KLEBSIELLA

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Tipificación de aislados
clínicos de Klebsiella
pneumoniae por la técnica de
“Multilocus Sequence Typing”
T E S I S
P AR A OBTENER EL TÍ TULO DE:
QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO
P R E S E N T A:
ERIKA GABRIELA SIERRA ATANACIO
Directoras:
Dra. Silvia Giono Cerezo
Dra. Rosa González Vázquez
CIUDAD DE MÉXICO, SEPTIEMBRE DE 2016



LUGAR DE REALIZACIÓN
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de
Bacteriología Médica del Departamento de Microbiología de
la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN; bajo la
dirección de la Dra. Silvia Giono Cerezo y
de la Dra. Rosa González Vázquez.
Forma parte de los proyectos

Análisis genético de algunas especies productoras de infecciones intrahospitalarias
resistentes a carbapenemes del grupo Eskape, formación de biopelículas, zona de
plasticidad en Helicobacter pylori, inhibidores de marcador Lc-3 en autofagia de
Haemophilus, modelo in vitro de inflamasoma en ppt y rpm. Clave SIP: 20151821
Infecciones nosocomiales resistentes a antibióticos, biopeliculas in vitro en:

Klebsiella spp., Acinetobacter baumannii, Staphylococcus spp, Helicobacter pylori, PFGE,
enzimas multilocus, adherencia, autofagia. Inflamación e infección en parto pretérmino PT
ruptura RPM. Clave SIP: 20160618

ii

Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de
(MLST).
ÍNDICE
Índice de figuras v
Índice de tablas vii
Resumen viii
1.0 Introducción 1
1.1 Generalidades y taxonomía 1
1.1.1 Taxonomía de K. pneumoniae 1
1.1.2 Generalidades 2
1.2 Factores de virulencia. 3
1.2.1 Cápsula 4
1.2.2 Adhesinas 5
1.2.3 Resistencia a anticuerpos y lipopolisacáridos 6
1.2.4 Sideróforos 6
1.3 Importancia de infecciones nosocomiales (HAI) 6
1.3.1 K. pneumoniae en infecciones nosocomiales (HAI) 10
1.4 Resistencia a antibióticos 11
1.4.1 Antibióticos β-lactámicos 11
1.5 β-lactamasas 13
1.5.1 β-lactamasas de espectro extendido (BLEE’s) 14
1.5.2 Clasificación de las enzimas β-lactamasas 14
1.5.3 Métodos para detectar susceptibilidad a antibióticos 17
1.6 Métodos de evaluación de diversidad genética para 18
K. pneumoniae
1.6.1 Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE) 18
1.7 Tipificación de Secuencias Multilocus (MLST) 20
1.8 Antecedentes de MLST 23
2.0 Justificación 27
3.0 Objetivos 28
3.1 Objetivo general 28
3.2 Objetivos particulares 28
4.0 Material y métodos 29
4.1 Esquema general de trabajo 29
4.2 Material biológico 30
4.3 Aislamiento e identificación de cepas clínicas de K. pneumoniae 30
4.4 Conservación de aislados clínicos 30
4.5 Perfil de resistencia a antibióticos 31
4.5.1 Determinación de la prueba confirmatoria de BLEE´s 31
4.6 Tipificación molecular por MLST 32
4.6.1 Obtención de DNA 32
4.6.2 Amplificación de los genes constitutivos por PCR 32
4.6.3 Purificación del amplicón 33
4.6.4 Secuenciación 34
iii
Sierra Atanacio Erika Gabriela
(MLST).
4.6.5 Análisis bioinformático 35

4.6.5.1 Genotipificación por MLST 35
4.6.5.2 Asignación de los complejos clonales (CC) 35
4.6.5.3 Medición de la clonalidad 36
4.6.5.4 Análisis de las secuencias 36
4.6.5.5 Relación filogenética 36
5.0 Resultados 37
5.1 Determinación de la frecuencia del aislamiento de K. pneumoniae 37
de diferente origen clínico
5.2 Aislamiento e identificación de cepas clínicas de K. pneumoniae 39
5.3 Perfil de resistencia a antibióticos 40
5.3.1 Determinación de la prueba confirmatoria de BLEE´s 42
5.4 Tipificación molecular por MLST 44
5.4.1 Amplificación de los genes constitutivos por PCR 44
5.5 Análisis bioinformático 45
5.5.1 Genotipificación por MLST 45
5.5.2 Asignación de los complejos clonales (CC) 47
5.5.3 Medición de la clonalidad 49
5.5.4 Análisis de las secuencias 49
5.5.5 Relación filogenética 50
6.0 Discusión 52
7.0 Conclusiones 61
8.0 Bibliografía 62
9.0 Anexo 70
iv
(MLST).
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Morfología de Klebsiella pneumoniae. 2
Figura 2. Representación esquemática de los factores de virulencia en 4
. K. pneumoniae
Figura 3. Representación de la evasión de la fagocitosis 5
Figura 4. Estructura de los principales grupos de antibióticos β-lactámicos. 12
Figura 5. Mecanismo de acción del β–lactámico 13
Figura 6. Hidrolisis del anillo β-lactámico 13
Figura 7. Prueba confirmatoria de Doble Disco para la presencia de 18
. BLEE´s.
Figura 8. Esquema representativo de la electroforesis de campos pulsados 19
Figura 9. Procedimiento resumido del análisis por MLST 22
Figura 10. Esquema general de trabajo 29
Figura 11. Distribución geográfica de los 93 aislados de K. pneumoniae en 37
. los diferentes hospitales de la CDMX
Figura 12. Numero de aislados clínicos de K. pneumoniae 38
Figura 13. Morfología colonial característica de K. pneumoniae ATCC 39
700603
Figura 14. Pruebas bioquímicas para la identificación de los aislados 40
. clínicos de K. pneumoniae
Figura 15. Porcentaje de resistencia a diferentes antibióticos de los 93 41
aislados clínicos de K. pneumoniae
Figura 16. Prueba control para la confirmación de BLEE´s. 42
Figura 17. Prueba confirmatoria de 56 aislados clínicos positivos a 43
. BLEE´s.
Figura 18. Electroferograma de la amplificación por PCR de los genes 44
constitutivos de K. pneumoniae ATCC 700603
Figura 19. Porcentaje de ST´s. 45
Figura 20. Población “snapshot” de K. pneumoniae, análisis comparativo 48
. eBURST.
Figura 21. Árbol filogenético obtenido mediante el programa START 2 51
. v.0.9.0, por el método “Neighbor-joining”.
Figura 22. Búsqueda de la secuencia de K. pneumoniae correspondiente 74
. al alelo 1 del gen gapA.
Figura 23. Visualización de la secuencia con el programa FinchTv. 75
v
(MLST).
Figura 24. Creación del archivo de los genes secuenciados para su . 76

. análisis.
Figura 25. Visualización de ambas secuencias con el programa ClustalX 76
. versión 1.83.
Figura 26. Visualización de las secuencias en el programa BioEdit 77
. Sequence Alignment Editor.
Figura 27. Edición de nucleótidos con los programas FinchTV versión 78
. 1.4.0 y BioEdit Sequence Alignment Editor.
Figura 28. Secuencia editada del gen gapA. 79
Figura 29. Introducción de la secuencia analizada en la base de datos. 80
Figura 30. Obtención de la secuencia tipo de K. pneumoniae ATCC 81
. 700603 a partir del perfil alélico.
vi
(MLST).
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Taxonomía de K. pneumoniae 1
Tabla 2. Diferenciación por pruebas bioquímicas de las dos especies de 3
. relevancia médica de Klebsiella spp.
Tabla 3. Criterios simplificados para la vigilancia de las infecciones 9
. nosocomiales
Tabla 4. Infecciones nosocomiales causadas por K. pneumoniae 10
Tabla 5. Clasificación de las β-lactamasas. 16
Tabla 6. Genes constitutivos de K. pneumoniae para MLST 25
Tabla 7. Componentes de la mezcla de reacción para la PCR convencional 32
Tabla 8. Programa de amplificación para los genes constitutivos de 33
. K. pneumoniae
Tabla 9. Programa de amplificación para la secuenciación para los genes 34
. constitutivos de K. pneumoniae
Tabla 10. Aislados clínicos de K. pneumoniae positivas a la prueba 43
. confirmatoria de doble disco para la detección de BLEE’s
Tabla 11. Asignación de la secuencia tipo a partir de los perfiles alélicos. 46
Tabla 12. Características y polimorfismo de los genes “housekeeping” de los 49
. aislados de K. pneumoniae
Tabla 13. Frecuencia de alelos empleados en MLST para K. pneumoniae 82
vii
(MLST).
RESUMEN
Introducción. Klebsiella pneumoniae es un microorganismo oportunista asociado a
infecciones nosocomiales (HAI) como neumonías, septicemias, además de
infecciones de vías urinarias (IVU). La técnica de “Multilocus Sequence Typing” (MLST)
se emplea en estudios epidemiológicos, de evolución y tipificación molecular, que
permiten establecer la relación genética en aislados clínicos asociados a brotes
nosocomiales.
Objetivo. Establecer las relaciones genéticas de aislados clínicos de diferente origen

de K. pneumoniae resistentes (BLEE’s) y sensibles a β-lactámicos de espectro
extendido a través de la técnica de MLST.
Métodos. Se estudiaron 93 aislados clínicos de K. pneumoniae de origen diferente.
Se realizó la identificación por métodos convencionales de bacteriología, el
antibiograma se obtuvo por el sistema automatizado Vitek®; lo cual permitió la
agrupación en multidrogo-resistente (MDR), extremodrogo-resistente (XDR) y
pandrogo-resistente (PDR), las cepas BLEE’s positivas fueron confirmadas por la
prueba de doble disco. Se amplificaron, purificaron y secuenciaron los genes
constitutivos de 48 aislados clínicos de K. pneumoniae de diferente origen clínico, se
obtuvo el perfil alélico de cada aislado en la base de datos de Pasteur para MLST.
Resultados. Se aislaron e identificaron 93 cepas clínicas de K. pneumoniae, a partir

de urocultivos (49.5%, 46/93), seguidas de hemocultivos (21.5%, 20/93). La
resistencia a antibióticos determinó que el 46% (43/93) fueron MDR, 17% (16/93)
XDR y 1% (1/93) PDR, el 96% (89/93) fue resistente a ampicilina, 60% (59/93)
fueron positivas en la prueba confirmatoria BLEE´s. Se empleó la técnica de MLST
con siete genes constitutivos (rpoB, gapA, mdh, pgi, phoE, infB, y tonB) de K.
pneumoniae. Se obtuvieron 30 secuencia tipo (ST) (incluyendo a K. pneumoniae
ATCC 700603), y prevalecieron seis ST´s. El algoritmo de eBURST arrojó que la
población “snapshots” a nivel mundial es de tipo clonal. El análisis filogenético
determinó la relación entre las ST´s encontradas en el estudio.
Conclusión. Los aislados ST25, ST36, ST392, ST405 y ST551 se asociaron a

brotes nosocomiales debido a su prevalencia en el ambiente hospitalario; las ST405
y ST551 se encontraron en muestras clínicas y de superficie. La ST1088 solo fue
encontrada en superficies inertes, lo que representa un peligro para los pacientes
debido a que están inmunocomprometidos.
viii
(MLST).
1.0 INTRODUCCIÓN
1.1. Generalidades y taxonomía
1.1.1. Taxonomía de K. pneumoniae
El género Klebsiella fue descrito por primera vez por Von Frisch en 1881, quien
observó, en muestras de pacientes con rinoescleroma la presencia de este bacilo
capsulado; el nombre del género fue dado por por Trevisan en 1885, en honor al
microbiólogo alemán Edwin Klebs (Martínez et al., 2004).
En 1888 Friedlander describió a K. pneumoniae causante de neumonía. Esto se

dió mientras analizaba cultivos obtenidos en pacientes con neumonía lobar;
observó una bacteria Gram negativa única a la que se le nombro inicialmente
“bacilo de Friendlander” (Ledermann, 2007).
La clasificación de especies de Klebsiella (Tabla 1), se basó inicialmente en sus

características patógenas o de origen. Posteriormente, las claves taxonómicas
incluyeron: la utilización de sustratos y las actividades enzimáticas del
microorganismo. Pertenece a la familia de las enterobacterias y de acuerdo a los
criterios de Edwards y Edwin corresponde a la tribu Klebsielleae (Tabla 1.) (Kanki,
2002).
Tabla 1. Taxonomía de K. pneumoniae

Dominio: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Enterobacteriales
Familia: Enterobacteriaceae
Género y especie: Klebsiella pneumoniae
Tomado de Koneman, 2008.
1
(MLST).
1.1.2. Generalidades
Las especies del género Klebsiella spp. son microorganismos saprófitos, las
cuales pueden estar presentes como biota normal, principalmente en el tracto
respiratorio, es por ello que K. pneumoniae se considera un patógeno oportunista
responsable de causar infecciones nosocomiales, afectando a pacientes
inmunocomprometidos (Arenas et al., 2009).
K. pneumoniae es bacilo Gram negativo, catalasa (+), oxidasa (-), las colonias son
de consistencia mucoide, en gelosa MacConkey estas colonias son lactosa
positivas (Figura 1) (Koneman, 2008).
a) b)
Figura 1. Morfología de Klebsiella pneumoniae. a) Morfología microscópica por tinción

de Gram vista en microscopio electrónico; b) Morfología Colonial en MacConkey,
colonias lactosa positivas (Tomado de Laboratorio de Bacteriología de ENCB).
2
(MLST).
Existen varias especies del género Klebsiella spp.; sin embargo, las especies de
interés medico son: K. pneumoniae y K. oxytoca, es por ello que su identificación a
través de la prueba bioquímica de indol es de suma importancia (Tabla 2). Otras
especies del género son: K. granulomatis, K. variicola K. alba, K. aerogenes, K.
senegalensis, K. singapurensis y K. milletis según la clasificación
taxonómica actual del Genebank (Pumarola et al., 1991; Izquierdo, 2003).
Tabla 2. Diferenciación por pruebas bioquímicas de las dos especies de

relevancia médica de Klebsiella spp.
Prueba bioquímica K. pneumoniae K. oxytoca
Indol - +
Lisina + +
Ornitina - -
Fermentación de lactosa + +
Voges-Proskauer + +
Rojo de Metilo - -
Producción de gas + +
Citrato de Simmons + +
Urea + +
ONPG + +
KCN + +
Movilidad - -
ONPG: o-nitrofenil- β D-galactopiranósido; KCN Cianuro de potasio. Tomado de
(Koneman, 2008).
1.2. Factores de virulencia
Los principales factores de virulencia asociados a K. pneumoniae son:

adhesinas, polisacáridos capsulares, sideróforos y lipopolisacáridos (LPS) para la
evasión de las células inmunes del huésped (Figura 2) (Vargas, 2010). 2010)
3
(MLST).
Figura 2. Representación esquemática de los factores de virulencia en

K. pneumoniae. Se señala los cinco factores de virulencia que presenta K. pneumoniae:
capsula, adhesinas, lipopolisacáridos (LPS), resistencia a anticuerpos y sideróforos
(Vargas, 2010).
1.2.1. La cápsula
La cápsula está compuesta de polisacáridos y ácidos complejos (ácido urónico),

existen 77 tipos serológicos. Las cápsulas son esenciales para la virulencia
(Highsmith y Jarvis, 1985). Los tipos capsulares más virulentos descritos son: 4
(K1, K2, K4 y K5). La virulencia asociada a la cápsula está relacionada con el
contenido de manosa, estos residuos son reconocidos por lectinas de superficie
de los macrófagos, lo cual modula la fagocitosis de forma independiente de
anticuerpos y estimula la unión del complemento (Yu et al., 2007). La presencia
de la cápsula favorece la evasión de la fagocitosis por células polimorfonucleares
(PMN) y evita la muerte por anticuerpos y complemento. En la figura 3, se observa
la inhibición de la activación o la absorción de los componentes del complemento,
especialmente C3b (Ullmann y Podschun, 1998; Vargas, 2010).
4
(MLST).
Figura 3. Representación de la evasión de la fagocitosis. La cápsula cubre al

complemento C3b, el cual evita que este sea reconocido por su receptor, evade la
fagocitosis (URL 1, 2015).
1.2.2. Adhesinas
Las propiedades adhesivas están mediadas generalmente por diferentes tipos de

pili; que son proyecciones filamentosas no flagelares sobre la superficie de la
bacteria. Estas estructuras son de hasta 10 µm de largo y tienen un diámetro de
1 a 11 nm; constan de subunidades de proteínas globulares poliméricos (pilina)
con una masa molecular de 15 al 26 kDa. Hay dos tipos predominantes en
K. pneumoniae: el tipo 1 pili (Hemaglutinina manosa sensible, MSHA, por sus
siglas en inglés) y el tipo 3 pili (Hemaglutinina resistente a manosa, MR/K-HA, por
sus siglas en inglés) (Sahly et al., 2008). El tipo 1 promueve la adherencia del
microorganismo a las células del tracto respiratorio, ocasiona la proliferación de
bacterias patógenas produciendo neumonía, principalmente en pacientes con
ventilación mecánica a largo plazo, también se encuentra asociada a infecciones
de vías urinarias (IVU) y pielonefritis. El tipo 3, interviene en la adherencia a las
células endoteliales del tracto respiratorio y urinario además de su probable
participación en la formación de biofilm o biopelículas en superficies inertes
(Ullmann y Podschun, 1998; Vargas, 2010).
5
(MLST).
1.2.3. Resistencia a anticuerpos y lipopolisacáridos
La acción bactericida del suero es mediada principalmente por proteínas, en

particular las proteínas del complemento C5b-C9 que se acumulan en la superficie
del microorganismo formando un poro, por el cual se lleva a cabo un influjo de
Na+ que provoca lisis osmótica de la bacteria (Ramm et al., 1983). La porción “O”
del Lipopolisacárido (LPS) protege a la bacteria contra la muerte mediada por el
complemento, las cadenas laterales de la porción “O” del LPS pueden atravesar
la capa de la cápsula y ser expuestas al entorno exterior de la cápsula (Ullmann y
Podschun, 1998; Vargas, 2010).
1.2.4. Sideróforos
Los sideróforos son moléculas orgánicas de bajo peso molecular con una alta
afinidad por los iones Fe3+. El hierro es esencial en las bacterias para: crecer,
sobrevivir, y sintetizar factores de virulencia (cápsula, adhesinas, toxinas) (Reyes,
2005).
1.3. Importancia de infecciones nosocomiales (HAI)
Las Infecciones Nosocomiales (“Healthcare associated infections”, HAI, por sus

siglas en inglés), actualmente llamadas infecciones asociadas a la atención de la
salud (IAAS), son un problema relevante de salud pública de gran trascendencia
económica y social, por lo que constituyen un desafío para las instituciones de
salud y el personal médico responsable de su atención. Las HAI se asocian con
altas tasas de morbilidad y mortalidad, lo que se traduce no solo en un incremento
en los días de hospitalización sino en los costos de atención (RHoVE, 2015).
6
(MLST).
Las HAI son infecciones que se adquieren 48 h posteriores al ingreso del paciente
en una unidad hospitalaria, en el cual la infección no se había manifestado ni
estaba en período de incubación en el momento de ingreso del mismo; afectan
principalmente a pacientes inmunocomprometidos (OMS, 2003). D. Siegel, 2007)
La Norma Oficial Mexicana NOM-EM-002-SSA2-2003, para la vigilancia

epidemiológica, prevención y control de las infecciones nosocomiales y la NOM-
045-SSA2-2005, para la vigilancia epidemiológica, prevención y control de las
infecciones nosocomiales definen a una infección nosocomial como la
multiplicación de un patógeno dentro del cuerpo del paciente y que puede o no dar
sintomatología y que fue adquirido durante la hospitalización.
Una encuesta de prevalencia realizada en el 2003 por la OMS en 55 hospitales de

14 países representativos de 4 Regiones de la OMS (Europa, el Mediterráneo
Oriental, el Asia Sudoriental y el Pacífico Occidental) mostró que en promedio el
8,7% de los pacientes hospitalizados presentaba HAI (OMS, 2003).
Las infecciones más frecuentes de HAI son: neumonía (vías respiratorias), IVU
(infecciones de vías urinarias), septicemia, heridas (quemaduras) y aquellas
adquiridas en terapia intensiva La prevalencia de infecciones nosocomiales ocurre
en unidades de cuidados intensivos (UCI) y en pabellones quirúrgicos y
ortopédicos de atención de enfermedades agudas, la principal preocupación con
las HAI es la resistencia a los antibiótico causando que la infección sea más
severa (Jane, 2007; OMS, 2003).
En los años 2006 y 2007, datos de “National Healthcare Safety Network” (NHSN,
por sus siglas en inglés) demostraron que Escherichia coli y Pseudomonas
aeruginosa fueron los microorganismos Gram-negativos más frecuentemente
aislados en HAI, entre otros microorganismos también mencionados son:
K. pneumoniae, especies de Enterobacter, Acinetobacter baumannii, y K. oxytoca
(Hidron et al., 2008).
7
(MLST).
En un estudio de prevalencia de HAI realizado en México durante el 2011 por la

Secretaría de Salud en hospitales generales de las principales instituciones
públicas de salud en el país, se encontró que el 21% de los pacientes
hospitalizados presentaban HAI, lo cual es más del doble de los estándares
internacionales (RHoVE, 2015).
Los procedimientos invasivos juegan un papel importante en el desarrollo de HAI,

además de las condiciones predisponentes del huésped que evidentemente son
relevantes. Las condiciones que predisponen a la adquisición de HAI son: la
inmunosupresión, ya sea por fármacos o por la enfermedad de base; los
trastornos de la deglución que acompañan al paciente que ha sufrido un accidente
vascular cerebral, situación que comporta un elevado riesgo de infección
respiratoria por aspiración, aquellas relacionadas con la colonización
por Staphylococcus aureus, frecuente en pacientes con insuficiencia renal crónica
(IRC), cirrosis hepática o diabetes mellitus, y que suponen un riesgo elevado de
infección por dicho microorganismo durante el ingreso hospitalario (Paterson et
al., 2004).(Paterson
Se han establecido criterios para identificar las HAI en determinados sitios del
organismo (Tabla 3). Las cuales derivaron de las definiciones publicadas por los
Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) en los Estados
Unidos de América o durante conferencias internacionales, los cuales se usan
para la vigilancia de las mismas (OMS, 2003).
8
(MLST).
Tabla 3. Criterios simplificados para la vigilancia de las infecciones nosocomiales
Tipo de infección nosocomial Criterios simplificados
Infección del sitio de una Cualquier secreción purulenta, absceso o celulitis difusa en el
intervención quirúrgica sitio de la intervención quirúrgica en el mes siguiente a la
operación
Infección urinaria Cultivo de orina con resultados positivos (1 ó 2 especies) al

menos con 105 bacterias/ml con síntomas clínicos o sin ellos.
Infección respiratoria Síntomas respiratorios con manifestación de por lo menos

dos de los siguientes signos durante la hospitalización: tos,
esputo purulento, nuevo infiltrado en la radiografía del tórax,
compatible con infección.
Infección del sitio de inserción de Inflamación, linfangitis o secreción purulenta en el sitio de

un catéter vascular inserción del catéter.
Septicemia Fiebre o escalofrío y por lo menos un cultivo de sangre con

resultados positivos.
Tomado de (OMS, 2003)
Las HAI también pueden considerarse endémicas o epidémicas. Las infecciones

endémicas son las más comunes, se dan dentro de la unidad hospitalaria y
permanecen durante un tiempo determinado en un lugar concreto, que afecta a
un número importante de personas y son consideradas: bacteriemia relacionada
con catéter, neumonía asociada a ventilación mecánica, infección de la herida
quirúrgica y la infección de vías urinaria (UVI) asociada a catéter vesical. Mientras
que, las infecciones epidémicas están relacionado con brotes, definidos
epidemiológicamente como un aumento inusual del número de casos de una
determinada enfermedad en una población específica, en un periodo de tiempo
determinado. El primer brote investigado por el CDC se publicó en 1956, y a partir
de este momento y especialmente en las últimas 2 o 3 décadas han existido
brotes epidémicos en los hospitales de la mayoría de los países del mundo y se
considera actualmente como un problema creciente. Las técnicas basadas en
Biología Molecular son de gran ayuda en la diferenciación de brotes epidémicos y
distingue dentro de un problema endémico (Horcajada y Padilla, 2013)
9
(MLST).
1.3.1. K. pneumoniae en infecciones nosocomiales (HAI)
K. pneumoniae es un patógeno oportunista relacionado con infecciones

nosocomiales en unidades de cuidado intensivo y salas de pediatría, empleando
como tratamiento el uso β-lactámicos sin embargo, se aíslan cada vez con más
frecuencia cepas productoras de BLEE´s, el problema es aún mayor, ya que al
ser más difíciles de tratar aumenta la tasa de mortalidad (Sanchez et al.,
2011).(Isabel Sánchez-Romero, 2011)
K. pneumoniae se describe como el cuarto patógeno causante de HAI y ha sido

asociada a un 2-5% total de las mismas y el 36% fueron productores de BLEE´s,
cuya resistencia a cefalosporinas de tercera generación se ha incrementado
significativamente (Morones et al., 2016).
Vargas y cols., 2010, determinaron cuales son los principales tipos de infección
nosocomial, Tabla 4 (Vargas, 2010). (Merino S, 1992)
Tabla 4. Infecciones nosocomiales causadas por K. pneumoniae

Infección % De las infecciones causadas por
Klebsiella
Unidad de Terapia Intensiva (UTI) 6-17
Neumonía 7-14
Septicemia 4-15
Infecciones de herida 2-4
Otras infecciones nosocomiales en 4-17
pacientes de la unidad de cuidados
intensivos (UCI)
Septicemia neonatal 3-20
Tomado de Vargas, 2010
Los datos proporcionados por la RHoVE demuestran un incremento en la

resistencia a antibióticos entre los principales géneros son: Klebsiella spp.,
Acinetobacter spp., y Pseudomonas spp., presentan un problema hospitalario, por
lo que es importante estudiar su epidemiología (Sydnor y Trish, 2011).
10
(MLST).
1.4 Resistencia a antibióticos
La aparición de resistencia a múltiples antibióticos en bacterias patógenas se ha

convertido en una amenaza significativa para la salud pública. Los antibióticos
para enterobacterias se clasifican en 17 categorías, el cual contiene agentes
antimicrobianos. Magiorakos y cols, 2012 propusieron la agrupación en
multidrogo-resistente (MDR “multidrug-resistant”), extremodrogo-resistente (XDR
“extensively drug-resistant”) y pandrogo-resistente (PDR “pandrug-resistant”), para
Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Enterobacterias, Pseudomonas
aeruginosa y Acinetobacter spp. En las enterobacterias, se describe a una cepa
MDR; como aquellas que presenten resistencia en un agente de al menos 3
categorias de antibióticos o más; XDR, son las cepas que tienen resistencia a un
agente de todos las categorias de antibióticos o menos 2 categorias; PDR, son
aquellas que tienen resistencia a todos los agentes de todas las categorias
(Magiorakos et al., 2012).
1.4.1 Antibióticos β-lactámicos
Los β-lactámicos son un grupo de antibióticos inocuos para el hombre ya que,

actúan sobre la pared celular de los microorganismos, porque bloquean a las
enzimas biosintéticas de la pared que sintetizan a los peptidoglicanos que solo se
encuentran en las células procariotas y no tiene homólogo en las células animales
eucariotas (Reyes, 2005).
Los antibióticos β-lactámicos presentan en su estructura química un anillo

β-lactámico que puede fusionarse con otros anillos y tener distintos sustituyentes,
dando lugar a cuatro grandes grupos de antibióticos: penicilinas, cefalosporinas,
carbapenémicos y monobactámicos (Figura 4) (Paterson y Bonomo, 2005).
(Paterson D, 2005)
11
(MLST).
Figura 4. Estructura de los principales grupos de antibióticos β-lactámicos.

Presentan el anillo β-lactámico con sus distintos sustituyentes (Paterson y Bonomo,
2005).
Los antibióticos β-lactámicos son agentes bactericidas que producen su efecto

principalmente a través de 2 mecanismos: inhibición de la síntesis de la pared
bacteriana e inducción de la autolisis bacteriana (Suárez y Gudiol, 2009).
El anillo β-lactámico presenta una similitud estructural con la región del

pentapéptido al que se unen las enzimas PBP (“penicillin binding protein”, proteína
de unión a penicilina), de forma covalente e impide la formación de la pared
celular, por lo tanto la bacteria muere debido a cambios en la presión osmótica.
Para que actúen los β-lactámicos, es preciso que la bacteria se encuentre en fase
de multiplicación, ya que éste es el momento en el que se sintetiza la pared celular
(Figura 5) (Suárez y Gudiol, 2009). (Suárez, 2009)
12
(MLST).
Figura 5. Mecanismo de acción del β–lactámico. El β-lactámico inhibe la formación

de la pared celular causando la inestabilidad en la bacteria y ocasiona su muerte
(Paterson y Bonomo, 2005).
1.5 β- lactamasas
Las β-lactamasas son enzimas codificadas cromosomalmente en el DNA o por

plásmidos. Interactuan con los antibióticos β-lactámicos, hidrolizan el anillo β-
lactámico dan como producto una molécula con un grupo carboxilo inactivando al
antibiótico y no puede ejercer su acción, como se observa en la figura 6. (Suárez y
Gudiol, 2009).
Figura 6. Hidrólisis del anillo β-lactámico. Al actuar la enzima β-lactamasa rompe el

enlace C-N, evitan que el antibiótico β-lactámico ejerza su acción (Suárez y Gudiol,
2009).
13
(MLST).
1.5.1 β-lactamasas de espectro extendido (BLEE’s)
Las β-lactamasas de espectro extendido (BLEE, por sus siglas en inglés) son un
grupo de rápida evolución que comparten la capacidad de hidrolizar cefalosporinas
de tercera, cuarta generación y el aztreonam; son inhibidas por el ácido
clavulánico. Las cepas productoras de BLEE’s tienen mayor potencial de
patogenicidad que las no productoras. En la última década se han generado
infecciones de K. pneumoniae multiresistentes (Rocha, 2006). El primer informe
de plásmidos que codifican para β-lactamasas que hidrolizan las cefalosporinas de
amplio espectro se publicó en 1983 (Knothe et al., 1983).
La primera β-lactamasa mediada por plásmidos se denominó TEM-1, la cual fue

descrita en 1965 en E. coli, dicha enzima es capaz de hidrolizar ampicilina a una
velocidad mayor que las β-lactamasa codificadas en el DNA y tiene una actividad
insignificante contra cefalosporinas de amplio espectro. La enzima TEM-2 descrita
posteriormente y tiene el mismo perfil hidrolítico de TEM-1 sin embargo, difiere de
TEM-1 por tener un promotor nativo más activo y una diferencia en el punto
isoeléctrico. En 1983, se describió la β-lactamasa SHV-1 (sulfridrilo variable) la
cual es producida por la gran mayoría de cepas de Klebsiella pneumoniae.
(Paterson y Bonomo, 2005; Pérez et al., 2007).
1.5.2 Clasificación de las enzimas β-lactamasas
Las β-lactamasas se clasifican de acuerdo a dos esquemas: clasificación

molecular de Ambler y la clasificación funcional de Bush, Jacoby y Medeiros. La
clasificación de Ambler las divide en cuatro clases de β-lactamasas (A-D).
Basandose en la homología que presentan las proteínas. Las clases A, C y D son
serin-β-lactamasas y la clase B son metalo-β-lactamasas (Ambler, 1980; Bush y
Jacoby, 2010).
14
(MLST).
La clasificación de Bush-Jacoby-Medeiros también consta de cuatro grupos así

como diversos subgrupos la cual se muestra en la tabla 5. Esta clasificación se
basa en las características funcionales, de las enzimas además de tomar en
cuenta diversos criterios tales como las propiedades bioquímicas (peso molecular
y secuenciación de nucleótidos), las propiedades físicas (punto isoeléctrico), el
espectro de hidrólisis, de inhibición y la codificación (plasmídica o cromosómica).
Esta clasificación es mucho más importante en el diagnóstico microbiológico de
laboratorio; ya que considera los substratos y los inhibidores de las β-lactamasas
clínicamente relevantes (Bush, 1995; Bush y Jacoby, 2010).
15
(MLST).
Tabla 5. Clasificación de las β-lactamasas.
Grupo funcional
Tipo
De Bush, Jacoby- Inh
molecular Atributos de las Beta-lactamasas en el grupo funcional
Medeiros AC
De Ambler
Grupo Subgrupo
Amp C β -lactamasas en bacterias Gram-negativas.
Los genes a menudo son cromosómicos pero pueden
1 C - ser plásmido-codificados. Confiere resistencia a todos
los tipos de β –lactámicos, excepto las carbapenasas,
no son inhibidas por el ácido clavulánico.
Incluyen penicilinasas estafilocócica y enterocóccica.
2a A +
confiere alta resistencia a las penicilinas
B-lactamasas de amplio espectro, incluyen TEM-1 y
2b A +
SHV-1, primordialmente de bacterias Gram negativas.
Las β-lactamasas de espectro extendido (BLEEs)
2b,c A + confieren resistencia a las penicilinas, oxyimino-
cefalosporinas y monobactámicos (aztreonam)
2 β- lactamasas tipo TEM y una tipo SHV que son
2br A +/-
resistentes a los inhibidores.
2c A + Enzimas que hidrolizan la carbenicilina
Enzima que hidrolizan la cloxacina (oxacilina):inhibidas
2d D +/-
moderadamente
2e A + cefalosporinasas
Enzimas que hidrolizan los carbapenemes con serina
2f A +
en la zona activa.
Metalo-beta-lactamasas que confieren resistencia a los
carbapenemes y todos los tipos de beta-lactámicos
3 3a,3b,3c B -
excepto los monobactámicos. No inhibidas por el ácido
clavulánico.
Penicilinasas que no caben en otro grupo. No son
4 ND -
inhibidas por el ácido clavulánico.
Inh: inhibidores; AC: ácido clavulánico Tomado de Bush y Jacoby, 2010
16
(MLST).
1.5.3 Métodos para detectar susceptibilidad a antibióticos
El “estándar de oro” para el estudio de la resistencia a antibióticos es la

determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI o MIC por sus siglas en
inglés) la cual se hace por la técnica de dilución en caldo o en agar sin embargo,
debido a que su realización es poco práctica en la rutina diaria del laboratorio de
Microbiología se ha recurrido a técnicas como la prueba de difusión con disco y los
métodos de microdilución en caldo, empleados en los sistemas de identificación
automatizados y en estudios de sensibilidad antimicrobiana, en nuestro país
principalmente por las marcas comerciales automatizados: Vitek® (BioMerieux),
Phoenix® (Becton Dickinson) y MicroScan® (DadeBehring) (Vargas, 2010; CLSI,
2014).
Los resultados arrojan la sensibilidad de los antibióticos, lo cual permite evaluar si

la cepa presenta BLEE´s, para ello se realiza la prueba confirmatoria de doble
disco (DD) según las recomendaciones de la CLSI, 2014. A partir de una
suspensión bacteriana ajustada al 0.5 de la escala McFarland, se siembra
masivamente en medio Mueller- Hinton (MH), se colocan los discos de: cefotaxima
(CTX) 30µg y CTX + ácido clavulánico 30µg/10µg; ceftazidima (CAZ) 30µg, CAZ +
Acido clavulánico 30µg/10µg, a una distancia de 20-30 mm de centro a centro. El
resultado será positivo si se observa un incremento en el diámetro del halo de
inhibición (≥5 mm), alrededor del sensidisco CTX ó CAZ más ácido clavulánico, en
comparación del que no tiene ácido clavulánico (Figura 7) (CLSI, 2014).
17
(MLST).
Figura 7. Prueba confirmatoria de Doble Disco para la presencia de BLEE´s. Se

observa un aumento en el halo de inhibición cuando se combina cefalosporina + ácido
clavulánico en relación a cuando solo se usa la cefalosporina (URL 2, 2016).
1.6 Métodos de evaluación de diversidad genética para K. pneumoniae
1.6.1 Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE)
La técnica de PFGE se basa en la separación de las moléculas, en función a la

capacidad de corrimiento en un gel de agarosa que es sometido a un campo
eléctrico pulsante, de tal manera que la velocidad de los mismos será
directamente proporcional a su tamaño (Vimont et al., 2008). Los dos ángulos de
los campos eléctricos se encuentran cerca a la perpendicularidad, no son
uniformes en la intensidad de campo y cambian de manera alterna (pulsos)
(Cardozo et al., 2013).
18
(MLST).
En un gel de forma rectangular un campo es homogéneo y genera así dos filas

de electrodos de puntos ubicados paralelamente y en lados opuestos del gel; el
otro campo no es homogéneo y es generado por una fila de electrodos de puntos
como cátodo y un electrodo de punto al lado opuesto como ánodo, figura 8
(Cardozo et al., 2013).
Figura 8. Esquema representativo de la electroforesis de campos pulsados. Del lado

izquierdo se observa el corrimiento electroforético a diferentes ángulos, del lado derecho
el gel revelado; en donde se observan las bandas de corrimiento (Cardozo et al., 2013).
Las variaciones se pueden presentar en el voltaje, la concentración del gel de

agarosa, el tiempo, los pulsos, la fuerza iónica del amortiguador y la temperatura.
Los resultados permiten distinguir entre cepas idénticas con 100% de similitud y
cepas relacionadas con 80% de similitud (Vimont et al., 2008).
Los perfiles de DNA (pulsotipos) presentan entre 10 y 30 fragmentos de DNA con

un tamaño variable, que oscila entre 10 y 800 kb. La interpretación de los
pulsotipos se realiza aplicando los criterios de Tenover y cols, 1995. Esta técnica
permite la separación de fragmentos de mayor tamaño (hasta 1.000 kb); es
altamente reproducible y tiene un poder de discriminación elevado (Tenover et al.,
1995; Cardozo et al., 2013)
19
(MLST).
1.7 . Tipificación de Secuencias Multilocus (MLST)
La secuencia de multilocus (MLST) es un método basado en la amplificación y

secuenciación de genes denominados “housekeeping” (genes constitutivos), que
caracteriza a aislados bacterianos. La secuencia de DNA de cada gen tiene un
tamaño aproximado de 450-500 pb. Las secuencias analizadas pueden asignarse
como alelos, cada uno de los siete loci elegidos, definen un perfil alélico o
secuencia tipo (ST “sequence type”), figura 9. La gran ventaja de la MLST es que
los datos de las secuencias se almacenan y se pueden comparan con una base
de datos central, a través de Internet en contraste con la mayoría de los
procedimientos de tipificación que implican la comparación de tamaños de los
fragmentos de DNA en geles de agarosa (Vázquez y Berrón, 2004; URL 3).
La aplicación de la MLST es descubrir variantes alélicas en varios genes

conservados generalmente se estudian siete genes, para la caracterización de
cepas bacterianas. MLST examina múltiples genes de limpieza que codifican
proteínas con funciones escenciales; por lo que la variación observada en estas
secuencias es, por tanto, neutra o casi neutra (Maiden et al., 1998).
Las características de cada gen “housekeeping”, así como de los fragmentos

internos de éstos, se utiliza en métodos de diversidad genética y debe ser
realizada para cada especie bacteriana de forma individual. Los genes utilizados
deberán estar lo mas repartidos posible a lo largo del cromosoma bacteriano, no
deberán estar flanqueados en ninguno de sus extremos por genes codificantes de
proteínas sometidas a presión selectiva; se seleccionan los siete genes que
ofrezcan un mayor grado de polimorfismo.
El análisis de los resultados MLST se realiza vía internet, existen bases de datos
para cada microorganismo (http://mlst.net) y que permite al usuario realizar
consultas de alelos, perfiles alélicos, de aislados específicos con objeto de
conocer su relación con otros aislados incluidos en la base (URL 4).
20
(MLST).
La secuencia del análisis de los resultados es la siguiente (URL 4):
1. Amplificación y posterior secuenciación de los fragmentos variables de los siete

genes previamente seleccionados. La secuencia de cada uno de los loci se alinea
con las ya existentes en una base de datos centralizada. Si la secuencia coincide,
el programa asigna uno de los alelos ya identificados; en caso contrario, asigna un
nuevo número a ese nuevo alelo. La asignación de los alelos se realiza de forma
inequívoca al secuenciar ambas hebras de DNA, por lo que las variaciones en la
secuencia de DNA son de esta forma "autentificadas".
2. Una vez asignado un número a cada alelo, se genera un perfil alélico que será
producto de la combinación de los siete alelos ya asignados.
3. Después de la designación de los perfiles alélicos se realiza una comparación

entre cepas.
21
(MLST).
Figura 9. Procedimiento resumido del análisis por MLST. Se señalan los pasos
indispensables para la aplicación de la técnica de MLST (Vázquez y Berrón, 2004).
MLST es un método adecuado para la investigación a largo plazo de la población

bacteriana con una alta tasa de recombinación genética. Aunque su desventaja es
ser una técnica muy laboriosa y costosa (Vázquez y Berrón, 2004).
22
(MLST).
1.8 Antecedentes de MLST
La técnica de MLST es empleada en diversas bacterias y levaduras: Bacillus

cereus, Bartonella henselae, Borrelia burgdorferi, Burkholderia pseudomallei,
Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis, Enteroccocus faecalis, E. faecium,
Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter. pylori, Leptospira spp.,
Moraxella catarrhalis, Neisseria meningitidis, Propionibacterium acnes, Salmonella
enterica, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae,
S. pneumoniae, S. pyogenes, S. suis, Vibrio vulnificus, Candida albicans,
C. glabrata, C. krusei, Cryptococcus neoformans var grubii (URL 4).
La MLST fue desarrollado originalmente para cepas de N. meningitidis; causante

de meningitis y septicemia a nivel mundial.se emplearon fragmentos internos de
los siguientes genes: abcZ (transportador ABC), adk (adenilato kinasa), aroE
(sikimato deshidrogenasa), fumC (fumarato hidratasa), gdh (glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa), pdhC (piruvato deshidrogenasa), pgm (fosfoglucomutasa). La
MLST proporcionó diferencias significativas entre las cepas debido a eventos
mutacionales o de recombinación, lo cual permitió hacer el reconocimiento
confiable de aislados hipervirulentos de N. meningitidis (Maiden et al., 1998).
Los trabajos previos sobre análisis de poblaciones bacterianas en S. pneumoniae

indicaban que el microorganismo presentaba procesos de recombinación
frecuentes, describiendo así, clonas virulentas en 16 de los más de 90 serotipos
que causan más del 90% de las enfermedades invasivas. Enright y cols.,1998,
emplearon la técnica de MLST en aislados de S. pneumoniae donde utilizaron los
genes constitutivos siguientes: aroE (shikimato deshidrogenasa), gdh (glucosa-6-
fosfato deshidrogenasa), gki (glucosa quinasa), recp (transcetolasa), spi (señal
peptidasa I), xpt (xantina fosforribosil transferasa) y ddl (D-alanina-D-alanina
ligasa), y encontraron 12 clonas virulentas. Por lo tanto, fue posible hacer la
identificación correcta de estas clonas y además de que permite conocer con gran
23
(MLST).
precisión el grado de dispersión a nivel mundial así como la posible adquisición de

nuevos determinantes de resistencia por las mismas (Enright y Spratt, 1998).
Enright y cols, 2000 demostraron la utilidad del método mediante la identificación

de las clonas de MRSA (S. aureus resistente a meticilina) y MSSA (S. aureus
sensible a meticilina) en aislamientos de pacientes con HAI. El esquema de MLST
utilizo fragmentos internos de siete genes constitutivos: arcC (carbamato quinasa),
aroE (shikimato deshidrogenasa), glp (glicerol cinasa), gmk (guanilato quinasa),
pta (fosfato acetiltransferasa), tpi (isomerasa triosafosfato) y yqiL (acetil CoA
acetiltranferasa). El desarrollo de MLST permitió definir con precisión cómo las
cepas sensibles a meticilina pertenecian generalmente a las mismas clonas que
las cepas MRSA “Meticilin resistent S.aureus” (Enright et al., 2000).
La primera publicación que describe a un microorganismo diferente fue realizado

por Bougnoux y cols., 2002, usaron 7 genes housekeeping de C. albicans (Hongo
diploide): AAT1a, ACC1, ADP1, MPIb, SYA1, VPS13 y ZWF1b. Observaron
cambios a pequeña escala en las frecuencias alélicas, acuñando el término
"microvariación" para describir la secuencia de cambios de los genes individuales
(Bougnoux et al., 2002; Odds y Jacobsen, 2008).
Diancourt y cols., 2005 reportaron el primer trabajo sobre MLST en cepas

nosocomiales de K. pneumoniae. Los genes se seleccionaron: de acuerdo a su
localización en el cromosoma (lejano uno de otro), con base a la disponibilidad de
los inicidores y para tonB, basado en la variación de nucleótidos conocida
(Tabla 6). Artículo en el que está basado nuestro trabajo de investigación
(Diancourt et al., 2005).
24
(MLST).
Tabla 6. Genes constitutivos de K. pneumoniae para MLST

Loci Función Iniciadores Secuencias 5´---------3´ Talla
pb
Subunidad β Vic3 GGCGAAATGGCWGAGAACCA
rpoB de la ARN 501
polimerasa Vic2 GAGTCTTCGAAGTTGTAACC
Malato mdh130 CCCAACTCGCTTCAGGTTCAG

mdh 477
deshidrogenasa mdh867 CCGTTTTTCCCCAGCAGCAG
pgi1F GAGAAAAACCTGCCTGTACTGCTGG
pgi1R CGCGCCACGCTTTATAGCGGTTAAT
Fosfoglucosa
pgi CTG CTG GCG CTG ATC GGC AT 432
isomerasa pgi2F(seq)
pgi2R(seq) TTA TAG CGG TTA ATC AGG CCG T

phoE604. ACCTACCGCAACACCGACTTCTTCGG
phoE Fosforina E 420
phoE604. TGATCAGAACTGGTAGGTGAT
infB1F CTCGCTGCTGGACTATATTCG
Factor de
infB1R CGCTTTCAGCTCAAGAACTTC
infB iniciación de la 318
traducción ACT AAG GTT GCC TCC GGC GAA
infB2F(seq)
GC
Gliceraldehído gapA173 TGAAATATGACTCCACTCACGG
gapA 3-fosfato 450
deshidrogenasa gapA181 CTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT
Transductor de tonB1F CTTTATACCTCGGTACATCAGGTT

tonB energía 414
Periplasmica tonB2R ATTCGCCGGCTGRGCRGAGAG
Tomado de Diancourt et al., 2005.
En el 2008 Vimont y cols., compararon ante la técnica de PFGE y la de MLST en

cepas de K. pneumoniae en donde se concluyó que la caracterización por
diferentes métodos tuvo concordancia; sin embargo, el método MLST fue el más
apropiado para determinar la filogenia y la epidemiología a gran escala (Vimont
et al., 2008).
25
(MLST).
Kitchel y cols., 2009, examinaron la epidemiología molecular de cepas productoras

de carbapenemes en K. pneumoniae provenientes del Centro para el Control y
Prevención de Enfermedades (CDC), a las cepas que presentaron un patrón de
PFGE ≥80% de similitud se aplicó MLST, dando una ST258. Sin embargo, el
poder discriminatorio de MLST fue menor que el de PFGE, lo cual representa una
ventaja en la identificación de complejos clonales internacionales (Kitchel et al.,
2009).
En el año 2013 en Beijing Wang y cols., determinaron la diversidad genética de

175 aislados de K. pneumoniae procedentes de HAI, el 63,8% (n=104) fueron
MDR, se detectaron 70 ST´s; 37 ST´s correspondia a una única cepa, mientras 23
ST´s fueron encontradas de 2 a los 17 aislados. Concluyeron que las clonas
resistente a fármacos son las mayormente transmisibles, causando HAI (Wang et
al., 2013).
26
(MLST).
2.0 JUSTIFICACIÓN
K. pneumoniae es un microorganismo oportunista asociado a infecciones
nosocomiales (HAI) como neumonía, septicemia además de infección de vías
urinarias (IVU).
El incremento de la multiresistencia en las cepas, es relevante principalmente por

la resistencia a β-lactámicos y la producción de β-lactamasas de espectro
extendido (BLEE´s).
La técnica de Multilocus Sequence Typing (MSLT) se emplea en estudios

epidemiológicos, de Evolución y tipificación molecular de aislados clínicos
asociados a brotes nosocomiales, en este estudio se aplicará para establecer la
relación genética y determinar la estructura poblacional de aislados de
K. pneumoniae provenientes de pacientes nosocomiales y ambulatorios.
27
(MLST).
3.0 OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Establecer las relaciones genéticas de aislados clínicos de diferente origen de

K. pneumoniae resistentes (BLEE’s +) y sensibles a β-lactámicos a través de la
técnica de MLST.
3.2. Objetivos particulares
1. Determinar la frecuencia de aislados clínicos de K. pneumoniae de diferente

origen clínico.
2. Determinar el perfil de resistencia a antibióticos y seleccionar grupos
BLEES (+) Y BLEES (-).
3. Aplicar la técnica de MLST a aislados clínicos de K. pneumoniae y analizar
el perfil alélico para establecer su relación genética.
28
(MLST).
4.0 MATERIAL Y MÉTODOS

4.1. Esquema general de trabajo
La figura 10 presenta un diagrama general de la metodología siguiendo los

lineamientos de Diancourt et al., 2005.
Genes constitutivos:
rpoB (subunidad β de la RNA
polimerasa)
gapA (gliceraldehído 3-fosfato
deshidrogenasa)
mdh (malato deshidrogenasa)
pgi (fosfoglucosa isomerasa)
phoE (fosforina E)
infB (factor de iniciación de la
traducción)
tonB (Traductor de energía
periplasmica)
Figura 10. Esquema general de trabajo.
29
(MLST).
4.2. Material biológico
Los 93 aislados clínicos de K. pneumoniae, provinieron de diferentes unidades

médicas, las cuales se denominaran como: I (65/93), II (11/93), III (5/93) y IV
(12/93) procedentes de diferentes zonas de la Ciudad de México.
Las cepas de referencia utilizadas en este estudio fueron:
K. pneumoniae ATCC 700603
E. coli ATCC 25922
4.3. Aislamiento e identificación de cepas clínicas de K. pneumoniae
La identificación de los aislados clínicos se hizo a partir de la morfología

microscópica, y la morfología colonial se determinó en los medios BHI y
MacConkey así como el uso de pruebas bioquímicas convencionales como:
catalasa, oxidasa, TSI, citrato de Simmons, MIO, LIA, RM/VP, se incubaron a
37°C por 24h (Giono, 2005).
4.4. Conservación de aislados clínicos
La conservación de los aislados se realizó mediante la siembra masiva en

placas de BHI (37°C/ 24 h); posteriormente el crecimiento se cosechó en
criotubos con caldo BHI y 15% de glicerol. Los criotubos se conservaron a -20°C
(Giono, 2005)
30
(MLST).
4.5. Perfil de resistencia a antibióticos
La sensibilidad a antibióticos se determinó a través del sistema automatizado

Vitek2®, que se basa en la determinación de la Concentración mínima inhibitoria
(CMI) (CLSI, 2014). Los antibióticos probados fueron: ampicilina (AMP), cefazolina
(CFZ), trimetropin/sulfametoxazol (SXT), ampicilina/sulbactam (SAM), cefepime
(FEP), ceftriaxona (CRO), aztreonam (ATM), tobramicina (TOB), gentamicina
(GM), nitrofurantoina (FD), ciprofloxacino (CIP), piperaciclina/tazobactam (TZP),
amikacina (AMK) ceftazidima (CAZ), moxifloxacina (MFX), levofloxacino (LVX),
cefoxitina (FOX), meropenem (MEM), imipenem (IM) y ertapenem (ETP) (CLSI,
2014).
Los aislados fueron clasificados de acuerdo al antibiograma en multidrogo-

resistente (MDR “multidrug-resistant”), extremodrogo-resistente (XDR “extensively
drug-resistant”) y pandrogo-resistente (PDR “pandrug-resistant”), considera los
criterios de clasificaciòn para enterobacterias (Magiorakos et al., 2011). (A.-P.
Magiorakos1, 2011)
4.5.1. Determinación de la prueba confirmatoria de BLEE´s
La confirmación de cepas BLEE´s se realizó con la prueba de doble disco (DD)

según las recomendaciones de la CLSI, 2014, a partir de una suspensión
bacteriana ajustada al 0.5 de la escala McFarland, se sembró masivamente en
medio Mueller Hinton (MH), se colocaron los discos de: cefotaxima (CTX) 30µg y
CTX + ácido clavulánico 30µg/10µg; ceftazidima (CAZ) 30µg, CAZ + ácido
clavulánico 30µg/10µg, a una distancia de 20-30 mm de centro a centro (CLSI,
2014).
El resultado fue positivo al observarse un incremento en el diámetro del halo de

inhibición (≥5 mm), alrededor del sensidisco CTX ó CAZ más ácido clavulánico, en
comparación del que no tiene ácido clavulánico (CLSI, 2014).
31
(MLST).
4.6. Tipificación molecular por MLST
4.6.1 Obtención de DNA
La obtención de DNA se hizo a partir de la siembra masiva en medio BHI (37°C

por 24 h). Posteriormente, se aplicó el método de Tiocianato-Guanidina (TG) para
la obtención del DNA cromosomal. La visualización del DNA se realizó por un
corrimiento electroforético en gel de agarosa al 0.7%, a 100V por 45 min, se reveló
en bromuro de etidio (0.5 µg/mL) durante 5 min (Sambrook, 1989). (ANEXO I.I)
4.6.2 Amplificación de genes constitutivos por PCR
El análisis de MLST se hizo solo a 48 aislados que fueron seleccionados, donde

se consideró los siguientes criterios: centro hospitalario, origen de la muestra
(principalmente urocultivo y/o hemocultivo), año de aislamiento y presencia o
ausencia de BLEE’s. La amplificación de los genes constitutivos “houskeeping”:
gapA, infB, mdh, pgi, phoE, ropB y tonB, se realizó por PCR individual; en la tabla
7 se describe los componentes y concentraciones de la mezcla de reacción.
Tabla 7. Componentes de la mezcla de reacción para la

PCR convencional
Reactivo Volumen (µL)
Regulador 1x (Tris-HCl pH 8.5, KCl 50
2.5
mM) *
MgCl2 (2.0 mM) * 2.0
Iniciador Foward 2.0
(20pM) Reverse 2.0
Mezcla de dNTP´s (200mM) * 2.0
DNA bacteriano (1:2) 2.0
Agua desionizada 13.3
Taq Polimerasa (0.5U) * 0.2
Volumen total 25 µL
*Reactivo de Invitrogen® tomada y modificado de Diancourt et al., 2005.
32
(MLST).
El programa de amplificación que se empleó para cada gen (gapA, infB, mdh, pgi,
phoE, ropB y tonB) se muestra en la tabla 8.
Tabla 8. Programas de amplificación para los genes constitutivos de

K. pneumoniae
Etapa Número de ciclos Temperatura (°C) Tiempo (min)
Desnaturalización
1 94 5
inicial
Desnaturalización 30 94 1
gapA 50
Alineamiento
rpoB 50
mdh 50
pgi 30 50 1
phoE 50
infB 50
tonB 45
Extensión 30 72 1
Extensión final 1 72 5
Tomado de Diancourt et al., 2005.
4.6.3 Purificación del amplicon
La purificación de los amplicones previo a la secuenciación se realizó a partir de

un gel de agarosa 1.7% con el kit comercial “PureLink Quick Gel Extraction and
PCR Purification combo kit (Invitrogen®)”, así como a partir del producto de PCR
con los kit´s “Montáge life ciencia kits GENOMICS (Millipore®)”, “EZ-10 Spin
Column PCR purification kit (BioBasic®)”,”Gene JET-PCR Purification kit (Thermo
Scientific)” siguiendo las instrucciones del fabricante (ANEXO I.II).
33
(MLST).
4.6.4. Secuenciación
La secuenciación se hizo con el kit “ABI PRISM® Big dye® Terminator v3.1 Cycle
Sequencing Kits”. La reacción se realizó a un volumen final de 10µL (2µL de Big
Dye, 2µL buffer, 1µL iniciador forward, 1µL DNA y 4µL agua inyectable). El
programa de amplificación se muestra en la tabla 9 (Diancourt et al., 2005).
Tabla 9. Programa de amplificación para la secuenciación para los genes

constitutivos de K. pneumoniae
Etapa Número de ciclos Temperatura (°C) Tiempo
Desnaturalización
1 96 5 min
inicial
Desnaturalización 25 96 10 seg
gapA 50
Alineamiento
rpoB 50
mdh 50
pgi 25 50 5 seg
phoE 50
infB 50
tonB 45
Extensión 25 60 4 min
Enfriamiento 1 4 -
Tomado y modificado de Diancourt et al., 2005.
Posterior a la obtención del amplicón se realizó la purificación con columnas de

Sephadex G-50 (poro fino) por centrifugación 2min a 2800 rpm; seguido del
secado del gen en el concentrador a 45°C por 30 min (Sambrook, 1989) (ANEXO
I.III).
La lectura de la reacción de secuenciación se realizó con el Instituto de Biología

de la UNAM, Laboratorio de Biología Molecular a cargo de la M. en C. Laura M.
Márquez Valdelamar, el cual cuenta con un equipo automatizado “ABIPRISM
3730XL de Applied Biosystems”; a la muestra seca se le agregó 15µL de
formamida HD y se colocó en los capilares del equipo para su lectura.
34
(MLST).
4.6.5 Análisis bioinformático
4.6.5.1. Genotipificación por MLST
Las secuencias obtenidas se analizaron para verificar la identidad de las mismas

por medio del análisis de alineamiento múltiple BLAST (“Basic Local Alignment
Search Tool”) disponible en la página de la NCBI (“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/”).
La edición de las secuencias se realizó con los programas: FinchTV v 1.4.0

(FinchTV 1.4.0 Geospiza), ClustalX v 2.1 (Larkin et al., 2007) y Bioedit v 7.2.5
(Hall, 1999). Las secuencias editadas se enviaron a una base de datos
internacional PUBMLST de K. pneumoniae (“http://pubmlst.org/”), para obtener el
número de alelo de cada gen, posteriormente se obtuvo el perfil alélico el cual
considera los siete genes constitutivos, y cada perfil alélico fue definido como
secuencia tipo (ST) (ANEXO I.IV).
4.6.5.2. Asignación de los complejos clonales (CC)
El programa eBURST v3 se empleó para identificar los diferentes complejos

clonales (CC). Los CC se definieron como dos o más aislados independientes que
comparten alelos idénticos, al menos en seis o más loci. Los complejos fueron
nombrados de acuerdo a la secuencia tipo fundadora (Feil et al., 2004). Los datos
de los 2317 ST´s de K. pneumoniae previamente reportadas fueron obtenidos de
la base de datos para MLST del Instituto Pasteur (www.pasteur.fr).
35
(MLST).
4.6.5.3. Medición de la Clonalidad
La determinación del índice de asociación IA (cuantificaciòn de la tasa de

recombinación entre el grupo de secuencias y la detección de asociación de los
alelos de diferente loci) de los siete genes se calculó con el programa START2 v
0.9.0 (Jolley et al., 2001).
4.6.5.4. Análisis de las secuencias
La determinación de las mutaciones sinónimas (ds) y no sinónimas (dn), así como

de los polimorfismos de los 7 genes empleados en el estudio se hizo con base a
los cambios nucleotídicos, a través de los programas START2 v 0.9.0 (Jolley et
al., 2001) y DnaSP v5.10 (Librado y Rozas, 2009). La traducción amiácidica de
las secuecias de cada gen se hizo emplendo la plataforma ExPASy
(www.expasy.org), para estabecer el marco de lectura abierto de la proteína .
4.6.5.5. Relación filogenética
El análisis filogenético se realizó con en el programa START2 v 1.0.5

(http://pubmlst.org/software/analysis/start2/). La construcción del árbol se hizo con
base al método de Neighbor-joining basado en el criterio de mínima evolución
(BME: balanced minimum evolution) en el alineamiento de las secuencias
concatenadas de los siete genes empleados en MLST con 1000 replicas
("bootstrap”) (Jolley et al., 2001).
36
(MLST).
5.0 RESULTADOS
5.1. Determinación de la frecuencia del aislamiento de K. pneumoniae de
diferente origen clínico.
Los 93 aislados clínicos de K. pneumoniae provenientes de diferentes unidades

médicas se analizaron, considera el origen de la muestra: hemocultivo, urocultivo,
punta de catéter, secreción bronquial, líquidos internos y superficie (Figura 11).
Figura 11. Distribución geográfica de los 93 aislados de K. pneumoniae en los

diferentes Hospitales de la CDMX. K. pneumoniae se aisló con mayor frecuencia en
muestras de urocultivos.
37
(MLST).
Los 93 aislados clínicos fueron obtenidos entre los años 2011 al 2015 excluyendo
el 2014, fueron clasificados en: A, ambulatorios (aislados provenientes de
pacientes no hospitalizados), I, intrahospitalarios (aislados provenientes de
muestra de pacientes hospitalizados) y S, (superficies inertes hospitalarias) con la
finalidad de distinguir aquellas provenientes del ambiente hospitalario (figura 12).
La mayoría de los aislados clínicos (44/93) se obtuvieron durante el 2015.
Figura 12. Número de aislados clínicos de K. pneumoniae. A, ambulatorias,

I, intrahospitalarias, S, superficie.
38
(MLST).
5.2. Aislamiento e identificación de aislados clínicos de K. pneumoniae.
La identificación de las cepas se realizó mediante el Vitek2®, seguida de la

confirmación de la identidad por métodos convencionales, donde la morfología
colonial se describió a partir de agar BHI: colonias con tamaño variado (2-7 mm
de diámetro), convexas, húmedas, brillantes con consistencia mucoide y bordes
irregulares; en el medio MacConkey se observaron colonias lactosa positivas
(Figura 13).
Figura 13. Morfología colonial característica de K. pneumoniae ATCC 700603.

A) Crecimiento en agar BHI, colonias de color crema, B) Crecimiento en agar Mac
Conkey, colonias lactosa positiva y consistencia mucoide. Tomadas en el laboratorio de
Bacteriología de la ENCB-IPN
La confirmación microbiológica de la identidad de los 93 aislados clínicos se

realizó por métodos convencionales de Bacteriología: microscópica (Tinción de
Gram, forma, agrupación, afinidad tintorial), pruebas bioquímicas: oxidasa,
catalasa, TSI, LIA, citrato y MIO (Figura 14).
39
(MLST).
Figura 14. Pruebas bioquímicas para la identificación de los aislados clínicos de

K. pneumoniae. (A) Acido; (K) Alcalino; (-) Negativo; (+) Positivo, RM: Rojo de Metilo;
VP: Voges Proskauer. Resultados comparados de Koneman W., 2008.
Las 93 cepas clínicas fueron confirmadas como: K. pneumoniae y conservadas en

caldo BHI con glicerol al 15% y almacenadas a -20°C.
5.3. Perfil de resistencia a antibióticos
La determinación del perfil de resistencia de los aislados clínicos de

K. pneumoniae se realizó por el sistema automatizado Vitek2®, se seleccionaron
únicamente los aislados BLEE´s (+) para el estudio de MLST.
40
(MLST).
La frecuencia de resistencia a cada antibiótico se determinó a partir de los

antibiogramas obtenidos (Figura 15); en donde el porcentaje de resistencia
mostró: AMP (96% 89/93), CFZ (61% 57/93), SXT (60% 56/93), SAM (57% 53/93),
FEP (56% 52/93), CRO (56% 52/93), TOB (39% 36/93), GM (35% 33/93), FD
(27% 25/93), CIP (22% 20/93), TZP (16% 15/93), AMK (9% 8/93), MEM, ETP (2%
2/93) e IM (1% 1/93).
Figura 15. Porcentaje de resistencia a diferentes antibióticos de los 93 aislados

clínicos de K. pneumoniae. Se observa la mayor frecuencia de resistencia con la
ampicilina (96%) y solo una cepa presentó resistencia al imipenem.
El 60% (56/93) de los aislados clínicos fueron presuntivas a BLEE´s (+), de

acuerdo a lo reportado por el Vitek2®.
41
(MLST).
La clasificación de los aislados de acuerdo al antibiograma en MDR,XDR Y PDR,

considera los criterios de Magiorakos y cols., 2011, se obtuvo que el 46% (43/93)
fueron MDR; 24 provenientes del Hospital I, 10 del Hospital de II, 1 de III y 8 del
IV, 17% (16/93) fueron XDR; 10 provenientes del Hospital I, 1 del Hospital II, 2 deL
III y 3 del Hospital IV, 1% (1/93) fue PDR originaria del Hospital IV
5.3.1. Determinación de la prueba confirmatoria de BLEE´s
En la figura 16 se muestra el resultado de la prueba de doble disco (DD), con los

controles positivo y negativo (K. pneumoniae ATCC 700603 y E. coli ATCC
25922).
Figura 16. Prueba control para la confirmación de BLEE´s. A) Control positivo

K. pneumoniae ATCC 700603, B) Control negativo E. coli ATCC 25922. El incremento
del halo de inhibición (≥5 mm) en el sensidisco de ceftazidima (CAZ) + ácido clavulánico
se considera un resultado positivo. Fotos tomadas en el laboratorio de Bacteriología de la
ENCB-IPN
42
(MLST).
La prueba de DD se realizó a todas las cepas clínicas (Figura 17); de las cuales 56
fueron positivas a la prueba y 37 negativas a BLEE´s; esto concordó con los datos
obtenidos del sistema automatizado Vitek2® (tabla 10).
Figura 17. Prueba confirmatoria de 56 aislados clínicos positivos a BLEE´s. Se

observa un incremento ≥ 5 mm en el halo de inhibición con el sensidisco de CAZC
(Cefazolina + ácido clavulánico), el mismo caso pasa con CTXC (Ceftriaxona + ácido
clavulánico). Fotos tomadas en el laboratorio de Bacteriología de la ENCB-IPN
Tabla 10. Aislados clínicos de K. pneumoniae positivas a la prueba confirmatoria

de doble disco para la detección de BLEE’s
Numero de cepas Prueba confirmatoria DD
Total de
presuntivas a
cepas BLEE´s (+) BLEE´s (-)
BLEE´s
Hospital I 65 30 30 0
Hospital II 11 11 11 0
Hospital III 5 3 3 0
Hospital IV 12 12 12 0
43
(MLST).
5.4 Tipificación molecular por MLST
5.4.1 Amplificación de los genes constitutivos por PCR
La amplificación de los genes “houskeeping” se realizó con las condiciones

mencionadas (Diancourt et al., 2005). En la figura 18 se representa el gel de
agarosa a 1.7% empleando una corriente de 100V por 45 min., donde se observa
la amplificación de los 7 genes constitutivos (gapA, rpoB, mdh, pgi, phoE, infB,
tonB) de la cepa de K. pneumoniae ATCC 700603.
Figura 18. Electroferograma de la amplificación por PCR de los genes constitutivos

de K. pneumoniae ATCC 700603. Carril: 1. Marcador de talla molecular 100 pb, 2. gapA
(670 pb), 3. infB (450 pb), 4. mdh (750 pb), 5. phoE (600 pb), 6. pgi (800 pb), 7. rpoB
(1000 pb), 8. tonB (550 pb). Gel de agarosa 1.7 %.
Los amplicones obtenidos se purificaron y secuenciaron de acuerdo a lo ya

descrito en la metodología (3.6.3 y 3.6.4).
44
(MLST).
5.5 Análisis bioinformático

5.5.1. Genotipificación por MLST
La MLST se hizo para determinar la diversidad genética de los aislados de

K. pneumoniae; en la tabla 11 se indican los resultados obtenidos: el número de
alelo de cada gen, el perfil alélico considera los siete genes y finalmente la
secuencia tipo (ST) de los aislados clínicos empleados en este estudio. Se
determinó la frecuencia de alelos para cada gen, los genes que presentaron mayor
variación fue: tonB, mdh y phoE (ANEXO II.I). Treinta secuencias tipo (ST) fueron
identificadas (29 ST clínicas y 1 ST correspondiente a K. pneumoniae ATCC
700603, 23 ST´s (79%) correspondieron a un solo aislado y seis ST´s (21%)
incluyeron de dos a seis aislados. Las ST´s que predominaron fueron ST551 y
ST405 (12.5%, 6/48 cada uno), posteriormente ST25 y ST1088 (8.3%, 4/48 cada
uno), en seguida ST392 (6.3%, 3/48%) y por último ST36 (4.1% 2/48). Las seis
ST´s fueron consideradas las clonas prevalentes en este estudio (figura 19).
Figura 19. Porcentaje de ST´s. 23 de las ST´s solo fueron encontradas en una cepa
La clasificación de resistencia, revelo que los aislados ST25 fueron MDR (2/4) y
XDR (2/4); aquellas ST405, fueron MDR (2/6) y XDR (2/6), el resto fueron
sensibles a la mayoría de los antibióticos. Las ST551 presentaron dos resistotipos:
MDR (3/6) y XDR (3/6); los aislados ST392 y ST1088 fueron MDR (4/4; 3/3). La
ST706 fue la única PDR.
45
(MLST).
Tabla 11. Asignación de la Secuencia Tipo a partir de los perfiles alélicos.

Origen Año Cepa Perfil alélico *ST
gapA rpoB mdh pgi phoE infB tonB
ATCC 700603 18 52 26 71 98 22 51 489
2011 1E 2 1 1 3 8 1 15 2015
2E 2 1 62 3 10 4 110 405
3E 2 1 1 1 9 4 12 23
4E 2 1 1 6 7 4 12 496
5E 2 1 62 3 10 4 110 405
6E 2 1 164 1 7 4 303 1846
2012 7E 2 9 2 1 13 1 10 309
8E 3 1 1 1 9 4 135 551
9E 3 1 1 1 9 4 135 551
10E 3 1 1 1 9 4 135 551
HOSPITAL I
11E 2 1 62 3 10 4 110 405

12E 3 1 1 1 9 4 135 551
13E 51 1 5 1 9 4 13 491
2015 14E 2 1 62 3 10 4 110 405
15E 2 1 1 1 10 4 13 25
16E 2 1 5 1 17 4 42 111
17E 2 1 1 1 7 1 12 485
18E 2 1 2 1 4 4 4 16
19E 2 1 2 1 7 1 7 36
20E 2 60 11 1 4 8 24 628
21E 2 1 2 1 1 4 13 804
22E 2 1 1 117 10 4 18 1726
23E 2 1 1 1 10 4 13 25
24E 3 3 1 1 9 1 4 1869
25E 2 9 2 1 13 1 16 37
2013 1S 2 1 1 10 1 1 76 1088
2S 2 1 1 10 1 1 76 1088
Hospital II
3S 3 1 1 1 9 4 135 551
4S 2 1 1 10 1 1 76 1088
5S 2 1 2 1 213 1 7 2175
6S 2 1 1 10 1 1 76 1088
7S 3 1 1 1 9 4 135 551
8S 2 1 162 3 10 4 110 405
2013 1I 2 4 2 1 7 1 12 788
Hospital III
2I 3 3 1 1 13 1 79 1406
3I 2 1 1 1 10 4 13 25
4I 2 1 97 1 9 4 13 846
5I 2 1 2 1 7 1 7 36
2015 1Z 2 1 1 1 10 4 13 25
2Z 2 1 62 3 10 4 110 405
3Z 4 1 2 52 1 1 7 307
HOSPITAL IV
4Z 3 4 6 1 7 4 40 392
5Z 4 1 32 1 7 4 10 151
6Z 3 4 6 1 7 4 40 392
7Z 4 5 88 1 1 94 23 2080
8Z 3 4 6 1 7 4 13 885
9Z 2 4 1 1 7 4 4 706
10Z 3 4 6 1 7 4 40 392
*ST: “Sequence type”
46
(MLST).
5.5.2. Asignación de los complejos clonales (CC)
El análisis filogenético se realizó con 48 aislados y las 2317 ST reportadas

previamente en la base de datos de MLST (http://bigsdb.pasteur.fr/). El estudio se
hizo con el algoritmo eBURST v3 el cual permite agrupar a las poblaciones
bacterianas en grupos de aislados relacionados y CC, además predice los
genotipos fundadores (ancestros) de cada CC. El algorítmo también permite
visualizar a la población de forma general a través de una agrupación denominada
“population snapshots” (Figura 19). La población “snapshots” a nivel mundial
mostró que en el caso de K.pneumoniae, el tipo de población fue clonal.
El programa eBURST v3 considera las 30 ST´s (incluye la cepa ATCC 700603 con
ST489, marcada con circulo verde; y los aislados clínicos señalados con circulo
rojo) que se identificaron en este estudio con repeticiones (1000 “bootstrap”). La
denominación de los CC fue asignada de acuerdo a la ST fundadora de cada
grupo, y se considera que un CC esta compuesto por aislados que tienen 6/7 loci
idénticos. En total se generaron 183 CC, en el centro del “snapshots” se observa
el principal complejo clonal (CC11) que presento 47 SLV, 43 DLV, 123 TLV y 688
SLV, donde se localizaron 18 ST´s. Los siguientes CC a los que pertenecen los
aislados son: CC147 (ST885, ST392); CC628 (ST628); CC1088 (ST1088); CC551
(ST551); CC2054 (ST10726); CC491 (ST491); CC405 (ST405) y CC307 (ST307) .
Las ST´s individiales (“singleton”) que no formaron parte de un CC fueron:
ST2080, ST1846, ST489.
47
(MLST).
Figura 20. Población “snapshot” de K. pneumoniae, análisis comparativo eBURST.

Se identificaron las ST´s en 48 aislados clinicos de K. pneumoniae resaltadas con un
circulo rojo y la ATCC 700603 de K. pneumoniae (circulo verde), los fundadores (azul) se
encuentran en el centro de cada complejo clonal (CC). Las ST´s individuales fuerón
resaltadas con una linea.
48
(MLST).
5.5.3 Medición de la Clonalidad
El análisis del índice de asociación IA (START2 V.1.0.5) señala que los valores
que difieren significativamente de cero indican poblaciones clonales, en este
estudio se obtuvo un valor de IA = 0.572 (n=48), lo que sugiere que la población
estudiada fue de tipo clonal.
4.5.4 Análisis de las secuencias
Las características y polimorfismo de cada gen son presentadas en la tabla 12. El

número de alelos para cada gen varió de 4 (gapA y rpoB) a 17 (tonB) y el número
de sitios polimórficos correlacionan con las mutaciones de cada gen, los valores
de π de 0.00463 (pgi) a 0.02794 (gapA) y θ de 0.00364 (gapA) a 0.01331 (rpoB)
los cuales fueron <1. El contenido de G+C se encuentra por arriba del 50% en los
siete genes, con rangos de 55.77% (mdh) a 64.66% (tonB).
Tabla 12. Características y polimorfismo de los genes housekeeping de los aislados de K. pneumoniae
Sitios Total de
Gen Tamaño Haplotipo π* θ* G+C dN* dS* dN/dS
Polimórficos mutaciones
gapA 450 4 3 3 0.02794 0.00364 0.5615 0.0000 0.0132 0.0000
infB 318 6 7 7 0.00797 0.00964 0.6140 0.0097 0.0037 2.6548
mdh 477 10 21 21 0.00526 0.00684 0.5577 0.0086 0.0145 0.5944
pgi 432 6 6 6 0.00463 0.00608 0.5733 0.0042 0.0056 0.7531
phoE 420 9 9 9 0.00728 0.00788 0.5585 0.0000 0.0311 0.0000
rpoB 501 4 13 13 0.01331 0.01331 0.5415 0.0128 0.0147 0.8713
tonB 414 17 16 16 0.01027 0.01143 0.6466 0.0050 0.0257 0.1961

π *: diversidad de nucleótidos por sitio.
θ *: número promedio de diferencias de nucleótidos por sitio.
dN*: No. de cambios no sinónimos por sitio no sinónimo.
dS*: No. de cambios sinónimos por sitio sinónimo.
49
(MLST).
Los cambios polimórficos correlacionan con las mutaciones, la mayoría de los

genes “housekeeping” no mostraron mutaciones en las diferentes posiciones del
triplete, con cambios sinónimos y no sinónimos de aminoácidos. La relación
dn / ds para la mayoría de los genes fueron significativamente <1 indicando que
no había una fuerte presión selectiva en los genes, por lo cual no afectan la
viabilidad de la bacteria, a excepción del gen infB.
5.5.5 Relación filogenética
El análisis filogenético se realizó con los 48 aislados, con el método de “Neighbor-

joining” basado en el criterio de mínima evolución (BME: “balanced minimum
evolution”), el cual determina secuencias más cercanas uniendolos mediante un
nodo interno a una distancia de 0.1, repitiéndose en el resto de secuencias hasta
que quedan todas unidas por dichos nodos internos que minimizan la longitud de
cada una de las ramas internas obteniendo un árbol filogenético en el que la
longitud de sus ramas indican el cambio evolutivo (Figura 20).
El árbol filogenético muestra un grupo externo conformado por 10% (5/48) de

aislados cada una con ST diferente (ST846, ST491, ST111, ST804 y ST16), por lo
cual, la distancia filogenética varió, el grupo interno se dividio en dos principales
clados (agrupación que contiene un antecesor común) , el clado A incluye 50%
(24/48) de aislados y el clado B 40% (19/48) aislados, las cepas con ST´s igual
(ST392, ST551, ST36, ST1088, ST405, ST25) se encuentras en el mismo clado y
a la misma distancia. No se observó relación la resistencia a antibióticos con la
formación de los grupos filogenéticos.
50
(MLST).
Figura 21. Árbol filogenético obtenido mediante el programa START 2 v.0.9.0,

por el método “Neighbor-joining”. El ancho de la línea refleja la variación
genética de cada aislado, el cual depende de su ST. A y B grupo interno, cada uno
representa un clado que a su vez se divide en subclados, C grupo externo.
51
(MLST).
6.0 DISCUSIÓN
K. pneumoniae es un patógeno de importancia en el ambiente hospitalario,
frecuentemente relacionado con infecciones nosocomiales (HAI) en unidades de
cuidado intensivo y salas de pediatría, constituyen un problema de salud de
extrema importancia en México y en el mundo. En los últimos años se han
producido niveles de resistencia elevados a antibióticos β-lactámicos,
aminoglucósidos y a quinolonas, lo que ocasiona un problema en la elección del
tratamiento para dicha infección (Espinal et al., 2004, Lombardo et al., 2012).
En este estudio se trabajó muestras procedentes de 4 centros hospitalarios

localizadas en diferentes puntos geográficos (el hospital I y II se localizan en la
delegación Azcapotzalco, el Hospital III en la delegación Tlalpan y el Hospital IV
en Iztapalapa), recolectados en diferentes años, esto permitió obtener una mayor
visión en cuanto a los resultados; las cuales fueron aisladas e identificadas por
métodos convencionales dando un total de 93 cepas clínicas confirmadas como
K. pneumoniae. La mayor parte de las muestras obtenidas del hospital I fueron a
partir de urocultivos, seguidos de hemocultivo, datos que no concuerdan con lo
reportado en Taiwan por Tsai y cols., 2010 donde >50% de muestras analizadas
en HAI causadas por K. pneumoniae, se obtuvieron en secreciones bronquiales,
seguidas de urocultivos (22% de la población total analizada) y una mínima
población (5%) a partir de hemocultivo, sin embargo, en dicho hospital las
muestras de urocultivo fueron el doble de lo señalado por Tsai y cols, 2010. En el
caso del hospital II la mayoría de las muestras provinieron de superficies, y
actualmente no se conoce un reporte que evalué las condiciones del hospital. En
el hospital III también se observó una alta frecuencia de aislamiento a partir de
urocultivos sin embargo, estas muestras provinieron de pacientes ambulatorios es
decir, que la infección fue adquirida en la comunidad y no presentan importancia
en cuanto a las HAI, pero nos permitió evaluar qué relación tiene una con otra.
52
(MLST).
El hospital IV tuvó una mayor frecuencia de aislamiento a partir de muestras de

hemocultivo comparado con lo reportado por Tsai y cols., 2010 los cuales
sugieren una complejidad en el tratamiento ya que la cepa al estar en el torrente
sanguíneo puedes dispersarse a cualquier organismo, provocando septicemias.
En México Curiel y cols., 2004 señalaron que las HAI causadas por K.
pneumoniae a partir de urocultivos se aislaban con mayor frecuencia en la
medicina interna (MI), mientras las provenientes de hemocultivo en la Unidad de
Cuidados Intensivo Neonatal (UCIN). La “National Healthcare Safety Network”
(NHSN, por sus siglas en inglés) señala que en el 2014, K. pneumoniae se aisló
con mayor frecuencia en UCI y salas de pediatría; en el presente estudio no se
pudo acceder a los datos de todos los hospitales debido a confidencialidad del
mismo, es por ello que no se identificó la unidad médica en la cual se aisló con
mayor frecuencia este microorganismo, cabe destacar que las muestras
provenientes del Hospital III fueron ambulatorias.
El incremento de la resistencia en K. pneumoniae se ha elevado debido al uso

indiscriminado de antibióticos en el tratamiento de las infecciones causadas por
esta bacteria, convirtiéndose en un problema a nivel mundial. La resistencia suele
asociarse con mayor frecuencia a la expresión de genes presentes en plásmidos,
transposones e integrones, los cuales son elementos claves en la transmisión
horizontal de la información genética, debido a que son capaces de propagar la
resistencia entre los miembros de una misma o diferentes especies (Guzman y
Alonso, 2010).
Los aislados clínicos del presente estudio tuvieron un elevados porcentajes de

resistencia a los antibióticos β-lactámicos (obtenido por el Vitek2®). Llevando a
cabo la clasificación de resistencia de acuerdo a los criterios de Magiorakos y
cols., 2011. Lo cual concuerda con lo reportado por Rocha, 2006 menciona que la
multiresistencia en infecciones nosocomiales está en aumento, elevando la tasa
de mortalidad, además en Chile Guzman y Alonso, 2010 mencionaron que la
53
(MLST).
resistencia a los antibióticos β-lactámicos es un problema cada vez mayor para el

tratamiento de las infecciones, es por ello que se ha implementado el uso de
antibióticos carbapenémicos como es Imipenen, ya que es un medicamento
altamente resistente a la hidrólisis por β-lactamasas (Nicandro, 2008); se emplea
para contrarrestar las infecciones causada por K. pneumoniae BLEE´s (+).
La mayoría de las cepas clínicas fueron sensibles a Imipenem, excepto una que
fue PDR (resistente a todos los antibióticos de todas las categorías) (Magiorakos
et al., 2011), la cual fue aislada en el 2015 del hospital VI, la importancia de esta
cepa PDR se basó en la deficiencia en el tratamiento de la misma de tal manera
que eleva el índice mortalidad para el paciente; sin dejar a un lado la probabilidad
de popagación a otros pacientes.
La búsqueda de mecanismos de resistencia a antibióticos, como la producción de

β-lactamasas de espectro extendido (BLEE’S), es importante para estudios
epidemiológicos, ya que proporcionan información necesaria para dar un
tratamiento adecuado a los pacientes, haciéndolos más eficaces En el presente
estudio el 60% (56/93) de las cepas fueron BLEE´s positivas, comparada con
estudios previos realizados por Hernández y cols., 2000, obtuvieron que solo el
16.7% de las cepas analizadas en España dieron positivo a la presencia de
BLEE´s, mimas que presentaron susceptibidad a aminoglucósidos, cloranfenicol y
tetraciclina, por lo cual la presencia de BLEE´s en cepas de K. pnumoniae está en
aumento; sin embargo, la susceptibilidad a otros antibióticos aún se mantiene en
la mayoría de los aislados que forman parte del estudio. En este estudio se
determinó que la mayoría de las cepas productoras de BLEE´s están asociadas a
HAI provenientes de urocultivos, un reporte de España realizado por Díaz y cols,
2006 analizaron a E. coli y a K. pneumoniae en muestras provenientes de
urocultivos, observaron un incremento en la producción de BLEE´s en ambas
cepas sin embargo, determinaron que las cepas de K. pneumoniae estaban
asociadas a HAI, siendo el 30% productoras de BLEE´s, dato que concuerda con
54
(MLST).
lo obtenido en este estudio. Sahly y cols., 2008 recapitulan la estimación de

Paterson y cols., 2004 que la presencia de BLEE´s en cepas de K. pneumoniae
varío de acuerdo al país: 12 % en los Estados Unidos, 33 % en Europa, 28 % en el
Pacífico occidental, y el 52 % en América Latina; México al ser un país
tercermundista los hospitales no cuenta con las condiciones necesarios para evitar
la recombinación de cepas, lo que ocasiona que cepas sensibles a β-lactámicos al
paso del tiempo sean productoras de BLEE´s.
No existen reportes previos del origen de las cepas clínicas productoras de

BLEE´s. En este estudio, la mayoría fue obtenido a partir de los aislados provienen
de urocultivo, hemocultivos y superficies inertes, siendo de mayor importancia las
de hemocultivo causantes de septicemias.
Actualmente en México no se cuenta con la suficiente información estadística del

incremento de la multirresistencia y producción de BLEE´s en cepas clínicas de
K. pneumoniae, por lo cual no podemos tener un amplio panorama de que tanto
han evolucionado y generado mecanismos de resistencia a antibióticos, este
trabajo representa un plus como punto de compasión para trabajos posteriores de
resistencia.
Se han implementados métodos de biología molecular para evaluar la diversidad

genética y tipificar a los microorganismos, así como conocer la relación que tienen
las cepas productoras de BLEE´s y las sensibles a β-lactámicos. La técnica de
MSLT se emplea en estudios epidemiológicos, de evolución y tipificación
molecular estableciendo la relación genética en aislados clínicos asociados a
brotes nosocomiales (URL 4).
En este trabajo, se empleó la técnica de “Multilocus Sequence Typing” (MLST) a

48 aislados, considerando lo reportado por Diancourt y col. en 2005 quienes
estandarizaron la técnica de MLST en cepas clínicas de K. pneumoniae, con siete
genes constitutivos (gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB, tonB), Para poder validar el
método en este estudio se utilizó la cepa de referencia K. pneumoniae ATCC
55
(MLST).
700603 como control positivo, sin embargo, en la práctica de obtuvieron

variaciones en la talla molecular de los datos esperados, siendo el doble a lo
previamente reportado, es por ello que se realizó análisis “in silico” de los
iniciadores para conocer la región del DNA que amplifican, obteniendose que los
iniciadores eran los adecuados para la amplificación de los genes constitutivos de
K. pneumoniae. A pesar de que se realizaron curvas de temperaturas,
concentraciones de DNA, iniciador y MgCl2; el gen rpoB dio una talla molecular de
1100pb y en el caso de los genes tonB y mdh presentaron bandas aspuria; estas
bandas fueron eliminadas mediante la purificación del producto de PCR a partir de
gel de agarosa, cortando solo las bandas de la talla molecular correcta.
El análisis BLAST, se realizó posterior a la edición de las secuencias para validar

que se obtuvo el gen deseado, este indicó un porcentaje de identidad del 99%
para cepas de K. pneumoniae con un valor de E de 0.0 por lo cual se considera al
alineamiento como significativo, y confirma que los genes fueron amplificados
exitosamente. En un estudio de MLST realizado en Beijing en el 2013 utilizaron la
misma cepa control dando una ST489, mismo obtenido en este estudio, por lo que
nos permitió determinar que el método es el adecuado para el análisis de las
cepas clínicas de K. pneumoniae (Qi Wang et al., 2013).
Una vez validado el método se prosiguió al análisis de los 48 aislados

representativos de cada hospital, año y sensibilidad. La base de datos arrojó 29
secuencias tipo (ST) y ningún nuevo alelo (Tabla 11), los cuales fueron obtenidos
de la base de datos PubMLST [http://pubmlst.org/]. 23 ST´s correspondieron a una
sola cepa y las seis restantes fueron consideradas como clonas (ST551, ST405,
ST25, ST1088, ST392, ST36). Para evaluar los patrones de descendencia
evolutiva de los aislados se implementó el algoritmo de eBURST, para identificar
los diferentes complejos clonales (Feil et al., 2004).
56
(MLST).
La distribución por el algoritmo de eBURST, para identificar los diferentes

complejos clonales, permitió concluir que la bacteria forma una población clonal, el
cual es consistente en estudios realizados por Qi Wang y cols., 2013. En este
estudio se observa un aumento de ST´s pertenecientes a un complejo clonal (CC)
incluso como ST´s individuales, donde se formaron 183 CC los cuales fueron
nombrados de acuerdo a la secuencia tipo fundadora, se obtuvo que el ancestro o
fundador del mayor CC es la ST11, estudios previos realizado por Qi Wang y
cols., 2013, el fundador fue la ST23, sin embargo no mencionan el total de ST´s
presentes en la base de datos internacional ni el número de complejos clonales.
De los aislados analizados en este estudio se encontró que las ST628, ST1088,
ST551, ST491, ST405 Y ST307 cumplieron la funcion de fundadores de un CC.
El índice de asociación (IA), realizado por Qi Wang y cols., 2013, señalaba un

resultado <1, por lo que se confirma con el algoritmo del eBURST de que la
población estudiada fue de tipo clonal, es decir que los aislados están
genéticamente relacionados, presentando un menor número de variaciones en su
cromosoma. El contenido de G+C de los genes constitutivos fue similar al
reportado por el GeneBank.
En ocasiones los genes presentan mutaciones, de tal manera que la estructura

terciaria de la proteína codificada no se altera. Sin embargo, los microorganismos
toleran un número limitado de mutaciones, es por ello que se determinaron las
mutaciones sinónimas y no sinónimas que afectan a la bacteria. Las mutaciones
puntuales en la 3ra posición raramente resultan en el cambio de aminoácido y los
cambios en la 2da posición (siempre), y en la 1ra posición resultan en un
aminoácido diferente (Salemi y Vandamme, 2003),
57
(MLST).
En este estudio se determinó que los cambios polimórficos correlacionaron con las
mutaciones, la mayoría de los genes “housekeeping” no presentaron mutaciones
en las diferentes posiciones del triplete, con cambios sinónimos y no sinónimos de
aminoácidos. La relación dn/ds para la mayoría de los genes fueron
significativamente <1, lo que indica que dichas mutaciones no afectaron, en
cambio en el gen infB se obtuvo una relación de 2.6548 lo cual indicó que las
mutaciones a pesar de ser 7 señalan una selección positiva. Por lo que no hay
reportes donde indique como han afectado las mutaciones en los genes
empleados para la MLST en K. pneumoniae.
Para tener una mejor visualización del análisis filogenético se realizó el método de
“Neighbor-joining” para la construcción de árbol filogenético.
El análisis mostró la presencia de dos principales clados (figura 21) en el cual el

clado A contiene el 50% (24/48) de los aislados analizados provenientes de los 4
hospitales, 13 son MDR, 5 XDR y 1 PDR. Las ST´s predominantes en este clado
fueron: ST551 que fue encontrada en el 2012 en el Hospital I y en el 2013 en el
Hospital II siendo 3/6 MDR y 3/6XDR; aislada de pacientes y muestras de
superficie, siendo una cepa causante de un brote en la delegación Azcapotzalco,
la ST392 solo se encontró en el 2015 Hospital IV cepas MDR (4/4), esta se
clasificó como una cepa endémica dentro del mismo hospital, la ST36 en 2015 en
el Hospital I y el 2013 en el Hospital III ninguna cumplió con los criterios de
clasificación de resistencia, dicha cepa presenta una ventaja para el paciente
debido a su sensibilidad a los antibióticos y puede ser fácilmente eliminada. La
ST706 es la única cepa PDR y pertenece al Hospital IV aislada en el 2015.
El clado B contiene 39.6% (19/48) de los aislados en el cual 10 fueron MDR y 4

XDR, las ST´s predominantes de este clado fueron: ST405 se encontró en 2011,
2012, 2015 en el Hospital I, 2013 en el Hospital II y en el 2015 en el Hospital IV
siendo 2/6 MDR y 2/6 XDR, el resto fueron sensibles, ya que no cumplieron con
los criterios de clasificación de resistencia, sin embargo también se localizó en
58
(MLST).
muestra de urocultivo y hemocultivo, así como en superficies inertes, la ST25 se

encontró en el 2015 en el Hospital I, 2013 en el Hospital II y en 2015 en el Hospital
IV siendo 2/6 MDR y 2/6XDR; estas ST´s son de mayor importancia ya que se
encuentra presente en 3 hospitales localizados en diferentes puntos geográficos
de la CDMX, provinieron de muestras clínicas como de superficie, la ST1088 solo
se encontró en superficies inertes en el 2013 del Hospital II, siendo endémica para
dicho hospital.
Se ha descrito la prevalencia mundial de la ST258, sin embargo, en este estudio

no se encontró dicha ST, Córdovaa y cols., 2012 reportaron que en Argentina la
ST258 predominó en pacientes con HAI proveniente de la unidad de Cirugía y
dichas cepas presentaron resistencia a carbapenémicos (Córdovaa et al., 2012).
En Estados Unidos, especialmente los aislados clasificados como ST 258, se han
convertido en una causa importante de muertes hospitalarias. Son
predominantemente resistente a múltiples fármacos, y por lo tanto, las infecciones
causadas por ellos son difíciles de tratar. No se sabe por qué el linaje ST258 es la
causa más frecuente de infecciones con multiresistencia en ese país (Kitchel et
al., 2009; Frank et al., 2013). Cabe mencionar que se debe de tomar en cuenta
medidas adecuadas para la prevención y control de los posibles brotes
nosocomiales ocasionados por la ST258.
En China se encontraron las ST11, ST37 y ST392, asociadas a la resistencia de

carbapenemes (Yang et al., 2013), en donde la ST11 ha presentado variaciones
mínimas, en este estudio el algoritmo de eBURST la señalo como fundadora del
principal complejo clonal, sin embargo, no fue encontrada en las dentro de las 48
cepas analizadas, en el caso de la ST37 fue encontrada en una cepa sensible a
antibióticos, lo cual no coincide por lo publicado por Yang y clos., 2013 mientras
que la ST392 prevalece con múltiple resistencia a antibióticos.
59
(MLST).
Otros estudios reportaron que en Francia en el 2014, la ST23 se relacionó con

cepas MDR (Davenet et al., 2014), en el siguiente año dicha ST23 también se
encontró en China prevaleciendo su resistencia a antibióticos (Ting et al., 2015),
dicha ST no coincidió con lo obtenido en este estudio, ya que solo se encontró en
un aislado en el 2011 y esta era sensible a casi todos los antibióticos.
Las ST´s que prevalecieron en este estudio no tienen reportes internacionales; sin
embargo, se debe tener especial cuidado ya que la mayoría fueron
multiresistentes, lo cual representan una aportación al estudio de MLST en México
en cepas de K. pneumoniae.
60
(MLST).
7.0 CONCLUSIONES
1. Se aislaron e identificaron 93 cepas clínicas de K. pneumoniae, a partir de

urocultivos, seguidas de hemocultivos.
2. La resistencia a antibióticos las agrupó en MDR, XDR y PDR, el 96%

(89/93) fue resistente a ampicilina, BLEE´s 60% (59/93) fueron positivas
en la prueba confirmatoria y hubo, solo una resistente a imipenem PDR.
3. Se estandarizó la técnica de MLST, en el cual se utilizó siete genes

constitutivos (rpoB, gapA, mdh, pgi, phoE, infB, y tonB) y K. pneumoniae
ATCC 700603 con ST489.
4. La resistencia a BLEE´s no tuvo relación con la ST obtenida. Los aislados

clínicos con ST25, ST36, ST392, ST405 y ST551 se asociaron a brotes
nosocomiales debido a su prevalencia en el ambiente hospitalario; las
ST405 y ST551 se encontraron en muestras clínicas y de superficie, la
ST1088 solo fue encontrada en superficies, lo que presenta un peligro para
los pacientes debido a que están inmunocomprometidos.
61
(MLST).
8.0 BIBLIOGRAFÍA
Arenas, N. E., Gutiérrez, A. J., Salazar, L. M., Polanco, J. C., Gómez, A. (2009).
Construcción de una filogenia molecular para las especies de los géneros
Klebsiella y Raoultella basada en los genes ARNr 16S y ARN polimerasa
subunidad. Revista Ciencias de la Salud, 7.
Ambler RP. (1980) The structure of β-lactamases. Philosophical Transactions of

the Royal Society B: Biological Sciences; 289:321-31.
Bougnoux M.E., Morand S., d'Enfert C. (2002) Usefulness of multilocus sequence

typing for characterization of clinical isolates of Candida albicans. Journal of
Clinical Microbiology; 40:1290-7.
Bush K, (1995). A functional classification scheme for β-lactamases and its

correlation with molecular structure. Antimicrobial Agents Chemotherapy; 39:1211-
33.
Bush K., Jacoby G. (2010). Updated Functional Classification of β-Lactamases.

Antimicrobial Agents Chemotherapy; 54: 969–976.
Brueggemann A.B., Griffiths D.T., Meats E., Peto T., Crook D.W., Spratt B.G.
(2003). Clonal relationships between invasive and carriage Streptococcus
pneumoniae and serotype- and clone-specific differences in invasive disease
potential. The Journal of Infectious Diseases; 187:1424-32.
Cardozo-Bernal Á. M., (2013). Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for the

molecular differentiation of Listeria monocytoge. Journal of the Faculty of Sciences;
203:222
CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute (2014). Performance Standards

for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fourth Informational Supplement
M100-S24.
Córdovaa E., Lespadaa M.I., Gómez N., Pasteránc F., Oviedoa V., Rodríguez C.
(2012). Descripción clínica y epidemiológica de un brote nosocomial por Klebsiella
pneumoniae productora de KPC en Buenos Aires, Argentina. Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica; 30:376–379
62
(MLST).
Cuenca, F., Cerero, L., Hernández, Á. (2013). Técnicas de tipificación molecular

para la vigilancia y control de la infección. Enfermedades Infecciosas y
Microbiología Clínica; 31: 20-25.
Curiel D., Tinoco J., Gayosso C., Carlos A., Daza C, Perez-Prado M., Salcido
L., Santos J., Alpuche-Aranda C. (2004). Nosocomial Bacteremia and Urinary
Tract Infections Caused by Extended-Spectrum β-Lactamase-Producing Klebsiella
pneumoniae with Plasmids Carrying Both SHV-5 and TLA-1 Genes. Clinical
Infectious Diseases; 38:1067-1074.
Davenet s., Criscuolo A., Ailloud F., Passet V., Jones L., Delannoy-Vieillard
A.S., Garin B., Le-Hello S., Guillaume A., Nicolas-Chanoine M., Decré D., Brisse S.
(2014). Genomic Definition of Hypervirulent and Multidrug-Resistant Klebsiella
pneumoniae Clonal Groups. Emerging Infectious Diseases; 20: 1812–1820.
Diancourt, L., Passet, V., Verhoef, J., Grimont, P. A., Brisse, S. (2005). Multilocus
sequence typing of Klebsiella pneumoniae nosocomial isolates. Journal of clinical
microbiology; 43:4178-4182.
Díaz M.A., Hernández J.R., Martínez-Martínez L., Rodríguez-Baño J., Pascual A.

(2006). Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae productoras de betalactamasas
de espectro extendido en hospitales españoles: segundo estudio multicéntrico.
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica; 27:503-510
Enright M.C., Spratt B.G. (1998). A multilocus sequence typing scheme for
Streptococcus pneumoniae: identification of clonas associated with serious
invasive disease. Journal of clinical microbiology; 144:3049-60.
Enright M.C., Day N.P., Davies C.E., Peacock S.J., Spratt B.G. (2000). Multilocus
sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-
susceptible clonas of Staphylococcus aureus. Journal of clinical microbiology;
38:1008-15.
Espinal P., Mantilla J., Saavedra C., Leal C., Alpuche C., Valenzuela E. (2004).
Epidemiología molecular de infección nosocomial por Klebsiella pneumoniae
productora de beta-lactamasas de espectro extendido. Biomédica; 24:252-61
63
(MLST).
Feil E.J., Li B.C., Aanensen D.M., Hanage W.P., Spratt B.G. (2004). eBURST:
inferring patterns of evolutionary descent among clusters of related bacterial
genotypes from multilocus sequence typing data. Journal of Bacteriology;
186:1518-30.
Frank R., Chen L., Porcella S., Martens C., Kobayashi S., Porter A., Chavda K.,
Jacobs M., Mathema B., Olsen R., Bonomo R., Musser J., Kreiswirth B. (2013).
Molecular dissection of the evolution of carbapenem-resistant multilocus sequence
type 258 Klebsiella pneumoniae. Current Issue; 111: 4988-4993
Giono, S. C. (2005). Diagnostico de Laboratorio de Infecciones Gastrointestinales.

En Fundamentos del Diagnostico Bacteriologico (pág. 181:209). INDRE.
Guzmán M., Alonso G. (2010). Characterization of the variable region within class
1 integrons in Klebsiella pneumoniae nosocomials strain. Revista médica de
Chile v.138 n.3
Hall T., (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and
analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium 41:95-98
Highsmith A.K., Jarvis W.R. (1985). Klebsiella pneumoniae: selected virulence

factors that contribute to pathogenicity. Infection Control; 6:75-7.
Hernandez, J.A., Jimenez A., Mullineaux P., Sevilia F., (2000). Tolerance of pea
(Pisum sativum L.) to long-term salt stress is associated with induction of
antioxidant defences. Plant Cell Environ; 23: 853-862.
Hidron, A. I., Edwards, J. R., Patel, J., Horan, T. C., Sievert, D. M., Pollock, D. A.,
Fridkin, S. K. (2008). Antimicrobial-resistant pathogens associated with healthcare-
associated infections: annual summary of data reported to the National Healthcare
Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention, 2006–2007.
Infection Control; 29:996-1011.
Horcajada J. P., Padilla B. (2013) Endemic and epidemic. Investigation of a

nosocomial outbreak. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica; 31:181-6
Izquierdo L. (2003). Biosintesis del lipopolisacarido de Klebsiella pneumoniae.

Tesis doctoral, Barcelona, pp 3-19
64
(MLST).
Jane D., Rhinehart E., Jackson M., Chiarello L., The Healthcare Infection Control
Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions:
Preventing Transmission of Infectious Agents in Health Care Settings. American
Journal of Infection Control; 35:65-164
Jolley K.A., Feil E.J., Chan M.S., Maiden M.C. (2001). Sequence type analysis and
recombinational tests (START). Bioinformatics; 17:1230-1.
Kanki, M., Yoda, T., Tsukamoto, T., Shibata, T. (2002). Klebsiella pneumoniae
produces no histamine: Raoultella planticola and Raoultella ornithinolytica strains
are histamine producers. Applied and environmental microbiology; 68: 3462-3466.
Kitchel B.1, Rasheed J.K., Patel J.B., Srinivasan A., Navon-Venezia S., Carmeli
Y., Brolund A., Giske C.G. (2009). Molecular epidemiology of KPC-producing
Klebsiella pneumoniae isolates in the United States: clonal expansion of multilocus
sequence type 258. Antimicrobial Agents Chemotherapy; 53:3365-70.
Knothe, H., P. Shah, V. Krcmery, M., S. Mitsuhashi. (1983). Transferable

resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates
of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens. Infection; 11:315–317.
Koneman, Winn, Allen, Janda, Procop, Woods, Schreckenberger (2008).

Diagnostico Microbiologico. Buenos Aires : Panamericana.
Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam
H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson
T.J., Higgins D.G. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics;
23:2947-8.
Ledermann W. (2007). Una historia personal de las bacterias. Sociedad Chilen de

infectología, RIL editores.
Librado, P., Rozas, J. (2009). DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of
DNA polymorphism data. Bioinformatics; 25: 1451-1452.
Lombardo E., Hernández H., Pérez V.M., Orozco E.H., Soto E.E., Haro E.A.,
Caniza M. (2012). Estudio de prevalencia puntual en un hospital pediátrico de
tercer nivel. Acta Pediátrica de México, 33(2).
65
(MLST).
Magiorakos, A. P., Srinivasan, A., Carey, R. B., Carmeli, Y., Falagas, M. E., Giske,
C. G., Monnet, D. L. (2012). Multidrug resistant, extensively drug resistant and
pandrug, resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard
definitions for acquired resistance. Clinical Microbiology and Infection; 18:268-281.
Maiden, M. C., Bygraves, J. A., Feil, E., Morelli, G., Russell, J. E., Urwin, R., Spratt,
B. G. (1998). Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification
of clonas within populations of pathogenic microorganisms. Proceedings of the
National Academy of Sciences; 95:3140-3145.
Martínez J., Martínez L., Rosenblueth M., Silva J., Martínez-Romero E. (2004).
How are gene sequence analysis modifying bacterial taxonomy? The case of
Klebsiella. International Microbiology; 7:261-68.
Morones-Esquivel I., Salgado-Muñoz T.G., Gonzaga-López T.I., Matamoros-Mejía

A.P., Terán-González J.O., Arteaga-Vázquez S., Castro-D’Franchis L.J., Reyes-
Jiménez A.E., López-González D.S., Meza-Oviedo D. (2016). Enterobacterias con
betalactamasas de espectro extendido en hemocultivos y urocultivos. Medicina
Interna de México; 32:381-387.
Mendoza-Patiño N., Campos-Sepúlveda A. (2008). Actualidades Farmacológicas.

Revista de la Facultad de Medicina; 51:29-32.
NOM-EM-002-SSA2-2003, NORMA Oficial Mexicana de Emergencia Para la

vigilancia epidemiológica, prevención y control de las infecciones nosocomiales.
Estados Unidos Mexicanos: Secretaria de salud.
NORMA Oficial Mexicana NOM-045-SSA2-2005, Para la vigilancia epidemiológica,

prevención y control de las infecciones nosocomiales. Estados Unidos Mexicanos:
Secretaria de salud.
Odds F.C. y Jacobsen M.D. (2008). Multilocus Sequence Typing of

Pathogenic Candida Species. Eukaryot Cell; 7:1075–1084.
OMS, Organización Mundial de la Salud (2003). Prevención de las infecciones

nosocomiales.
66
(MLST).
Paterson D.L., Ko W.C., Von Gottberg A., Mohapatra S., Casellas J.M., Goossens
H., Victor L.Y. (2004). Antibiotic therapy for Klebsiella pneumoniae bacteremia:
implications of production of extendedspectrum β-lactamases. Clinical Infectious
Diseases; 39:31-37.
Paterson D.L. y Bonomo R. A. (2005). Extended-spectrum β-lactamases: a Clinical

Update. Clinical Microbiology Reviews; 18:657-686.
Perez, F., Endimiani, A., Hujer, K.M., Bonomo, R. A. (2007). The continuing
challenge of ESBLs. Current opinion in pharmacology; 7:459-469.
Pumarola, A., Rodríguez A., García J., & Piedrola G. (1991). Microbiología y
Parasitología Médica. Barcelona.
Ramm L.E., Whitlow M.B., Mayer M.M. (1983). Size distribution and stability of the
trans-membrane channels formed by complement complex C5b-9. Molecular
immunology; 20:155-160.
Reyes, R. (2005.). El hierro y la virulencia bacteriana. Enfermedades Infecciosas y

Microbiología Clínica; 25:104-107.
RHoVE, Red Hospitalaria de Vigilancia Epidemiológica (2015). Manual de

procedimientos estandarizados para la vigilancia epidemiológica. Secretaria de
salud.
Rocha R., (2006). Mecanismos de Patogenicidad e Interacción: Parásito-

Hospedero I. Direccion y fomento editorial.
Sahly H., Navon-Venezia S., Roesler L., Hay A., Carmeli Y., Podschun R. Ofek, I.
(2008). Extendedspectrum β-lactamase production is associated with an increase
in cell invasion and expression of fimbrial adhesins in Klebsiella pneumoniae.
Antimicrobial agents and chemotherapy; 52:3029-3034.
Salemi M., Vandamme A.M. (2003). The Phylogenetic Handbook: A Practical

Approach to DNA and Protein Phylogeny. Systematic Biology; 54:984-986.
Sambrook J. (1989). Molecular Cloning. En Bowtell, Analysis and Cloning of

Eukaryotic Genomic DNA. Cold Spring Harbor Laboratory Press, pág. 9.22.
67
(MLST).
Sánchez-Romero I., Asensio A., Oteo J., Muñoz-Algarra M., Isidoro B., Vindel A.,
Álvarez-Avello J., Balandín-Moreno B., Cuevas O., Fernández-Romero S.,
Azañedo L., Sáez D., Campos J. (2011). Nosocomial Outbreak of VIM-1–
producing Klebsiella pneumoniae of multilocus sequence type 15: Molecular basis,
clinical risk factors, and outcome. Antimicrob Agents Chemother; 56:420-7.
Schwartz D.C., Cantor C.R. (1984). Separation of yeast chromosome-sized DNAs

by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell.; 37:67-75.
Sydnor Emily R. M., Trish M. Perl (2011). Hospital Epidemiology and Infection
Control in Acute-Care Settings. Clinical Microbiology; 24:141.
Suarez y Gudiol, (2009). Beta-lactam Antibiotics. Enfermedades Infecciosas y

Microbiología Clínica; 27:116.
Tsai S.S., Huang J.C., Chen S.T., Sun J.H., Wang C.C., Lin S.F., Hsu B.R., Lin
J.D., Huang S.Y., Huang Y.Y. (2010). Characteristics of Klebsiella pneumoniae
bacteremia in community-acquired and nosocomial infections in diabetic patients.
Chang Gung Medical Journal; 33:532-9.
Tenover F., Arbeit R., Goering R., Mickelsen P., Murray B., Persing D,
Swaminathan B. (1995) Interpreting chromosomal DNA restriction patterns
produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing.
Journal of clinical microbiology; 33:2233–2239.
Ting-ting Qu, Jian-cang Z., Yan J., Ke-ren S., Bin L., Ping S., Ze-qing W.,Yun-
song Y. (2015). Clinical and microbiological characteristics of Klhiebsiella
pneumoniae liver abscess in East China. Infectious Diseases; 15:161
Ullmann U., Podschun R. (1998). Klebsiella spp. as Nosocomial Pathogens:

Epidemiology, Taxonomy, Typing Methods, and Pathogenicity Factors. Clinical
Microbiology Reviews; 11:589.
Vargas L. (2010). K. pneumoniae: ¿la nueva “superbacteria”? Patogenicidad,

epidemiología y mecanismos de resistencia. Revista Médica Universidad de
Antioquia; 23:157-165.
Vázquez A., Berrón S. (2004). Multilocus sequence typing: el marcador molecular

de la era de Internet. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica; 23:157-
165.
68
(MLST).
Vimont S., Minif B., Fevre C., Brisse S. (2008). Comparison of PFGE and
multilocus sequence typing for analysis of Klebsiella pneumoniae isolates. Medical
Microbiology; 57:1308-1310 .
Wang Q., Li B., Tsang A.K., Yi Y., Woo P.C., Liu C.H. (2013). Genotypic analysis
of Klebsiella pneumoniae isolates in a Beijing hospital reveals high genetic
diversity and clonal population structure of drug-resistant isolates. PloS one; 8(2).
Yang J, Ye L., Guo L., Zhao Q., Chen R., Luo Y., Chen Y., Tian S., Zhao J., Shen
D., Han L. (2013). A nosocomial outbreak of KPC-2-producing Klebsiella
pneumoniae in a Chinese hospital: dissemination of ST11 and emergence of ST37,
ST392 and ST395. Infectious Diseases; 7:72
Yu L. Y., Hansen D. S., Ko W. C., Sagnimeni A., Klugman, K. P., Von-Gottberg A.,
International Klebsiella Study Group. (2007). Virulence characteristics of Klebsiella
and clinical manifestations of K. pneumoniae bloodstream infections. Emerging
infectious diseases; 13:986.
URL 1. (02 de 03 de 2016). Obtenido de

https://www.google.com.mx/search?q=mecanismo+de+patogenesis+de+la+
neumonia&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=tQn4UvK7GqnkyQHmsoGIBA
&ved=0CAcQ_AUoAQ&biw=1024&bih=667#facrc=_&imgdii=_&imgrc=sI4T
Mfzm3TODaM%253A%3BpoI-
CmZQfjqB4M%3Bhttp%253A%252F%252F4.bp.blogs
URL 2. (13 de 03 de 2016). Obtenido de

http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-
10182003020100002
URL 3. (s.f.). Obtenido de página del Instituto de Pasteur

http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html
URL 4. (s.f.). Obtenido de página de MLST http://pubmlst.org
69
(MLST).
9.0 ANEXO
ANEXO I Metodología
I.I Extracción de DNA por el método del Tiocianato-Guanidina (TG)
1. Cosechar una placa de 24hrs de incubación, resuspender en tubos

eppendorf con 250 µL solución de lisis pH 7.6 e incubar a 60°C/24hrs
2. Colocar la suspensión en baño maría a 100°C/15min e inmediatamente en
hielo durante 10min
3. Agregar 400µl de GE (Guanidina 5.0M, EDTA 0.1M; pH8) homogenizar y
adicionar 25µL de sarcosinato 10%, mezclar nuevamente por inversión,
dejar a temperatura ambiente durante 5 min, pasado este tiempo colocar
en hielo 20 min
4. Adicionar 200 µL de acetato de amonio 7.5 M, mezclar por inversión e
incubar a temperatura ambiente durante 5 min, posteriormente 10 min en
hielo.
5. Realizar lavado con 400 µL de cloroformo/isoamílico frío (24:1), mezclar
por inversión y centrifugar a 10000 rpm durante 10 min
6. Recuperar la fase acuosa en un tubo eppendorf limpio
7. Repetir los pasos 5 y 6 (solo si esta amarillo)
8. Adicionar 500 µL de isopropanol, mezclar por inversión y dejar precipitar
24hrs/ -20°C, centrifugar durante 10 min a 10000 rpm. Decantar el
sobrenadante.
9. Lavar la pastilla de DNA con etanol frío al 70%, centrifugar a 10000 rpm
durante 5 min, repetir 2 veces
10. Secar la pastilla al aire
11. Hidratar la pastilla de DNA con 50 µL de agua inyectable
12. Leer a ∆ 260 nm y determinar la concentración de DNA
13. Conservar a una temperatura -20°C
70
(MLST).
I.II Purificación del amplicón
PureLink Quick Gel Extraction and PCR Purification combo kit (Invitrogen®)
1. Realizar un corte en el gel donde se encuentra el fragmento amplificado de

DNA a purificar usando una navaja limpia, y colocarlo en un tubo eppendorf
de 1.5 mL.
2. Pesar el fragmento en una balanza analítica con una escala sensitiva de
0.001g, cuidando que el peso máximo por tubo no exceda los 400mg.
3. Agregar 3 volúmenes del buffer de solubilización (L3) por un volumen gel.
4. Colocar a 50°C/10 min, invertir el tubo cada 3 minutos para asegurar la
completa disolución del gel.
5. Incubar el tubo por 5 min adicionales.
6. Adicionar un volumen de isopropanol por volumen de gel, mezclar por
inversión.
7. Pipetear la disolución del gel en el centro de una columna de PureLink®
que se encuentra en una tubo de lavado.
8. Centrifugar a 10,000 rpm/1min y descartar el contenido del tubo de lavado.
9. Adicionar 700 µl de buffer de lavado (W1), el cual contiene etanol.
10. Centrifugar a 10,000 rpm/1min, desechar el filtrado y volver a centrifugar
10,000 rpm/3min para remover cualquier residuo de buffer de lavado,
cambiar el tubo de lavado por un tubo de elución.
11. Agregar 50 µl de buffer de elución (E1) en el centro de la columna.
12. Incubar por 1 minuto a temperatura ambiente y centrifugar a 10,000
rpm/1min, almacenar el DNA purificado en el tubo de elución a una
temperatura de -20°C.
71
(MLST).
Purificación de producto de PCR protocolo Montage life ciencia kits

GENOMICS Millipore ®
1. Agregar 300 µl de agua inyectable en la columna de filtrado “Spin the

montage PCR” (cuidando no tocar la membrana con la pipeta),
posteriormente adicionar 100 µl de la reacción de PCR.
2. Centrifugar a 10,000 rpm/15min, desechar el filtrado de la columna,
sustituir el tubo eppendorf por uno nuevo.
3. Agregar 20 µl de agua inyectable, centrifugar a 10,000 rpm/2min
4. Almacenar el DNA purificado a una temperatura de -20°C
EZ-10 Spin Column PCR purification kit (BioBasic®)
1. Agregar en la columna de filtrado EZ-10 una mezcla del producto de PCR

más 5 volúmenes de buffer B3, dejarlo 2 min a temperatura ambiente.
2. Centrifugar a 10,000 rpm/2min y decantar el fluido del tubo colector.
3. Adicionar 350 µl de solución de agua, centrifugar a 10,000 rpm/2min y
desechar residuo del tubo colector.
4. Repetir paso 3.
5. Agregar 50 µl de buffer de elución en el centro de la columna y pasar la
misma a un tubo eppendorf nuevo.
6. Incubar 2 min a temperatura ambiente, centrifugar a 10,000 rpm/2min
conservar el DNA purificado a -20°C.
Gene JET PCR Purification kit (Thermo Scientific)
1. Agregar en un tubo eppendorf volumen/volumen del producto de PCR más

“binding buffer” observándose un color amarillo en la solución (si el color es
anaranjado o violeta agregar 10 µl de acetato de sodio 3M, pH 5.2).
72
(MLST).
2. Adicionar 100 µl de isopropanol, homogenizar y transferir la mezcla a una

columna de purificación.
3. Centrifugar a 10,000 rpm/1min y decantar el filtrado.
13. Adicionar 700 µl de solución de agua concentrada, centrifugar a 10,000
rpm/1min y desechar residuo del tubo de centrifuga, volver a centrifugar
10,000 rpm/3min para remover todo residuo y transferirla columna a un tubo
eppendorf nuevo.
4. Agregar 50µl de buffer de elución en el centro de la columna, incubar 2 min
a temperatura ambiente, centrifugar a 10,000 rpm/2min guardar el DNA
purificado a -20°C hasta su uso.
I.III Purificación de la reacción de secuenciación
1. Preparar el Sephadex G-50 Sigma® (2.6g en 40 ml de agua), mezclar y

dejar reposar por dos horas.
2. En una columna colocar la tapa inferior agregar 800µl del Sephadex
hidratado, evitando hacer burbujas y dejar reposar durante 5 min
3. Quitar la tapa inferior de la columna y colocarla en un tubo colector
4. Centrifugar a 2,800 rpm/2min cuidando la posición de la columna, transferir
la columna a los tubos eppendorf, previamente rotulados.
5. A los tubos que contienen la reacción de secuenciación se le agregar 10 µl
de agua inyectable, colocar la mezcla (amplicon más agua) en el centro de
la columna, centrifugar a 2800rpm/3min cuidando que la posición de la
columna se la misma que el paso 4.
6. Desechar la columna y secar la muestra en un concentrador a 45°C el
tiempo necesario.
73
(MLST).
I.IV Análisis bioinformático
Obtención de las secuencias del alelo 1 de los genes constitutivos
La secuencia de los genes constitutivos “housekeeping” (gapA, infB, mdh, pgi,

phoE, rpoB, tonB), de K. pneumoniae obtenidas correspondieron al alelo 1 en
todos los genes.
El análisis consistió en los siguiente: con la herramienta Entrez del NCBI (“National
center for Biotechnology Information” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
En el menú All Databases se desplegó la lista de bases de datos con que cuenta
el NCBI, a continuación se seleccionó la opción nucleotide para la búsqueda
(figura 22).
El análisis bioinformático se ejemplificará con la secuencia de gapA
Figura 22. Búsqueda de la secuencia de K. pneumoniae correspondiente al alelo 1 del gen

gapA. Una vez que abrió la opción de interés, se descargó la secuencia de nucleótidos en formato
FASTA, (compatible con los programas de alineamiento o edición), para guardarlo en el equipo de
cómputo se seleccionó Send > File> Format FASTA> Creater File, se seleccionó el destino y
nombre del archivo; preferentemente gapA genebank, para diferenciarla del archivo de la
secuencia obtenida experimentalmente.
74
(MLST).
Análisis de la secuencia del gen en relación a su alelo 1
Las secuencias a analizadas fueron recibidas en un archivo zip sin formato; la cual
se ordenó por carpetas de acuerdo al gen correspondiente. El archivo se abrió con
el programa FinchTV, que permitió crear un nuevo documento, para su acceso a
través del programa en bloc de notas (figura 23).
Figura 23. Visualización de la secuencia con el programa FinchTv. El archivo se

almacenó en formato Fasta, a continuación se seleccionó la opción File> Export> DNA
Sequence: FASTA. Y se guardó el archivo con la extensión (gapA.txt).
Se abrió un archivo nuevo de Bloc de notas donde se juntó la secuencia del gen
gapA descargado de la base de datos del gene bank de la NCBI y la secuencia del
gen a analizar. Este se guardó como gapAvisor (figura 24).
75
(MLST).
Figura 24. Creación del archivo de los genes secuenciados para su análisis. Se
observa gapA alelo 1 de K. pneumoniae ATCC 13883T y gapA secuenciado de
K. pneumoniae ATCC 700603
Para realizar el alineamiento de ambas secuencias se abrió el nuevo archivo en el

programa ClustalX desplegar el menú File>Load sequences seleccionar el archivo
previamente creado gapAvisor, seleccionar Alignment> Do complete alignment.>
ALING (figura 25).
Secuencias por
alinear
Posición de los
nucleótidos
Figura 25. Visualización de ambas secuencias con el programa ClustalX versión

1.83. Se observa paso a paso la alineación de ambas secuencias, para poder
compararlas y poder editarlas.
76
(MLST).
Una vez alineado se procede a guardar los cambios, en ese momento en la

carpeta se crearon dos archivos con extensiones distintas: .aln y otro .dnd; el
archivo de interés será el que tiene formato .aln el cual nos permitió abrir en
archivo en el programa BioEdit Sequence Alignment Editor; para realizar la
edición. Una vez abierto el programa BioEdit Sequence Alignment Editor se
seleccionó en el icono Mode > Edit (figura 26). En este momento también se abrió
el programa FinchTV versión 1.4.0 del gen secuenciado, para la realización de la
edición y el análisis. Se comparó la altura y ancho de la curva del nucleótido en
toda la secuencia correspondiente al gen secuenciado, comparándolo con la
secuencia reportada en el genbank.
Posición de los
nucleótidos
Figura 26. Visualización de las secuencias en el programa BioEdit Sequence

Alignment Editor. (*) Indica que el nucleótido es el mismo; en caso que no lo presente
señala que el nucleótido secuenciado es diferente al del gen bank.
77
(MLST).
En el caso que ambas secuencias no coincidieron se realizó la edición del nucleótido.

Como se observa en la imagen en la posición del nucleótido 467, no coincidió el
nucleótido Citocina; y la Guanina de la secuencia escrita; por lo tanto se cambió G por C
(figura 27).
Figura 27. Edición de nucleótidos con los programas FinchTV versión 1.4.0 y
BioEdit Sequence Alignment Editor. En el cuadro en rojo indica la posición de los
nucleótidos que se analiza.
Finalizada la edición se eliminaron gaps y se creó un archivo con formato txt File>
Save As con nombre gapAedit, se abrió el archivo en Bloc de notas y eliminar todo
aquello que no pertenezca a la secuencia del gen analizado, creando un nuevo
archivo guardado como gapAeditado consiste en la secuencia analizada y editada
del gen gapA (figura 28)
78
(MLST).
Figura 28. Secuencia editada del gen gapA. Esta secuencia es la que se inglesara en la
base de datos del instituto de Pasteur.
A continuación se acceso a la base de datos de la página web:

httpbin/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef_public&page=sequenceQu
ery donde se subió la secuencia analizada y se le asignó el alelo al gen
correspondiente por lo que se seleccionó la opción Submit después de introducir
la secuencia en el cuadro de diálogo. El servido envía el número alelo del gen
gapA; en este caso el gen analizado correspondió al alelo 18 (figura 29)
79
(MLST).
Figura 29. Introducción de la secuencia analizada en la base de datos. En el

recuardro rojo se observa el número de alelo arrojado por la base de datos internacional
para MLST.
El mismo procedimiento se realizó para obtener el número de alelo de los siete

genes constitutivos: rpoB, gapA, mdh, pgi, phoE, infB, tonB de la cepa de
referencia ATCC700603 de K. pneumoniae.
80
(MLST).
En el servidor (http://bigsdb.web.pasteur.fr/cgi-
bin/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef_public&page=profiles&scheme_id=)
se introdujo el alelo correspondiente a cada gen constitutivo (figura 30).
Figura 30. Obtención de la secuencia tipo de K. pneumoniae ATCC 700603 partir del
perfil alélico. La secuencia tipo o perfil alélico obtenido fue: ST: 489
81
(MLST).
Anexo II Resultados
II.I Frecuencia alélica de los genes “houskeeping” empleados en MLST
Tabla 13. Frecuencia de alelos empleados en MLST para K. pneumoniae
Alelos gapA infB mdh pgi phoE rpoB tonB

1 - 36 22 34 7 15 -
2 32 - 9 - - - -
3 12 2 - 7 - - -
4 3 6 - - 2 31 3
5 - 1 2 - - - -
6 - - 4 1 - - -
7 - - - - 12 - 4
8 - - - - 1 1 -
9 - 2 - - 10 - -
10 - - - 4 11 - 2
11 - - 1 - - - -
12 - - - - - - 4
13 - - - - 3 - 8
15 - - - - - - 1
16 - - - - - - 1
17 - - - - 1 - -
18 - - - - - - 1
23 - - - - - - 1
24 - - - - - - 1
32 - - 1 - - - -
40 - - - - - - 3
42 - - - - - - 1
51 1 - - - - - -
52 - - - 1 - - -
60 - 1 - - - - -
62 - - 6 - - - -
76 - - - - - - 4
79 - - - - - - 1
88 - - 1 - - - -
94 - - - - - 1 -
97 - - 1 - - - -
110 - - - - - - 6
117 - - - 1 - - -
135 - - - - - - 6
164 - - 1 - - - -
213 - - - - 1 - -
303 - - - - - - 1
Total 4 6 10 6 9 4 17
82

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

P AR A OBTENER EL TÍ TULO DE:

QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO

ERIKA GABRIELA SIERRA ATANACIO

Dra. Silvia Giono Cerezo

Dra. Rosa González Vázquez

CIUDAD DE MÉXICO, SEPTIEMBRE DE 2016

Forma parte de los proyectos

Infecciones nosocomiales resistentes a antibióticos, biopeliculas in vitro en:

4.6.5 Análisis bioinformático 35

Figura 24. Creación del archivo de los genes secuenciados para su . 76

Objetivo. Establecer las relaciones genéticas de aislados clínicos de diferente origen

Resultados. Se aislaron e identificaron 93 cepas clínicas de K. pneumoniae, a partir

Conclusión. Los aislados ST25, ST36, ST392, ST405 y ST551 se asociaron a

1.1.1. Taxonomía de K. pneumoniae

En 1888 Friedlander describió a K. pneumoniae causante de neumonía. Esto se

La clasificación de especies de Klebsiella (Tabla 1), se basó inicialmente en sus

Tabla 1. Taxonomía de K. pneumoniae

Figura 1. Morfología de Klebsiella pneumoniae. a) Morfología microscópica por tinción

Tabla 2. Diferenciación por pruebas bioquímicas de las dos especies de

1.2. Factores de virulencia

Los principales factores de virulencia asociados a K. pneumoniae son:

Figura 2. Representación esquemática de los factores de virulencia en

La cápsula está compuesta de polisacáridos y ácidos complejos (ácido urónico),

Figura 3. Representación de la evasión de la fagocitosis. La cápsula cubre al

Las propiedades adhesivas están mediadas generalmente por diferentes tipos de

1.2.3. Resistencia a anticuerpos y lipopolisacáridos

La acción bactericida del suero es mediada principalmente por proteínas, en

1.3. Importancia de infecciones nosocomiales (HAI)

Las Infecciones Nosocomiales (“Healthcare associated infections”, HAI, por sus

La Norma Oficial Mexicana NOM-EM-002-SSA2-2003, para la vigilancia

Una encuesta de prevalencia realizada en el 2003 por la OMS en 55 hospitales de

En un estudio de prevalencia de HAI realizado en México durante el 2011 por la

Los procedimientos invasivos juegan un papel importante en el desarrollo de HAI,

Tabla 3. Criterios simplificados para la vigilancia de las infecciones nosocomiales

Tipo de infección nosocomial Criterios simplificados

Infección urinaria Cultivo de orina con resultados positivos (1 ó 2 especies) al

Infección respiratoria Síntomas respiratorios con manifestación de por lo menos

Infección del sitio de inserción de Inflamación, linfangitis o secreción purulenta en el sitio de

Septicemia Fiebre o escalofrío y por lo menos un cultivo de sangre con

Tomado de (OMS, 2003)

Las HAI también pueden considerarse endémicas o epidémicas. Las infecciones

1.3.1. K. pneumoniae en infecciones nosocomiales (HAI)

K. pneumoniae es un patógeno oportunista relacionado con infecciones

K. pneumoniae se describe como el cuarto patógeno causante de HAI y ha sido

Tabla 4. Infecciones nosocomiales causadas por K. pneumoniae

Los datos proporcionados por la RHoVE demuestran un incremento en la

1.4 Resistencia a antibióticos

La aparición de resistencia a múltiples antibióticos en bacterias patógenas se ha

1.4.1 Antibióticos β-lactámicos

Los β-lactámicos son un grupo de antibióticos inocuos para el hombre ya que,

Los antibióticos β-lactámicos presentan en su estructura química un anillo

Figura 4. Estructura de los principales grupos de antibióticos β-lactámicos.

Los antibióticos β-lactámicos son agentes bactericidas que producen su efecto

El anillo β-lactámico presenta una similitud estructural con la región del

Figura 5. Mecanismo de acción del β–lactámico. El β-lactámico inhibe la formación

Las β-lactamasas son enzimas codificadas cromosomalmente en el DNA o por

Figura 6. Hidrólisis del anillo β-lactámico. Al actuar la enzima β-lactamasa rompe el

1.5.1 β-lactamasas de espectro extendido (BLEE’s)