Lectura Sesion 1 Espectrofotometria

UNIDAD DE CIENCIAS BÁSICAS
ASIGNATURA DE BIOQUÍMICA
GUÍA DE PRÁCTICAS
SEGUNDO AÑO
SESION 1. ESPECTROFOTOMETRÍA.
ELABORACION DE UNA CURVA DE
CALIBRACION
SESIÓN 1. ESPECTROFOTOMETRÍA. ELABORACION DE UNA
CURVA DE CALIBRACION.
1. INTRODUCCIÓN.
Las técnicas e instrumentación analíticas proporcionan la base para todas las

mediciones realizadas en un laboratorio de química clínica moderno. La mayoría
de las técnicas se encuentran en una de las cuatro disciplinas básicas dentro del
campo de la química analítica: Espectrometría (espectrofotometría, absorción
atómica y espectrometría de masas); luminiscencia (fluorescencia y
quimioluminiscencia); métodos electroanalíticos (electroforesis, potenciometría y
amperometría) y cromatografía (gaseosa y liquida).
La espectrofotometría aprovecha la propiedad de las sustancias químicas de

absorber una determinada longitud de onda del espectro visible o ultravioleta.
La intensidad de la absorción depende de la concentración de la sustancia, ya que

ésta mantiene relación directa con el número de moléculas disueltas en el
solvente. También de la distancia que debe recorrer el rayo de luz en una
determinada solución, debido a que cuanto mayor es el recorrido que realiza la luz
mayor será la posibilidad de ser absorbida por la molécula química. Y del
coeficiente de extinción, propiedad que es inherente a la naturaleza química de la
sustancia. Estas observaciones se expresan de una manera matemática a través
de la ley de Lambert y Beer:
log Io = C x l x ε
log It
Donde:
log Io = log de la luz incidente log It = log de la luz transmitida
C = concentración de la muestra l = paso de la luz en la cubeta (cm)

ε = coeficiente de extinción
La relación log Io / log It se denomina absorbancia (A); el valor de l es

generalmente igual a 1 cm y  puede tener las dimensiones de molaridad, en cuyo
caso tendremos M= coeficiente de extinción molar.
Reemplazando: A = C x ε
La determinación cuantitativa de la concentración de una solución problema puede

realizarse por dos métodos:
1.- Factor de calibración.
Se utiliza una sustancia estándar, que debe corresponder a la sustancia motivo de

la cuantificación (ejemplo: estándar de glucosa para cuantificar la glicemia).
Establecemos la siguiente relación:
Ast = Cst x ε Ap = Cp x ε
Donde:
Ast = absorbancia del estándar Cst = concentración del estándar
Ap = absorbancia del problema Cp = concentración del problema
Dividiendo y despejando:
Cp = Ap x Cst / Ast
Si Cst / Ast = Factor de calibración, entonces:
Cp = Ap x Factor de calibración
Para obtener la concentración del problema solo bastara multiplicar su

absorbancia con el factor de calibración. La expresión de los resultados dependerá
de las unidades del estándar (ejemplo: mg/dL, g/dL, mmol/L).
2.- Curva de calibración.
Se utiliza una solución estándar de concentración conocida, luego bajo las mismas
condiciones en que se va a realizar la determinación cuantitativa de la muestra
problema se procede con el estándar. Para elaborar la curva de calibración se
preparan varias concentraciones del estándar cuyas absorbancias se leen en un
espectrofotómetro y luego se grafican los resultados obtenidos.
2. OBJETIVO.
Explicar los fundamentos de la técnica espectrofotométrica y sus aplicaciones.
3. FUNDAMENTO DEL MÉTODO.
Se elaborará una curva de calibración a partir de varios estándares de azul de

metileno de concentraciones progresivas y la lectura en el espectrofotómetro a la
longitud de onda de mayor absorbancia (660 nm). Esta grafica nos servirá para
determinar la concentración de las muestras problemas con solo conocer su valor
de absorbancia. También utilizaremos el método del factor de calibración.
4. EQUIPOS, MATERIALES, REACTIVOS Y MUESTRA.
4.1. EQUIPOS.
Espectrofotómetro
4.2. MATERIALES.
Tubos de vidrio 13 x 100 Pipetas de vidrio
Gradilla Cubetas del espectrofotómetro

4.3. REACTIVOS.
Solución de azul de metileno 10 mg/dL
Agua destilada
5. PROCEDIMIENTOS.
5.1 Preparar cinco tubos de acuerdo con el siguiente esquema:
TUBOS N° 1 2 3 4 5
Azul de metileno 10 mg/dL 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0

(mL)
Agua destilada 4.0 3.0 2.0 1.0 0
(mL)
5.2 Mezclar apropiadamente los tubos y leer la absorbancia en el

espectrofotómetro a una longitud de onda de 660 nm.
5.3 Calcular las concentraciones del azul de metileno en cada uno de los tubos.
5.4. Graficar los resultados obtenidos en papel milimetrado. En el eje de abscisas

(X) anotar las concentraciones de azul de metileno de cada tubo y en el eje de
ordenadas (Y) la absorbancia correspondiente. Debe obtenerse una línea recta
ascendente que inicia en el punto cero.
6. RESULTADOS.
Anotar los resultados de absorbancia de cada uno de los tubos
TUBOS N° 1 2 3 4 5
Concentración (mg/L) 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
Absorbancia
Ejemplo:
Calcule la concentración de las muestras problema A y B, cuya absorbancia son

0.20 y 1.70 respectivamente.
a) Utilizando la curva de calibración, ubicamos las absorbancias de A= 0.2 y B=

1.7 en el eje de absorbancia y extrapolamos estos puntos hacia la línea recta y
luego al eje de la concentración. Estos valores son 1.0 y 9.0 mg/dL
aproximadamente.
b) Utilizando el factor de calibración, calculado a partir de los datos del tubo 5.
Factor de calibración = 10.0 / 1.8 = 5.55
Luego reemplazamos en la fórmula:
Concentración A = 0.2 x 5.55 = 1.11 mg/dL
Concentración B = 1.7 x 5.55 = 9.44 mg/dL

7. BIBLIOGRAFIA.
Gonzales HA. Principios de bioquímica clínica y patología molecular. 3ª ed.

Elsevier España. 2019. Página e1-e11. En:
https://www.clinicalkey.com/student/content/book/3-s2.0-B9788491133896000387.
Universidad de Córdova. Practicas generales de Bioquímica y Biología Molecular
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/
08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf.

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UNIDAD DE CIENCIAS BÁSICAS

Las técnicas e instrumentación analíticas proporcionan la base para todas las

La espectrofotometría aprovecha la propiedad de las sustancias químicas de

La intensidad de la absorción depende de la concentración de la sustancia, ya que

log Io = log de la luz incidente log It = log de la luz transmitida

C = concentración de la muestra l = paso de la luz en la cubeta (cm)

La relación log Io / log It se denomina absorbancia (A); el valor de l es

La determinación cuantitativa de la concentración de una solución problema puede

1.- Factor de calibración.

Se utiliza una sustancia estándar, que debe corresponder a la sustancia motivo de

Establecemos la siguiente relación:

Ast = absorbancia del estándar Cst = concentración del estándar

Ap = absorbancia del problema Cp = concentración del problema

Si Cst / Ast = Factor de calibración, entonces:

Para obtener la concentración del problema solo bastara multiplicar su

Explicar los fundamentos de la técnica espectrofotométrica y sus aplicaciones.

3. FUNDAMENTO DEL MÉTODO.

Se elaborará una curva de calibración a partir de varios estándares de azul de

4. EQUIPOS, MATERIALES, REACTIVOS Y MUESTRA.

Tubos de vidrio 13 x 100 Pipetas de vidrio

Gradilla Cubetas del espectrofotómetro

Solución de azul de metileno 10 mg/dL

5.1 Preparar cinco tubos de acuerdo con el siguiente esquema:

Azul de metileno 10 mg/dL 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0

5.2 Mezclar apropiadamente los tubos y leer la absorbancia en el

5.4. Graficar los resultados obtenidos en papel milimetrado. En el eje de abscisas

Anotar los resultados de absorbancia de cada uno de los tubos

Calcule la concentración de las muestras problema A y B, cuya absorbancia son

a) Utilizando la curva de calibración, ubicamos las absorbancias de A= 0.2 y B=

b) Utilizando el factor de calibración, calculado a partir de los datos del tubo 5.

Factor de calibración = 10.0 / 1.8 = 5.55

Luego reemplazamos en la fórmula:

Concentración A = 0.2 x 5.55 = 1.11 mg/dL

Concentración B = 1.7 x 5.55 = 9.44 mg/dL

Gonzales HA. Principios de bioquímica clínica y patología molecular. 3ª ed.

Universidad de Córdova. Practicas generales de Bioquímica y Biología Molecular

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