Producción de enzimas pectinolíticas por fermentación: Eficacia del
método de producción y downstream
Production of pectinolytic enzymes by fermentation: Effectiveness of
the production method and downstream
María Carolina Martín1,2, Vilma Inés Morata de Ambrosini 1,2.
1. Facultad de Ciencias Aplicadas a la Industria-UNCUYO. 2.CONICET.
[email protected] Resumen
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el método de producción enzimática y downstream a partir de Bacillus sp.
CH15 pectinolítico, para la obtención de una preparación enzimática con potencial aplicación en la industria vitivinícola.
Los métodos de producción incluyeron: i) cultivos estáticos, utilizando frascos de 1 L de capacidad incubados en
condiciones controladas, y ii) biorreactor semiautomático de laboratorio. Los mejores resultados fueron obtenidos para el
cultivo desarrollado en el biorreactor, alcanzándose una biomasa significativamente mayor y una rápida producción de
enzimas pectinolíticas. La concentración enzimática se llevó a cabo con un evaporador rotativo a presión reducida, y
como parte del proceso de downstream se utilizó la ultrafiltración, a través de un filtro tangencial con membranas de
cut-off de 10 KDa. En este sentido, la ultrafiltración no permitió alcanzar una adecuada purificación de las enzimas de
interés, debido a que se observaron grandes pérdidas de la actividad enzimática durante el proceso. Sin embargo,
mediante la concentración se obtuvo un producto con un 40% más de actividad enzimática respecto a la inicial, el cual
resultaría apropiado para su potencial aplicación en la maceración y clarificación de mostos y vinos.
Palabras clave: Producción Enzimática, Pectinasas, “Fermentación Sumergida”, Purificación.
Abstract
The aim of this work was to evaluate enzymatic production and downstream methods from Bacillus sp. CH15
pectinolytic, for the enzyme preparation with potential application in winemaking. The production methods included: i)
static cultures, using flasks of 1 L capacity incubated under controlled conditions; ii) semi-automatic laboratory bioreactor.
The best results were obtained for the bioreactor culture, reaching a significantly higher biomass and rapid production of
pectinolytic enzymes. Enzymatic concentration was carried out with a rotary evaporator under reduced pressure, and
ultrafiltration was used as part of the downstream process, through a tangential filter with 10 KDa cut-off membranes. In
this sense, ultrafiltration did not achieve suitable purification of the enzymes of interest, because large losses of
enzymatic activity were observed during the process. Nevertheless, a product with 40% more enzymatic activity than the
initial one was obtained by concentration, which would be appropriate for its potential application in the maceration and
clarification of musts and wines.
Keywords: Enzymatic Production, Pectinases, "Submerged Fermentation", Purification.
1. Introducción obtener pectinasas y glucanasas, respectivamente, de
estos hongos. Estas cepas son reconocidas como
Las enzimas pectinolíticas o pectinasas son GRAS (Generally Recognized As Safe) por la FDA
polisacaridasas que degradan la pectina presente en (Food and Drug Administration) y su uso está
la lamela media y pared celular primaria de las aceptado por la OIV (Organización Internacional de
células vegetales. Esta capacidad es ampliamente la Viña y el Vino).
utilizada en la elaboración de vinos ya que las La producción de pectinasas, a partir de cepas
pectinasas pueden ayudar a mejorar la clarificación fúngicas o bacterianas, puede llevarse a cabo tanto
y filtrabilidad de los vinos, y aumentar el por fermentación sumergida (FSum), como por
rendimiento en mosto así como la extracción de fermentación en sustrato sólido (FSS) (Pedroni et
compuestos polifenólicos y de color atrapados en los al., 2009). Un proceso industrial típico de
hollejos (Martín y Morata de Ambrosini, 2014). producción enzimática es la FSum, la cual implica
un cultivo líquido del microorganismo productor de
En enología, las preparaciones enzimáticas son la enzima, normalmente en condiciones aeróbicas,
producidas por algunas cepas de microorganismos, desarrollado en un biorreactor agitado. Por su parte,
principalmente hongos, no modificados en la FSS se hace uso de un medio simple,
genéticamente, y contienen numerosas actividades consistiendo normalmente en un producto de la
enzimáticas, predominando una de ellas. Las cepas agricultura no refinado, el cual le provee al
normalmente utilizadas son Aspergillus niger y microorganismo un medio soporte para
Trichoderma harzianum, debido a la facilidad para inmovilizarlo y todos los nutrientes necesarios para
1
el crecimiento microbiano. Los sustratos más
empleados son los subproductos agro industriales,
tales como bagazo de caña de azúcar, salvado de
trigo, bagazo de manzana y cítricos, pulpa de café,
orujo de uva agotado, etc. Éstos, generalmente, se
utilizan en combinación y/o complementados con
fuentes de carbono y energía fácilmente
metabolizables (melazas, maltodextrinas,
polisacáridos, etc.) y otros nutrientes (sales de
calcio, urea, fosfatos, etc.). Sin embargo, la
recuperación de las enzimas y purificación en este
método resulta más difícil y costosa, además de
requerir mayores tiempos de fermentación (Uzuner y
Cekmecelioglu, 2015). Por otro lado, la Fsum es
más fácil de controlar a mayor escala y ha sido
exitosamente usada para la producción de distintos
metabolitos desde la década del 40. Particularmente,
la producción de pectinasas a partir de distintas
especies de Bacillus por FSum ha sido reportado
exitosamente por muchos autores (Sharma y
Satyanarayana, 2006; Ahlawat et al.,2009; Joshi et
al., 2013).
La Figura 1 muestra el flowchart del proceso de
fermentación (FSum) y downstream de una
preparación enzimática de origen microbiano. El
proceso de downstream comprende los pasos de
aislamiento de la enzima y de purificación y
formulación de la preparación enzimática. Este es un
paso muy importante en biotecnología debido a los
costos de recuperación, concentración y purificación
del producto final. Una alta concentración de la
enzima en el sobrenadante o dentro de la célula y
Figura 1. Flowchart del proceso de fermentación y
una eficiente purificación son aspectos relevantes en downstream de una preparación enzimática.
la manufactura de enzimas para uso industrial Fuente: Modificado de Collection of Information on
(Werner et al., 2002). Para lograr una purificación Enzymes (Werner et al., 2002).
completa de las enzimas se utilizan técnicas
analíticas como la filtración en gel o cromatografía
de exclusión en gel, en la cual las enzimas, y otras El grado de pureza de las enzimas comerciales varía
macromoléculas, se pueden separar por su tamaño. desde muy poco purificadas (extractos enzimáticos
A partir de las enzimas purificadas, se puede realizar crudos) a enzimas altamente purificadas, y depende
un estudio profundo de caracterización enzimática, de su aplicación industrial. Con frecuencia, algunas
como los mecanismos de degradación del sustrato, enzimas pueden ser purificadas cientos de veces
condiciones de actividad óptimas y mecanismos de pero el rendimiento de la producción enzimática
regulación de síntesis de la enzima (Pedroni et al., puede ser muy pobre, hasta un 10% de la actividad
2009). del material de partida. Por el contrario, a nivel
industrial, las enzimas deben ser purificadas lo
menos posible, solamente otras enzimas o
compuestos interferentes en la actividad catalítica de
la enzima en estudio deben ser removidos. Debe
evitarse una purificación innecesaria ya que etapas
adicionales son costosas en términos de
equipamiento, manufactura y, en especial, pérdida de
actividad enzimática. Como resultado, algunas
preparaciones de enzimas comerciales consisten
esencialmente del caldo de fermentación
concentrado, acompañado de aditivos que garanticen
la estabilización y actividad catalítica de la enzima.
Sin embargo, el contenido de la enzima requerida en
una preparación debe ser lo más alto posible (por ej.
2
un 10% p/p de las proteínas) para facilitar los pasos La fermentación se llevó a cabo en dos sistemas de
del proceso de downstream. Esto puede alcanzarse producción diferentes: a) en frascos de cultivos de 1
optimizando las condiciones de cultivo de la cepa, o L de capacidad conteniendo 800 mL de caldo,
a menudo drásticamente, por ingeniería genética, incubados a 30ºC por un período de 72 h, sin
sobreexpresando la actividad enzimática en cuestión. agitación (lotes 1 y 2), y b) en un biorreactor SGI
SET002M (Setric Genie Industriel, Toulouse,
El objetivo del presente trabajo fue evaluar Francia) conteniendo 1 L de caldo de cultivo, con
diferentes métodos de producción enzimática y control automático de temperatura a 30ºC,
procesos de downstream o purificación parcial, a mantenido durante 24 h con aireación intermedia
partir de cultivos de una cepa bacteriana productora (lote 3) (Figura 2). El inóculo fue al 2%, tratándose
de enzimas pectinolíticas, para la obtención de una de un cultivo activo con DO (560 nm) no menor de
preparación enzimática a escala piloto o industrial 0,600.
con potencial uso en la industria vitivinícola.
2. Materiales y métodos
2.1. Microorganismo:
Como microorganismo productor de enzimas
pectinolíticas (pectinasas) se utilizó la cepa Bacillus
sp. CH15, la cual fue previamente aislada desde la
superficie de uvas para vinificación provenientes de
la región vitivinícola San Rafael, Mendoza,
Argentina (Cabeza et al., 2011). Dicha cepa fue
estudiada y seleccionada por su capacidad de
producir pectinasas extracelulares acídicas y
“activas en frío (Martín y Morata de Ambrosini,
2013). Además, el efecto de dicha preparación
enzimática sobre la extracción y evolución del color
de vinos Malbec fue oportunamente estudiado, Figura 2. Biorreactor SGI SET002M (Setric Genie
mediante ensayos de microvinificaciones llevados a Industriel, Toulouse, Francia)
cabo a bajas temperaturas de maceración (Martín y
Morata de Ambrosini, 2014).
2.3. Recuperación de la enzima en estudio:
2.2. Producción enzimática:
A partir de los cultivos celulares se procedió a la
Para la producción de las enzimas pectinolíticas, así recuperación de las enzimas de interés. Por tratarse
como también primeramente para la producción del de enzimas extracelulares, directamente se procedió
inóculo, se utilizó el medio de cultivo líquido a eliminar los microorganismos y recuperar el
diseñado y optimizado por Kobayashi et al. (2001), sobrenadante libre de células (SLC), al cual se lo
con algunas modificaciones, conteniendo pectina llamó SLC crudo. Las células fueron removidas, en
cítrica (60% de metilación) como principal fuente de primer lugar, por centrifugación (15 min a 3000 x g),
carbono. La composición del mismo se detalla en la y seguidamente por filtración, utilizando un filtro
Tabla 1. vertical a vacío con membranas de poro de 0,45 μm.
2.4. Purificación parcial y concentración:
Tabla 1. Composición del medio de cultivo Kobayashi
et al. (2001) parcialmente modificado.
Los SLC crudos fueron sometidos, por un lado,
directamente a concentración (lote 1), y por otro, a
Componentes Composición (g/L)
Pectina cítrica (60% metilación) 5
purificación parcial y concentración por
Peptona de carne 2,5 ultrafiltración (lotes 2 y 3). Para la concentración
Peptona de soja 2,5 directa se utilizó un evaporador rotativo a presión
Extracto de levadura 5 reducida (Rotavapor Fbr® Decalab S.R.L.,
K2HPO4 1 MERCOSUR) bajo las siguientes condiciones: 40±2
MgSO4.7H2O 0,2 ºC, vacío de 90 KPa, baja agitación (4-8 rpm), 180
MnSO4.6H2O 0,05 min (Figura 3). Mientras que para la ultrafiltración
CaCl2.2H2O 0,05 se utilizó el equipo piloto de filtración tangencial
Agua (c.s.p.) 1L HI-FLOW (Setric Genie Industriel, Toulouse,
Agar 15 Francia), acoplado con módulos de filtración de
pH = 5 cut-off de 10 KDa (SGI 30 UFIB/1/S18/10KD)
3
(Figura 4). Dicha filtración se llevó a cabo en La actividad enzimática específica (UE/mg) se
condiciones de refrigeración, con una presión de 0,5 evaluó determinado la concentración de proteínas,
bar, durante 30-40 min. de acuerdo al método de Bradford (1976), utilizando
seroalbúmina bovina como estándar para la
reacción.
3. Resultados y Discusión
La cepa Bacillus sp. CH15 fue cultivada por
fermentación sumergida para la producción de
enzimas pectinolíticas. Dicha producción enzimática
fue diferente en los distintos sistemas de producción
utilizados. Mientras que dos lotes fueron producidos
por fermentación en frascos de cultivos estáticos
(lotes 1 y 2), un único lote fue obtenido por
fermentación en el biorreactor (lote 3).
La recolección de las células y obtención del
extracto enzimático se realiza, normalmente, en la
etapa final de crecimiento exponencial, cuando la
secreción enzimática es máxima, de acuerdo a
experiencias previas. Sin embargo, los cultivos
Figura 3. Evaporador rotativo a presión reducida fueron procesados según se mencionó en la sección
(Rotavapor Fbr® Decalab S.R.L., MERCOSUR). anterior, a tiempos de crecimiento definidos. Así, los
cultivos de los lotes 1 y 2 alcanzaron una densidad
óptica (DO) de solamente 0,200 unidades en 72 h,
mientras que el lote 3 alcanzó una DO de 1,015 en
tan solo 24 h. Con respecto a los dos primeros casos,
la DO alcanzada es significativamente baja, lo cual
indicaría que los cultivos se encuentran en etapas
tempranas de fase exponencial. El tiempo de cultivo
(72 h) fue definido en base a experiencias previas de
cultivos estáticos, llevadas a cabo en iguales
condiciones, excepto por el volumen del material de
partida (100-250 mL, datos no mostrados).
Probablemente esta última variable (volumen de
medio de cultivo) esté relacionada con los cambios
observados en el crecimiento celular.
Seguidamente, los SLC crudos fueron sometidos,
Figura 4. Sistema piloto de ultrafiltración tangencial por un lado, directamente a concentración en
HI-FLOW (Setric Genie Industriel, Toulouse, Francia). rotavapor a presión reducida (lote 1), y por otro, a
purificación parcial y concentración por
ultrafiltración (lotes 2 y 3). La actividad pectinolítica
2.5. Ensayo de actividad enzimática de las diferentes preparaciones enzimáticas se
muestra en la Figura 5.
La actividad pectinolítica se cuantificó mediante la
liberación de azúcares reductores desde una Por un lado, se puede observar que la fermentación
dispersión de pectina (0,25% de pectina en buffer en el biorreactor (SLC-3) fue la que alcanzó la
acético/acetato 50 mM, pH 4,0) usando el reactivo mayor actividad enzimática en el extracto crudo en
ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959) y muy corto período de tiempo (0,148±0,008 UE/mL).
ácido galacturónico como estándar. La relación Mientras que los cultivos producidos en frascos en
enzima:sustrato fue 1:10 (v/v) y las condiciones de condiciones estáticas (SLC-1 y SLC-2) mostraron
reacción enzimática 20ºC, pH 4,0 y 15 min. Una valores de 0,080±0,021 y 0,099±0,016 UE/mL.
unidad enzimática (UE) se define como la cantidad Estos últimos son un 54 y 67% de la actividad
alcanzada en el biorreactor, a pesar de la baja DO
de enzima que libera 1 μmol de grupos reductores alcanzada por los cultivos.
(expresados como ácido monogalacturónico) por
minuto bajo las condiciones del ensayo. Por otra parte, la actividad pectinolítica de la
preparación enzimática concentrada en el rotavapor
(Concentrado-1) aumentó un 40%, respecto al
4
material de partida (SLC-1). Sin embargo, se relativamente bajas (menores de 10 KDa) con este
constató una pérdida de actividad pectinolítica neta, tipo de actividad. La presencia de pectinasas en esta
lo cual llevó a obtener una recuperación de las fracción no sería conveniente en vista de la
pectinasas en el concentrado de un 67%. Cabe producción de una preparación enzimática
mencionar que la concentración total, en las parcialmente purificada y concentrada, porque si
condiciones dadas, fue de 2,1 veces (v/v). bien la actividad mostrada no es demasiado alta, sí
lo es el volumen de dichos extractos, conllevando
esto a una importante pérdida de actividad
enzimática en la fracción concentrada.
En general, el peso molecular de las enzimas
pectinolíticas depende del tipo de enzima que se
trate, tomando valores muy variables, comprendido
en un rango de entre 35 y 140 KDa (Kashyap et al.,
2001). Con respecto a las pectinasas reportadas para
el género Bacillus, la mayoría de las enzimas
identificadas hasta el momento en este género son
pectato liasas, siendo las liasas de la familia PL1 las
más numerosas, con pesos moleculares entre 30 y 50
kDa. La familia PL3 contiene pectato liasas de un
menor tamaño molecular, entre 20 y 25 kDa,
mientras que la familia PL9 contiene pectato liasas
Figura 5. Actividad pectinolítica de las preparaciones con un tamaño molecular superior a 72 kDa.
enzimáticas. SLC: Sobrenadante libre de células “crudo”
(lotes 1, 2 y 3); Concentrado-1: SLC concentrado en
Por otra parte, el rendimiento del proceso de
rotavapor (lote 1); Conc/Purif: SLC concentrados por
ultrafiltración (lotes 2 y 3). Los barras son el promedio de purificación por ultrafiltración en los lotes de
tres determinaciones y los segmentos verticales producción 2 y 3 se muestra la Tabla 2. En este
corresponden a las desviaciones estándar. sentido, en ambos lotes se observó una significativa
pérdida de actividad enzimática al pasar por el
módulo de filtración de 10 KDa, siendo más drástica
En cuanto a los concentrados obtenidos por en el lote 3. Esto conllevó a que la producción sea
ultrafiltración (Conc/Purif) puede observarse que la muy baja en las fracciones concentradas,
actividad en dichos concentrados fue prácticamente aproximadamente un 20 y 30% en los lotes 2 y 3.
la misma o incluso menor que la actividad del SLC Con respecto a la concentración de proteínas totales,
de partida. Por lo que un efecto nulo o levemente hubo una recuperación adecuada en las fracciones
negativo se obtuvo en cuanto a concentración de la concentrada y filtrada, respecto a la de partida. Sin
actividad enzimática. Solamente una significativa embargo, en las fracciones de mayor interés, es decir
reducción de volumen y desalado parcial pudo los concentrados (Conc/Purif), las actividades
alcanzarse, lo cual resultaría importante para la específicas son muy bajas e inferiores a las de
producción de enzimas de uso industrial. partida, por lo que no pudo lograrse una correcta
purificación enzimática. Por su parte, en las
Cabe mencionar que los SLC filtrados por fracciones filtradas, se constata la actividad de
membrana de corte de 10 KDa (fracción no enzimas pectinolíticas en las mismas, siendo
concentrada) retuvieron enzimas con actividad particularmente en el lote 2 considerablemente
pectinolítica, con valores de actividades de mayor la producción debido al gran volumen de
0,063±0,007 y 0,075±0,005 UE/mL en los lotes 2 y dicha fracción.
3, respectivamente (actividades no mostradas en la
Figura 5). Esto indicaría, preliminarmente, la
presencia de enzimas de pesos moleculares
Tabla 2. Evaluación de los procesos de purificación enzimática por ultrafiltración en dos lotes de producción
Actividad Volumen de Actividad Actividad
Proteínas Fold Producción
Muestras enzimática muestra pectinásica específica
(mg) purification (%)
(UE/mL) (L) neta (UE) (UE/mg)
SLC-2 0,099 1,550 43,70 153,21 3,51 - -
Conc/Purif 10KD-2 0,097 0,315 23,68 30,58 1,29 0,37 19,96
Filtrado10KD-2 0,063 1,150 25,22 71,96 2,85 0,81 46,97
SLC-3 0,148 0,650 29,52 96,14 3,26 - -
Conc/Purif 10KD -3 0,119 0,240 16,91 28,67 1,70 0,52 29,82
5
Filtrado10KD-3 0,075 0,280 5,70 21,11 3,70 1,14 21,95
Los resultados precedentes están en concordancia psychrotolerant microorganisms producing
con lo reportado para la producción de cold-active pectinases for biotechnological
preparaciones de enzimas comerciales, en el sentido processes at low temperature, Food Technology
de minimizar pasos de purificación que resultarían and Biotechnology 49(2), 187-195.
innecesarios, debido a la potencial pérdida de
Joshi, M.; Nerurkar, M.; Adivarekar, R. (2013). Use
estabilidad y de la actividad catalítica de las
of citrus limetta peels for pectinase production by
enzimas cuando se modifica el medio en el que se
marine Bacillus subtilis. Innovative Romanian
encuentran activas, además del correspondiente
Food Biotechnology 12, 75-83.
aumento en los costos de producción.
Kashyap, D.R.; Vohra, P.K.; Chopra, S.; Tewari, R.
4. Conclusiones (2001). Applications of pectinases in the
commercial sector: a review, Bioresource
De acuerdo a los sistemas de producción enzimática Technology 77, 215-227.
evaluados en el presente trabajo, se puede observar
que el método más conveniente es la fermentación Kobayashi, T. y otros 6 autores, (2001).
en el biorreactor, ya que con éste se alcanzó una Purification and properties of a galacturonic
alta densidad celular en muy corto período de acid-releasing exopolygalacturonase from a strain
tiempo y la mayor actividad enzimática en el of Bacillus. Bioscience, Biotechnology and
extracto crudo. Esto puede ser atribuido Biochemistry 65, 842–847.
especialmente a las condiciones de aireación Martín, M.C.; Morata de Ambrosini, V.I. (2013).
constante del cultivo, teniendo en cuenta que se Cold-active acidic pectinolytic system from
trata de un microorganismo aeróbico. Otros psychrotolerant Bacillus. Application in pigment
métodos de cultivos no estáticos, como la extraction from red grapes. American Journal of
fermentación en estufas o baños termostáticos Enology and Viticulture 64(4), 495-504.
agitados sería una alternativa interesante de
estudiar. Martín, M.C.; Morata de Ambrosini, V.I. (2014).
Effect of a cold-active pectinolytic system on colour
Con respecto al proceso de downstream realizado development of Malbec red wines elaborated at low
por ultrafiltración tangencial, con membranas de temperature, International Journal of Food Science
cut-off de 10 KDa, este no resultó un método & Technology 49(8), 1893-1901.
adecuado para lograr una correcta purificación de Miller, G.L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid
las enzimas de interés, debido a que se observaron reagant for determination of reducing sugar,
grandes pérdidas de la actividad enzimática. Sin Analytical Chemistry 31, 426-428.
embargo, una concentración en volumen fue
lograda, a expensas de un mantenimiento en los Pedrolli, D.B.; Monteiro, A.C.; Gomes, E.;
niveles de actividad enzimática respecto a los SLC Carmona, E.C. (2009). Pectin and pectinases:
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