TEMA INTRODUCTORIO: LOS MÉTODOS

EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Análisis bioquímico
Ciclo formativo de Laboratorio clínico y biomédico

1. INTRODUCCIÓN.
2. TIPOS DE MÉTODOS DEL LABORATORIO CLÍNICO.
2.1. POR EL TIPO DE MEDIDA QUE REALIZAN.
2.2. POR LA NATURALEZA DE LOS PROCESOS FÍSICO – QUÍMICOS
IMPLICADOS.
2.3. POR EL DESARROLLO DE LA REACCIÓN.
2.4. POR EL MODO DE OPERAR.
2.5. POR EL USO AL QUE SE DESTINAN.
3. CARACTERÍSTICAS DE LOS MÉTODOS.
3.1. PRACTICABILIDAD.
3.2. FIABILIDAD.
3.2.1. EXACTITUD.
3.2.2. PRECISIÓN.
3.3.3. SENSIBILIDAD.
3.3.4. LÍMITE DE DETECCIÓN.
3.3.5. ESPECIFICIDAD.
3.3.6. INTERFERENCIA.
3.3.7. RANGO ANALÍTICO O LINEALIDAD.
3.3.8. MEDIDAS DEL BLANCO.
4. IDENTIFICACIÓN DE ERRORES MEDIANTE ESTUDIOS DE
EVALUACIÓN DEL MÉTODO.
5. SELECCIÓN DE MÉTODOS EN EL LABORATORIO CLÍNICO.
6. EVALUACIÓN DE MÉTODOS SEGÚN SU CAPACIDAD DIAGNÓSTICA
7. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS ANALÍTICOS.

1. INTRODUCCIÓN.
En el laboratorio clínico se realizan diferentes tipos de análisis en diferentes
muestras biológicas (sangre, orina, LCR, etc.) para detectar la presencia de
determinadas sustancias que, en general, se llaman analitos, o bien, para medir los
niveles (concentración o cantidad de sustancia) de estos analitos.
Como los resultados que se obtienen se aplican al diagnóstico, pronóstico y
tratamiento clínicos o a la adopción de medidas preventivas, los métodos de laboratorio
han de ser estudiados antes de ser implantados en el trabajo de rutina, de manera que se
tenga la garantía de que los datos que proporciona son fiables.
A continuación veremos qué tipos de métodos se emplean en el laboratorio clínico
y cuáles son las características que se deben comprobar en ellos.

2. TIPOS DE MÉTODOS EN EL LABORATORIO CLÍNICO.

En el laboratorio de Bioquímica Analítica o Clínica se utilizan diferentes tipos de
métodos que pueden clasificarse utilizando diversos criterios:
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2.1. Por el tipo de medida que realizan:

 Métodos cualitativos: sólo detectan la presencia o ausencia de un
determinado analito. Ejemplo: la detección de sangre oculta en heces.
 Métodos semicuantitativos: Indican el rango aproximado de
concentración del analito. Ejemplo: las tiras reactivas para el examen
básico de orinas.
 Métodos cuantitativos: Indican la concentración, con mayor o menor
exactitud, del analito en la muestra. Ejemplo: cuantificación de
glucosa en un suero.

2.2. Por la naturaleza de los métodos físico – químicos implicados:

A) MÉTODOS DE SEPARACIÓN:
A.1. Métodos mecánicos
A.1.1. Métodos que dependen de la exclusión por el tamaño:
- Filtración
- Ultrafiltración
- Diálisis
A.1.2. Métodos que dependen de diferencias en la masa o
densidad:
- Centrifugación
- Ultracentrifugación
- Flotación
- Decantación
A.2. Destilación
A.3. Electroforesis
A.4. Cromatografía
A.5. Extracción con disolventes.

B) MÉTODOS DE ANÁLISIS:
B.1. Métodos electroquímicos (electrodos ion – selectivos):
- Potenciometría
- Amperometría o polarografía
- Coulombimetría
B.2. Métodos ópticos:
- Espectrofotometría de absorción molecular UV – V
- Espectrofotometría de absorción atómica
- Fluorimetría y Luminometría
- Turbidimetría
- Nefelometría
- Fotometría de llama
- Espectrometría de rayos infrarrojos
- Reflexometría (química seca)
- Refractometría
- Microscopía
B.3. Métodos térmicos:
- Osmometría
B.4. Métodos inmunoquímicos:
- Inmunonefelometría
- Inmunoturbidimetría

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- Inmunodifusión
- Inmunoelectroforesis
- Inmunoanálisis (RIA, EIA, FIA, ECL, etc.).

2.3. Por el desarrollo de la reacción:

A) Métodos a punto final

B) Métodos por dos puntos
C) Métodos cinéticos

2.4. Por el modo de operar:

 Métodos manuales: todos los procesos implicados en ellos se realizan

sin utilizar procedimientos mecanizados.
 Métodos semiautomatizados: se hallan parcialmente mecanizados.
 Métodos automatizados: Se hallan mecanizados en prácticamente
todas sus etapas.

2.5. Por el uso al que se destinan:

 Métodos definitivos: son métodos de muy alta precisión y exactitud,

normalmente basados en cromatografía y espectrometría de masas. Se
usan para la medición de líquidos de referencia biológicos o no
biológicos de manera exacta y con un error de precisión muy bajo o
desconocido. Son muy costosos y están fuera del alcance del
laboratorio clínico.
Los líquidos de referencia deben poseer las siguientes características:
- Homogeneidad: La composición del líquido es uniforme
dentro de todo el envase que lo contiene y en todos los
envases de un mismo lote.
- Estabilidad: Las concentraciones de analitos deben
permanecer estables en las condiciones adecuadas de
almacenamiento y por el periodo especificado por el
fabricante.
- Conmutabilidad: Los analitos contenidos deben comportarse
de una forma similar a los análogos de las muestras o
especímenes biológicos.

Los líquidos de referencia, según su utilización, se dividen en:

- Patrón: Es aquel líquido de referencia que se utiliza para
obtener resultados analíticos.
- Calibrador: Es aquel líquido de referencia que se emplea para
calibrar los aparatos de medida, es decir, para ajustar los
resultados proporcionados por estos a los que deberían dar,
según la información facilitada por el laboratorio comercial
que prepara el calibrador utilizado.
- Control: Es aquel líquido de referencia biológico (suero,
plasma o sangre total) procesado por un laboratorio comercial
del que se han obtenido valores de distintos analitos tras una
serie de determinaciones (por ejemplo 30 por analito, donde

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han podido participar seis laboratorios de referencia que

realizan la determinación a cada analito por quintuplicado),
estableciéndose el valor real de cada analito en forma de
media con una desviación estándar determinada permitida (2 o
3 desviaciones estándar habitualmente).
Se utilizan tanto para el control de calidad interno como
externo de los métodos o procedimientos de medida de los
laboratorios clínicos.

 Métodos de referencia: son métodos de alta precisión y exactitud,

utilizados para obtener valores no sujetos a error en soluciones
biológicas, con los que se comparan los resultados obtenidos con
otros métodos en fase de validación o de control externo. Ejemplo:
Método de Cali para calcio plasmático por espectrofotometría de
absorción iónica; método de la glucosa – hexoquinasa para
determinación de glucosa.

 Métodos de elección, de rutina, de campo, o de trabajo : son los

métodos que elige un determinado laboratorio para el trabajo de
rutina, presentando buena practicabilidad y fiabilidad. Por ejemplo, si
el método de referencia para glucosa es el de la glucosa –
hexoquinasa, en la rutina actual se suele utilizar el de la glucosa –
oxidasa.

3. CARACTERÍSTICAS DE LOS MÉTODOS

3.1. Practicabilidad: Los aspectos de practicabilidad incluyen la educación y el

adiestramiento requeridos; disponibilidad y cantidad de personal cualificado;
requerimientos de espacio, instrumental y reactivos; tiempo de ejecución
(rapidez, flexibilidad); coste económico; seguridad y utilidades.

3.2. Fiabilidad: Cualquier método de análisis que deba utilizarse en el laboratorio

clínico ha de ser capaz de proporcionar resultados fiables aunque sea
realizado por diferentes técnicos, con diferentes lotes de reactivos y a lo largo
del tiempo. Para garantizar esta fiabilidad, los métodos han de presentar las
siguientes características o propiedades:

a) Exactitud: Es la ausencia de error en una medida. En el laboratorio clínico

se considera que un método es exacto cuando el valor obtenido en la
medida concuerda con el valor esperado o real (obtenido por un método de
referencia o previamente aceptado). Existen diversos criterios para
establecer la exactitud de un método analítico por comparación con otro
de referencia o previamente aceptado.
Para efectuar estudios de comparación con muestras de pacientes, se
requiere un mínimo de 40 muestras. Estas deben representar un amplio
rango de concentraciones, incluyendo valores bajos, normales y altos.

Uno muy usado es el que trata de comparar en un eje de coordenadas

ambos métodos (eje Y con los valores del método en estudio, y eje X con
los valores del método de referencia o previamente aceptado).

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En general, la ecuación que relaciona un eje Y con uno X es así:

y = b·x + a.
- El análisis de la regresión lineal mediante eje de coordenadas
indica una recta positiva, con una pendiente de la recta (b)
comprendida entre 0,95 y 1,05 (o sea, aproximadamente de 45º,
siendo 45º = 1).
- La intersección de la recta con el eje Y (a), se produce en la
unión del eje Y con el eje X. El valor ideal es cero.
- Existe una correlación positiva estadísticamente significativa,
donde r es el coeficiente de correlación de Pearson, con valores
posibles entre –1 y +1. Debe ser igual o mayor que 0,9.

Una forma de evaluar la exactitud analítica de un método es el uso de

tres controles (de valores bajo, medio y alto) que se analizan por
triplicado, y en cinco series analíticas distintas, calculándose el valor
medio obtenido para cada analito estudiado, y comparándose con el
valor real o esperado asignado a los analitos de los controles. El
método será exacto si el resultado coincide con el valor esperado o se
varía menos que la desviación estándar admisible.

3.2.1. Precisión: Es el grado de concordancia entre diferentes

medidas del analito obtenidas en pruebas analíticas realizadas por un
mismo método, sea en las mismas condiciones de ensayo (intraserie
o interserie - intradía, mismos reactivos, mismos instrumentos,
mismo laboratorio, misma persona), donde hablamos de
repetibilidad, sea en condiciones distintas (días distintos o interdías,
reactivos distintos, instrumentos distintos, persona distinta o
laboratorio distinto), donde hablamos de reproductibilidad.
En el laboratorio clínico se utiliza más el concepto antagónico, es
decir, el de imprecisión, porque es más fácil de medir
estadísticamente. Dicha imprecisión se define como la variabilidad
que se obtiene al repetir las medidas de un mismo analito en
alícuotas de una misma muestra o control bien intraserie, bien
interserie, estableciendo el coeficiente de variación. Una imprecisión
aceptable arroja valores inferiores al 5% en el coeficiente de
variación (CV), siendo excelente cuando es inferior al 2%.
DE
CV = x 100
Media Aritm.

Algunos factores que producen imprecisión:

Intraserie
 Errores en las mediciones de reactivos y/o muestras
 Evaporación de la muestra
 Error espectrométrico
 Variación de la temperatura de incubación
 Variación electrónica posterior a la calibración

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Interserie - intradía
 Error aleatorio en la calibración
 Deterioro de los calibradores posterior a la reconstitución
Interdías
 Variación entre lotes de calibración (de frasco a frasco)
 Errores de reconstitución

3.2.2. Sensibilidad : Es la capacidad de un método para poder

discriminar entre dos magnitudes (cantidad o concentración) muy
parecidas del analito. También se puede definir como la relación
existente entre el cambio en la respuesta de un método de medida y el
correspondiente cambio en la medida del analito.

3.2.3. Límite o umbral de detección: Es la más pequeña concentración o

cantidad de analito que pueda ser detectada para un nivel de confianza
dado.

3.2.4. Especificidad: Es la capacidad de un método para determinar

exclusivamente el analito en cuestión, discriminando entre éste y otras
sustancias generalmente presentes en la muestra. Un método químico
basado en la reacción del analito con un reactivo, será específico si no
hay reacción con otras sustancias componentes habituales de la muestra o
matriz.

3.2.5. Interferencia: es el efecto de alguna propiedad, ya sea química o

física, del sistema de reacción que pueda influir sobre el valor de la
cantidad investigada. Son interferentes, por ejemplo: sueros hemolizados
o lipémicos, la luz parásita en fotometría, agentes reductores como el
ácido ascórbico en técnicas basadas en la oxidación de cromógenos, etc.

3.2.6. Rango de linealidad: Es el rango de concentración de las muestras

sobre el que se puede aplicar el método sin tener que hacerle ninguna
modificación. Para determinar la linealidad de un método se analiza un
rango amplio de concentraciones correspondientes a varias soluciones
patrón, y se elabora una curva de calibración.

3.2.7. Medidas del blanco: Son las respuestas observadas durante el

procedimiento de medida que se deben al reactivo sin la muestra (blanco
de reactivo) o a la muestra sin que haya reacción propia del método
(blanco de muestra), cuyos valores son sustraídos a la respuesta
observada durante la medida propia del método. Como es de esperar,
cuanto más bajos sean los valores del blanco de un método, mejores
serán la exactitud y la precisión del mismo. Otro blanco empleados en
ocasiones es la medida de la respuesta propia de la cubeta, bien vacía o
con agua destilada.

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4. IDENTIFICACIÓN DE ERRORES MEDIANTE ESTUDIOS DE

EVALUACIÓN DEL MÉTODO

Los estudios de evaluación del método identifican dos tipos de errores:

a) El error aleatorio ocurre sin predicción o al azar en un momento concreto

(por ejemplo: incorrecta preparación de reactivos o estándares; confusión entre
muestras; variación en la adición correcta del reactivo a la muestra; un cálculo
incorrecto de resultado; transcripción equivocada de un resultado).

b) El error sistemático o sesgo es mantenido o constante y produce una

desviación de los valores obtenidos con respecto al valor real siempre en el
mismo sentido (valores más altos o más bajos constantemente). La causa es
inherente al método o a factores instrumentales (como una mala conservación
de muestras; defectuosa calibración instrumental: pipetas, balanzas, material
volumétrico, baños termostáticos, espectrofotómetros; error informático en el
cálculo). Hay dos tipos de errores sistemáticos:
- El error sistemático proporcional es aquel que se hace más
grande a medida que aumenta la concentración del analito.
- El error sistemático constante es aquel que afecta al método
por una cantidad en todo el rango analítico.

Los parámetros estadísticos estudiados que informan de estos errores son:

Parámetro Error
Coeficiente de variación Aleatorio
Pendiente Sistemático proporcional
Intersección con el eje Y Sistemático constante

5. SELECCIÓN DE MÉTODOS EN EL LABORATORIO CLÍNICO.

Para analizar un determinado analito o parámetro bioquímico hay disponibles, en
la actualidad, una considerable variedad de métodos y técnicas. Por ello, cada
laboratorio, según las características ya estudiadas, debe seleccionar sus métodos de
trabajo o rutina. Las diversas características en cuestión se recogen en el siguiente
cuadro:

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6. EVALUACIÓN DE MÉTODOS SEGÚN SU CAPACIDAD DIAGNÓSTICA

Los métodos analíticos cualitativos también deben evaluarse con el fin de

determinar su capacidad para diagnosticar la presencia de un analito en forma correcta,
(es decir la presencia o ausencia de la enfermedad en un sujeto), evitando:
- los falsos positivos (sujetos sin enfermedad o analito buscado con resultado positivo
para ella en el método analítico diagnóstico) y
- los falsos negativos (sujetos con enfermedad y con resultado negativo en el método
analítico diagnóstico).

Una prueba de laboratorio que se utiliza para el diagnóstico de una enfermedad

puede dar cuatro resultados:
1. Verdadero positivo (VP): resultado positivo en sujeto con enfermedad o
presencia del analito demostrada por otro método.
2. Verdadero negativo (VN): resultado negativo en sujeto sin enfermedad.
3. Falso positivo (FP): resultado positivo en sujeto sin enfermedad.
4. Falso negativo (FN): resultado negativo en sujeto con enfermedad.

La capacidad de una prueba diagnóstica analítica para discriminar entre sujetos

enfermos o no, se evalúa según cuatro criterios:
 Sensibilidad: Es la probabilidad de que un sujeto con enfermedad resulte
positivo en una prueba analítica para diagnosticar dicha enfermedad.

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S = VP / (VP + FN) x 100

 Especificidad: Es la probabilidad de que un sujeto sin enfermedad, resulte

negativo en una prueba analítica para diagnosticar dicha enfermedad.

E = VN / (VN + FP) x 100

 Valor predictivo positivo: Es el porcentaje de personas, con una prueba

positiva, que realmente padecen la enfermedad que se pretende diagnosticar
con esta prueba.

Valor predictivo positivo (VPP) = VP / (VP + FP) x 100

 Valor predictivo negativo: Es el porcentaje de personas, con una prueba

negativa, que realmente no padecen la enfermedad que se pretende
diagnosticar con esta prueba.

Valor predictivo negativo (VPN) = VN / (VN + FN) x 100

7. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS ANALÍTICOS

Los resultados obtenidos por los métodos analíticos comprometen seriamente al

laboratorio clínico, por cuanto son importantes (a veces decisivos), en la toma de
decisiones diagnósticas, pronósticas y terapéuticas del médico respecto de su paciente.

Por ello siempre deben establecerse valores de referencia para cada método
analítico, que ayuden a discriminar lo normal de lo patológico, teniendo en cuenta
siempre que estos pueden variar según la persona o población en estudio. Por ejemplo,
no es lo mismo detectar proteinuria en un sujeto en reposo que tras un ejercicio intenso.
Y también se pueden observar diferencias entre poblaciones según etnias, situación
geográfica, edad, sexo, mujer gestante o no, etc.

En cualquier caso los valores de referencia deben incluir aquel rango de valores
que, según un determinado método y para una población determinada, señalan
normalidad para el analito estudiado, estableciéndose un valor inferior y superior del
rango por fuera de los cuales hablaremos de anormalidad en el resultado.

Para establecer valores de referencia en una población, se elige una muestra al

azar de más de 100 sujetos, incluyendo ambos sexos, edades variables y diferentes
actividades. El procedimiento a seguir es el siguiente:
a) Establecer la media muestral y la desviación típica.
b) Establecer el error estándar.
c) Establecer un rango de valores de referencia como intervalo de
confianza del 95%. Es decir, que la probabilidad de que un sujeto
sano de esa población que presente un resultado analítico fuera de ese
rango sea inferior al 5%.