hay dos tipos:
o Centrifugación: es la mejor porque remueve la mayor parte de materia particulada
y restos celulares. Se debe llevar a cabo en frío.
o Filtración: sirve solo para muestras pequeñas y no es tan buena porque las
proteínas de interés pueden quedar pegadas al filtro.
• Precipitación diferencial (opcional): como cada proteína tiene distintas solubilidades,
al modificar las concentraciones de sales puedo precipitar algunas.
Luego se realiza la cromatografía liquida. Esta consta de una columna de vidrio o plástico que
contiene una fase estacionaria y por encima una fase móvil inmiscible en donde se coloca la
muestra. Esta va ir bajando por la fase estacionaria produciendo la separación de las proteínas
debido a las distintas velocidades de migración que tienen, determinadas por el tiempo que
permanecen en la fase estacionaria. La afinidad por la fase estacionaria es indirectamente
proporcional a la velocidad de migración. De esta manera, una mezcla de proteínas se va
separando en distintas “bandas” según sus absorbancias, graficadas a través de un cromatograma.
Hay distintos tipos de cromatografías basadas en las distintas propiedades de separación:

• Intercambio Iónico: separa en función de la carga. Puede ser aniónica (retiene las proteínas
negativas) o catiónica (retiene las proteínas positivas), y cada una va a tener cargada la fase
estacionaria con su carga contraria para así permitir la atracción. Luego de eliminar las
proteínas que bajaron primero, las proteínas que quedaron pegadas a la fase estacionaria, se
despegan modificando el pH con un buffer (cambia la carga) o con sales (apantallan la carga).
• Interacción Hidrófoba: separa en función de la polaridad. Se pone una fase estacionaria
hidrofóbica para que así las proteínas apolares se peguen. Para despegar las proteínas tengo
que bajar las concentraciones de sales para que las fuerzas disminuyan.
• Exclusión Molecular: separa en función del tamaño o peso molecular. La fase estacionaria
es un gel con poros de distintos tamaños, de manera que las que salen primero son las más
grandes y las que salen ultimo son las más pequeñas.
• Afinidad: separa en función de la especificidad de unión. La fase estacionaria tiene un
ligando (Ni o Co) que se une únicamente a la etiqueta (Histag) de la proteína de interés, por
lo tanto, el resto pasa de largo y es eliminado. Luego se vierte una solución de elusión
(imidazol) que contiene ligandos libres para nuestra proteína, por lo que esta se despega de la
fase estacionaria y cae.
• Inmunoafinidad: separa naturalmente (sin recombinar) a través del uso de un anticuerpo en
la fase estacionaria, con su antígeno especifico (proteína de interés). Y para despegarla se
modifica el pH o las sales.
• Afinidad con unión a GST: tiene una etiqueta que es la GST, que se une a la fase estacionaria
formando un puente con la glutamina y el imidazol. Para liberarla rompo el puente.
También existen aparatos automáticos de purificación como el AKTA PURE. Luego para validar
se realiza SDS-PAGE en condiciones reductoras y se observa mediante la tinción de azul de
coomassie.

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8. Inmunidad
Los anticuerpos artificiales se generan cuando se inmuniza a un animal (inyección de un
antígeno). Pueden ser:

• Policlonales: cuando se inyecta el antígeno se genera una respuesta de muchos

anticuerpos contra los distintos epítopes.
• Monoclonales: sucede lo mismo que en la anterior, pero después nosotros tomamos solo
uno de esos anticuerpos y se lo fusiona con una célula tumoral. De esta manera tenemos
una fuente indeterminada de anticuerpos con una única especificidad

Inmunoensayo
Es un conjunto de técnicas analíticas de laboratorio que usan complejos inmunes. Se basa en
detectar la presencia e identificar la interacción entre anticuerpo y antígeno a través del etiquetado
de estos, mediante la unión covalente (conjugación) de determinadas moléculas como:
➢ Fluorocromos: absorben radiación electromagnética excitándose, y para volver a su
estado basal emiten energía en forma de luz/flúor. Es la mejor porque permite diferenciar
de acuerdo a los distintos colores, pero es muy cara.
➢ Isotopos Radioactivos: medimos radioactividad.
➢ Enzimas: utilizan un sustrato incoloro llamado cromógeno que dan como producto algún
color soluble o un precipitado.
Hay distintos mecanismos o procesos para realizar un inmunoensayo, algunos son:
1. Inmunomarcación: brinda información de la localización del antígeno al ser analizada por
microscopio, pero no la cantidad. Se debe fijar la muestra (célula o tejido), colocarla en un
portaobjetos, bloquear los sitios de unión inespecíficos y luego seguir con una de las dos
variantes:
a. Directa: incubación del antígeno con anticuerpo especifico etiquetado. Rápida.
b. Indirecta: se une el anticuerpo primario sin marcar con el antígeno, y luego se pone
el anticuerpo secundario marcado que se une al anticuerpo primario. Es más sensible
pero más cara y lenta.
2. Inmunohistoquímica en diagnóstico: análisis de biopsias de tejidos de cáncer incluido en
parafina para diferenciar tres colores, rojo, marrón y verde (anticuerpo) para diagnosticar.
3. ELISA: se usa la placa de ELISA (soporte de plástico o vidrio) la cual nos permite obtener
múltiples análisis de muestras. No sirve para localizar (por ende, no se usa microscopio), pero
si nos dice la presencia/ausencia y la cantidad de antígeno, a través de enzimas y
espectrofotometría. Tiene tres variantes:
a. Directo: se cubre la placa con la muestra donde suponemos que esta el antígeno, y se
coloca el anticuerpo primario.
b. Indirecto: se coloca en cada pocillo de la placa muestras con antígeno puro, y luego
colocamos la muestra que sospechamos que tiene anticuerpo primario. Luego se
agrega un anticuerpo secundario que detecta el anticuerpo primario. Se usa para
detectar anticuerpos contra antígenos en enfermedades infecciosas.
c. Sándwich: se pone en la placa el anticuerpo primario, luego la muestra a analizar, y
por último el anticuerpo secundario anti-antígeno marcado. Es específica y sensible.
4. Western Blot: se hace un SDS-PAGE en condiciones de reducción a la muestra. Luego se la
pasa a un soporte solido y se incuba las proteínas con el anticuerpo, que se va a unir con el
antígeno. Por último, se agrega el anticuerpo secundario marcado. Esta técnica nos permite
ver una proteína entre miles, y cuantificarla, pero no da la localización. Confirma HIV.

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5. Aglutinación: se visualiza la unión de anticuerpo- antígeno (aglutanina-aglutinógeno) a

través de la formación de grumos que son vistos a simple vista. No utiliza marcadores ni
equipamientos, pero no es cuantificable ni sensible. Hay dos tipos:
a. Activa: el antígeno particular (glóbulos rojos, parásitos, bacterias) esta recubierto en
su superficie por otro antígeno. Entonces el anticuerpo funciona como un puente entre
dos moléculas de antígeno.
b. Pasiva: se utilizan glóbulos rojos lisados, o látex. Inmoviliza el anticuerpo en la
superficie del antígeno particular.

Determinación de Factor y Grupo Sanguíneo

La membrana de los eritrocitos tiene antígenos formados por N-acetil-galactosamina, galactosa y
fucosa unidos a una ceramida si es un glicolípido, o a un resto aminoacídico si es una
glicoproteína. Este se conoce como antígeno precursor o H, al cual se le pueden agregar otras
cosas, según el gen AB0:

• Alelo A: una transferasa coloca una acetilgalactosamina al antígeno H. Da grupo

sanguíneo A con anticuerpos AntiB. Reciben sangre A o 0.
• Alelo B: se le agrega una galactosa al antígeno H. Da grupo sanguíneo B con anticuerpos
AntiA. Reciben sangre B o 0
• Alelo AB: tienen las dos anteriores. Da grupo sanguíneo AB sin anticuerpos. Reciben
cualquier tipo de sangre
• Alelo 0: no se le agrega nada al antígeno H. Da grupo sanguíneo 0 con anticuerpos AntiA
y AntiB. Dadores universales, pero solo reciben 0
Además de este antígeno, los eritrocitos pueden contener el sistema RH, que son más de 45
antígenos proteicos, de los cuales el único que se determina es el D. Si este antígeno está presente
la persona tiene sangre +, y si no lo tiene es – con anticuerpos AntiD. Por ende, los + reciben
sangre tanto – como +, pero los – solo pueden recibir -.
La eritroblastosis es una patología que se da en madres – que cursan un embarazo de un feto +, lo
que provoca que genere anticuerpos AntiD, que en su segundo embarazo puede dañar al bebe.

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