Instructivo de Trabajo Bacteriología

Hemocultivo

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1. OBJETIVO

Establecer criterios y procedimientos cuyo objetivo sea separar e identificar

bacterias patógenas o productoras de septicemia o bacteriemia.

2. CAMPO DE APLICACIÓN

 Área de Bacteriología

3. PRINCIPIO DE LA PRUEBA

El hemocultivo se utiliza en caso de septicemia o bacteriemia, en pacientes con

fiebre de origen desconocido, cambios de pulso, alteración de la temperatura,
fiebre prolongada intermitente de escasa intensidad asociada a murmullo cardiaco.
En pacientes con shock posterior a intervenciones del aparato genital. Pacientes
con infecciones urinarias, quemaduras infectadas, heridas sépticas post
operatorias, infecciones de tejidos blandos, pacientes que tienen catéteres
venosos. Pacientes debilitados posterior a una terapia con antibióticos, drogas
inmunosupresoras, corticoides o con alimentación parenteral.

4. APLICACIÓN CLINICA

En la septicemia causada por microorganismos piógenos, cuando se encuentra

presente el síndrome clásico: fiebre, escalofrío, choque; no es difícil ayudar al
germen causal; las dificultades se presentan cuando las bacterias se encuentran
en pequeña cantidad en el torrente circulatorio, o cuando estas invaden la sangre
en forma intermitente como en los casos de endocarditis bacteriana subaguda
(EBSA) o brucelosis.
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En la fiebre tifoidea, tularemia, peste bubónica o ántrax las muestras para

hemocultivo se obtienen los primeros días de presentación de los signos clínicos,
posteriormente los microorganismos desaparecen de la circulación.

En pacientes con aumentos intermitentes de temperaturas, extraer la sangre

momentos antes de estos aumentos, pues generalmente existe un periodo de uno
a dos horas entre el momento de entrada de los gérmenes a la circulación y el
escalofrío siguiente.

En endocarditis bacteriana las muestras se pueden obtener en cualquier momento

debido a que los microorganismos se encuentran en escasa cantidad en la
circulación pero en forma constante.

En pacientes con choque séptico en los cuales se debe iniciar rápidamente la

terapia antimicrobiana, se puede extraer tres muestras; una tras otra, en tres sitios
diferentes, cambiando jeringas y agujas momentos antes de iniciar la terapia con
antibióticos.

Por ello es de suma importancia que el laboratorio disponga de los antecedentes

del paciente, información sobre los signos clínicos, diagnostico presuntivo y la
utilización actual/previa de antimicrobianos para decidir el número, la secuencia y
los horarios de la toma de muestra del hemocultivo; así como el tipo de medios de
cultivos donde se inoculara la sangre afín de preparar las mejores condiciones
para aislar al organismo.
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5. TOMA DE MUESTRA

5.1 Sangre para hemocultivo.

Material necesario:

 Dos frascos de hemocultivo de 100 o 50 ml. (AEROBIO: caldo Tripticasa soya,

caldo Tríptico, caldo Columbia, caldo Brucella, caldo BHI).
 Torniquete.
 Jeringas y agujas de punción.
 Gasas estériles.
 Guantes estériles.
 Alcohol etílico o isopropílico al 70%.
 Yodo povidona al 10%.

Obtención de la muestra:

El procedimiento para la extracción de sangre para hemocultivos se debe realizar

cumpliendo las máximas precauciones de asepsia. Identificar el frasco del medio
para hemocultivo con una etiqueta que contenga nombre completo y edad del
paciente, sala de internación y numero de cama, fecha y hora de obtención de la
muestra.

1. Lavarse las manos.

2. Colocar ligadura y campo estéril.
3. Colocarse los guantes estériles
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3. Palpar la vena al puncionar y realizar asepsia con alcohol al 70% en una zona
de piel de unos 10 cm de diámetro de punción. Se comenzara por el centro y se
irá haciendo círculos concéntricos hacia el exterior.
4. Repetir el procedimiento utilizando yodo povidona al 10%. Dejar actuar de 1 a 2
minutos (hasta que seque el antiséptico sobre la piel).
5. Mientras actúa el iodoformo, desinfectar el tapón de goma del frasco de
hemocultivo con alcohol al 70%.
6. Extraer la sangre sin tocar en ningún momento el campo desinfectado.
7. Cambiar de aguja e inyectar directamente la sangre en el frasco y moverlo para
que la sangre y el medio de cultivo se mezclen.

Volumen:

La cantidad de sangre a introducir en cada botella es de 5 - 10 ml. en caso de

pacientes adultos (si los frascos contienen 100 ml., puesto que la dilución de
sangre/medio debe ser al 10%). En el caso de neonatos y niños pequeños en que
no se pueda obtener volúmenes grandes de sangre, es suficiente una cantidad de
1 a 5 ml. por frasco. En estos casos se utilizan botellas de hemocultivo pediátrico.

Numero de Muestras:

Dos hemocultivos por paciente previo al tratamiento antimicrobiano. El intervalo de

tiempo entre las extracciones es de una hora, pero cuando existe urgencia por
iniciar el tratamiento, este intervalo puede acortarse hasta 15 minutos o se pueden
extraer dos muestras simultaneas de diferentes sitios de punción.
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En caso de endocarditis subaguda, se recomienda aumentar a tres frascos de

hemocultivo repartidos en 24 horas y en caso de que la primera serie sea
negativa, obtener tres muestras más al día siguiente.

5.2 Sangre para retrocultivo

En caso de querer realizar diagnóstico de bacteriemia relacionada a catéter (BRC)

se pueden seguir dos procedimientos:
1. Extracción de una muestra de hemocultivo por punción venosa periférica, más
extracción posterior del catéter sospechoso y envío de su punta para cultivo.
(Recomendado para catéteres de corta permanencia)

2. Muestras pareadas: Extracción de sangre por venopunción periférica y a través

del catéter venoso central, en igualdad de volumen y con un intervalo entre
ambas muestras menor a 5 minutos, empezando por la venopunción periférica.
Cada muestra debe colocarse en diferentes frascos de hemocultivo,
consignando tanto en los frascos como en la boleta de solicitud cuál es la
muestra extraída por catéter central (también llamada RETROCULTIVO) y cuál
por vena periférica. (Recomendado para catéteres de larga permanencia: 30
días o más).

Obtención de la muestra: retro cultivo

1. Lavarse las manos.

2. Colocarse guantes estériles.
3. Desinfectar la llave del catéter pasando dos torundas separadas embebidas
en alcohol 70%. Dejar secar.
4. Quitar la tapa plástica del/los frasco/s de hemocultivo y desinfectar el tapón de
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goma con alcohol 70%. Dejar secar.

5. Quitar el tapón de la llave y conectar la jeringa.
6. Colocar la aguja a la jeringa e inyectar la sangre en el frasco de hemocultivo.
7. Invertir la botella varias veces para mezclar.
8. Descartar la aguja en forma segura (contenedor de paredes rígidas).

Transporte y conservación:

Deben enviarse de forma inmediata al laboratorio una vez finalizada la serie.

Mientras, mantener a temperatura ambiente. Nunca debe refrigerarse ni
congelarse.

6. PROCEDIMIENTO

6.1. MATERIALES
 Jeringas de 1 a 5 ml.
 Mechero bunsen
 Ansa calibrada de platino.
 Hisopos estériles
 Aceite de inmersión.
 Porta y cubre objetos nuevos

6.2. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

 Colorantes para tinción de Gram

 Agar Sangre, Mac Conkey, Agar GC con isovitalex sin antibióticos.
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 Pruebas para identificación bioquímica para enterobacterias: TSI, Urea,

SIM, Lisina, Citrato, MIO.
 Pruebas para identificación de CGP: peróxido de hidrogeno, agar Manitol
salado, DNAsa, urea, orinitina.

Nota: De acuerdo a la solicitud o sospecha clínica, añadir medios específicos para

aislar bacterias que no crecen en los medios habituales, tales como Leptospira,
Listeria, Pasteurela, Brucella, Actinomyces y Legionella.

6.3. EQUIPOS

 Estufa de cultivo 35 – 37 C
 Microscopio
 Refrigerador
 Cabina de Seguridad Biológica

6.4. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA

a) Tomar de la estufa el frasco inoculado 24 horas antes con la sangre del

paciente, evitando cualquier movimiento brusco y observar el sobrenadante:
 Si en el sobrenadante se observan hemolisis de glóbulos rojos y turbidez
sospechar de Streptococcus pyogenes.
 Si se presenta turbidez en todo el sobrenadante y algunas veces burbujas
de gas; pensar en enterobacterias.
 Si en el caldo se presenta un coagulo que se enturbia y desarrolla en
colonias macroscópicas como copos de algodón, sospechar de Staphylococcus
aureus.
 En presencia de un olor nauseabundo pensar en Bacteroides.
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 Cuando se observa gran cantidad de gas sospechar de Clostridium.

Nota: El aspecto nunca se debe tomar como un guía segura, este se utiliza
únicamente como una orientación; aun con un sobrenadante limpio efectuar los
subcultivos que se indican a continuación en los medios de aislamiento primarios.

b) Registrar en el formulario del laboratorio para este análisis, las

características del sobrenadante para comparar con los resultados finales.
c) Ordenar todos los materiales al lado del mechero.
d) Identificar las cajas de Petri que contienen los medios de cultivo primarios
previamente atemperados y secados en la estufa a 35°C. Igualmente identificar los
portaobjetos que se utilizaran para el extendido.
e) Inclinar ligeramente el frasco de hemocultivo para flamear la tapa de esta
con el mechero.
f) Probar la jeringa sin retirar la protección de la aguja para evitar la aspiración
del aire ambiental.
g) Introducir la aguja con cuidado de no mover demasiado el sobrenadante;
aspirar alrededor de 1 ml. de líquido, evitando al introducir la aguja que ingrese
aire al frasco.
h) Abrir la tapa de las cajas de Petri de los medios con sumo cuidado con la
mano izquierda y con la derecha introducir la aguja en la caja, sin tocar la
superficie del medio, depositar de dos a tres gotas de líquido y cerrar rápidamente
la caja, proceder igualmente con los otros medios de cultivo; también depositar
tres gotas de líquido en cada portaobjetos.
i) Extender las gotas del sobrenadante sobre el medio de cultivo, con asa de
platino, así mismo extender ligeramente el líquido depositado sobre los
portaobjetos.
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j) Incubar las cajas de Petri a 35°C y las cajas de agar sangre y GC sin
antibióticos en atmosfera de 5 a 10% de CO2 (jarra con vela encendida) luego
dejar secar los portaobjetos a temperatura ambiente.
k) Colocar nuevamente los frascos en la estufa y cada dos días observar el
sobrenadante, si no se observa ninguna manifestación de crecimiento, esperar
hasta 7 días de inoculación del medio y repetir el procedimiento de inoculación.
Hasta ese tiempo, cerca del 95% de las bacterias con significación clínica
crecerán.

En pacientes graves, que están recibiendo antibióticos y no responden al

tratamiento o pacientes con endocarditis, presumiblemente por bacterias de difícil
crecimiento, incubar los frascos de hemocultivos hasta 14 días.

6.5. INTERPRETACION

En la mayor parte de los casos es uno solo lo que el agente etiológico de una
bacteriemia; por ello es de esperar que en los cultivos solamente se aísla un tipo e
colonias.

Únicamente en casos excepcionales y/o cuando los pacientes han sido o están
hospitalizados y en pacientes de gravedad que se presentan dos tipos de colonias.

El aislamiento de Bacillus sp. (Bacteria ambiental), Staphylococcus epidermidis y

Corynebacterium sp. (Bacterias de piel) en escasas cantidad y en un solo
hemocultivo, indica en general una contaminación (es esta una de las razones por
las cuales se debe tomar más de tres hemocultivos en un proceso infeccioso).
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Recientemente y cada vez con más frecuencia, se ha implicado al Staphylococcus

epidermidis multiresistente (meticilino resistente) en sepsis de recién nacidos en
unidades de cuidados intensivos de neonatología.

Cuando se aíslan Streptococcus no hemolíticos, con excepción de los

Streptococcus del grupo D y alfa hemolíticos en un solo hemocultivo, los
resultados son inciertos.

La presencia de enterobacterias, Pseudomonas aeruginosa, levaduras,

Staphylococcus aureus, Haemophylus, Pneumococos y Bacteroides en un
hemocultivo, indica en la gran mayoría de los casos que se trata de los agentes
etiológicos.

6.6. INFORME DE RESULTADOS

El hemocultivo es uno de los más importantes análisis de emergencia, por lo tanto

cualquier avance en los resultados o sospecha justificada de crecimiento de algún
microorganismo debe ser informada inmediatamente al clínico sea por escrito o
por teléfono.

El segundo día de incubación cuando se efectúa el primer sub cultivo en medios

sólidos, a su vez se efectúan también dos extendidos para tinción de Gram del
líquido extraído. El resultado de esta observación microscópica debe informarse
inmediatamente, tratando en lo posible de definir la coloración, forma y disposición
de los gérmenes encontrados. Solo de esta manera se podrá contribuir
eficientemente al tratamiento del paciente. Por ello se recomida que este análisis
sea efectuado por personal especializado y con mucha experiencia.
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7. SIGLAS

EBSA - Endocarditis Bacteriana Subaguda

BACTE - Bacteriología General

PC - Procedimiento de Calidad

SS - agar Salmonella Shigella

LÍA - Lisina Iron Agar

TSI - Triple azúcar Iron / Triplique azúcar-hierro

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8. BIBLIOGRAFIA

 Forbes. Sahm. Weissfeld. 2007. Bailey y Scott Diagnóstico

Microbiológico. Madrid España. Panamericana
 Sociedad de Microbiología e Infecciosas. 2007. Manual de
Estandarización de Toma de Muestras para Estudios en Microbiología.
 www.wikipedia.com

ELABORADO APROBADO Y LIBERADO

Nombre: Dra. Claudia Nelly Ibáñez Nombre: Dra. Claudia Nelly Ibañez
Justiniano Justiniano
Cargo: Responsable del área de Cargo: Responsable de laboratorio
Bacteriología

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Fecha: 01 /09/2021 Fecha: 19/10/2021