Fluorescencia

La fluorescencia es la propiedad de una sustancia para emitir luz cuando es expuesta a luz o radiaciones electromagneticas. Las radiaciones absorbidas, son transformadas en luz de una longitud de onda mayor al incidente. En el proceso, una molcula absorbe un fotn de alta energa, el cual es emitido como un fotn de baja energa (mayor longitud de onda). La diferencia de energa entre la absorcin y la emisin, es disipada como calor (vibraciones moleculares). Todo el proceso es muy corto (millonsimas de segundo) y este tiempo es la principal diferencia con otro conocido fenmeno luminoso, la fosforescencia. Las sustancias que producen este tipo de radiacin se denominan fluoritas, mientras que el fenmeno en s mismo, se debe a la presencia de materia orgnica o de iones de tierras raras. Sin embargo, en una muestra de minerales que poseen propiedades fluorescentes, no todos ellos, incluso los que se han extrado de un mismo lugar, presentan la caracterstica luminiscencia. Por otro lado existe una amplia variedad de colores, dependiendo de la longitud de onda emitida.

Ecuaciones
Fotoqumica
La fluorescencia ocurre cuando una molcula, tomo o nanostructura vuelve a su estado fundamental despus de haber estado excitada elctricamente. Excitacin: Fluorescencia (emisin) ; aqu, h es un trmino genrico para la energa del fotn con h = constante de Planck y = frecuencia de la luz. (Las frecuencias especficas de la luz excitada y emitida son dependientes en el sistema particular.) El estado S0 es llamado estado fundamental de la molcula fluorescente y S 1 es su primer estado de excitacin (electrnico). Una molcula en estado de excitacin, S1, puede relajarse por diferentes formas. Esta puede sufrir una 'relajacin no radioactiva' en la cual la energa de excitacin es disipada como calor (vibraciones) al solvente. Las molculas orgnicas excitadas tambin pueden relajarse mediante conversin a un estado triplete el cual posteriormente se relaja va fosforescencia o mediante un segundo paso no-radioactivo de relajacin. La relajacin de un estado S1 tambin puede ocurrir a travs de una interaccin con una segunda molcula mediante apagamiento fluorescente. El oxgeno molecular (O2) es muy eficiente quitando la fluorescencia debido a su inusual estado triplete fundamental. Las molculas que se excitan a travs de la absorcin de luz o por via de un proceso diferente (ej. Como el producto de una reaccin) pueden transferir energa a una segunda molcula sensibilizada, la cual es conducida a su estado de excitacin y puede entonces emitir fluorescencia.

Rendimiento cuntico
El rendimiento cuntico de fluorescencia muestra la eficiencia del proceso fluorescente. Este rendimiento es definido como la proporcin del nmero de fotones emitidos sobre el nmero de fotones absorbidos.

El mximo rendimiento cuntico de fluorescencia es 1 (100%); cada fotn absorbido resulta en un fotn emitido. Compuestos con rendimientos cunticos de 0,10 son todava considerados bastante fluorescentes. Otra forma de definir el rendimiento cuntico de fluorescencia es mediante las tasas a las cuales decae el estado de excitacin:

Donde kf es la tasa de emisin espontnea de radiacin y

k
i

es la suma de todas las tasas de decaimiento. Otras tasas de decaimiento del estado de excitacin son causadas por mecanismos diferentes a la emisin de fotones y son por lo tanto con frecuencia llamadas tasas no-radioactivas, las cuales pueden incluir:desactivacin de colisin dinmica, interaccin de campo cercano dipolo-dipolo (o Transferencia de energa de resonancia), conversin interna y paso de intersistema. Por lo tanto, si la tasa de cualquier va cambia, esto afectara tanto el tiempo de vida del estado excitado y como el rendimiento cuntico de fluorescencia. El rendimiento cuntico de fluorescencia es medido al compararlo con un estndar de cuantologa conocida; la sal de quinina, sulfato de quinina, en una solucin de cido sulfrico es un estndar comn de fluorescencia.

Tiempo de vida
El tiempo de vida de la fluorescencia se refiere al tiempo promedio que dura la molcula en su estado de excitacin antes de emitir un fotn. La fluorescencia tpicamente sigue a cintica de primer orden:

Donde es la concentracin de molculas en estado de excitacin en el tiempo t, es la concentracin inicial y es la tasa de decaimiento o el inverso del tiempo de vida de la fluorescencia. Este es un ejemplo de decaimiento exponencial. Varios procesos radiativos y no-radiativos pueden despoblar el estado excitado. En ese caso, la tasa de decaimiento total es la suma de todas las tasas: to t = rad + nrad Donde tot es la tasa de decaimiento total, rad es la tasa de decaimiento radiativo y nrad la tasa de decaimiento noradiativo. Es muy similar a una reaccin qumica de primer orden en la cual la tasa constante de primer orden es la suma de todas las tasas (un modelo cintico paralelo). Si la tasa de emisin espontnea, o cualquiera de las otras tasas son rpidas, el tiempo de vida es corto. Para compuestos fluorescentes que emitan fotones con energas desde el UV hasta el cercano infrarrojo, los tiempos tpicos de decaimiento del estado excitado se encuentran entre 0.5 a 20 nanosegundos. El tiempo de vida fluorescente es un parmetro importante para aplicaciones prcticas de la fluorescencia como transferencia de energa de resonancia.

Reglas
Existen algunas reglas que reencargan de la fluorescencia. La Regla de Kasha dicta que el rendimiento cuntico de luminiscencia es independiente de la longitud de onda de la radiacin. Esto no es siempre cierto y se contradice severamente en muchas molculas simples. Una declaracin un tanto ms confiable, aunque an con excepciones, podra ser que el espectro de fluorescencia muestra muy poca dependencia en la longitud de onda de la radiacin. El diagrama Jablonski describe la mayor parte del mecanismo de relajacin para las molculas en estado excitado.

Aplicaciones
Existen muchos compuestos naturales y sintticos que exhiben fluorescencia, y tienen un nmero de aplicaciones. Algunos animales del fondo del ocano, como los ojiverde, usan la fluorescencia.

Iluminacin
Pintura y plstico fluorescentes iluminados por luz Ultravioleta.

El comn tubo fluorescente depende de la fluorescencia. Dentro del tubo de vidrio hay un vaco parcial y una pequea cantidad de mercurio. Una descarga elctrica en el tubo causa que los tomos de mercurio emitan luz. La luz emitida se encuentra en el rango ultravioleta (UV), es invisible, e inofensiva para la mayora de los organismos vivientes. El tubo es revestido con una capa de un material fluorescente llamado fsforo, el cual absorbe la luz ultravioleta y reemite la luz visible. La iluminacin fluorescente es energticamente muy eficiente comparada con la tecnologa incandescente, pero el espectro producido puede hacer que ciertos colores no parezcan naturales. A mediados de los 90s, el diodo emisor de luz (LED) blanca estuvo disponible, el cual funciona a travs de un proceso similar. Tpicamente, el actual semiconductor emisor de luz produce luz en la parte azul del espectro, la cual choca con un compuesto fsforodepositado en el chip; el fsforo se pone fluorescente desde la parte verde hasta la parte azul del espectro. La combinacin de la luz azul que pasa a travs del fsforo y la luz emitida por el mismo produce una emisin de luz blanca. Se dice que las modernas Lmparas de vapor de mercurio del alumbrado pblico han evolucionado de la lmpara fluorescente. La Lmpara fluorescente compacta (CFL) es la misma que cualquier lmpara fluorescente tpica con ventajas. Esta es usada para reemplazar lmparas incandescentes en muchas aplicaciones. Producen un cuarto del calor por lumen como los bombillos incandescentes pero duran como cinco veces ms. Estas lmparas contienen mercurio y deben ser manejadas y dispuestas con cuidado. Las desventajas de que estas lmparas tengan un balastro es que no encajan adecuadamente en todos los aparatos de luz. Todas las lmparas fluorescentes tienen un retraso significativo al momento de ser encendidas comparadas con las lmparas incandescentes, una desventaja en algunas aplicaciones. Adicionalmente, la tecnologa que les permite ser usadas tambin reduce significativamente su vida til y su fiabilidad en aplicaciones de oscurecimiento.

Qumica analtica
La fluorescencia puede ser detectada con un detector selector de longitud de onda para encontrar compuestos presentes en una HPLC. Adems, las placas de una TLC pueden ser visualizadas si los compuestos o los reactivos de color son fluorescentes. La fluorescencia es ms efectiva cuando hay una gran proporcin de tomos en los niveles bajos de energa en una distribucin de Boltzmann. Existe entonces una mayor probabilidad que los tomos con energa baja sean excitados y liberen a su vez fotones, permitiendo as un anlisis ms eficiente. Las huellas dactilares pueden ser visualizadas con compuestos fluorescentes como ninhidrina.

Bioqumica y medicina
Las molculas biolgicas pueden ser marcadas con un grupo qumico fluorescente (fluoro cromo) mediante una reaccin qumica simple, lo cual permite una deteccin sensible y cuantitativa de la molcula. Algunos ejemplos: La microscopa de fluorescencia de tejidos, clulas o estructuras subcelulares es lograda marcando el anticuerpo con un fluorocromo y permitiendo que ste encuentre su antgeno correspondiente presente en la muestra. Al marcar varios anticuerpos con diferentes fluoro cromos se puede lograr la visualizacin de mltiples objetivos dentro de una misma imagen.

Secuenciacin automtica de ADN por el mtodo de terminacin de la cadena: cada uno de los cuatro ddNTPs se encuentra marcado con un fluorocromo especfico de tal forma que se generan cadenas de diferente longitud que al ser sometidas a una fuente de UV se puede determinar la base nitrogenada terminal de cada cadena debido a la longitud de onda emitida caracterstica de cada fluorocromo.

Gel de agarosa teido con bromuro de etidio. El bromuro de etidio se intercala en el ADN y fluoresce naranja cuando se expone a luz UV.

Deteccin de ADN: el compuesto bromuro de etidio, libre de cambiar su conformacin en solucin, tiene poca fluorescencia. La fluorescencia del bromuro de etidio se aumenta enormemente cuando se une al ADN, de tal forma que este compuesto es muy til para visualizar la localizacin de fragmentos de ADN en el mtodo de electroforesis en geles de agarosa. El bromuro de etidio puede ser txico por tanto, una alternativa ms segura es teir con SYBR Green. Microarreglos Inmunologa: los sitios de unin de un anticuerpo a un espcimen microscpico por ejemplo, pueden ser vistos, e incluso cuantificados, empleando la fluorescencia si se le ha unido previamente un grupo qumico fluorescente al anticuerpo especfico. La fluorescencia ha sido empleada para el estudio de la estructura y conformacin del ADN, as mismo como de protenas, con tcnicas como la transferencia de energa de resonancia, la cual mide distancias a nivel de angstroms. Lo anterior es especialmente importante en complejos de biomolculas mltiples. FACS (Citometra) La Protena Verde Fluorescente (GFP), de la medusa Aequorea victoria, se ha convertido en una herramienta de investigacin muy importante. GFP y otras protenas relacionadas son usadas como reporteros de un sin nmero de eventos biolgicos incluyendo aquellos de localizacin subcelular. Los niveles de expresin gnica son medidos en algunas ocasiones uniendo el gen de produccin de GFP con el gen de inters. Tambin, diversas molculas biolgicas tienen fluorescencia intrnseca y por tanto, pueden ser empleadas sin necesidad de unirlas a una etiqueta qumica. Algunas veces, esta fluorescencia intrnseca cambia cuando la molcula se encuentra en un ambiente especfico, de tal forma que la distribucin o el ligamiento de la molcula pueden ser medidos. La bilirrubina, por ejemplo, es altamente fluorescente cuando se une a la albmina srica en un sitio especfico. La protoporfirina zinc, la cual se encuentra en las clulas sanguneas cuando la produccin del grupo hemo es inhibido por la existencia de plomo o la ausencia de hierro en la sangre, tiene una fuerte fluorescencia y puede ser, por tanto, empleada para detectar estos problemas. El nmero de aplicaciones de la fluorescencia ha ido creciendo en el campo de la biomedicina, la biologa y en otras ciencias relacionadas. Los mtodos de anlisis en estos campos tambin han ido aumentando: FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FRIPS, SHRIMP or TIRF. Muchas de estas tcnicas se basan en los microscopios de fluorescencia. Los microscopios utilizan fuentes de luz de alta intensidad, usualmente lmparas de mercurio o xenn, LEDs, o lseres, para generar fluorescencia en las muestras bajo observacin. Posteriormente, los filtros pticos separan la luz excitada de la fluorescencia emitida, para permitir que sea detectada a simple vista, empleando una cmara o utilizando algn otro detector de luz como espectrgrafos, etc. Muchas investigaciones se estn llevando a cabo para mejorar la capacidad de esos microscopios, las sondas fluorescentes usadas, y las aplicaciones de las mismas. De observacin particular se encuentran los microscopios confocales, los cuales utilizan un poro para lograr secciones pticas, proporcionando una vista cuantitativa y en 3D de la muestra.

Gemologa, mineraloga, geologa y ciencias forenses

Las gemas, los minerales, las fibras y muchos otros materiales, que pueden ser encontrados en medicina forense, pueden tener una fluorescencia distintiva o pueden fluorecer diferente bajo luz utravioleta de onda corta, de onda larga, o rayos Xs: Muchos tipos de calcita y mbar presentarn fluorescencia bajo luz ultravioleta de onda corta. Los rubes, las esmeraldas y el diamante Hope exhiben fluorescencia roja bajo luz UV de onda corta; los diamantes tambin emiten luz bajo rayos Xs. El petrleo emite fluorescencia en un rango de colores, desde el marrn mate para aceites pesados y alquitrn hasta el amarillento y blanco azulado para los aceites muy livianos y condensados. Este fenmeno es usado en perforaciones hechas para la exploracin de petrleo permitiendo identificar pequeas cantidades de crudo en las perforaciones y en el centro de las muestras.

Lquidos orgnicos
Los lquidos orgnicos, como las mezclas de antraceno en benceno o tolueno en los mismos solventes, emiten fluorescencia con radiacin UV o rayos gamma. Los tiempos de decaimiento de esta fluorescencia son del orden de nanosegundos ya que la duracin de la luz depende del tiempo de vida de los estados excitados del material fluorescente, en este caso antraceno.