NORMAS DE BIOSEGURIDAD Y MATERIAL DE TRABAJO EN

MICROBIOLOGÍA

I. NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Durante el transcurso del curso de Infectología General los estudiantes deben

adoptar una actitud responsable y critica en el proceso de manipulación
microbiológica. Por esta razón es de vital importancia mantener las siguientes
normas:

Siempre utilizar en el laboratorio delantal blanco

Dejar en sus casilleros o closet los abrigos, libros, etc.
No colocar objetos personales sobre los mesones de trabajo
Respetar siempre las indicaciones que se darán durante las primeras actividades
prácticas respecto al uso del mechero, asas, tubos u otros materiales
La persona con heridas no podrá participar directamente en los ensayos de
laboratorio que pongan en riesgo su salud
Está estrictamente prohibido fumar, comer, ingerir líquidos y maquillarse en el
laboratorio
No tocarse boca ni nariz con las manos durante los procedimientos de laboratorio
No utilizar el delantal para limpiar objetos del laboratorio
Trabajar siempre de modo ordenado y tranquilo, evitar movimientos innecesarios
en el interior del laboratorio
No bloquear los accesos o rutas de escape del laboratorio
No hacer bromas ni permitir que sus compañeros las hagan con el material de
laboratorio
El material a examinar debe manipularse exclusivamente con instrumentos
estériles y nunca con las manos
Avisar al profesor ante cualquier accidente de tipo corto punzante, rasguño o
quemadura. Tratar las cortaduras o rasguños inmediatamente de ocurridos,
limpiando con solución antiséptica.
Botar los desechos de material en un recipiente especial, no utilizar el lavamanos
o desagüe
No salpicar mesones y piso con agua o colorantes
En caso de derrame de material infeccioso, avisar inmediatamente al profesor
Colocar el material de vidrio reutilizable, desechable y corto punzante en
recipientes indicados por el profesor
Los cultivos de desecho deben colocarse en un recipiente adecuado para su
posterior descontaminación
Las pipetas contaminadas deben depositarse en un recipiente con desinfectante
Antes de abandonar el laboratorio se deben lavar cuidadosamente las manos

1
II. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

El trabajo en el laboratorio de microbiología debe ser considerado de alto riesgo

para todo el personal de laboratorio debido al manejo de muestras clínicas
potencialmente contaminadas con patógenos microbianos y de cultivos de
microorganismos obtenidos a partir de dichas muestras clínicas. La exposición del
personal de laboratorio a este riesgo debe ser minimizada y controlada mediante un
plan de bioseguridad en el laboratorio clínico. Los riesgos biológicos infecciosos más
comunes en el laboratorio clínico incluyen cultivos de microorganismos (bacterias,
micobacterias, hongos, virus y parásitos) en altas concentraciones, muestras
clínicas de origen humano o animal conteniendo agentes infecciosos y otros riesgos
como toxinas, alérgenos, productos recombinantes, etc.

Es importante considerar que existen cuatro elementos necesarios para que se

inicie una infección; un hospedero susceptible, un agente infeccioso, la
concentración de dicho agente infeccioso (dosis infectante), y una ruta de
transmisión. Esta última es la única que puede ser controlada por medio de normas
de bioseguridad y por lo tanto es indispensable brindarle especial atención a las
rutas más comunes de transmisión; oral, respiratoria, percutánea y contacto directo
con la piel y/o las mucosas.

Toda muestra clínica; fluidos corporales, tejidos y cultivos microbianos deben ser
considerados como infecciosos para el personal de laboratorio y deben ser
manipulados bajo determinadas medidas de contención, las cuales incluyen
adecuadas prácticas microbiológicas, la utilización de barreras físicas, un adecuado
diseño de laboratorio y cámaras de bioseguridad. El uso de vacunas seguras y
eficaces puede proporcionar un mecanismo adicional para la reducción de las
infecciones ocupacionales.

El establecimiento de los programas de bioseguridad en el laboratorio de

microbiología es responsabilidad de los administradores del mismo. Sin embargo,
es importante tener claro que no es posible crear un ambiente de laboratorio
saludable y seguro sin que cada una de las personas que laboran en él no asuma
su cuota de responsabilidad hacia la seguridad en el laboratorio.

Evaluación del riesgo

año, lesión o enfermedad. En el

contexto de los laboratorios microbiológicos y biomédicos, la evaluación del riesgo
se concentra principalmente en la prevención de infecciones de laboratorio. Cuando
se trate de actividades de laboratorio que involucren material infeccioso o
potencialmente infeccioso, la determinación del riesgo representa un ejercicio crítico
y productivo. Ayuda a asignar los niveles de bioseguridad (instalaciones, equipo y
prácticas) que reducen al mínimo el riesgo de exposición del trabajador o del
ambiente a un agente.

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 La evaluación del riesgo puede ser cualitativa o cuantitativa. Los tipos, subtipos
y variantes de agentes infecciosos que involucran vectores diferentes o inusuales,
la dificultad de los ensayos para medir el potencial de amplificación de un agente y
las consideraciones únicas de los recombinantes genéticos son solamente algunos
de los desafíos que impone la realización de un trabajo de laboratorio seguro. Ante
dicha complejidad, con frecuencia no se cuenta con métodos de muestreo
cuantitativo significativos. Por lo tanto, el proceso de evaluación o determinación del
riesgo cuando se trabaja con materiales que revisten peligro no puede depender de
un algoritmo prescripto. El director del laboratorio o quien se encuentre a cargo de
la investigación será el responsable de evaluar el riesgo con el fin de establecer el
nivel de bioseguridad para el trabajo

Barreras Primarias y Secundarias:

Equipos de Seguridad (Barreras Primarias): Los equipos de seguridad

incluyen gabinetes de bioseguridad, recipientes cerrados, y otros controles de
ingeniería destinados a eliminar o minimizar las exposiciones a materiales biológicos
peligrosos. El gabinete de bioseguridad es el dispositivo principal utilizado para
proporcionar contención de salpicaduras o aerosoles infecciosos generados por
diversos procedimientos microbiológicos. Un ejemplo de otra barrera primaria es la
cubeta centrífuga de seguridad, un recipiente cerrado destinado a prevenir la
liberación de aerosoles durante el centrifugado. Para minimizar este riesgo, se
deben utilizar controles de contención tales como gabinetes de bioseguridad o
cubetas centrífugas cuando deban manipularse agentes infecciosos que puedan
transmitirse a través de la exposición a aerosol.

Los equipos de seguridad pueden también incluir elementos de protección

personal, tales como guantes, ambos, delantales, cobertores de zapatos, botas,
respiradores, máscaras faciales, anteojos de seguridad o antiparras. Los equipos de
protección personal se utilizan en general en combinación con gabinetes de
bioseguridad y otros dispositivos que contienen los agentes, animales o materiales
que se manipulan. En algunas situaciones en las cuales resulta poco práctico

3
trabajar en gabinetes de seguridad biológica, los equipos de protección personal
pueden formar la barrera primaria entre el personal y los materiales infecciosos.

Diseño y Construcción de Instalaciones (Barreras Secundarias): El diseño

y la construcción de la instalación contribuyen a la protección de quienes trabajan
en el laboratorio, proporcionan una barrera para proteger a las personas que se
encuentran fuera del laboratorio, y protegen a las personas o animales de la
comunidad de agentes infecciosos que pueden ser liberados accidentalmente del
laboratorio. La jefatura del laboratorio es responsable de la provisión de
instalaciones que guarden relación con la función del laboratorio y el nivel de
bioseguridad recomendado para los agentes que se manipulan. La barrera o
barreras recomendadas dependerán del riesgo de transmisión de los agentes
específicos. Por ejemplo, los riesgos de exposición de la mayor parte del trabajo en
instalaciones del nivel de Bioseguridad 1 y 2 serán el contacto directo con los
agentes o exposiciones a contactos inadvertidos a través de medio ambientes de
trabajo contaminados. Las barreras secundarias en estos laboratorios pueden incluir
la separación del área de trabajo del laboratorio del acceso al público, la
disponibilidad de una sistema de descontaminación (por ejemplo, autoclave) e
instalaciones para el lavado de las manos. Cuando el riesgo de infección por
exposición a un aerosol infeccioso está presente, quizás sea necesario implementar
un mayor nivel de contención y barreras secundarias múltiples para evitar que los
agentes infecciosos se escapen hacia el medio ambiente. Dichas características de
diseño incluyen sistemas de ventilación especializados para asegurar el flujo de aire
direccional, sistemas de tratamiento de aire para descontaminar o eliminar agentes
del aire de escape, zonas de acceso controladas, esclusas de aire en las puertas de
acceso al laboratorio o edificios o módulos separados para aislar al laboratorio.

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 Clasificación de microorganismos según grupos de riesgo:

El concepto de grupo de riesgo fue desarrollado como una manera de clasificar

los diferentes tipos de microorganismos (bacterias, virus, hongos, parásitos)
dependiendo del grado de virulencia para el ser humano, animales y plantas. Se han
definido cuatro grupos de riesgo de microorganismos, cuyas características se
indican a continuación:

Equipos de Protección Personal (EPP)

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 Niveles de bioseguridad:

Internacionalmente se describen cuatro niveles de bioseguridad (BSLs), que constan

de combinaciones de prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad e
instalaciones de laboratorio. Cada combinación es específicamente apropiada para las
operaciones llevadas a cabo, las vías de transmisión documentadas o sospechadas de
los agentes infecciosos, y la función o la actividad del laboratorio.

El o los Niveles de Bioseguridad para los organismos representan aquellas

condiciones bajo las cuales el agente puede comúnmente manipularse en forma segura.
El director del laboratorio es la persona específica y principalmente responsable de
evaluar los riesgos y de aplicar adecuadamente los niveles de bioseguridad
recomendados. En general, el trabajo con agentes conocidos debe realizarse al nivel de
bioseguridad recomendado. Cuando se cuenta con información específica para sugerir
que la virulencia, la patogenicidad, los patrones de resistencia a antibióticos, la
disponibilidad de vacunas o tratamientos, u otros factores han sido alterados
significativamente, se pueden especificar prácticas más (o menos) estrictas.
A continuación se describen los cuatro niveles de bioseguridad, enfatizando en el
nivel 1, el cual corresponde a este laboratorio.

Nivel de bioseguridad 1

En el nivel de bioseguridad 1 los microorganismos que pueden ser manipulados

están bien definidos y caracterizados por tener una muy baja o ninguna virulencia
para personas adultas saludables y pertenecen al grupo de riesgo 1. El acceso a
este laboratorio debe ser limitado o restringido y las puertas y ventanas deben de
permanecer cerradas, el mobiliario debe ser fácil de lavar y desinfectar y tienen que
estar disponibles lavamanos con jabón, desinfectante y papel toalla. Todos los
desechos generados que implican algún riesgo biológico deben ser autoclavados o
incinerados.
Los procedimientos operativos deben estar incluidos en las guías de
bioseguridad en el laboratorio, deben estar claramente detalladas por escrito y

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accesibles en todo momento para el personal de laboratorio. Se debe proporcionar
un entrenamiento inicial en prácticas microbiológicas, en las guías de bioseguridad
y en los procedimientos para el control de las infecciones a cada uno de los nuevos
empleados, estudiantes y visitantes.

A. Prácticas Microbiológicas Estándar:

1. El acceso al laboratorio es limitado o restringido a criterio de la jefatura

cuando se están llevando a cabo experimentos o trabajos con cultivos y
especímenes.
2. Las personas se lavan las manos luego de manipular materiales viables,
luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio.
3. No está permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto,
maquillarse o almacenar alimentos para uso humano en áreas de trabajo.
Las personas que usan lentes de contacto en laboratorios deben también
utilizar antiparras o un protector facial. Los alimentos se almacenan fuera
del área de trabajo en gabinetes o refrigeradores designados y utilizados
con este único fin.
4. Está prohibido pipetear con la boca; se utilizan dispositivos mecánicos.
5. Se instituyen políticas para el manejo seguro de objetos cortantes o
punzantes.
6. Todos los procedimientos se llevan a cabo con precaución a fin de
minimizar la creación de salpicaduras o aerosoles.
7. Las superficies de trabajo se descontaminan como mínimo una vez por
día y luego de todo derrame de material viable.
8. Todos los cultivos, stocks y otros desechos reglamentados se
descontaminan antes de ser desechados mediante un método de
descontaminación aprobado, como por ejemplo, mediante autoclave. Los
materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato
son colocados en un recipiente duradero, estanco y cerrado para su
transporte desde el laboratorio. Los materiales que se deben
descontaminar fuera del laboratorio inmediato se embalan de
conformidad con las normas locales, estatales y federales aplicables
antes de retirarlos del establecimiento.
9. Se debe colocar una señal de advertencia de riesgo biológico en la
entrada del laboratorio cuando se encuentren presentes agentes
infecciosos. La señal debe incluir el nombre del agente o agentes en uso
y el nombre y número de teléfono del investigador.

B. Prácticas Especiales: Ninguna.

C. Equipos de Seguridad (Barreras Primarias)

1. En general, no se requieren dispositivos o equipos de contención

o equipamientos especiales, como gabinetes de bioseguridad
para las manipulaciones de agentes asignados al Nivel de
Bioseguridad 1.
2. Se recomienda el uso de ambos, delantales o uniformes de
laboratorio a fin de evitar que la ropa de calle se pueda contaminar
o ensuciar.

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 3. Se deben usar guantes si existen heridas en las manos o si la piel
presenta alguna erupción. Deben existir alternativas disponibles
al uso de guantes de látex empolvados.
4. Se debe utilizar protección ocular para los procedimientos en los
que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros
materiales peligrosos.

D. Instalaciones del Laboratorio (Barreras Secundarias)

1. Los laboratorios deben tener puertas para el control de acceso.

2. Cada laboratorio contiene un lavamanos.
3. El laboratorio ha sido diseñado para que su limpieza sea sencilla. Las
alfombras no son adecuadas para los laboratorios.
4. Las superficies de las mesas de trabajo son impermeables al agua y
son resistentes al calor moderado y a solventes orgánicos, ácidos,
álcalis y productos químicos utilizados para descontaminar la
superficie de trabajo y los equipos.
5. Los muebles de laboratorio deben tener la capacidad de soportar
cargas y usos previstos. Los espacios entre las mesas de trabajo,
gabinetes y equipos deben ser accesibles para su limpieza.
6. Si el laboratorio tiene ventanas que se abren hacia el exterior, están
provistas de mosquiteros.

Nivel de bioseguridad 2

El Nivel de Bioseguridad 2 es similar al Nivel de Bioseguridad 1 y es adecuado

para trabajos que involucren agentes de riesgo potencial moderado para el personal y
el medio ambiente. Difiere del BSL-1 en que (1) el personal del laboratorio cuenta con
una capacitación específica en la manipulación de agentes patogénicos y está dirigido
por científicos competentes; (2) el acceso al laboratorio es limitado cuando se están
desarrollando actividades; (3) se toman precauciones extremas con elementos
cortantes contaminados y (4) ciertos procedimientos que pueden generar aerosoles o
gotitas infecciosas se llevan a cabo en gabinetes de seguridad biológica o en otros
equipos de contención física.

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 Nivel de bioseguridad 3

El Nivel de Bioseguridad 3 es aplicable a las instalaciones clínicas, de

diagnóstico, enseñanza, investigación o producción en las que se llevan a cabo trabajos
con agentes indígenas o exóticos que pueden producir una enfermedad grave o
potencialmente letal como resultado de la exposición por vía de inhalación. Los
microorganismos que deben ser trabajados en el nivel de bioseguridad 3 son altamente
infecciosos, pueden causar graves infecciones sistémicas en seres humanos
inmunocompetentes e incluyen a Mycobacterium tuberculosis, Coxiella burnetii y las
especies de Brucella.

El personal de laboratorio recibe instrucción específica en el manejo de agentes

patogénicos y potencialmente letales, y es supervisado por científicos competentes con
experiencia en el trabajo con estos agentes.
Todos los procedimientos que involucren la manipulación de materiales infecciosos se
realizan dentro de gabinetes de bioseguridad u otros dispositivos de contención física o
por personal que lleva ropa y equipo protector adecuado. El laboratorio tiene
características de diseño e ingeniería especiales.

Todas las actividades de laboratorio, incluyendo el manejo de muestras clínicas

y de cultivos microbianos, deben ser realizadas en cámaras de bioseguridad clase II o
utilizando combinaciones de protección personal y contención física. El laboratorio debe
estar físicamente separado de áreas abiertas al tráfico no restringido de personal de las
instalaciones. El laboratorio debe tener un lavamanos colocado cerca de la salida y debe
tener un dispositivo que permita abrir el grifo del lavamanos con el pie, con el codo o
automáticamente.

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 Las ventanas deben ser selladas y las puertas deben tener un dispositivo para
que se cierren por sí mismas. Debe tener un sistema de ventilación diseñado de tal
manera que sea unidireccional e ingrese al laboratorio por el área de entrada.

Nivel de bioseguridad 4

El Nivel de Bioseguridad 4 debe aplicarse para trabajar con agentes peligrosos

y exóticos, usualmente mortales, para las cuales no se tienen vacunas y tratamientos
eficaces. Presenta únicamente agentes virales, como los virus Ebola y Hanta, pero no
agentes bacterianos. Los miembros del personal de laboratorio poseen una capacitación
específica y completa para manipular agentes infecciosos extremadamente peligrosos
y conocen las funciones de contención primaria y secundaria de las prácticas estándar
y especiales, los equipos de contención y las características de diseño del laboratorio.
Este personal es supervisado por científicos competentes que poseen capacitación y
experiencia para trabajar con estos agentes. El acceso al laboratorio es controlado
estrictamente por el director del laboratorio. El establecimiento se encuentra en un
edificio separado o en un área controlada dentro de un edificio, la cual está totalmente
aislada de todas las demás áreas del edificio. Se prepara o se adopta un manual de
operaciones específico para el establecimiento. Dentro de las áreas de trabajo del
establecimiento, todas las actividades se restringen a los gabinetes de seguridad
biológica Clase III o a los gabinetes de seguridad biológica Clase II utilizados con trajes
de personal presurizado con presión positiva y de una sola pieza ventilados por aire
externo. El laboratorio de Nivel de Bioseguridad 4 tiene 27 características especiales de
ingeniería y diseño para evitar la diseminación de los microorganismos en el medio
ambiente.

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Relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las prácticas y el
equipo:

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 III. MATERIAL DE TRABAJO EN MICROBIOLOGÍA

Mechero

El mechero es el principal elemento que nos ayuda a trabajar en forma estéril, este sirve
para esterilizar el asa microbiológica, la boca de tubos de ensayo, pipetas, portaobjetos,
etc. y para mantener un pequeño ambiente de trabajo estéril. En los últimos años su uso
ha disminuido en microbiología, reemplazado por el uso de asas desechables y trabajo
en gabinetes de bioseguridad.

Placas de Petri

Placas de vidrio o de plástico en las cuales se deposita una determinada cantidad de

medio de cultivo sólido. Consta de una base y una tapa, debe mantenerse cerrada,
excepto en los breves momentos en que debe sembrarse el medio de cultivo.

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Asas

Instrumento con un mango y un alambre en la punta. Existen dos tipos: asa recta (que
termina en punta), y asa en anillo (un pequeño círculo en el extremo). Sirven para
sembrar muestras bacterianas en superficie y en profundidad (asa recta) y para sembrar
en superficie y trasladar pequeñas gotas (asa en anillo). En el grupo de asas en anillo
encontramos asas calibradas utilizadas en el cultivo con recuento bacteriano.

Pipetas Pasteur

Es un tubo angosto que termina en punta, puede ser de vidrio o de plástico, estériles o
no. Sirve para trasladar material líquido (gotas) o bien para diseminar siembras
acodando un extremo o formando un rastrillo. Debe romperse la punta y esterilizarse
antes de ser utilizada.

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Pipetas Graduadas

Utilizadas para la preparación de medios de cultivo y reactivos, para el uso

microbiológico deben esterilizarse en horno Pasteur envueltas en papel. Al
desenvolverse deben flamearse al mechero.

Tubos de ensayo

En microbiología los tubos de ensayo se utilizan principalmente para preparación de

medios y reacciones bioquímicas, deben esterilizarse en horno Pasteur y taponarlos con
algodón hidrófobo o con tapas especiales de goma o plástico. Debe flamearse la boca
del tubo cada vez que se saque la tapa y antes de volver a colocársela.

Microscopio

En microbiología se emplea el objetivo 40 X para observaciones sin tinción (al fresco) y

el objetivo 100 X para observaciones por inmersión (con aceite) en preparaciones
teñidas. El microscopio debe quedar perfectamente limpio después de finalizada la
observación correspondiente.

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Estufa de Cultivo

Los productos biológicos o siembras de bacterias en medios de cultivo deben cultivarse

en estufas que se encuentran generalmente a una temperatura de 35 - 37°C.

Baño María

Consiste en un recipiente con agua de la llave que tiene una fuente de calor para
mantener una determinada temperatura. Generalmente se hace hervir el agua, por
ejemplo, para fundir el agar en los tubos con medio de cultivo sólido.

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Horno Pasteur o Pupinel

Es un aparato que sirve para esterilizar todo el material de vidrio que se utiliza en
microbiología. La esterilización se realiza a 180°C por una hora Es una esterilización en
seco.

Autoclave

Es un aparato que sirve para esterilizar medios de cultivo (agares, caldos, etc.) y
también para esterilizar material contaminado (placas de Petri con cultivos positivos,
caldos con crecimiento, muestras patológicas, etc.).

Jarra atmosfera

Utilizada para generar un ambiente apropiado para el crecimiento de bacterias que

requieren una atmosfera anaerobia o microaerofila.

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 MORFOLOGIA BACTERIANA Y TECNICAS DE TINCION

Introducción
La observación microscópica nos permite conocer algunas características de las
bacterias tales como forma, disposición, agrupación y movilidad. Además, gracias a
distintas tinciones podemos conocer otras características como flagelo, capsula,
composición de la pared, etc. Corresponde a la primera etapa en el estudio de las
bacterias y es fundamental para orientar al diagnóstico bacteriológico.
Existen numerosas técnicas para el estudio de la célula bacteriana, entre las
cuales destacan:

1. Observación con bacterias vivas:

- Al Fresco: La observación al fresco permite observar al microorganismo en

estado vivo y evita deformaciones artificiales de su morfología que implican las
técnicas con coloración. Su aplicación más importante se refiere al estudio de
movilidad de los microorganismos.
- Con fondo Oscuro: Se basa en el fenómeno de Tyndall de reflexión luminosa.
Se ilumina la preparación en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos
directamente sobre los microorganismos sin penetrar en el objetivo del
microscopio. Este microscopio permite la visualización de bacterias difíciles de
colorear como el Treponema pallidum, agente de la sífilis.

2. Observación de bacterias fijadas*:

- Tinciones simples
- Tinciones diferenciales
- Tinciones especiales.

*ver detalles más adelante

Formas bacterianas Agrupaciones bacterianas

Formas

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Preparación de frotis

El material a ser observado debe fijarse sobre el portaobjetos. Si este

procedimiento no se realiza, las células se lavarán durante los distintos pasos de la
coloración. La técnica a emplear utiliza calor para adherir las células al portaobjetos,
además es necesario matar los microorganismos antes de la coloración.
El agente de fijación ideal es aquél que preserva las estructuras de las células en sus
respectivas formas y posiciones sin producir la aparición de artefactos. Aunque el calor
es el agente de fijación más utilizado, también se pueden emplear alcoholes (éter,
alcohol etílico, alcohol metílico) y otros compuestos químicos.

Tinciones

Las tinciones se definen como compuestos orgánicos que contienen anillos de

benceno más un grupo cromóforo (grupo químico portador de color pero que no tiñe) y
un grupo auxocromo (grupo químico que tiñe). La capacidad de un colorante de unirse
a componentes macromoleculares celulares, tales como proteínas o ácidos nucleicos,
depende de la carga eléctrica que posee el grupo cromóforo y de la carga eléctrica del
componente celular a ser coloreado.
Los colorantes ácidos son compuestos aniónicos; es decir el grupo cromóforo exhibe
carga negativa y por lo tanto se unirán fuertemente a los componentes celulares que
posean carga positiva. Las proteínas celulares que poseen carga positiva se unirán al
cromóforo aniónico del colorante ácido.
Los colorantes básicos son catiónicos, la ionización del grupo cromóforo exhibe carga
positiva y por lo tanto posee una alta afinidad por los componentes celulares cargados
negativamente. Los ácidos nucleicos, y diferentes proteínas celulares poseen esta carga
y podrán unirse al cromóforo catiónico del colorante básico. Como ejemplo se puede
citar al azul de metileno, el cual produce un cromóforo catiónico. Los colorantes básicos
son los que comúnmente se utilizan para las coloraciones bacterianas. La presencia de
cargas negativas en la superficie bacteriana produce repulsión electrostática con la
mayoría de los colorantes ácidos evitando que los mismos penetren a las células.

Las tinciones se clasifican en 3 tipos:

Tinción simple: Se basa en el empleo de un solo colorante sobre la bacteria, por lo

tanto, todas se tiñen del mismo color. Sirva principalmente para observar forma y
agrupación.
Tinción diferencial: Su objetivo es establecer diferencias entre las bacterias según la
afinidad a ciertas tinciones. Se utilizan generalmente dos colorantes, un fijador o
mordiente y decolorantes, los cuales se aplican secuencialmente.
Tinción especial: Su principal función es poner en evidencia ciertas estructuras
bacterianas.

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Tinción de Gram:

La coloración diferencial más importante utilizada en bacteriología es la tinción de

Gram. Esta coloración divide a las bacterias en dos grandes grupos, Gram positivas y
Gram negativas.
La coloración de Gram utiliza cuatro reactivos.
- Colorante primario: Cristal Violeta
Es un colorante básico que tiñe a las células de color violeta.
- Fijador o mordiente: Ioduro de Gram (Lugol)
Este reactivo forma un complejo insoluble cuando se une al colorante primario.
- Agente decolorante: Alcohol acetona
Este reactivo sirve tanto como solvente de lípidos y como agente deshidratante.
- Colorante de contraste: Safranina
Este es el reactivo final, se utiliza para colorear de rojo o rosado a aquellas células que
fueron previamente decoloradas. Las bacterias Gram negativas podrán tomar éste color,
en tanto que las Gram positivas retendrán el color púrpura del colorante primario.

Las diferencias observadas entre bacterias Gram positivas y negativas se deben

a la naturaleza física de sus paredes celulares. El peptidoglucano en sí mismo no se
tiñe, sino que actúa aparentemente como barrera de permeabilidad previniendo la
pérdida de cristal violeta. Durante el procedimiento las bacterias se tiñen primero con
cristal violeta y luego se tratan con ioduro para promover la retención del colorante. En
las Gram positivas, el decolorante encoge los poros de la gruesa capa de
peptidoglucano, de forma que el complejo cristal violeta- ioduro es retenido durante la
decoloración y las bacterias permanecen púrpura. En cambio el peptidoglucano de las
Gram negativas es muy delgado, con menor número de puentes peptídicos y tiene poros
de mayor tamaño que las Gram positivas. El tratamiento con decolorante también puede
extraer suficientes lípidos de la membrana externa de la pared Gram negativa e
incrementar aún más la porosidad de la pared. Por estas razones la solución decolorante
remueve más fácilmente el complejo colorante- mordiente a partir de las bacterias Gram
negativas.
El paso más crítico en el procedimiento de esta tinción, es la decoloración, en la
cual el complejo Cristal Violeta-Ioduro será liberado de las células. Una sobre
decoloración puede resultar en la pérdida del colorante primario, apareciendo las
bacterias Gram positivas como Gram negativas. Una decoloración ineficiente no
removerá por completo el complejo, produciendo que los organismos Gram-negativos
aparezcan como Gram positivos.
Es necesario que los extendidos se laven con agua entre las aplicaciones de los
reactivos. Esto remueve el exceso de los mismos y prepara al extendido para el próximo
paso de coloración.
Las mejores preparaciones de Gram se obtienen a partir de cultivos frescos, es
decir, a partir de cultivos que no exceden las 48 horas de incubación. Cuando los cultivos
son viejos, especialmente si se trata de bacterias Gram positivas, los microorganismos
tienen la tendencia de perder su capacidad de retener el colorante primario y pueden
aparecer como Gram variables.

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Tinción de Ziehl-Neelsen:

La mayoría de las bacterias se colorean por tinción simple o por tinción de Gram,
pero existen algunas especies de los géneros Mycobacterium y Nocardia que son
resistentes a estas coloraciones y pueden teñirse calentándolos con carbolfucsina. El
calentamiento permite la entrada del colorante dentro de las células. Una vez que las
mismas han tomado la carbolfucsina, resisten la decoloración aun aplicando una mezcla
de ácido-alcohol como agente decolorante. Como consecuencia de esta propiedad,
estos organismos se clasifican como ácido-alcohol resistentes y se visualizan de color
rojo, en tanto que si el colorante puede ser extraído por el decolorante, los
microorganismos se clasifican como acido-alcohol no resistentes y utilizando esta
técnica aparecerán celestes debido a la contra coloración con azul de metileno. Esta
diferencia característica entre las micobacterias y los otros microorganismos se debe al
alto contenido lipídico de la pared celular de las primeras, en la que el peptidoglucano
está unido mediante enlaces covalentes a un polímero de ácido micólico galactosa -
arabinosa.

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Colorante primario: Carbol fucsina
Carbol fucsina es un colorante fenólico que es soluble en la cera de las paredes de las
micobacterias, por lo tanto puede penetrarlas y permanecer retenida en ellas. La
penetración de este colorante es intensificada mediante tratamiento con calor. Todas
las células aparecerán rojas.
- Agente decolorante: Acido-alcohol (HCl 3%-Etanol 95%)
Antes de la decoloración el extendido debe enfriarse, esto permite que la cera
solidifique. Una vez aplicado el agente decolorante, las células ácido-alcohol resistentes
resisten la decoloración, debido a que el colorante primario es más soluble en la cera
de la pared que en el agente decolorante. Por lo tanto el colorante primario será retenido
y las micobacterias permanecerán rojas.
Este no será el caso con los organismos ácido-alcohol no resistentes los cuales carecen
de la pared de cera. El colorante primario será fácilmente removido y las células
quedarán incoloras.
- Colorante de contraste: Azul de metileno
Este colorante es utilizado como el reactivo final que colorea a las células incoloras. Las
células ácido-alcohol resistentes, debido a la composición de su pared no serán teñidas
por este colorante, estas se verán color fucsia ya que previamente fueron teñidas con el
colorante primario.

Tinción de Ziehl Neelsen

Tinciones especiales

Técnicas para tinción de esporas:

Método de Schaeffer-Fulton

- Colorante primario: Verde de malaquita

Las cubiertas de las esporas no aceptarán fácilmente el colorante primario. Para que
este pueda penetrar, es necesario aplicar calor. Luego de cubrir con el colorante
primario, se debe calentar el extendido, tanto las células vegetativas como las esporas
aparecerán de color verde.
- Agente decolorante: Agua
Una vez que las esporas aceptan el colorante verde de malaquita, no podrán ser
decoloradas con agua. Las esporas permanecerán verdes. Por otro lado, el colorante

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no muestra una alta afinidad por los componentes de las células vegetativas, el agua lo
remueve y las células quedarán incoloras.
- Colorante de contraste: Safranina
Este colorante se utiliza como contraste para teñir las células vegetativas incoloras,
éstas absorben el colorante y aparecerán rojas. Las esporas retendrán el color verde
del colorante primario.

Bacillus subtilis. Tinción de esporas.

Materiales:

Aportados por el estudiante:

- 1 lápiz marcador indeleble

- 1 lápiz graso
- Lápices de colores

Aportados por el laboratorio:

- Kit de tinción de Gram

- 2 Porta objetos
- 1 tubo de caldo nutritivo sembrado con Staphylococcus aureus
- 1 placa de agar (base sangre, tripticasa u otro) sembrado con Escherichia coli
- 1 asa en anillo
- 1 cronómetro
- Láminas de bacterias teñidas con tinción de Gram

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Objetivos:

- Conocer el fundamento de la tinción de Gram.

- Identificar los pasos de la tinción de Gram.
- Reconocer forma, agrupación y coloración de las preparaciones teñidas.
- Conocer los fundamentos de la tinción de Ziehl-Neelsen
- Conocer los fundamentos de la tinción de esporas

Procedimiento:

Los estudiantes deberán trabajar en grupos, según instrucciones del docente, para
realizar los procedimientos A y B. (el informe es individual)

A. Preparación del frotis:

1. Rotular y limpiar un portaobjetos. Pasarlo rápidamente por la llama del mechero.

Dejar enfriar
2. Esterilizar un asa de cultivo hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar
3. Con el asa esterilizada colocar una gota del caldo sobre el portaobjetos.
4. Esparcir la muestra, formando una película fina.
5. Secar el portaobjetos al aire o manteniéndolo a 60 cm de la llama de un mechero.
6. Cuando el frotis esté seco, pasar el portaobjetos tres veces por la llama del
mechero rápidamente (con la preparación hacia arriba)

B. Tinción de Gram *:

1. Previamente hecho y fijado el frotis. Cubrir con Cristal violeta durante 60

segundos.
2. Eliminar el exceso de colorante y lavar bajo un chorro suave de agua.
Manteniendo la lámina en posición inclinada y cuidando que el agua no golpee
directamente la preparación.
3. Cubrir la preparación con Lugol durante 60 segundos. Lavar nuevamente con
agua.
4. Decolorar con alcohol acetona durante 30 segundos. Lavar con agua
5. Cubrir con Safranina o Fucsina, colorante de contraste, por 30 segundos.
6. Lavar, retirar el exceso de agua con papel absorbente sin tocar la preparación y
dejar secar al aire. Finalmente, y una vez seco, observar al microscopio con
aceite de inmersión (objetivo 100x).**

*Verificar tiempos con inserto del Kit de tinción de Gram.

** Deje secar al aire y entregue sus preparaciones al docente para observar en la
siguiente sesión práctica.

C. Observación láminas teñidas:

- Cada alumno recibirá y deberá observar 2 láminas de bacterias teñidas con

tinción de Gram.

23
Nombre alumno:

Informe:
Dibuje las observaciones de las láminas teñidas con Gram:

24
 MEDIOS DE CULTIVO, TECNICAS DE SIEMBRA Y OBSERVACIÓN
MACROSCOPICA.

MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es
enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande.
Las necesidades nutricionales básicas pueden suministrarse en el laboratorio,
mediante el uso de medios de cultivo artificiales, los cuales se encuentran disponibles
en una gran variedad y los cuales en general aportan a los microorganismos:

1. Una fuente de carbono: El carbono es un componente esencial y central para

conformar la estructura celular y permitir a la célula realizar todas sus funciones.
Según la fuente de carbono los microorganismos se encuentran en dos grupo:
Autótrofos y heterótrofos. Los organismos autótrofos pueden cultivarse en
medios que contengan únicamente compuestos inorgánicos (utilizan
principalmente dióxido de carbono como carbono inorgánico). Los organismos
heterótrofos en su lugar necesitan un suministro de carbono orgánico (por
ejemplo glucosa u otro carbohidrato).
2. Una fuente de Nitrógeno: Elemento esencial para que la célula construya
macromoléculas como: proteínas y ácidos nucléicos. Algunos microorganismos
usan nitrógeno atmosférico, otros emplean sales de nitrato o de amonio como
compuestos inorgánicos, así como, otros requieren compuestos orgánicos que
contengan nitrógeno como los aminoácidos.
3. Elementos no metálicos: Iones no metálicos como el azufre y el fósforo. El azufre
puede encontrarse en proteínas, sulfatos o como azufre elemental; mientras el
que el fósforo puede encontrarse formando sales.
4. Elementos metálicos (Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, Fe+2 y Fe+3): Llamados
también micronutrientes, oligoelementos o elementos traza. Encontrados en
sales inorgánicas adicionadas a los medios y los cuales son tomados en bajas
concentraciones por los microorganismos.
5. Vitaminas:. Los microorganismos puede tomarlas del medio ya elaboradas o
iniciar procesos de síntesis de las mismas. Algunos microorganismos poseen
una variedad de vías para sintetizar vitaminas; mientras otros, sintetizan un
número muy limitado de ellas a partir de componentes del medio. Otros las
requieren como suministro.
6. Agua.
7. Energía: Existen dos tipos bioenergéticos de microorganismos, los fotótrofos y
los quimiótrofos. Los fotótrofos emplean la energía radiante (luz solar), como
única fuente de energía; y los quimiótrofos que, obtienen la energía por oxidación
de compuestos químicos orgánicos o inorgánicos.

Además se deben cubrir las necesidades físicas, las cuales involucran factores,
como: Temperatura, pH y gases, los cuales se encuentran en un rango óptimo
específico para cada microorganismo; por lo tanto, su variación puede acelerar o
disminuir el crecimiento

25
 Por otra parte, un medio de cultivo debe presentar las siguientes condiciones:
- Contener sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los
microorganismos (tales como aminoácidos, carbohidratos, poli alcoholes,
vitaminas, minerales )
- Tener un pH que permita un desarrollo óptimo, por lo general las bacterias
patógenos necesitan un pH neutro o ligeramente alcalino (7.0 7.4 ) , en cambio
las levaduras y hongos requieren un pH ácido (5.0).
- Estar previamente esterilizados o preparados en condiciones asépticas
- Estar protegidos de la contaminación ambiental por tapones de algodón cardé,
tapones de goma, tapas metálicas o roscas.
- Tener adecuada presión osmótica.

La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados

que es preciso rehidratar. La preparación de un medio de cultivo se reduce en general
a pesar la cantidad de medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del
crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles se
esterilizan por filtración y se añaden al resto de los componentes previamente
esterilizados en autoclave.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares

en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos
medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y peptona a la que se añadirán
otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de

medios de cultivo. Es un polisacárido natural de peso molecular elevado producido por
dos tipos de algas marinas, se licua completamente a temperatura de ebullición y se
solidifica al enfriarse a 40 ºC. Forma geles transparentes, estables, químicamente
inertes y no modifica el pH de las soluciones con las cuales se mezclan y, con mínimas
excepciones, no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y tampoco es
metabolizado por aquellas que crecen en él. Por su capacidad de retener agua, el agar
gelatinizado no pierde líquido con facilidad, de ahí que los medios de cultivo en base
agar pueden conservarse por largo tiempo a 4 ºC.
La gelatina, al igual que el agar, es otro agente solidificante. Es de naturaleza
proteínica y su uso está muy restringido, ya que bastantes bacterias provocan su
licuación.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el
valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los
microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden
para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y
no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo
en pH Ácido). La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento
de la mayoría de las bacterias Gram-positivas).

26
Tipos de medios de cultivo:

Los distintos medios de cultivo pueden clasificarse en base a su estado físico, o en base
a un punto de vista práctico.

A) Desde un punto de vista físico:

Medios de cultivo líquidos o caldos (Sin agar)

Medios de cultivo semi-sólidos ( 0.25 % de agar)
Medios de cultivo sólidos (1,5 % de agar)

B) Desde un punto de vista de su composición quimica:

Medio básicos o fundamentales

Mejorados o enriquecidos
Diferenciales
Selectivos
Selectivos diferenciales.

- Medios simples o básicos: Se caracterizan por ser pobres en materiales

nutricios, se desarrollan bacterias poco exigentes y constituyen la base para
preparar otros medios. Los más utilizados son el Agar base, que contiene
peptona, extracto de carne, NaCl, agar y agua destilada, y el caldo peptonado,
con los mismos ingredientes pero sin agar.

- Medios mejorados o enriquecidos: Son los mismos medios básicos a los cuales
se les agrega una sustancia enriquecedora como sangre, humana o animal,
suero, líquido ascético, etc. Entre los más utilizados destacan el Agar Sangre,
que contiene Agar base más sangre desfibrinada al 5% y el Agar Chocolate.

- Medios diferenciales: Estos medios se emplean para demostrar alguna

propiedad bioquímica de la bacteria como ser, degradación de carbohidratos,
proteínas, productos finales de metabolismo, etc. En general, propiedades de la
bacteria que facilitan su identificación. Como se trata de fenómenos metabólicos,
el estudio con medios diferenciales, generalmente, debe hacerse empleando
cepas bacterianas puras. (ej.: TSI, LIA, MIO, Citrato de Simmons, etc).

- Medios selectivos: Estos medios de cultivo contienen sustancias que impiden o

limitan el crecimiento de algunas bacterias y permiten el desarrollo de otras. Este
tipo de medios de cultivo tiene gran aplicación en el diagnóstico bacteriológico,
en que el problema corriente consiste en aislar un microorganismo de un
producto que contiene numerosas especies bacterianas. (ej.: Agar Thayer Martin
para Neisseria, Chapman para Staphylococcus y Skyrrow para Campylobacter).

- Medios selectivos diferenciales: Son medios selectivos a los cuales se les ha

adicionado un sustrato especial, generalmente un azúcar, para demostrar la
actividad fermentativa de la bacteria sobre esta sustancia. La actividad
metabólica se revela por el cambio de color de un indicador (generalmente
indicador de pH) que lleva incorporado el medio. Dentro de los más utilizados
destacan el Agar Mac Conkey para estudio de enterobacterias, Agar SS para
estudio de Salmonella y Shigella y Agar XLD para estudio de enteropatógenos.
27
Medios de cultivo más utilizados en bacteriología:

- Agar Sangre: Medio enriquecido utilizado de rutina para la siembra de la mayoría

de las muestras clínicas que permite el crecimiento de una gran variedad de
bacterias ya sean bacilos o cocáceas o bien poco exigentes o exigentes, desde
el punto de vista nutricional. Además este medio permite detectar la producción
de hemolisinas, mediante la visualización macroscópica de una hemólisis, de los
glóbulos rojos presentes en el medio, al borde de la colonia bacteriana.

- Agar Chocolate: Medio enriquecido, utilizado para el aislamiento de

Haemophilus y otras bacterias fastidiosas. Está compuesto por agar tripticasa y
sangre de cordero desfibrinada calentada a 80 ºC, ya que a esta temperatura los
glóbulos rojos se lisan y la hemoglobina liberada toma un color café chocolate
(de ahí su nombre). Además contiene suplemento de vitaminas y cofactores.

- Agar Mac Conkey: Medio selectivo diferencial. Destinado al estudio de bacilos

gram negativos, principalmente enterobacterias. Contiene sales biliares y cristal
violeta, que inhiben el crecimiento de gram positivos, lactosa como agente
diferencial y rojo neutro como indicador de pH. Por lo tanto, por fermentación de
la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia, esto produce el viraje en el
color del medio y la absorción de éste a las colonias (color rosado). Las bacterias
no fermentadoras de lactosa producen colonias incoloras.

- Agar SS: Medio selectivo diferencial dirigido al estudio de Salmonella y Shigella

(de ahí su nombre SS). Contiene sales biliares y verde brillante, que inhiben el
desarrollo de gram positivos y de la mayoría de la flora comensal intestinal gram
negativa. Al igual que el Agar Mac Conkey posee lactosa y rojo neutro. Shigella
crece incolora, ya que no fermenta la lactosa y Salmonella crece como colonias
incoloras con un punto negro en el centro producto de la formación de sulfuro de
hierro (H2S).

- Agar Muller Hinton: Es un medio nutritivo utilizado para realizar pruebas de

susceptibilidad a antibióticos. Permite el crecimiento adecuado de gran parte de
las bacterias de importancia clínica y no contiene ingredientes que actúen como
antagonistas con los antibióticos.

28
METODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO

La mayoría de las bacterias debido a su rápida multiplicación deben ser

resembradas constantemente de un medio de cultivo a otro con el fin de mantener su
viabilidad y su vitalidad. Esta siembra a su vez debe ser hecha en medios de cultivo
adecuados para la bacteria y bajo estrictas condiciones de asepsia para evitar la
contaminación con otros microorganismos.
Por aislamiento bacteriano se entiende la separación, en cultivos puros de las
diferentes bacterias que se encuentran en cultivos o productos polimicrobianos. En
general la flora bacteriana de productos o ambientes naturales (agua, alimentos, suelo,
etc.) y de materiales patológicos es heterogénea y, por lo tanto, el aislamiento constituye
una etapa fundamental para la mayoría de los estudios bacteriológicos.
Se entiende por siembra a la acción de depositar asépticamente, sobre el medio
de cultivo apropiado, una muestra clínica con el objetivo de recuperar y luego identificar
la bacteria involucrada en el proceso infeccioso.
Las modalidades de siembre más empleadas en la práctica con fines de
aislamiento bacteriano son las siguientes:

A. Siembra en superficie:
Esta siembra se realiza con la finalidad de obtener colonias aisladas a partir de una
muestra, en teoría, poli microbiana. Consiste en depositar una asada de la muestra
sobre la superficie del medio de cultivo, se coloca cerca del borde de la placa y con una
pipeta
Pasteur acodada o con un asa en argolla diseminarla en forma de zig-zag por la
superficie del medio de cultivo en forma de pentágono y así se obtiene en la superficie
colonias bacterianas aisladas.

A.1. Procedimiento método por estría:

1. Obtener la muestra con asa y suspenderla en un extremo de la placa de agar,
haciendo estrías (líneas) de un extremo a otro (a)
2.- Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante primero y
extenderlas hasta el cuadrante dos (b)
3.- Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante dos y
extenderlas hasta el cuadrante tres (c)
4.- Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante tres y
extenderlas hasta el cuadrante cuatro. (d)

29
 B. Siembra en césped:
Se realiza con tórula de algodón a partir de una suspensión monomicrobiana, la cual
contiene los microorganismos a estudiar. Consiste en esparcir la muestra de manera
homogenea por toda la placa, pasa así lograr un crecimiento parejo en toda la superficie
(tipo césped). Este método está indicado principalmente en el estudio de susceptibilidad
antimicrobiana.

C. Siembra en tubo

C.1. Picadura o profundidad:

Puede ser en medios de cultivos sólidos o semisólidos y se realiza con un asa recta o
en punta, introduciéndola hasta el fondo del agar, de tal forma que pueda observarse
crecimiento de las bacterias en la profundidad de éste.

C.2. Superficie:
Esta se realiza sobre la superficie de un agar tendido o inclinado, pasando el asa en
zigzag desde el fondo hacia la boca del tubo.

30
C.3. Siembra en medios líquidos (caldo):
Se procede a depositar la cepa bacteriana introduciendo el asa de cultivo en el medio
agitando suavemente. O bien se puede traspasar asépticamente de un medio líquido a
otro con una pipeta Pasteur.

OBSERVACIÓN MACROSCOPICA

La mayoría de las bacterias se multiplican rápidamente y son visibles como

colonias cuando se las siembra en medios de cultivo sólidos adecuados. Requieren una
incubación de aproximadamente 24 horas en una atmósfera que favorezca su
desarrollo, a temperatura óptima. Existen excepciones como M. tuberculosis, que
requiere para su desarrollo de dos a ocho semanas de incubación.
Una colonia está constituida por los descendientes de una o unas pocas células.
Las características de la colonia también dependen de la movilidad de la bacteria. El
tamaño puede variar desde 0.5 mm
(Haemophilus sp. o N. gonorrhoeae) a más grandes como las enterobacterias. La forma
de la colonia puede ser circular (Staphylococcus), irregular o filamentosa (Bacillus). Los
bordes pueden ser ondulados (característicos de los bacilos largos como Bacillus
anthracis), en sierra o dentados (Yersinia pestis) o lisos (por ejemplo Proteus vulgaris o
Escherichia coli). La superficie de la colonia también es orientadora y puede ser: plana,
convexa, mamelonada, umbilicada (S. pneumoniae). En relación al pigmento que
adquieren, éste puede ser: verde (P. aeruginosa), amarillo (S. aureus), grisáceo (N.
meningitidis). También es diferente el comportamiento frente a la luz: brillante
(Streptococcus) u opaca (Staphylococcus). Pueden presentar olores particulares como
el frutal de P. aeruginosa o el putrefacto de los anaerobios.
Por último hay que destacar la consistencia: mucoide (M), liso (S) o rugoso (R).
Las colonias M tienen aspecto acuoso, brillante, propio de las bacterias capsuladas o
que forman cubiertas polisacáridas como Klebsiella pneumoniae, Streptococcus
pneumoniae,
Haemophilus influenzae. Los polímeros capsulares pueden ser específicos de grupo y
son generalmente antigénicos. Entre las bacterias patógenas, las formas capsuladas
suelen ser más virulentas. Por otra parte, las colonias S son de aspecto homogéneo, de
textura uniforme y son características de microorganismos de tipo salvaje recientemente
aislados de su hábitat natural como las enterobacterias. Las colonias R son de aspecto
granulado, en general son cepas mutantes que carecen de proteínas o polisacáridos de
superficie. Las formas R de enterobacterias, por ejemplo, generalmente no son
virulentas, en oposición a la mayor resistencia de las bacterias procedentes de colonias
S de tipo salvaje. Un cuarto tipo de colonia es la L y se asocia a la ausencia de la pared

31
celular como resultado de la exposición a antibióticos; en general estas formas vuelven
a sintetizar la pared celular una vez que el fármaco se extrae del medio

La descripción se realiza sobre las colonias formadas (agrupamiento bacteriano

originado por el crecimiento y observable macroscópicamente), de forma aislada y se
evalúa de la siguiente manera:

a. Tamaño: Grande (diámetro mayor a 1mm), mediano (diámetro aproximado a

1mm), pequeño (diámetro inferior a 1mm), y puntiforme.
b. Forma: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide y lanceolada.

32
 c. Borde: De borde regular (continuo), de borde irregular (ondulado, lobulado,
espinoso/dentado/lacerado, ondulado y filamentoso).
d. Elevación: Plana o aplastada (no elevación), elevada (convexa baja, convexa
cupuliforme, mamelonada, pulvinada y umbilicada).
e. Superficie: Lisa o rugosa.
f. Aspecto: Brillante, opaca, mate, translúcida, mucosa.
g. Pigmento: De diferente color. Pueden ser pigmentos solubles en agua y que
decoloran el medio; piocianina (azul verdosa y factor de virulencia en P.
aeruginosa), pigmentos fluorescentes y pigmentos no difundibles confinados a
las colonias.
h. Hemólisis: Parcial (Alfa, parcial aclaración de la sangre alrededor de las
colonias, con decoloración verde del medio; borde de células rojas intacta), total
(Beta, zona de completa aclaración de sangre alrededor de las colonias, debida
a la lisis de las células rojas), y no hemólisis (Gamma, no hay cambio en el medio
circundante a la colonia; no hay lisis ni decoloración de las células rojas de la
sangre).

La morfología de las colonias es un parámetro importante en el proceso de

identificación bacteriana, siendo estas características, comunes entre cada género
bacteriano. Sin embargo, la morfología puede alterarse por el tiempo de incubación,
composición del medio de cultivo (excesiva desecación o humedad), etc.

Actividad Práctica:

Materiales:

- Frascos con diferentes medios de cultivo

- Placa de agar sangre
- Placa de agar Mac Conkey
- Asa en anillo
- Placa de agar Mac Conkey sembrada con E. coli
- Placas agar sangre sembrada con S. aureus (u otro Staphylococcus)

Objetivos:

- Identificar distintos medios de cultivo y reconocer la importancia de sus

componentes para el crecimiento bacteriano.
- Practicar técnicas de siembra y aislamiento.
- Observar y reconocer características macroscópicas del desarrollo bacteriano

33
Procedimiento (el trabajo se realizará en pareja o grupos según indicación de su
docente)

1. Observación de medios de cultivo deshidratados:

Elija 2 medios de cultivos deshidratados de los que se encuentran en exposición, y

para cada uno de ellos:

a. Anote su nombre:
b. Composición:
c. Preparación:
d. Usos:
e. ¿qué tipo de medio es?:

Preparen un informe sobre los medios de cultivo, a entregar la próxima sesión, que
incluya:
- Introducción
- Información anotada sobre los medios de cultivo seleccionados.
- Control de calidad de los medios elegidos (debe realizar búsqueda bibliográfica)
- Bibliografía (citada según normas APA).

2. Practique la siembra de superficie (estría)*:

- Siembre la cepa de Staphylococcus aureus en agar sangre, según el

procedimiento descrito en el punto A.1 (siembra en pentágono)
- Siembre la cepa de Escherichia coli en agar Mackonkey, según el procedimiento
descrito en el punto A.1 (siembra en pentágono).

*1 placa por alumno

Adjunte a su informe lo siguiente:
Debe observar el desarrollo de colonias a las 24 o 48 hrs:
- Determine y anote los errores efectuados en la siembra, en caso de no obtener
separación de colonias.
- Anote las características de las colonias observadas, según la especie bacteriana
observada: Realice una tabla con las características morfológicas, según lo
descrito en esta guía.

34
 MICROBIOTA NORMAL

El cuerpo humano presenta una gran superficie cutánea y mucosa por la que
entra en contacto con el medio ambiente. En esta superficie existen diversos sectores,
donde residen microorganismos con diferentes características de humedad,
temperatura, pH y disponibilidad de nutrientes.

El microbioma es el conjunto de genomas de los microorganismos que se hallan

en el cuerpo humano. Estos microorganismos, que componen la microbiota humana, se
pueden encontrar en todo nuestro organismo.

La microbiota normal es el conjunto de microorganismos que conviven con el

hospedero en estado normal, sin causarle enfermedad, es decir, que generalmente
mantienen una relación simbiótica de tipo mutualista o comensal con él.

La composición de la microbiota normal es característica para la especie

humana, tanto en los microorganismos que la componen como en su número y
distribución en el organismo.

La colonización microbiana del individuo, comienza con el nacimiento. Los primeros

microorganismos en establecerse son aquellos transferidos desde la vagina materna y
del área perineal, hacia la piel, la boca, la nariz y región faríngea del niño. Las biotas
características de éstas y otras áreas, se desarrollan posteriormente y probablemente se
derivan y seleccionan de diversas fuentes ambientales.
La microbiota basal o residente es la característica de cada sector del
organismo y está constituida por gérmenes que siempre están presentes en ese sector.
Por ejemplo: Staphylococcus epidermidis en la piel o E. coli en el intestino.

En cambio, la microbiota transitoria es variable de un ser humano a otro y está

compuesta por gérmenes que colonizan en forma intermitente un determinado sector.
Esta flora transitoria puede incluir bacterias potencialmente patógenas para el propio
individuo u otras personas que entran en contacto con él.
pueden ser patógenas.

Los gérmenes para iniciar la infección deben, en general, comenzar por colonizar
los epitelios. Allí seguramente compiten con los integrantes de la flora por factores tales
como receptores celulares y nutrientes.
Dentro de la importancia de la microbiota normal, se encuentran los siguientes
factores:

1. Efectos directos:

- Producción de bacteriocinas
- Producción de metabolitos tóxicos
- Reducción del potencial redox
- Consumo de nutrientes esenciales
- Competencia por receptores

35
 2. Efectos indirectos:

- Aumento de la producción de anticuerpos.

- Estímulo de la fagocitosis
- Aumento de la producción de interferón.
- Deconjugación de ácidos biliares.

Los microorganismos más comunes presentes en distintas zonas del cuerpo humano
son:
Zona corporal Microroganismos
Piel - Levaduras
- Staphylococcus coagulasa negativo
- Difteroides
- Propionibacterium acnes
- Staphylococcus aureus
- Streptococcus spp
- Peptococcus (micrococos anaeróbicos)
- Bacilos Gram negativos

Boca y faringe - Streptococcus (no grupo A)

- Lactobacilos
- Neisseria spp
- Staphylococcus coagulasa negativo
- Fusobacterium spp
- Haemophilus spp
- Treponema spp
- Difteroides
- Micrococcus sp.
- Staphylococcus aureus
- Actinomyces spp
- Porphyromonas spp
- Prevotella spp
- Candida spp

Fosas nasales - Staphylococcus coagulase negativo

- Staphylococcus aureus (20-30%)
- Neisseria spp
- Haemophilus
- Streptococcus pneumoniae (neumococos)
- Flora de la piel

Estómago - Helicobacter
- Proteobacterias
- Bacteroidetes
- Actinobacterias
- Fusobacterium spp
- Lactobacillus
Intestino delgado - Lactobacilos
- Enterococcus
- Bacteroides

Intestino grueso (90- - Bacteroides spp

95% son anaerobios - E. coli
obligados) - Enterococcus

36
 - Lactobacilos
- Klesbsiella sp.
- Actinomycetes
- Difteroides
- Proteus mirabilis
- Clostridium perfringens
- Candida albicans
- Pseudomonas aeruginosa
- Alcaligenes faecalis
- Staphylococcus epidermis y aureaus

Conjuntiva - Staphylococcus coagulasa negativa

- Haemophylus spp
- Staphylococcus aureus
- Streptococcus spp
Oído externo - Staphylococcus coagulasa negativo
- Difteroides
- Pseudomonas
uretra - Staphylococcus coagulasa negativo
- Difteroides
- Streptococcus spp
- Bacteroides spp
- Fusobacterium spp
- Peptostreptococcus
Vagina - .Lactobacillus
- Peptostreptococcus
- Difteroides
- Streptococcus
- Clostridium
- B0acteroides
- Candida spp
- Gardnerella vaginalis

En el otro extremo se encuentran ciertos tejidos y órganos que son normalmente

estériles, en donde la presencia de microorganismos se considera de importancia
diagnóstica:
- Sangre
- Líquido céfalo raquídeo (LCR)
- Riñones, uréteres y vejiga están libres de microorganismos por lo que la orina
en la vejiga también lo está.
- La laringe, la tráquea, los bronquios, los bronquíolos y los alvéolos son
habitualmente estériles (tracto respiratorio inferior)
- Útero
- Oído medio e interno
- Líquido de cavidades estériles (sinovial, pleural, etc)

37
 Normalmente existe un equilibrio entre los microorganismos de la flora y el
hospedero; sin embargo este equilibrio puede romperse por:
- Aumento de la masa crítica
- Traslado desde el sitio original
- Ruptura de barreras mecánicas por traumatismos.

Esto produce una proliferación e invasión de los microorganismos, dando origen

a una infección endógena. Por lo general, se requieren algunos determinantes para que
se produzcan estas enfermedades, como son:
- Deficiencia en el estado inmunitario del huésped.
- Tratamiento inmunosupresor o con corticoides.
- Cirugías.
- Uso de antibióticos.

Actividad Práctica:

Materiales:

- Placas de agar sangre

- Placas de agar chocolate
- Baja lenguas
- Tórulas estériles
- Pisetas con difusor, con alcohol al 70%.
- Cajas con guantes S, L y M
- Lápices marcadores indelebles (lo debe traer cada alumno)
- Jarras con vela
- Asas en anillo (esto para todos los prácticos)
- Tubos con agua destilada estéril
- Kit de tinción de Gram
- Portaobjetos

Objetivos:

- Conocer la microbiota bacteriana normal de distintas superficies corporales

- Identificar los medios de cultivo básicos para el estudio microbiológico
- Reconocer aspectos macroscópicos del crecimiento bacteriano.

38
Procedimiento:

El trabajo se realizará en grupos (según instrucciones del docente):

- Todos los grupos de estudiantes deberán realizar el procedimiento de toma de

muestra nasal, faríngea y piel de manos.

Seguir el procedimiento cómo se indica a continuación para comprobar la existencia

de microorganismos en distintas áreas del cuerpo:

1. Secreción faríngea:

- Inspección de la faringe: ubicar al paciente en una posición cómoda y con buena

iluminación, deprimir la lengua con baja lengua, visualizar la fosa amigdalina y
faringe en busca de exudado posterior, presencia de pseudomembrana o placas.
-
para elevar la úvula y evitar las náuseas.
- Introducir el hisopo y frotar enérgicamente ambas amígdalas y la pared posterior
de la faringe con movimientos de barrido.
- Retirar el hisopo cuidando de no tocar las paredes laterales de orofaringe, úvula,
lengua, encías y dientes.
- Se realiza la descarga del hisopo en un extremo de la placa de agar sangre,
luego se continúa con el asa estéril, volviendo a pasar ésta sobre la zona de
descarga, se estría la placa en 3 o 4 direcciones. De esta manera el inóculo de
bacterias arrastrado por el asa disminuye progresivamente a medida que se
avanza sobre la superficie de la placa, y puede obtenerse el desarrollo de
colonias aisladas.
- Se realizan siembras de profundidad con el asa para la detección de hemolisinas
estreptocócicas (rasgar el agar en 2 partes del primer cuadrante sembrado).
- Se incuba en atmosfera 3-5% CO2 a 35-37°C por 16 24 horas (jarra con vela)
- Se analizarán los resultados de la siguiente manera:

a. observación macroscópica: morfología colonial (ver guía trabajo práctico n° 3)

b. observación microscópica (tinción de Gram de las colonias): forma, agrupación,
comportamiento frente al Gram.

2. Secreción nasal:

- Elevar la punta de la nariz con el dedo pulgar.

- En caso de ausencia de secreción, humedecer la punta del hisopo en solución
salina estéril e introducirlo en la zona interna del vestíbulo de la fosa nasal,
donde se rota suavemente.
- Retirar el hisopo con cuidado de evitar la contaminación del mismo con las
bacterias de la piel.
- Sembrar en medio de cultivo: agar chocolate, siguiendo el mismo
procedimiento que en el punto anterior.
- Incubar las placas en atmósfera aeróbica a 35-37°C por 16 a 24 horas.
- Se analizarán los resultados de la siguiente manera:

39
 a. observación macroscópica: morfología colonial ( describir según guía trabajo
práctico n° 3)
b. observación microscópica (tinción de Gram de las colonias): forma, agrupación,
comportamiento frente al Gram.

3. Piel:

Para investigar la flora de la piel, se toca la placa de agar sangre con la mano de un
voluntario.
Se incuba a 35-37ºC durante 24 horas.

a. observación macroscópica: morfología colonial ( describir según guía trabajo

práctico n° 3)
b. observación microscópica (tinción de Gram de las colonias): forma, agrupación,
comportamiento frente al Gram.

Cada grupo de estudiantes deberá confeccionar un informe que incluya:

- Introducción
- Procedimiento realizado en el paso práctico
- Resultados
- Conclusión
- Discusión
- Bibliografía

40
 Desinfección y antisepsia
Introducción

En la comunidad y en los centros de atención de salud existen algunos microorganismos

que son perjudiciales o potencialmente perjudiciales para el ser humano, lo que ha
provocado que a lo largo del tiempo se hayan utilizado diferentes agentes microbicidas
en su control o eliminación.

Estos agentes, químicos y físicos, se ocupan de destruir o impedir el crecimiento

bacteriano y su mecanismo de acción se relaciona directamente sobre la estructura y/o
procesos metabólicos de la célula bacteriana. El objetivo de este control es evitar
enfermedades infecciosas o cualquier otro efecto indeseable en la salud del paciente.

La esterilización es el proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las

formas de vida microbianas, incluyendo bacterias y sus formas esporuladas altamente
resistentes, hongos (incluyendo sus esporas) y virus. El empleo de los métodos de
esterilización es fundamental en la clínica médica y hospitalaria, ya que permiten el
control de posibles fuentes de infección para el hombre.

CLASIFICACION DE LOS METODOS DE ESTERILIZACION

METODOS FISICOS METODOS QUIMICOS METODOS MECANICOS

Calor ETO Filtración

Radiaciones Gas Plasma Centrifugación
Ultrasonido

1. METODOS FISICOS

Llameado: Se realiza por exposición directa a la llama por lo menos por unos 10
segundos. La llama se produce por combustión del gas + O2. La combustión completa
(con exceso de oxígeno) produce agua y dióxido de carbono, es una llama poco
luminosa y de gran poder calorífico, manteniendo un ambiente estéril alrededor.

41
Calor seco: Se realiza por la acción de aire caliente circulante en Hornos Pasteur o
Poupinel. La esterilización se produce en todo material vivo debido al aumento
exagerado de los procesos oxidativos y la coagulación de las proteínas.
Se utiliza para esterilizar jeringas, agujas y material de vidrio que se desee dejar
exento de pirógenos a una temperatura de 200º C durante 30 a 60 minutos.
Para material de vidrio como tubos de ensayo, placas petri, frascos para toma
de muestras, se utiliza una temperatura de 180º C por 60 minutos.

Actualmente se esta dejando de utilizar por su dificultad en la certificación.

Actúa por circulación de aire caliente

para homogeneizar la temperatura
dentro de la cámara

Calor húmedo: Se realiza por la acción de vapor saturado a baja presión. Tiene un
mayor poder de penetración que el calor seco y produce la muerte de los
microorganismos por desnaturalización y coagulación de las proteínas del protoplasma
de las células microbianas.
Se realiza en equipos denominados "Autoclave". Se utiliza principalmente para la
esterilización de medios de cultivo a temperaturas entre 105 a 120º C.

42
Radiaciones: El principal elemento que se utiliza es la luz UV, su efecto se atribuye a
la absorción por parte del ADN microbiano lo que produce distorsiones en la forma del
DNA con la consiguiente inhibición de su síntesis. Se utiliza para materiales que no
resisten altas temperaturas o sustancias químicas, principalmente material de plástico y
para descontaminación principalmente de aire y superficie de algunos equipos.

2. METODOS QUÍMICOS
Óxido de Etileno (ETO): agente químico con alto poder microbicida que puede ser
utilizado para esterilizar artículos sensibles al calor y a la humedad. Su acción
microbicida se fundamenta en la alquilación de la pared celular del microorganismo que
inhabilita a la célula para tener un metabolismo normal o reproducirse. Sin embargo, es
un sistema que presenta también riesgos como inflamabilidad, intoxicación y riesgo
potencial de carcinogénesis sino se toman las medidas de bioseguridad adecuadas.

Gas Plasma: agente químico que corresponde al peróxido de hidrógeno que se

encuentra es estado plasma, es decir, iones reactivos que eliminan a los
microorganismos por un mecanismo de oxidación. Esteriliza a temperaturas no
superiores a 50ºC en un ambiente de muy baja humedad lo que favorece la esterilización
de material termolábil o delicado. No presenta riesgos de toxicidad para el operador ni
para el paciente.

43
3.- MÉTODOS MECÁNICOS

Filtración: se fundamenta en utilizar distintos tipos de filtros que poseen poros que
tengan la capacidad de detener las bacterias. Se utiliza para esterilizar líquidos
termolábiles como azúcares, urea, sueros, antibióticos, etc.
Los filtros pueden ser de asbesto, membrana, celulosa, cerámica, etc., dependiendo del
material a esterilizar.

El proceso, por el cual se remueve mecánicamente el material extraño en el ambiente,

en superficies inertes o vivas y objetos, se denomina limpieza. El objetivo de este
procedimiento, es disminuir el número de microorganismos a través del arrastre
mecánico, pero no asegura la destrucción de éstos.

Por otro lado, el proceso de desinfección, se refiere a la destrucción de formas

vegetativas de microorganismos en objetos inanimados y no necesariamente esporas.
Se realiza por métodos químicos o físicos. La desinfección de alto nivel implica la
eliminación total de toda forma de vida microbiana excluyendo sólo las esporas
bacterianas. Existen agentes desinfectantes que no tienen capacidad para la
destrucción completa de todos los microorganismos vegetativos, en este caso la

44
 desinfección que se obtiene se califica como de nivel intermedio o bajo. Estos últimos
niveles de desinfección tienen muy poca aplicación práctica en la actualidad

Ahora, si el propósito es eliminar microorganismos de las superficies cutáneo-mucosas,

el procedimiento, se denomina antisepsia.

Se cuenta, con muchas sustancias químicas, que se utilizan con fines desinfectantes o
antisépticos, cuya potencia antimicrobiana es variable. En la tabla siguiente, se resume
el uso y mecanismo de acción de los principales antisépticos y desinfectantes:

Fuente: Madigan,M ; Martinko, J; Stahl, D; Clark,D (2012). Brock Biology of Microorganisms. (13ed) San Frnacisco:Benjamin cummings.

45
Actividad Práctica:
Materiales:

- Guantes
- Difusor con alcohol 70%
- Difusor con hipoclorito de cloro al 0,5%
- torulas algodón estériles
- agua oxigenada 10vol
- Povidona yodada
- 6 Placas agar soja tripticasa, sangre u otro no selectivo.
- kit de Gram
- portaobjetos
- aceite de inmersión
- agua destilada estéril
- cronómetros
- Papel y solución limpieza lentes microscopios

Objetivos:

- Conocer los métodos químicos de control microbiano.

- Determinar la acción desinfectante y/o antiséptica de diferentes agentes
químicos.

Procedimiento:

El trabajo se realizará en grupo según indicaciones del docente.

A. Limpieza y desinfección:
1. Al inicio de la sesión cada grupo dejará en su area de trabajo una placa de medio
de cultivo abierta, la que deberá cerrarse al final de la sesión e incubar por 24
horas, a 37°C. (marcar como control ambiente)
2. Realizar la toma de muestra de la superficie del area trabajo con una torula esteril
y sembrar en placas de medio de cultivo, marcada como meson.
3. Dividir una placa petri por detrás en dos mitades, trazando una línea con un
marcador indeleble. Marcar una de las mitades como alcohol y la otra como
cloro.
4. Limpiar la superficie del area de trabajo con alcohol 70% dejar actuar, tomar una
segunda muestra y sembrar nuevamente en la mitad de otra placa.
5. Aplicar hipoclorito de cloro al 0.5% sobre la superficie del area de trabajo, dejar
actuar, tomar una nueva muestra y sembrar en la otra mitas del medio de cultivo.
6. Discutir los resultados esperados.
7. revisar el crecimiento a las 24 horas: Contar y describir colonias (en el caso de
haber desarrollo bacteriano), realizar Gram de colonias de interés (usar un solo
portaobjetos para 2 o 3 muestras), discutir los resultados obtenidos.

46
 B. Antisepsia:
1. Dividir una placa petri por detrás en dos mitades, trazando una línea con un
marcador indeleble. Marcar una de las mitades como control y la otra con el
nombre del antiséptico a probar, o jabón, según corresponda.
2. Humedecer en condiciones asépticas un hisopo en solución salina isotónica
o agua destilada estéril y frotarse con él la palma de la mano, e inocular
mediante estrías la mitad de la placa Petri marcada como control.
3. Lavar con agua y jabón por un minuto las manos, enjuagar con agua corriente
y enseguida frotar con un aplicador humedecido en solución salina o agua
destilada estéril e inocular mediante estría la otra mitad de la placa Petri.
4. Humedecer en condiciones asépticas un hisopo en solución salina isotónica
o agua destilada estéril y frotarse con él la cara interna del antebrazo u otra
área del cuerpo elegida, e inocular mediante estrías la mitad de la placa Petri
marcada como control.
5. Humedecer otro aplicador con povidona yodada y frotarse solo una vez en el
antebrazo u otra área del cuerpo elegida en un área de 5 cm².
6. Esperar un minuto y humedecer otro hisopo en solución salina y frotar el área
tratada con el antiséptico e inocular mediante estría, la otra mitad de la caja
Petri.
7. Humedecer en condiciones asépticas un hisopo en solución salina isotónica
o agua destilada estéril y frotarse con él la cara interna del antebrazo u otra
área del cuerpo elegida, e inocular mediante estrías la mitad de la placa Petri
marcada como control.
8. Humedecer otro aplicador con agua oxigenada y frotarse solo una vez en el
antebrazo u otra área del cuerpo elegida en un área de 5 cm².
9. Esperar un minuto y humedecer otro hisopo en solución salina y frotar el área
tratada con el antiséptico e inocular mediante estría, la otra mitad de la caja
Petri.
10. Incubar las placas sembradas durante 24-48 horas a 37 °C.
11. Después de este período observar si hubo crecimiento sobre las estrías de
inoculación de cada una de las mitades de las placas Petri. Contar y describir
las colonias, realizar Gram de colonias de interés (usar un solo portaobjetos
para 2 o 3 muestras). Interpretar y discutir los resultados.

Informe:

Cada grupo de estudiantes deberá confeccionar un informe que incluya:

- Introducción
- Procedimiento realizado en el paso práctico
- Resultados*
- Conclusión
- Discusión
- Bibliografía

*En resultados, llenar una tabla como la siguiente:

Placa Desinfectante o N°colonias Morfología Gram (si
antiséptico colonias corresponde)
ambiente no (control)
Mesón no
Desinfectante 1 Alcohol
etc

47
 Antibiograma. Técnica de difusión en Agar

Introducción

Los antibióticos son sustancias químicas producidas por microorganismos o

derivados semisintéticos de éstas, mientras que los quimioterapéuticos son productos
de síntesis química, pero ambos tienen la propiedad de estar dotados de actividad
antibacteriana.

El conocimiento de las principales propiedades que tienen los antibacterianos es

fundamental para los alumnos del área de la salud. En los últimos años la gran actividad
antibacteriana se ha visto opacada por la aparición de cepas de elevada
multirresistencia y por la aparición de nuevas enfermedades infecciosas.

El origen de la multirresistencia es un proceso multifactorial en el que intervienen

aspectos relacionados con el propio microorganismo, otros derivados del uso de los
antimicrobianos y también los relacionados con el hospedador o lugar de la infección.
Este último juega un papel importante, dado que se produce una colonización crónica
que requiere exposiciones prolongadas a antibióticos para controlar su progresión
y la llegada de los antibióticos a los propios microorganismos se ve dificultada por las
características de las cepas

Propiedades generales de los agentes antibacterianos:

A. Espectro de actividad antibacteriana

Cada agente antibacteriano puede actuar solamente sobre un determinado número de

especies bacterianas, así por ejemplo las bacterias Gram-negativas son más
difícilmente afectadas por estos compuestos debido a la complejidad de su estructura
de envoltura lo que dificulta la penetración del antibiótico.
El conjunto de especies bacterianas que pueden ser inhibidas o muertas por un agente
antibacteriano, lo que se llama, susceptibles al antibacteriano, constituye su espectro
de actividad antibacteriana.

Antibióticos de reducido espectro: Antibacterianos que actúan solamente sobre

bacterias Gram positivas, o bien solamente sobre Gram negativas.

Antibióticos de amplio espectro: Antibacterianos que actúan en los dos grupos

bacterianos, Gram positivos y Gram negativos

B. Tipo de actividad antibacteriana

Actividad Bacteriostática: Los antibacterianos pueden inhibir el desarrollo de la

población bacteriana.
Actividad Bactericida: Los antibacterianos matan a la población bacteriana.

48
C.- Mecanismo de acción de los Antibióticos

Actuar sobre la pared celular de la bacteria inhibiendo su síntesis

Alterando la permeabilidad de la membrana
Inhibir síntesis proteica de la célula bacteriana
Inhibir síntesis de Ácidos nucleicos de la célula bacteriana
Inhibir o alterar las vías metabólicas fundamentales en procariontes

D.- Resistencia de las bacterias a los agentes antibacterianos

Este es uno de los fenómenos de mayor importancia que ocurre naturalmente y se

expresa a causa del empleo de los agentes antimicrobianos. La resistencia de una
bacteria a un determinado agente antibacteriano puede ser:

Natural, porque esta propiedad es un atributo de la especie bacteriana

49
 Adquirida, si la especie está formada por cepas susceptibles que
paulatinamente cambian su comportamiento frente al uso de un antibacteriano,
apareciendo las resistentes.

La aparición de cepas resistentes en la naturaleza se realiza por dos procesos:

Mutación. Las mutantes resistentes se producen espontáneamente con una frecuencia

definida y característica para cada agente antibacteriano. La presión selectiva (empleo
clínico) del antibacteriano selecciona estas mutantes eliminando las susceptibles. Esta
nueva cepa, presenta resistencia sólo al antibacteriano involucrado en su selección, o a
otro muy relacionado.

Transferencia genética de resistencia. Algunos genes extracromosomales que

codifican resistencia están ubicados en plásmidos, transposones y/o integrones y, por
lo tanto, pueden transferirse desde bacterias resistentes a bacterias susceptibles, bajo
ciertas condiciones. Estos elementos extracromosomales codifican resistencia para más
de un antibiótico, por lo tanto, la adquisición de esta resistencia puede conducir a
multirresistencia.

Todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos

antibacterianos. La evaluación de esta sensibilidad nos va a ayudar en la selección del
compuesto más adecuado para el tratamiento de una infección bacteriana. Las pruebas
más utilizadas para evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente antibacteriano
están basadas en el enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas concentraciones
del agente.

Concentración mínima inhibitoria (CMI o CIM) se define como la menor

concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepa bacteriana
dada.
Concentración mínima bactericida (CMB) se define como la menor concentración
de antimicrobiano capaz de destruir una cepa bacteriana dada.

Las pruebas in vitro para determinar la susceptibilidad bacteriana se pueden clasificar

en test por difusión y test por dilución.

Prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusión en agar

Variados métodos de laboratorio pueden ser usados para determinar in vitro la

susceptibilidad de bacterias ante agentes microbianos. En muchos laboratorios de
microbiología clínica, el test de difusión en agar es usado en forma rutinaria para
bacterias de rápido crecimiento y algunas bacterias fastidiosas patógenas. Los ensayos

50
de susceptibilidad basados solamente en la presencia o ausencia de una zona de
inhibición sin importar su tamaño, no son aceptables. Resultados confiables sólo se
pueden obtener con un disco de ensayo de difusión que use el principio de metodología
estandarizada y con medidas de diámetro de zonas correlacionadas con la
determinación de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) con cepas conocidas
susceptibles y resistentes a varios antibióticos.
El método que actualmente recomienda Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI), está basado en el método originalmente descrito por Bauer et al., (método de
Kirby-Bauer). Este es el método de difusión en disco en que se han desarrollado
estándares para su interpretación y está apoyado por datos clínicos y de laboratorio.

Para minimizar la confusión, todos los agentes antimicrobianos deberían ser

informados usando nombres sin marcas o propietario (es decir nombres genéricos).
Para enfatizar la relación de muchas drogas disponibles actualmente, deberían ser
agrupadas por clase.

ß-Lactámicos

Los antibióticos ß-Lactámicos comparten un anillo central de 4 ß-Lactam y su principal

modo de acción es la inhibición de síntesis de la pared celular. Anillos adicionales a la
estructura o grupos agregados al anillo ß-Lactam determina si el agente es penicilina,
cefem, carbapenem, o monobactam.

- Penicilinas

El espectro de actividad de la penicilina primaria incluye no productores de ß-lactamasa,

grampositivos y algunos fastidiosos, y bacterias gram negativas. Las acilamina
penicilinas (ampicilina y amoxicilina) tienen actividad específica contra más especies de
gramnegativos, incluyendo miembros de la familia Enterobacteriaceae no productoras
de ß-Lactamasa. Carboxi-penicilinas (carbenicilina y ticarcilina) y ureido-penicilinas
(mezlocilina y piperacilina) tienen un amplio y considerable espectro contra
gramnegativos, incluyendo actividad contra Pseudomonas spp. Penicilinas penicilinasa
resistentes (cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina y oxacilina) que tienen un
espectro predominantemente grampositivo, incluyendo Staphylococcus spp productor
de penicilinasa.

51
 - Combinación de ß-Lactámicos / Inhibidor de ß-Lactamasa

Estos agentes antimicrobianos incluyen una penicilina y un segundo agente que tiene
una mínima actividad antibacteriana pero funciona como un agente inhibidor de algunas
ß-Lactamasas. Actualmente, tres inhibidores de ß-Lactamasas están en uso:
clavulanato, sulbactam, y tazobactam.

- Cefemes (incluyendo Cefalosporinas)

Diferentes antibióticos Cefemes, incluyendo cefalosporina, pueden tener un espectro de

actividad algo diferente contra bacterias gram positivas y gram negativas. Estos agentes
a menudo son llamados como "primera", "segunda", o "tercera" generación de
cefalosporinas, basado en la extensión de su actividad contra la mayoría de bacterias
gram negativas resistentes a antibióticos. No todos los representantes de un grupo
específico o generación necesariamente tienen el mismo espectro de actividad. Debido
a estas diferencias de actividad un representante de cada grupo puede ser seleccionado
para test de rutina.

- Carbapenemes

Difieren ligeramente en estructura de las penicilinas y son mucho más resistentes a la

hidrólisis por ß-Lactamasa, lo que da a ellos un amplio espectro de actividad contra
muchas bacterias gram positivas y gram negativas.

- Monobactam

Estos antibióticos son los únicos que estructuralmente muestran una significativa
actividad sólo contra bacterias gram negativas aeróbicas. Aztreonam es el único
monobactam aprobado para uso por la FDA.

- Glicopéptidos

Antibióticos glicopéptidos comparten una compleja estructura química y el modo de

acción es la inhibición de síntesis de la pared celular en sitios diferentes a los sitios de
acción de los ß-Lactámicos. La actividad de este grupo es dirigida primeramente a
bacterias gram positivas. La vancomicina es un agente aceptado para tratamiento de
infecciones por bacterias gram positivas en pacientes alérgicos a la penicilina y es útil
para terapia en infecciones causadas por bacteria gram positivas ß-lactamasa
resistentes, por ej. Staphylococcus aureus (MRSA) y algún Enterococcus spp.

- Aminoglicósidos

Inhiben la síntesis de proteínas bacterianas a nivel del ribosoma. Son usados

primeramente para tratar infecciones por bacterias aeróbicas gram negativas o en
combinación sinérgica con antibióticos activos en la pared celular contra algunos gram
positivo resistentes, por ej.: Enterococcus spp.

- Macrólidos

52
Macrólidos están estructuralmente relacionados a antibióticos que inhiben la síntesis
proteica a nivel del ribosoma. Hay varios miembros de esta clase actualmente en uso
que pueden ser considerados para pruebas contra fastidiosos gram positivo o
gramnegativo. Drogas de este grupo están estrechamente relacionadas entre sí, con
pocas excepciones, solo es necesario probar de rutina la tetraciclina.

- Tetraciclinas

Inhiben la síntesis proteica a nivel del ribosoma de ciertas bacterias gram negativas y
gram positivas. Las drogas en este grupo están estrechamente relacionadas y, con
pocas excepciones, sólo la tetraciclina puede requerir ser probada de rutina.

- Quinolonas

Grupo de compuestos incluye a un número de agentes estrechamente relacionados que

funcionan primeramente por inhibición de la actividad de la DNA girasa de muchas
bacterias gram negativas y gram positivas. Por algunas diferencias en el espectro se
requiere probarlos individualmente.

- Sulfonamidas y Trimetoprim

Este grupo de compuestos abarca varios agentes quimioterapéuticos con espectro

similar de actividad resultante de la inhibición del metabolismo bacteriano. Sulfisoxazole
es la sulfonamida más usada en el tratamiento de infecciones en el tracto urinario, y
debe probarse in vitro. Sulfometoxazole es usualmente probada en combinación con
Trimetoprim.

Clases de droga simple

Cloranfenicol, clindamicina, linezolid y quinupristin/dalfopristin que actúan inhibiendo la

síntesis de proteínas. Rifampicina que es un inhibidor de la síntesis de RNA.
Nitrofurantoína actúa por inhibición de síntesis de muchas proteínas y etapas de
ensamblaje a nivel del ribosoma, es útil sólo en la terapia de infecciones en el tracto
urinario, debido a su extremada baja concentración en los otros fluidos del cuerpo.
Fosfomicina, aprobada por la FDA para infecciones del tracto urinario, actúa inhibiendo
enzimas que están involucradas en la síntesis de la pared celular.

Para que la prueba de susceptibilidad sea práctica y relevante, el número de

agentes antimicrobianos debería ser limitado. En el Anexo, la tabla 1A indica las drogas
que deberían usarse de rutina en muchos laboratorios clínicos. La tabla está dividida en
columnas basadas en organismos específicos o grupos de organismos, y la variedad de
drogas están indicadas por prioridad para realizar la prueba con el fin de ayudar al
laboratorio en la selección de la prueba de rutina. Los distintos casilleros designan
grupos de agentes comparables que generalmente no requieren ser duplicados en una
prueba ya que la interpretación de los resultados es usualmente similar, y la eficacia
clínica usualmente comparable. La palabra "o" designa a grupos de agentes
relacionados, los cuales muestran un espectro casi idéntico de actividad e interpretación
de resultados, por esto, usualmente sólo uno de estos agentes necesita ser
seleccionado para la prueba:

53
 Grupo A: Los agentes de este grupo se consideran apropiados para incluirlos
en la rutina, como panel primario de prueba por lo que el informe de rutina debe
incluirlos todos.
Grupo B: comprende agentes que son importantes clínicamente,
particularmente para infecciones nosocomiales, ellos deben ser informados sólo
selectivamente, cuando el organismo es resistente a agentes de la misma clase,
en el Grupo A.
Grupo C: comprende agentes antimicrobianos alternativos o suplementarios
que pueden requerir pruebas en aquellas instituciones que mostraron endemias
o epidemias de cultivos. resistentes a muchas drogas primarias (especialmente
en la misma clase, por ej.: ß-lactámicos o aminoglicósidos); para tratamiento de
pacientes alérgicos a drogas primarias; para tratamiento de organismos
inusuales (por ej. cloranfenicol para aislados extraintestinal de Salmonella spp
algún Enterococcus resistente a vancomicina).
Grupo U: lista ciertos agentes antimicrobianos (por ej. Nitrofurantoina y
algunas quinolonas), que están limitadas a tratamiento de infecciones del tracto
urinario. Estos agentes no son para ser probados contra patógenos
recuperados de otro sitio de infección que no sea el tracto urinario.
Grupo O: (otros), incluye agentes que tienen indicación clínica para el grupo
de organismo pero no están indicados en los test de rutina.
Grupo Inv. (Investigación), incluye agentes que se están investigando y aún no
han sido aprobados por la FDA.

De los muchos medios disponibles, se considera el Agar Mueller - Hinton como el

mejor para pruebas de susceptibilidad de rutina de bacterias no fastidiosas por las
siguientes razones:

- Reproducibilidad aceptable lote a lote para ensayos de susceptibilidad.

- Es bajo en inhibidores de sulfonamida, trimetoprim, y tetraciclina.
- Crecimiento satisfactorio para la mayoría de los patógenos no fastidiosos.

Los factores a considerar en la utilización del medio de cultivo incluyen:

- Preparación, a partir del reactivo comercial deshidratado y de acuerdo a las

instrucciones del fabricante.
- El pH, El agar debe tener un pH entre 7,2 y 7,4 después de gelificar a
temperatura ambiente. Si el pH es muy bajo, ciertas drogas parecería que
pierden potencia (por ej. aminoglicósidos, quinolonas y macrólidos), mientras
otros agentes pueden presentar excesiva actividad (por ej. tetraciclinas). Si el pH
es muy alto, puede esperarse efectos opuestos.
- Humedad, La superficie debe ser húmeda, pero sin gotas de humedad en la
superficie del medio o en la tapa de la placa antes de ser inoculada.
- La variación en cationes divalentes, principalmente Magnesio y Calcio, afecta los
resultados de ensayo de aminoglicosidos y tetraciclinas con cepas de
Pseudomonas aeruginosa.

El agar Mueller-Hinton sin suplemento sólo debería usarse para probar bacterias
aeróbicas o facultativas que crezcan bien en él. Especies fastidiosas tales como
Haemophilus spp, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae, S. viridans y

54
Streptococcus ß-hemolítico requieren suplementos o diferentes medios para crecer y
ellos deberían ser probados en los medios específicos.

Los sensidiscos (discos de papel filtro especial impregnados con antibióticos),

también tienen indicaciones especiales, entre ellas las que respectan a su
almacenamiento.
- Refrigerar los viales a 8ºC o menos, o congelar a -14ºC o más bajo, en un frezeer
"non Frost o frost free".
- Viales de discos sellados que contienen drogas de la clase ß-lactámicos deben
ser almacenados congelados, excepto pequeñas cantidades para trabajo
inmediato, las que pueden ser refrigeradas sólo por una semana.
- Algunos agentes como por ej. Combinaciones de imipenem, cefaclor,
clavulanato pueden conservar mayor estabilidad si se almacenan congelados
hasta el día de uso.
- Los viales de discos que no han sido abiertos deben ser sacados del refrigerador
o frezeer, 1 o 2 horas antes de usar para que igualen su temperatura a la del
ambiente antes de abrir. Este procedimiento minimiza la cantidad de
condensado que se forma cuando aire caliente toca los discos fríos.
- Una vez que un vial de discos se ha sacado de su paquete sellado, debe ser
puesto en un desecador bien sellado. Cuando se usa un dispensador de discos,
éste debe ser puesto con una cubierta ajustada y con un adecuado agente
desecante.
- Sólo aquellos discos con fecha de expiración del fabricante dentro del plazo
pueden ser usados. Otro factor importante para este método consiste en la
turbidez del inóculo preparado con la bacteria a estudiar.
- Para estandarizar la densidad del inóculo se utiliza un estándar de turbidez de
BaSO4, equivalente a un estándar 0.5 McFarland o su equivalente óptico (este
patrón proporciona una densidad óptica comparable a la de una suspensión
bacteriana de 1.5 x108 UFC/ml).

Actividad Práctica:

Materiales:

- Placas de agar Mueller Hinton

- Tórulas estériles
- Pisetas con difusor, con alcohol al 70%.
- Cajas con guantes S, L y M
- Lápices marcadores indelebles (lo debe traer cada alumno)
- Asas en anillo (esto para todos los prácticos)
- Tubos con 5 ml de NaCl 0,85% estéril.
- Estándar 0,5 McFarland
- Pinzas
- Vórtex
- Placas de agar sangre sembradas con S. aureus ATCC 25923
- Placas de agar MacConkey sembradas con E. coli ATCC 25922
- Discos con antimicrobianos.

55
Objetivos:

- Conocer los métodos de estudio de susceptibilidad a agentes antimicrobianos.

- Realizar un antibiograma utilizando el método de difusión en agar.
- Determinar la acción de diferentes antibióticos sobre una misma especie
bacteriana.

Procedimiento:

El trabajo se realizará en pareja o grupos, según indicaciones del docente.

Preparación del inóculo:

El inóculo puede ser preparado haciendo directamente un caldo o suspensión salina de

colonias aisladas de una placa de agar de 18 a 24 horas (un medio no selectivo, tal
como agar sangre). La suspensión se ajusta hasta 0,5 McFarland de turbidez.

Inoculación de las placas:

1. En un lapso de tiempo óptimo de 15 minutos después de ajustar la turbidez de la

suspensión del inóculo, una tórula de algodón se sumerge en ella. La tórula debe ser
rotada varias veces y presionada firmemente contra la pared interna del tubo sobre el
nivel de líquido. Esto remueve el exceso de inóculo.
2. Se inocula la superficie de una placa de agar Mueller -Hinton por rayado con la tórula
sobre toda la superficie. Este procedimiento es repetido rayando dos o más veces,
rotando la placa aproximadamente 60º C cada vez para asegurar una distribución
constante del inóculo. Como paso final se pasa sobre los bordes del agar.
3. La tapas de la placa pueden quedar entreabiertas por 3 a 5 minutos, pero no más de
15, para permitir que un exceso de humedad de la superficie se absorba antes de aplicar
el disco con la droga impregnada.
4. Se debe evitar excesos en la densidad del inóculo. Nunca usar caldos de cultivo de
la noche anterior sin diluir u otro inoculo no estandarizado

Aplicación de los discos a las placas inoculadas:

1. Los sensidiscos se dispensan sobre la superficie del agar. Cada disco debe ser
presionado para asegurar contacto pleno con la superficie del agar. Ya sea que el disco
se ponga individualmente o con un dispensador, deben ser distribuidos en forma
constante y no debe quedar a menos de 24 mm de distancia entre centros. No más de
12 discos se deben poner por placa de 150 mm o no más de 5 en placas de 100 mm.
Debido a que algunas drogas difunden casi instantáneamente, un disco no debe ser
relocalizado una vez que haya tomado contacto con la superficie del agar.
2. Las placas son invertidas y puestas en un incubador a 35ºC en el lapso de 15 minutos
después de aplicados los discos. Las placas no se deben incubar en un ambiente de
CO2 porque los estándares de interpretación fueron desarrollados usando aire ambiente
y el CO2 alterará significativamente el tamaño de las zonas de inhibición de algunos
agentes.

56
Lectura de las placas e interpretación de los resultados:

1. Después de 16 a 18 horas de incubación, cada placa es examinada. Las zonas de

inhibición resultantes deben ser uniformemente circulares en una capa homogénea de
crecimiento. Si aparecen colonias individuales, el inóculo estaba muy diluido y la prueba
debe ser repetida. Los diámetros de la zona de inhibición completa (a ojo desnudo son
medidos en mm. pasando por el centro del disco. La placa Petri se mantiene a una
distancia de pocos centímetros sobre un fondo negro no reflectante y se ilumina con luz
reflejada. Si se agregó sangre al agar base (como para Streptococcus), las zonas son
medidas en la superficie superior del agar iluminado con luz reflejada sacando la tapa.
Si el organismo de prueba es un Staphylococcus spp. o Enterococcus spp., se requieren
24 horas de incubación y luz transmitida (placa se mantiene hacia la luz) se usa para
examinar la zona de oxacilina y la zona de vancomicina buscando ligeros desarrollos de
colonias resistentes a meticilina o vancomicina.
2. El margen de las zonas debe ser tomado como el área donde no se observa
crecimiento visible. Un crecimiento pobre de pequeñas colonias, las que se detectan
con lente de aumento al borde de la zona de crecimiento inhibido, son ignoradas. Sin
embargo, colonias discretas creciendo dentro de la zona clara de inhibición deben ser
identificadas y probadas nuevamente. Con Proteus spp., el delgado velo de población
en una obvia zona de inhibición debe ser ignorado. Con trimetoprim y las sulfonamidas,
pueden aparecer zonas de crecimiento leve; por lo tanto, no se considera y se mide los
márgenes más obvios para determinar el diámetro de la zona. Cuando se usa medio
suplementado con sangre para probar Streptococcus spp., se debe ser cuidadoso en
medir la zona de inhibición y no la de hemólisis.
3. Los tamaños de las zonas de inhibición son interpretados en las Tablas CLSI para
ser informado como susceptible, intermedio, o resistente a los antimicrobianos que se
han probado. Estas tablas deben ser actualizadas periódicamente.

Interpretación de los resultados de la prueba de difusión en disco:

- Estándares de interpretación de zonas de diámetro

Existen tablas específicas CLSI las que indican los criterios para interpretar los
diámetros de zonas para categorizar exactamente los niveles de susceptibilidad de los
microorganismos a diferentes agentes antimicrobianos.

57
Las tablas CLSI utilizadas deben ser las vigentes, ya que son periódicamente publicadas
y pueden contener variaciones.

- Categorías interpretativas:

Sensible: La categoría "sensible" implica que una infección debido a una

cepa puede ser apropiadamente tratada con la dosis de agente
antimicrobiano recomendado para ese tipo de infección y especie
infectante.
Intermedio: La categoría "Intermedio" incluye aislamientos con agentes
antimicrobianos con un CIM que se aproximan usualmente a nivel de
tejido y sangre disponible y para los cuales su velocidad de respuesta
puede ser más lenta que la de los aislamientos susceptibles. La categoría
"Intermedia" implica eficacia clínica en sitios del cuerpo donde la droga
es fisiológicamente concentrada (por ej. quinolonas y ß-lactámicos en
orina) o cuando una dosis mayor que lo normal de una droga puede ser
usada (por ej. ß-lactámicos).
Resistente: Las cepas resistentes no son inhibidas por la concentración
sistémica usualmente alcanzable de un agente cuando los esquemas de
dosificación normal son usados. Pueden tener CIM que caen dentro del
rango donde están disponibles mecanismos de resistencia específicos
(por ej. ß-lactámicos) y la eficacia clínica no ha sido confiable en
tratamientos estudiados.

Cada pareja o grupo de estudiantes deberá confeccionar un informe que incluya:

- Introducción
- Procedimiento realizado en el paso práctico
- Resultados*
- Conclusión
- Discusión
- Bibliografía

*En resultados, llenar una tabla como la siguiente, con los 2 antibiogramas:

Antibiograma N°
Cepa:

Antimicrobiano Diámetro del halo de Interpretación

inhibición

58
Anexo

59
 Identificación cocáceas Gram positivas

Las cocáceas gram positivas patógenas se aíslan en agar con sangre de

carnero al 5%. Algunas especies presentan capacidad hemolítica, parcial (alfa
hemólisis) o total (beta hemólisis)

El género Staphylococcus se separa de las otras cocáceas gram positivas por

su morfología microscópica, macroscópica y propiedades bioquímicas. El S. aureus es
el único coagulasa positivo y forma grandes colonias cremosas y frecuentemente con
pigmentación amarilla y es beta hemolítico. A diferencia de aquél, los otros
Staphylococcus son coagulasa negativo, no-hemolítico.

El género Streptococcus presenta 13 grupos (clasificación de Lancefield) en

base al carbohidrato C de la pared celular y son dclasificados de la A a la O. Los
estreptococos del grupo A, también denominados Streptococcus pyogenes constituyen
la causa más común de faringitis en humanos. Al crecer en medio de cultivo forman
colonias de 1-2 mm, transparentes, beta hemolíticas. Son sensibles a la Bacitracina.

Los estreptococos del grupo B o S. agalactiae, son beta hemolíticos, y dan la

prueba de CAMP positiva: una hemólisis marcada en forma de punta de flecha en el
punto de unión de su crecimiento con S. aureus, productor de B lisina.

El Streptococcus pneumoniae es conocido como neumococo y desarrolla

colonias de 1-3 mm, apigmentadas, alfa hemolíticas. Las cepas virulentas dan colonias
mucoides debido a que presentan una gran cápsula, lo que constituye un factor de
virulencia.
Los Enterococcus son organismos que forman parte de la flora normal del intestino en
humanos y debido a la capacidad que tienen de sobrevivir en todo tipo de ambientes,
pueden ser aislados a partir de una gran variedad de muestras clínicas. Causan una
gran variedad de infecciones y son patógenos importantes en infecciones urinarias,
especialmente en aquellas adquiridas en forma nosocomial, infecciones de heridas
intraabdominales, bacteremias y endocarditis. Son capaces de crecer en NaCl 6,5% y
en el medio de bilis-esculina, y tienen el antígeno del grupo D.

Actividad Práctica:

Materiales:
- Placa de agar sangre con cepas de Staphylococcus aureus atcc 25923
- Placa de agar sangre con Staphylococcus epidermidis o coagulasa negativo
- Placa agar sangre con Streptococcus grupo A
- Placa agar sangre con Streptococcus grupo B
- Placa de agar sangre con Streptococcus pneumoniae o Streptococcus viridans
- Placa de agar sangre con Enterococcus faecalis o faecium
- Tubos con agua destilada estéril
- Pipeta pasteur estéril desechable
- Pisetas con difusor, con alcohol al 70%.
60
- cronómetros
- Cajas portaobjetos
- Palitos de madera
- Asas en anillo
- Frascos aceite de inmersión
- Papeles y solución de limpieza para lentes de microscopios.
- Cajas de guante (S,M,L)
- Caja mascarillas
- Peróxido de Hidrógeno al 3%
- Tubos con 0.5 ml de plasma humano o de conejo
- Placa de agar sangre para prueba de novobiocina
- Sensidiscos de novobiocina
- Pinzas para sensidiscos
- Placa de agar sangre para hacer el test de Camp
- Placas de agar sangre para bacitracina y optoquina
- Sensidiscos de bacitracina 0.04U y optoquina
- Tubos con caldo nutritivo con NaCl al 6.5%
- Tubos con agar bilis esculina

Objetivos:
- Conocer las características microscópicas y macroscópicas de las cocáceas
gram positivas.
- Conocer y realizar pruebas bioquímicas utilizadas en la identificación de
cocaceas gram positivas.

Procedimiento:

El trabajo se realizará en grupos, según instrucciones del docente.

Cada grupo deberá trabajar todas las cepas de cocáceas disponibles.

1. Staphylococcus

Morfología macroscópica

Observar y registrar las características de las colonias en placa mediante observación

directa.

Pruebas Bioquímicas

Prueba de la catalasa: (realice esta prueba a todas las cepas)

- Objetivo: Diferenciar los géneros Staphylococcus y Micrococcus (catalasa +) de los

géneros Streptococcus y Enterococcus (catalasa -) principalmente.
- Fundamento: La enzima catalasa descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en
agua y oxígeno.

61
- Procedimiento:

Se coloca una gota de H2O2 al 3% sobre un portaobjetos y luego se transfiere una

porción de colonia sobre el H2O2 realizándose una emulsión. En lo posible debe
tomarse la colonia a partir de un medio sin sangre ya que los eritrocitos tienen actividad
de catalasa y pueden falsear los resultados.

- Interpretación de resultados: El desprendimiento de burbujas se considera una

prueba positiva.

Prueba de la coagulasa en tubo: (realice esta prueba a S. aureus)

- Objetivo: Permite diferenciar S. aureus (coagulasa positivo), de las otras especies

de estafilococos que genéricamente se denominan coagulasa negativos.
- Fundamento: la exocoagulasa o coagulasa libre actúa mediante la activación de un
factor (FRC), formándose un complejo coagulasa-FRC, el cual reacciona con el
fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina.
- Procedimiento:
Se emulsionan varias colonias en un tubo con 0,5ml de plasma citratado humano o
de conejo. Se incuba a 35º y se chequea la formación del coágulo a las 4 horas. Si
es negativo se reincuba toda la noche y se procede a su lectura a las 18 horas. La
lectura a las 4 horas, es fundamental porque en alguna oportunidad puede suceder
que las fibrinolisinas de S. aureus lisen el coágulo luego de 18 horas de incubación
y de esta manera se produzcan un test falso negativo.
- Interpretación de resultados: Se observa la formación de un coágulo total o parcial
si el test es positivo.

Susceptibilidad a la novobiocina: (realice esta prueba al Staphylococcus coagulasa

negativo)

- Objetivo: Diferenciar S. saprophyticus (resistente a la novobiocina) de los demás

estafilococos coagulasa negativos.
- Fundamento: Varias especies del Género Staphylococcus son resistentes a la

- Procedimiento:

Tomar varias colonias, y sembrar en cuadrante una placa de agar sangre. Luego se
aplica el disco de novobiocina en primer cuadrante y se incuba a 35º C por 18 a 24
horas.

Interpretación de resultados

- Un halo de inhibición de crecimiento menor o igual a 16 mm corresponde a S.

saprophyticus. Un halo de inhibición mayor de 16 mm corresponde a otros
Staphylococcus coagulasa negativos.

62
Streptoococcus y Enterococcus

Morfología macroscópica

Observar y registrar las características de las colonias en placa mediante observación

directa.
Observar la presencia de Hemolisis:
- -hemolíticos: Hemólisis parcial, se observa como un halo con verdoso alrededor de
las colonias.
- ß-hemolíticos: Hemólisis total de los glóbulos rojos, se observa como un halo
transparente alrededor de las colonias.
- -hemolíticos: No producen hemólisis sobre el agar sangre

Pruebas Bioquímicas

Prueba de la catalasa:

- Ver objetivo, fundamento y procedimiento en punto 1.

Sensibilidad a la bacitracina: (realizar este test a S. pyogenes)

- Objetivo: Separar el S. pyogenes de los demás Streptococcus -hemolíticos.

- Fundamento: S. pyogenes es sensible a bajas concentraciones de bacitracina
(discos 0,04U).
- Procedimiento:

Se realiza sembrando un gran inóculo, tomado con asa bacteriológica de un cultivo

puro, que se estría sobre una placa de agar sangre en varias direcciones intentando
obtener un cultivo confluente. Luego se coloca el disco de bacitracina y se incuba
18- 24 horas a 37°C.

- Interpretación de resultados: La aparición de cualquier diámetro de halo de inhibición

de crecimiento alrededor del disco se considera prueba positiva

Prueba de CAMP: (realizar este test a S. agalactiae)

- Objetivo: Separar S. agalactiae de los demás estreptococos ß-hemolíticos.

- Fundamento: Se basa en que los estreptococos del grupo B producen un factor
llamado CAMP (factor de monofosfato de adeninato ciclasa) que aumenta la zona
de hemólisis producida por un estafilococo productor de ß-lisina.
- Procedimiento:

Se realiza estriando un cultivo de estreptococo ß-hemolítico en forma perpendicular a

una estría de un estafilococo productor de ß-lisina en agar sangre (Staphylococcus
aureus). Se incuba 18-24 horas a 37ºC.

- Interpretación de los resultados: La prueba positiva se evidencia por la presencia de

una zona de potenciación de la hemólisis en forma de punta de flecha en el lugar
donde se contactan las dos estrías.

63
Bilis esculina: (realizar este test a Enterococcus)

- Objetivo: Separar los estreptococos del grupo D de los demás grupos de

estreptococos.
- Fundamento: Se basa en la capacidad de los Streptococcus del grupo D o
Enterococcus de crecer en un medio de cultivo que contiene un 40% de bilis y de
hidrolizar la esculina a esculetina, la cual se combina con el citrato ferroso que posee
el medio, dando un complejo de color negro. La concentración de bilis es
fundamental, ya que existen estreptococos del grupo Viridans que son capaces de
crecer a concentraciones menores de bilis.
- Procedimiento:

Se realiza sembrando en superficie tubos de agar bilis esculina inclinado.

- Interpretación de resultados: Una reacción positiva se evidencia como

ennegrecimiento del medio.

Prueba de NaCl 6,5%: (realizar este test a Enterococcus)

- Objetivo: Diferenciar genero Enterococcus, capaces de crecer en NaCl 6,5% de

Streptococcus
- Fundamento: Se basa en la capacidad de los enterococos de crecer en una
concentración de 6,5% de NaCl. Se trata de un medio de cultivo líquido que contiene
además de NaCl, glucosa y un indicador de pH: púrpura de bromocresol.
- Procedimiento:

Se inocula el caldo salado con la cepa a estudiar y se incuba 18-24 horas a 35°C

- Interpretación de resultados: Se considera la prueba positiva cuando aparece

turbidez con o sin acidificación del medio, que se observa como un viraje de color
del púrpura al amarillo. La no aparición de turbidez indica una prueba negativa.

Sensibilidad a la optoquina (realizar este test a S. pneumoniae)

- Objetivo: Diferenciar S. pneumoniae -hemolíticos.

- Fundamento: Se basa en la sensibilidad de S. pneumoniae a una concentración

- Procedimiento:

Tomar con asa estéril una colonia y estriar en cuadrante una placa de agar sangre.
Colocar luego un disco de optoquina en el centro del área estriada del primer cuadrante.
Incubar 18-24 horas a 37°C en 5% CO2.

- Interpretación de resultados: S. pneumoniae

13 mm) deben confirmarse con pruebas adicionales

64
Cada grupo de estudiantes deberá confeccionar un informe que incluya:

- Introducción
- Procedimiento realizado en el paso práctico
- Resultados (confeccionar tablas)
- Conclusión
- Discusión
- Bibliografía

65
 Identificación de Enterobacterias

Los bacilos gramnegativos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae son los que

se aíslan con mayor frecuencia a partir de muestras clínicas. Éstos crecen bien en
cualquier agar nutritivo, y forman colonias diferentes cuando se siembran en agares
selectivos (ej.: Agar MacConkey), dependiendo de sus capacidades metabólicas y los
componentes del medio. Algunas especies son patógenos clásicos, independiente de la
cantidad en que se encuentren en la muestra (Ej.: Salmonella, Shigella). Otros colonizan
el tracto intestinal sin causar enfermedad, pero pueden presentarse como patógenos
oportunistas en pacientes inmunosuprimidos o cuando se introducen en un sitio estéril.

La diferenciación de las enterobacterias se basa en la presencia o ausencia de enzimas,

por lo tanto para su identificación se incorporan a los medios de cultivo los distintos
sustratos sobre los que estas enzimas actúan junto con un indicador, para detectar si
hubo utilización de sustrato o si hay presencia de productos metabólicos específicos.

Actividad Práctica:

Materiales:
- kit de tinción de gram
- Tubos con agua destilada estéril
- Pipeta pasteur desechable estéril
- Pisetas con difusor, con alcohol al 70%.
- cronómetros
- Portaobjetos
- Frascos aceite de inmersión
- Papeles y solución de limpieza para lentes de microscopios.
- Cajas de guante (S,M,L)
- Caja mascarillas
- Agar Mac Conkey sembrado la mitad con E.coli y la otra mitad con Proteus
(vulgaris o mirabilis)
- Agar Mac Conkey sembrado con P.aureginosa
- 3 baterías con: TSI, LIA, MIO, Citrato, Urea
- Asas en punta
- Asas en anillo

Objetivos:
- Conocer las características microscópicas y macroscópicas de bacilos Gram
negativos.
- Conocer y realizar pruebas bioquímicas utilizadas en la identificación de bacilos
Gram negativos.

66
Procedimiento:

El trabajo se realizará en grupos, según instrucciones del docente.

Cada grupo deberá trabajar todas las cepas de Bacilos Gram negativos disponibles.

Morfología microscópica:

Tinción de Gram
Realizar un frotis a partir de las colonias de cepas sembradas de bacilos Gram
negativos. Observar y registrar la forma, agrupación y característica tintorial de Gram.

Morfología macroscópica

Observar y registrar las características de las colonias en placa mediante observación

directa.

Pruebas Bioquímicas

Agar MacConkey:

Es un medio selectivo y diferencial utilizado para la recuperación de enterobacterias y

bacilos Gram negativos entéricos relacionados. Contiene sales biliares y cristal violeta
que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y de algunas Gram negativas
exigentes. La lactosa es la única fuente de carbono. El indicador es el rojo neutro. Las
bacterias fermentadoras de lactosa formas colonias de diferentes tonos de rojo. Los
fermentadores fuertes de lactosa pueden provocar la precipitación de las sales biliares
por la gran cantidad de ácidos formados, lo que se observa fácilmente en el medio por
la aparición de zonas opacas alrededor de las colonias. Las bacterias que no fermentan
la lactosa forman colonias incoloras o transparentes.

Agar TSI:

Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la

fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y las peptonas, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos
de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la
producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+,
los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color
negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del
indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una
sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

Siembra: siembre el agar TSI haciendo una punción central hasta el fondo del tubo y
estría en superficie

67
Lectura: se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C. Se lee un quebrado,
la reacción ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia)
y la reacción ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte
anaerobia) La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la
letra K (color rojo)

En este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:

Fermentación de la glucosa (K/A).
Fermentación de glucosa, lactosa y/o sacarosa (A/A)
No fermentación de los carbohidratos (K/K), la bacteria no utiliza los hidratos de
carbono, produciendo aminas que alcalinizan el fondo y la superficie del medio.
Producción de gas: ruptura del medio.
Producción de H2S: ennegrecimiento del medio

Agar LIA:

Basado en la decarboxilación / deaminación de la lisina y en la producción de ácido

sulfhídrico.
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para
el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es
el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y
deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de
la producción de ácido sulfhídrico.
El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual
o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio
y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina,
tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesaria que la glucosa sea previamente
fermentada.

68
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son
fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al
amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al
consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio
debido a la formación de sulfuro de hierro.
Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella,
desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de
hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

Siembra: Sembrar con asa recta, por doble picadura hasta el fondo del tubo y en
Superficie

Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación (48 horas si es

necesario) a 37ºC. Se lee un quebrado, la reacción ocurrida en la superficie del
medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reacción ocurrida en la
profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia). La acidez
se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color
púrpura).

En este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:

Fermentación de la glucosa (K/A), la bacteria no ataca el aminoácido solo
fermenta la glucosa.
Descarboxilación de la lisina: (K/K)
Desaminación de la lisina: R/A) rojo/ amarillo
Producción de gas: ruptura del medio
Producción de H2S: ennegrecimiento del medio

69
Medio MIO

Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad,

actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol.
Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de
levadura, peptona y tripteína. Además, la tripteína aporta grandes cantidades de
triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol.
La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la
detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador
de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo.
Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad,
presencia de ornitina decarboxilasa e Indol.
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que
difunde más allá de la línea de inoculación.
La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. Debido a la
fermentación de la dextrosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y
originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo.
La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima
ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilación, se
alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura.
El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la
enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de
reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultado positivo.

Siembra: inocular por punción profunda con asa recta.

Lectura: Se efectúa después de 18-24 horas a 35-37 °C.

En este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:

Movilidad:
- Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de
siembra.
- Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.

Ornitina decarboxilasa:
- Resultado positivo: color púrpura.
- Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo
en la superficie del medio.

Prueba del indol:

- Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.

- Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento

70
Urea:

Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la actividad ureasa.

Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae, presenta bajo contenido de nutrientes y alta capacidad buffer.
El extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y cofactores,
y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfatos
constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH y la urea es el sustrato
de la enzima ureasa.
Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrógeno
proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos
productos metabólicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo fenol del
amarillo al rosado.

Siembra: Sembrar con asa recta, solamente en superficie.

Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37ºC.

El indicador de PH es rojo de fenol, el cual en alcalinidad vira a un color rosado indicando

una prueba POSITIVA. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA.

Agar Citrato de Simmons:

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de

usar citrato como única fuente de carbono y energía.
En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el
citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para
el desarrollo bacteriano.
Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador
de pH, que vira al color azul en medio alcalino.
El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar
citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de
nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.

Siembra: sembrar con asa recta, solamente en superficie.

Lectura: se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación (48 horas sí es necesario)

a 37ºC.

71
El indicador de PH es el AZUL DE BROMOTIMOL el cual en presencia de alcalinidad
vira al color azul indicando que la prueba es POSITIVA.
Cuando no hay cambio de color ni crecimiento se dice que la prueba es
NEGATIVA.

Cada grupo de estudiantes deberá confeccionar un informe que incluya:

- Introducción
- Procedimiento realizado en el paso práctico
- Resultados (confeccionar tablas)
- Conclusión
- Discusión
- Bibliografía

72
 Observación de hongos

Características Macroscópicas de los Hongos

Los hongos presentan una gran diversidad de colonias que van desde colonias
similares a las bacterianas, producidas por el crecimiento de levaduras hasta colonias
muy algodonosas capaces de cubrir toda superficie del cultivo. Las características
morfológicas de la colonia fúngicas son en muchos casos particulares a determinados
hongos, así la correcta interpretación del análisis de la colonia es un paso importante en
el proceso de identificación. Además, conocer las colonias de hongos patógenos es
importante para identificarlos en cultivos polimicrobianos, obtenidos frecuentemente en
micosis superficiales y cutáneas. Sin embargo, la colonia de muchos hongos
filamentosos puede variar considerablemente entre un medio de cultivo y otro debido a
la constitución nutritiva de estos, además influye la temperatura y tiempo de incubación.
Por tal motivo es fundamental conocer el medio y las condiciones de incubación del
agente aislado para poder interpretar adecuadamente las características de la colonia.
El agar Sabouraud-glucosa es el medio de cultivo utilizado universalmente para el
aislamiento de hongos, incubándose a 37°C cuando se sospecha de levaduras o a 25°C
cuando se buscan filamentosos. Ambas temperaturas son utilizadas en muestras de
micosis profundas o sistémicas para cubrir todo el espectro, incluso hongos patógenos
dimórficos

La observación y análisis macroscópico de la colonia del hongo debe caracterizar:

73
 Características microscópicas de los Hongos

Las células fúngicas presentan morfología variable, inclusive dentro de los organismos
de una misma especie y cepa, mostrando gran diversidad en las estructuras de
propagación, dispersión y fructificación, tanto en su forma como en tamaño.

Los hongos están formados por unidades básicas celulares denominadas talo o micelio,
y estas pueden ser unicelulares en el caso de las levaduras o pluricelulares, llamadas
hifas en los hongos filamentosos, cuyo conjunto constituye el micelio. Sin embargo,
algunas levaduras tienen la propiedad de formar estructuras pluricelulares.

Actividad Práctica:

Materiales:
- Placa de agar saboureaud sembrada mitad con Candida albicans y mitad
Cryptococcus neoformans
- Placa de agar saboureaud sembrada con Mucor spp
- Placa de agar saboureaud sembrada con Aspergillus niger
- Cinta adhesiva transparente
- Tijeras
- Frascos con gotario con azul de lactofenol

Objetivos:
- Conocer las características microscópicas y macroscópicas de Hongos.

.
Procedimiento:

(El trabajo se realizará en grupos de 2 alumnos (máximo 15 grupos por laboratorio)

Cada grupo deberá trabajar todas las cepas de Hongos disponibles.

1. Observar, describir y analizar el cultivo y colonias de hongos sembradas en

agar Sabouraud

74
2. Observar y dibujar las principales estructuras microscópicas básicas de los
hongos levaduriformes

75
Estructuras reproductoras

En los hongos podemos reconocer dos tipos de micelio; el vegetativo y el reproductor,

con funciones definidas:

- Micelio vegetativo: se desarrolla en la superficie del sustrato y su función principal

es absorber los nutrientes, crecer y sustentar al micelio reproductor.
- Micelio reproductor: crece proyectándose en dirección vertical, perpendicular al
talo vegetativo y desarrollan las células especializadas en la reproducción de la
especie, sea esta sexual o asexual.

Observar, dibujar y señalar las principales estructuras reproductoras de los hongos:

76
Cada grupo de estudiantes deberá confeccionar un informe que incluya:

- Introducción
- Procedimiento realizado en el paso práctico
- Resultados (confeccionar tablas)
- Conclusión
- Discusión
- Bibliografía

77
 Observación de Parásitos

Introducción

Parasitismo:
Es la asociación entre dos seres o especies diferentes, pudiendo vivir en el
interior o superficie de su huésped, el cual le proporciona las condiciones de ambiente
y alimentación que le son necesarios para conseguir su maduración sexual y le causa
al huésped daño en sus estructuras o funciones

Parásito:

Organismo que durante una parte o la totalidad de su existencia se aloja y/o se

alimenta a expensas de otro ser vivo de diferente especie.

Ciclo de vida de un parasito

El conjunto de etapas y transformaciones que experimenta un parásito durante

su desarrollo, se conoce como ciclo de vida o ciclo biológico. Estos ciclos pueden ser
directos o monoxénicos si el parásito requiere de un solo huésped para todo su
desarrollo e indirectos o heteroxénicos si necesita dos o más huéspedes

Los ciclos directos o monoxénicos son simples: el huésped infectado transfiere al

medio ambiente las formas infectantes de los parásitos y estos llegan al huésped
susceptible a través del fecalismo

78
 En los ciclos evolutivos indirectos o heteroxénicos, los parásitos necesitan pasar
por dos o más huéspedes de distinta especie para alcanzar su pleno desarrollo. El
huésped infectado elimina al medio ambiente las formas infectantes, por fecalismo
llegan al huésped intermediario, en éste se desarrolla un estado larval o metacestodo
en los tejidos y llega al huésped susceptible a través del carnivorismo

Huésped: Se denomina huésped al ser vivo que alberga un parásito y podemos

distinguir:

Huésped definitivo: En el cual el parásito alcanza su madurez sexual y se

reproduce
Huésped intermediario: Alberga las formas larvales de los parásitos y se
desarrolla parte de su ciclo biológico

Vector: Organismo que trasmite un parásito de un huésped a otro. Se clasifican en:

Biológico: vector que es esencial para que se complete el ciclo de vida del
parásito
Mecánico: transmite mecánicamente el parásito de un lugar a otro y no es
esencial para que se complete el ciclo de vida del parásito

79
Clasificación de los parásitos:

Clasificación Morfológica

Clasificación Topográfica

Ectoparásitos: Se ubican en la superficie del cuerpo

Endoparásitos: Viven en el interior del organismo y se denominan de siguiente
manera:

- Enteroparásitos: Se ubican en el tubo digestivo

- Histoparásitos: Se ubican en los tejidos
- Hemoparásitos: Se ubican en la sangre

80
 TRABAJO DE LABORATORIO

Nombres:

Complete y entregué lo que a continuación se le solicita, según corresponda:

1. Observación de_________________________

Dibujo: a. Grupo taxonómico al que pertenece el

40x
Indique estructuras observadas.
parásito:___________________________________

b. Forma evolutiva observada:_____________________

c. Características morfológicas típicas de la forma

observada:__________________________________

___________________________________________

___________________________________________

d. Hábitat:_________________________

e. Formas evolutivas encontradas en el ser

humano:_________________________

f. Hospedero definitivo:______________________

g. Hospedero intermediario:___________________

h. Forma infectante para el ser humano:____________

i. Vector:___________________________________

j. Forma infectante para el ser humano____________

k. Mecanismo de infección:_______________________

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Referencias

- Versaloviic J, C. K. (2011). Manual of Clinical Microbiology. Washington DC:

ASM Press.
- Koneman (2008). Diagnóstico Microbiológico. Buenos aires: Editorial Médica
Panamericana.
- Montiel F, Lam M. (2001). Manual de Microbiología Clínica. Chile: Publicaciones
Técnicas Mediterráneo.
- Velasco J. (2008). Manual Práctico de Bacteriología Clínica. Venezuela:
Publicaciones Vicerrectorado Académico, CODEPRE.
- Organización Mundial de la Salud. (2005). Manual de bioseguridad en el
laboratorio. Ginebra: OMS
- Centro de Control y Prevención de Enfermedades, National Institutes of
- Health, (1999). Bioseguridad en laboratorios de microbiología y biomedicina.
Atlanta: CDC/NIH.
- Madigan M, Martinko J, Stahl D, Clarck D. (2012). Brock Biology of
Microorganisms. San Francisco: Benjamin Cummings.
-

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