UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID

FACULTAD DE MEDICINA

Alteraciones del Intersticio

Testicular y de la Pared Peritubular
en la Insuficiencia Hepática Crónica
y en la Criptorquidia Postpuberal.

TESIS DOCTORAL

Rosa María Baldonedo Costoya

Madrid, 2015
 AGRADECIMIENTOS:

a la Profesora Dra. Pilar González-Peramato, por su amabilidad y su permanente asesoría en

todos los aspectos científicos de este trabajo

al Prof. Javier Regadera, por sus enseñanzas científicas, su dedicación constante y su paciencia
durante la elaboración de la presente Tesis Doctoral

al Prof. Manuel Nistal, por su magisterio al señalar el camino científico durante la realización de
este estudio

a Dña. Carmen Sánchez-Palomo, por su oportuna ayuda en múltiples aspectos prácticos de

histotecnología y a Dña. Raquel Marcos, por el procesamiento de las inmunotinciones

al Lic. Juan Pedro Velasco-Martín, por su inestimable ayuda en los aspectos informáticos de este
trabajo

al Dr. Luis Alberto Condezo, por su excelente asesoría estadística

al Ing. Antonio Baldonedo Costoya y a Lic. Margarita Benavides Valls, por su gran colaboración
en el arte gráfico de este trabajo

al Dr. Carlos de Gorospe Pérez-Jáuregui, al Dr. José Manuel Bádenas Sierra y a la Dra. Pilar Piñero
Campos, por su apoyo al proyecto y entusiasmo contagioso

al Dr. Roald Gómez Pérez, por haber iniciado todo el proceso de investigación en endocrinología
andrológica, y por su amistad

a la Lic. Lucila Pardo Ruiz, por su asesoría técnica muy necesaria para la preparación de la tesis, y
por su constante preocupación por el desarrollo del proyecto
 DEDICATORIA:

a mi marido Hector y a mis hijas Laura y Ana, por todo su cariño y apoyo

a mi padre Siro, a mi madre Laura y a mi tía Chelo,

que son el ejemplo que siempre ha orientado mi vida

y a toda mi familia, que han colaborado de diversas formas durante

la realización de este proyecto

a Carlos Schneider Weissman y a Luis Beltrán Cabrera por ser mi inspiración

para seguir en contacto con la investigación, a pesar de los obstáculos,
y por ser mis amigos, más allá del tiempo y la distancia
 Índice

INTRODUCCIÓN............................................................................................................ 1
ESTRUCTURA Y REGULACIÓN PARACRINA DEL TESTÍCULO ....................................... 2
Células de Sertoli .............................................................................................. 4
Las células de Sertoli en la regulación paracrina testicular.............................. 5
Pared Peritubular.............................................................................................. 7
Intersticio Testicular ......................................................................................... 8
Células de Leydig .............................................................................................. 9
Fibroblastos CD34 + ........................................................................................ 11
Macrófagos ..................................................................................................... 13
Células cebadas .............................................................................................. 15
Insuficiencia hepática crónica y patología testicular...................................... 17
Criptorquidia y síndrome de Disgenesia Testicular ........................................ 21
Estrógenos y Disruptores endocrinos............................................................. 23
Finalidades de la presente Tesis Doctoral ...................................................... 26
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS............................................................................................. 28
MATERIAL Y MÉTODOS.............................................................................................. 30
MATERIAL ................................................................................................................... 31
MÉTODOS ................................................................................................................... 31
Métodos de Estudio Histológico General ....................................................... 31
Métodos de Secciones con Microtomo y Tinciones Histológicas .................. 32
Método Inmunohistoquímico Estreptavidina-Biotina-Peroxidasa................. 33
Métodos de Cuantificación del intersticio testicular
y de la pared peritubular ................................................................................ 35
Software.......................................................................................................... 36
Colour deconvolution ...................................................................................... 37
Segmentación ................................................................................................. 37
Cuantificación ................................................................................................. 38
Métodos Estadísticos ...................................................................................... 38
Manejo de Datos ............................................................................................ 38
Técnicas Fotográficas...................................................................................... 38
 Índice

RESULTADOS .............................................................................................................. 39
Características clínicas y estudio histológico del parénquima
testicular ......................................................................................................... 40
Diámetro tubular en los diferentes grupos de estudio. ................................. 44
Estudio histológico con inmunotinciones....................................................... 45
Evaluación de inmunotinción CD34+.............................................................. 76
Cuantificación de macrófagos CD68 +. ........................................................... 77
Cuantificación de células cebadas triptasa +. ................................................. 78
DISCUSIÓN ................................................................................................................. 80
CONCLUSIONES .......................................................................................................... 95
RESUMEN ................................................................................................................... 98
ABSTRACT................................................................................................................... 99
REFERENCIAS............................................................................................................ 101
 Introducción 1

INTRODUCCIÓN
 Introducción 2

ESTRUCTURA Y REGULACIÓN PARACRINA DEL TESTÍCULO

El testículo humano está constituido por los tubos seminíferos y el intersticio testicular, el
cual contiene abundantes vasos sanguíneos, vasos linfáticos y células de Leydig, así como
macrófagos, células cebadas, tejido conjuntivo laxo y terminaciones nerviosas.171 En el testículo
humano la espermatogénesis y la esteroidogénesis se desarrollan respectivamente en los
tubos seminíferos y en el intersticio testicular intertubular. A pesar de que ambos
compartimientos se encuentran anatómicamente separados, están estrechamente regulados
entre sí. La función de los testículos, y de sus compartimientos está regulada por el
hipotálamo y la hipófisis y estos efectos endocrinos están mediados y modulados a nivel
testicular por mecanismos de control local: los factores paracrinos, que actúan entre células
vecinas, principalmente por difusión, y autocrinos, factores que son liberados desde una
célula y actúan en esa misma célula.270 Es evidente que los mecanismos endocrinos juegan un
papel fundamental en la regulación de la función testicular, y factores producidos localmente
son importantes para la modulación de la actividad hormonal.

Algunos factores testiculares podrían ser mediadores de la acción hormonal y de la

comunicación intra e intercelular (Figs 1 y 2).

Fig. 1. Regulación endocrina: eje hipotálamo-hipófiso-testicular.

 Introducción 3

Fig. 2. Estructura testicular, y corte transversal de un tubo seminífero.

Se han estudiado una gran variedad de factores con potencial paracrino testicular:
factores de crecimiento, factores de células madre, factores inmunológicos, opioides,
oxitocina, vasopresina, sustancia modificadora de células peritubulares, renina, angiotensina,
hormona liberadora de hormona de crecimiento (GHRH), hormona liberadora de
corticotropina (CRH), corticotropina (ACTH), hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) ,
calmodulina, ceruloplasmina, proteínas transportadoras, glicoproteínas, activador de
plasminógeno, metaloproteasas, dinorfina, etc.269 Generalmente, el factor de crecimiento
semejante a insulina I (IGF-I) y el factor de crecimiento transformante alfa (TGF-α) ejercen
una acción estimulante en el testículo, mientras que el factor de crecimiento transformante
beta (TGF-β) actúa como inhibidor. En la rata, el desarrollo de las células de Leydig se
mantiene por una interrelación entre TGF-α y TGF-β, y la actividad de la hormona luteinizante
(LH) es modulada por IGF-I. Este factor influye directamente en la espermatogénesis. En el
hombre, el IGF-I muestra la mayor expresión en los espermatocitos y estimula la síntesis de
DNA en las células germinales en mitosis. La administración de IGF-I a pacientes, mostró un
aumento del tamaño del testículo, así como un incremento en la secreción de gonadotropina
y testosterona.134
 Introducción 4

CÉLULAS DE SERTOLI

El tubo seminífero se encuentra dividido en dos compartimientos:

1. Compartimiento basal: entre la lámina basal y las uniones Sertoli-Sertoli.

Contiene espermatogonias y los espermatocitos de primer orden recién
formados.
2. Compartimiento adluminal: por encima de las uniones Sertoli-Sertoli. Se
encuentran allí los espermatocitos de primero y segundo orden y espermátidas.
En el interior de los tubos seminíferos, la espermatogénesis está regulada por factores
que secretan las células de Sertoli, las cuales también tienen mecanismos de regulación
paracrinos con las células de Leydig, los macrófagos intersticiales y las células miodes
peritubulares. Las células de Sertoli son las células diana para la hormona folículo estimulante
(FSH)229 y los andrógenos.240 Las células de Sertoli son células cilíndricas que se apoyan en la
lámina basal y alcanzan la luz tubular y en el adulto muestran un núcleo de contorno
triangular y con nucléolo evidente. Una sección tubular transversal contiene de 10 a 12
células.219 El citoplasma emite una gran cantidad de prolongaciones laterales que rodean a las
células germinales próximas, a través de las cuales contacta con otras células de Sertoli
vecinas, estableciéndose un tipo de unión característica denominada especialización
ectoplásmica, única y específica del testículo. Consiste en uniones Sertoli-Sertoli (uniones
adherentes, uniones estrechas y nexos) y uniones entre las células de Sertoli y las células
germinales (mediadas por N-cadherina).7 En el testículo se han identificado tres clases de
proteínas de membrana: ocludina, claudinas y moléculas de uniones adherentes.41,143
Además, entre la membrana plasmática de las células de Sertoli y las cisternas de retículo
endoplásmico se encuentran otras moléculas, incluidas moléculas de anclaje de los
filamentos de actina, vinculina, zónula ocluyente 1, 2 (ZO-1, ZO-2), placoglobina, radixina y
nectinas.267Las uniones estrechas constituyen la base morfológica de la barrera
hematotesticular, proporcionando el ambiente necesario para la espermatogénesis. Se ha
comenzado a estudiar la influencia de dicho control en la adhesión celular, pero todavía es
necesario avanzar más en la investigación para comprender la regulación transcripcional de la
función de la adhesión celular en los testículos en particular en la barrera hematotesticular
durante la espermatogénesis.142 Se ha postulado que la matriz extracelular regula la función
 Introducción 5

de barrera hematotesticular y de modo particular, regula también las uniones estrechas que
se establecen entre las células de Sertoli y los espermatocitos y las espermátides. 41,120 La
estructura de la barrera hematotesticular y de la membrana basal testicular están
relacionadas directamente con las uniones intercelulares en el epitelio testicular. 230

La función de adherencia celular que permite la unión de las células germinales a las
células de Sertoli en el epitelio seminífero, viene dada por las unidades de adhesión de
células de Sertoli con la matriz extracelular.3,230 Estas unidades constan de tres entidades
separadas: 1) Receptores de adhesión transmembrana, que se unen con componentes de la
matriz extracelular o con receptores externos de otras células; ellos también determinan la
especificidad de las interacciones entre las células, y entre ellas y la matriz, lo que incluye las
integrinas, cadherinas y nectinas.45,264 2) Proteínas de la membrana extracelular, que son
largas glicoproteínas que interactúan con múltiples receptores de superficie celular. 3)
Proteínas periféricas intracelulares, que ponen en contacto los receptores de adhesión a la
actina subyacente, y que corresponden a filamentos intermedios o microtúbulos del
citoesqueleto.89,120,230

Las células de Sertoli en la Regulación Paracrina Testicular

En la regulación funcional de la espermatogénesis es fundamental, de una parte la

integridad de la barrera hematotesticular, formada por las uniones Sertoli-Sertoli, y de otra,
la integración de factores paracrinos establecidos entre las células de Sertoli, las células de
Leydig, y los macrófagos y otras células miodes y componentes de la matriz extracelular del
intersticio testicular, sin olvidar también la participación de mecanismos de regulación
autocrina que ocurren en cada una de las células testiculares.43

Las células de Sertoli están bajo el control paracrino de las células germinales,
presentando variaciones en los requerimientos de sustancias metabólicas dependiendo de la
fase del ciclo espermatogénico.72 Se ha demostrado, por inmunohistoquímica, la presencia de
receptores para los andrógenos en el núcleo, y su expresión varía con los estadios de la
espermatogénesis en el testículo humano.240 Además, presentan en el citoplasma
abundantes filamentos de vimentina, F-actina y α-tubulina. La F-actina participa en la
 Introducción 6

formación de las uniones Sertoli-Sertoli y su distribución también varía con el ciclo del
epitelio seminífero.159,235 Se ha demostrado una correlación positiva entre el número total de
células de Sertoli y la producción diaria de espermatozoides.114 Las células de Sertoli
disminuyen en número con la edad, y se estima que después de los 50 años sólo queda la
mitad.189

Las inhibinas y activinas son moléculas secretadas por las células de Sertoli y estas
moléculas, asimismo, están reguladas por FSH y participan en la secreción de esta hormona.
Ambos grupos de moléculas (inhibinas y activinas) pertenecen a la superfamilia del factor de
crecimiento transformante beta (TGFβ). Las inhibinas consisten en un heterodímero con una
misma subunidad alfa unida a una subunidad βA o βB, para formar inhibina A o inhibina B,
respectivamente. En cambio, las activinas son homodímeros (βAβA o βBβB). Generalmente,
las activinas se consideran factores estimulantes de la proliferación de espermatogonias,
mientras que las inhibinas ejercen una función inhibitoria. La concentración sérica de inhibina
se correlaciona con la actividad espermatogénica, con el tamaño testicular y con la
producción de esperma y puede ser utilizado como un indicador endocrino de defectos
espermatogénicos.26,148 Las activinas inhiben o estimulan la esteroidogénesis en las células de
Leydig en distintas especies.24 En el hombre, la inhibina, secretada por las células de Sertoli en
los túbulos seminíferos, llega a los conductos eferentes, donde es reabsorbida en el torrente
sanguíneo.167 De otra parte, los niveles de bioactividad de la activina participan también en el
control de la espermatogénesis y en el control de las diferentes etapas de desarrollo
testicular14,55 y el inicio de la espermatogénesis.15 La inhibina B es probablemente el principal
regulador de retroalimentación de la secreción de FSH en el hombre97,123 y participa en la
regulación paracrina testicular.58 Además, la inhibición de la secreción de FSH por los
esteroides sexuales es más evidente cuando los niveles en suero de inhibina B están muy por
debajo del rango normal.26Existen datos que han demostrado que las células germinales
tienen el potencial de regular su propia maduración a través de la producción endógena de
activina A y folistatina.150 En biopsias testiculares de pacientes con subfertilidad se han
encontrado células de Sertoli inmaduras y disgenéticas con cambios de la inmunoexpresion
de inhibina, lo cual es muy evidente en los casos con criptorquidia, o con tumores
testiculares.176
 Introducción 7

PARED PERITUBULAR

La túnica propia que rodea cada túbulo seminífero está compuesta por células y por
matriz extracelular. Las células mioides peritubulares son fundamentes en el mantenimiento
de la estructura y función de los tubos seminíferos, pero en la pared peritubular también se
identifican otros elementos celulares del tejido conjuntivo, incluidos los fibroblastos, los
macrófagos y las células cebadas.

Las células mioides peritubulares son miofibroblastos, que representan el principal

componente celular de la pared de los tubos seminíferos.218 En los miofibroblastos
peritubulares, el análisis de expresión génica y los análisis inmunohistoquímicos de proteínas
que son codificadas por estos genes revelan una expresión predominante de genes de la
matriz extracelular y de genes que codifican los componentes de la membrana basal. Estos
miofibroblastos tienen receptores para histamina y triptasa que son los productos más
activos secretados por las células cebadas presentes en el intersticio testicular.4En las células
mioides peritubulares se ha identificado la proteína vinculina, que participa en mecanismo de
adhesión celular, la cual también está presente en las células musculares lisas de los
pequeños vasos sanguíneos del intersticio testicular.160,197 La vinculina regula los complejos
cadherina/catenina y su union al citoesqueleto de actina.200 A diferencia de la vinculina, α-
catenina se restringe a las uniones adherentes de célula-célula, pero no las uniones focales
adherentes entre célula y matriz extracelular.196,200

El colágeno tipo IV202 y la laminina son los constituyentes más abundantes de la

membrana basal testicular.3,56,244,245 El colágeno IV no solo es una proteína estructural, sino
también es una proteína de señalización testicular, participando en la transducción de
señales a través de los receptores transmembrana, como las integrinas.3,186,239 En la matriz
extracelular también se ha identificado el colágeno tipo I.186,199

INTERSTICIO TESTICULAR

El intersticio testicular, además de contener a las células de Leydig, está formado por
tejido conectivo laxo en el que se identifican fibroblastos, macrófagos y células cebadas, así
como fibras de colágeno y moléculas de la matriz extracelular. (Fig.3).
 Introducción 8

Los componentes celulares y extracelulares del intersticio testicular son

cualitativamente similares en los diferentes mamíferos, a pesar de que su composición
cuantitativa es específica para cada especie.56,66,220 En el testículo también se han descrito
proteínas de la matriz extracelular, incluidas el colágeno, la laminina, la fibronectina, la
vitronectina y el fibrinógeno. El colágeno tipo IV,3,61,208,231 laminina,3,61,128,208 heparán-sulfato-
proteoglicanos,3,61,141 y entactina,61,139 están íntimamente asociados con la barrera
hematotesticular.

Los vasos sanguíneos del tejido intersticial están formados por arterias de pequeño
calibre, arteriolas, capilares y vénulas, las cuales drenan a las pequeñas venas intertubulares.
Los capilares intertubulares e intersticiales no están fenestrados.207 Los vasos linfáticos del
intersticio testicular son también muy abundantes y en los roedores forman grandes
sinusoides, en contraste con el testículo humano, en el que estos vasos existen solo en los

principales septos de tejido conectivo que se extienden desde la túnica albugínea.220

Fig. 3. Componentes celulares y extracelulares del intersticio testicular, y tubos

seminíferos.
 Introducción 9

Células de Leydig

El componente celular más importante del intersticio testicular está constituido por las
células de Leydig. Fueron descritas por primera vez por Franz von Leydig en 1850. 137 Estas
células se encuentran en pequeños grupos o también aisladas, generalmente alrededor de los
171
capilares. Ocasionalmente, se pueden disponer adosadas a la pared peritubular. Las
células de Leydig ocupan solo del 10 al 20% del tejido intersticial de los mamíferos,
incluyendo a los humanos.56,66

Las células de Leydig se pueden originar, tal como se ha sugerido en estudios

experimentales en ratas, tanto a partir de células peritubulares, como de células musculares
lisas y pericitos.54 Se ha establecido una relación entre los pericitos y las células de músculo
liso vascular y el origen de las células de Leydig, aunque ha sido difícil poder probarlo, ya que
estos grupos celulares no expresan factores esteroidogénicos y enzimas características de las
células de Leydig; pero el descubrimiento del modo de transición de esas células de las
paredes vasculares hasta convertirse en células de Leydig, en particular el proceso de
transdiferenciación, fue crucial para establecer a los pericitos y las células musculares lisas
como los precursores de las células de Leydig.53,54

La células de Leydig sintetizan y secretan andrógenos, especialmente testosterona,

esencial para la espermatogénesis.66 La secreción de testosterona por las células de Leydig
está bajo el control directo de la hormona luteinizante (LH).33,34,40,42,65,80,91,187,195,237,253 Las
células de Leydig son las responsables de la virilización del varón, mediante la acción directa
de la secreción de testosterona libre y conjugada, cuyos niveles se encuentran altos en el
varón normal. 56,66

Las células de Leydig poseen un gran desarrollo de las organelas involucradas en la

síntesis de hormonas esteroideas, como el retículo endoplásmico liso, mitocondrias
pleomórficas de crestas tubulares y matriz clara, abundantes lisosomas y peroxisomas,
organelas implicadas en la síntesis y regulación intracelular de la esteroidogénesis. Las células
muestran importantes cambios morfológicos en relación con los seis estadios del ciclo del
epitelio seminífero.191 La capacidad funcional de las células de Leydig se puede explorar con
técnicas específicas de 3-beta-hidroxiesteroidohidrogenasa (3β-HSD),41,165 y más
 Introducción 10

recientemente con anticuerpos anti-testosterona conjugada.205 Pero además, las células de

Leydig muestran inmunorreactividad específica para receptores de LH, 3β hidroxiesteroide
deshidrogenasa (3β-HSD), inhibina, calretinina,238 y ghrelina.17También contienen un gran
número de sustancias que sugieren una función neuroendocrina: oxitocina,
propiomelanocortina, sustancia P, endorfina, moléculas de adhesión neurales (N-CAM) y
proteína asociada a microtúbulos (MAP-2). En las células de Leydig próximas a los vasos, se
observa actividad inmunohistoquímica de sinaptofisina y cromogranina A y B.

La función de las células de Leydig depende del mantenimiento de un volumen

relativamente constante de fluido en los espacios intersticiales.12 Un volumen constante de
líquido intersticial es esencial para la transferencia óptima de oxígeno y otros solutos desde
los capilares a las células de Leydig, y para la difusión de factores paracrinos en el tejido
intersticial testicular. Por otra parte, un volumen importante de fluido es necesario para
realizar el intercambio de productos de desecho celular hacia los capilares y permite el paso
de los productos secretorios de las células de Leydig al torrente sanguíneo, a través de las
vénulas post-capilares.90

Se sugiere que la calretinina puede desempeñar un papel en la producción de

testosterona.238 En los testículos después de la pubertad, la calretinina se expresa en las
células de Leydig, pero no en células germinales o en células de Sertoli de adultos normales ni
en las células de la rete testis.32 Las células de Leydig expresan calretinina en todas las
biopsias estudiadas de varones adultos y sirven como control interno de inmunorreactividad.
En biopsias testiculares, realizadas para la recuperación de espermatozoides para técnicas de
fertilización in vitro, en hombres azoospérmicos, se identificó la expresión de calretinina en
células de Sertoli anormales. Este patrón de expresión calretinina-selectivo en las células de
Sertoli inmaduras sugiere una relación funcional entre la expresión de calretinina y el grado
de diferenciación de las células de Sertoli.18 La calretinina es un interesante marcador de las
células de Leydig normales y neoplásicas y puede ser de valor en el diagnóstico del tumor de
células de Leydig pobremente diferenciado.11
 Introducción 11

Fibroblastos CD34 +

El antígeno CD34 es una glicoproteína que se encuentra en las células

hematopoyéticas inmaduras y en las células endoteliales. El antígeno CD34 ha sido
descubierto como un marcador de células hematopoyéticas humanas. Es una molécula de
110 kDa, una glicoproteína de superficie transmembrana. El gen CD34 está localizado en el
cromosoma 1 en la región 1q32. Se han detectado células neoplásicas CD34+ en varios
tumores mesenquimales.252

En el intersticio testicular y en la pared peritubular del hombre adulto, se han

identificado células de morfología dendrítica que corresponden a células estromales CD34+.
Están presentes en la túnica albugínea y alrededor y entre los tubos seminíferos, formando
una red que rodea a las células de Leydig. Aunque estas células han recibido múltiples
denominaciones, Díaz-Flores et al, proponen unificar dicha terminología llamando a estas
células CD34+SFCs (células estromales/ fibroblastos/ fibrocitos/ telocitos CD34+). En los
cortes histológicos, las células CD34+SFCs (en adelante: células CD34+) se caracterizan por su
pequeño soma celular y por presentar múltiples y finas extensiones citoplásmicas, que
pueden ser bipolares o multipolares. Estas extensiones citoplásmicas se comunican con las de
las células vecinas, y forman una red. Son células aplanadas y por ello no es fácil observarlas
con el microscopio óptico.60

Los fibroblastos o fibrocitos CD34+ son un subgrupo de fibroblastos localizados en el

tejido conjuntivo de múltiples localizaciones anatómicas, tanto en el área perivascular como
en el estroma, habiéndose descrito en mama, tiroides, glándulas submandibulares, colon,
páncreas, meninges, amígdalas palatinas, y cuello uterino.19,20,21,51,163,192,252,273,274,275,276 Estas
células CD34+ participan en el recambio de la matriz extracelular, produciendo colágeno tipo
I, III y V, y fibronectina en el intersticio testicular, pero también contribuyen en la formación
de la membrana basal y en la secreción de laminina y colágeno tipo IV. Por lo tanto, son
células reguladoras del contenido de colágeno del tejido conjuntivo, y pueden responder a
múltiples estímulos, como factores de crecimiento (por ejemplo: TGF-β1, IGF, PDGF y otros)
cambiando la producción de colágeno y de metaloproteinasas de la matriz. Además de
expresar la glicoproteína CD34, las células CD34+ pueden expresar otros marcadores
 Introducción 12

inmunohistoquímicos, como vimentina, CD10, bcl2, CD117, CD99, desmina y citoqueratinas,

dependiendo de su localización, actividad funcional y participación en procesos patológicos.
Las células CD34+, además de considerarse células progenitoras de células mesenquimales,
realizan otras múltiples funciones: inmunomodulación, soporte estructural de otras células, y
propiedades fagocíticas.60 Los estudios sobre células CD34+ en el estroma testicular humano
son escasos y se ha relacionado las células estromales CD34+ y los miofibroblastos.21,87,130,265

En torno a los tubos seminíferos, en la pared peritubular, se observan dos capas: los
fibroblastos CD34+ en la capa externa, y los miofibroblastos en la capa
interna.9,31,46,52,57,75,105,115,123,130,133,153,212,251,263Los miofibroblastos y la red de células CD34+ se
encuentran presentes en el estroma testicular durante el desarrollo fetal y neonatal. 130
Cuando se realiza una doble inmunotinción de testículos fetales, neonatales y adultos es
posible identificar α-actina de músculo liso y CD34, lo cual ha permitido confirmar que los
miofibroblastos y las células estromales CD34+ están presentes, respectivamente, en la capa
interna y externa del tejido peritubular.130 Usando una doble inmunotinción, se observó que
las células peritubulares expresan tanto antígenos CD34 como antígenos de actina de
músculo liso (SMA) de forma focalizada. Se sugiere que las células estromales CD34+ y los
miofibroblastos pueden tener el mismo origen.130 Recientemente se ha obtenido y purificado
una nueva línea de células CD34 positivas, identificadas como JK1, derivadas del estroma
testicular de ratón que facilitaron el cultivo a largo plazo de las células madre progenitoras
espermatogónicas y células madre pluripotenciales,124 lo cual abre nuevas expectativas de
investigación del estroma intersticial testicular y de las células CD34+.

Por último, las células CD34+ de la capa externa de la pared peritubular se disponen en
íntima vecindad de las células CD34+del intersticio testicular, las cuales rodean a las células
de Leydig; pero además, las prolongaciones citoplasmáticas finas de las células CD34+ están
estrechamente conectadas a la membrana celular de los macrófagos del estroma. Todos
estos datos permiten especular a favor del papel que pueden jugar las células CD34+
testiculares, al igual que se ha sugerido previamente para otros órganos, en la vigilancia
inmunológica del intersticio testicular.130,274,275
 Introducción 13

Macrófagos

Las células inmunocompetentes son relativamente escasas en el intersticio testicular,

dado que el testículo normal es un órgano protegido frente a la respuesta inmunológica; no
obstante, en el intersticio testicular se pueden identificar muy escasos linfocitos, siendo más
abundantes los macrófagos, los cuales, además de su función fagocitaria en situaciones
patológicas, en el testículo normal participan también en mecanismos de regulación
paracrina testicular, disponiéndose en íntima vecindad de las células de Leydig.107,154 Se sabe
que los andrógenos regulan la respuesta inmune testicular y participan en la inhibición de la
expresión de citoquinas proinflamatorias, lo que facilita que el testículo tenga un ambiente
inmunológicamente tolerante.71 En el testículo humano adulto normal se describe que hay un
macrófago por cada 10-50 células de Leydig y representan cerca del 25% de todas las células
del intersticio testicular. Se sabe que los macrófagos participan en la proliferación y
diferenciación de las células de Leydig. Los macrófagos secretan sustancias estimulantes e
inhibidoras de la esteroidogénesis. Las citoquinas proinflamatorias, especies reactivas de
oxígeno, óxido nítrico y protaglandinas pueden inhibir la función de la célula de Leydig.93,222
Los macrófagos testiculares se pueden clasificar en dos categorías:

1) Macrófagos residentes, relacionados con la regulación funcional de las células de

Leydig normales.

2) Macrófagos activados, presentes en pacientes con infertilidad u otras patologías

testiculares, y que producen interleuquina 1 (IL-1) y 6 (IL-6), factor de necrosis tumoral alfa
(TNFα) y factor transformador de crecimiento α (TGFα), moléculas que juegan un papel muy
importante en los procesos inflamatorios o tumorales, incluidos los que ocurren en el
testículo.79,92

Los macrófagos testiculares tienen disminuida la capacidad de excreción de algunas

citoquinas como IL-1β y TNF-α, comparados con los macrófagos de otros tejidos.96 La
expresión de citoquinas pro-inflamatorias como IL-1β, TNF-α e Interferón γ (IFN-γ) por los
macrófagos testiculares, sin embargo, demuestra la capacidad testicular para la respuesta
inflamatoria.62,109 En pacientes infértiles con diferentes grados de alteración de la
espermatogénesis, se ha visto un incremento del número de macrófagos.269 Estos macrófagos
 Introducción 14

tienen una mayor expresión de los genes de la IL-1 y el TNF-α, y además estas moléculas se
han identificado inmunohistoquímicamente en el intersticio testicular, en la pared tubular, y
en el lumen tubular. En el síndrome de sólo células de Sertoli y los síndromes de parada en la
maduración de las células germinales, el número total de macrófagos se incrementó en más
del doble, observándose en algunos casos la migración de los macrófagos intersticiales hacia
el lumen tubular.73

Células cebadas

En el intersticio testicular humano también se identifican células cebadas,180 las cuales

pudieran participar en diferentes procesos de la regulación paracrina testicular. Las células
cebadas testiculares se localizan más frecuentemnete alrededor de los vasos de los tabiques
intersticiales y de la túnica vasculosa subalbugínea, pero también las células cebadas son muy
abundantes en el parénquima intertubular, dispuestas alrededor de la microvasculatura y de
las células de Leydig intersticiales y peritubulares. En el testículo humano normal, el número
de células cebadas cambia con la edad, aumentan levemente en la primera infancia,
disminuye durante la progresión del desarrollo infantil, y aumenta de nuevo en la pubertad,
para disminuir en la senectud;179contrariamente, se ha descrito el aumento del número de
células cebadas en hombres con problemas de infertilidad.8,223

Las proteasas de las células cebadas quimasa y tripsina inducen la proliferación de

fibroblastos in vitro, tanto en modelos animales como en células humanas.25,78,184,213 Las
células cebadas pueden regular los mecanismos de fibrosis a través de la activación de las
metaloproteinasas de la matriz extracelular (MMPs), que constituyen una familia de enzimas
proteasas involucradas en el remodelado de la matriz extracelular durante el desarrollo
normal y también en procesos de fibrosis tisular.234,266 Las principales MMPs son la MMP 2 y
la MMP 9. 4,125,210,242 Además, se sabe que las células cebadas se relacionan directamente con
numerosos mecanismos de regulación del sistema inmunológico innato y adaptativo;81,236 por
ejemplo, en el cerebro, las células cebadas pueden cambiar la permeabilidad vascular de la
barrera hematoencefálica de linfocitos T activados, e incrementa el tráfico de células
inflamatorias. Las células cebadas secretan triptasa (una proteasa de serina), la cual es un
mitógeno para fibroblastos.5,78,149,184,213La triptasa puede actuar en los receptores activados
 Introducción 15

por proteasas 2 (PAR2) y causar la proliferación de los fibroblastos, aumentando la síntesis de

colágeno. La activación de PAR2 conduce a una mayor expresión de la ciclooxigenasa 2 (COX-
2), una enzima clave en la biosíntesis de prostaglandina y en la proliferación celular.74

El aumento del número de células cebadas activadas se correlaciona con la fibrosis en

los testículos de hombres infértiles y, por ello, las células cebadas pueden participar en los
mecanismos de fibrosis, engrosamiento e hialinización de la pared de los tubos seminíferos e
incremento de la matriz extracelular. Por lo tanto, las células cebadas desempeñan un papel
clave en la fibrosis peritubular y en la atrofia testicular.269 En la fibrosis peritubular, las células
cebadas, junto con los macrófagos, son fuente de la secreción de TNF-α, molécula que es bien
conocida como reguladora de procesos de fibrosis, tal como recientemente se ha demostrado
en las células peritubulares del testículo humano.218 Así mismo, en los pacientes con atrofia
mixta testicular, ocurre aumento del número de células cebadas testiculares y cambios en su
fenotipo, modificándose su capacidad de expresar la COX-2 y de sintetizar prostaglandinas.

En la actualidad, las células cebadas y las prostaglandinas se han convertido en

moléculas protagonistas de mecanismos implicados en la disfunción espermatogénica.271 En
este sentido, se ha demostrado que los inhibidores de células cebadas, evitando su activación
y degranulación, son beneficiosos en el tratamiento de la oligozoospermia idiopática y de la
oligostenozoospermia.39,104 Además, las células peritubulares testiculares humanas expresan
receptores para los productos de las células cebadas, histamina y triptasa,4 lo cual podría ser
útil en el mantenimiento de un fenotipo inmunosupresivo.269 En el síndrome de sólo células
de Sertoli y en el síndrome de parada de la maduración de las células germinales, el
incremento del espesor de las paredes tubulares se correlacionó positivamente con el
aumento del número de células cebadas, que además mostraron una citología diferente, con
formas redondeadas o alargadas y signos de degranulación. Los productos de degranulación
de las células cebadas, incluyendo la triptasa, que es un potente factor de crecimiento de
fibroblastos, muy probablemente estén involucrados en el engrosamiento de la pared
tubular, en la hialinización peritubular, en fibrosis intersticial y atrofia testicular de los
pacientes infértiles.8,151
 Introducción 16

Los mecanismos íntimos del inicio de esta fibrosis peritubular no se conocen bien, pero
datos experimentales sugieren que, muy probablemente, determinadas alteraciones de la
membrana basal tubular pueden participar en el desarrollo de infertilidad, puesto que en
algunos pacientes se han detectado alteraciones morfofuncionales de la membrana basal y el
depósito de inmunocomplejos.136,214,215 Además, la membrana basal tubular también muy
frecuentemente se encuentra engrosada en hombres subfértiles con varicocele,217
criptorquidia,6 o después de la vasectomía.110

En pacientes con azoospermia, se han detectado alteraciones de la membrana basal y

de los mecanismos inmunológicos que actúan en el testículo humano.136,215 El estudio de
biopsias testiculares de hombres con azoospermia, incluyendo pacientes con síndrome sólo
Sertoli, ha demostrado que el contaje de células cebadas, linfocitos T y B y macrófagos CD68
es mayor en síndrome sólo Sertoli, que en los casos con espermatogénesis normal;106 si bien
el incremento de células T, B y macrófagos no ha demostrado diferencia significativa, el
aumento de células cebadas en biopsias con síndrome de sólo Sertoli ha sido
significativamente mayor que en el grupo control; por ello, es necesario realizar nuevos
estudios acerca de la participación de las células cebadas en diferentes patologías testiculares
causantes de infertilidad en el varón.

INSUFICIENCIA HEPÁTICA CRÓNICA Y PATOLOGÍA TESTICULAR

El hígado juega un papel fundamental en el metabolismo, detoxificación y excreción de

los esteroides sexuales. La insuficiencia hepática crónica (IHC) daña el eje hipotálamo-
hipófiso-testicular, y por consiguiente todas las glándulas endocrinas relacionadas con el
metabolismo de los esteroides sexuales. En la enfermedad hepática crónica, el principal
factor patogénico de la subfertilidad está relacionado con la pérdida del parénquima
hepático, 259 y en general, la cantidad de tejido hepático residual funcionante se correlaciona
con el grado de deficiencia androgénica en estos pacientes.85,95,112,121,127,132,201,254,255 El
hipogonadismo es más evidente cuando avanza la enfermedad hepática crónica y se
convierte en una enfermedad severa, como ocurre en el alcoholismo, en las hepatopatías
fibróticas precirrogénicas, y en la hemocromatosis.280La IHC está asociada con importantes
manifestaciones de hipogonadismo, incluyendo infertilidad, hipoespermatogénesis, atrofia
 Introducción 17

testicular, ginecomastia, disminución del vello corporal y disfunción sexual.269 La biopsia

testicular en pacientes con fibrosis hepática demuestra importante disminución del diámetro
tubular, hipoespermatogénesis severa, fibrosis y sobre todo hialinizacion de la pared
peritubular. Además, el intersticio está ampliado y en él se ven numerosas células de Leydig,
agrupadas en grandes nódulos, lo que, aparentemente, da un aspecto de falsa hiperplasia,
rodeando a estas células se observa edema y fibrosis del tejido conjuntivo intersticial. Sin
embargo, esta fibrosis intersticial no se asocia a un incremento del número de células
cebadas activas en la biopsias de pacientes cirróticos, respecto del control, cuando estas
células cebadas se identifican con el método histoquímico de fucsia aldehído de Gomori o el
método de azul alcián.180

La producción de testosterona total y la testosterona libre biológicamente activa está

disminuida en pacientes con IHC, lo que determina niveles circulantes más bajos; sin
embargo, existe un aumento concomitante de los niveles circulantes de la globulina fijadora
de hormonas sexuales (SHBG) con la consiguiente disminución en la velocidad de eliminación
renal de testosterona, lo que puede enmascarar la severidad de la deficiencia androgénica. 144
De hecho, aproximadamente el 20 % de los pacientes con IHC tienen un incremento inicial de
la testosterona sérica, mientras que en la enfermedad avanzada, los niveles de testosterona
disminuyen. El incremento inicial se debe a una elevación de la SHBG y su metabolismo
disminuido en el hígado.243

En los pacientes con enfermedad hepática crónica, a pesar de los niveles bajos de
testosterona, los niveles de gonadotropinas permanecen por debajo o dentro del rango
eugonadal, con disminución de la secreción pulsátil de LH, lo que enfatiza la importancia de la
disregulación hipotalámica en la patogénesis del hipogonadismo presente en pacientes con
enfermedad hepática crónica.255 En efecto, en pacientes con hemocromatosis genética o
postransfusional y fibrosis o cirrosis hepática, existe un hipogonadismo hipogonadotrópico,
por depósito de hierro en la hipófisis, lo que determina alteraciones selectivas de las células
gonadotropas. En los casos avanzados de hemocromatosis, los efectos metabólicos de la
asociación de la cirrosis y de la diabetes aumentan el déficit androgénico de estos
pacientes.59,126
 Introducción 18

Estudios experimentales sugieren que un cortocircuito porto-cava, la sobreexpresión de

aromatasa o la deficiencia de IGF-1 pueden participar en la disfunción gonadal secundaria a la
cirrosis, a pesar de que estos mecanismos no han sido completamente confirmados en
humanos.37,38Por último, el incremento de la testosterona en pacientes con IHC puede
representar un factor de riesgo para el desarrollo de un carcinoma hepatocelular, lo que
explica la preponderancia masculina del hepatocarcinoma.241 En pacientes con cirrosis, los
niveles de estradiol total y libre, y la relación estradiol/testosterona se incrementa. El
hiperestrogenismo se relaciona con características físicas femeninas.157 En pacientes
esperando un trasplante hepático se observó aumento de los niveles de estrógenos
circulantes, que disminuyeron después de realizado el transplante.221

Los pacientes con alcoholismo crónico frecuentemente presentan atrofia testicular y

ginecomastia, alteraciones que inicialmente fueron consideradas como el resultado de la
enfermedad hepática crónica secundaria al alcoholismo.16,23,83,140,158,203 Más tarde, se ha
demostrado que la ingestión aguda de alcohol suprime los niveles plasmáticos de
testosterona en sujetos voluntarios no alcohólicos y animales de experimentación; estos
datos indican que la ingesta de alcohol directamente inhibe la esteroidogénesis en la célula
de Leydig,13,88,257,278 y causa la pérdida de los signos de masculinización.77 Se ha demostrado
que el alcohol, y su metabolito acetaldehído, directamente suprime la función
esteroidogénica testicular49 Además, diferentes estudios en células de Leydig murinas
aisladas han demostrado que el etanol directamente inhibe la síntesis de
testosterona.47,48,63,64,161 El mecanismo por el cual el alcohol o el acetaldehído actúan en la
función esteroidogénica testicular es la inhibición de la actividad de la 17-α-
hidroxiprogesterona aldolasa.44,116 Se ha sugerido también que el alcohol induce lesiones en
el hipotálamo y la hipófisis, que también contribuye con los cambios atróficos en los
testículos.77 Otros estudios en ratas también han demostrado que la exposición al alcohol
durante la vida fetal, a través del consumo de alcohol por las hembras embarazadas, produce
inhibición de la biosíntesis androgénica en los testículos perinatales.122

En el hombre, el efecto de la ingestión crónica de etanol en la estructura de la célula de

Leydig está poco documentada y la mayoría de estudios han sido realizados en tejidos
postmortem16,23,140,158,203 y son bastante contradictorios, ya que se ha informado que las
 Introducción 19

células de Leydig parecen histológicamente normales, a pesar del evidente daño de los tubos
seminíferos y la atrofia y engrosamiento del tejido peritubular;76 además, la cuantificación del
número de células de Leydig en biopsias testiculares de pacientes alcohólicos son poco
concluyentes, ya que han referido, tanto la existencia de hipoplasia, como de hiperplasia;76
no obstante en un estudio metodológicamente bien estructurado, claramente se demuestra
un incremento de las células de Leydig en algunos casos.129 Estos hallazgos morfológicos
están en consonancia con datos funcionales, ya que los pacientes con enfermedad alcohólica
crónica presentan diferentes niveles de elevación de gonadotrofinas, sugestivos de un daño
directo testicular debido al alcohol; pero concomitante con estos cambios también es
necesario considerar los efectos predominantemente hipotalámicos que produce la IHC tan
frecuente en el alcoholismo crónico; además, en los casos de IHC muy severos y en el coma
hepático, estos pacientes tienden a presentar niveles extraordinariamente bajos de
269
gonadotrofinas. Estos pacientes refieren síntomas como disminución de la libido,
impotencia, y presentan tamaño reducido de la próstata y de las vesículas seminales.

El parénquima testicular en la mayoría de los pacientes alcohólicos crónicos, con o sin

cirrosis, demuestra lesiones testiculares muy evidentes, caracterizadas por tubos seminíferos
con diámetro reducido, engrosamiento de la lámina propia, y disminución o ausencia de
células germinales. Las células de Leydig se encuentran reducidas en número y contienen
múltiples gránulos de lipofucsina. Estos hallazgos histológicos se correlacionan, en parte, con
alteraciones del seminograma, en el que frecuentemente se ven importantes cambios en el
número y motilidad de los espermatozoides, así como un incremento en el porcentaje de
espermatozoides morfológicamente anormales.76,86,256

Por último, la asociación de atrofia testicular con ginecomastia y cirrosis hepática es

ampliamente conocida, recibiendo la denominación de síndrome de Silvestrini-Corda.50,228

CRIPTORQUIDIA Y SÍNDROME DE DISGENESIA TESTICULAR

La criptorquidia y los hipospadias son defectos congénitos genitales comunes que

afectan respectivamente al 2-9% y al 0,2-1% de los varones recién nacidos. Estas alteraciones
del desarrollo del aparato genital masculino también están vinculadas entre sí, compartiendo
factores de riesgo2,268 y una fertilidad reducida.10,135,170Además los pacientes con ambas
 Introducción 20

patologías tienen un mayor riesgo de desarrollar un cáncer de testículo, o una

oligospermia.69,119,174,178,198,248,260,261

La criptorquidia forma parte del denominado Síndrome de Disgenesia Testicular

(SDT),22,226,233 el cual también comporta la presencia de hipospadias, alteración de la
espermatogénesis y cáncer testicular.68,108,169,225,262 Estudios epidemiológicos han demostrado
una mayor incidencia del SDT en los países nórdicos, en los que es más frecuente la pobre
calidad seminal y el descenso del recuento espermático,118 así como un aumento de la
frecuencia de la criptorquidia y los hipospadias.194,233,246 La incidencia de estas
malformaciones parece haber aumentado en las últimas décadas en los países
occidentales.70,147,246 Las diferencias geográficas mencionadas para ambas malformaciones se
relacionan con la incidencia del cáncer testicular y de la baja calidad del semen.1,27,28,258

El SDT en los casos más leves se manifiesta por un defecto en la espermatogénesis, y en

los casos más graves, por el desarrollo de cáncer testicular. En los testículos de los pacientes
con SDT se han encontrado una variedad de lesiones histológicas, entre las que se incluyen la
presencia de tubos con sólo células de Sertoli, un patrón de atrofia mixta tubular, tanto en el
mismo lobulillo testicular como en lobulillos adyacentes, tubos hipoplásicos, los denominados
nódulos de células de Sertoli o adenomas de Pick, microlitiasis, tubos malformados, cambios
granulares en las células de Sertoli, hiperplasia nodular de las células de Leydig y carcinoma in
situ testicular (CIS).1,27,28,258

Los mecanismos fisiológicos y endocrinos que regulan el descenso testicular no se

conocen por completo. Varios factores están involucrados en la inducción del descenso
testicular, entre los que se encuentran, además de andrógenos, el péptido relacionado con el
gen de la calcitonina, el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y la familia del factor de
crecimiento de fibroblastos (FGF). 166

Las lesiones histopatológicas observadas en pacientes con alteraciones del descenso

testicular son muy variables y difieren sustancialmente si la biopsia testicular se realiza, como
así está recomendado, al final del primer año de edad, se difiere a final de la infancia o se
realiza en adolescentes postpuberales; además, la intensidad de las lesiones depende
también de la localización testicular inguinal baja, incluidos casos de testículo en ascensor,
 Introducción 21

inguinal alta, o intraabdominal, en donde las lesiones túbulo-intersticiales del testículo son
muy intensas. En niños puede verse todo un espectro de alteraciones tubulares, desde tubos
prácticamente normales, a otros con importante disminución del diámetro tubular y
disminución del número de células germinales, hasta casos muy graves, con ausencia de
espermatogonias, constituyéndose el característico patrón de sólo células de Sertoli.173

Después de la pubertad, en la biopsia o en la orquiectomía de pacientes criptorquídicos

frecuentemente se observa un patrón de atrofia mixta testicular, que se correlaciona con el
pronóstico de fertilidad.174,175,190 En estos testículos se ven células de Sertoli inmaduras y
disgenéticas, las cuales presentan cuerpos de inhibina que permiten identificarlas.176 Además,
la intensidad de la inmunotinción para receptor androgénico en las células de Sertoli
disminuye en función de la severidad de las lesiones tubulares, de modo que la ausencia de
expresión del receptor de andrógenos en células de Sertoli se correlaciona con la ausencia de
espermatogénesis en los tubos seminíferos.172,206 En estos casos de criptorquidia postpuberal
también se han observado alteraciones en la lámina propia de los tubos seminíferos.216 Así
mismo, existen alteraciones de las células de Leydig, con incremento de las vacuolas lipídicas
intracitoplásmicas y disminución de la inmunoexpresión de testosterona205 y también se
evidencia un mayor número de células de Leydig extraparenquimatosas que en testículos
normales.204 Estas células de Leydig ectópicas parecen tener una actividad funcional menor,
dado que la intensidad de inmunotinción de testosterona disminuye con respecto a la
observada en las células de Leydig intratesticulares.205 En definitiva, en la criptorquidia la
detención de la espermatogénesis y, sobre todo, la presencia de un síndrome de sólo células
de Sertoli son lesiones muy importantes, aunque no específicas, ya que este patrón
morfológico de solo células de Sertoli ha sido descrito en otras muchas causas de infertilidad
en el varón.188

Estrógenos y Disruptores endocrinos

Es evidente que los mecanismos endocrinos juegan un papel fundamental en la

regulación de la función testicular, y factores producidos localmente en la hipófisis o en el
testículo son importantes para la regulación de la actividad hormonal. Algunos factores
testiculares podrían ser mediadores de la acción hormonal y de la comunicación intra e
 Introducción 22

intercelular. En el testículo humano existen mecanismos de control local de la función de

diferentes grupos celulares de los tubos seminíferos y del intersticio testicular, surgiendo así
los conceptos de regulación paracrina, no solo entre las células germinales, las células de
Sertoli, las células mioides peritubulares, sino también en relación con las células del
intersticio testicular, incluidas las células de Leydig, los macrófagos y las células cebadas. Así
mismo, se ha descrito una regulación autocrina dentro de cada tipo celular.270 Se ha
establecido que estas regulaciones paracrinas y autocrinas son andrógeno-dependientes y
tanto la espermatogénesis como la secreción de testosterona está regulada por la activación
del receptor de andrógenos (para revisión ver Regadera et al, 1991; Regadera et
al,2001)205,206

En la actualidad, la participación de los estrógenos en mecanismos íntimos de

regulación endocrina testicular está adquiriendo especial importancia. En efecto, en el varón
los estrógenos pueden ser sintetizados localmente en múltiples tejidos a partir de la
testosterona, por la acción de la aromatasa,117,224 tal como se ha demostrado en el cerebro,
donde los estrógenos actúan a través de sus receptores nucleares clásicos, o a través de
acciones rápidas en la membrana. 30,152,250 Se sabe que el estradiol suprime la LH y FSH, las
cuales se secretan como respuesta a una administración exógena de GnRH, de modo que en
hombres deficientes de GnRH, la inhibición de aromatasas incrementa la LH y FSH, lo que
indica un papel de retroalimentación negativa para los estrógenos. Estos efectos se bloquean
por agonistas de GnRH, indicando que los cambios en la secreción hipotalámica de GnRH son
los responsables de estas acciones. En varones, los mecanismos dependientes de estrógenos
intervienen también en la retroalimentación negativa mediada por testosterona en la
162
expresión y secreción de la GnRH. Pero además, los niveles estrogénicos se incrementan
por la conversión periférica de testosterona en estrógenos en el tejido adiposo y muscular.84

En el testículo las hormonas estrogénicas están reguladas por receptores de estrógenos

(ERs) α y β, que son expresados selectivamente en los diferentes tipos celulares testiculares.
Por tanto, la fisiología testicular está, en parte, bajo el control de un balance entre los
andrógenos y los estrógenos, lo cual también depende de la actividad de la aromatasa,
permitiendo la formación de estrógenos a partir de andrógenos.34,99,183 En la rata madura, las
 Introducción 23

células de Leydig se consideran como la mayor fuente de estrógenos, mientras que en el

animal inmaduro, la mayor síntesis ocurre en las células de Sertoli. 35,102,131,181,193,211

Los estrógenos tienen un papel esencial en la regulación del eje hipotálamo-hipofisario-

testicular, controlando, en forma indirecta, el balance entre la LH y la testosterona, a través
de un mecanismo de retroalimentación.183 Los receptores estrogénicos ERα y ERβ se han
identificado en el testículo, los conductos eferentes y en el epidídimo.98,99,100,101,102,103,227 El
receptor de estrógenos ERα y ERβ se expresa en las células de Leydig, así como en el epitelio
seminífero. Los estrógenos actúan sobre algunos mecanismos de la espermatogénesis,
incluidos la proliferación, la diferenciación de las células germinales y la maduración final de
las espermátidas, participando en los mecanismos de espermatogénesis y de apoptosis del
epitelio seminífero normal.36 Pero además, las células cebadas humanas expresan receptores
estrogénicos α (αER)111,279 y la exposición a los estrógenos determina una retroalimentación
positiva de la expresión de triptasa y un incremento en la degranulación de las células
cebadas,25,26,138,155,156,182 lo cual también interviene en la remodelación de la matriz
extracelular de la pared peritubular y del intersticio del testículo normal y patológico.

El incremento de los estrógenos en diferentes patologías endocrinas del varón o la

acción de los denominados disruptores endocrinos, producen un efecto deletéreo sobre el
contaje espermático y un aumento de las alteraciones en el tracto reproductivo masculino,
incluidas la criptorquidia, la presencia de hipospadia y el desarrollo de cáncer testicular.232,247
En el varón, estos disruptores endocrinos modifican los niveles de estrógenos, de andrógenos
o de hormonas tiroideas y podría determinar alteraciones de la función reproductiva y
malformaciones del tracto genitourinario, con disminución de la fertilidad.185 De hecho,
algunos productos químicos ambientales, por ejemplo, pesticidas policlorados,
contaminantes orgánicos, plaguicidas y ftalatos se han relacionado con alteraciones del
descenso testicular y con el cáncer de testículo.29,226,262 Además, la exposición prenatal a los
ftalatos se correlacionó negativamente con los niveles de testosterona y la distancia
anogenital, distancia que viene determina por la acción de los andrógenos en la maduración
embrionaria y fetal del varón. Por lo tanto, alteraciones del desarrollo del tracto reproductivo
masculino, incluida la criptorquidia, puede ser estar relacionados con los efectos adversos de
disruptores hormonales ambientales.145
 Introducción 24

En el SDT se ha sugerido que las lesiones se producen durante el desarrollo prenatal,

como consecuencia de factores genéticos, ambientales o disruptores endocrinos que
causarían una alteración en el cociente estrógenos/andrógenos.22,82,146,177,226,272 Es posible
que la disfunción de las células de Leydig con posterior disminución de los niveles de
113
testosterona juegue también un papel en la patogénesis del SDT. En definitiva, estos
factores exógenos tendrían un mayor peso en la asociación causal, aunque no excluye otros
factores endógenos o de base genética. Incluso se postula la posibilidad de que ciertos
polimorfismos genéticos específicos podrían potenciar el papel de los factores
ambientales.164,247 Entre los factores de riesgo que comparten se encuentra la exposición a
actividad estrogénica no equilibrada en momentos claves del desarrollo embrionario;70 esto
es, a una exposición fetal a productos químicos anti-androgénicos, puesto que los estrógenos
endógenos o ambientales también han sido involucrados como causa de un descenso
testicular alterado.67,249,277 En estudios experimentales, se observaron niveles de testosterona
disminuidos y de estradiol elevados, en forma significativa, en testículos criptorquídicos,
comparados con los controles.25,138

En el SDT, la exposición a estrógenos y a antiandrógenos durante la vida fetal se

acompaña de una maduración incompleta de las células de Sertoli, pero no se ha establecido
fehacientemente si estos cambios están relacionados con alteraciones de la producción de
testosterona por las células de Leydig fetales. En individuos adultos con tratamiento para
cambio de género, expuestos a terapia estrogénica y antiandrogénica, se ha comparado los
cambios de la maduración de células de Sertoli, con respecto a los encontrados en pacientes
adultos criptorquídicos con SDT, demostrándose claramente una desdiferenciación de las
células de Sertoli causada por la exposición a estrógenos.168 Sin embargo, es necesario
realizar nuevos estudios para confirmar los mecanismos íntimos implicados en el desarrollo
de SDT.272

FINALIDADES DE LA PRESENTE TESIS DOCTORAL

En la presente Tesis Doctoral se pretende estudiar la participación de la alteración de la

regulación paracrina entre las células cebadas, los macrófagos y el estado de
hipoespermatogénesis presente en patologías testiculares que cursan con subfertilidad,
 Introducción 25

incluyéndose en este estudio como prototipo de patología testicular adquirida la observada

en pacientes con IHC y, de otra parte, como ejemplo de patología testicular congénita, la
criptorquidia. De este modo se pretende valorar la relación de las células cebadas y los
macrófagos con la organización estructural del tejido conjuntivo, y concretamente con la
distribución de los fibroblastos CD34+, así como la participación de estas células en los
mecanismos de fibrosis, evaluando morfométricamente la distribución de fibroblastos
CD34+en el intersticio y en la pared peritubular en el testículo del hombre normal, en
pacientes con IHC y en casos con criptorquidia.

En las biopsias testiculares realizadas en pacientes con diferentes causas de infertilidad,

incluidos los casos con IHC o con criptorquidia, muy frecuentemente se observa un
engrosamiento de la pared peritubular, la cual se fibrosa y sufre una continua remodelación
que termina en una evidente fibrosis peritubular.169,216 Sin embargo, las causas y las
consecuencias de estos importantes cambios no son bien conocidas. Dado que las células
cebadas, a través de sus productos triptasa e histamina, están implicadas en mecanismos de
fibrosis, se ha sugerido que las células cebadas testiculares participan en el desarrollo de la
fibrosis de la pared tubular y del intersticio en diferentes tipos de patología testicular.4,180,209
En biopsias testiculares de pacientes con azoospermia obstructiva y no obstructiva, así como
en controles fértiles,209 se han identificado dos poblaciones de células cebadas, unas
localizadas en la pared peritubular y otras en el intersticio testicular. En los pacientes con
síndrome de sólo células de Sertoli o con parada en la maduración de la línea germinal se
observó un incremento de las células cebadas, tanto en las localizadas en la pared peritubular
como en el intersticio; sin embrago, en los pacientes con azoospermia obstructiva también se
demostró un incremento, aunque no fue significativo comparado con los controles. Todos
estos datos sugieren la participación de las células cebadas en los mecanismos de la
alteración de la espermatogénesis relacionados con la subfertilidad.209

Por todo ello, las investigaciones que se desarrollarán en la presente Tesis Doctoral
centradas en los mecanismo de fibrosis del intersticio y de la pared tubular, en relación con
las alteraciones de los tubos seminíferos, de las células de Leydig, así como de los cambios
cuantitativos de las células cebadas y de los macrófagos del intersticio testicular en pacientes
con IHC o con criptorquidia, dos entidades en los que existe una evidente desregulación de
 Introducción 26

los andrógenos y de los estrógenos, constituyen dos modelos naturales de investigación de

mecanismos implicados en las alteraciones de la regulación paracrina en la patología
testicular humana.
 Hipótesis y Objetivos 28

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
 Hipótesis y Objetivos 29

HIPÓTESIS

¿Existen cambios en el tejido conjuntivo del intersticio testicular y de la pared

peritubular en relación con la insuficiencia hepática crónica y en la criptorquidia postpuberal,
con respecto al testículo humano normal?

OBJETIVOS

Primero. Determinar la expresión inmunohistoquímica de CD34, CD68 y triptasa en el

intersticio testicular y en la pared peritubular en el hombre adulto normal.

Segundo. Determinar la expresión inmunohistoquímica de CD34, CD68 y triptasa en el

intersticio testicular y en la pared peritubular en testículos de pacientes con insuficiencia
hepática crónica.

Tercero. Determinar la expresión inmunohistoquímica de CD34, CD68 y triptasa en el

intersticio testicular y en la pared peritubular en diferentes tipos de disgenesia testicular,
presentes en testículos criptorquídicos de pacientes postpuberales.
 Materiales y Métodos 30

MATERIAL Y MÉTODOS
 Materiales y Métodos 31

MATERIAL

Se ha evaluado la expresión inmunohistoquímica y la cuantificación morfométrica de

los macrófagos, células cebadas y la distribución de la expresión de CD34, nuevo marcador
del tejido conjuntivo, en el intersticio y en la pared peritubular. Para ello, se han utilizado
tejidos histológicos previamente fijados en formol e incluidos en parafina, procedentes de los
archivos del Hospital Universitario La Paz de Madrid (UAM). En total, en la presente Tesis se
evalúan 37 casos que se distribuyeron en los siguientes grupos:

Grupo Control. 10 testículos de varón adulto normal.

Grupo 1. 17 testículos obtenidos en autopsias de pacientes diagnosticados con IHC.

Grupo 2. 10 piezas de orquiectomía de testículos disgenéticos obtenidos de pacientes

con criptorquidia postpuberal uni o bilateral.

MÉTODOS

Métodos de Estudio Histológico General

La mayoría de las piezas de orquiectomía se fijaron por inmersión en formol neutro

tamponado al 4%, durante 72 horas, pero algunas piezas quirúrgicas se fijaron en líquido de
Bouin, fijador habitual de conservación de las biopsias testiculares para la evaluación
diagnóstica y pronóstica de la fertilidad.
 Materiales y Métodos 32

Tabla 1. Fijadores del tejido testicular

Formol Tamponado
Fosfato monosódico, monohidrato 4,00 g
Fosfato disódico anhidro 6,50 g
Agua destilada 900 ml
Formol puro (CH2O 40%) 100 ml
Líquido de Bouin
Ácido pícrico a saturación en agua
750 ml
destilada
Formol puro (40%) 250 ml
Ácido acético glacial 50 ml

Métodos de Secciones con Microtomo y Tinciones Histológicas

Las piezas de orquiectomía fueron seccionadas en cortes perpendiculares a todo lo

largo del eje mayor del testículo, con un espesor de cada sección macroscópica de alrededor
de 3 mm. A continuación, se procedió a la inclusión en parafina de secciones seleccionadas al
azar (siempre en número superior a 6 cortes por testículo) en las piezas extirpadas en
pacientes adultos. Todas estas piezas fueron incluidas en parafina en el procesador de tejidos
marca Autotechnicon Duo®, lo que permitió realizar la deshidratación de las secciones fijadas
mediante pases consecutivos en alcohol de concentraciones crecientes (70%, 96% y alcohol
absoluto) y aclarado posterior en acetato de butilo, dando dos pases de una hora cada uno.
Finalmente, las secciones tisulares se incluyeron en parafina líquida (punto de fusión 60º C)
durante dos horas.

Una vez realizados los bloques de parafina, se obtuvieron 5 cortes seriados de 5 µm de

espesor, mediante un microtomo de la marca Ernnst Leitz GMBH (Typ 1212) Wetzlar
Germany®, y las secciones se desparafinaron en xilol, se hidrataron en alcoholes de
concentraciones decrecientes y se tiñeron con Hematoxilina-Eosina (HE), PAS (ácido periódico
y reactivo de Schiff), tricrómico de Masson, siguiendo los métodos histológicos habituales. Las
 Materiales y Métodos 33

preparaciones de HE recién teñidas se aclararon en agua destilada. Como método de montaje

para todas las técnicas histológicas se utilizó la resina sintética DePex (Probus, Badalona).

Método Inmunohistoquímico de la Expresión Proteica

Los anticuerpos y su dilución usados para la identificación de los macrófagos, células

cebadas y para la valoración de distribución de células CD34 positivas se incluyen en la Tabla
2.

Tabla 2: Anticuerpos utilizados

Anticuerpo Casa Dilución

Anti-CD68 Dako 1:200
Anti-Triptasa Dako 1:200
Anti-CD34 Dako 1:200

Método Inmunohistoquímico Estreptavidina-Biotina-Peroxidasa (SBP)

Para realizar el método inmunohistoquímico de SBP de detección de la expresión de 3

anticuerpos se obtuvieron cortes de 5 µm de grosor del material incluido en parafina y se
colocaron en portaobjetos tratados previamente con L-polilisina (Sigma, St Louis) o con xilano
(Sigma, St Louis) durante 24 horas, con el fin de adherir mejor el corte al portaobjetos.

Las secciones se procesaron con el método de Estreptavidina-Biotina-Peroxidasa

(Complejo SBP), siguiendo el método general inmunohistoquímico, descrito por Hsu, con las
modificaciones habituales de nuestro laboratorio,205,240 que se especifican a continuación: se
realizó la desparafinación completa de las secciones, seguido de la hidratación en alcoholes
decrecientes hasta el agua destilada.

A continuación se procedió a la inhibición de la peroxidasa endógena de los tejidos

mediante peróxido de hidrógeno al 3% a temperatura ambiente durante diez minutos. Los
cortes se lavaron en buffer fosfato (PBS) a temperatura ambiente, pH 7,4, durante 5 minutos.
Se procedió al desenmascaramiento del epítope mediante tratamiento por calor; para ello,
 Materiales y Métodos 34

las preparaciones se introdujeron en buffer citrato a pH 7,6 y se realizó el tratamiento con

microondas en dos pases de 2,5 minutos, procurando que las preparaciones no llegasen a
hervir, y enfriando las mismas entre cada uno de los pases. Posteriormente, las preparaciones
se dejaron reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, se realizó un lavado
rápido, dos minutos, en H2O destilada para retirar el sobrenadante del buffer citrato.
Lavamos las preparaciones en dos pases de 5 minutos en buffer PBS, pH 7,4. Seguidamente,
realizamos el bloqueo de las inmunoglobulinas inespecíficas de los tejidos con suero bovino
normal durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se extrajo el sobrenadante del suero
bovino, sin lavar nunca entre este paso y el siguiente.

A continuación, añadimos el anticuerpo primario a la dilución óptima (Tabla 2), en una

solución de PBS+BSA al 1%. El anticuerpo primario se incubó durante toda la noche a 4º C en
cámara húmeda. Las secciones se lavaron en tres pases de PBS, de 5 minutos cada uno, a
temperatura ambiente. Se añadió a las secciones el complejo biotinilado anti-ratón, con una
dilución 1:200, durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavaron las
preparaciones en tres pases de PBS, durante 5 minutos cada pase y a temperatura ambiente.
Se incubaron las preparaciones en el complejo Estreptavidina-Biotina-Peroxidasa (SBP)
(Zymet, San Francisco, USA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Realizamos tres
lavados en PBS durante 5 minutos. La inmunorreacción se reveló con diaminobencidina
(Sigma, St. Louis, USA) (30 mg de diaminobencidina en 10 ml de buffer tris-HCl, a pH 7,4 y con
H202 al 0,015 %). El tiempo de revelado con diaminobencidina es de 3 minutos. A
continuación, se hizo una tinción nuclear con hematoxilina de Harris. Las preparaciones se
lavaron con abundante agua destilada, se deshidrataron en etanol en concentraciones
crecientes, y se montaron en la resina sintética DePex.
 Materiales y Métodos 35

Métodos de Cuantificación del intersticio testicular y de la pared peritubular

El proceso de selección de campos microscópicos, con el fin de efectuar después las

cuantificaciones histométricas, se describe a continuación brevemente: se seleccionaron 40
campos de cada caso, distribuidos al azar, con un objetivo 40X. En cada campo, se contaron el
número de macrófagos CD68+ y el número de células cebadas Triptasa+ localizadas en el
parénquima testicular. (Fig. 4).

Fig 4. a) Abundantes macrófagos CD 68+ en un testículo de un paciente con IHC que muestra
esclerosis tubular. b) Células cebadas triptasa+ distribuidas aisladamente en el intersticio y en
la pared peritubular de un testículo de un caso de IHC, con un patrón de sólo células de
Sertoli.

También se realizó una cuantificación de la distribución de las células CD34 positivas,

tanto en el intersticio testicular como en la pared peritubular, usando el programa de análisis
de imagen Image J que se describe a continuación.

Todas las muestras histológicas, previa selección al azar de los campos microscópicos,
fueron fotografiadas con un fotomicroscopio Leica Eclipse 55i equipado con una cámara
digital Leica DC200 y adquiridas con el software Image-Pro Plus y procesadas en formato TIFF.
Todas las fotografías fueron realizadas con el objetivo de 40X. En cada muestra se fotografió
el intersticio testicular y los tubos seminíferos, habiéndose obtenido las imágenes de 25
campos histológicos por caso, lo que da un total de 925 campos.

De cada fotografía histológica original se obtuvieron cuatro copias, las cuales fueron
tratadas mediante el programa Adobe Photoshop, con el fin de segmentar las siguientes
 Materiales y Métodos 36

estructuras: intersticio total, expresión de CD34 en el intersticio (Fig. 5), pared peritubular
total y expresión de CD34 en la pared peritubular (Fig. 6). En definitiva, se procesaron para
análisis morfométrico un total de 4.625 imágenes.

Fig. 5. a) Intersticio y tubos seminíferos, se observan células CD34+. b) Eliminación de tubos

seminíferos, observando todo el intersticio que contiene las células CD34+. c) Eliminación de
las células de Leydig, vasos sanguíneos y matriz extracelular del intersticio, observándose
únicamente las células CD34+.

Fig. 6. a) Interstico y tubos seminíferos, se observan células CD34+. b) Eliminación

completa del intersticio. c) Eliminación completa del intersticio y de los tubos seminíferos,
conservándose solamente las células CD34+ de la pared peritubular.

Software

Estas imágenes se procesaron con el software Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij). Image

J es ampliamente utilizado en numerosos estudios histométricos. Brevemente, describimos
el software, el procesamiento y el análisis de las imágenes que incluyó el denominado Colour
deconvolution, la segmentación y por último, la cuantificación.
 Materiales y Métodos 37

Image J es un programa de procesamiento de imagen digital de dominio público

programado en Java desarrollado en el National Institute of Health. La primera versión del
programa fue desarrollada por Wayne Rastban en 1997. Las características actuales del
programa consisten en numerosas plugins y macros (macroinstrucciones) para el
procesamiento de imágenes y operaciones de análisis, incluyendo segmentación y extracción
de la imagen, reducción del ruido, transformaciones de la imagen y análisis de partículas.
Estas características han sido expandidas por una amplia base de usuarios activos.
Actualmente existen cientos de plugins y macros disponibles para su descarga. Otras ventajas
del programa incluyen la capacidad de soportar numerosos tipos de formatos independientes
de la plataforma. Como resultado de su independencia del tipo de plataforma, Image J es
capaz de funcionar en múltiples sistemas operativos, incluyendo MS Windows, Apple OS y
Linux.

Colour deconvolution

El plugin colour desarrollado por Gabriel Landini (Landini G: Colour

deconvolutionpluginv1.5.[http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/cdeconv/cdec
onv.html) fue usado para separar imágenes originales en tres imágenes que contienen los
componentes del método inmunohistoquímico de Estreptavidina-Biotina-Perodxidasa (SBP)
usando el vector H-DAB. El plugin crea una imagen adicional correspondiente al revelado con
DAB de color marrón. Debido a que las regiones de interés son aquellas que expresan una
tinción de color marrón, solo la imagen de 8-bit DAB fue conservada.

Segmentación

La herramienta treshold (umbral) fue utilizada para separar los pixeles más oscuros que
el valor de treshold. Mediante esta selección podemos seleccionar aquellas regiones que
presentan inmunotinción de aquellas con inmunotinción negativa y proceder a su
cuantificación.
 Materiales y Métodos 38

Cuantificación

En cada imagen, después de aplicar el plugin colour deconvolution y seleccionar el valor

umbral, se procedió a cuantificar el área correspondiente a la superficie total del intersticio
testicular y del área tubular, y la superficie correspondiente a aquellas áreas que expresaron
inmunotinción. El resultado se expresó como un ratio entre el área inmunomarcada y el área
total del intersticio o de los tubos seminíferos.

MÉTODOS ESTADÍSTICOS

Manejo de Datos

Para informatizar los datos, se creó una base de datos (BD) con el programa Excel y se
procesaron con la estructura adecuada para poder analizarlos posteriormente. Todos los
datos cuantitativos se expresaron como el promedio ± SEM (error estándar de la media). La
significancia estadística se analizó mediante ANOVA de una vía, complementada por la
prueba Tukey de comparación. La asociación entre las variables estudiadas se realizó
mediante análisis de correlación paramétrica de Pearson. Un valor de p < 0,05 se consideró
estadísticamente significativo.

Técnicas Fotográficas

Las imágenes microscópicas han sido capturadas con una cámara digital Leica DC200,
almacenadas en formato TIFF y tratadas con el programa Adobe Photoshop CS5. La
composición de las planchas iconográficas se ha realizado con el programa Power Point 2010.
 Resultados 39

RESULTADOS
 Resultados 40

CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS Y ESTUDIO HISTOLÓGICO DEL PARÉNQUIMA TESTICULAR

En este trabajo hemos estudiado el parénquima testicular en 3 grupos, un grupo control

y dos grupos de estudio:

1.- Grupo control, formado por 10 testículos de 5 pacientes adultos jóvenes con edades
comprendidas entre 16 y 60 años, obtenidos durante la autopsia. Ninguno de estos pacientes
presentaba enfermedad hepática, renal o endocrina, ni otras enfermedades o tratamientos
con repercusión testicular.

2.- Grupo 1, formado por 17 testículos provenientes de autopsias de varones con

insuficiencia hepática crónica, con edades comprendidas entre los 34 y 69 años (media: 51
años). Los diagnósticos clínicos y las lesiones hepáticas de los pacientes se reflejan en la
Tabla 3. Entre los factores etiológicos más frecuentes se encuentra la hepatitis vírica, en 6 de
los casos (35%), de los cuales 4 con hepatitis C y 2 con hepatitis B. El antecedente de
alcoholismo crónico se pudo identificar en 2 casos. Las lesiones hepáticas compatibles con
diagnóstico de cirrosis se observaron en 7 de los casos (41,1%), mientras que la necrosis
hepática en 3 casos (17,6%) y fibrosis hepática en 4 casos (23,5%). En 2 casos se describen
varices esofágicas y síndrome de hipertensión portal.

Las alteraciones del patrón de la espermatogénesis en los testículos de los pacientes

con hepatopatía crónica cubren un gran espectro, desde espermatogénesis completa hasta
hialinización tubular. En 6 casos podemos ver espermatogénesis completa, en grados
variables entre el 80 y 95% en cuatro casos, y en los dos restantes, se observa en un 100%. El
patrón de hipoespermatogénesis está presente en 4 casos, constituyendo el 100% en dos. En
6 de los casos hay parada de la maduración de espermatogonias, siendo el único patrón
observado en tres. En 8 casos se observa hialinización testicular, y en uno de ellos comprende
el 100%. Se observa un patrón mixto en 9 de los 17 casos, siendo la combinación más
frecuente la espermatogénesis completa y la hialinización testicular. Se recogen los datos de
cada uno de los casos en la Tabla 4.

Tabla 3. Características clínicas y lesión hepática de los pacientes del grupo 1 con IHC.
 Resultados 41

Nº caso Edad Historia Clínica/Lesión hepática

(años)
Cirrosis macro-micronodular, por Hepatitis B crónica.
1 34
Síndrome de hipertensión portal.
Esteatonecrosis hepática por infección por Citomegalovirus.
2 35
SIDA.
Hepatitis crónica por virus C.
3 47
Síndrome de hipertensión portal.
4 50 Hepatitis crónica evolucionada por Hepatitis C.
Cirrosis post-hepatitis C, ligeramente evolucionada y con ligera
5 48 actividad.
Alcoholismo crónico.
Hepatitis crónica C.
6 48
Sd. hipertensión portal.
Cirrosis por Hepatitis crónica C.
7 55
Varices gastroesofágicas.
8 65 Fibrosis centrolobulillar.
9 34 Necrosis hepática.
10 69 Fibroesteatonecrosis hepática.
11 61 Fibroesteatosis hepática en estado pre-fibrótico.
Cirrosis evolucionada probablemente post-alcohólica.
12 80
Ictericia visceral.
13 56 Cirrosis por Hepatitis B crónica.
14 49 Cirrosis hepática.
Fibrosis portal no cirrótica.
15 47 Trombosis portal.
Varices esofágicas. Estado post esplenectomía.
Marcada fibrosis biliar con intensa colestasis secundaria a
16 50
obstrucción.
17 39 Cirrosis macro-micronodular.
 Resultados 42

Tabla 4. Lesiones del parénquima testicular de los pacientes del grupo 1 con IHC.

Nº caso Edad Diagnóstico Anatomopatológico

(años)
1 34 Intensa hipoespermatogénesis difusa (100%).
Atrofia tubular difusa.
2 35 Parada de la maduración en espermatogonias (95%).
Hialinización tubular (5%).
3 47 Hipoespermatogénesis (50%) Hialinización tubular (50%)
Espermatogénesis completa (80%). Hialinización tubular
4 50
(20%)
Espermatogénesis completa (95%). Hialinización tubular
5 48
(5%)
Hipoespermatogénesis severa (50%). Parada de la
6 48
maduración en espermatogonias (50%).
Atrofia tubular difusa.
7 55 Parada de la maduración en espermatogonias (90%).
Hialinización tubular (10%).
8 65 Espermatogénesis completa (100%).
Atrofia tubular ligera.
9 34 Espermatogénesis completa (95%). Hialinización tubular
(5%).
Atrofia tubular difusa.
10 69
Hipoespermatogénesis (90%). Hialinización tubular(10%).
11 61 Parada de la maduración en espermatogonias (100%).
Espermatogénesis completa (85%). Hialinización tubular
12 80
(15%)
13 56 Espermatogénesis completa (100%).
14 49 Parada de la maduración en espermatogonias (100%).
15 47 Hialinización tubular (100%).
16 50 Parada de la maduración en espermatogonias (100%).
17 39 Hipoespermatogénesis severa (100%).
 Resultados 43

3.- Grupo 2, formado por 10 testículos obtenidos de piezas quirúrgicas de varones con
criptorquidia postpuberal, con edades comprendidas entre los 26 y 58 años (media: 29 años).
En la tabla 5 se resumen las alteraciones anatomopatológicas de los testículos criptorquídicos
postpuberales. En la mayoría, 8 casos, se observa un patrón de sólo células de Sertoli. Dos
casos presentan hipoespermatogénesis, y en un caso, esclerosis tubular. Se pueden ver
nódulos de células de Leydig en 4 casos. Las características histológicas del parénquima
testicular de criptorquidia postpuberal de cada caso se recogen en la Tabla 5.

Tabla 5. Diagnóstico anatomopatológico del parénquima testicular de los pacientes del grupo
2 con criptorquidia postpuberal.

Nº caso Edad (años) Diagnóstico Anatomopatológico

Sólo Sertoli disgenéticas (100%). Nódulos de células de
1 26
Leydig.
Sólo Sertoli disgenéticas (100%). Zonas hipoplásicas.
2 29
Nódulos de células de Leydig.
3 27 Sólo Sertoli disgenéticas (100%).
Sólo Sertoli disgenéticas (100%). Nódulos de células de
4 26
Leydig.
5 18 Sólo Sertoli disgenéticas (100%). Zonas hipoplásicas.
6 58 Esclerosis tubular disgenética. Nódulos de células de Leydig.
Atrofia mixta.
Sólo Sertoli disgenéticas (80%). Tubos con
7 32
hipoespermatogénesis (15%).
Tubos esclerosados (5%).
Atrofia mixta.
8 27
Sólo Sertoli (25%). Hipoespermatogénesis (75%).
Atrofia mixta. Células Sertoli disgenéticas (80%),
9 22
Hipoespermatogénesis (20%).
Sólo Sertoli disgenéticas (100%). Fibrosis intersticial.
10 26
Hiperplasia de células de Leydig.
 Resultados 44

Diámetro tubular en los diferentes grupos de estudio.

Como método de evaluación del trofismo tubular se realizó medición del diámetro
tubular en los dos grupos de estudio y el grupo control. El promedio del diámetro tubular
mostró diferencias significativas entre los tres grupos, siendo menor en el grupo de IHC
(p<0,01) y en el grupo de criptorquidia (p<0,001) con respecto al grupo control. (Tabla 6 y Fig.
7)

Tabla 6. Diámetro tubular. Se muestran los promedios de cada grupo.

Grupo Diámetro tubular promedio (µm)+DE

Control 201,8 ± 10,3····
Insuficiencia Hepática Crónica 144,5 ± 13,3**
Criptorquidia 118,1 ± 5,6***

**: p<0,01. ***: p<0,001.

250
D iá m t e r o tu b u la r ( m )

200

**
150

***
100

50

0
C o n tro l IHC
I. H e p a t C r ip to

Figura 7. Promedio del diámetro tubular en los diferentes grupos de estudio.

**: p<0,01. ***: p<0,001.
 Resultados 45

Estudio histológico con inmunotinciones.

En el presente estudio hemos observado la distribución de las células CD34+,

macrófagos y células cebadas, en el intersticio testicular y en la pared de los tubos
seminíferos en testículos humanos normales, (Fig. 8) en testículos con alteraciones
adquiridas, como lo es IHC, (Fig. 9-15) y alteraciones congénitas, en este caso, criptorquidia
postpuberal. (Fig. 16-22)
 Resultados 46

Fig. 8. Intersticio y pared peritubular del testículo normal.

a) Pared peritubular e intersticio de un testículo normal. Obsérvese la rica red

inmunomarcada con el anticuerpo anti-CD34.
b) Se observa irregular distribución de las células CD34+ en la pared peritubular,
con engrosamiento inicial. La espermatogénesis es normal y las células CD34+
del intersticio rodean a una arteriola.
c) Detalle de la imagen anterior en el que se observan esbozos de
inmunomarcaje CD34+ entre las células de Leydig. Nótese duplicación de
estas células en la pared peritubular engrosada.
d) El testículo es normal, pero el espacio intertubular está ampliado, debido al
incremento de la matriz extracelular que distiende las prolongaciones
celulares CD34+.
e) Detalle de la figura anterior en el que se demuestra engrosamiento irregular
de la pared peritubular que contiene varias células CD34+. La
espermatogénesis es normal.
f) Tubo seminífero con espermatogénesis conservada e intersticio normal. Los
macrófagos CD68+ son escasos.
g) En la proximidad de la pared peritubular se identifican dos macrófagos
CD68+. La espermatogénesis es normal.
h) En el citoplasma de los macrófagos se observa un intenso inmunomarcaje de
CD68.
i) En el tejido conjuntivo del intersticio intertubular se localizan dos células
cebadas triptasa+.
j) La espermatogénesis es normal, aunque existe descamación intratubular. La
pared peritubular es fina y contiene una célula cebada triptasa+.
k) En la vecindad de las células de Leydig intersticiales existe una célula cebada
triptasa+ con posibles signos de degranulación.
 Intersticio y Pared Peritubular del Testículo Normal

a b c

d e

g h

i j k
 Resultados 48

Fig. 9. Valoración de la expresión de CD34 en la pared peritubular en pacientes con

insuficiencia hepática crónica.

a) Los tubos seminíferos conservan la espermatogénesis. El intersticio es normal

y la pared peritubular está focalmente engrosada. Destaca la expresión de
aspecto fibrilar de células CD34+ en la pared peritubular y en el intersticio
testicular.
b) Las células CD34 rodean a las arterias y arteriolas intersticiales.
c) Detalle de la pared peritubular en el que se observa una continuidad de la
lámina externa CD34+ con las células inmunomarcadas del intersticio.
Destacan cúmulos lineales y focales de material CD34+ en la porción interna
del engrosamiento de la pared tubular.
d) Desestructuración completa de una pared peritubular engrosada en donde se
aprecian prolongaciones celulares irregulares CD34+, entremezcladas con
depósito de matriz extracelular.
e) El tubo seminífero es muy irregular, debido a un engrosamiento de su pared
peritubular, y son evidentes las prolongaciones celulares CD34+ tortuosas, las
cuales también rodean a dos divertículos tubulares. En el intersticio existe
una condensación de las células CD34.
f) Los tubos seminíferos son pequeños y tienen importantes alteraciones de la
espermatogénesis. La pared peritubular está engrosada y externamente está
delimitada por una lámina circunferencial con intensa expresión de CD34; sin
embargo hacia el interior de la pared las células CD34+ son más espaciadas.
En el intersticio existen células CD34+ que se condensan alrededor de una
arteriola.
g) La gruesa pared peritubular contiene abundante matriz extracelular y escasas
células CD34+, si se compara con el intenso marcaje del intersticio testicular.
El tubo presenta hipoespermatogénesis intensa con espermatogonias
hipertróficas.
h) Tubo muy atrófico, con importante fibrosis peritubular, constituida
fundamentalmente por células CD34+.
 Insuficiencia Hepática Crónica: Células CD34 + en Pared Peritubular

a b c

f h
 Resultados 50

Fig. 10. Valoración de la expresión de CD34 en el intersticio testicular en pacientes con

insuficiencia hepática crónica

a) La atrofia tubular intensa se acompaña de importante aumento del espacio

intersticial, en donde se identifican células CD34+ que rodean nódulos de
células de Leydig.
b) El inmunomarcaje de CD34 es muy intenso en el intersticio y se dispone
formando gruesas prolongaciones CD34+.
c) La intensa fibrosis intersticial se acompaña de extenso inmunomarcaje de
células CD34+ que engloban y colapsan a los nódulos de células de Leydig.
d) La abundancia de células CD34+ en el intersticio se continúa directamente
con la pared peritubular engrosada.
e) Tubos seminíferos completamente esclerosados, rodeados por una extensa
fibrosis intersticial, con abundantes células CD34+.
f) Las numerosas células CD34+ del intersticio rodean y se introducen en el
interior de los tubos seminíferos esclerosados.
g) Los tubos seminíferos esclerosados quedan atrapados por la intensa fibrosis
intersticial, observándose la penetración de células CD34+ que
progresivamente sustituyen al tubo seminífero.
 Insuficiencia Hepática Crónica: Células CD34 + en Intersticio

f g
 Resultados 52

Fig. 11. Valoración de la expresión de CD34 en relación con las células de Leydig en
pacientes con insuficiencia hepática crónica

a) Tubos seminíferos con diferente grado de hipoespermatogénesis y fibrosis

peritubular. En el intersticio se observan nódulos de células de Leydig y
células CD34+.
b) Detalle de una hiperplasia de células de Leydig adosadas a la pared
peritubular engrosada. Entre las células de Leydig se observan células CD34+.
Inset: En la íntima vecindad de las células de Leydig se destaca finas
prolongaciones con inmunomarcaje de CD34.
c) La expresión de CD34 es evidente en la pared peritubular engrosada; además,
se observan células CD34+ dispuestas entre las células de Leydig.
d) Extensa hiperplasia de células de Leydig surcada por células CD34+. La pared
de los tubos seminíferos es gruesa y la distribución de células CD34+ es muy
irregular.
e) Detalle del intersticio testicular, caracterizado por una irregular distribución
de la expresión de CD34, formando finas prolongaciones celulares situadas
entre las células de Leydig.
f) Entre los tubos esclerosados destaca abundantes células CD34+ rodeando las
células de Leydig.
 Insuficiencia Hepática Crónica: Células CD34 + en Intersticio

d f
 Resultados 54

Fig. 12. Expresión de CD68 en los macrófagos testiculares en pacientes con insuficiencia
hepática crónica

a) Tubo seminífero normal con ligera descamación del epitelio tubular.

b) Moderada atrofia del epitelio seminífero y dilatación luminal. Se observa un
macrófago CD68+ en el intersticio peritubular.
c) Múltiples macrófagos CD68+ en el tejido conjuntivo intersticial testicular. El
tubo presenta hipoespermatogénesis moderada.
d) Se ven nidos de macrófagos intersticiales inmunomarcados. La matriz
extracelular está aumentada y los tubos presentan hipoespermatogénesis.
Las células de Leydig son histológicamente normales.
e) Importante fibrosis intersticial y atrofia tubular. En el intersticio se observan
nidos de macrófagos CD68+. Inset: Intensa inmunotinción de CD68 en el
citoplasma de los macrófagos intersticiales.
f) Masiva presencia de macrófagos en intersticio peritubular. Se observa atrofia
de tubos seminíferos y engrosamiento de la pared peritubular.
g) La inmunoexpresión de CD68 ocupa todo el citoplasma de los abundantes
macrófagos intersticiales. El tubo seminífero presenta hipoespermatogénesis
intensa.
h) En la luz del tubo esclerosado se acumulan varios macrófagos intensamente
inmunomarcados con el anticuerpo anti-CD68.
 Insuficiencia Hepática Crónica: Macrófagos CD68+

a b c

g h
 Resultados 56

Fig. 13. Expresión de CD68 en los macrófagos testiculares en pacientes con insuficiencia
hepática crónica

a) Patrón mixto de hipoespermatogénesis intensa y esclerosis tubular completa.

En el intersticio se observan algunos macrófagos CD68+.
b) Los macrófagos inmunomarcados, localizados en el tejido conjuntivo
intersticial, se disponen en la vecindad de la pared peritubular esclerosada.
c) La infiltración de macrófagos CD68+ es masiva, y los macrófagos migran y se
acumulan en el interior de los tubos seminíferos esclerosados.
d) El intersticio testicular está ampliado y existe edema y dilatación de los
espacios paralinfáticos, los cuales contienen abundantes macrófagos CD68+.
e) Tubo seminífero con hipoespermatogénesis intensa, en el intersticio
adyacente se observan numerosos macrófagos CD68+.
f) Cúmulos de células de Leydig asociados a atrofia tubular. Nótese la presencia
de infiltrados difusos de macrófagos.
g) Pseudohiperplasia de células de Leydig en un testículo atrófico. Nótese la
presencia de macrófagos con intensa expresión de CD68 en su citoplasma.
h) Se observa una heterogeneidad del tamaño y de la intensidad de
inmunotinción en los macrófagos intersticiales.
 Insuficiencia Hepática Crónica: Macrófagos CD68+

a b c

e h
 Resultados 58

Fig. 14. Expresión de triptasa en las células cebadas testiculares en pacientes con
insuficiencia hepática crónica

a) Los tubos seminíferos presentan hipoespermatogénesis intensa, y el

intersticio está ampliado. Se observa una célula cebada triptasa+ en la
vecindad de células de Leydig.
b) La pared del tubo seminífero está engrosada y contiene dos células cebadas
inmunomarcadas. Testículo con hipoespermatogénesis y edema intersticial.
c) La alteración de la espermatogénesis es importante y existe moderada
fibrosis peritubular. Se observa pseudohiperplasia de células de Leydig y una
célula cebada de gran tamaño y parcialmente degranulada.
d) El diámetro tubular está disminuido, la espermatogénesis está alterada y solo
se observa diferenciación focal de espermátidas maduras. La pared
peritubular está muy engrosada y contiene una célula cebada elongada con
signos de degranulación.
e) Los tubos seminíferos están atróficos y existen múltiples grupos de células de
Leydig en cuyo interior hay células cebadas triptasa+.
f) El epitelio seminífero está constituido por células de Sertoli y aisladas
espermatogonias. La pared peritubular está engrosada y en su periferia se
observan dos células cebadas triptasa+.
g) Detalle de la imagen anterior en el que se observa una gran célula cebada
intensamente inmunomarcada adosada a la pared peritubular. En el otro
extremo de la imagen se identifican gránulos triptasa+ en el espesor de la
matriz extracelular de la pared.
 Insuficiencia Hepática Crónica: Células Cebadas Triptasa +

a b

e g
 Resultados 60

Fig. 15. Expresión de triptasa en las células cebadas testiculares en pacientes con
insuficiencia hepática crónica

a) Se observan tubos atróficos con hipoespermatogénesis y fibrosis peritubular.

En el intersticio, se observa edema e infiltrados inflamatorios y se identifican
varias células cebadas triptasa+.
b) Tubos esclerosados en cuyo interior existen células cebadas
inmunomarcadas. El intersticio contiene abundantes infiltrados de células
inmunocompetentes.
c) Asociado a tubos esclerosados, se encuentran grupos de células de Leydig
rodeadas por tejido intersticial edematoso, en donde se identifican algunas
células cebadas.
d) Detalle de otro campo del caso anterior. Se visualiza una célula cebada
triptasa+ en la periferia de un nódulo de células de Leydig.
e) Extensa fibrosis intersticial, con edema de la matriz y abundantes células
cebadas que muestran posibles signos de degranulación.
f) Las células de Leydig presentan signos de atrofia, y el intersticio está
fibrosado y contiene células cebadas de tamaño heterogéneo y parcialmente
degranuladas.
g) Detalle de una célula cebada con intensa expresión intracitoplásmica de
triptasa.
h) Célula cebada inmunomarcada en el intersticio testicular. Nótese la
presencia de gránulos intracitoplásmicos triptasa+ y también secretados
hacia el intersticio.
 Insuficiencia Hepática Crónica: Células Cebadas Triptasa +

a b

e g h
 Resultados 62

Fig. 16. Evaluación de la expresión de CD34 en la pared peritbular del testículo

criptorquídico postpuberal

a) Los tubos seminíferos tienen células de Sertoli y aisladas espermatogonias y

espermatocitos de primer orden. Las células de Sertoli son inmaduras y
están microvacuoladas. La pared peritubular externamente está rodeada por
una lámina circunferencial de células CD34+.
b) En otra área del caso anterior se observa engrosamiento de la pared
peritubular, secundario al depósito de material hialino, y externamente
vemos láminas circunferenciales de células CD34+. En el intersticio, rodeando
a los nidos de células de Leydig o a la matriz extracelular, se ven
prolongaciones CD34+.
c) Los tubos están constituidos por células de Sertoli disgenéticas y por una
pared intensamente hialinizada, en la que se distingue una capa externa
discontinua de células CD34+.
d) En otra área del caso anterior, el depósito del material hialino en la pared
peritubular está delimitada por dos capas circunferenciales concéntricas de
células CD34+.
e) Tubo atrófico disgenético, con intensa hialinización de la pared delimitada
externamente por una capa circunferencial concéntrica de células CD34+. En
el intersticio, el depósito de células CD34+ es muy escaso.
f) Patrón mixto de tubos esclerosados y tubos disgenéticos, con irregular
distribución de células CD34+.
 Criptorquidia: Células CD34 + en Pared Peritubular

a b

c d

e f
 Resultados 64

Fig. 17. Expresión de CD34 en la pared peritubular en relación con la migración intratubular
de células de Leydig en el testículo criptorquídico postpuberal

a) El tubo seminífero muestra una hialinización muy extensa de la pared

delimitada por una capa fina de células CD34+, que contrasta con las escasas
células inmunomarcadas en el intersticio.
b) La expresión de CD34 en la pared peritubular permite visualizar el inicio
circunferencial concéntrico de células alrededor del material hialinizado.
c) Tubo seminífero hialinizado, separado del intersticio por una pared
circunferencial CD34+. En su íntima vecindad existe un nido de células de
Leydig que se relacionan con una solución de continuidad del inmunomarcaje
de células CD34. En el interior del tubo, adosadas a las células de Sertoli, se
ven células de Leydig microvacuoladas.
d) Tubo con patrón de sólo células de Sertoli disgenéticas, hialinización
peritubular y presencia de células de Leydig peritubulares atrapadas entre las
células CD34+.
e) Las células de Leydig se introducen en la pared peritubular hialinizada, y
quedan rodeadas por células CD34+.
f) Tubo atrófico con células de Sertoli microvacuoladas y células de Leydig
peritubulares atrapadas entre dos capas de células CD34+.
g) Tubo esclerosado rodeado por un anillo de células de Leydig
microvacuoladas. Externamente, el tubo queda delimitado por una capa de
células CD34+.
h) Las células de Leydig intratubulares microvacuoladas muestran signos de
degeneración y están en contacto con el material hialino de la pared de un
tubo esclerosado, delimitado por una capa de células CD34+.
i) Esclerosis completa de los tubos seminíferos con escasas células
peritubulares e intratubulares CD34+. En el tubo superior, su pared
peritubular contiene células de Leydig microvacuoladas.
 Criptorquidia: Células CD34 + en Pared Peritubular

a b c

d f

g h i
 Resultados 66

Fig. 18. Expresión de CD34 en relación con fibrosis intersticial en el testículo criptorquídico
postpuberal

a) Tubos disgenéticos con hialinización peritubular y pseudohiperplasia de

células de Leydig, separadas por escasas células CD34+.
b) Intersticio que contiene varios nódulos de células de Leydig, rodeados de
células CD34+.
c) Los tubos están esclerosados y con escasas células CD34+ entre las células de
Leydig.
d) Extensa hiperplasia pseudoadenomatosa de células de Leydig, rodeada por
una capa de células CD34+. En el interior del nódulo se visualizan aisladas
células CD34+ asociadas en algunos casos, a pequeños vasos sanguíneos.
e) Detalle de la porción superior de la pared tubular con escasas células CD34+.
f) Detalle de la porción inferior de la imagen anterior, en la que se observa un
revestimiento continuo de células CD34+.
g) En el interior de nódulo de células de Leydig existe una evidente
angiogénesis, con finas y escasas prolongaciones de células CD34+.
h) Tubos de pequeño diámetro con sólo células de Sertoli y con moderada
fibrosis y presencia de células CD34+.
i) Tubo seminífero con pared intensamente hialinizada, delimitado por dos
finas laminas circunferenciales de células CD34+. En el intersticio se ven
abundantes células de Leydig separadas por células CD34+.
j) La matriz extracelular es abundante y queda delimitada múltiples células
CD34+.
k) En otra área del mismo caso, las células CD34+ rodean a pequeños nidos de
células de Leydig.
l) Intersticio con abundantes células CD34+.
m) Abundante fibrosis intersticial que enmascara las células CD34+.
 Criptorquidia: Células CD34 + en Intersticio

a b c

d
g

h l

i k m
 Resultados 68

Fig. 19. Expresión de CD34 en relación con las células de Sertoli disgenéticas

a) Tubos seminíferos con retraso de la maduración formados por células de

Sertoli de núcleo esférico. En la pared peritubular existe una capa de células
CD34+. En el intersticio predomina la matriz extracelular, en la que se ven
algunas células CD34+.
b) Los tubos seminíferos con sólo células de Sertoli de núcleo esférico y están
delimitados por una pared de células CD34+. En el intersticio, las células
inmunomarcadas son escasas.
c) Tubo disgenético de contorno muy irregular, asociado a otros tubos de
pequeño diámetro. Se ve marcaje circunferencial de células CD34+ en la
pared peritubular y aisladas células inmunomarcadas, en el intersticio.
d) En la vecindad de un tubo con diferenciación postpuberal y patrón de sólo
células de Sertoli disgenéticas y fibrosis peritubular, se disponen nódulos de
tubos de tipo infantil, muy irregulares, constituidos exclusivamente por
células de Sertoli con núcleo elongado. La pared peritubular está hialinizada y
externamente delimitada por una capa discontinua de células CD34+.
También se ven en el intersticio prolongaciones celulares inmunomarcadas
que rodean a pequeños nidos de células de Leydig.
e) Nódulo de células de Sertoli disgenéticas. Los tubos seminíferos están
íntimamente adosados entre sí y separados por una fina pared intertubular
con expresión mínima o ausente de CD34+. Delimitando al nódulo se observa
una banda de células CD34+.
f) Área central de un nódulo de células de Sertoli formado por tubos anulares
disgenéticos. Destaca la ausencia de células CD34+ en la pared peritubular, lo
que contrasta con la intensa inmunotinción en la pared capilar.
 Criptorquidia con Células de Sertoli Disgenéticas : Células CD34 +

a b

c
d

e f
 Resultados 70

Fig. 20. Expresión de CD68 en los macrófagos de testículos criptorquídicos postpuberales

a) Tubos seminíferos que muestran sólo células de Sertoli. El intersticio

testicular está aumentado y contiene abundantes macrófagos CD68+.
b) Tubos con sólo células de Sertoli, con múltiples macrófagos CD68+
localizados en la vecindad de la pared peritubular.
c) Tubo seminífero con importante vacuolización de las células de Sertoli. Se
observa engrosamiento de la pared y un macrófago CD68+ en el intersticio.
d) Tubo seminífero esclerosado en el que se observa un macrófago
intensamente marcado con el anticuerpo anti-CD68, localizado en la pared
peritubular.
e) Tubos esclerosados mostrando en su interior macrófagos CD68+. En el
intersticio se aprecia una pseudohiperplasia de células de Leydig.
f) Tubos con sólo células de Sertoli. En el intersticio se observan múltiples
células CD68+.
g) Nódulo de células de Leydig en cuyo interior se identifican múltiples
macrófagos CD68+.
h) Tubos con esclerosis tubular completa y fibrosis intersticial, con aislados
macrófagos CD68+.
i) Detalle de un tubo seminífero esclerosado. En su interior se visualiza un
macrófago, con amplio citoplasma e intenso inmunomarcaje con el
anticuerpo anti-CD68.
j) Se observan múltiples macrófagos CD68+ en el interior de un tubo
completamente esclerosado. El intersticio presenta moderado edema.
 Criptorquidia: Macrófagos CD68+

a b

c d e

h i j
 Resultados 72

Fig. 21. Expresión de triptasa en las células cebadas en la pared peritubular de testículos
criptorquídicos postpuberales

a) Tubos con células de Sertoli, vacuoladas. Se observan células triptasa+, tanto

en la pared peritubular como en el espacio intersticial.
b) Tubo seminífero con sólo células de Sertoli vacuoladas. Se ven varias células
cebadas triptasa+, dispuestas en la vecindad de la pared peritubular y una
dentro del tubo.
c) Tubos seminíferos con sólo células de Sertoli con células disgenéticas. En el
intersticio se ven tres células cebadas triptasa+, localizadas en la periferia de
un grupo de células de Leydig.
d) Se observa un tubo seminífero con sólo células de Sertoli disgenéticas y una
extensa hialinización peritubular. El intersticio está ampliado, edematoso, y
contiene células de Leydig y varias células cebadas triptasa+, entre las que
sobresale una de gran tamaño e intenso inmunomarcaje, situada cerca del
nido de células de Leydig.
e) El intersticio está muy ampliado y edematoso. Los tubos seminíferos
presentan sólo células de Sertoli, con núcleos esféricos (disgenéticos). En la
pared peritubular engrosada se encuentran varias células cebadas triptasa+.
f) Tubos con sólo células de Sertoli vacuoladas. Se localizan múltiples células
cebadas, con signos de degranulación, que infiltran una gruesa pared
peritubular.
g) La pared peritubular está hialinizada y contiene células cebadas. Se observa
pseudohiperplasia de células de Leydig pequeño tamaño.
 Criptorquidia: Células Cebadas Triptasa + en Pared Peritubular

a b c

d
e

f g
 Resultados 74

Fig. 22. Expresión de triptasa en las células cebadas de testículos criptorquídicos

postpuberales

a) Esclerosis tubular intensa. Aumento del espacio intersticial que contiene

varias células cebadas triptasa+.
b) Esclerosis tubular intensa. Se observan varias células cebadas con intenso
inmunomarcaje de triptasa, en el interior de un tubo seminífero.
c) En el interior del tubo esclerosado, se observa migración de células de Leydig
y también una célula cebada intensamente inmunomarcada. Inset: Dos
pequeñas células cebadas inmunomarcadas en la pared tubular esclerosada.
d) Fibrosis tubular completa, asociada a escasas células cebadas.
e) El intersticio que rodea a los tubos esclerosados presenta edema en el que se
identifican dos células cebadas. Inset: El inmunomarcaje con anticuerpo
antitriptasa permite distinguir células cebadas en proceso de degranulación.
f) Se ven varias células cebadas dispuestas en la vecindad de pequeños nódulos
de células de Leydig.
g) Una célula cebada está en íntimo contacto con células de Leydig
microvacuoladas.
h) Tubos seminíferos con sólo células de Sertoli. El intersticio está ampliado y
edematoso, y contiene células cebadas y escasas células de Leydig atróficas.
i) Hiperplasia nodular de células de Leydig, en cuyo interior se identifica una
célula cebada triptasa+.
j) Centro de un gran nódulo adenomatoso de células de Leydig, con múltiples
células cebadas. Inset: La célula cebada del nódulo presenta signos de
degranulación.
 Criptorquidia: Células Cebadas Triptasa +

a b

c d e

f g h

i j
 Resultados 76

Evaluación de inmunotinción CD34+.

Las células más abundantes del tejido conjuntivo intersticial testicular son los
fibroblastos y se marcan inmunohistoquímicamente con la glicoproteína CD34. Evaluamos la
relación entre el área inmunomarcada con CD34 con respecto al área total intersticial. La
expresión de CD34 en el intersticio testicular es significativamente mayor (p<0,01) en los
pacientes con hepatopatía crónica comparados con los controles y con los testículos
criptorquídicos. (Tabla 7 y Fig. 23).

Tabla 7. Superficie intersticial y tubular positiva para inmunotinción con CD34.Se muestran los
promedios de cada grupo.

Grupo CD34+ CD34+

Intersticial Pared tubular
2
(µm ) +DE (µm2) +DE
Control 7.442 ± 2.249 5.478 ± 619

Insuficiencia Hepática Crónica 13.692 ± 10.775** 7.308 ± 660

Criptorquidia 5.470 ± 3.444 5.804 ± 353

**
0 .4
**
0 .3
C D 3 4 -In t

0 .2

0 .1

0 .0
C o n tro l IHC
I. H e p a t C r ip to

Figura 23. Relación entre área con inmunotinción CD34+ intersticial con respecto al área del
intersticio testicular.**: p<0,01.
 Resultados 77

Al igual que lo observado a nivel intersticial testicular, la expresión de CD34 en la pared

de los tubos seminíferos en relación con el área tubular total, es significativamente mayor
(p>0,01) en los pacientes con IHC comparados con los controles y con los testículos
criptorquídicos. (Tabla 7 y Fig 24).

0 .5 **

0 .4
**
C D 3 4 -T u b

0 .3

0 .2

0 .1

0 .0
C o n tro l IHC
I. H e p a t C r ip to

Figura 24. Relación entre área con inmunotinción CD34+ tubular con respecto al área tubular
testicular. **: p<0,01

Si tomamos en cuenta el promedio del valor absoluto del área intersticial ocupada por
la inmunotinción con CD34 podemos observar que el área CD34+ es mayor en el grupo de
hepatopatía crónica, y es una diferencia significativa con respecto a los otros dos grupos. En
cambio, al observar el promedio del área absoluta tubular, vemos que el grupo de IHC es
mayor que el de los otros grupos, pero no estadísticamente significativa. (Tabla 7)

Cuantificación de macrófagos CD68 +.

La inmunotinción con CD68 marca a los macrófagos presentes. Se observa que tanto en
los casos control como en los testículos criptorquídicos la presencia de macrófagos es
mínima, mientras que los testículos de pacientes con hepatopatía crónica muestran un
contaje muy elevado, con una significancia muy alta (p<0,001) con respecto a los otros dos
grupos. (Tabla 8 y Fig. 25)
 Resultados 78

Tabla 8. Cuantificación de macrófagos CD68+ y de células cebadas triptasa+. Se muestran los

promedios de cada grupo.

Grupo Nº de macrófagos CD68+ Nº de células cebadas

+DE triptasa+ +DE
Control 1,26 ± 0,27 1,19 ± 0,15
Insuficiencia Hepática crónica 18,69 ± 2,36*** 3,82 ± 0,36***
Criptorquidia 1,92 ± 0,45 4,16 ± 0,58***

Nº: Número de células promedio. ***: p < 0,001.

***
25

***
20

15
C D 68

10

0
C o n tro l IHC
I. H e p a t C r ip to

Figura 25. Cuantificación de células CD68+.***: p<0,001.

Cuantificación de células cebadas triptasa +.

La inmunotinción con triptasa identifica a las células cebadas presentes en el

parénquima testicular. Estas células se encuentran significativamente aumentadas tanto en el
grupo con hepatopatía crónica como en el grupo con criptorquidia, en comparación con el
grupo control, con un alto nivel de significancia (p<0,001). (Tabla 8 y Fig. 26).
 Resultados 79

5
***
***
4

T r ip ta s a
3

0
C o n tro l IHC
I. H e p a t C r ip to

Figura 26. Cuantificación de células triptasa positivo.***: p<0,001.

 Discusión 80

DISCUSIÓN
 Discusión 81

En el presente trabajo nos hemos propuesto estudiar los cambios en el intersticio

testicular y en la pared peritubular en pacientes con IHC y en pacientes criptorquídicos, cuyo
testículo fue extirpado después de la pubertad. Si bien ambas patologías son, en principio,
muy distintas entre sí, dado que, respectivamente, una es adquirida y la otra congénita, las
dos entidades determinan hipogonadismo y lesiones de atrofia progresiva de los tubos
seminíferos.

Además, ambas patologías presentan un factor común relevante como es el incremento

de estrógenos circulantes, los cuales también producen daño testicular. En efecto, modelos
experimentales han descrito alteraciones histológicas testiculares, cuando la exposición
estrogénica ocurre durante el período fetal.232,247 De otra parte, la IHC está asociada con
importantes manifestaciones de hipogonadismo, incluyendo infertilidad,
hipoespermatogénesis, atrofia testicular, ginecomastia, disminución del vello corporal y
disfunción de la libido.269 De hecho, en muchos casos durante las fases más avanzadas de la
IHC se ha encontrado, como denominador común, el aumento de la acción estrogénica, la
cual actúa en competición con la actividad androgénica testicular;269 sin duda, esta alteración
del equilibrio andrógenos/estrógenos pudiera determinar cambios evidentes en la estructura
testicular, tal como se ha planteado investigar en el presente trabajo de Tesis Doctoral.

En la criptorquidia, el daño testicular, además de estar determinado, en parte, por la

exposición del testículo a altas temperaturas, realmente las lesiones son secundarias a una
etiología más compleja, que comienza desde los primeros momentos del desarrollo fetal.
Desde los trabajos de Skakkebaek,232,233 se considera que la criptorquidia es una
manifestación del SDT, y respecto a su etiología se ha identificado un aumento de la acción
estrogénica endógena. Así mismo, en la actualidad también se ha considerado, como muy
verosímil, la hipótesis que aboga por la participación de un incremento de los disruptores
endocrinos ambientales en la disregulación endocrina testicular. En las últimas décadas se ha
sugerido que los estrógenos tienen una evidente relevancia en el control endocrino y
paracrino a nivel testicular, y también se han relacionado con procesos de migración celular y
fibrosis testicular.269,270
 Discusión 82

La secreción sincronizada de andrógenos regula los procesos de espermatogénesis.

Para que esta función tan compleja pueda existir y mantenerse en el tiempo, es necesario
que se establezcan mecanismos de regulación endocrina y paracrina muy delicados,
desarrollándose fundamentalmente entre los tubos seminíferos y el intersticio testicular. En
estos mecanismos regulatorios, las células dianas principales son las células de Sertoli y las
células de Leydig; pero además también están involucrados la pared peritubular y al barrera
hematotesticular.3,186,239

Si bien el primer nivel de regulación endocrina está a cargo del eje hipotálamo-
hipófiso-testicular, es muy importante considerar el nivel de regulación intratesticular, dado
que las concentraciones de testosterona son completamente distintas de los niveles
plasmáticos; por ello, la regulación paracrina, e incluso autocrina, es fundamental en la
regulación de la función testicular.269 En este sentido, es evidente que algunos factores
testiculares podrían ser mediadores de la acción hormonal y de la comunicación intra e
intercelular.270 Sin embargo, es mucho menos conocida la interrelación entre los elementos
del intersticio testicular entre sí, y su influencia en la espermatogénesis.3,186,239

Por todos estos hechos, el presente trabajo se ha centrado, de una parte, en los
cambios que ocurren en el intersticio testicular y en la pared peritubular en pacientes
postpuberales con criptorquidia, como muestra de alteraciones testiculares por aumento de
la acción estrogénica en el desarrollo prenatal, y, de otra, en pacientes adultos con IHC con
enfermedad adquirida crónica, en la que las lesiones testiculares se relacionan, en parte, con
una acción estrogénica.

Se han postulado múltiples mecanismos implicados en la patogénesis de la

criptorquidia. La evidencia más reciente sugiere que un número importante de los casos de
criptorquidia son el resultado de un déficit androgénico durante la vida fetal, sugiriéndose un
exceso materno de estrógenos. La insuficiencia androgénica parece ser leve y transitoria.173 El
nivel elevado de estrógenos maternos podría causar disminución de la secreción fetal de FSH,
lo que favorecería la disminución de la proliferación de las células de Sertoli, y también podría
ocasionar un efecto inhibitorio de la producción de andrógenos por las células de Leydig.22,146
 Discusión 83

En el presente estudio hemos incluido un grupo de pacientes criptorquídicos en los

que el testículo se extirpó después de la pubertad (en la mayoría los casos los testículos se
extirparon en la tercera década, media de edad: 29 años). El estudio histológico del testículo
criptorquídico demostró una lesión de sólo células de Sertoli en el 80% de los casos, y una
hiperplasia multinodular de células de Leydig en el 40%; además en todos los casos se
encontraron diferente grado de hipoespermatogénesis. El estudio morfométrico del diámetro
tubular reveló una disminución significativa en los testículos criptorquídicos con respecto al
control.

En general, los hallazgos observados en las piezas de orquiectomía estudiadas,

fundamentalmente las lesiones de tubos con sólo células de Sertoli, o la presencia de un
patrón de atrofia mixta tubular coinciden con lo publicado en estudios previos.1,27,28,258 En
algunos casos también hemos encontrado los característicos nódulos de células de Sertoli,
adenomas de Pick, e hiperplasia adenomatosa de células de Leydig, así como la presencia de
tubos malformados, y la presencia focal de cambios granulares en las células de
Sertoli.1,27,28,258

Todos los casos estudiados se han desarrollo en hombre adultos, bien masculinizados;
además, en la historia clínica no hemos encontrado otras malformaciones asociadas distintas
al mal descenso de uno de los testículos. Todos estos datos nos permiten sugerir que en estos
casos la criptorquidia unilateral aparece como un defecto aislado de mal descenso testicular,
aunque no se puede descartar completamente que forme parte de un SDT con escasas
manifestaciones clínicas,232,233 dado que en el estudio histológico exhaustivo del tejido
testicular no hemos encontrado una evidente microlitiasis, ni células de CIS, que, como bien
es conocido desde los estudios tempranos de Skakkebaek,232,233 son lesiones que forman
parte del SDT.

En la literatura existen datos que abogan por el desarrollo prenatal de las lesiones del
testículo criptorquídico como consecuencia de factores genéticos, pero también en el
desarrollo de las lesiones pueden influir factores ambientales, incluidos diferentes
disruptores endocrinos que causarían una alteración en el cociente
estrógenos/andrógenos.22,82,146,177,226 Se consideran como disruptores endocrinos diversas
 Discusión 84

sustancias químicas contaminantes ambientales con actividad hormonal,113 los cuales pueden
causar un desequilibrio en el balance de los estrógenos, los andrógenos, los progestágenos y
las hormona tiroideas. En el varón, los disruptores hormonales podrían provocar alteraciones
de la función reproductiva, incluidas la presencia de malformaciones en el tracto
genitourinario, una mayor frecuencia de cáncer de testículo, así como alteraciones del
seminograma y disminución de la fertilidad.185 En este sentido, se han propuesto la acción
deletérea de pesticidas policlorados en relación con las alteraciones del descenso del
testículo y con el cáncer testicular. Además, en niños, la exposición prenatal a los ftalatos se
correlacionó negativamente con los niveles de testosterona y la distancia anogenital, que es
una medida del efecto antiandrogénico. De otra parte, los disruptores endocrinos
posiblemente también estarían implicados, asociados a otros factores genéticos, en el
desarrollo del SDT; pero además, también cabe la posibilidad de que ciertos polimorfismos
genéticos específicos podrían potenciar el papel deletéreo de los factores ambientales sobre
el aparato genital masculino.164,247 Todos estos datos corroboran la evidencia actual que
aboga a favor de los efectos adversos de los disruptores hormonales ambientales sobre el
desarrollo del tracto reproductivo masculino.145

Respecto a la relación de hepatopatías con patología testicular, en la presente Tesis

Doctoral se ha investigado también las lesiones testiculares en la IHC, dado que puede ser un
buen modelo experimental natural de investigación del equilibrio de los niveles de
andrógenos y de estrógenos circulantes en el hombre adulto. Estudios previos han publicado
que la IHC está asociada con importantes manifestaciones de hipogonadismo, incluyendo
infertilidad, hipoespermatogénesis, atrofia testicular.269 Por ello, en nuestro estudio de los
pacientes con IHC se han investigado las lesiones generales de los tubos seminíferos; pero
además se ha efectuado una investigación mucho más pormenorizada de las alteraciones
estructurales del intersticio testicular y de la pared peritubular.

En nuestro trabajo hemos evaluado los testículos provenientes de la autopsia de 17

pacientes con IHC, con una edad promedio de 51 años. De la revisión de la historia clínica se
desprende que un 35% de los pacientes presentaba hepatitis vírica y que el 41% habían
desarrollado una cirrosis; sin embargo, el antecedente de alcoholismo sólo se constató en dos
casos. En presente serie de pacientes con IHC hemos observado una espermatogénesis
 Discusión 85

completa sólo en el 35% de los casos, y en el resto de los casos se vieron diferentes lesiones
tubulares, incluyendo hipoespermatogénesis, que fue evidente en el 23% de los casos, parada
de la maduración de las espermatogonias, la cual se vio en el 23%, e hialinización tubular que
se encontró en el 47% de los casos con IHC. En nuestro estudio, independientemente de la
causa de IHC, el diámetro tubular medio fue de 144,5 µm, presentando una disminución
significativa con respecto al promedio del diámetro del grupo control.

Todos estos datos indican lesiones testiculares muy importantes en los pacientes con
IHC, las cuales muy probablemente sean la consecuencia del efecto deletéreo
desencadenado por las evidentes alteraciones hormonales presentes en las hepatopatías
crónicas. En este sentido, se sabe que el hígado juega un papel fundamental en el
metabolismo, detoxificación y excreción de los esteroides sexuales, y que la IHC daña el eje
hipotálamo-hipófiso-testicular. El desarrollo de hipogonadismo es frecuente en la fase final
de la enfermedad hepática crónica severa, tanto en la secundaria al alcoholismo crónico,
como también los casos de enfermedad hepática no alcohólica, y en los pacientes con
hemocromatosis.173

En los pacientes con IHC, la producción de testosterona está disminuida, lo que

conlleva niveles circulantes más bajos, a pesar del aumento concomitante de los niveles
circulantes de la SHBG;144 estos mecanismos determinan una disminución en la velocidad de
eliminación renal de testosterona, lo que puede enmascarar la severidad de la deficiencia
androgénica en las primeras etapas de la IHC. Estos cambios funcionales de la regulación de la
testosterona, no se pueden relacionar con cambios morfológicos, al menos en nuestro
material, de las células de Leydig, dado que su distribución peritubular e intersticial no
muestra alteraciones morfológicas evidentes, las cuales sí han sido muy relevantes en los
casos de criptorquidia postpuberal, tal como ha sido publicado previamente.205 Cabe
considerar que en la IHC los niveles de gonadotropinas permanecen por debajo o dentro del
rango eugonadal, a pesar de la disminución de los niveles de testosterona observada en estos
pacientes, asimismo es frecuente observar una disminución de la secreción pulsátil de LH.
Todos estos datos permiten enfatizar la importancia de la disregulación hipotalámica en la
patogénesis del hipogonadismo de los pacientes con IHC.255
 Discusión 86

En definitiva, tanto la IHC como la criptorquidia presentan en común, como se ha

indicado previamente, un aumento de la acción estrogénica, que ocurre desde el período
perinatal en los casos criptorquidia, y en el caso de las alteraciones hepáticas a partir de la
vida adulta. El papel fisiológico de los estrógenos en el tracto reproductivo masculino ha sido
debatido por mucho tiempo. Los testículos producen cantidades significativas de hormonas
estrogénicas, vía aromatasa, y receptores estrogénicos (ERs) α y β que son expresados
selectivamente en los diferentes tipos celulares testiculares.34,99,183

En la presente Tesis, dado que en la criptorquidia postpuberal y en al IHC existe un

aumento de estrógenos, se ha planteado el siguiente interrogante: ¿situaciones con una
exposición a niveles estrogénicos elevados podrían producir cambios morfológicos
semejantes en el intersticio testicular y en la pared peritubular?. Con el fin de responder a
esta hipótesis, se ha evaluado pormenorizadamente la organización del tejido conjuntivo
intersticial y peritubular, y, en concreto, se han cuantificado los fibroblastos CD34+,
incluyendo la formación reticular integrada por sus prolongaciones celulares; y asimismo se
ha cuantificado la presencia de macrófagos y de células cebadas en el tejido testicular, dado
que estos dos tipos de células participan en la remodelación del tejido conjuntivo y en los
procesos de inflamación y de fibrosis. Para evaluar estas alteraciones previamente se han
estudiado la distribución de macrófagos, células cebadas y de células CD34+ en el testículo
adulto normal (grupo control). En nuestro material del grupo control hemos observado que
las células CD34+ tienen largas prolongaciones que rodean a las células de Leydig y a los
escasos macrófagos y células cebadas del intersticio intertubular. En la pared peritubular de
los tubos con espermatogénesis completa también se identifica una fina capa circunferencial
concéntrica de células CD34+. Estos datos coinciden con los previamente publicados, en los
que se describen células de morfología dendrítica que corresponden a células estromales
CD34+, presentes en la túnica albugínea y alrededor y entre los tubos seminíferos, las cuales
también forman una red que rodea a las células de Leydig. 21,60,87,130,265

La distribución de estas células CD34+ en el intersticio testicular y pared peritubular en

los casos con criptorquidia y en los casos con IHC no ha sido descrita, por ello el CD34 es uno
de los marcadores que se estudiaron sistemáticamente en nuestro trabajo. En testículos
criptorquídicos postpuberales, los tubos seminíferos con patrón de sólo células de Sertoli
 Discusión 87

presentaron una capa de células CD34+ que delimita la pared peritubular, la cual tiene una
matriz extracelular hialinizada; sin embargo, en aquellos tubos en los que aún se conserva
alguna célula germinal, sólo se visualizó una capa circunferencial de fibras CD34+ en la parte
exterior de la pared peritubular. Esta peculiar disposición contrasta con los hallazgos de la
expresión de CD34 en la pared peritubular normal, en la que se objetiva la presencia de
prolongaciones irregulares inmunomarcadas con CD34 que rodean a las células miodes de la
pared peritubular que rodea a tubos normales con espermatogénesis completa.
Descripciones similares han sido publicadas previamente.60,130

Nuestros datos cuantitativos demuestran que la expresión de CD34 en el intersticio

testicular es significativamente mayor (p<0,01) en los pacientes con IHC, comparados con los
controles y con los testículos criptorquídicos postpuberales. Así mismo, la expresión de CD34
en la pared de los tubos seminíferos es significativamente mayor (p<0,01) en los pacientes
con IHC, comparados con los controles y con los testículos criptorquídicos postpuberales. Se
desencadenan mecanismos profibrogénicos en el testículo de pacientes con IHC. En este
sentido, se sabe que los fibroblastos CD34+ participan en el recambio de la matriz
extracelular, produciendo colágeno tipo I, III y V, y fibronectina, y contribuyen con la
formación de la membrana basal con la secreción de laminina y colágeno tipo IV; además las
células CD34+ contribuyen a modificar la producción de colágeno y de metaloproteinasas de
la matriz extracelular.149

En definitiva, los cambios de la distribución histológica de las células CD34+ y, sobre

todo de sus prolongaciones, en la criptorquidia y en la IHC, con respecto al testículo normal,
permiten sugerir que en los mecanismos de fibrosis intersticial y peritubular participa un
incremento de las células CD34+, lo cual determinaría una progresiva e irreversible atrofia de
los tubos seminíferos y una fibrosis del intersticio testicular.

En la regulación de estos mecanismos de incremento de la células CD34+ y de la

superficie ocupada por este marcador, tanto en el intersticio como en la pared peritubular de
los casos con criptorquidia postpuberal y con IHC podrían participar alteraciones en el
número y capacidad funcional de los macrófagos y de la células cebadas testiculares. Las
prolongaciones citoplasmáticas finas de las células estromales CD34+ están estrechamente
 Discusión 88

conectadas a la membrana celular de los macrófagos del estroma testicular y pueden jugar
un papel en la vigilancia inmune, como se ha sugerido previamente para otros
órganos.130,274,275 De hecho, los macrófagos pueden interaccionar con los fibroblastos, a
través de la producción de Interleukina-1, TNF-α, PDGF-AB, TGF α y β, VEGFβ,
prostaglandinas, y especies reactivas de oxígeno, favoreciendo su actividad, por lo que
pueden jugar un papel muy importante en los procesos de fibrosis.149

Se sabe que los macrófagos establecen una relación paracrina con las células de Leydig
y que los macrófagos están alterados en diversas patologías testiculares que cursan con
cambios funcionales de las células de Leydig y con alteraciones del equilibrio
andrógenos/estrógenos. En el presente estudio, la cuantificación de macrófagos ha
demostrado que los testículos de pacientes con IHC tienen un número de macrófagos muy
elevado, con una significación estadística muy alta (p<0,001) con respecto al grupo control;
contrariamente, en el grupo de testículos criptorquídicos postpuberales no se observaron
cambios en el promedio de macrófagos. Es posible que en los testículos de pacientes con IHC
se encuentren presentes múltiples mediadores quimiotácticos que atraen a los macrófagos y
perpetúan el proceso inflamatorio testicular. Ha sido descrito previamente por Frungieri et
al.73 diferentes grados de alteración de la espermatogénesis con relación al número de
macrófagos CD68+ presentes en los testículos de pacientes infértiles. Se demostró que estos
macrófagos expresaban los genes de la interleukina 1 y el factor de necrosis tumoral-α. En el
síndrome de sólo células de Sertoli y en los casos de detención de la maduración de las
células germinales, el número total de macrófagos se incrementó más del doble.

También en trabajos previos acerca de fibrosis intersticial testicular se ha descrito un

incremento del número de células cebadas.74 En los pacientes con atrofia mixta testicular se
han observado cambios en el número de células cebadas testiculares y en su fenotipo, con
respecto a la capacidad de expresar la ciclooxigenasa 2 y sintetizar prostaglandinas. Por
tanto, las células cebadas pueden participar en mecanismos involucrados en la disfunción
espermatogénica.271

Está establecido que las células cebadas participan en mecanismos de fibrosis testicular,
los cuales en el presente estudio ya han sido claramente demostrados con el incremento de
 Discusión 89

células CD34+. Nuestros datos morfométricos demuestran que la cuantificación de células

cebadas tripstasa+ está significativamente aumentada, tanto en el grupo con IHC como en el
grupo con criptorquidia postpuberal, en comparación con el grupo control, con un alto nivel
de significancia (p<0,001). Se infiere que el aumento de la actividad de las células cebadas en
estos casos podría relacionarse con los procesos de fibrosis intersticial presentes en estos dos
grupos de patología testicular. Estos datos coinciden con múltiples publicaciones previas, en
las que se ha demostrado que las células cebadas promueven la fibrosis, debido a la
estimulación de la proliferación de fibroblastos y al depósito de colágeno.5,213

Estudios in vitro en modelos humanos han demostrado que las proteasas de las células
cebadas, quimasa y tripsina, inducen la proliferación de fibroblastos.5,213 Se ha descrito un
aumento en la síntesis proteica y de colágeno, cuando los fibroblastos fueron expuestos a los
productos de secreción de células cebadas, la histamina y la triptasa.78 Otra forma en la que
las células cebadas pueden influir en el desencadenamiento de mecanismos de fibrosis es a
través de la activación de las metaloproteinasas de la matriz, que son dependientes de las
células cebadas y de su producto, la quimasa.242

Los datos obtenidos en el presente estudio permiten sugerir que es posible que el
incremento de las células cebadas en el intersticio testicular, observado en ambos grupos de
estudio -criptorquidia e IHC- participe en el aumento del proceso de fibrosis intersticial y
peritubular, mientras que la mayor presencia de macrófagos y células CD34+ podrían
contribuir con dicho proceso fibrogénico, predominantemente en los casos con IHC. Sin duda,
esta fibrosis testicular podría de determinar la perpetuación de importantes alteraciones
paracrinas testiculares presentes en los testículos criptorquídicos; pero además, en la
actividad fibrogénica presente en el intersticio testicular en los casos con IHC, además de los
cambios paracrinos, pudiera participar mecanismos procesos inflamatorios crónicos que
forman parte de los cuadros de IHC.

En el caso particular de los cambios testiculares presentes en los casos con IHC,
podemos proponer el siguiente mecanismo patogénico, el cual puede explicar los resultados
obtenidos en este grupo de pacientes: La mayor presencia de macrófagos en el tejido
intersticial testicular pudiera determinar la interacción de factores de crecimiento,
 Discusión 90

especialmente Interleukina 1 y TNF-α, con los fibroblastos CD34+;73 subsecuentemente estos

mecanismos afectarían a los procesos de regulación de esteroidogénesis en las células de
Leydig; estimulándose los mecanismos de síntesis de colágeno y de la remodelación de la
matriz extracelular, lo cual desencadenaría el inicio de la fibrosis testicular. Está claro que las
alteraciones funcionales de las células de Leydig también están involucradas con el evidente
hiperestrogenismo con el que cursan muchos pacientes con hepatopatías crónicas, incluidos
los pacientes con cirrosis, en los que están incrementados los niveles de estradiol total y libre,
y la relación estradiol/testosterona, los cuales disminuyen y llegan a normalizarse cuando se
realiza el trasplante hepático.221 Pero además, todas estas alteraciones intersticiales
testiculares presentes en casos con IHC determinarían un efecto quimiotáctico aún mayor,
que facilitarían la capacidad de atraer un mayor número de células inmunocompetentes que
participarían en los procesos inflamatorios, incluyendo la migración de más macrófagos
infiltrantes en el tejido intersticial, en la pared peritubular e, incluso, en la luz de los tubos
seminíferos. (Fig. 27)

En cambio, las alteraciones observadas en el intersticio de testículos criptorquídicos

postpuberales muestran un aumento del proceso de fibrosis, posiblemente relacionado con
la exposición a factores deletéreos durante el desarrollo testicular fetal. Dada la relación de la
criptorquidia con el síndrome de disgenesia testicular,232,233 se ha sugerido que la presencia
de niveles de estrógenos elevados, o la participación de factores intercurrentes con acción
estrogénica (por ejemplo los niveles de estrógenos elevados o la presencia de sustancias
químicas que ejercen como disruptores hormonales). Esta elevación de los estrógenos,
acompañada o no de un aumento de la expresión de receptores estrogénicos, podría explicar,
en parte, los hallazgos histológicos tubulares y la fibrosis intersticial observados en los
testículos criptorquídicos.
 Discusión 91

Fig. 27. Relación entre macrófagos activados y fibroblastos CD34+ para la producción de
colágeno y matriz extracelular. a) Factores quimiotácticos inflamatorios atraen a monocitos,
con posterior transformación en macrófagos en el tejido intersticial testicular. b) Los
macrófagos activados producen mediadores, especialmente IL-1 y TNF-α, que estimulan a los
fibroblastos CD34+ para la producción de colágeno y matriz extracelular. c) IL-1 y TNF-α
ejercen efecto quimiotáctico, favoreciendo la llegada de mayor número de macrófagos, que
infiltran intersticio testicular y tubos seminíferos.

En relación con la estimulación estrogénica sobre el testículo, se ha observado un

incremento en el número de las células cebadas en varios modelos experimentales.79,155 En
un modelo ratas recién nacidas, la administración de estradiol produjo un aumento en el
número de células cebadas en el intersticio testicular y la alteración de la
espermatogénesis.79 En otro modelo en ranas, dos semanas después de la inyección de
estrógenos, el grupo con estrógenos mostró un aumento del número de células cebadas, y
estas células contenían gránulos maduros, este efecto se revirtió con la administración de
tamoxifén.155 Todos estos hallazgos experimentales sugieren que las células cebadas están
reguladas por los estrógenos y que esta interacción tiene un efecto en el desarrollo testicular
en animales. Sin embargo, en humanos no existen estudios que valoren la relación del
 Discusión 92

número de células cebadas en respuesta a la exposición estrogénica durante el desarrollo

testicular.149

Se sabe que las células cebadas humanas expresan receptores estrogénicos α

(αER)111,279 y que la exposición a los estrógenos determina una retroalimentación positiva de
la expresión de triptasa y un incremento en la degranulación de las células cebadas.182
También se ha demostrado que la migración y activación de las células cebadas intervienen
en la degradación de la matriz extracelular y en el inicio de mecanismos de fibrosis; así
mismo,111 también se ha demostrado la exposición a los estrógenos produce una
retroalimentación positiva de la expresión de tripsina y un incremento en la degranulación de
las células cebadas.182 Todos estos estudios abogan por una estrecha relación causa-efecto
entre la exposición a estrógenos y la activación de las células cebadas humanas.

Los resultados encontrados en nuestra investigación podrían obedecer al siguiente

mecanismo de regulación paracrina testicular mediada por células cebadas: Las alteraciones
que llevan al hipogonadismo favorecen la actividad de la aromatasa en las células de Leydig,
lo cual determina una mayor producción de estrógenos intratesticulares. El estradiol estimula
la migración de las células cebadas y su activación a nivel intersticial, favoreciendo la
producción de sustancias con actividad paracrina, especialmente Triptasa, que actúan en la
pared peritubular y en los fibroblastos CD34+, produciéndose el engrosamiento de la pared, y
el aumento de la producción de colágeno y matriz extracelular, lo que conlleva finalmente al
desarrollo de fibrosis intersticial y peritubular en los testículos con criptorquidia e IHC. (Fig.
28)

En definitiva, el factor común entre los grupos de estudio (prenatal en el caso de

criptorquidia, y adquirida en el caso de IHC) pudiera estar relacionado con una exposición
estrogénica aumentada. Los resultados inmunohistoquímicos y morfométricos obtenidos en
la presente Tesis nos van a permitir avanzar en el conocimiento de la importancia del
intersticio testicular en la fisiopatología testicular; así como correlacionar los hallazgos
histológicos con las alteración endocrina y paracrina presentes en las enfermedades que
cursan con fibrosis testicular, tal como claramente ha quedado demostrada en los testículos
criptoriquídicos y en los testículos de pacientes con IHC.
 Discusión 93

Fig. 28. Relación entre células cebadas y fibroblastos CD34+. a) Aumento de la actividad
de aromatasa testicular en las Células de Leydig, con aumento de la síntesis de estradiol. b) A
nivel vascular, efecto quimiotáctico del estradiol, que favorece el aumento de las células
cebadas en el intersticio testicular. c) Las células cebadas producen triptasa, con efectos en los
fibroblastos CD34+ y en la pared peritubular, con aumento de la producción de colágeno y
matriz exatracelular, y engrosamiento de la pared peritubular.
 Conclusiones 95

CONCLUSIONES
 Conclusiones 96

CONCLUSIONES

Primera. La cuantificación del área ocupada por las células CD34 positivas y sus
prolongaciones, tanto en el intersticio testicular como en la pared peritubular, es
significativamente mayor en los casos de insuficiencia hepática crónica, con respecto al
testículo normal.

Segunda. Las áreas del intersticio testicular y de la pared peritubular ocupadas por
inmunotinción CD34 positiva son significativamente mayores en pacientes con insuficiencia
hepática crónica, con respecto a la cuantificada en los testículos criptorquídicos; sin embargo,
no se han encontrado diferencias significativas de la cuantificación de la expresión de CD34
en los testículos criptorquídicos, con respecto al control.

Tercera. En el intersticio testicular de pacientes con insuficiencia hepática crónica existe

un marcado incremento de los macrófagos CD68 positivos, comparado con el testículo
normal. También es significativamente mayor el número de macrófagos intersticiales en los
casos de insuficiencia hepática crónica, con respecto a los encontrados en los testículos
criptorquídicos. Sin embargo, no hay diferencias significativas del número de macrófagos,
cuando se comparan los casos con criptorquidia con el grupo control.

Cuarta. El número de células cebadas triptasa positivo en el intersticio testicular es

significativamente mayor en los casos con insuficiencia hepática crónica o con criptorquidia,
respecto al testículo normal, pero no hay diferencias significativas entre estas dos patologías
testiculares.

Quinta. Las alteraciones del intersticio testicular y de la pared peritubular de causa

congénita -criptorquidia- y de causa adquirida -insuficiencia hepática crónica-, relacionadas
con alteraciones hormonales, son semejantes, aunque de diferente intensidad, y conllevan
lesiones irreversibles de la pared peritubular y del intersticio testicular, probablemente
secundarios a las importantes alteraciones de la regulación paracrina testicular.
Resumen 97

RESUMEN
 Resumen 98

En el presente proyecto de investigación se pretende estudiar los cambios presentes en

testículos de pacientes con insuficiencia hepática crónica, una patología adquirida, en
relación con la pared de los tubos seminíferos y el intersticio testicular, y compararlos con los
cambios observados en criptorquidia postpuberal, una patología congénita. Con este fin, se
ha diseñado un estudio inmunohistoquímico para la exploración de la expresión de las
siguientes moléculas: CD34, para identificar las células mioides y fibroblastos peritubulares,
CD68 para identificar los macrófagos presentes, y triptasa, como marcador de células cebadas
tisulares.

Como material de estudio se han incluido sujetos controles (10 casos), pacientes con
insuficiencia hepática crónica (17 casos), y pacientes con criptoquidia postpuberal (10 casos).
Todas las moléculas exploradas se identificaron mediante el método inmunohistoquímico de
estreptavidina-biotina-peroxidasa. La cuantificación del área de inmunotinción con CD34 se
realizó con el programa image J, y se realizaron contajes celulares de macrófagos CD68+ y
células cebadas triptasa +.

Se ha encontrado que el intersticio testicular y la pared peritubular presentan grandes

cambios en presencia de patología hepática crónica, con gran variedad de alteraciones de la
espermatogénesis, desde hipoespermatogénesis a atrofia tubular completa, fibrosis
intersticial aumentada, mostrando una mayor área de fibroblastos y fibras CD34+ y mayor
presencia de macrófagos CD68+ tanto en intersticio como en pared peritubular. Estas
diferencias son estadísticamente significativas con respecto al grupo control y con el grupo de
testículos criptorquídicos postpuberales.

Tanto en el grupo de insuficiencia hepática como en el grupo de criptorquidia

postpuberal se observó aumento de la presencia de células cebadas triptasa+ en el tejido
intersticial testicular y en la pared peritubular, siendo estadísticamente significativa con
respecto al grupo control, pero no entre ambos grupos de estudio.

Todos estos datos sugieren cambios importantes en el intersticio testicular y en la

pared peritubular en testículos de pacientes con insuficiencia hepática y pacientes con
criptorquidia postpuberal.
 Summary 99

SUMMARY
 Summary 100

This research project aims to study the changes present in testes of patients with
chronic hepatic impairment, an acquired condition, in relation to the wall of the seminiferous
tubules and the testicular interstitium, and compare them with the changes observed in
postpubertal cryptorchidism, a congenital pathology. For this purpose, it has been designed an
immunohistochemical study to explore the expression of the following molecules: CD 34 to
identify myoid cells and peritubular fibroblasts, CD68 to identify macrophages, and tryptase, as
marker of mast cells.
The material included control subjects (10 cases), patients with chronic liver failure (17
cases), and patients with postpubertal cryptorchidism (10 cases). All scanned molecules were
identified by immunohistochemical method of streptavidin-biotin-peroxidase. Quantification of
the area of immunostaining with CD34 was performed with the Image J program, and cell
counts of CD68 + macrophages and tryptase + mast cell were performed.
It has been found that the testis interstitium and peritubular wall show the alterations in
chronic liver disease. A variety of alterations in spermatogenesis, from hypospermatogenesis to
full tubular atrophy, increased interstitial fibrosis, showing a major area of CD34 + fibroblasts
and fibers and presence of CD68 + macrophages in both interstitium and peritubular wall were
observed. These differences are statistically significant compared to the control group and the
group of postpubertal undescended testicles.
Both the group with liver failure and the group of postpubertal cryptorchidism showed
increased presence of tryptase+ mast cells in testicular interstitial tissue and peritubular wall.
The increment was statistically significant compared to the control group, but not between the
two groups study.
All these data suggests significant changes in the testicular interstitium and the
peritubular wall in testes of patients with liver failure and patients with postpubertal
cryptorchidism.
 Referencias 101

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