2.

Cultivo de bacterias y hongos

Objetivo general
Realizar diferentes técnicas de siembra y cultivo in vitro de bacterias y hongos; conocer
la clasificación de los medios de cultivo y describir la morfología colonial de estos
microorganismos, para desarrollar sus habilidades en el laboratorio de microbiología.

Objetivos específicos
Conocer la importancia y condiciones necesarias para el cultivo in vitro de las bacterias y
hongos.
Conocer los medios de cultivo según sus características físicas: líquido, semisólido, sólido
y duro.
Conocer algunas características específicas de los diferentes medios de cultivo y su
clasificación según su utilidad diagnóstica: básico, enriquecido, diferencial,
selectivo, de enriquecimiento, de transporte y especiales.
Realizar las técnicas de siembra en medios de cultivo líquidos, semisólidos y sólidos.
Describir la morfología colonial de bacterias y hongos considerando las siguientes
características: tiempo de crecimiento, tamaño, color, estructura interna, borde,
elevación, hemólisis; cambios en el pH y pigmentación del medio de cultivo.
Observar en los medios de cultivo diferenciales algunas reacciones metabólicas de
bacterias y hongos.

Introducción
Para realizar el estudio de los microorganismos es necesario recuperarlos del
ambiente donde se encuentren y hacer que proliferen en medios artificiales que les
proporcionen sus requerimientos nutrimentales. A este procedimiento se le conoce
como cultivo in vitro.
Tanto las bacterias como los hongos necesitan para su metabolismo la presencia de
macronutrientes y micronutrientes como fuentes de energía, fuentes de carbono,
fuentes de nitrógeno, minerales y factores de crecimiento; además de estos
nutrimentos debemos tomar en cuenta factores o agentes fisicoquímicos como
temperatura, pH, humedad relativa y atmósfera de incubación.

Nutrimentos
Fuentes de energía. Los microorganismos obtienen su energía a partir de reacciones
metabólicas de óxido-reducción; requieren de compuestos orgánicos como los
sustratos oxidables, de ellos el más comúnmente utilizado es la glucosa, y
 aceptores de hidrogeniones (H+) para generar la síntesis de ATP. Las bacterias
aerobias necesitan O2 como aceptor final de H+, mientras que las bacterias
anaerobias utilizan otros compuestos orgánicos o inorgánicos (sulfatos, nitratos)
como aceptores de H+. Todos los microorganismos utilizan fuentes de carbono (C)
y nitrógeno (N) para la síntesis de compuestos orgánicos celulares. El tipo de
sustrato requerido puede variar de un microorganismo a otro, pero en términos
generales la mayoría de los microorganismos pueden obtener N a partir del
amoniaco (NH3).
Minerales. Los microorganismos necesitan minerales que actúen como cofactores
enzimáticos en la gran diversidad biomolecular; por ejemplo, el magnesio y el
potasio son constituyentes de diversos compuestos orgánicos; el azufre está
presente en grupos sulfhídricos de muchas proteínas; el fósforo se encuentra en
los grupos fosfatos de ácidos nucleicos, ATP y de algunas coenzimas. Estos
minerales son generalmente incorporados en los medios de cultivo en forma
iónica o como sustratos inorgánicos.
Factores de crecimiento. Algunos microorganismos requieren factores de crecimiento
adicionales necesarios en su metabolismo intermediario. Por ejemplo: colesterol,
vitaminas, NAD, hemina, etc.

FACTORES FISICOQUÍMICOS.:
Temperatura. Ésta puede variar tanto para hongos como para bacterias.
Aunque existen diferencias en los rangos de temperaturas propuestas entre los
autores, en general se pueden clasificar en:
Psicrofílicas crecen a temperaturas 0 a 20ºC.
Mesofílicas: crecen en un rango de 21 a 41ºC.
Termofílicas: crecen a temperaturas mayores de 42ºC.
La mayoría de los hongos y bacterias patógenas de importancia en medicina
veterinaria se encuentran en el rango de las mesofílicas. Los recientes hallazgos
de microorganismos bajo los casquetes polares y en fuentes termales, han
obligado a emplear neologismos como termodúricos o extremofílicos; uno de
ellos, la denominada "cepa 121" ( Geobacillus stearothermophilus), que puede
desarrollarse en una temperatura de 60 °C.
pH. Se refiere a la concentración de iones de hidrógeno, lo cual indica el grado
de acidez o alcalinidad del medio. La mayoría de las bacterias patógenas crecen
mejor en un rango de pH de 6.0 a 8.0 y casi todos los hongos patógenos, en un
pH de 5.5 a 5.7.
Humedad relativa. Para el cultivo in vitro de la mayoría de los
microorganismos su rango es de 70 a 80 %.
 Atmósfera. Las bacterias tienen diferentes denominaciones con base en sus
requerimientos de oxígeno, se clasifican en:
Anaerobias obligadas. Crecen en medios bajos de potencial de óxido-reducción.
El oxígeno es letal para ellas. Ejemplos: especies de Clostridium, Bacteroides y
Fusobacterium.
Anaerobias facultativas. Son capaces de crecer en condiciones tanto de
anaerobiosis como de aerobiosis. Ejemplo: las enterobacterias y levaduras.
Anaerobias aerotolerantes. La condición óptima para su desarrollo es la
anaerobiosis, aunque pueden permanecer viables en presencia de O2. Ejemplo:
Clostridium perfringens.
Microaerofílicas. Requieren de una baja tensión de oxígeno y de 5 a 10% de CO2.
Ejemplo: Campylobacter y algunas especies de Brucella.
Aerobias obligadas. El O2 es indispensable para su desarrollo. Ejemplo:
Pseudomonas y Leptospira y hongos filamentosos.

Características físicas de los medios

Las técnicas de siembra de bacterias y hongos están directamente relacionadas con el
estado físico de los medios.

Medios líquidos. No contienen agar como agente solidificante, son envasados en tubos,
botellas y matraces. Se siembran por agitación del asa (FIGURA 1), por medio de
pipetas o depositando una porción de la muestra. El crecimiento en este tipo de
medios se manifiesta como turbidez. La utilidad de los medios líquidos es
aumentar las posibilidades de crecimiento, diluir efectos tóxicos y observar la
motilidad de microorganismos en preparaciones húmedas.
Medios semisólidos. Son medios que contienen de 0.5 a 0.75% de agar. Se envasan en
tubos y se siembran con asa recta por picadura (FIGURA 1). El crecimiento se
observa por turbidez en el sitio de inoculación en bacterias no móviles y turbidez
a los lados de la línea de inoculación en bacterias móviles. La utilidad de estos
medios es observar la motilidad bacteriana y conservar temporalmente cepas
bacterianas.

Medios sólidos y duros. Los primeros contienen 1.5% de agar y los últimos, de 3 a 7%.
Pueden envasarse en cajas de Petri, botellas o tubos. La utilidad de estos medios
es el aislamiento de colonias de bacterias o levaduras, la realización de pruebas
de susceptibilidad a quimioterapéuticos y conservar temporalmente cepas
bacterianas y micóticas. Los medios duros se utilizan para disminuir el
crecimiento invasivo de algunos microorganismos.
Como puede observarse en la FIGURA 1, la técnica de siembra de estos medios cuando se
encuentran envasados en cajas de Petri es la de estría cruzada para obtener aislamiento
de la muestra o bacteria; con esto se realiza una dilución para tener colonias separadas.
Cuando se envasa en tubo, se siembra por estría continua o picadura. Para el cultivo de
hongos filamentosos en placa o tubos, la siembra se realiza con la técnica de punto
aislado con asa en "L"

Siembra por agitación Picadura en el centro Siembra por picadura en el fondo del tubo
de asa del agar y en estría

Estría cruzada: Siembra en punto aislado con asa en “L”

• Flamear y enfriar el asa. Tomar la muestra.
• Depositar el inóculo en el cuadrante y realizar la
estría.
• Flamear y enfriar el asa entre cada cuadrante para
realizar el aislamiento.
• Asegurar que exista contacto entre las estrías de
cada cuadrante (1 con 2, 2 con 3 y 3 con 4).
Nota: En el caso de siembra de muestras clínicas se
realiza la tecnica de estria cruzada sin flamear el asa
entre cada cuadrante.

Figura 1. Técnicas de siembra en medios de cultivo.

 Figura 2. Técnica de siembra de estría cerrada.

Para pruebas de susceptibilidad a quimioterapéuticos se utiliza la técnica de siembra

de estría cerrada (FIGURA 2).

Clasificación de los medios de cultivo de acuerdo con su

utilidad diagnóstica
Los medios sirven para dos propósitos principales: promover el crecimiento y facilitar la
observación de algunas reacciones metabólicas; esto dependerá de la composición del
medio, por lo que se clasifican como sigue:
Medios de cultivo básicos o generales. Promueven el desarrollo de bacterias y
hongos poco exigentes, ya que contienen los mínimos requerimientos
nutrimentales. Son utilizados para análisis cuantitativos, conservación de cepas y
muestreo del medio-ambiente o superficies. Ejemplos: agar nutritivo, agar
tripticasa soya (TSA), caldo nutritivo, caldo tripticasa soya y agar dextrosa
Sabouraud (SDA).
Medios enriquecidos. Son medios que se suplementan con factores de crecimiento para
el desarrollo de bacterias y hongos de requerimientos nutrimentales exigentes.
Estos medios generalmente contienen uno o más de los siguientes ingredientes:
sangre, suero, líquido ascítico, extracto de levadura, huevo, extracto de carne,
vitaminas y aminoácidos específicos, entre otros. Ejemplos: agar sangre, agar
Sabouraud con ácido nicotínico, agar Lowenstein-Jensen, caldo infusión cerebro
corazón (BHI), Müller Hinton sangre (MHS), agar chocolate, PPLO
(pleuropneumonia-like organisms ), etcétera.
Medios selectivos. Estos medios contienen sustancias inhibitorias para suprimir
parcial o totalmente el desarrollo de microorganismos no deseados. Las
sustancias utilizadas con mayor frecuencia son los colorantes, las sales
inorgánicas, las sales biliares, los antibióticos y los detergentes. Los medios
selectivos tienen gran utilidad para el aislamiento de microorganismos patógenos
a partir de muestras clínicas que contengan microbiota. Ejemplos: agar
MacConkey, agar verde brillante (VB), agar micobiótico, agar manitol sal (MSA).
(CUADRO 1).
Es importante recordar que también se logra un efecto selectivo hacia ciertos grupos de
microorganismos simplemente variando la temperatura y la atmósfera de incubación.
Medios diferenciales. Estos medios contienen indicadores que permiten diferenciar
géneros o especies de algunos microorganismos por el aspecto característico de
sus colonias. La mayoría de los medios selectivos son también diferenciales; por
ejemplo, MacConkey, VB, MSA, PPLO con acetato de talio y penicilina. Pero existen
otros que solo son diferenciales porque no contienen substancias inhibidoras
como el agar Niger y el agar Biggy usados para diferenciar algunas levaduras
(CUADRO 1).
Medios de enriquecimiento. Estos medios son líquidos y poseen efectos inhibitorios
sobre ciertos géneros bacterianos, favoreciendo al mismo tiempo el desarrollo
de otros que se encuentren en menor proporción en la muestra. En el caso de
Salmonella para evitar desarrollo de otros gérmenes intestinales, se utilizan
caldo selenito y caldo tetrationato.
Medios de transporte. Son medios utilizados para el transporte de las muestras
clínicas desde el lugar de su recolección hasta el laboratorio. Su finalidad es
preservar la viabilidad de los microorganismos para posteriormente intentar su
cultivo en el laboratorio ejemplos: Stuart, Campy-thio, Cary-Blair, SSF con 1% de
caldo nutritivo.
Medios específicos para reacciones metabólicas. Son los medios que no pueden ser
agrupados bajo alguna de las categorías anteriores. La mayoría se emplea para
detectar metabolismo bacteriano como utilización de carbohidratos, urea, citrato,
pruebas de oxidación - fermentación (O/F) de sustratos.

Morfología de las colonias

El estudio de la morfología de las colonias es de gran importancia debido a que
permite iniciar una identificación preliminar de los microorganismos aislados.
Cuando una célula bacteriana o micótica prolifera sobre una superficie sólida, da
lugar a la formación de un acúmulo de millones de células que pueden observarse a
simple vista. Esto recibe el nombre de colonia o clona.
Las características morfológicas son constantes para cada especie en idénticas
condiciones de cultivo. Para su descripción debe tomarse en cuenta lo siguiente: tiempo
de crecimiento, tamaño, color, borde, superficie, pigmentación, hemólisis y estructura
interna. Es necesario detallar todas las características morfológicas relevantes. La
descripción de colonias micóticas se realiza en medios especiales conforme al género de
que se trate. Ejemplo: Aspergillus en agar Czapeck Dox.
En cuanto al número relativo de colonias bacterianas, este es expresado conforme
al desarrollo de colonias bacterianas o levaduras en los diferentes cuadrantes, las
lecturas son: desarrollo escaso cuadrantes 1, desarrollo moderado cuadrantes 1 y 2,
desarrollo abundante cuadrantes 1, 2, 3 y 4.
Material
General
Por sección
Medios demostrativos
- SIM y caldo nutritivo (con y sin crecimiento)
- Agar sangre (hemolisis completa e incompleta)
- TSA (pigmento)
- Agar MacConkey y VB (fermentadoras y no fermentadoras de lactosa)
-Agar Niger (colonias de levaduras)
Por equipo
- cultivo de E. coli en TSA inclinado en tubo
- cultivo de Salmonella arizonae en TSA inclinado en tubo
- mezcla de E. coli y S. aureus en caldo nutritivo
- cultivo de Aspergillus fumigatus en SDA inclinado en tubo
- cultivo de Cryptococcus neoformans en SDA inclinado en tubo
- cultivo de Candida albicans en SDA inclinado en tubo
- caldo nutritivo en tubo
- medio semisólido SIM
- placa de agar MacConkey (McC)
- placa de agar verde brillante (VB)
- placa de agar manitol sal (MSA)
- placa de agar Niger
- placa de agar Sabouraud dextrosa (SDA)
- placa de agar tripticasa soya (TSA)
- asa bacteriológica, asa recta y asa micológica

Procedimiento
Realice la siembra en caldo nutritivo con una asada del cultivo de
E. coli.
Realice la siembra en el medio semisólido SIM con el asa recta a partir de un cultivo de E.
coli.
Realice la siembra de la mezcla bacteriana en la placa de TSA, utilizando la técnica de
estría cruzada para obtener el aislamiento de colonias.
Realice la siembra de la mezcla bacteriana en la mitad de las placas de MacConkey, VB
y MSA, utilizando la técnica de estría cruzada para obtener el aislamiento de
colonias, en la otra mitad siembre el cultivo de Salmonella arizonae de la misma
manera.
Realice la siembra por estría cruzada del cultivo de Cryptococcus neoformans en la mitad
del medio Niger, en la otra mitad siembre por estría cruzada el cultivo de Candida
 albicans.
Realice la siembra del cultivo de Aspergillus fumigatus utilizando la técnica de punto
aislado en el medio de cultivo SDA.
Identifique adecuadamente sus cultivos e incube a 37°C las bacterias, levaduras, y los
hongos filamentosos (Aspergillus spp.) a temperatura ambiente o a 30°C, por 24-48
horas.
Observe el crecimiento en los medios de cultivo demostrativos: agar sangre, Niger, TSA,
McC, VB y realice la descripción de los cambios que se observan en cada uno.
Observe a las 24 o 48 horas el crecimiento en cada uno de los medios de cultivo
sembrados; observe el crecimiento en el medio líquido por turbidez, observe el
crecimiento y motilidad en el medio SIM y realice la descripción de las colonias en los
medios TSA y SDA y describa los cambios en los medios selectivos y diferenciales.

Descripción básica de las colonias

Tamaño
Diámetro en milímetros
Superficie
Lisas
Rugosas
Estructura interna
Mucoide
Granular
Filamentosas
Opacidad (transmisión de luz)
Translúcida
Opaca
Transparente (brillante)
Borde
Enteras
Onduladas
Lobuladas
Erizadas
Filamentosas
Elevación
Difusas
Convexas
Planas
Umbilicadas
Pigmento.
De la colonia
En el medio
Hemólisis en agar sangre
hemólisis completa
hemólisis incompleta
Hemolisina soluble caldo sangre

Forma débilmente irregular, bordes débil e irregular, y

estructura interna granular opaca.

Elevación plana, superficie lisa, borde liso aparente con

presencia de pigmento verde obscuro.

Forma circular, superficie lisa, borde entero, -hemólisis

(medio agar sangre).

Forma circular, borde entero, opaco con pigmentación

amarilla.

Forma irregular, superficie rizoide, borde lobulado,

estructura interna filamentosa con pigmento amarillo
naranja.

Cuadro 1. Medios de cultivo selectivos y diferenciales

 Organismos Organismos Sustancia
Nombre Substrato Indicador de pH Apariencia de colonias
favorecidos inhibidos inhibitoria
Algunos
grampositivos Fermentadoras de la lactosa: rosas o
permiten el Sales biliares y rojas. No fermentadoras de la
MacConkey Enterobacterias Lactosa Rojo neutro
crecimiento cristal violeta lactosa:
de Staphylococcus incoloras u opacas.
y enterococos
Fermentadoras de la lactosa: café
Eosina azul Eosina azul Lactosa y Eosina y azul de oscuro o centro negro. E. coli verde
Enterobacterias Grampositivos
de metileno de metileno sacarosa metileno metálico.
No fermentadoras: incoloras.
Grampositivos,
Fermentadoras de la lactosa:
Agar verde coliformes, y la Lactosa y
Salmonella Verde brillante Rojo de fenol verde amarillo. No fermentadoras
brillante mayoría de las sucrosa
de lactosa: rojas o rosa.
Shigellas
Sales biliares,
Fermentadoras de la lactosa: rojas o
citrato de
rosas. No fermentadoras de lactosa:
Salmonella Salmonella Grampositivos, sodio, tiosulfito
Lactosa Rojo neutro incoloras. Productoras de H2S:
y Shigella y Shigella coliformes. de sodio
rodeadas
y verde
de un precipitado negro.
brillante
 Staphylococcus aureus: colonias con
Manitol sal halo amarillo alrededor.
Manitol Rojo de fenol
agar Staphylococcus epidermidis: colonias
pequeñas con zonas rosas alrededor.
En el área donde ha
crecido una colonia y
ha sido removida del
Chapman Es inhibida la mayoría
No tiene indicador de medio, se agrega una gota de
Stone de los géneros
Cloruro pH púrpura de bromocresol. Lo mismo
Staphylococcus bacterianos, con Manitol,
de sodio se hace en el medio sin crecimiento.
excepción de fosfato
Cualquier diferencia
Staphylococcus dipotásico,
de color entre las gotas indica que la
sulfato de
bacteria fermenta el manitol
amonio
Staphylococcus aureus: colonias
Staphylococ
amarillas
cus 110
o anaranjadas.
Staphylococcus epidermidis: colonias
blancas o incoloras.
Medio de
Bacterias. Retrasa
prueba para Hongos Ciclohexamida Dermatofitos.
el crecimiento de Dextrosa Rojo de fenol
dermatofito dermatofitos y cloranfenicol El medio cambia a color rojo a
hongos contaminantes
s (DTM)
Agar Niger Levaduras ----- -------
 Literatura consultada

Bailón L, et al. Atlas interactivo de Pruebas bioquímicas para identificar bacterias.

Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Estudios Superiores de
Zaragoza, 2004. 06/09/12. En: http//es scribd.com/ doc/39602083/
Balows A, et al. Manual of clinical microbiology. 11TH ed. Washington, D.C.: American
Society for Microbiology, 2015.
Carter GR. Diagnostic procedures in veterinary bacteriology and micology. 5a ed.
Springfied, Illinois (EE.UU.): Charles C. Thomas Publisher, 1990.
Cowan ST. Cowan and Steel´s manual for the identification of medical bacteria. Londres:
Cambridge University, 2003.
Jawetz E, et al. Medical microbiology. 25° ed. Lange Medical Publications: / Mc. Graw-Hill,
2010.
Pérez MJ, et al. Procedimientos de laboratorio para bacteriología y micología veterinarias.
México: UNAM, FMVZ, 1990.
Siembra y aislamiento. http://mail.fq.ed.uy/microbio/MGral/practico/siembra,html. 2010-
02-02
Tipos básicos de medios de cultivo. http:/danival.org/medioscult. 2010-03-26
Evaluación

Realice un dibujo del método de siembraque se utilizá en los siguientes medios de

cultivo:

Líquido SIM SDA Estría cruzada en

TSA

Menciona dos ejemplos de los medios de cultivo:

Básicos:________________________________________________________________________

Selectivos:_____________________________________________________________________

Diferenciales: __________________________________________________________________

Enriquecidos:___________________________________________________________________

Enriquecimiento:_______________________________________________________________

Describa la morfología colonial que se observa en la placa de TSA.

Describa la morfología colonial que se observa en la placa de SDA.

Realice un dibujo de lo que se observa después de incubar los medios MSA, VB,
MacConkey y Niger, describa por qué suceden los cambios y señale su clasificación
según su utilidad:
 MSA: VB: MacConkey: Niger:

-Cambios del medio:

-Clasificación según su utilidad diagnóstica:

Firma del profesor de laboratorio:

____.______________________________________________________