POLIMORFISMOS Y MICROMATRICES ISSN 0025-7680

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ARTICULO ESPECIAL MEDICINA (Buenos Aires) 2004; 64: 533-542

MEDICINA GENOMICA
APLICACIONES DEL POLIMORFISMO DE UN NUCLEOTIDO Y MICROMATRICES DE ADN

MONICA P. SPALVIERI1, ROSA G. ROTENBERG2

1
Círculo Bioquímico, Distrito III de la Federación Bioquímica de la Pcia. de Buenos Aires
2
Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA

Resumen Esta actualización tiene por objeto difundir un nuevo enfoque de las variaciones del ADN entre
individuos y comentar las nuevas tecnologías para su detección. La secuenciación total del genoma
humano es el comienzo para conocer la diversidad genética. La unidad de medida reconocida de esta variabi-
lidad es el polimorfismo de un solo nucleótido (single nucleotide polymorphism o SNP). El estudio de los SNPs
está restringido a la investigación pero las numerosas publicaciones sobre el tema hacen vislumbrar su entra-
da en la práctica clínica. Se presentan ejemplos del uso de SNPs como marcadores moleculares en la
genotipificación étnica, la expresión génica de enfermedades y como potenciales blancos farmacológicos. Se
comenta la técnica de las matrices (arrays) que facilita el estudio de múltiples secuencias de genes mediante
chips de diseño específico. Los métodos convencionales analizan hasta un máximo de 20 genes, mientras que
una sola micromatriz provee información sobre decenas de miles de genes simultáneamente con una
genotipificación rápida y exacta. Los avances de la biotecnología permitirán conocer, además de la secuencia
de cada gen, la frecuencia y ubicación exacta de los SNPs y su influencia en los comportamientos celulares. Si
bien la validez de los resultados y la eficiencia de las micromatrices son aún controvertidos, el conocimiento y
caracterización del perfil genético de un paciente impulsará seguramente un cambio radical en la prevención,
diagnóstico, pronóstico y tratamiento de las enfermedades humanas.

Palabras clave: SNP, polimorfismo, micromatriz, genotipificación, farmacogenómica

Abstract Genomic Medicine. Polymorphisms and microarray applications. This update shows
new concepts related to the significance of DNA variations among individuals, as well as to their
detection by using a new technology. The sequencing of the human genome is only the beginning of what will
enable us to understand genetic diversity. The unit of DNA variability is the polymorphism of a single nucleotide
(SNP). At present, studies on SNPs are restricted to basic research but the large number of papers on this
subject makes feasible their entrance into clinical practice. We illustrate here the use of SNPs as molecular
markers in ethnical genotyping, gene expression in some diseases and as potential targets in pharmacological
response, and also introduce the technology of arrays. Microarrays experiments allow the quantification and
comparison of gene expression on a large scale, at the same time, by using special chips and array designs.
Conventional methods provide data from up to 20 genes, while a single microarray may provide information
about thousands of them simultaneously, leading to a more rapid and accurate genotyping. Biotechnology
improvements will facilitate our knowledge of each gene sequence, the frequency and exact location of SNPs
and their influence on cellular behavior. Although experimental efficiency and validity of results from microarrays
are still controversial, the knowledge and characterization of a patient’s genetic profile will lead, undoubtedly, to
advances in prevention, diagnosis, prognosis and treatment of human diseases.

Key words: SNP, polymorphism, microarray, genotyping, pharmacogenomics

El genoma humano contiene 3x109 pares de bases y polimorfismo es aún menor, alrededor del 0.1%. Ello re-
difiere de nuestro pariente cercano, el chimpancé, en presenta 3x106 pares de bases susceptibles de presentar
aproximadamente un 1%, estableciendo una diferencia cambios de un solo nucleótido o el de polimorfismos múl-
entre ambas especies que sólo involucra a 30 millones de tiples. El 90% de la diversidad fenotípica humana provie-
ellas1. La variabilidad genética entre individuos o sea su ne de las variaciones heredadas en una sola base o sin-
gle nucleotide polymorphism (SNP)2. Es la menor altera-
Recibido: 17-XII-2003 Aceptado: 8-VI-2004 ción que puede experimentar la secuencia de ADN de un
individuo, y se origina por el intercambio recíproco de los
Dirección postal: Dra Rosa G. Rotenberg, Zabala 2432 4° A. (1426)
Buenos Aires, Argentina
nucleótidos: adenina, citosina, timina o guanina. Es el más
Fax: (54-11) 4758-0259 e-mail: [email protected] común de los polimorfismos. Si no superan el 1% de inci-
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dencia son consideradas mutaciones y no polimorfismos. los graves efectos colaterales y adversos observados en
Ocurren aproximadamente cada 100 a 1.000 bases, en los tratamientos. Las nuevas tecnologías genómicas per-
cantidad variable y distribución aleatoria a lo largo del miten una mejor comprensión de las diferencias genéticas
genoma humano3. Cuando se encuentran integrando que gobiernan esta variedad de respuestas. Es por ello
exones dan lugar, en la mayoría de los casos, a proteínas que la Food and Drug Administration (FDA) promueve la
con expresión, estructura o funciones biológicas altera- búsqueda de nuevos productos farmacéuticos basados
das y se conocen como SNPs codificantes (cSNPs). De- en datos genéticos para hallar la droga más beneficiosa
bido a que sólo 3 a 5% del ADN humano corresponde a en cada caso, que conduzca a la terapéutica
secuencias que codifican, la mayoría de los SNPs se lo- personalizada. Los SNPs pueden predecir así la eficacia
caliza fuera de estas regiones. Sin embargo, aun en au- y tolerancia a determinada medicación8.
sencia de significado funcional, su proximidad a un deter- Debido a que son relativamente estables genética-
minado gen alterado, con el que segrega en forma con- mente, los SNPs actúan como verdaderas señales bio-
junta, lo transforma en un indicador útil para detectar po- lógicas. Su localización en zonas bien definidas del ADN
tenciales anomalías génicas. Estos polimorfismos son de permite elaborar mapas cromosómicos indicadores de
particular interés, y con el desarrollo de nuevas tecnolo- su posición relativa respecto de genes conocidos y a la
gías facilitan la identificación genética. vez, caracterizar las interacciones con otros genes.
Se presume que existen más de 5 millones de SNPs Analizando la información que brinda la célula nor-
en el genoma humano y en el año 2001 fue publicado un mal, se inicia una nueva era tendiente a definir los sitios
mapa que identifica y localiza 1.42 millones de ellos4. claves del genoma humano. Es previsible que la
Algunos parecen actuar como marcadores ancestrales y decodificación de los millones de cambios posibles en la
es previsible que muchos de ellos presenten relevancia secuencia de ADN, es decir sus polimorfismos, permitirá
clínica. Irizarry y col señalan 48196 SNPs candidatos que con el tiempo una genotipificación masiva. Esta ardua
podrían ser utilizados en el mapeo de genes asociados tarea del secuenciamiento de decenas de miles de indi-
a distintas enfermedades5. viduos, requiere del uso de métodos eficaces para su
Los SNPs actúan como improntas de nacimiento y su detección, aplicables a gran número de muestras y al
variedad caracteriza al grupo poblacional. Cada indivi- menor costo posible9.
duo es portador de un patrón propio de SNPs que lo iden- Durante los últimos años el mapeo genómico de los
tifica y que comparte con su grupo étnico. Las investiga- SNPs ha sido el blanco de varias empresas de
ciones están dirigidas a analizar sectores del ADN porta- biotecnología, tales como Incyte (EE.UU), Genset (Fran-
dores de un SNP asociado al o los genes responsables cia), Celera (EE.UU.) y CuraGen (EE.UU.). En abril de
de determinada anomalía, con el o los cuales co-segre- 1999, la unión de varias grandes compañías farmacéu-
ga. Su identificación puede permitir establecer un regis- ticas con importantes centros de secuenciamiento del
tro genómico de enfermedades humanas. ADN dio origen a The SNP Consortium, la que estable-
La mayoría de estas enfermedades son el producto ció una base de datos pública de más de 300.000 SNPs
de desórdenes genómicos complejos ya que son pocos en el lapso de dos años. Este evento impulsó el interés
los casos en que la alteración de un solo nucleótido con- en el área y a partir de 2002, coincidente con la crea-
duce a la enfermedad. Sin embargo, tanto si la anomalía ción del centro de coordinación de los datos obtenidos
proviene de un solo gen (monogénicas) o de varios (DCC), los SNPs identificados superaron los 1.5 millo-
(poligénicas), el fenotipo resultante constituye el reflejo nes10, 11.
tanto de las interacciones con otras secuencias génicas
como de diversas variables epigenéticas. La evaluación
de estos factores no genéticos, que incluyen cambios SNPs del angiotensinógeno
ambientales, dietarios y estilos de vida, permite una me-
jor interpretación del comportamiento génico6. Comparados con la población general de Canadá, los
El test genético consiste en un estudio de asociación, aborígenes Oji Cree de Sandy Lake, Ontario, presentan
comparando el patrón de SNPs de la población enferma, una alta prevalencia de diabetes mellitus tipo 2 (DM2).
cuyo gen responsable es conocido, con el de individuos Se ha observado que estos diabéticos tienen una proba-
sin esa enfermedad y permite, a través de la expresión bilidad siete veces mayor de desarrollar una enferme-
génica, identificar a la población susceptible de contraerla. dad renal terminal, que la población diabética general
La extensión de dichos conceptos es utilizada por la canadiense12. Ello sugiere que estos individuos son por-
farmacogenómica para establecer la eficacia de una dro- tadores de algún factor distintivo que los predispone a
ga4, 7. Normalmente no es posible predecir la reacción este riesgo.
del paciente a un determinado fármaco y esto ha movili- Es reconocida la frecuente asociación entre la
zado a las empresas farmacéuticas a buscar una rela- nefropatía de la DM2 con la hipertensión arterial (HTA) y
ción entre cambios génicos y las respuestas disímiles o la elevación en plasma de angiotensinógeno (AGT)13.
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Hegele y col hallaron en la población diabética Oji Cree intestinal o de almacenamiento hacia las células especí-
una relación entre la susceptibilidad a la nefropatía y la ficas que lo requieren, o para integrar las reservas de Fe
existencia de ciertos polimorfismos. Comprobaron que uno bajo la forma de ferritina o hemosiderina.
de los determinantes de las complicaciones renales en la Si bien se han descripto variantes génicas de TF hu-
DM2 es el polimorfismo proteico Met235Thr del gen AGT, mana, es poco lo que se sabe acerca de sus diferencias
donde una metionina canjea por treonina, como conse- funcionales. Sin embargo, el análisis de los genes
cuencia del reemplazo de una timina por citosina (T842 → involucrados en el metabolismo del Fe sugiere que de-
C)14. Los mismos autores detectaron variaciones en la zona terminados SNPs podrían contribuir a caracterizar tanto
promotora del gen AGT, debido a una sustitución de una la predisposición a las deficiencias como a las sobrecar-
guanina por una adenina (G6 → A)15. gas de Fe en el humano19.
Los resultados del estudio de la población Oji Cree Kasvosve y col estudiaron selectivamente una etnia de
llevan a las siguientes conclusiones: existe en ellos una Zimbabwe que presenta un mayor riesgo para la sobre-
alta prevalencia de las variantes 6A y T235 con una im- carga de Fe debido al consumo ritual de cierta bebida al-
portante relación entre ambos polimorfismos; los sujetos cohólica20. El uso de recipientes de hierro sin galvanizar
con DM2 presentan mayor frecuencia de T235, la que a en la elaboración casera de la bebida contribuye a que
su vez está significativamente asociada a la presencia esta población tenga la prevalencia de sobrecarga de Fe
de microalbuminuria, utilizada como indicador de más alta del mundo. A pesar de esta costumbre tradicio-
nefropatía temprana14, 16. nal, estos individuos modulan el nivel de Fe circulante
Se ha demostrado que la variante T235 y en menor mediante una adaptación de los factores genéticos
grado el alelo 6A, tienen relación con el aumento de la involucrados, especialmente en relación con las variantes
presión sistólica en la población general. Si bien aún se de TF presentes. Algunas investigaciones mencionan 77
desconoce el impacto aislado del alelo 6A sobre la HTA, potenciales SNPs para la TF pero pocos han sido valida-
es frecuente la segregación conjunta de ambos polimor- dos por secuenciación del ADN correspondiente21.
fismos, hecho que correlacionaría la nefropatía diabéti- Los fenotipos de TF más estudiados e identificados
ca con la presión arterial en estos aborígenes. La sus- por electroforesis capilar, corresponden a la forma C, que
ceptibilidad a desarrollar complicaciones renales sería es la más frecuente y las variantes B anódica y D catódica.
aún más importante en los homocigotas T235/T235. La combinación de estos alelos origina los diferentes
Aun cuando estas variaciones en el gen AGT se aso- haplotipos de TF hallados en distintas poblaciones22. El
cian con la predisposición a determinados fenotipos anor- homocigota CC es la forma casi exclusiva en los
males, como la nefropatía diabética, es probable que caucásicos, mientras que existe una alta frecuencia de
requieran la presencia de un segundo factor ya sea individuos heterocigotas CD en distintas regiones de Afri-
genético o ambiental, para hacerse evidentes. La crea- ca (Zimbabwe, Ruanda, Mozambique) y algunas regio-
ción de las reservas indígenas provocó grandes cam- nes sudamericanas. La presencia del alelo D le confiere
bios en el estilo de vida de esta comunidad nómada de a la TF una diferencia funcional para transportar Fe, con
la región subártica. Originariamente se alimentaban de valores de Fe sérico, TIBC (transferrin iron binding
la caza y la reducción de la actividad física con las nue- capacity), saturación de TF e índice Fe sérico/TF, signi-
vas costumbres adquiridas parece haber influido en una fica-tivamente más bajos que los homocigotas CC. La
mayor prevalencia de la enfermedad metabólica17. relación Fe/TF determina la capacidad de unión del Fe a
Distintos estudios realizados en la población humana las distintas variantes de TF. Esta fracción, aislada por
y en primates sugieren que los dos SNPs analizados diálisis, indica la cantidad de Fe que puede ser unido y
corresponderían a formas ancestrales del gen AGT, in- transportado por la proteína y ha sido confirmada por
dicando una falta de readaptación génica a los nuevos experiencias in vitro.
hábitos de este grupo nativo. Según Diamond, la DM2 El oeste de Africa y la zona Bantú tienen la mayor
puede considerarse una enfermedad prevalente en po- frecuencia del alelo D y coinciden con las poblaciones
blaciones que presentan susceptibilidad genética, la que de riesgo para la sobrecarga de Fe. Sin embargo, llama
sería desenmascarada por los factores ambientales, aso- la atención que la población negra de EE.UU. presenta
ciados a determinados estilos de vida18. una frecuencia baja, cercana al 10%, de fenotipo CD23.
La existencia de homocigotas DD sería poco viable y
desventajosa genéticamente pues impediría casi en su
SNPs de la transferrina totalidad el transporte de Fe. La literatura informa el ha-
llazgo de solamente un individuo con haplotipo DD, en
La transferrina (TF) es la proteína circulante encargada una familia aborigen australiana.
de transportar el hierro (Fe) en el organismo. Posee la La ausencia de homocigotas DD de TF y la diferencia
capacidad de trasladarlo desde los sitios de absorción de saturación entre los distintos fenotipos, aportan mu-
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chas evidencias de la importancia biológica y clínica de CYP2D6*2 metabolizan las drogas en forma ultra-rápi-
los SNPs. En el caso de las poblaciones expuestas a da, causando la falla terapéutica.
una sobrecarga de Fe, originada por sus hábitos, la adap- Estos hallazgos han promovido numerosos estudios
tación a través de la presencia de determinados SNPs poblacionales, especialmente en orientales y caucásicos.
en el gen TF, evidencia una presión génica para minimi- Las diferencias inter-étnicas observadas se adjudican a la
zar el transporte de Fe. Puede concluirse que estos indi- azarosa distribución de los alelos de este gen en las dis-
viduos estarían protegidos por su alelo D de una acumu- tintas etnias.
lación perjudicial de Fe. Estudios realizados en la población china de Hong
Con respecto al estudio de los polimorfismos de TF Kong determinaron una prevalencia del 54.2% para el
en otras enfermedades, publicaciones recientes involu- alelo CYP2D6*10B y del 10.5% para el CYP2D6*10A,
cran al SNP Cis282Tir de la TF, relacionada a la hemo- concluyendo que el 64.71% de la población presenta un
cromatosis, como un factor de riesgo en la enfermedad genotipo que incluye al alelo *10. Las variantes *10A y
de Parkinson24. *10B estarían relacionadas con el fenotipo EM (exten-
sión de la acción metabólica) en cuanto a la duración del
efecto de la droga. Dichos alelos presentan una muta-
SNPs del citocromo P450 ción C188 → T, que causa la sustitución Pro34Ser, en el
exón 1, originando una enzima inestable y poco eficaz.
Los citocromos son hemoproteínas localizadas en la Mediante estudios de genotipificación masiva ha sido
membrana de las mitocondrias y del retículoendoplás- demostrada la variable actividad enzimática de CYP2D6,
mico que intervienen fundamentalmente en la transfe- no solo a nivel racial, sino también entre distintos grupos
rencia de electrones mediante reacciones redox rever- étnicos de la misma raza.
sibles. Se clasifican en cuatro familias o grupos principa- En la población caucásica, en cambio, se observa una
les: a, b, c y d, según la naturaleza de la cadena lateral prevalencia cercana al 10% de los alelos *3 y *4 y serían
de la porfirina y el tipo de enlace que une al hem. Cada los responsables del aumento del fenotipo MP. Ambos
familia está constituida por varias sub-familias. Una de se heredan en forma autosómica recesiva, aun cuando
las más estudiadas, perteneciente al grupo b, es la del el 75% de los alelos mutados del CYP2D6 son acapara-
citocromo P450 (CYP: del inglés CYtochrome P450), lla- dos por el *4. Las mutaciones más frecuentes se obser-
mada así debido a que su máxima absorción (pico de van en las variantes CYP2D6*4, *7 y *8 y las deleciones
Soret) se ubica a 450 nm. en los alelos *3 y *626.
La proteína CYP es polimórfica y posee varias Es previsible que la genotipificación del gen CYP2D6
isoenzimas que se caracterizan por actuar como se convierta en el futuro en un estudio de rutina para
hidroxilasas25. Una de ellas, la isoenzima debrisoquina- optimizar la eficacia de un tratamiento terapéutico. Sin
4-hidroxilasa conocida como CYP2D6, es responsable embargo es importante destacar que la variabilidad
de la metabolización de ciertas drogas que incluyen en descripta en el metabolismo de las drogas es la resul-
su estructura a la debrisoquina. Tal es el caso de nume- tante de la co-existencia de factores genéticos y ambien-
rosos neurolépticos y antidepresivos tricíclicos utilizados tales, tal como se desprende al estudiar etnias con dis-
con frecuencia. Por otra parte se ha observado que dis- tintas ubicaciones geográficas.
tintas alteraciones del gen CYP estarían involucradas en Gran cantidad de drogas y carcinógenos son
la aparición de efectos colaterales, incompatibilidad y/o excretados por el organismo luego de su conversión
variación en la eficacia terapéutica de más de 30 com- metabólica a través de enzimas oxidativas y de conjuga-
puestos farmacéuticos. ción. Se ha sugerido al CYP450 como un gen candidato
Se han identificado y asociado varios SNPs del asociado a la quimiorresistencia de diferentes tipos de
CYP2D6 con alteraciones del metabolismo de debriso- tumores y también a la enfermedad de Parkinson, si bien
quina y drogas estructuralmente relacionadas. Estos los estudios realizados hasta el momento se limitan a la
cambios genómicos son los responsables del amplio investigación27-30.
rango de actividad observado en la enzima CYP2D6: En resumen, el estado refractario a una droga puede
desde un metabolismo ultra-rápido hasta ausencia ab- ser detectado mediante la identificación de los SNPs re-
soluta de acción. Los portadores homocigotas o lacionados con las proteínas involucradas en su meta-
heterocigotas de deficiencias en el alelo CYP2D6 bolismo. Las variadas respuestas serían consecuencia
metabolizan las drogas en baja proporción (MP: de la presencia de polimorfismos en los genes que go-
metabolizadores pobres) permitiendo una permanencia biernan su absorción, interacción, transporte, biodispo-
más prolongada en circulación, con mayor riesgo de nibilidad y excreción. De este modo la carga genética
efectos tóxicos. En cambio, los individuos que presen- afectaría la toxicidad o respuesta a una misma droga en
tan duplicación del gen activo CYP2D6 o poseen el alelo distintos individuos.
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Micromatrices de ADN Las matrices de ADN actúan como moldes y pueden

hibridizar con los correspondientes ácidos nucleicos pro-
La progresiva evolución del Proyecto Genoma Humano venientes de cualquier material biológico adecuadamente
constituye uno de los ejes centrales que impulsan el de- preparado.
sarrollo de nuevas tecnologías moleculares. Su objetivo Actualmente es enorme la información que brinda la
primordial consiste en acelerar la detección de anoma- web acerca de la tecnología de los MA. Es posible ac-
lías génicas potencialmente utilizables como marcado- ceder a protocolos para diseñarlos, al software para un
res31. Si bien ya desde la década del 80, fueron usados adecuado análisis e incluso para su interpretación, a
exitosamente con ese fin el análisis de los polimorfismos través del High-Density Array-Pattern Interpreter
de restricción, la hibridización, la espectroscopia de masa (HAPI)35.
y la secuenciación, todos ellos constituyen métodos lar- 2) Utilización de la micromatriz (microarray): las se-
gos y laboriosos. cuencias a analizar, que actúan como sondas, hibridizan
La técnica de las micromatrices, iniciada en 1995, en forma específica con las bases complementarias fi-
permite estudiar simultáneamente múltiples secuencias jadas en el soporte y deben llevar una marca fluores-
de un gen en forma confiable y eficiente. cente o radioactiva antes de ser aplicadas a la superfi-
1) Diseño o construcción de la matriz (array): consiste cie de la matriz. Generalmente se utilizan como sondas
en fijar, mediante técnica robótica, ínfimas cantidades gADN, cADN o ARN, aunque también es posible apli-
de secuencias conocidas de ácidos nucleicos, del orden car esta nanotecnología al estudio de la expresión de
de los nanolitros, sobre plataformas adecuadas que ge- proteínas.
neralmente no superan el tamaño de un portaobjeto o Según los objetivos existen distintos tipos de ensa-
tarjeta. Estas colecciones de ADN o DNA-arrays se pre- yos con MA. Si se desea comparar el perfil de expresión
paran depositando oligonucleótidos (oligoNT), ADN com- génica de dos muestras simultáneamente, ambas serán
plementario (cADN) o ADN genómico (gADN) pre-selec- incluidas en una misma matriz, marcándolas con
cionados que luego se fijan químicamente a la fase sóli- radioisótopos diferentes o fluoróforos que posean distin-
da (spotting)32. Otros métodos construyen las secuen- ta frecuencia para la emisión de fluorescencia, tales como
cias de oligoNT in situ mediante técnicas electroquímicas las cyaninas (Fig. 1a). El ARN proveniente de dos pobla-
o de fotolitografía, obteniéndose de ese modo los llama- ciones celulares o tejidos diferentes es usado para sinte-
dos DNA-chips, chips genéticos o biochips33. Genérica- tizar ADN complementario simple cadena en presencia
mente todos son denominados micromatrices o de nucleótidos marcados: Cy3-dUTP y Cy5-dUTP. En
microarrays (MA) y pueden ser acondicionados sobre general este tipo de ensayo emplea matrices de alta den-
membranas, vidrios o superficies sólidas no porosas. sidad y es aplicado a la comparación de patrones
Existen marcas registradas que utilizan bases de geles genéticos, donde el nivel relativo de ambos ARN puede
acuosos 3D, asegurando que este medio permite la máxi- ser determinado por la relación Cy3/Cy5 para cada gen36.
ma interacción entre las fases reactivas34. Cada uno de Otro tipo de diseño utiliza dos soportes construidos
los soportes descriptos admite distinto número de grillas con la misma matriz de oligoNT: uno de ellos para anali-
y en consecuencia de zonas de reacción. La fase sólida zar las distintas secuencias del ARN de la muestra pro-
fotolitográfica presenta la mayor capacidad: de 50.000 a blema y el otro para identificar las de cada gen del mARN
250.000 blancos posibles. de referencia, separadamente (Fig. 1b). La doble cade-
De acuerdo al tamaño de las secuencias empleadas, na de cADN es generada mediante el uso de poli A+
los MA serán de alta o baja densidad. Los primeros es- ARN de diferentes tejidos o poblaciones celulares. En
tán preparados con cADN, pueden tener hasta varias dicho experimento debe someterse al cADN a una se-
kilobases de longitud y generalmente son los productos gunda transcripción reversa in vitro para obtener el cARN,
amplificados y generados por PCR a partir de bibliote- incorporando nucleótidos marcados con biotina y detec-
cas de cADN o colecciones de clones33. Los de baja den- tado por su unión a streptavidina36. Este modelo de en-
sidad emplean fragmentos pequeños de ADN u oligoNT sayo es aplicable a la genotipificación, detección de
cortos (20-25 bases) o largos (50-80 bases) presinte- SNPs, análisis de expresión de ARN o secuenciación de
tizados o de síntesis in situ. Algunas empresas comer- ADN. La matriz puede ser diseñada con parte de un
cializan sistemas optimizados para distintas especies: transcripto, permitiendo la búsqueda de genes relacio-
humana, rata y ratón. Otras ofrecen diseñar la matriz a nados o variantes de corte y empalme (splicing).
pedido, construyendo el oligoNT solicitado, cuando los La hibridización sólo se llevará a cabo en el sitio exacto
existentes en el comercio no cumplen con los requeri- del MA donde el ADN u oligoNT adherido al soporte es
mientos del investigador34. reconocido por el cADN o cARN problema.
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Fig. 1.– Esquema de la utilización de las matrices con ARN proveniente de muestras y testigos, reali-
zando una o dos transcripciones reversas según el tipo de matriz empleada. Las señales fluorescentes
derivadas del impacto laser son escaneadas y analizadas mediante sistemas de bioinformática y
estadística36.
F1 (Cy3) y F2 (Cy5): distintas señales fluorescentes provenientes de cada una de las cadenas sim-
ples de cADN obtenidas por transcripción reversa del ARN a analizar.
a) Ensayo con dos señales fluorescentes provenientes de una matriz.
b) Ensayo con una sola señal.

Aplicaciones tegorías sólo basadas en la modulación de genes indivi-

duales, que actuarían además como factores predictivos,
a. Tipificación molecular de enfermedades permitiendo un mejor abordaje terapéutico en cada caso37.
Este aspecto posee una inminente aplicación en el campo
La identificación de genes clínicamente relevantes ya per- de la oncología: la existencia de una especie de "firma
mite redefinir muchas enfermedades en función de la rela- transcripcional" que actuaría como impresión digital, esta-
ción genotipo-fenotipo. Es factible que esta novel clasifica- bleciendo la contribución de ciertos genes propios al esta-
ción molecular-genética de la enfermedad establezca ca- do de salud o al riesgo de contraer cáncer38-40.
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b. Diagnóstico, evolución y pronóstico fermedades degenerativas o en la búsqueda de nuevas

modalidades terapéuticas54.
La posibilidad de co-hibridizar dos muestras biológicas Es poco claro aún el rol que desempeñan los
diferentes en una misma matriz permite la comparación polimorfismos hallados en el gen parkin, aunque la litera-
conjunta de un material de referencia. De este modo se tura refiere la mayor relación de alguno de ellos con el
reduce la variabilidad y es posible comparar tejidos sa- Parkinson familiar. Lucking y col detectaron una significa-
nos versus sus contrapartidas tumorales u observar las tiva asociación del homocigota Asp394Asn con la forma
diferencias en la expresión génica antes y después de heredada y una mayor frecuencia de homocigotas
un tratamiento40, 41. Ciertos subgrupos de genes permiti- Val380Leu en los casos esporádicos. También analizan
rían identificar estadios iniciales u avanzados y otros algunos genes relacionados al metabolismo del hierro y
estarían asociados a la sensibilidad de los pacientes fren- observan que sólo el cambio Gly258Ser de la transferrina
te a la quimioterapia41-43. incide en el desarrollo de la enfermedad55, 56.
La tecnología de los MA ha sido aplicada al estudio de Se ha demostrado que el alelo epsilon4 de la
tumores sólidos como asimismo en oncohematología42-44. apolipoproteína E (apoE4) es un factor de riesgo para la
Las investigaciones se orientan hacia la expresión y enfermedad de Alzheimer. El predominio de la isoforma
funcionalidad génica en la definición de subtipos clínicos e E4 sobre la E3 promueve el depósito cerebral de péptidos
histopatológicos, la agresividad tumoral, la existencia de beta-amiloides, responsables del progresivo déficit
enfermedad mínima residual, la respuesta al tratamiento y sináptico-colinérgico. Investigaciones recientes sugieren
la búsqueda de nuevos blancos terapéuticos45-47. Dichos la importancia de ciertos polimorfismos existentes en el
enfoques permiten ampliar los conocimientos sobre la evo- promotor del gen apoE, los que afectarían su transcrip-
lución y pronóstico de ciertas neoplasias. ción57. La identificación de los portadores de este alelo
permitirá un mejor conocimiento de la relación genotipo-
c. Esclarecimiento de mecanismos moleculares fenotipo en los casos de demencia precoz familiar, posibi-
litando una intervención temprana.
Algunos ensayos con MA se basan en los mecanismos Con MA se ha identificado la cepa de Escherichia coli
básicos reconocidos del desarrollo tumoral posibilitando responsable de los cuadros más frecuentes de
una aplicación clínica inmediata en oncología. Un ejem- enterohemorragias generadas por estas bacterias. Esta
plo es el diagnóstico temprano del carcinoma de colon a tecnología suministra una herramienta genómica en la
través de la detección de K-ras mutado en las células diferenciación de las infecciones causadas por la familia
epiteliales gastrointestinales descamadas y eliminadas de E. coli y puede conducir tanto al hallazgo de nuevos
por las heces. Consiste en un test de hibridización con antibióticos para combatirlas como la fabricación de va-
un MA diseñado para las diez mutaciones más frecuen- cunas58.
tes de los codones 12 y 13 de dicho oncogen48. La detección de anticuerpos circulantes para Toxo-
También se ha desarrollado un MA de baja densidad plasma gondii, rubéola, citomegalovirus y herpes simplex
para discriminar los genes responsables que codifican tipo 1 y 2 ha sido posible a través de los MA sembrados
para 12 tipos de MAGE-A. Estos antígenos son compar- con las proteínas de los respectivos antígenos micro-
tidos por varias clases de tumores y poseen particular bianos59.
interés en la inmunoterapia antitumoral49.
Es cada vez más frecuente el uso de MA para explo- d. Desarrollo de tissue microarrays (TMA)
rar genes moduladores de diversos procesos biológicos.
Así, han sido estudiados los cambios en las células Aplicados al estudio del material de biopsias permiten
endoteliales por diversas noxas, en especial en relación definir la localización celular y la expresión génica in situ
con la patogénesis de la ateroesclerosis, la desregulación en forma rápida y con ahorro del espécimen necesario.
de genes pro y anti-apoptóticos en la aparición de lesio- Amplían el conocimiento de la prevalencia y significado
nes cutáneas del lupus eritematoso, la alteración de com- clínico de muchos genes candidatos. La mayor informa-
ponentes de la matriz extracelular en la cardiomiopatía ción de los TMA proviene de su uso en oncología y ya se
hipertrófica o la resistencia al tratamiento del neuro- comercializan DNA-chips, de marca registrada, que inclu-
blastoma infantil, a través del incremento de la inestabi- yen diferentes subtipos histológicos y con variados gra-
lidad genómica y de la muerte celular por apoptosis50-53. dos de diferenciación de un determinado tumor. La
Abundan las publicaciones que utilizan MA en el es- complementación con técnicas de inmunohistoquímica o
tudio de enfermedades de variada etiología, todas abo- de hibridización in situ permite, por comparación,
cadas a identificar los SNPs o mutaciones involucrados correlacionar la expresión génica del tejido problema con
en mecanismos como el estrés oxidativo, procesos muestras de tejido normal, neoplásico y en diferentes es-
inflamatorios e infecciosos, rechazos de trasplantes, en- tadios del desarrollo tumoral60-62.
540 MEDICINA - Volumen 64 - Nº 6, 2004

e. Mecanismos farmacológicos y blancos ge-nómico a fin de establecer sus futuras implican-

terapéuticos cias68, 69.
El reciente proyecto Hap-Map (mapa de haplotipos)
Es posible aplicar los MA en la comparación de mues- añade un nuevo esfuerzo a la investigación genómica.
tras biológicas con distintos tratamientos y a diferentes La tarea es titánica y consiste en efectuar estudios de
concentraciones del compuesto activo. Ello permite no asociación, comparando secuencias del ADN obtenido
sólo predecir la sensibilidad a ciertos fármacos sino es- de gran cantidad de individuos con diferentes ubicacio-
tablecer una eventual progresiva resistencia, suministran- nes geográficas. Se espera completarlo en tres años y
do nuevas estrategias diagnósticas63. El tratamiento "a ya son previsibles numerosos litigios sobre su paten-
medida", basado en el perfil transcripcional de cada pa- tamiento70.
ciente, facilitará nuevas formas de encarar la terapia y la En conclusión: Los avances tecnológicos de la ultima
prevención y redundará en mejores resultados, con ma- década han impulsado cambios revolucionarios en el
yor sobrevida. campo de la biología molecular. Miles de genes requie-
ren una adecuada investigación para determinar su pa-
f. Teorías sobre la evolución pel en el delicado equilibrio salud-enfermedad.
Así como hoy usamos la historia familiar y la determi-
El reconocimiento de los genes embrionarios y jerárqui- nación del colesterol para predecir el riesgo de una
cos que marcan los diferentes caminos biológicos, per- coronariopatía, los tests de polimorfismos permitirán una
mitirá comprender a fondo el complejo mecanismo de adecuada prevención basada en las improntas génicas
los estadios de diferenciación celular64. Caracterizar esos propias de una gran gama de enfermedades, posibilitan-
genes ancestrales definirá si las variaciones halladas en do una intervención precoz.
el ADN son consecuencia de la acumulación de errores La profundización en el estudio de la variabilidad
durante la evolución o, por el contrario, responden a la genética nos introduce en los albores de una nueva me-
adaptación de la especie a su hábitat natural con el fin dicina. Sin embargo, abundan las polémicas sobre la vio-
de asegurar la supervivencia. Es indudable que los MA lación de la privacidad genética, la diseminación de la
ayudarán al esclarecimiento de la organización genómica información y su posible utilización con fines discrimi-
y la relación evolutiva entre los distintos organismos65, 66. natorios. La ética debe evitar que un individuo marcado
Si bien la técnica de los MA complementa el proyecto por un determinado perfil genético sea marginado y ex-
de secuenciación total del genoma humano, la avalan- cluido de la sociedad.
cha de datos publicados con esta nueva metodología Es previsible que las micromatrices se apliquen tam-
obliga a extremar las precauciones para su interpreta- bién en otros campos. En el área de la agricultura, la
ción. Uno de los factores limitantes es la fluctuación de identificación de determinados SNPs permitirá asociarlos
resultados obtenidos con diferentes matrices diseñadas con atributos de relevancia, como su valor nutricional, el
con el mismo fin. Generalmente ello ocurre por una se- poder quimiopreventivo en el desarrollo de ciertas enfer-
lección inadecuada del número de replicados y el déficit medades y la resistencia a plagas o sequías con el obje-
en el análisis estadístico para discriminar el "ruido de to de mejorar las cosechas. La información es brindada
base" de mínimas variaciones en la expresión génica. en la web a través del Access To Global Online Research
Los expertos consideran previsibles estas diferencias por in Agriculture (AGORA).
lo reciente y cambiante de esta novedosa tecnología y
se esfuerzan en afinar los métodos estadísticos para la
interpretación de los resultados. Para ello se reúne des- Bibliografía
de hace cuatro años el comité Critical Assessment of
Microarray Data Analysis (CAMDA). Dada la compleji- 1. Hellmann I, Zollner S, Enard W, Ebersberger I, Nickel
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----
II
Para dialogar,
preguntad, primero:
después. . . escuchad

Antonio Machado (1875-1938)

Nuevas Canciones (1917-1930). CLXI.-Proverbios y cantares.

En: Poesías. Buenos Aies: Losada, 1995, p 213