Rev. Cubana Quím.

Vol.32, no.3, sep-dic., 2020, págs. 511-526, e-ISSN: 2224-5421

Artículo original

Remoción de cobre de aguas contaminadas empleando ramnolípidos

Removal of copper from contaminated waters using rhamnolipids

Dr.C. Odalys Rodríguez-Gámez1* https://orcid.org/0000-0001-6511-7064

Esp. Rocio Pérez-Macías2 https://orcid.org/0000-0002-4817-0901
MSc. Isabel Aguilera-Rodríguez1
Dr.C. Rosa María Pérez-Silva1 https://orcid.org/0000-0002-9878-7192
Dr. C. Arelis Abalos-Rodríguez1 https://orcid.org/0000-0002-0007-5825

1
Centro de Estudios de Biotecnología Industrial, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas,
Universidad de Oriente, Santiago de Cuba, Cuba.
2
Empresa Geominera Oriente Sur, Cuba

*Autor para la correspondencia. correo electrónico: [email protected]

RESUMEN
El empleo de ramnolípidos constituye una alternativa atractiva y ecocompatible en la
remediación de ambientes contaminados con metales pesados. En el presente trabajo se evaluó
la capacidad del ramnolípido producido por P. aeruginosa ORA9 de remover cobre en aguas
contaminadas de la Laguna Azul del Cobre, para controlar y disminuir el riesgo humano y
ambiental que estas aguas representan. Se estudió la influencia del pH de la solución de
ramnolípidos (4-10), el tiempo de contacto (2-10 horas) y la concentración del biosurfactante
(40-120 mg L-1) en el proceso, a través de un diseño factorial Box-Bhenken. Se observó un
incremento del porcentaje de remoción de cobre, proporcional al tiempo de contacto y la
concentración del biosurfactante, alcanzándose un 48 % de remoción a las 10 h y 120 mg L -1. Los
resultados obtenidos indican que los ramnolípidos pueden utilizarse en el diseño de una
tecnología para remover cobre en aguas contaminadas.
Palabras clave: ramnolípido; agua contaminada; metales pesados; cobre; diseño factorial.

ABSTRACT
The use of rhamnolipids constitutes an attractive and eco-compatible alternative in the
remediation of contaminated environments with heavy metals. In the present work, the ability
of rhamnolipid produced by P. aeruginosa ORA9 to remove copper in contaminated waters of
the Blue Lagoon of El Cobre, was evaluated, to control and reduce the human and
environmental risk that these waters represent. The influence of the pH of the rhamnolipid
solution (4-10), the contact time (2-10 hours) and the concentration of the biosurfactant (40-
120 mg L-1) in the process were studied, through a factorial design Box-Bhenken. An increase in
the percentage of copper removal proportional to the contact time and the concentration of the
biosurfactant was observed, reaching 48 % removal at 10 h and 120 mg L-1. The results
obtained indicate that rhamnolipids can be used in the design of a technology to remove copper
in polluted contaminated waters.
Keywords: rhamnolipid; contaminated water; copper; heavy metals; factorial design.

Recibido: 21/7/2020

Aprobado: 11/9/2020

Introducción
La contaminación con metales pesados es uno de los problemas más importantes que afectan al
medio ambiente, debido a la toxicidad y a los daños que provocan en la salud humana y en los
ecosistemas acuáticos y terrestres. Debido a su naturaleza química, estos compuestos son
persistentes en el medio ambiente y no se degradan por métodos biológicos, químicos o físicos
a productos más inocuos; sino que permanecen en el ambiente, acumulándose como iones o
como metalocompuestos en los organismos por largos períodos de tiempo.(1)
El cobre, aunque es esencial para el funcionamiento normal del metabolismo en humanos, su
consumo excesivo a través de aguas o bebidas contaminadas, puede producir nauseas, vómitos
y/o dolor abdominal, pérdida del cabello, anemia y daños renal y hepático.(2)
Se han desarrollado diferentes técnicas para remover cobre de las aguas contaminadas
(precipitación química, el intercambio iónico, la adsorción, la filtración por membrana, las
técnicas de tratamiento electroquímico, etc), pero la aplicación de estos métodos es cara e
inefectiva en términos del consumo de energía y de productos químicos, además se pueden
generar grandes cantidades de lodos a tratar con dificultad.(3)
Actualmente se evalúan novedosas tecnologías que involucran microorganismos y sus
productos metabólicos, para el tratamiento de efluentes de las industrias y la actividad minera.
Dentro de ellas, ha cobrado auge el empleo de biosurfactantes para mejorar la remoción de los
metales pesados de estos efluentes.(4)
Los ramnolípidos (RL) son biosurfactantes aniónicos de tipo glicolipídico producidos
mayoritariamente por las cepas del género Pseudomonas. En su estructura presentan una parte
hidrofílica, constituida por ramnosa; y una parte hidrofóbica constituida por ácidos grasos
saturados e insaturados.(5) Presentan excelentes propiedades superficiales comparables a los
surfactantes de origen sintético, pero a su vez tienen la ventaja de ser biodegradables, no
tóxicos y pueden obtenerse a partir de materias primas renovables. Varios estudios han
demostrado la efectividad de los ramnolípidos en la remoción de metales pesados de suelos (6),
sedimentos (7) y aguas contaminadas.(8)
Las minas del Cobre, ubicadas en el poblado del mismo nombre, en Santiago de Cuba,
comenzaron su explotación desde el siglo XVI hasta finales del XX, en la modalidad de minería a
cielo abierto. Por razones económicas y tecnológicas la mina cerró en el año 2001. Los más de 4
siglos de explotación convirtieron el cerro en una enorme laguna (Laguna Azul) que es
testimonio del daño ecológico ocurrido en esta zona, impactada fundamentalmente con
cobre.(9)
Debido al carácter ácido de las aguas de la Laguna Azul, su alto contenido de cobre y otros
metales pesados (10), y el empleo por parte de la población vecina del lugar como área de baño,
se hace necesario la remediación de la misma y con ello, la recuperación de este lugar, lo cual
puede tener beneficios para la actividad turística, conservación de la biodiversidad, la
acuicultura, la irrigación y como fuente de abasto de agua para otras actividades mineras que se
desarrollan, en un marco donde a nivel mundial se realizan ingentes esfuerzos para la
recuperación y protección del vital líquido. Hasta donde se tiene conocimiento, no existen
reportes del empleo de los ramnolípidos para la remoción de cobre de aguas contaminadas
procedentes de un lago de mina.
La presente investigación tuvo como objetivo evaluar las potencialidades de un ramnolípido
para extraer el cobre de estas aguas contaminadas, con vistas a implementar una tecnología de
remediación y minimizar el riesgo que representa este ecosistema acuático para la salud
humana y ambiental.

Materiales y métodos
Muestras de agua
Se tomaron muestras de aguas contaminadas de la Laguna Azul, la cual se encuentra situada en
las latitudes 20°2’56’’ Norte y 75°56’49’’ Oeste, tiene alrededor de 4 millones de m3 de agua, un
kilómetro en su parte más larga, alrededor de 60 m de profundidad y casi 800 m en su parte
más ancha. Teniendo en cuenta que en la caracterización físico-química de estas aguas se
comprobó que existe homogeneidad espacial y entre las aguas superficiales y a una profundidad
de 1,5 m10, se tomaron muestras en una zona (20º02’47.8’’N; 75º56’27.1’’E) que se utiliza con
fines recreativos (baño), donde las aguas son cristalinas y el fondo no se observa debido a la
gran profundidad. Las mismas se colectaron en la mañana, en contenedores plásticos de 500 mL
pre-lavados, y se almacenaron a 4°C hasta su tratamiento en el laboratorio.
En el laboratorio, las muestras se filtraron bajo presión a través de filtros de membrana PES
(polyethersulfone) de 0,45 µm. Las alícuotas de muestras de agua para el análisis de cobre se
acidificaron en el momento de la colecta con ácido nítrico 1% (HNO3, 65% supra pure, Merck) y
se conservaron a 4ºC hasta su análisis. La concentración de cobre se determinó por
Espectroscopia Óptica de Emisión Atómica mediante Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-
AES) en un espectrómetro AMETEK, ALEMANIA. La solución de calibración se preparó a partir de
una solución mono elemental estándar certificada (solución estándar de cobre 1mg mL-1 como
Cu en HNO3 2%, ACROS-ORGANICS®)

Solución de ramnolípido
Se utilizó el ramnolípido producido por la bacteria Pseudomonas aeruginosa ORA9 aislada de
suelos contaminados con residuales oleosos y cultivada en medio mineral con aceite de fritura
como fuente de carbono.(11) La misma se encuentra depositada en la Colección de Cultivos del
Centro de Estudios de Biotecnología Industrial, de la Facultad de Ciencias Naturales y Exactas,
de la Universidad de Oriente. La solución de ramnolípido se preparó disolviendo el
biosurfactante crudo en agua destilada para una concentración final de 400 mg L-1.

Remoción de cobre de agua contaminada

El ensayo de remoción de cobre se realizó según la metodología descrita por Elouzi y
colaboradores (12) con modificaciones. Alícuotas de agua contaminada y solución de ramnolípido
se transfirieron a tubos de centrífuga. Cada tubo se agitó en zaranda (120 rpm) a temperatura
ambiente y al finalizar, las muestras se centrifugaron (8000 rpm, 20 min.) (Heal Force®, China) y
se filtraron a través de filtros de acetato de celulosa 0,2 µm. La concentración de cobre se
determinó por Espectroscopia Óptica de Emisión Atómica mediante Plasma de Acoplamiento
Inductivo (ICP-AES) en un espectrómetro AMETEK, ALEMANIA, y el porcentaje de metal
removido se calculó por la ecuación (1):

MCi  MCf
% Re moval  x100
MCi (1)

donde
MCi es la concentración inicial de cobre y MCf es la concentración final de cobre (después del
tratamiento con ramnolípidos).

Diseño experimental
Se evaluó el efecto de tres variables: pH de la disolución de ramnolípido, tiempo de contacto y
concentración de dicha disolución utilizando un diseño experimental Box-Behnken de superficie
de respuesta, que consistió de 15 experimentos incluyendo tres réplicas en el punto central
para evaluar el error experimental. Cada variable independiente se estudió a tres niveles (-1, 0,
+1) (tabla 1). El rango y los niveles de los factores estudiados se seleccionaron basados en
resultados de estudios similares realizados.(11) El porcentaje de cobre se seleccionó como la
variable respuesta.

Tabla 1 - Variables independientes y niveles estudiados en el diseño experimental Box-Behnken -ara la

remoción de cobre de agua contaminada

. Niveles
Factores
Variables -1 0 1
X1 Tiempo de contacto (h) 2 6 10
X2 pH solución de ramnolípido 4 7 10
Concentración de solución de
X3 40 80 120
ramnolípido (mg L-1)

Análisis estadístico
Los resultados se presentaron como la media de tres réplicas ± desviación estandard. Para el
diseño experimental, el efecto de cada factor o variable independiente estudiado, el P-valor y el
coeficiente de determinación (r2) se calculó mediante el Análisis de Varianza (ANOVA). Por un
análisis de regresión se determinó el modelo matemático que describe el comportamiento de
los factores estadísticamente significativos sobre la variable respuesta. La bondad del ajuste se
comprobó mediante el gráfico de correlación entre los valores observados y los predichos por el
modelo matemático determinado. La significación estadística se fijó a p ≤0,05. Los análisis y los
gráficos se realizaron con la ayuda del software estadístico STATGRAPHICS Centurión XV 15,2.(13)

Resultados y discusión
La tabla 2 muestra los valores promedios de la remoción de cobre obtenidos en cada corrida
experimental, observándose porcentajes de hasta 48 %.
Aunque no se encontraron reportes similares que estudien la extracción de cobre de aguas
contaminadas empleando ramnolípidos, el valor de remoción obtenido en este estudio es
similar a los obtenidos por otros autores que evaluaron la eficiencia de estos compuestos en la
extracción de cobre de diferentes ambientes contaminados. Mulligan (14) reportó una remoción
máxima de cobre (46 %) empleando una solución al 2 % de ramnolípidos en el lavado de un
suelo contaminado con metales pesados, mientras que Dahrazma y Mulligan (15) lograron
remover hasta el 37 % del cobre presente en sedimentos contaminados, cuando evaluaron la
eficiencia de un biosurfactante ramnolipídico, utilizando una configuración de flujo continuo
para la remediación de sedimentos contaminados.
Las aguas contaminadas de la Laguna Azul, tienen un pH moderadamente ácido (pH = 4,6±0,2) y
altos contenidos de cobre (43,6±1,7 mg L-1) y manganeso (24,1±1,1 mg L-1), por encima de los
límites aceptables para fuentes de abasto de aguas superficiales estipulados por la Norma
Cubana 1021:2014.(16) Además presenta otros metales cuyas concentraciones se observaron en
la siguiente secuencia: Al> Zn> Sr> Fe> Co> Cd > Ba> Ni. Metales traza y metaloides como As, Cr,
Mo, Pb, Sb y Se, se encontraron en concentraciones muy bajas.(10)

Tabla 2 - Matriz del diseño experimental Box-Behnken utilizado para evaluar la influencia de tres factores
en la remoción de cobre de aguas contaminadas, empleando ramnolípidos
Concentración de Remoción (%)
Tiempo de pH solución de -
Experimento ramnolípido (mg L
contacto (h) ramnolípido 1 Experimental Predicho
)
1 6 4 120 47,4±4,1 47,9
2 2 4 80 34,0±3,3 33,8
3 6 10 40 36,2±2,5 35,7
4 2 7 40 27,1±1,3 27,1
5 2 10 80 33,0±1,4 33,1
6 6 7 80 40,0±2,5 38,8
7 6 4 40 36,0±2,7 35,7
8 10 7 120 48,0±5,3 47,6
9 10 7 40 37,8±2,2 38,1
10 6 10 120 46,4±4,1 46,6
11 10 4 80 42,3±3,1 42,2
12 6 7 80 41,2±4,4 38.8
13 10 10 80 41,5±3,2 41,7
14 6 7 80 35,2±3,3 38,8
15 2 7 120 41,5±2,2 41,1

Aunque la presencia de múltiples cationes metálicos en estas aguas pudo interferir en la

remoción del cobre por el ramnolípido, estudios realizados (17) han demostrado que estos
compuestos forman complejos con muchos elementos con diferentes constantes de estabilidad
(desde más fuertes, log K= 10,30 hasta más débiles Log K= 0,96): Al3+ > Cu2+ > Pb2+ > Cd2+ > Zn2+
> Fe3+ > Hg2+ > Ca2+ > Co2+ > Ni2+ > Mn2+ > Mg2+ > K+ , lo que indica que en este caso, la formación
del complejo cobre-ramnolípido, tuvo mayor prevalencia que otros complejos ramnolípido-
metal que pudieron formarse, en las condiciones experimentales ensayadas.
La capacidad de los biosurfactantes de formar complejos con los metales es la principal razón
por la cual se pueden utilizar en la remediación de ambientes contaminados con metales
pesados. Los biosurfactantes aniónicos como son los ramnolípidos, forman enlaces iónicos con
los metales, generando complejos no iónicos de gran estabilidad. La presencia del grupo
carbonilo en el grupo carboxilo ejerce un efecto electroatractor sobre el oxígeno del grupo OH
del carboxilo, provocando una baja densidad electrónica sobre ese átomo de oxígeno, situación
que no ocurre en los hidroxilos de la ramnosa, siendo más favorable la unión con el catión. Por
otra parte, el tamaño y la basicidad de los átomos donadores (OH) en la ramnosa favorecen la
formación de complejos estables.(18)
Hogan (19) estudió la naturaleza de las interacciones del mono-ramnolípido con los metales
mediante la Espectroscopia protónica por Resonancia Magnética (RMN-H1) y la Espectroscopía
Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). Comprobó que el grupo carboxilo solamente está
débilmente involucrado en el acomplejamiento del metal, por lo que la gran estabilidad de los
complejos que se forman se debe a la unión del catión metálico a otras partes de la molécula del
ramnolípido, como son los grupos hidroxilo de la molécula de ramnosa, formándose una
estructura conocida como bolsillo de enlace (binding pocket) que involucra el grupo carboxilo y
el azúcar ramnosa.
Específicamente la descripción de la interacción de los ramnolípidos con los iones Cu2+ fue
estudiada por Ciésla y otros (20), quienes evaluaron mezclas de ramnolípidos en estado
premicelar y agregado, en agua y en solución de KCl 20 mM, a pH 5,5 y 6,0. El biosurfactante
reveló la mejor actividad quelante en soluciones premicelares. El grado de unión del metal
disminuyó con la concentración creciente del sistema y la presencia de K+ redujo la unión del
Cu2+ por ramnolípidos, pero no modificó significativamente la estabilidad del complejo. Se
demostró que la efectividad de estos compuestos depende de la composición del sistema y las
condiciones de pH.
El análisis estadístico de estos resultados (tabla 2) determinó que el tiempo de contacto y la
concentración de la solución de ramnolípidos fueron los factores con mayor influencia en el
proceso de remoción del metal de las aguas contaminadas, lo cual se observó al graficar los
efectos estimados en orden decreciente de importancia en un gráfico de Pareto (figura 1a). En
el gráfico de efectos principales se observa como el porcentaje de remoción de cobre aumenta
desde 32 % hasta 48 %, conforme los dos factores principales con efectos significativos se
mueven desde su nivel inferior a su nivel superior (figura 1b).

Diagrama de Pareto Estandarizada para Cu

C:Concent RL +
A:tiempo cont -
AA
CC
AC
BB
B:pH
BC
AB

0 2 4 6 8
a) Efecto estandarizado
 Gráfica de Efectos Principales para Cu

47

44

41

Cu %
38

35

32
-1,0 1,0 -1,0 1,0 -1,0 1,0
tiempo cont pH concent RL
b)
Fig. 1 - Gráficos de Pareto (a) y de efectos principales (b) obtenidos en el estudio de la remoción de cobre
de aguas contaminadas empleando ramnolípido
Un mayor tiempo de contacto entre la solución del biosurfactante y el agua contaminada
favorecería una mayor interacción de los cationes metálicos Cu2+ con los grupos quelantes del
ramnolípido, permitiendo su posterior extracción en forma de complejo ramnolípido-metal. De
igual forma, una mayor concentración de ramnolípidos permite que haya un mayor número de
moléculas del biosurfactante interactuando con los cationes disueltos, favoreciendo la remoción
del metal del agua.
La significación estadística de las variables estudiadas (tiempo de contacto, concentración y pH)
se comprobó mediante un Análisis de Varianza (tabla 3), donde se obtuvo que los factores
tiempo de contacto y concentración de la solución de ramnolípido tuvieron un P-valor menor
que 0,05, con un nivel de confianza del 95,0%.

Tabla 3 - Análisis del diseño experimental Box-Behnken utilizado para evaluar la influencia de tres
factores en la remoción de cobre de aguas contaminadas, empleando RL
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

A:t de 144,5 1 144,5 33,71 0,0021

contacto.
B:pH 0,845 1 0,845 0,20 0,6756
C: concent. de 266,805 1 266,805 62,25 0,0005
RL
AA 14,7692 1 14,7692 3,45 0,1225
AB 0,01 1 0,01 0,00 0,9633
AC 4,41 1 4,41 1,03 0,3570
BB 2,99077 1 2,99077 0,70 0,4416
BC 0,36 1 0,36 0,08 0,7836
CC 11,9631 1 11,9631 2,79 0,1556
Error total 21,43 5 4,286
Total (corr.) 470,429 14

R-cuadrada = 95,44 %, R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 87,24 %

Error estándar del est. = 2,07, Error absoluto medio = 0,71
Estadístico Durbin-Watson = 2,252 57 (P=0,585 3),
Autocorrelación residual de Lag 1 = -0,127 712
El modelo matemático que describe la relación entre el porcentaje de extracción de cobre y las
dos variables con influencia significativa está dado por la ecuación (2):

Cu (%) = 38,8 + 4,25*tiempo de contacto + 5,775*concentración de ramnolípidos (2)

El valor del coeficiente de determinación (r2) indica que este modelo explica el 95,4 % de la
variabilidad obtenida en el porcentaje de remoción del metal. La bondad del ajuste obtenida
por este modelo se comprobó con el gráfico de los resultados predichos versus los observados
(figura 2), donde se evidenció una distribución homogénea en las tres variables. El coeficiente
de correlación (r= 0,988 0) obtenido indica una relación relativamente fuerte entre los valores
experimentales y los determinados por el modelo ajustado.

%Cu

51

47

43
observados

39

35

31

27
27 31 35 39 43 47 51
p red ic ho s

Fig. 2 - Gráfico de valores predichos por el modelo matemático y los observados experimentalmente en
la remoción de cobre de aguas contaminadas empleando el ramnolípido

En la actualidad, los esfuerzos para lograr tecnologías eficaces para la remediación de aguas
contaminadas con metales pesados se han enfocado hacia el empleo de los ramnolípidos
combinado con otras técnicas físico-químicas o biológicas utilizadas para estos fines, con el
objetivo de aumentar la efectividad de las mismas, tal es el caso de la ultrafiltración micelar por
membrana21, la precipitación por flotación (8) y la fitorremediación.(22)

Conclusiones
Los ramnolípidos constituyen una opción ecocompatible para la remoción de metales pesados
de aguas contaminadas. En esta investigación se demostró las potencialidades del ramnolípido
producido por Pseudomonas aeruginosa ORA9 para la remoción de cobre de las aguas
contaminadas de la Laguna Azul del Cobre y la influencia que tiene el tiempo de contacto y la
concentración del biosurfactante en este proceso de remoción. Se determinó además el modelo
matemático que explica el proceso de remoción del metal. Esta investigación constituye un
antecedente necesario para establecer una tecnología adecuada.

Agradecimientos
Los autores del trabajo agradecen a la Universidad de Oriente, la Agencia Universitaria de la
Francofonía (AUF) Buró Caribe y la Embajada de Francia en Cuba, por el financiamiento a los
proyectos que sustentaron la investigación desarrollada. También agradecen a la Empresa
Geominera Oriente Sur por la colaboración en la consecución de los resultados.

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Conflicto de interés
Los autores expresan que no hay conflictos de intereses en el manuscrito presentado

Contribución de los autores

Odalys Rodríguez Gámez: Participó en la adquisición, interpretación y análisis de datos
experimentales. Participó en la evaluación de los resultados y escritura del manuscrito.
Rocio Pérez Macías: Participó en la adquisición, interpretación y análisis de datos
experimentales. Participó en la evaluación de los resultados y escritura del manuscrito.
Isabel Aguilera Rodríguez: Participó en la realización de los análisis químicos e interpretación de
los datos experimentales.
Rosa María Pérez Silva: Participó en el diseño y supervisión de la investigación, así como en la
discusión de los resultados, revisión y aprobación final del manuscrito.
Arelis Abalos Rodríguez: Participó en el diseño y supervisión de la investigación, así como en la
discusión de los resultados, revisión y aprobación final del manuscrito.