Límite de resolución: menor distancia en la que se deben encontrar 0.

61 µm
dos objetos/puntos para que se puedan visualizar por separado. En LR= Longitud de onda x Constante de proporcionalidad
ojo humano= 0.2mm. Microscopio Óptico= 0.2µm Apertura Numérica
Poder de resolución: es la capacidad de un lente para ver imágenes
separadas, claras y nítidas de objetos muy cercanos unos de otros. n. senα (semiángulo de apertura)
No tiene valor numérico. Es inversamente proporcional al límite de
Agua= 1.33
resolución y es independiente del aumento o magnificación obtenida Aceite= 1.515
por la combinación de lentes. Aire= 1

¿Cómo se puede mejorar el poder resolutivo de un microscopio óptico? Debemos disminuir el LR ¿Cómo? disminuyendo la
longitud de onda de la luz-> colocando un filtro azul. Otra opción es interponer un medio de mayor índice de refracción
(aceite de inmersión) entre el objetivo y el cubreobjeto para aumentar la AN.

MICROSCOPIO ÓPTICO
Sistema mecánico
• Soporte: pie y brazo
• Platina: donde coloco preparado
• Cabezal: contiene los lentes oculares
• Revolver: contiene los lentes objetivos
• Tornillos de Enfoque: macrométrico que aproxima y micrométrico que logra enfoque más fino
Sistema óptico
o Ocular: monocular o binocular
o Lentes objetivos: 4x (de campo), 10x (seco débil), 40x (seco fuerte), 100x (de inmersión-> con aceite de inmersión)
o Condensador: lente que concentra rayos luminosos
o Diafragma: regula la cantidad de luz que entra al condensador

MARCHA DE RAYOS
Las lentes objetivo y ocular poseen dos caras que pueden ser convexas (lentes biconvexas) o planoconvexas. Éstas son
lentes de tipo convergentes, ya que los rayos que las atraviesan se acercan entre sí.
Las diferentes partes de una lente
✓ Centro de curvatura (c.c.): centro de la circunferencia
✓ Eje principal (e.p.): recta que pasa por los dos centros de curvatura;
✓ Centro óptico (c.o.): punto de la lente en el cual todo rayo que lo atraviesa no se desvía
✓ Plano principal (p.p.): eje perpendicular al e.p. que contiene al c.o.
✓ Foco principal imagen (f ´): un punto del e.p. en el que converge la imagen de un objeto
ubicado en el infinito
✓ Foco principal objeto (f): punto del e.p. en el cual debe ubicarse el objeto para que la
imagen se forme en el infinito
Los rayos incidentes pueden seguir tres direcciones:
a) Si el rayo incidente es paralelo al e.p., se desvía pasando por f’
b) Si el rayo incidente pasa por f, se desvía y emerge paralelo al e.p.
c) Si el rayo incidente atraviesa el c.o. el rayo no se desvía

Lente objetivo: conjunto de lentes de corta distancia focal. La imagen (i) que resulta será real (imagen del lado opuesto a
la lente), invertida (orientado en sentido inverso al objeto) y mayor.
Lente ocular: hace foco con el objeto ubicado muy cerca de la lente, a menor distancia que la focal (f). La imagen será
virtual (imagen del mismo lado que el objeto), directa (orientado en el mismo sentido que el objeto) y mayor.
IMAGEN FINAL (objetivo + ocular) = VIRTUAL, INVERTIDA y MAYOR

@necroticaenfmed Cami
 MICROSCOPIOS
Microscopio invertido: permite la observación de cultivos celulares, donde las células se encuentran adheridas al fondo de
cápsulas de Petri. El microscopio invertido tiene la fuente de luz y el condensador en la parte superior de la platina, sobre
la cual se colocan las cápsulas de Petri con los cultivos.
Microscopio de fondo oscuro: permite estudiar y/o detectar el relieve y estructura superficial de células y
microorganismos en preparados frescos sin colorear. Es un microscopio óptico en el cual los rayos luminosos penetran en
el objetivo en forma oblicua.
Microscopio de polarización: para estudiar la presencia de moléculas o estructuras birrefringentes capaces de rotar el
plano de la luz polarizada tales como el colágeno y los microtúbulos.
Microscopio de contraste de fase: permite el estudio de los tejidos vivos-> permite observar las células vivas sin teñir. Un
microscopio óptico puede convertirse en un microscopio de contraste de fase si se le incorporan un condensador anular,
una placa de fase y objetivos ad hoc. Permite apreciar las diferencias entre el núcleo y el citoplasma, así como las
especializaciones de membrana tales como microvellosidades, cilios, flagelos.
Microscopio de fluorescencia: permite observar sustancias autofluorescentes de los tejidos o colorantes fluorescentes
(denominados fluorocromos) que, ligados a anticuerpos o sondas de ADN o ARN, se unen a sitios específicos en el interior
de las células y tejidos.
Microscopio confocal: es un tipo particular de microscopio de fluorescencia, pero la calidad de la imagen es superior
porque el foco se realiza en un único plano focal y se elimina toda la información que está fuera de foco.
Microscopio de dos fotones o de excitación multifotónica: es una variante del microscopio confocal que permite la
observación tridimensional de colorantes fluorescentes, aplicable en células vivas.
Microscopios electrónicos: MET posee una mayor resolución y utiliza un haz de electrones que atraviesa la sección -zonas
claras son atravesadas por el haz y las oscuras absorbieron o dispersaron la luz-. MEB los electrones NO atraviesan la
muestra-> chocan con la superficie. En la microscopía óptica los tamaños se miden en micrones y en la microscopía
electrónica se miden en nanómetros y Angstrom.

TÉCNICA HISTOLÓGICA DE RUTINA

Obtención de la Muestra Biopsia: extracción de tejidos en sujeto vivo. Autopsia: post mortem.
Para impedir descomposición del tejido. Lo + usado es el FORMALDEHIDO por perfusión (se inyecta
Fijación previo a muerte) o inmersión (se sumerge). En microscopía electrónica-> se usa tetróxido de osmio.
CONGELAMIENTO con nitrógeno líquido o hielo seco y acetona (se corta con Criostato IMPORTANTE).
Deshidratación ¿Para qué? Para poder incluir la muestra en parafina (hidrofóbica). ¿Cómo? Sumergiendo la muestra
en concentraciones CRECIENTES de ALCOHOL (50%->70%->96%->100%).
Aclaración (algunos autores Para que ingrese la Parafina tengo que desplazar el Alcohol-> ¿Cómo? Sumergiendo muestra en
incluyen este paso en el XILOL (solvente orgánico) que vuelve la muestra traslúcida y disuelve los ácidos grasos (=chau
anterior)
lípidos).
Inclusión en Parafina La Parafina tiene la consistencia de una vela= la tengo que derretir para usarla. La muestra se
sumerge y esta desplaza al Xilol. ¿Qué obtenemos? Un TACO solidificado que nos permite cortar.
Corte MICRÓTOMO 4 o 5 µm. Luego los sumerjo en agua tibia que permite su estiramiento y montarlos.
Montaje Tomamos el portaobjetos con ALBUMINA y lo sumergimos en el agua.
Desparafinación e Debemos eliminar la Parafina para poder teñir la muestra con colorantes HIDROFÍLICOS.
Hidratación 1. Sumerjo en Xilol para desplazar parafina 2. Sumerjo en concentraciones DECRECIENTES de
ALCOHOL. Se lava con agua destilada para sacar los restos.
Primero se sumerge portaobjetos en HEMATOXILINA-> se lava con agua corriente y luego destilada=
vira el color desde un tono rojo a azul. Segundo se sumerge en EOSINA y se lo lava con agua
destilada.
Coloración Principios químicos:
Hematoxilina es un colorante BÁSICO (catiónico +) que tiñe elementos ácidos (pej. ADN y ARN) = son
Basófilos.
Eosina es ÁCIDO (aniónico -) y tiñe elementos básicos (ej. proteínas y mitocondrias) = son
Acidófilos/Eosinófilos.
Deshidratación y Para adherir el cubreobjeto usamos Bálsamo de Canadá (HIDROFÓBICO) = debemos deshidratar la
Montaje muestra otra vez con concentraciones CRECIENTES de ALCOHOL y luego sumergir el XILOL para
desplazar el alcohol.

@necroticaenfmed Cami
TINCIONES ESPECIALES
PAS: se expone tejido a ácido peryódico (oxida glúcidos y libera grupos aldehídos) luego se sumerge en reactivo de Schiff
(contacta con los aldehídos= reacción Plasmal). Se utiliza para evidenciar glúcidos. Color-> MAGENTA
Feulgen: se somete al tejido a una hidrólisis con HCL que extrae ARN y bases púricas de ADN= apertura de anillos de
desoxirribosas y formación de grupos aldehídos-> luego se sumerge a reactivo de Schiff. Color-> MAGENTA
Entonces, Schiff nos permite ver las membranas basales de los tejidos epiteliales, la mucina de las células caliciformes, el
glucocálix de las células epiteliales y las inclusiones de glucógeno de los hepatocitos.
Sudán: sudan III y black. Son solubles en lípidos y se unen a tejidos que los poseen. Obviamente se usa una técnica
diferente, donde se usan fijadores especiales o se realizan cortes por congelación.
Tricrómico De Mallory: es una técnica que emplea fucsina ácida, azul de anilina y Naranja G. Tiñe las fibras colágenas,
reticulares, la matriz extracelular del cartílago y el hueso de color azul; los citoplasmas, núcleos y músculos, en distintas
tonalidades de rojo, y las fibras elásticas y hematíes, de color amarillo.
Tricrómico De Masson: emplea hematoxilina de Mayer, fucsina Ponceau y azul de anilina. Tiñe los núcleos de azul, los
citoplasmas rojos, las fibras colágenas de color celeste, los glóbulos rojos y el músculo de fucsia.
Tricrómico De Van Gieson: es una mezcla de ácido pícrico, fucsina ácida y hematoxilina férrica. Tiñe los núcleos de marrón
o negro, las fibras de colágeno de rosado a rojo, y el citoplasma y el músculo de amarillo.

METACROMASIA meta= otro croma=color

Es una propiedad de algunos componentes químicos de las células y tejidos de cambiar el color de algunos colorantes
catiónicos/básicos empleados.
¿Por qué? Se debe a la presencia de polianiones (carga -) en las macromoléculas, quienes reaccionan químicamente con
la tinción.
Ejemplos de sustancias metacromáticas:
✓ Condroitín sulfatos->en la matriz extracelular del tejido cartilaginoso y en la gelatina de Wharton
✓ Los gránulos con Heparina de leucocitos basófilos y mastocitos.
Azul de toluidina-> en los mastocitos se tiñen de violeta por los aniones en el Heparán Sulfato. También en el cartílago.
Cambiando de color cuando reacciona en un tejido con mucopolisacáridos ácidos sulfatados o con fosfatos (GAGs y
proteoglucanos).
La metacromasia no es una técnica histoquímica, pero puede emplearse para identificar algunos componentes químicos si
previamente se somete al tejido a la acción de enzimas que digieren moléculas metacromáticas = la ausencia de
coloración en el tejido después del procedimiento confirma la presencia de la sustancia.
Ortocromasia: es la capacidad que tienen los colorantes de mantener invariable su espectro de absorción
electromagnética.

INCIDENCIA DE CORTE
Cuando observamos un preparado estamos viendo un corte bidimensional de un órgano/tejido. Por esto, puede haber
estructuras que NO veamos y va a ser común encontrarnos con cortes transversales, oblicuos y longitudinales de las
diferentes estructuras.

@necroticaenfmed Cami