Biorremediación (NRC: 2010) Presentación final: Biorremediación enzimática

Integrantes: Gerardo Benavides (00211918), Dariel Salvador (00212613)

Abstract
La biorremediación con enzimas es una técnica que se basa en la extracción de enzimas de
microorganismos para degradar los contaminantes que actuarán como sustrato en el medio. Se
basa en un protocolo de cinco pasos los cuales empiezan a variar con su extracción, purificación
y posterior uso. Estas proteínas son preferidas a las células completas puesto que tienen
interacciones con su ambiente menos complejas y se puede mejorar su estabilidad con ciertos
polímeros. De hecho, se ha probado que la peroxidasa versátil bajo su encapsulación en
nanopartículas mejoró su estabilidad frente al aumento de temperaturas, degradación por
bacterias y proteasas y que conservó su actividad a pH 4 para la degradación de varios
contaminantes. También, se evaluó la eficiencia de lacasas en medios libres para degradar NOR
y CIPRO, de los cuales se degradaron 88% y 92% en los ensayos respectivamente. A pesar de
las limitaciones del uso de enzimas que recae en la ampliación de los procesos para su uso, se
especula que con el uso de microorganismos recombinantes se podrá expresar enzimas
específicas en células modelo más resistentes a las condiciones de su medio.
1. Introducción
La biorremediación es todo este cúmulo de procesos del comportamiento del elemento
microbiológico en un entorno fisiológico cambiante y sus consecuentes efectos en la
degradación de compuestos en específico (Alexander, 1999). Cuando nos referimos a la
biorremediación enzimática entonces se requiere de la comprensión de las tasas de actividad y
estabilidad de estas proteínas para la catálisis del contaminante deseado. Bajo este panorama
varias de las prácticas de biorremediación enzimática se refinan bajo cinco procesos
fundamentales: selección del microorganismo, cultivo celular, extracción enzimática,
purificación, y uso en medio libre o inmovilizado (Montiel, Carruyo, Marcano & Mavárez,
2005).
1.1 Selección de células respecto al contaminante o al sustrato
Se empieza por la revisión bibliográfica de microorganismos previamente estudiados con la
capacidad de metabolizar contaminantes específicos. Los esfuerzos actuales se centran en la
descomposición de hidrocarburos totales de petróleo, residuos de pesticidas/herbicidas,
antibióticos, colorantes y demás. Aunque, también es común la extracción de cultivos celulares
provenientes del foco de contaminación en un intento de recuperar microorganismos que
habitan en estos puntos por su metabolismo adaptado (Montiel, Carruyo, Marcano & Mavárez,
2005).
1.2 Cultivo celular
Una vez está establecido el microorganismo se establece las condiciones adecuadas en un
medio de cultivo que cuenta con: el contaminante, un sustrato seguro, ajuste de pH y
temperatura adecuados para su crecimiento. Esto puede darse en biorreactores o en cultivo de
menor escala según el conocimiento del microorganismo seleccionado (Montiel, Carruyo,
Marcano & Mavárez, 2005).
1.3 Extracción enzimática
Aquí ya empieza a diferir la práctica de cada caso, algunos se basan en la ruptura celular
mediante centrifugación o aumentos temperatura, otros en el uso de sustancias químicas que
cambian la permeabilidad celular y permiten la salida de la enzima. Según la técnica utilizada
se puede comprometer la integridad y estabilidad enzimática. No obstante, independiente de
estos métodos, la purificación de la enzima es indispensable y se realiza mediante técnicas
cromatográficas (Montiel, Carruyo, Marcano & Mavárez, 2005).
1.4 Purificación
Estas se basan en el conocimiento de la enzima tratada y se pueden enfocar según su peso
molecular, carga, interacciones hidrofóbicas. En la primera se separa las moléculas según el
tamaño cuando pasa una solución de las enzimas a través de un medio fijado poroso que
retendrá las moléculas en una especie de tamizado molecular. Las moléculas de menor tamaño
se irán filtrando a través de los poros. La segunda es la más utilizada y consiste en el uso
proteínas fijadas con carga opuesta a la molécula deseada de modo que se forman uniones
reversibles en las que se unirá únicamente la enzima con carga específica. La unión a
compuestos aniónicos o catiónicos depende netamente del pH. La tercera se basa en la
formación de uniones hidrófobas al agregar sales altamente polares lo que resulta en la
precipitación de la enzima (Deloisa, Martínez & Palomares, 2012)
1.5 Uso en medio libre o fijado
Este paso también depende del conocimiento de la enzima. Aquellas menos estudiadas se las
suspenden en soluciones junto al contaminante de interés para identificar si efectivamente
existe una reacción con el mismo bajo cierto estímulo. Luego, se procede a una caracterización
más profunda que permite entender en qué clase de matriz puede ser fijada (captura física o
química) para aumentar el tiempo de rendimiento o estabilidad en la reacción o incluso la
eficiencia (Alarcón, 2017).
2. ¿Por qué usar enzimas?
El uso de microorganismos para la remediación de contaminantes puede ser un proceso lento
que disminuye la eficiencia de este tipo de técnicas, por lo que usar enzimas separadas de la
célula puede ayudar a resolver este problema. Las enzimas pueden mejorar la velocidad de una
reacción al disminuir la energía de activación de las moléculas (Mohammadi.,et al., 2022).
Además, el uso de enzimas solo depende de conservar su actividad catalítica y no de mantener
condiciones de crecimiento celular. También se conoce que, en suelos pobres en nutrientes, la
biorremediación puede ser posible mediante el uso de una enzima purificada. Además, Los
productos secundarios tóxicos producidos por la biotransformación microbiana no se producen
mediante el uso enzimas, por lo que es más segura para el medio ambiente (Sharma, Dangi &
Shukla, 2018). En las enzimas se busca:
A) Especificidad: es decir que la enzima reconozca y degrade únicamente el contaminante
deseado.
B) Estabilidad: que sea estable en las condiciones ambientales a las que se las llevará para
degradar el contaminante.
C) Costo: que permita la viabilidad de la biorremediación al no tener costos elevados.
 D) Seguridad: que la enzima ni sus productos derivados sean tóxicos para los organismos
o el medio en donde se realice la remediación.
E) Actividad: que se trate de una enzima que tenga una alta actividad catalítica para poder
degradar el contaminante deseado.
3. Control de las condiciones fisiológicas
Las condiciones fisiológicas son importantes en un proceso de biorremediación por enzimas
de hongos debido a que se tratan de organismos que son sensibles al entorno en el que se
encuentran y necesitan de condiciones óptimas para que puedan producir las enzimas de forma
efectiva para realizar la degradación de contaminantes. En condiciones poco favorables la
biorremediación por enzimas de hongos puede ser poco efectiva. Entre las más importantes se
encuentran el pH óptimo, la temperatura y las condiciones de agitación ya que son
determinadas según la enzima seleccionada. Existen varias enzimas producidas por hongos que
son útiles para la degradación de compuestos contaminantes, entre ellas se encuentran lacasas,
celulasas, ligninasas, peroxidasas (El Enshasy, et al., 2017).
El pH utilizado para los hongos si bien es específico para cada tipo en enzima se ha encontrado
que son estables a pHs de 4 a 8. La temperatura es otro factor que considerar, la mayoría de
este tipo de hongos tienen su crecimiento ideal en temperaturas entre 20-35°C, aunque existen
casos de hongos que requieren temperaturas más altas, de entre 40-50°C para algunas celulasas.
Además, requiere de una constante condición de agitación para evitar la formación de
sedimentos entre los sustratos y las enzimas producidas. Esta permite el intercambio correcto
de nutrientes, de oxígeno y de los productos de la degradación (Zhuo & Fan, 2021).
4. Ejemplos de uso de enzimas en biorremediación
4.1 Inmovilización de peroxidasa versátil en nanopartículas de quitosano
Parte del problema de uso de enzimas es que su rendimiento en solución es muy variable y no
suele resistir las condiciones fisiológicas del medio, así que a fin de mejorar su estabilización
se han desarrollado matrices en las cuales se pueden fijar o inmovilizar.
Por ejemplo, en el estudio de (Payán, 2017) se describe el uso de nanopartículas de quitosano
como matriz fijadora y por otras propiedades como que es biodegradable, tiene baja toxicidad
y mejora la superficie de contacto. Ciertos hongos de la podredumbre blanca se han
aprovechado para biorremediación dado que sintetizan para enzimas de interés como la
peroxidasa versátil que proviene de Bjerkandera adusta, esta actúa sobre compuestos fenólicos,
colorantes industriales, ciertos compuestos farmacéuticos e hidrocarburos aromáticos
policíclicos. La cadena de reacciones por esta enzima resulta en la oxidación indirecta de varios
sustratos por la formación de Mn3+, un agente oxidante potente.
La unión de esta enzima con las nanopartículas de quitosano es posible porque esta matriz de
carga positiva captura estas proteínas con una carga negativa equivalente de modo que se
adjuntan por interacciones iónicas. Se evaluó la degradación de 17 compuestos contaminantes
por HPLC y espectrofotometría según correspondía (3 hidrocarburos aromáticos policíclicos
(HAPs), 3 plaguicidas, 2 fenoles, 4 fenoles halogenados, 2 disruptores endócrinos y 3
colorantes industriales). Además, se evaluó la estabilidad enzimática por cambios de pH,
temperatura, degradación microbiana o por proteasas.
La eficiencia de inmovilización de las peroxidasas versátiles alcanzó un aproximado del 80%
y se visualizaron las matrices de nanopartículas con microscopía electrónica para asegurar que
la fijación ocurrió. De los 17 contaminantes se pudieron degradar 13, estos casos fallidos fueron
el antraceno, fenantreno, pireno y paratión. Entre los factores limitantes de la actividad
enzimática estuvieron la concentración de glutaraldehído que es un componente entrecruzante
que interfiere con la enzima al unirse e impedir la reacción con el sustrato. Sin embargo, es un
componente esencial para la formación de las nanopartículas así que no se puede omitir su uso
ya que favorece a la estabilización de la partícula.
Se conservó la actividad enzimática en la matriz fijada con una actividad máxima a un pH
cercano a 4; la enzima fijada tuvo mayor estabilidad en su rendimiento a temperaturas más
elevadas a diferencia de la enzima libre, aunque igual se asemejan al tener una actividad
máxima a 40 °C; al pasar las enzimas a medios con aguas residuales que asemejan un entorno
más real entonces se observó que las enzimas inmovilizadas son más estables frente a la
degradación por otros microorganismos o por proteasas. En general, las enzimas libres tuvieron
mayor eficiencia en cuanto a la degradación de los contaminantes, sin embargo, su degradación
temprana hace que las nanopartículas con la peroxidasa versátil fijada sean más eficientes al
perdurar más frente a los cambios en las condiciones fisiológicas del medio con aguas
residuales que es un entorno más realista para su aplicación.
4.2 Uso de lacasa extraída de Trametes versicolor para la degradación de antibióticos
La enzima proviene del hongo de T. versicolor el cual es un hongo de pudrición blanca de la
madera, capaz de producir enzimas como lacasa y peroxidasas. Se conoce que este tipo de
enzimas son útiles para degradar compuestos orgánicos persistentes y otros residuos tóxicos
por lo que se busca conocer su capacidad degradativa de compuestos emergentes como los
antibióticos. Los contaminantes que se buscó biodegradar son los antibióticos ciproflaxina
(CIPRO) y norfloxacina (NOR), los cuales son fluoroquinoles sintéticos para tratar
enfermedades causadas por infecciones bacterianas. Su uso excesivo y eliminación incompleta
de estos contaminantes ha causado su acumulación en el ambiente y cuerpo humano, la cual se
ha presentado en la excreción de orina y heces. Estos compuestos acumularse en el vertido de
aguas residuales provenientes de hospitales, veterinarias, industrias farmacéuticas y hogares.
Puede afectar gravemente al medio ambiente al tener la capacidad de formar especies
bacterianas resistentes a este tipo de antibióticos, afectando a la vida y fauna marina y terrestre.
(Prieto, et al., 2011).
La enzima utilizada para este ejemplo de biorremediación fue la lacasa. Se ha realizado estudios
en donde se obtiene este tipo de enzimas mediante cultivos del hongo T. versicolor en un medio
de extracto de malta al 2% con un pH de 4.5 y una temperatura ambiente de 25°C. Se realizaban
subcultivos de estos hongos cada 30 días para mantener la eficacia de producción de enzimas.
Además, de esta técnica se han realizado otras experimentaciones con la inmovilización de
estas enzimas, aumentando la estabilidad de la enzima y permitiendo el continuo uso de estas
para futuras degradaciones. La lacasa puede degradar este tipo de contaminantes debido a una
oxidación en presencia de oxígeno, oxidando los grupos amino y metilo presentes en la
estructura de los antibióticos, formando radicales libres y otros productos que se degradan
posteriormente con mayor facilidad. Se confirmó mediante espectrofotométricos y
cromatográficos que en un lapso de aproximadamente 15 días se logró degradar hasta un 88%
de NOR y un 92% de CIPRO. Concluyendo que esta técnica es útil y eficiente para la
biorremediación de este tipo de contaminantes. (Prieto, et al., 2011).
4.3 Enzimas a futuro
Se espera que la extracción de las enzimas ya no tenga que venir del microorganismo original
y ni siquiera depender del mismo para su uso. Con el uso de técnicas de ingeniería genética
para la transformación de microorganismos recombinantes que expresen estas enzimas al
insertar genes específicos. Por ejemplo, (Partida & Naim, 2014) consiguieron la transformación
de Escherichia coli BL21 con los genes nahH descubiertos en Pseudomonas spp., de modo que
expresó del complejo enzimático GST para la degradación de plaguicidas organoclorados como
el DTT o el lindano. Esto sería posible puesto que estas enzimas son capaces de retirar los
cloros de estas estructuras por deshalogenación y degradaría el resto de la molécula por
desalquilación.
5. Discusión
Cuando se hacen procesos de biorremediación mediante enzimas se puede reconocer dos
principales conformaciones de las enzimas, las enzimas inmovilizadas y las enzimas en medio
libre. Aunque, siempre es requerido analizar las ventajas y desventajas que tiene cada una para
reconocer cual es el método más eficiente y rentable para este tipo de proyectos. Las enzimas
de medio libre tienen la ventaja de que son fáciles de producir y utilizar, evitando realizar
procesos adicionales para su uso. Pueden ser menos costosas por evitar gastos de
inmovilización y ser utilizadas en medios de cultivo con diferentes composiciones y
condiciones, haciéndolas más flexibles. En cuanto a las desventajas podemos encontrar que se
traten de enzimas menos resistentes a la degradación por otras enzimas o factores ambientales.
Al no tener protección adicional contra factores como temperatura y pH algunos compuestos
presentes en el medio de cultivo pueden resultar en inhibidores de la actividad enzimática o
que la enzima se vea degradada por otros microorganismos en el medio de cultivo. Por último,
una vez realizaron la biodegradación las enzimas no pueden volver a ser recogidas para
posteriores usos, gastando más y siendo menos sostenibles. Entre las ventajas para las enzimas
inmovilizadas se puede encontrar que se tratan de enzimas con protección adicional a las
condiciones climáticas en las que se encuentran, pudiendo ser reutilizadas varias veces,
reduciendo costos. Además, aumenta la estabilidad y tiempo en la que permanece activa. Son
más versátiles pues pueden soportar distintas cantidades de pH y temperaturas. Por último, la
desventaja más significativa que se encontró a las enzimas inmovilizadas es que requieren de
procesos adicionales para realizar la inmovilización, haciendo su elaboración más costosa y
dificultando su producción a gran escala (Fajardo, et al., 2011).
6. Conclusión
Los protocolos de extracción de enzimas no siguen una sola vía, todo depende del contaminante
objetivo el cual influirá en la enzima a utilizar y que requerirá de un ambiente adecuado para
conservar su estabilidad y actividad catalítica. Esto se puede solventar con técnicas modernas
de ingeniería genética que busca la transformación de microorganismos resistentes que
expresen estas enzimas específicas, sin embargo, requieren de evaluaciones de seguridad de
uso más estrictas si se planteara su uso in vitro. Por ello, mayor comprensión de las técnicas
usadas como las enzimas inmovilizadas permitirían procesos de biorremediación más
duraderos.
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