MANUAL DE USO DEL

FACSCanto II 255
EN TUBO
(FACSDiVA 8)

Servicio de Citometría de Flujo (S.C.F.)

Centro de Biología Molecular Severo Ochoa
Universidad Autónoma de Madrid. Cantoblanco.
28049. Madrid. Spain.
Tlf. 34-91 196 4499/4526
E-mail. [email protected]

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 ÍNDICE

1. GUÍA RÁPIDA de MANEJO del FACSCanto II

ADQUISICIÓN DE MUESTRAS (sin HTS)

1.1. Encender el equipo--------------------------------------------3

1.2. Abrir o crear un Experiment--------------------------------4

1.3. Adquisición de muestras------------------------------------7

1.3.1 ¿Qué hacer si el citómetro no detecta eventos detecta

menos o de forma irregular?----------------------------------------9

1.4. Limpieza del citómetro--------------------------------------10

1.5. Apagado del citómetro--------------------------------------11

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 1. GUÍA de MANEJO del FACSCanto II
ADQUISICIÓN DE MUESTRAS (en TUBO)

1.1. Encender el equipo

 Encender el equipo: botón verde en el lateral izquierdo del aparato

 Encender el ordenador de adquisición y entrar en Windows

USER: Admin
PASSWORD: BDIS#1

 Se bloquea el escritorio aparece el siguiente mensaje en una pantalla

gris, se nos pide introducir nuestro usuario y contraseña del PPMS (sólo
podremos registrarnos cuando seamos autónomos en el manejo del
equipo)

 Doble clic en el icono del software FACSDiVA 8

 Aparece la ventana Log In de control de uso:

 Selecciona el nombre de usuario de la lista (User Name)

correspondiente a tu laboratorio e introduce el password también propio
de tu laboratorio y por tanto común a todos los miembros del mismo.
 Fijarse en el margen inferior derecho de la pantalla donde aparece el
status bar:
Tarda unos segundos en los que pone “connecting cytometer”,
una vez conectado aparece en el status bar.

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  Fijarse en los niveles de fluidos, en la parte inferior derecha de la

ventana Cytometer . El orden es FacsFlow, waste, solución de

lavado 1 y solución de lavado 2 , vaciad o sustituid el fluido

correspondiente*. La solución de lavado 1 es agua destilada (botellas de
5 litros junto al FACSFlow) y la solución 2 es Clean (lejía diluida
comercial).
*ver anexo de utilidad
 Hacer un “Fluidics startup”: ir en el menú de la barra superior del
software a cytometer => fluidics Startup. En el Canto II del lab 111, sale
una ventana en la que te advierte que el acoplador de placa no está
conectado, le das a aceptar (consultar si en las reservas algún usuario
del día va a usar el HTS, en cuyo caso su reserva aparecerá de color
verde. Si es así, hacer el fluidics startup con el acoplador de placa
puesto y las puertas cerradas).

Tanto en el Canto A como en el Canto II sale una segunda ventana en la

que te indica el tiempo que dura, 7 minutos (sin acoplador de placa):
hacer clic en OK y esperar hasta que termine. En el status bar aparecerá
finalmente así:

El citómetro está listo para ser utilizado

 Tras hacer el “Fluidics Startup” hay que comprobar que no haya aire en
los filtros (mirar carro de fluidos: parte frontal en Canto II, en el lado
izquierdo en el Canto A). Si se ve aire o si se tiene la duda, con los
guantes puestos coger papel absorbente, rodear el filtro a purgar con
bastante papel, aflojar el tapón de arriba y dejar salir todo el aire. Cuando
empiece a salir líquido volver a cerrar; el filtro de la derecha es sheath el
del medio clean (OJO TIENE LEJÍA, este no se purga) y el de la
izquierda agua.

1. 2. Abrir o crear un Experiment

 Selecciona tu carpeta de usuario o crea una si no la tienes. No se debe
crear subcarpetas dentro de la carpeta de usuario.

 Pincha el icono “carpeta” de la barra de herramientas del browser antes

del experimento. Dentro aparecerán los “experimentos de referencia”
con los que trabajas más habitualmente.

RECUERDA TENER COPIAS DE SEGURIDAD DE LA

INFORMACIÓN DEL BROWSER

RECUERDA QUE NO SE PUEDEN TENER DATOS EN LOS

EXPERIMENTOS DEL BROWSER, ESTOS DEBEN SER
EXPORTADOS Y ELIMINADOS DEL BROWSER

NO SE PUEDEN TENER MÁS DE 5 EXPERIMENTOS EN EL4

BROWSER
  Selecciona el EXPERIMENT del browser adecuado para las
muestras que vas a pasar. Es recomendable importar el
experimento vacío cada vez que queramos trabajar con él para
evitar acumular errores en los archivos, LA REUTILIZACIÓN DE
EXPERIMENTOS PUEDE CORROMPERLOS. Ver como se exporta
un experimento en el apartado 1.5 de este manual.

 Para IMPORTAR el experimento de interés en el browser, ir a:

File >import >experiment

Selecciónalo de la carpeta Planillas y settings del escritorio o Servidorcito e

impórtalo. Es recomendable guardar los experimentos fuera del
browser e importarlos para evitar que se corrompan.

 ABRIR el “experiment” directamente si lo tienes en el browser

haciendo doble clic, se mostrará el contenido: haz una copia si
quieres mantener el original y modifícala o adáptalo a las muestras
que vas a pasar hoy, crea tubos, modifica las condiciones de
adquisición, las planillas…

Todo aquello que modifiques de un experimento será

automáticamente guardado cuando cierres el software o salgas de
tu sesión, SI QUIERES MANTENER EL ORIGINAL HAS DE
DUPLICAR EL EXPERIMENTO y CAMBIARLE EL NOMBRE O
EXPORTARLO, Y ENTONCES MODIFICAR EL EXPERIMENT.

Los Experiments aparecen en el browser con el icono de un libro, para

abrirlo hacer doble clic y el icono será el de un libro abierto, para cerrarlo
volver a hacer doble clic y el icono será el de un libro cerrado.

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 ÚNICAMENTE SE PUEDE TENER UN EXPERIMENTO ABIERTO A LA
VEZ. Para renombrar copiar y pegar especímenes o muestras tiene
que estar abierto el experimento.

Añade al experimento el specimen (ejemplo fecha) y las

muestras (tube) que vas a adquirir ese día (se debe
realizar la estructura antes de adquirir datos).

 Clic en el botón New Specimen para añadir un grupo de

muestras al experimento. Por defecto, se crea con una muestra.

 Clic en el botón New Tube para añadir muestras, puedes

nombrarlas todas antes de la adquisición.

 Clic en el icono del browser para seleccionar la muestra que se va a

analizar en ese momento, para la que se van a mostrar los datos de
adquisición y en la que se van a ajustar los settings. El icono se
vuelve de color verde y aparecen 5 pestañas verdes en la ventana
Cytometer (esta ventana sólo está activa y visible si está conectado y
encendido el citómetro).

 Clic en la pestaña Parameters de la ventana Cytometer. Aquí se

eliminan los parámetros que no se vayan a utilizar, seleccionando la fila
y pulsando el botón Delete. Te has de poner sobre un tubo para activar
completamente esta ventana.

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 VERIFICA QUE LOS SETTINGS SON LOS QUE TE INTERESAN EN
LA VENTANA DEL CYTOMETER PONIÉNDOTE ENCIMA DE LOS
CYTOMETER SETTINGS

 Al seleccionar la muestra o Tube, el inspector nos permite editar

diferentes parámetros de ese tubo. Selecciona cada una de las pestañas
para ver las distintas opciones de la muestra en curso.

 Selecciona en el menú Experiment  Experiment Layout para

establecer los nombres o labels de cada parámetro y los eventos que se
van a grabar de cada tubo en acquisition (existe la opción de copiar y
pegar). También puedes añadir los labels a la lista que aparece a la
derecha, de manera que siempre los tendrás disponibles.

 En la tercera pestaña se selecciona primero la planilla de análisis (global

worksheet por defecto) y después el stopping gate

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1.3. Adquisición de muestras
 Girar el soporte metálico de la parte inferior del SIT (sample injection
tube). SÓLO GIRA HACIA EL LADO IZQUIERDO. Inserta el primer tubo
en el SIT encajando la parte superior del tubo al citómetro, el tubo queda
suspendido en el aire (Canto II) y sujeto (Canto A).
 Seleccionar el tubo que nos interesa pasar en el browser o hacer clic en

el botón next tube de la ventana acquisition dashboard

hasta llegar al tubo deseado (el puntero se pone de color verde).

 Hacer clic en Acquire , no se graban los datos solo se

visualizan (el puntero se pone de color amarillo durante la adquisición).

 Para modificar la velocidad de paso de muestra en el cuadrante inferior

derecho del acquisituion dashboard seleccionar flow rate: low, medium o
high.

 Ajustar los settings seleccionar la ventana del cytometer , seleccionar

la pestaña de parameters y modificarlos si fuera necesario.

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 Para modificar los settings, hacer clic encima del voltaje y los puedes
modificar de varias maneras:

1.- Tecleando un valor directamente

2.- Haciendo clic en los cursores que aparecen

3.-Arrastrándo el puntero de la barra que aparece a la derecha del

número cuando está seleccionado.

 Para modificar el threshold seleccionar la pestaña correspondiente en la

ventana cytometer. La escala es de 5 décadas logarítmicas reales por lo
que los valores no se corresponden para nada con los de los Caliburs.
Se puede modificar de la misma manera que los voltajes.

 Para modificar las compensaciones seleccionar la pestaña

compensation de la ventana cytometer y se modifica igual que los
apartados anteriores.

 Una vez verificados y/o ajustados (ver siguiente apartado) los settings de

la muestra si haces clic en record , los datos son

guardados (el puntero se pone de color naranja durante la
grabación)

 Una vez guardados los datos el puntero se pone verde de nuevo y

aparece un diskette negro junto al tubo guardado .

 Para pasar a la siguiente muestra hacer clic en next tube en el

acquisition dashboard o seleccionar con el ratón la flecha a la izquierda
del tubo que se quiere pasar en el browser, si no lo haces te dirá que
ese tubo ya existe y que si quieres sobrescribir los datos overwrite o bien
adjuntarlos al mismo fichero: append.

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  Quitar el tubo:

CANTO II

 Una vez adquirido el tubo, el citómetro automáticamente, deja

libre el tubo DURANTE UNOS SEGUNDOS para ser retirado,
al retirarlo automáticamente suelta una pequeña cantidad de
líquido que se absorbe por el brazo metálico del propio
citómetro (lavado entre muestra y muestra). Hasta que no
acaba este proceso no se puede meter el siguiente tubo.
 Si el tubo no es extraído se abre un mensaje en el software
que te pregunta si hay que volver a adquirir o si quieres quitar
la muestra: hacer clic donde proceda.

CANTO A

 Una vez adquirido el tubo, el citómetro el botón Remove del

acquisition dashboard se activa, haz clic sobre él y quita el
tubo, al retirarlo automáticamente suelta una pequeña cantidad
de líquido que se absorbe por el brazo metálico del propio
citómetro (lavado entre muestra y muestra). Hasta que no
acaba este proceso no se puede meter el siguiente tubo.

1.3.1 ¿Qué hacer si el citómetro no detecta eventos, detecta menos o de

forma irregular?

 SE HA ATASCADO:

PROTOCOLO DE ACTUACIÓN EN CASO DE ATASCO: Si

durante la adquisición deja de pasar la muestra, pasa más
lentamente o las poblaciones se mueven detén la adquisición del
tubo inmediatamente, quítalo, espera a que el citómetro se
limpie,
 seleccionas en la barra del menú del software
cytometer=> cleaning modes => de-gas flow cell,
posteriormente pasas clean un par de minutos y agua
otro par.
 Si sigue atascado pones un tubo con agua y te vas a
cytometer => cleaning modes => clean flow cell
 Si persiste el atasco cytometer=>cleaning
modes=>Bubble filter purge and degass
 Al final de la adquisición hacer lavado largo. Si los
problemas persisten filtrar las muestras para continuar
adquiriéndolas.

 AIRE EN LOS FILTROS DE FLUIDOS:

EN CASO DE QUE NO PASE MUESTRA, PUEDE SER

NECESARIO REALIZAR UN PURGADO DE LOS FILTROS: Con
los guantes puestos coger papel absorbente, rodear el filtro a

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 purgar con bastante papel, quitar el tapón dejar salir todo el aire y
cuando empiece a salir líquido volver a tapar. Hacer sólo en el
filtro de la izquierda (es sheath).

1. 4. Limpieza del citómetro

 En el browser encontrarás en shared experiments un experimento que

recibe el nombre de lavado con un specimen llamado corto y otro que
recibe el nombre de lavado largo.
 Si no eres el último usuario del día y no has pasado muestras
problemáticas haz el lavado corto: dos tubos: 5 min clean y 5 min con
agua. NO DEBEN PASAR MÁS DE 300 eventos a velocidad máxima
(high) con el agua, si no es así se debe proceder al lavado largo.
 Si eres el último usuario del día o has pasado muestras problemáticas
haz el lavado largo: tres tubos: 5 min clean, 5 min con rinse y 5 min de
agua. NO DEBEN PASAR MÁS DE 300 eventos a velocidad máxima
(high) con el agua; si no es así cambiad el tubo de agua por agua
filtrada y comprobad si pasan menos de 300 eventos. Repetir el lavado
largo si el citómetro no ha quedado limpio.

1.5. Apagado del citómetro

 Comprobar en el sistema de reservas si hay un usuario antes de dos

horas.
 SÍ HAY UN USUARIO antes de 2 horas, únicamente después de lavar:

1. Confirma esa reserva.

2. EXPORTA TUS DATOS (barra del menú File=> export FCS, o clic
derecho sobre el experimento=> export FCS), Y/O EXPERIMENTO
(barra del menú File=> export Experiment, o clic derecho sobre el
experimento=> export Experiment), y guárdalos en tu carpeta
personal dentro de la carpeta Servidorcito
(Desktop/Servidorcito/Carpeta de vuestro laboratorio).
Comprueba que se han exportado haz copia de seguridad y
ELÍMINALOS DEL BROWSER.

3. Exporta el experimento: Si el experiment que has modificado te

interesa por la planilla o los settings duplica el experimento sin datos
en el browser, ponle el nombre correspondiente y expórtala a tu
carpeta experiments. Recuerda que este archivo incluye los settings
pero también puedes exportarte los settings aparte (ver anexo
manual ANEXOS DE UTILIDAD).

4. Sal del DiVa

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 IMPORTANTE: ES OBLIGATORIO ELIMINAR TUS DATOS DEL
BROWSER ANTES DE UNA SEMANA PARA EVITAR PROBLEMAS DE
SATURACIÓN Y EXPORTA TODA LA INFORMACIÓN QUE
CONSIDERES IMPORTANTE CONSERVAR (experimentos, settings,
etc.)

 NO HAY UN USUARIO antes de 2 horas pero si después, después de

lavar proceder a:
1. Confirma esa reserva.
2. EXPORTA TUS DATOS* (File=> export FCS; EXPERIMENT)
3. Salir del software
4. Apagar el ordenador
5. Apagar el citómetro (botón verde lateral izquierdo)

 NO HAY MÁS USUARIO (verifícalo en ese momento):

1. EXPORTA TUS DATOS* (File=> export FCS; EXPERIMENT)

2. Realizar el Fluidics shutdown (verificar que el nivel de
shutdown solution es suficiente si no lo es cambiarlo): ir en el
menú de la barra superior del software a cytometer => fluidics
shutdown. Dar a ok tarda 5 minutos
3. Salir del software
4. Apagar el ordenador
5. Apagar el citómetro (botón verde lateral izquierdo)

*el Servicio de Citometría no se hace responsable de la pérdida de datos

de los usuarios, estos son los responsables de copiar sus archivos en el
lugar que corresponda así como de hacer copias de seguridad de los
mismos.

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