Guia Practica Microbiologia Ii

GUÍA PRÁCTICA MICROBIOLOGÍA II
DOCENTES:
Q.F. JOSE ALBERTO ZAMORA GUEVARA M. Sc
Ph.D. ALONDRA IDROVO E.
CICLO I 2023 — 2024

Universidad de Guayaquil
Facultad de Ciencias Químicas
Carrera: Bioquímica y Farmacia
Guía de Prácticas de Laboratorio
Asignatura MICROBIOLOGÍA II
Campo de PRAXIS PROFESIONAL
formación
Código 064 Semestre: Séptimo 2023-2024 Ciclo CI
Unidad 1. ASPECTOS FUNDAMENTALES DE LA MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

Práctica 1: Bioseguridad y Normas en el laboratorio de Microbiología
Práctica 2: Preparación de Medios de cultivos y Preparación de diluciones
Práctica 3: Planes de Muestreo y Toma de muestras (ambiente, superficies, manos)
Unidad 2. INFECCIONES E INTOXICACIONES. MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA-ETAS

Práctica 4: Determinación de Aerobios Totales
Práctica 5: Uso de otras metodologías. Petrifilm (determinación de aerobios totales)
Práctica 6: Determinación de Hongos y Levaduras
Práctica 7: Determinación de Coliformes Totales, FECALES Y E. COLI. Número más probable (NMP).
Unidad 3. MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA EN LA INDUSTRIA ALIMENTICIA

Práctica 8: Determinación de Salmonella spp
Práctica 9: Determinación de Staphylococcus
Unidad 4. MICROORGANISMOS PATÓGENOS DE IMPORTANCIA EN LOS DIFERENTES ALIMENTOS.

Práctica 10: Determinación de Vibrios
Práctica 11: Análisis MICROBIOLOGICOS DE ALIMENTOS. (Diversas metodologías)
PRACTICA #1 Bioseguridad y Normas en el laboratorio de Microbiología
Objetivos de la práctica de laboratorio
1.- Concientizar al alumno la importancia de la Bioseguridad en el Laboratorio
2.- Actualizar y difundir las Normas y medidas de Bioseguridad
3.- Establecer normas y medidas de Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología
Instrucciones o consideraciones previas
1.- Investigar y exponer las Normas de Bioseguridad y Trabajo en el Laboratorio de Microbiología.
(Entregar documento de evidencia de la investigación).
2.- Investigar y exponer el significado del uso de colores y señales de seguridad en el laboratorio de Microbiología.
3.- Establecer un cuadro de los grupos de riesgo de los agentes biológicos.
Reactivos de laboratorio
No aplica para esta práctica
Materiales de laboratorio
Equipos de laboratorio
Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimiento

Resultados obtenidos
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
1.- Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología y Biomedicina, 4th editions. CDC
2.- http://vww. ucv.ve/fileadmin/userupload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_normas_de_bioseguridad.pdf"
PRACTICA #2 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS Y PREPARACIÓN DE DILUCIONES
1.- Aprender a preparar correctamente los principales medios de cultivos que se usan en el laboratorio de
Microbiología.
2.- Conocer los diferentes tipos de medios de cultivos, su clasificación y su importancia en el diagnóstico.
3.- Preparar adecuadamente las muestras de los alimentos bajo estudio, así como las diluciones que les permitan
investigar su contenido microbiológico.
4.- Determinar el número de diluciones adecuado, con base en las características y datos de la muestra y de los
microorganismos que serán investigados.

Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se
siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización. El medio
de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La
composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían
considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio
normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o
sangre para crecer.
Dado el tamaño de las poblaciones microbianas que pueden estar presentes en un alimento, que van desde
algunos miles hasta varios millones de células por gramo, su determinación cuantitativa requiere la preparación
de diluciones conocidas de la muestra; y es costumbre utilizar cifras decimales para facilitar los cálculos.
Lo más adecuado es preparar una dilución primaria y, a partir de ella, todas las necesarias para poder contar los
microorganismos presentes; pueden ser dos diluciones decimales consecutivas, es decir, 1:10 y 1:100 o superiores,
según la carga.
El estudiante deberá investigar los diferentes medios de cultivos, su formulación, su uso y su preparación.
(Deberá entregar el respectivo documento como evidencia del trabajo).
Beaker
Cilindros
Tubos
Espátulas
Varillas de vidrio
Hornilla
Balanza
Potenciómetro
Estufas
Dependerá del medio de cultivo que se prepare
Dependerá del medio de cultivo que se prepare
Conclusiones
Las conclusiones serán de acuerdo a los medios preparados
Recomendaciones
Seguir las recomendaciones para la elaboración de los medios de cultivos.
Bibliografía
http://www.ugr.es/-cjl/medios%20de%?20cultivo.pdf
https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/preparacion-de-medios-de-cultivo
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasic-Diluciones_6526.pdf
Carrera: Bioqímica y Farmacia
PRACTICA #3 Planes de muestreo y tomas de muestras (Ambiente, superficies, manos)
1.- Conocer cómo se debe hacer un muestreo representativo para su análisis
2- Determinar el tamaño de la muestra
3- Determinar la cantidad de unidades de cada lote que se deben inspeccionar
4. Realizar el análisis de superficies para diversos grupos microbianos de importancia en alimentos.
5. Interpretar los resultados del análisis de superficies y su importancia en la verificación de la correcta aplicación
de los protocolos de higiene de las plantas procesadoras de alimentos.

El estudiante deberá investigar y exponer lo que es un plan de muestreo, diferentes planes de muestreo.
Muestreo para análisis microbiológicos, obtención de la muestra. (El estudiante deberá presentar el trabajo
investigado en físico como evidencia).
Control de superficies:
Los Controles de superficies se realizan para asegurar la higiene de los elementos y superficies en contacto con
los alimentos procesados.
Los Controles de manipuladores de alimentos se realizan para asegurar la higiene de los manipuladores en
contacto con los alimentos procesados.
La higiene de las superficies, equipos y utensilios, es uno de los pilares donde se asientan las buenas prácticas de
manufactura y si se considera que entre el 6 y 15 % de los alimentos producidos poseen algún tipo de
contaminación, cifra que podría dispararse de manera imprevisible en un mercado de producción a escala macro
como lo hacen las industrias alimenticias en la actualidad, la respuesta a estos grados de contaminación son
varias, pero una de ellas se basa en la comprobación de que existen microorganismos capaces de resistir los
tratamientos habituales de limpieza (Forte, L.M. y Rebagliati, J.E.,2000).
Los microorganismos patógenos pueden pasar de un alimento a otro por contacto directo o bien a través de
quienes los manipulan, de las superficies de contacto del aire (CAC/RCP 1, 1997).
Una correcta higiene de los alimentos está determinada por una multitud de factores: condiciones de obtención
de los mismos, características de los medios empleados para su transporte, temperaturas y condiciones de
conservación, estructura de los locales donde se manipulan, destacando entre todos ellos la higiene de las
prácticas de los manipuladores de alimentos (Pérez Silva García, M.; Belmonte Cortés, S. y Martínez Corral, J.;
1998).
Entre los agentes etiológicos productores de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) predominan los
biológicos (Gomez, D.; Cotella, O.; Fernandez Pascua, C y Ameztoy, AM., 1997); entre los cuales se destaca el
género Salmonella.
En la industria de los alimentos Escherichia coli es un organismo de particular importancia por su impacto en
salud, y se considera que, conociéndose el papel de los reservorios, la prevalencia del organismo en las plantas
procesadoras y en los alimentos, sería fundamental establecer el significado de éstos (Rodríguez; H.R.1995).
También se deberían conocer cuáles serían las operaciones o procedimientos en las etapas de producción y en
las posteriores de procesamiento que facilitan o producen contaminación microbiana, la investigación sobre
estos organismos aportaría la información científica necesaria para sustentar programas de control de estos
emergentes.
Asimismo, la intoxicación estafilocócica es una de las ETA más frecuentes, con especial preponderancia en la
región latinoamericana, y su presentación ocurre por las enterotoxinas producidas por numerosas cepas de
Staphylococcus aureus que proliferan en los alimentos, los estafilococos abundan en el medio y el origen de la
contaminación por lo regular está relacionada con heridas de la piel, la nariz, la boca o la garganta de los
manipuladores, cuando se procesan aun estando ya cocidos y calientes (INPPAZ / OPS / OMS, 1997). La
contaminación cruzada entre materias primas crudas o entre productos crudos y los ya cocidos a través de
manos.
1. Agua de peptona
2. Hisopos de algodón
3. Medios de cultivos selectivos de acuerdo al microorganismo que se investiga
1. Tubos 16 x 150 mm
2. Cajas de Petri
3. Mecheros de Bunsen
4. Tubos de 13 x 100 mm
5. Hisopos de algodón
1. Balanza de precisión
2. Horno para esterilizar material de vidrio.
3. Autoclave
4. Incubadora a 35 ±2 ºC
Investigar planes de muestreo
Parte 2:
Técnica de frotación con hisopo de algodón.
Si el muestreo es en una planta de alimentos, se considerará sectores bien definidos de la planta, que se
correspondan con las áreas de elaboración de alimentos, teniendo en cuenta las etapas de producción
preoperacionales y operacionales, que, al tratarse de superficies en contacto con productos terminados para
consumo directo, conllevan un alto riesgo sanitario.
Para la toma de la muestra se utiliza la técnica de frotación con hisopo de algodón humedecido en caldo
peptona al 0.1 %, sobre superficies de utensilios, mesones, equipos y manos de operarios.
Los hisopos se transportaran en tubos individuales con 10 ml de la solución referida, refrige dos y en un lapso no
mayor a 2 horas de obtenidas las muestras, se procederá a su procesamiento en el laboratorio.
Cada uno de los tubos conteniendo los hisopos se agitan manualmente, mediante 50 movimientos de rotación
en un diámetro de 15 cm en un tiempo de aproximadamente 10", posteriormente se procede a efectuar el
aislamiento y tipificación de especies patógenas con especial referencia la Salmonella Spp, Coliformes totales,
Escherichia coli y Staphilococcus aureus.
Conclusiones
No aplica para esta practica
Recomendaciones
No aplica para esta practica
Bibliografía
1.- www.fda. gov
2.- www.codexalimentarius.net
Carrera: Química y Farmacia
PRACTICA #4 Determinación de Aerobios Totales
1.-Confirmar la presencia de aerobios totales
2.- Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de estos microorganismos.
3.- Demostrar la contaminación post proceso, la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies
inadecuadamente sanitizadas.

1.- Seguir las Normas de Bioseguridad establecidas.
2.- Cumplir con los tiempos establecidos de siembras.
3.- Cumplir con las normas de asepsia requeridas para este tipo de trabajos.
1. Medio de cultivo PlateCount
2. Diluyente: agua peptonada al 0.1%
3. Agua Destilada
1. Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón
2. (se debe utilizar una pipeta para cada dilución) o pipetas automáticas
3. Pipetas Pasteur estériles
4. Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón (en caso de que la muestra sea líquida.)
5. Propipeta.
6. Varillas de vidrio de 3.5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. de largo, dobladas en ángulo recto
(forma de “L”), estériles (se debe utilizar una por dilución).
7. Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas, pinzas, tijeras, espátulas y separador
de huevo.
8. Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher
9. Motor para licuadora o Stomacher
10. Asa bacteriológica
11. Portaobjetos
1. Balanza gramera
3. Autoclave
4. Baño de agua a ebullición
5. Incubadora a 35 ±2 ºC
Preparar la muestra de alimento traída según su tipo, si es líquido hay que homogenizar, si es sólido hay que licuar
o triturar la mezcla por trituración en vaso esterilizado de licuadora a una velocidad aproximada de 14.000 rpm y
en un tiempo medio de 60-90 segundos.
Luego preparamos las diluciones correspondientes, generalmente hacemos 6
Luego de hacer las diluciones, y de haber agregado los inóculos, pasamos a agregar a cada placa el agar PlateCount,
este debe estar a 45 — 46 ºC (10 a 15 mL. por placa).
Luego hacemos la mezcla (agar + inóculo).
La mezcla se realiza de la siguiente. Manera: hacer rotaciones 5 veces sentido horario, 5 veces
de abajo arriba, 5 veces antihorario y 5 veces derecha e izquierda.
Luego esperamos que solidifique el medio y luego incubamos a 29 — 31 ºC por 24h (dejamos
una placa control).
Realizamos las lecturas a las 24 y 48 h.
Se puede realizar un cómputo de recuento estándar en placa o computo estimado de recuento estándar en placa.
Hay que elegir placas que tengan de 30 a 300 colonias.
Resultados obtenidos (Observaciones, cálculos, datos, ecuaciones, tablas, gráficos, figuras,
fotos y otros que así se consideren)
Los resultados obtenidos, serán de acuerdo a la calidad microbiológica de la muestra
Conclusiones
Las conclusiones serán de acuerdo a la calidad microbiológica de las muestras y de acuerdo a
lo que establecen las Normas INEM o sus similares.
Recomendaciones
1.- Aplicar las Normas de Bioseguridad
2- Respetar los tiempos de siembras
3- Seguir las indicaciones en la preparación de los medios de cultivos
Bibliografía
AOAC Official Methods of Analysis (Laboratorio de Microbiología)
Bacteriological Analytical Methods On Line (BAM)
www.fda. gov
www.codexalimentarius.net
www.foodsafety. gov.
www.consumaseguridad.com.es
Carrera: Biouímica y Farmacia
PRACTICA #5 USO DE OTRAS METODOLOGÍAS. PETRIFILM (DETERMINACIÓN DE AEROBIOS)
Reducir tiempos y movimientos en el área de Microbiología.
La Placa PetrifimO para el Recuento de Aerobios puede ser usada para enumerar aerobios totales en todos los
alimentos y cuenta con aprobaciones AOAC-OMA
Debido a que las colonias en la Placa Petrifiim6 AC son de color rojo, se las puede diferenciar de las partículas de
producto que tienen forma irregular y color opaco

Verificar el pH de las muestras antes de inocular las Placas PetrifilmO. Para productos ácidos, ajuste el pH de la
muestra diluida a un 6.5 - 7.2 con NaOH 1N para asegurar que vire a rojo.
Tiempo y temperatura de incubación:
Incube las Placas Petrifim8 cara arriba en grupos de no más de 20 piezas. El tiempo de incubación y la
temperatura varían según el método. Los métodos aprobados más conocidos son:
* AOAC método oficial 986.33 8 989.10 (leche y productos lácteos) Incubar 48h+3h a 32 ºC ±1 ºC
* AOAC método oficial 986.33 & 990.12 Incubar 48 h ±3h a 35 ºC ± 1º C.

* AFNOR método validado 3M 01/1-09/89 Incubar 72 h±3h a30 ºC +1º C.
1.- Agua de peptona
2.- Placas Petrifilm
1.- Pipetas automáticas
2.-Tubos
3.- Fiolas
Balanza gramera
Stomacher
Estufa
Contador de colonias
La Placa Petrifilm para recuento Aerobio permite el crecimiento de bacterias aerobias totales (cuenta total en
placa o aerobios mesófilos). La Placa Petrifilm para Recuento de Aerobios Totales (AC) es un sistema de medio
de cultivo listo para ser empleado, que contiene nutrientes del Agar Cuenta Estándar, un agente gelificante
soluble en frío y tetrazoilo que facilita la enumeración de las colonias.
Resultados obtenidos (Observaciones, cálculos, datos, ecuaciones, tablas, gráficos, figuras, fotos y otros que así
se consideren)
Los resultados serán de acuerdo a la calidad Microbiológica del alimento
Conclusiones
Las conclusiones serán de acuerdo a la calidad microbiológica del alimento
Recomendaciones
Aplicar las Normas de Bioseguridad
Bibliografía
Bacteriological Analytical Methods On Line (BAM)
http://solutions.3m.com.co/3MContentRetrievalAPI/BlobServiet?Imd=13325358720008locale=es CO&gas
PRACTICA # 6 Determinación de Hongos y Levaduras
1- Obtener mediante el método de cuenta en placa, el número de mohos y levaduras presentes en productos
alimenticios destinados al consumo humano.
2- Explicar el fundamento del método de detección y cuantificación de mohos y levaduras en alimentos.

Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como
flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y
levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo, también pueden ser causantes de la
descomposición de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y
levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos probable. Estas condiciones
pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de
almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo tanto, pueden
ser un problema potencial en alimentos lácteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas,
granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, manjares, especias,
etc.
Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como carbohidratos incluyendo pectinas y otros
polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar problemas a través de: (a) síntesis de
metabolitos tóxicos (micotoxinas) y (b) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento
de bacterias patógenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la decoloración de las superficies de
alimentos.
El término moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos multicelulares cuyo crecimiento en
la superficie de los alimentos se suele reconocer fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces
pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido considera no apto para el consumo. La identificación y
clasificación de los mohos se basan en observaciones macroscópicas y microscópicas.
Propiedades fisiológicas. En comparación con la mayoría de las levaduras y de las bacterias, la mayoría de los
mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible. Un porcentaje total de humedad por debajo del 14 al
15 por ciento en la harina o en algunos frutos secos impedirá o retardará mucho el crecimiento de los mohos. Los
mohos podrían considerarse mesófilos, es decir, que son capaces de crecer bien a temperaturas normales. La
temperatura óptima de la mayoría se encuentra alrededor de los 25 a 30º C, aunque algunos son psicrótrofos y
algunos son termófilos. Son aerobios, esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie de los
alimentos. Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH (pH comprendido
entre 2 y 8.5), aunque la mayoría crece mejor a pH ácido.Son capaces de utilizar muchos tipos de alimentos, que
van desde sencillos a complejos.
Poseen enzimas hidrolíticas, y de aquí que algunos se utilicen para la producción industrial de las amilasas,
pectinasas, proteasas y lipasas.
Levaduras y hongos levaduriformes.
El término levadura se refiere a aquellos hongos que generalmente no son filamentosos, sino unicelulares y de
forma ovoide o esferoide, y que se reproducen por gemación o por fisión.
Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benéficas o perjudiciales. Las levaduras se utilizan
en la elaboración de alimentos como el pan, la cerveza, vinos, vinagre y quesos, también se utilizan en la obtención
de enzimas y alimentos fermentados. Las levaduras son perjudiciales cuando producen la alteración de los zumos
de frutas, de los jarabes, de la melaza, de la miel, de las cames, del vino, de la cerveza y de otros alimentos.
Los caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su observación microscópica. Su forma
puede ser desde esférica a ovoide, alimonada, piriforme, cilíndrica, triangular e incluso alargada. La mayoría se
reproducen asexualmente por gemación multicetular o por gemación polar. Unas pocas especies se reproducen
por fisión.
En los cultivos en placas de agar es difícil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas; la
observación microscópica de los microorganismos es la única forma segura de diferenciarlas. La mayoría de las
colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas, la mayoría de las colonias son blancuzcas, aunque
algunas tienen un color crema o rosado.
Son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos.
La mayoría de las levaduras crecen mejor con un alto contenido de humedad. No obstante, crecen mejor que la
mayoría de las bacterias en sustratos que contienen elevadas concentraciones de solutos (por ejemplo,
carbohidratos o cloruro de sodio), es decir son osmotolerantes. Sin embargo, la mayoría de las levaduras necesitan
mayor humedad que los mohos. Para la mayoría de las levaduras la A, mínima de crecimiento oscila entre 0.88 y
0.94. El intervalo de temperaturas de crecimiento es parecido al de los mohos, con una temperatura
óptima en tomo a los 25 a 30ºC y una temperatura máxima en tomo a los 35 a 47ºC. Crecen mejor en aerobiosis,
aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. Los
azúcares son la fuente energética más apropiada para las levaduras, aunque las oxidativas, pueden oxidar los
ácidos orgánicos y el alcohol.
FUNDAMENTO
El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de: cultivo selectivo específico,
aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar: tomo nutrientes a los polisacáridos que contiene
el medio. La hidrólisis de estos compuestos se efectúa por enzimas que poseen estos microorganismos. La
sobrevivencia de los hongos y levaduras a pH ácidos se pone de manifiesto al inocularlos en el medio de cultivo
acidificado a un pH de 3.5. Así mismo, la acidificación permite la eliminación de la mayoría de las bacterias.
Finalmente, las condiciones de aerobiosis y la incubación a una temperatura de 25 + 1 ºC da como resultado el
crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos.
1. Agua de peptona al 0.1% o, solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2.
2. Agar papa dextrosa
3. Agar extracto de malta
4. Solución estéril de ácido tartárico al 10.0 %
1. Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón.
2. Auxiliar de pipeta.
3. Matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad o frascos de vidrio de 500 mL de capacidad.
4. tubos 16 x 150 mm
5. cajas de Petri
6. Utensilios estériles para la manipulación de muestras: cuchillos, cucharas, tenedores, etc
3. Autoclave
4. Incubadora a 25 +2ºC
1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estéril y pasarla a un matraz Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de
una solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 o agua de peptona al 0.1%.
2. Homogeneizar la muestra con la solución anterior en un vaso de licuadora estéril o pasarla a una bolsa de
Stomacher y homogeneizar durante 10.0 seg en el caso de la licuadora a velocidad mínima, o 30.0 seg en el
Stomacher a una velocidad normal.
3. De la suspensión o solución anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de ensayo que contenga 9.0 mL de
solución amortiguadora de fosfatos de pH 7. 26 agua de al 0.1%, agitar y repetir esta operación tantas veces
como diluciones sean necesarias.
Se debe utilizar una pipeta estéril para cada dilución.
4. Colocar por duplicado en cajas Petri estériles, 1.0 mL de cada una de las diluciones de la muestra, utilizando
una pipeta estéril.
5. Fundir el agar papa dextrosa y/o de agar extracto de malta estériles. Enfriarlos y mantenerlos a 45ºC.
6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL. de agar, 1.4 mL de ácido
tartárico al 10% esterilizado por filtración en membrana, o bien esterilizar la solución a 121%C 1*C durante 15
minutos. Esto significa que a cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a 45*C se le
deberá adicionar 0.3 mL del ácido.
7. En cada caja de Petri con inóculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa acidificado y/o agar extracto
de malta acidificado, fundidos y mantenidos a 45 ºC. El tiempo transcurrido entre la preparación de las
diluciones y el momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min.
8. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las
manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrás hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo
cuidado de no humedecer con el medio la tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri
solidifique, dejándolas reposar sobre una superficie horizontal fría.
9. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verterá en una caja de Petri sin inóculo, de
15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada y/o agar extracto de malta acidificado. Después de la
incubación estas cajas no deberán presentar desarrollo de colonias.
10. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 ºC.
11.Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días, seleccionar
aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de
mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar la cuantificación de 4 días de incubación o incluso
las de 3 días. En este caso, se informa el período de incubación en los resultados de los análisis.
12. Contar las colonias de cada placa representativa, después de 3, 4 y 5 días de incubación (a 25 ±1ºC o a
temperatura ambiente).
13. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por
el inverso de la dilución.
14. informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos y levaduras (cada
uno en forma independiente), incubadas a 25 1 C durante 5 días.
15. Describir las características macroscópicas observadas, de los mohos y/o levaduras desarrolladas a partir de
la muestra analizada.
16. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es difícit contar las colonias,
considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 días de incubación y aún a los 3 días. En este caso se
debe informar el periodo de incubación de 3 ó 4 días, en los resultados del análisis.
ANÁLISIS CUANTITATIVO
Para hacer un reporte cuantitativo de este análisis, se deben seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150
colonias (representatividad estadística). Posteriormente contar las colonias presentes y calcular el número de
hongos y levaduras por separado. De esta manera se puede calcular las unidades formadoras de colonias por
gramo o del estado físico de la muestra analizada. Esto se logra multiplicando el número de UFC encontradas en
una caja representativa, por el inverso de la dilución correspondiente a esa caja.
En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos y/o levaduras, se debe reportar el
número obtenido de UFC indicando la dilución correspondiente.
En el caso de no encontrar colonias características de hongos y/o levaduras, el resultado a reportar es: menos de
10 UFC/g o bien menos de 10 UFC/mL (Sensibilidad del Método)
Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar el tiempo de incubación en el que se realizó la
cuantificación.
Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar por separado el resultado de la cuantificación de hongos
y de levaduras.
ANÁLISIS CUALITATIVO
Reportar las observaciones macroscópicas y microscópicas de los diferentes tipos de colonias de mohos y
levaduras obtenidas durante el análisis. Si es posible reportar el o los géneros probables.
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
1.- Técnicas para el análisis Microbiológico de Alimentos. Segunda Edición. Universidad Nacional Autónoma de
México. Facultad de Química, Departamento de Biología
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
REPORTE DE RESULTADOS
MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………
ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….
FECHA………………………………… SUBGRUPO………………………….
RESULTADO…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES……………………………………………………………………………………
CONCLUSIONES...…………………………………………………………………………………...
TECNICOS RESPONSABLES
MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………
ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….
FECHA………………………………… SUBGRUPO………………………….
RESULTADO…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES……………………………………………………………………………………
CONCLUSIONES...…………………………………………………………………………………...
PRACTICA #7 Determinación de Coliformes Totales, FECALES Y E. COLI. Número más probable (NMP)

1.-Determinar la Calidad Microbiológica del alimento
2.- Determinar la presencia de Indicadores de contaminación fecal
3.- Determinar la eficiencia de un proceso de producción

Los controles microbiológicos rutinarios para determinar la inocuidad de un alimento se basan en la búsqueda de
microorganismos indicadores cuya presencia nos aporte información sobre la posibilidad de encontrar
microorganismos patógenos.
Los microorganismos indicadores son microorganismos que generalmente se encuentran en la materia fecal del
hombre y los animales, su presencia en los alimentos es una evidencia de que están contaminados con materia
fecal de humanos u otros animales de sangre caliente y por consiguiente con el microorganismo patógeno.
Entre los microorganismos indicadores de la calidad de los alimentos se encuentran los coliformes totales. Del
grupo coliformes forman parte los coliformes fecales como Escherichia Coli, Enterobacter, Klebsiella Citrobacter,
entre otros.
El microorganismo utilizado como indicador es Escherichia coli y su detección se puede hacer mediante pruebas
sencillas como: determinación del número más probable (NMP) de coliformes totales y fecales o mediante
filtración en membrana (muestras líquidas) usando medios selectivos y diferenciales.
1. Caldo Bilis verde brillante.
2. Caldo EC
3. Agar EM
4. Agua de peptona
5. Caldo RM — VP
6. Agar SI
7. Agar Urea
8. Agar Citrato de Simmons
• Tubos de vidrio
• Campanas durhann
• Cajas petri
• Puntas
1. Baño de agua a 44.5º + 0,1ºC.
2. Incubadora a 35º + 2,0ºC
3. Horno para esterilizar material de vidrio
4. Potenciómetro
PRUEBA PRESUNTIVA
Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de Asepsia
1. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces para lograr una distribución uniforme de los
microorganismos.
2. Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado preparar diluciones
3. Para preparar las diluciones, con una pipeta estéril tomar una alícuota de 1 mL de la muestra original y llevarlo
a uno de los tubos conteniendo 9 mL de agua de peptona estéril, obteniendo de esta manera una dilución de 10-
1
4. Agitar el tubo de la dilución 10-1 y con otra pipeta estéril tomar una alícuota de 1 mL y llevarlo a otro tubo con
9 mL de agua de dilución estéril para obtener una dilución de 10 -2
5. Proceder de la misma manera hasta obtener una dilución de 10 -3
O hasta donde sea necesario.
6. inocular asépticamente con 1 mL de muestra por triplicado tubos de fermentación conteniendo caldo lactosado
o caldo lauryl-triptosa, a partir de las últimas 3 diluciones y conservar todas las anteriores en refrigeración por si
se requieren su utilización posterior.
7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 ºC durante 24 horas.
8. Después de 24 horas de incubación efectuar una primera lectura para observar si hay tubos positivos, es decir,
con producción de ácido, si el medio contiene un indicador de pH, turbidez y producción de gas en el interior de
la campana Durham.
9. Al hacer esta verificación es importante asegurarse que la producción de gas sea resultado de la fermentación
de la lactosa, en cuyo caso se observará turbidez en el medio de cultivo, y no confundir con burbujas de aire.
10. Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las campanas Durham antes de proceder a la
inoculación y desechar aquellos tubos cuyas campanas contengan burbujas de aire o de alguna manera eliminar
éstas y así poder utilizarlos
11. De los tubos que en la primera lectura den positivos, ya se puedas hacer las pruebas confirmatorias para
coliformes totales y coliformes fecales.
12. En caso de no apreciarse crecimiento en el resto de los tubos, continuarán en incubación 24 horas más.
13. Después de 48 horas (± 2h) a partir de la inoculación, se hace la lectura final.
14. Si pasadas 48 h tampoco se aprecia crecimiento ni producción de gas, los tubos se toman
como negativos.
INTERPRETACIÓN:
- Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA DE
COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada.
- Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarán convenientemente y se
procederá a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA para Coliformes Totales y Fecales.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitándolos para
homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB).
2. Incubar durante 48±3 h a 35 ± 0.5ºC.
3. Después de la incubación observar la presencia de turbidez y de gas.
INTERPRETACIÓN:
1. Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de
tubos positivos para
2. Posteriormente hacer el cálculo del NMP.
3. Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: Se consideran
NEGATIVOS, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo del NMP
4. Si todos los tubos dan negativos o todos dan positivos, con base en los grados de dilución analizados, considerar
la necesidad de repetir el análisis a partir de grados de dilución menores (mayores volúmenes de muestra) o
mayores (menores volúmenes de muestra), respectivamente
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES:
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitándolos para
homogeneizar, inocular con tres asadas tubos contenido caldo E. C. (Escherichia coli).
2. Incubar durante 24 horas a 44.5±0.2 ºC. y después de este período.
3. Observar presencia de turbidez y gas.
INTERPRETACIÓN:
1. Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, Si se observa producción de gas:
La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de tubos positivos y establecer el código para
posteriormente hacer el cálculo del NMP,
2. Si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez:
3. Se consideran negativos, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo del NMP.
4. Si todos los tubos dan negativos o todos dan positivos, con base en los grados de dilución analizados, considerar
la necesidad de repetir el análisis a partir de grados de dilución menores (mayores volúmenes demuestra) o
mayores (menores volúmenes de muestra), respectivamente.
Resultados obtenidos (Observaciones, cálculos, datos, ecuaciones, tablas, gráficos, figuras,
fotos y otros que así se consideren)
De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para ColiformesTotales y Fecales, establecer los
códigos correspondientes para calcular por referencia en las tablas estadísticas el NMP de ColiformesTotales y
Fecales en 10 g o mL de muestra.
En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos adecuada, emplear para los cálculos la siguiente
ecuación:
Se puede hacer uso de la tabla de NMP, para obtención de los resultados.

Conclusiones
Las conclusiones van a depender de la calidad microbiológica de la muestra analizada y deacuerdo a la Norma
INEN o su similar
Recomendaciones
Las recomendaciones van a depender de la calidad microbiológica de la muestra
Bibliografía
Norma INEN
www.fda.gov o
www.foodsafey.gov VA ZN
www.consumaseguridad.com.es
MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………
ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….
FECHA………………………………… SUBGRUPO………………………….
RESULTADO…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES……………………………………………………………………………………
CONCLUSIONES...…………………………………………………………………………………...
PRACTICA #8 Determinación de Staphylococcus aureus en alimentos
1- Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este microorganismo
enterotoxigénico.
2- Demostrar la contaminación postproceso, la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies
inadecuadamente sanitizada.
3- Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones.

Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, Gram positivos y se presentan solos, en pares o racimos, no
son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable; así,
por ejemplo, Staphilococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el
humano. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa positiva y puede metabolizar una gran variedad
de carbohidratos en condiciones aeróbicas, con la subsecuente liberación de ácido, principalmente ácido acético
con pequeñas cantidades de dióxido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la
fermentación es el ácido láctico.
Las tres condiciones necesarias para su óptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad, temperatura
alrededor de 30ºC y ausencia de microorganismos competitivos. Este último punto es importante, ya que
Staphilococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos. Staphylococcus se puede
encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua,
agua residual; b) en alimentos: por ejemplo, los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la
leche y derivados Lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de
sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la
mayonesa, ésta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al
diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el
desarrollo de este microorganismo enterotoxigenico y finalmente
c) también se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas son los
principales reservorios de estos microorganismos
Medios de cultivo y diluyentes
1. Agar Baird Parker
2. Emulsión de yema de huevo con telurito de potasio
3. Caldo infusión cerebro corazón (BHI)
4. Agua peptonada al 0.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2
Biológicos
Plasma de conejo o plasma humano con EDTA (0+) obtenido del banco de sangre.
1. Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón (se debe utilizar una pipeta para cada dilución) o
pipetas automáticas.
2. Pipetas graduadas estériles de 10 mL. con tapón de algodón (en caso que la muestra sea líquida.)
4. Matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad o frascos de vidrio de 500 mL de capacidad.
5. tubos 16 x 150 mm
6. cajas de Petri
7. Varillas de vidrio de 3.5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. de largo, dobladas en ángulo recto
(forma de “L”), estériles (se debe utilizar una por dilución).
8. Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas, pinzas, tijeras, espátulas y separador de
huevo.
11. Asa bacteriológica
12.Mecheros de Bunsen
13. Tubos de 13 x 100 mm
Balanza de precisión
Horno para esterilizar material de vidrio.
Autociave
Incubadora a 35 ±2ºC
MÉTODO DE RECUENTO DE PLACA DIRECTA
PROCEDIMIENTO
Aislamiento y enumeración
1- Pesar 10.0 g de muestra en una caja de Petri estéril.
2. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estéril.
3. Adicionar 90.0 mL de agua peptonada estéril al 01% o solución amortiguadora de fosfatos 0.1M de pH 7.2estéril.
4. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora a velocidad mínima.
5. Realizar diluciones decimales hasta 10-3 (el número de diluciones está en función de la rocedencia de la muestra)
en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo diluyente.
6. Por cada dilución que se va a sembrar, se transfiere asépticamente 1 ml de suspensión de muestra a 3 placas
de agar Baird-Parker, distribuyendo 1 ml de inóculo equitativamente a 3 placas (por ejemplo, 0,4 ml, 0,3 ml y 0,3
ml
Nota Una alternativa para utilizar una menor cantidad de cajas de agar Baird-Parker consiste en transferir 0.1 mL
de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 a cajas de Petri con agar Baird Parker.
7. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril, en forma de “L”,
iniciando a partir de la mayor dilución (Método de inoculación por extensión en superficie).
8. Mantener las placas en su posición hasta que el inoculo sea absorbido por el agar, entre 5 y 10 minutos
aproximadamente.
9. Invertir las placas e incubar a 35 + 1º C. durante 45 a 48 h.
10. Después de incubar, observar las colonias características de este microorganismo en el agar Baird Parker (BP).
Éstas se presentan como: colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas con diámetro de 1 a 2 mm,
muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia.
11. Seleccionar las placas que contengan entre 20 y 200 colonias típicas de S. aureus, a menos que sólo las placas
con diluciones más bajas (> 200 colonias) tengan colonias con apariencia típica de S.aureus. Las colonias de S.
aureus son circulares, lisos, convexos, húmedos, de 2-3 mm de diámetro en las placas sin aglomeración, de color
gris a negro intenso, frecuentemente con márgenes claros (blancuzcos), rodeados de zonas opacas y
frecuentemente con una zona exterior clara.
12. Si se observan varios tipos de colonias que parecen ser S. aureus en las placas seleccionadas haga el recuento
del número de colonias de cada tipo y registre por separado. Cuando las placas de la dilución más baja contienen
menos de 200 colonias estas pueden ser usadas. Si las placas que contienen más de 200 colonias tienen apariencia
típica de S. aureus y las colonias típicas no aparecen en las diluciones mas altas, se debe utilizar estas placas para
la enumeración de S. aureus, pero n o se deben contar las colonias no típicas.
13. Seleccione más de 1 colonia de cada tipo contado y realice la prueba de producción de
coagulasa.
14. El número de colonias en las placas representadas por colonias que dan prueba de coagulasa positiva se
multiplican por el factor de dilución de la muestra.
15. Informe este número como número de S. aureus / g de alimento probado.
Pruebas bioquímicas.
Prueba de la presencia de la enzima coaguiasa.
1. Transferencia las colonias sospechosas de S. aureus en pequeños tubos que contienen 0,2-0,3 ml de caldo
infusión cerebro corazón (BHI). Incubar a 35ºC por 24 h.
2. Con una pipeta estéril de 1 mL, tomar 0.2 mL de la suspensión del microorganismo que desarrolló en el caldo
infusión cerebro corazón, adicionar 0.2 mL de plasma de conejo.
Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen con solución salina estéril.
3. Incubar en baño termostático o en incubadora, entre 35 y 37º C y observar durante 6 h. en intervalos de 1 hora;
en caso de no presentarse formación de coágulo, prolongar el período de observación hasta por 24 h.
4. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo, tomar 0.5 mL de plasma reconstituido y depositario en
un tubo de 13 X 100 mm, posteriormente añadir una gota de cloruro de calcio al 5%; se debe formar un coágulo
entre 10 a 15 segundos.
Prueba de la enzima termonucleasa.

1. Calentar 0.3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo infusión cerebro corazón durante 15
minutos en baño de agua hirviendo.
2. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensión bacteriana, del punto anterior, con
ayuda de una pipeta Pasteur estéril. Incubar a 35ºC + 2 ºC en cámara húmeda, durante 4 a 24 h.
3. Después de incubar, adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M a los orificios hechos en el agar DNA.
(Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de ortotoluidina).
4. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro alrededor del orificio, en donde
se inoculó, indicará que el microorganismo posee la enzima termonucleasa.
5. En el caso de no contar con orto toluidina, se puede utilizar HCI 1.0N como indicador. De encontrarse esta
enzima, se observa un halo transparente alrededor de la colonia, seguido de un precipitado blanco.
1. El número de colonias en las placas representadas por colonias que dan prueba decoagulasa positiva se
multiplican por el factor de dilución de la muestra.
2. Informe este número como número de S. aureus / g de alimento probado
Conclusiones
1.-
2.-
3.-
Recomendaciones
1.-
2.-
3.-
Bibliografía
1- https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucmO071429.htm
2- Técnicas para el análisis Microbiológico de Alimentos. Segunda Edición. Universidad Nacional Autónoma de
México. Facultad de Química, Departamento de Biología
MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………
ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….
FECHA………………………………… SUBGRUPO………………………….
RESULTADO…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES……………………………………………………………………………………
CONCLUSIONES...…………………………………………………………………………………...
MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………
ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….
FECHA………………………………… SUBGRUPO………………………….
RESULTADO…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES……………………………………………………………………………………
CONCLUSIONES...…………………………………………………………………………………...
PRACTICA #9 Determinación de Salmonella spp
1.- Describir la metodología llevada a cabo por el Laboratorio de Microbiología para realizar la detección,
aislamiento e identificación de Salmonella spp. en muestras de alimentos.

Salmonella spp. es un bacilo Gram-negativo anaerobio facultativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae.
Aunque los miembros de este género son capaces de moverse por medio de flagelos perítricos, existen variantes
no móviles, S. entérica serovarPullorum y S. entérica serovarGallinarum, así como cepas no móviles debido a la
presencia de flagelos disfuncionales. Las especies de Salmonella son quimioorganótrofas, con habilidad para
metabolizar nutrientes por las vías fermentativa y respiratoria. Las bacterias crecenóptimamente a 37ºC y
pueden catabolizar la D-glucosa y otros carbohidratos con producción de ácido y gas. Estos microorganismos son
oxidasa negativos y catalasa negativos, crecen en citrato como única fuente de carbono, generalmente producen
ácido sulfhídrico, descarboxilan la lisina y ornitina, y no hidrolizan la urea. La mayoría de estas características se
utilizan para la identificación bioquímica de cepas aisladas de Salmonella.
De acuerdo con la definición contemporánea, una cepa de Salmonella típica produce ácido y gas a partir de la
glucosa en el agar hierro tres azúcares, pero no es capaz de utilizar lactosa y sacarosa en éste medio, o en
medios sólidos selectivos tales como verde brillante, xilosa lisina desoxicolato y/o entérico de Hektóen. Las
especies típicas de Salmonella producen en agar hierro lisina, una rápida reacción alcalina por la
descarboxilación de la lisina y generan cadaverina. La variabilidad genética observada en este microorganismo
ha originado mutaciones, e intercambio intra e intergenérico de plásmidos lo cual ha reducido los biotipos
típicos de Salmonella. En muestras clínicas y de alimentos se han encontrado biotipos lac+ y/o sac+; biotipos que
no descarboxilan la lisina, que incluso hidrolizan la urea, que producen indol y que crecen rápidamente en KCN.
Esta situación ha llevado a reevaluar el esquema de identificación del género, e incluso a utilizar tecnologías
moleculares para establecer loci genéticos y/o productos únicos para el género Salmonella.
FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un esquema general
que consiste de 5 pasos básicos:
Preenriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que
permite restaurar las células de Salmonella dañadas, logrando de esta manera una condición fisiológica estable.
Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos condiciones, por un lado
debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la
muestra.
Siembra en medios sólidos, este punto se deriva directamente del anterior y se pues medios selectivos, que
restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual
característico de colonias sospechosas.
Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella y la
eliminación de cultivos sospechosos falsos.
Serotipificación, es una técnica inmunológica (antígeno-anticuerpo) que permite la identificación específica de
un microorganismo.
Los medios de cultivo que a continuación se presentan son los utilizados en el procedimiento general.
1. Caldo lactosado o Agua de peptona bufferada
2. Caldotetrationato
3. Caldo RappaportVassiliadis
4. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD
5. Agar entérico de Hektóen (HE)
6. Agar sulfito de bismuto (SB)
7. Agar hierro-triple azúcar (TSI) o agar hierro Kiigler (KIA) solidificado e inclinado
8. Agar hierro-lisina (LIA) inclinado.
9. Agar urea
10. Agar SIM (sulfuro-indol-motilidad)
11. Agar citrato de Simmons inclinado
12. Caldo rojo de metilo-VogesProskauer (RM-VP)
13. Solución de verde brillante al 0.1%
14. Soluciónyodoyodura de potasio
15. Reactivo de Kovac's
16. Solución de rojo de metilo.
17. Solución reactiva de Voges-Proskauer Nº 1 (VP1; solución etanólica de atfa-naftot al 5% PNV)
18. Solución reactiva de Voges-Proskauer Nº 2 (VP2; hidróxido de potasio al 40% PV).
1. matraz Erlenmeyer de 500 mL de capacidad o frasco de vidrio de 500 mL de capacidad
2. Funda de stomacher (funda estéril) o un vaso de licuadora estéril
3. Utensilios necesarios para la manipulación de muestras: cucharas, cuchillos, tenedores, estériles
4. tubos de ensayo de 16 x 150 mm.
5. cajas de Petri estéril.
6. tubos de ensayo de 13 x 100 mm.
7. Pipetas de vidrio de 1 mL estériles con filtro de algodón
10. Pipetas Pasteur estériles con filtro de algodón
11. Asa de inoculaciónredonda
12. Asa de inoculación en punta
2. Stomacher o motor para licuadora
3. Incubadora a 35%C Incubadora a 42º
PROCEDIMIENTO
El siguiente método se basa en el análisis de 25.0 g de la muestra, que se considera como una unidad analítica, en
una proporción de 1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variar siempre que se mantenga la misma
proporción de 1:9 en el medio de preenriquecimiento. La mínima muestra recomendada es de 25.0 g, es decir,
una unidad analítica. Para algunos casos donde el riesgo es mayor, se utilizan dos unidades analíticas (50.0 9) o
más.
1. Preenriquecimiento.
a) Procedimiento general para la preparación de muestras
b) Pesar en una bolsa de Stomacher estéril, en área aséptica 25.0 g de muestra a analizar.
c) Verter 225.0 mL de caldo lactosado estéril en la bolsa.
d) Homogeneizar la muestra con el diluyente durante 30.0 seg
e) Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de
rosca y dejar reposar por 60.0 min. a temperatura ambiente con la tapa perfectamente cerrada.
f) Mezclar bien y determinar el pH de la muestra con papel pH.
g) Ajustar si es necesario, a un pH de 6.8±0.2 con NaOH 1N o HCI 1N estériles.
h) Mezclar y cerrar suavemente la tapa del matraz
i) Incubar la muestra homogénea a 35 + 2 ºC durante 24 h.
2. Enriquecimiento selectivo.
a. Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar
suavemente.
b. Transferir 1.0 mL del cultivo de preenriquecimiento (con una pipeta de vidrio de 1 mL, estéril) a un tubo con
10.0 mL de cada uno de los siguientes medios de enriquecimiento:
Caldo tetrationato (antes de su uso, deberá activarse añadiendo al medio base 0.2 mL de solución yodo-yoduro
de potasio y 0.1 ml. de solución de verde brillante al 0.1 %) y CaldoRappaport- Vassiliadis.
c. Incubar los tubos inoculados en caldo tetrationato y caldo Rappaport- Vassiliadis a 35
±1 ºC durante 24 h. Para alimentos altamente contaminados deberán incubarse tos medios de
enriquecimiento a 42ºC por el mismo periodo.
3. Siembra en medios selectivos

La metodología descrita deberá realizarse para cada uno de los caldos de enriquecimiento descritos
anteriormente, es decir para los cultivos desarrollados en caldo, caldo tetrationato y/o caldo Rappaport-
Vassiliadis.
a. Homogeneizar el tubo con caldo de enriquecimiento ya incubado.
b. Tomar una muestra del cultivo anterior con asa microbiológica estéril y sembrar por agotamiento en cajas
de Petri, en cada uno de los siguientes medios selectivos:
- Agar SulfitoBismuto (SB)
- Agar Xilosa Lisina Desoxicolato(XLD) y,
- Agar Hektoenenteric
c. Incubar las cajas ya sembradas en posición invertida a 35 +2 “C durante 24 2 h.
d. Observar las características macroscópicas de las colonias en los medios sólidos selectivos.
e. Seleccionar al menos 2 colonias sospechosas de cada medio selectivo, de acuerdo con las características
específicas de desarrollo en cada uno de los medios.
f. Almacenar en refrigeración de 5 a 8%C, las placas con medios selectivos por si es necesario tomar más
colonias.
g. Realizar una purificación de las colonias seleccionadas, sembrando nuevamente por agotamiento en cajas
de Petri conteniendo un medio idéntico del que se tomó la colonia.
4. Pruebas bioquímicas preliminares
NOTA
Se recomienda identificar seis cultivos por cada unidad analítica (25.0 g). Seleccionar colonias procedentes de
ambos medios de enriquecimiento.
4.1. Agar triple azúcar hierro
1. Registrar las características del medio TSI antes de la inoculación (color del medio).
2. Por duplicado tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa bacteriológica recta y estéril
e inocular por picadura y estría en un tubo con agar triple azúcar hierro (TSI) inclinado.
3. Incubar el medio TSI a 35 ±2 ºC durante 24 h.
4. Consultar la tabla para la interpretación de los resultados.
4.2. Agar lisina hierro.

1. Hacer la misma operación que se hizo para TSI, tomando la asada de la misma colonia con la que se sembró
en estos medios, pero sembrando ahora en el agar lisina hierro (LIA).
3. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los medios TSI y LIA
para realizar las pruebas bioquímicas complementarias.
4. Los cultivos desarrollados en TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan en ambos medios.
5. Pruebas bioquímicas preliminares

5.1. Caldo urea (convencional)
1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar del crecimiento del tubo TSI e inocular en el tubo con caldo urea.
2. incubar a 35 ±2 ºC durante 24 ±2 h.
4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos que den la prueba negativa.
5.2. Agar citrato de Simmons

1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo de TSI e inocular por estría en el tubo con
agar citrato de Simmons.
2. incubara 35 ±2 ºC durante 24 ±2 h.
3. Interpretar los resultados (Consultar tabla).
5.4. Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad)

1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI e inocular por punción
vertical en el tubo con medio de SIM.
2. Incubara 35±2 ºC durante 24±2
3. Para verificar la producción de indol, adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento de 0.2 a
0.3 mL de reactivo de Kovac's.
4, Interpretar resultados (Consultar tabla).
5.5. Caldo RM-VP (Rojo de metilo-Voges-Proskauer)

1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI e inocular el tubo con
caldo RM-VP.
5.5.1, Prueba de Voges-Proskauer (VP)

1. Parala prueba de Voges-Proskauer incubar a 35 ±2 ºC durante 48 ± 2 h.
2. Transferir a un tubo de 13 x 100 mm estéril un mililitro de cultivo.
3. Adicionar a este cultivo, 0.6 mL de reactivo de VP1 (alfa-naftol etanólico al 5 %), agitar y agregar 0.2 mL del
reactivo VP2 (hidróxido de potasio al 40%).
4. Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).

5. Agitar nuevamente y dejar reposar el tubo en forma inclinada, con el objeto de que la reacción se lleve a
cabo en presencia de oxígeno.
6. Interpretar los resultados después de 2 h. de incubación a temperatura ambiente (consultar tabla)
5.5.2. Prueba de Rojo de Metilo

1. Para la prueba de rojo de metilo (RM) incubar a 35 ±2ºC el resto del medio RMVP durante 48 h más (96 h.
de incubación en total a partir de la inoculación del -RMVP).
2. Adicionar al medio de cultivo dos a tres gotas de solución indicadora de metilo.
3. Agitar e interpretar los resultados en forma inmediata (Consultar tabla)
Las pruebas bioquímicas se pueden interpretar en la siguiente tabla, sin embargo, se sugiere que se consulten
otras referencias, además de las ya expresadas aquí, con el fin de determinar la especie del género en cuestión,
esto quiere decir que no necesariamente se encuentre en el alimento analizado la Salmonella, pero sí puede
encontrarse otra Enterobacteria, el que es indispensable identificar.
En este cuadro solamente se encuentran las pruebas bioquímicas más generales de Salmonella.
+ 90% o más positivos en 1 o 2 días; - 90% o más negativos en 1 o 2 días; v, variable.
La mayoría de los cultivos de S. arizonae son negativos. La mayoría de los cultivos de S. arizonae son positivos.
Excepto S. entéricaserovar Pullorum y S. entéricaserovar Gallinarum y cepas con flagelos disfuncionales.
6. Identificación serológica.
6.1. Investigación de los antígenos somáticos de Salmonella (suero anti Salmonella “O” polivalente).
1. Colocar con una asa bacteriológica, dos gotas separadas de solución salina estéril (NaCl 0.85%) sobre un
portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación.
2. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI.
3. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Salmonella “O” polivalente y mezclar con el canto del asa o
empleando aplicadores de madera.
4. Agitar inclinando la lámina, hacer girar las gotas durante aproximadamente un minuto.
5. Observar bajo una buena iluminación y sobre un fondo oscuro la reacción.
6. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.
7. Consultar el Cuadro 3 para la interpretación de los resultados.
NOTAS
* La suspensión del cultivo en la que no se adicionó el suero anti Salmonetla “O” polivalente se considerará
como el control negativo para poder interpretar el resultado.
* Cuando la aglutinación es positiva con el suero anti Salmonella “O” polivalente, puede determinarse el
subgrupo empleando sueros inmunes para los diferentes subgrupos (los más frecuentes son B, C, D y E).
* Si la aglutinación con el suero anti Salmonella “O” polivalente es negativa, utilizar el suero anti Salmonella
“Vi” polivalente y efectuar la prueba en las mismas condiciones ya descritas. Si hay aglutinación con “Vi”
calentar a ebullición y repetir nuevamente la prueba con el suero anti Salmonella O” polivalente.
6.2. Investigación de los antígenos flagelares de Salmonella (suero anti Salmonella “H” polivalente).
1. Para ensayo el antígeno flagelar en el mismo día, inocular el crecimiento del cuitivo de TSI en agar infusión
cerebro corazón (BHI).
2. Incubara 35º C durante 4 a 6h.
3. Adicionar al cultivo 2.5 mL de solución salina formalizada.
4. Colocar 0.5 mL del suero antiflagelar “H” polivalente en un tubo de ensayo para serología (12 x 75 mm).
5. Adicionar 0.5 mL del cultivo formalizado (el obtenido en el punto 3 de este inciso).
6. Preparar un control de solución salina mezclando 0.5 mL de solución salina formalizada con 0.5 mL del
antígeno formalizado.
7. Incubar las mezclas en baño de agua a una temperatura entre 48 y 50 ºC. .
8. Observar en intervalos de 15 minutos por espacio de 1 hora.
9. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la muestra de prueba, pero no en el control.
10. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinación.
11. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica.
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
1. Técnicas para el análisis Microbiológico de Alimentos. Segunda Edición. Universidad Nacional Autónoma de
México. Facultad de Química, Departamento de Biología.
2. https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm
MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………
ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….
FECHA………………………………… SUBGRUPO………………………….
RESULTADO…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES……………………………………………………………………………………
CONCLUSIONES...…………………………………………………………………………………...
PRACTICA #10 Determinación de Vibrio spp
Explicar el fundamento de cada etapa del análisis de Vibrio spp en alimentos.
Entre los alimentos involucrados en ETA's que están contaminados por V. cholerae resaltan los moluscos bivalvos
así como los crustáceos y los pescados frescos refrigerados y congelados. Estos productos pueden generar
enfermedades a los consumidores debido a que desde su origen están sometidos a contaminación
microbiológica y química entre otras, aunado a la forma de consumo que en muchos casos es cruda.
El cólera es una enfermedad relacionada con el abastecimiento de aguas con poca higiene, o bien de los
alimentos provenientes de aguas contaminadas con materia fecal y que se consumen crudos. También puede
aparecer V. cholerae O1 en moluscos bivalvos, crustáceos o pescados que se obtienen de aguas no
contaminadas en donde el microorganismo forma parte de la microbiota autóctona.
El género Vibrio incluye a los bacilos rectos o curvos Gram-negativos, oxidasa positivos (excepto las especies
metschnik ovii y gazogenes), anaerobios o anaerobios facultativos. Muchas especies de Vibrio spp. son
patógenas para humanos y están implicadas en toxiinfecciones transmitidas por alimentos. La mayoría de los
microorganismos que pertenecen a este género no crecen en medios sin cloruro de sodio a excepción de V.
cholerae y V. mimicus, por lo tanto, debido a esta característica no es considerado un Vibrio halofílico, aunque
requieran trazas del ión sodio para su crecimiento.
Las especies de Vibrio cholerae comprenden varios grupos antigénicos somáticos incluyendo el grupo O1, el cual
se asocia con los biotipos clásico y El Tor. A su vez, este grupo 01 puede tener varios serotipos incluyendo Inaba,
Ogawa e Hikojima. Las especies de V. cholerae no- O1 (referidos en la literatura como vibrios no aglutinables o
NAG), se encuentran en aguas estuarinas y pueden causar enfermedad gastrointestinal, aunque típicamente es
menos severa que la causada por el V. cholerae O1. El serotipo 0139 identificado por primera vez en 1992 como
el causante de una nueva epidemia de cólera en la India y Bangladesh y el que si produce los síntomas clásicos
del cólera.
El método de detección estándar para la recuperación y la detección de Vibrio cholerae es cualitativo. Sin
embargo, se recomienda para las especies aisladas de V. cholerae de los serotipos O1 y no-O1 demostrar la
producción de la toxina del cólera. Este método describe un esquema general que consiste en:
- Enriquecimiento a diferentes temperaturas, dependiendo del tipo de alimento que se desee analizar,
donde se pretende incrementar las poblaciones de Vibrio e inhibir otros microorganismos presentes en
la muestra.
- Aislamiento diferencial en medio sólido selectivo, el cual restringe el crecimiento de otros géneros
diferentes a Vibrio, permitiendo el reconocimiento de colonias sospechosas de la especie Vibrio
cholerae.
- Purificación: Las colonias características sospechosas de pertenecer a la especie cholerae, se purifican en

medios no selectivos.
• Identificación bioquímica, que permite la identificación de los cultivos de V. cholerae.

• Pruebas serológicas, que permitan la identificación de los cultivos de V. Cholerae.
1. Agua de peptona alcalina
2. Agar tiosulfato-citrato-bilis-sucrosa (TCBS)
3. Agar tripticasa de soja (TSA)
4. Cloruro de sodio
5. Agar de hierro Kligler inclinados (KIA)
6. Caldo triptona sin NaCI(T1No0)
7. Caldo triptona más 3% de NaCI(T1N3)
8. Caldo triptona más 6% de NaCl (T1N6)
1. cajas de Petri
2. Matraz de 500 mL o frasco de vidrio de 500 mL de capacidad
3. tubos 13 x 100
4. discos para prueba de oxidasa.
5. discos para prueba de ONPG
8. Pipetas Pasteur estériles con filtro de algodón
9. Asa de inoculación redonda
10. Asa de inoculación en punta
3. Autoclave
4. Incubadora a 35 ± 2 ºC
Enriquecimiento y siembra
1. Pesar 25 g de muestra en una funda estéril o frasco tarado (capacidad de aproximadamente 500 ml). Los
productos tales como mariscos o verduras se pueden mezclar o cortar en trozos pequeños con tijeras estériles.
2. Añadir 225 ml de APA al frasco. Mezclar bien la muestra o mezclar 2 min a alta velocidad.
3. Incubar APA a 35 + 2 * C durante 6 a 8 h. Vuelva a incubar el frasco durante la noche si la muestra es de alimento
procesado.
Para el análisis de ostras crudas, se incluye un segundo matraz tarado con 25 g de producto más 275 mL de APA.
Este matraz se debe incubar de 18 a 21h a 42 ± 0,2ºC en un baño de agua.
4. Preparar las placas secas de agar TCBS. Transferir con ayuda de un asa de 3 mm el inóculo de la película
superficial del cultivo de APA a la superficie de una placa de TCBS secada y sembrar por agotamiento de manera
que produzca colonias aisladas.
5. Incubar las cajas de agar TCBS durante la noche (18 a 24h) a35º ±2 ºC.
6. Las colonias típicas de V. cholerae en agar TCBS son grandes (2 a 3 mm), lisas, amarillas y ligeramente aplanadas
con centros opacos y periferias translúcidas.
7. Para la identificación bioquímica, las colonias aisladas de las placas deben ser sembradas en un agar no selectivo
(agar TSA-2% NaCl) para purificar la cepa.
8. Incubar durante la noche a 35 ± 2 º C y proceder a la identificación utilizando una única colonia aislada.
Confirmación
La fórmula para todos los medios de pruebas bioquímicas deberá contener por lo menos un 2% de NaCl.
Se recomiendan los siguientes medios porque las reacciones permiten efectuar una diferenciación presuntiva
entre la mayoría de las especies de Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas y otras bacterias. La diferenciación de las
colonias sospechosas se realiza por duplicado en:
Prueba de oxidasa.
1. Colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerio con algunas gotas de reactivo de oxidasa.
Alternativamente se puede utilizar un disco reactivo comercial.
2. Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en agar soya tripticasa con NaCl al 2%, u otro medio
que no contenga carbohidratos fermentables y depositario en el papel filtro anterior.
3. Para los microorganismos oxidasa positivos, el papel se tomará púrpura oscuro azul en pocos segundos. Las
especies patógenas de Vibrio son oxidasas positivas (Excepto V. metschnnikovii)
Agar triple azúcar hierro (TSI) y Agar Kligler hierro (KIA)

1. Registrar las características del medio TSI y KIA antes de la inoculación (color del medio).
2. Tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa bacteriológica recta y estéril e inocular por
picadura y estría en un tubo con agar triple azúcar hierro (TS) y agar de Kligler (KIA) inclinado.
3. Incubar el medio TSI y KIA a 35 ± 2 C durante 18 a 24 h.
Prueba de halofilia.
1. Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en KIA o TSI con asa bacteriológica estéril y suspender
el inóculo en un tubo con los siguientes medios:
Caldo triptona con NaCl al 0% (T1N0)
Caldo triptona con NaCl al 3% (T1N3)
Caldo triptona con NaCl al 6% (T1N6).
2. Incubar los medios a 35 ±2 ºC durante 18 a 24 h.

NOTAS
El V. cholerae y el V. mimicus crecerán en T1No y T1N3 y no crecen en T1N6.
Algunos géneros de bacterias que no son Vibrio y que presentan reacciones similares a las de V. cholerae
en medios de TSI y LIA no crecen en T1N3. La mayoría de las especies de Vibrio spp. que incluyen algunos
V. cholerae no O1, crecen únicamente en T1N3 y no crecen en T1N6 ni en concentraciones mayores de sal.
Prueba de oxidación-fermentación.
1. Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en KIA o TSI con asa bacteriológica estéril e inocular
por picadura en un tubo con el medio Hugh Leifson.
2. Añadir una capa de aceite mineral estéril a uno de los tubos para incubación en anaerobiosis.
3. Incubar ambos tubos a 35-37%C durante 18 a 24 h.
NOTA
Las especies de Vibrio spp utilizan la glucosa tanto para la oxidación como para la fermentación. Las
especies de Pseudomonas, que comúnmente se aíslan del pescado y los mariscos con métodos de
enriquecimiento que se usan para las especies de Vibrio, utilizan sólo la glucosa para la oxidación.
Identificación y confirmación de V. chforeae O1, V.cholerae no O1 y V. mimicus a través de pruebas bioquímicas

complementarias.
Leer los resultados de las prueba bioquímicas de TSi, KIA, T+No, T1N3, T1N6, además del caldo glucosa de Hugh-
Leifson. También se sugiere realizar una tinción de Gram a un cultivo de 18 a 24 h. de incubación.
La interpretación de las pruebas bioquímicas para identificación de V. cholerae y otras especies bacterianas afines
figuran en los cuadros.
Prueba serológica de aglutinación.

1. Inocular los cultivos sospechosos presuntivos en agar tripticasa soya (TSA) e incubar a 35-37ºC durante 16 a 24
h.
2. Colocar con un asa bacteriológica, dos gotas separadas de solución salina estéril (NaCI 0.85%) sobre un
portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación.
3. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSA.
4. Agregar a una de ellas una gota del suero anti-Vibrio cholerae Grupo 01 subgrupo Inaba (factor AC) y mezclar
con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.
5. Agitar inclinando la lámina hacer girar las gotas durante aproximadamente un minuto.
6. Observar bajo una buena iluminación y sobre un fondo oscuro la reacción.
7. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.
8. Realizar el mismo procedimiento con el suero anti-Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo Ogawa (factor AB).
NOTAS
La suspensión del cultivo en la que no se adicionó el suero anti Vibrro cholerae Grupo O1 subgrupo Inaba (factor
AC) o el suero anti-Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo Ogawa (factor AB) se considerará como el control negativo
para poder interpretar el resultado.
Existe la posibilidad que los antígenos anti-Vibrio cholerae estén relacionados entre sí, por lo que se considera
pertinente realizar pruebas bioquímicas para confirmar que el cultivo puro sea de V. cholerae O1 o no O1.
Es conveniente incluir cultivos positivos y negativos, además de los controles salinos para cada antisuero usado.
Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente (grupo O1) y con los sueros Inaba y Ogawa, tienen los 3 factores
(A, B y C) y son del serotipo Hikojima.
Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente, pero no aglutinan ms sueros Ina Ogawa, no se pueden tipificar
con estos antisueros.
Los cultivos de V. cholerae cuya identidad se haya confirmado con métodos bioquímicos y que no aglutinen con el
suero del grupo O1 se deben considerar como V. cholerae O1.
CUADRO 3. Características diferenciales de especies y biotipos del género Vibrio
CUADRO 1. Reacciones de algunas especies de Vibrio spp. y microorganismos relacionados
en medios sólidos diferenciales.
Ninguna de las especies de Vibrio spp. aquí enlistadas producen ácido sulthídrico en KIA, TSI o AAG, o gas de
la glucosa en cantidades detectables en KIA, TSI 0 AAG. Algunas especies de Aeromonas spp pueden producir
gas a partir de la glucosa en estos medios.
CUADRO 2. Características mínimas para la identificación de Vibrio cholerae

Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
1- https:/Awww.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm
2- Técnicas para el análisis Microbiológico de Alimentos. Segunda Edición. Universidad Nacional Autónoma de
México. Facultad de Química, Departamento de Biología.
MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………
ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….
FECHA………………………………… SUBGRUPO………………………….
RESULTADO…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES……………………………………………………………………………………
CONCLUSIONES...…………………………………………………………………………………...

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GUÍA PRÁCTICA MICROBIOLOGÍA II

CICLO I 2023 — 2024

Unidad 1. ASPECTOS FUNDAMENTALES DE LA MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

Unidad 2. INFECCIONES E INTOXICACIONES. MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA-ETAS

Unidad 3. MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA EN LA INDUSTRIA ALIMENTICIA

Unidad 4. MICROORGANISMOS PATÓGENOS DE IMPORTANCIA EN LOS DIFERENTES ALIMENTOS.

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimiento

Instrucciones o consideraciones previas

Instrucciones o consideraciones previas

Instrucciones o consideraciones previas

Instrucciones o consideraciones previas

* AOAC método oficial 986.33 & 990.12 Incubar 48 h ±3h a 35 ºC ± 1º C.

Instrucciones o consideraciones previas

MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………

ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….

MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………

ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….

Objetivos de la práctica de laboratorio

Instrucciones o consideraciones previas

Se puede hacer uso de la tabla de NMP, para obtención de los resultados.

MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………

ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….

Instrucciones o consideraciones previas

Prueba de la enzima termonucleasa.

MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………

ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….

MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………

ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….

Instrucciones o consideraciones previas

3. Siembra en medios selectivos

4.2. Agar lisina hierro.

5. Pruebas bioquímicas preliminares

5.2. Agar citrato de Simmons

5.4. Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad)

5.5. Caldo RM-VP (Rojo de metilo-Voges-Proskauer)

5.5.1, Prueba de Voges-Proskauer (VP)

4. Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).

5.5.2. Prueba de Rojo de Metilo

MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………

ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….

Instrucciones o consideraciones previas

- Purificación: Las colonias características sospechosas de pertenecer a la especie cholerae, se purifican en

• Identificación bioquímica, que permite la identificación de los cultivos de V. cholerae.

Agar triple azúcar hierro (TSI) y Agar Kligler hierro (KIA)

2. Incubar los medios a 35 ±2 ºC durante 18 a 24 h.

Identificación y confirmación de V. chforeae O1, V.cholerae no O1 y V. mimicus a través de pruebas bioquímicas

Prueba serológica de aglutinación.

CUADRO 2. Características mínimas para la identificación de Vibrio cholerae

MUESTRA……………………………. MARCA ………………………………

ANÁLISIS ……………………………. MÉTODO…………………………….

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