UNIVERSIDAD NACIONAL JOSÉ FAUSTINO

SÁNCHEZ CARRIÓN

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

Alumno:

Huacho – Perú
2023
PRACTICA Nº4: TÉCNICAS DE SIEMBRA, ESTUDIO DE COLONIAS

Las bacterianas pueden caracterizarse por el tipo de reacciones de oxidación

que utilizan para generar energía que les permita su crecimiento. Las AEROBIAS
ESTRICTAS sólo utilizan el oxígeno como agente oxidante. Las bacterias
ANAEROBIAS ESTRICTAS crecen en ausencia de oxígeno, utilizan los metales y
sulfatos como agentes oxidantes. Las bacterias MICROAEROFILAS crecen en
presencia de concentración baja de oxígeno.

La siembra es el procedimiento por el cual se pone en contacto el

microorganismo con un medio de cultivo, para que en condiciones óptimas de
temperatura y tiempo de incubación pueda desarrollarse y multiplicarse in vitro. Las
finalidad es el aislamiento para obtener un cultivo puro de bacterias a partir de una
muestra problema (orina, heces, esputo, aguas servidas, polvo, etc.)

Es importante conocer las procedencias de las muestras para poder conocer

el medio de cultivo adecuado para su siembra.

MATERIALES :

• Placas con Agar Sangre, Mc. Conkey, TSI, LIA

• Tubos con Caldo Nutritivo
• Tubos con Agar Semisólido o sólido
• Cultivo de Microorganismos en tubo
• Asa de Siembra, mechero.

PROCEDIMIENTO:

a) SIEMBRA POR INOCULACIÓN: Con una asa de siembra, previamente

esterilizada a la llama, tomar una cantidad suficiente de inóculo o muestra e
introducirla hasta el fondo del tubo líquido, sin tocar las paredes del mismo.
Flamear la boca del tubo antes y después de la siembra para evitar
contaminaciones. Rotular e incubar.

b) SIEMBRA POR ESTRIA: Tomar una muestra con el asa de siembra y

sembrar en ZIGZAG en el tubo de agar sólido inclinando empezando por la
superficie más profunda del medio

c) SIEMBRA POR DISPERSIÓN AGOTAMIENTO: Tomar una asada de

muestra y colocarla en un extremo del medio sólido, realizar movimientos del
ZIG ZAG hacia el centro de la placa. Luego girar la placa 60º y hacer el mismo
procedimiento, tomando solo una vez la asada de la muestra. Finalidad:
obtener colonias aisladas.
 d) SIEMBRA POR PUNTURA: Con una aguja de platino, tomar una pequeña
cantidad de una colonia sembrar en el agar semisólido ó sólido
introduciendo la aguja en forma vertical.

PREGUNTAS:

1. ¿Qué características de las bacterias se evalúan en un medio semisólido?

2. ¿Cuál es la utilidad de la siembra por dispersión - agotamiento?

PROTOCOLO:

REALIZA LOS ESQUEMAS DE LOS METODOS DE SIEMBRA

Nº1 Nº 2

Método por Inoculación en medio Método por estría en medio sólido

líquido en tubo

Nº 3 Nº 4

Método por dispersión – agotamiento Método por puntura en medio

en medio sólido en placa petri semisólido o sólido en tubo
PRACTICA Nº 5: ANTIBIOGRAMA

En la práctica médica los quimioterápicos y antibióticos s emplean para el

tratamiento de las enfermedades infecciosas. Las bacterias se defienden
desarrollando varios mecanismos que las llevan a resistir los antimicrobianos. En
la mayoría de los casos, esta resistencia no es posible.

El Laboratorio de Microbiología ayuda al clínico haciéndole conocer la

sensibilidad o resistencia de una determinada bacteria por medio del antibiograma.

El antibiograma puede realizarse por métodos de Dilución o de Disco

difusión.

METODO DILUCIÓN:

Se prepara 10 tubos de prueba de Caldo nutritivo cada tubo se le agrega una

cantidad de antibióticos diluidos en serie, desde 100 ug/ml hasta 0.39 ug/ml. el tubo
10 no contiene antibiótico y sirve como control de crecimiento. Se inocula cada tubo
con una suspensión calibrada de microorganismos en estudio y se incuba a 37ºC
por 18 horas.

A partir de algún tubo empezará la inhibición del crecimiento, este punto de

ruptura representa la MIC, definida como la concentración mínima de antibióticos
en ug/ml que impide el crecimiento bacteriano in vitro.
Completar el esquema:
METODO DE DIFUSIÓN: El método de prueba de susceptibilidad por difusión en
discos incluye el agregado de una cantidad conocida de agente antimicrobiana un
pequeño disco de papel absorbente que mide 6 mm de diámetro.

La colocación de este disco sobre una superficie de agar previamente sembrada

con el microorganismo susceptible. La zona concéntrica de inhibición que resulta
cuando el microorganismo a prueba se siembra sobre la superficie de la placa de
agar antes de la aplicación del disco tiene relación lineal demostrada con la MIC
para la mayoría de los antimicrobianos, medida por pruebas de susceptibilidad por
dilución.

El método de disco-difusión en agar es una manera práctica fácil y rápida de realizar

el antibiograma. El recomendado, el Bauer-Kirby, con el que se ha logrado
uniformizar criterios que toman en cuenta los conceptos de concentración mínima
inhibitoria (MIC) y de la concentración promedio en sangre de las drogas
frecuentemente usadas.

MATERIALES:

• Placas Petri con Agar Muller Hinton.

• Torundas estériles.
• Discos impregnados con diferentes antibióticos.
• Pinzas estériles.
• Tubo de prueba con 3 ml de caldo triplicase soya sembrado con cepa
bacteriana, con una turbidez desarrollo comparable con el tubo Nº 5 de la
escala de Mc. Farland.

PROCEDIMIENTO:

• Sumergir la torunda en el tubo con caldo tripticasa soya con cepa bacteriana,
escurrir en las paredes del tubo y extender uniformemente en al superficie
de la placa de agar Muller-Hinton.
• Colocar con ayuda de pinzas los discos impregnados con diferentes
antibióticos sobre la superficie del agar. Escoger los antibióticos de acuerdo
al tipo de gérmenes y la localización de la infección.
• Los discos deben quedar a una distancia de 20 mm entre ellos.
• Incubar a 37 ºC , durante 24 horas.
 LECTURA E INTERPRETACIÓN:

• El diámetro de la zona de inhibición se mide con una regla milimetrada,

colocada debajo de la placa Petri.
• El límite del área de inhibición está dado por la inhibición completa del
desarrollo tal como se puede apreciar a simple vista.
• Los milímetros de la lectura serán llevados a la tabla para traducir su
interpretación a los términos y SUSCEPTIBLE, INTERMEDIO Y
RESISTENTE.

ANTIBIÓTICOS QUE DEBEN SER CONSIDERADAS PARA PRUEBAS DE

ANTIBIOGRAMA

ENTEROBACTERIACEAE PSEUDOMONAS ESTAFILOCOCOS ENTEROCOCOS ESTREPTOCOCOS

PRIMARIO

AMIKACINA AMIKACINA CEFALOTINA PENICILINA G PENICILINA G

AMPICILINA AZLOCILINA CLINDAMICINA AMPICILINA
CEFAZOLINA CARBENICILINA ERIROMICINA VANCOMICINA
CEFALOTINA GENTAMICINA OXACILINA
CLORANFENICOL NETILMICINA DICLOXACILINA
GENTAMICINA TOBRAMICINA PENICILINA G
TETRACICLINA TETRACICLINA
TOBRAMICINA

SECUNDARIO
AMOXICILINA CEFTAZIDINA AMIKACINA CEFALOTINA
CEFTAZIDINA CEFTRIAXONA GENTAMICINA CLORANFENICOL
CEFTRIAXONA CEFOTAXINA AMOXICILINA CLINDAMICINA
CARBENICILINA CLORANFENICOL CLORANFENICOL ERITROMICINA
TMP – SMX IMIPEM TMP – SMX TETRACICLINA

GUIA PARA INTERPRETAR EL HALO DE INHIBICION

CARGA DEL DIÁMETRO DEL HALO (mm)
ANTIBIÓTICO
DISCO RESIST. INTERM. SUSCEPT.
AMPICILINA 10 ug 11 ó - 12 – 13 14 ó +
CEFACLOR 30 ug 14 ó - 15 –17 18 ó +
CLORANFENICOL 30 ug 12 ó - 13 –17 18 ó +
ERITROMICINA 15 ug 13 ó - 14 – 17 18 ó +
GENTAMICINA 10 ug 12 ó - 13 –14 15 ó +
AC. NALIDIXICO 30 ug 13 ó - 14 –18 19 ó +
TETRACICLINA 30 ug 14 ó - 15 - 18 19 ó +
PROTOCOLO:
1.- Despues de haber hecho la siembra y ATB por el método de disco difusión de una
cepa de Escherichia coli se obtuvo los siguientes resultados: Ampicilina 10 mm,
Gentamicina 20 mm, Ac Nalidixico 22 mm, Cefaclor 19 mm.
Complete el cuadro siguiente con los resultados:

ANTIBIÓTICO O RESULTADO
GERMEN
QUIMIOTERAPICO SUSCEPTIBLE INTERMEDIO RESISTENTE

2.- Que factores podrían alterar un buen resultado de antibiograma.

PREGUNTAS:

1. ¿Para qué es útil un Antibiograma?

2. Señale cinco ejemplos de antibióticos que sean: Aminoglucósidos,

Betalactámicos, Quinolinas, indicando el nivel de acción con respecto a la
estructura bacteriana

3. Señale mecanismos de resistencia antimicrobiana.

4. ¿Cuál es el medio de cultivo más utilizado para realizar un antibiograma?

 PRACTICA Nº 6 IDENTIFICACIÓN DE LAS ENTEROBACTERIAS

Las enterobacterias son bacilos gram negativos no esporulados aerobios y

anaerobios facultativos que habitan en el tracto intestinal. Algunos géneros de está
familia son patógenos para el hombre, en cambio otros condicionan enpatogenidad
al hábitat que colonizan.

La identificación de las diferentes especies de enterobacterias se realiza

estudiando la actividad metabólica del microorganismo sobre los diversos sustratos
(carbohidratos, proteínas, etc.). en la practica se estudian las especies de mayor
importancia médica.

MATERIAL :

• Placas Petri con Agar Mc. Conkey y sembrado con enterobacterias.

• Placas Petri con Agar SS sembrado con enterobacterias.
• Tubos con TSI, LIA, CITRATO inoculados con especie a estudiar.
• Cepas a estudiar: Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Salmonella typhi y
Shiguella.

PROCEDIMIENTO :

• Observar el desarrollo bacteriano en las placas de Agar Mc. Conkey, colonias

rojas que corresponden a bacterias que han metabolizado la lactosa debido
al indicador de pH ácido (rojo neutro). Las colonias incoloras son bacterias
que no han metabolizado la lactosa, se consideran como sospechosas de ser
patógenas (Salmonella-Shiguella).
• Al observar el desarrollo en la placa de SS, medio más selectivo para las
bacterias patógenas, también se puede observar colonias rojas e incoloras.
• En este medio también puede observarse colonias negras de bacterias
productoras de H2S dentro de las cuales están la Salmonella y Proteus. El
medio SS se diferencia del Mc. Conkey porque contiene verde brillante y
tiosulfato de sodio.

IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA :

• El reconocimiento de las diversas especies de Enterobacterias se realiza

observando las reacciones metabólicas, por los cambios del color del medio
sobre los sustratos contenidos en dichos medios diferenciales.
 • En el medio TSI se observa el metabolismo fermentivo de los carbohidratos,
(Glucosa, Sacarosa y Lactosa). Cuando metabolizada la glucosa hay viraje
de color amarillo en el fondo del tubo por metabolismo en ausencia de
oxigeno. Todas las enterobacterias metabolizan la glucosa.
• Cuando metaboliza otros carbohidratos el viraje es en todo el tubo porquela
concentración de lactosa y sacarosa es mayor.
• La producción de H2S toma un color negro que es variado, a veces toma un
color negro en todo el tubo por lo que se considera además la glucosa
positiva. La LIA se observa el metabolismo de la lisina que permanece de
color violeta y no metabolizada la lisina, cuando cambia de color el fondo
(amarillo). También hay producción de H2S en este tubo por lo que se forma
un precipitado negro.
• El citrato en el tubo es de color verde cuando la bacteria utiliza el carbono
como fuente de energía el medio vira al alcalino y toma un color azul.

CUADRO DE DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA DE

ENTEROBACTERIAS
Leyenda:

L C
I
Lactosa, i i
n
Sacarosa, s t
d
Glucosa i r
o
Y n a
l
H2S a t
o
Sup. Fond.
Gas H2S
Ac. Ac.
Escherichia coli + + + - V -
Shiguella - + - - - - V
Salmonella typhi - + - (t) + - -
Salmonella paratyphi A - + + - - - -
Otras Salmonellas - + + + + + -
Klebsiella + + + - - + V
Proteus sp - + V V + V V
Citrobacter - + V V - + -

• Ac : Acidez ( toma el color Amarillo )

• Lisina : + (permanece color violeta)
• Lisina : - (cambia a un color amarillo)
• (t) : Trazas
• + : Positivo
• - : Negativo
• V : Variable
 DIFERENCIACIÓN BIOQUIMICA

Shiguella sp

TSI LIA CIT SIM

K/A K/A (-) (-,-,-)

Pseudomona aeuroginosa

TSI LIA CIT SIM

K/K K/K (+) (-,-,-)
Escherichia coli

TSI LIA CIT SIM

A/A K/K (-) (-,+,+)

Enterobacter sp.

TSI SIM CIT LIA

A/A GAS 3+ (-,-,+) (+) K/K
 SEROTIPIFICACION DE ESCHERICHIA COLI.

Escherichia coli
Antisueros
E coli clasica polivalente A
E. coli Enteropatogena ( EPEC) E coli clasica polivalente B
E coli clasica polivalente C
E coli invasora polivalente A
E. coli Enteroagregativa (EIEC)
E coli invasora polivalente B
E. coli Enteroagregativa (EHEC) E coli O 157

AGLUTINACION

NEGATIVO POSITIVO
PROTOCOLO:
Dibuje o pegue la batería de tubos de diferenciación presentados en la
pràctica, señalando las reacciones y su identificación bacteriana:

TSI :
LIA :
CITRATO :
OXIDASA :
OTRO :

IDENTIFICACION :

PREGUNTA:
1.- Enumere a todos los Gèneros y principales Especies de la Familia de las
Enterobacterias.

2.- Señale a las enterobacterias que causan diarreas disentèricas

PRACTICA Nº 7 ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE PACIENTES CON INFECCIÓN
URINARIA

Las infecciones de las vías urinarias, cualquiera que sea su localización, se

manifiestan con la eliminación de gérmenes por la orina, la que normalmente es
estéril. El diagnóstico etiológico de estas infecciones se hace mediante el Urocultivo.

En ocasiones la orina puede contener pequeña cantidad de gérmenes sin

estar produciendo infección, debido generalmente a la contaminación con
microorganismos que habitan normalmente en la uretra o que se encuentran en
cavidades vecinas ( vagina). Para descartar esta posibilidad se emplea el Urocultivo
cuantitativo, que establece como bacteriurea significativa, cifras mayores de cien
mil gérmenes por ml

AGENTES PATÓGENOS

1. Escherichia coli
2. Proteus mirabillis
3. Klebsiella sp.
4. Enterobacter sp.
5. Estafilococo áureus, Estafilococo epidermidis.
6. Enterococo
7. Pseudomona aeruginosa.
8. Serratia marcescens
9. Candida albicans

TOMA DE MUESTRA

1. La muestra debe ser en lo posible la primera orina de la mañana. De no ser

así debe tratar de retenerse la orina el mayor tiempo posible en la vejiga
antes de la recolección para incrementar el número de microorganismos por
mililitro.
2. Debe utilizarse frasco estéril
3. Dar instrucciones al paciente sobre el aseo previo con agua y jabón en la
zona genital.
4. El método de recolección es el de “chorro medio” que consiste en que el
paciente no recolecte la orina del inicio si no que sea la de unos segundos
después de iniciada la micción.
5. En caso el paciente tenga sonda Foley no recolectar la orina de la bolsa
colectora sino directamente de la sonda con una jeringa estéril.
6. En caso de niños es mejor usar bolsa colectora especial.
7. En casos muy especiales puede realizarse una punción suprapúbica.
MATERIALES:

• Muestras de orina.
• Placas de Agar Mc. Conkey y Azida
• Láminas y laminillas cubreobjetos
• Asa de siembra.

PROCESAMIENTO:

1. SIEMBRA

• Antes de proceder en la siembra, homogenizar la muestra agitándola

suavemente.
• Preparar una placa con Agar Mc. Conkey y otra con Agar Azida.
• Proceder a la siembra: calentar al rojo vivo el asa de siembra que debe
estar calibrada en 0.001 ml, esperar que enfrié, introducirla
verticalmente solo hasta que cubra la porción del asa y retirarla
rápidamente. Hacer una estría vertical del borde al centro de la placa
petri y luego hacer estrías por agotamiento perpendicularmente a la
estría vertical.
• Incubar a 37ºC toda la noche.
• Centrifugar 10 ml de orina y leer el sedimento urinario, anotar:
Leucocitos, Gérmenes y otros (tricomonas, hongos, etc.)

2. LECTURA

• Si no hay crecimiento en ningun medio informar como NEGATIVO

• Si hay crecimiento proceder al recuento de colonias: cada colonia
representa a 1,000 UFC/ml (Unidad Formadora de Colonias por
mililitro). Si el recuento es < 100,000 UFC/ml informar como
NEGATIVO.

3. DIFERENCIACIÓN

• Si creció > 100,000 UFC/ml en Mc. Conkey repicar en TSI, LIA,

Citrato y Urea. Incubar a 37ºC toda la noche.
• Si creció > 100,000 UFC/ml en Agar Azida, observar tipo de colonia,
gram. si es estafilococo hacer prueba de Coagulasa.
• Si crecen colonias de levaduras hacer prueba de Tubo germinal para
ver si es Candida albicans.
 4. ANTIBIOGRAMA

Una vez identificado el germen se puede proceder a realizar el

antibiograma:
Colocar los siguientes discos:

1) Nitrofuranos : Nitrofurantoina

2) Quinolonas : Ac. Nalidixíco, Norfloxacina, Enocacina

Cinoxacina, Ac. Pipemédico, Ciprofloxacina.

3) Aminopenicilinas : Ampicilina

4) Sulfas : Trimetropin – Sulfametoxazol

5) Cefalosporinas : Ceflacor, Ceafalexina.

En caso de Pseudomona agregar:

6) Carbenicilina

7) Ceftazidime

PROTOCOLO:

Anotar los resultados del examen del sedimento urinario y cultivo:

Sedimento urinario

Urocultivo : Se aísla : ...................................................................................

Recuento de las colonias: ............................................................... ufc x ml

Antibiograma : Sensible Intermedio Resistente.

 PRACTICA Nº 8 : HEMOCULTIVOS

INTRODUCCIÓN

Definimos como bacteriemia la presencia de bacterias en la sangre que se

pone en manifiesto por aislamiento de éstas en los hemocultivos. La bacteriemia
es una complicación grave de las infecciones bacterianas, con importantes
implicaciones pronosticas.

El término fungemia se utiliza para designar la presencia de hongos en la

sangre, de forma análoga y como hemos definido bacteriemia. La mayoría de las
fungemias son causados por las levaduras de Cándida y Criptococcus y tienen las
mismas implicaciones y metodología diagnóstica que las bacteriemias por la que las
describimos en forma conjunta.

Septicemia o Serpis son expresiones que se emplean a menudo para

denominar el sindorme clínico.

Bacteriemia : germen en sangre circulante, este se divide en:

a. Transitoria : Se realiza procedimiento invasivo cerca de las mucosas ó tejidos

poblados por gérmenes, o cualquier maniobra invasiva que produce ingreso
del germen. Eje: Extracción dentaria, manipulación a nivel de boca,
cateterismo, intervención quirúrgica, abrir abscesos.
b. Continua : Germen de circulación constante. UEM: Endocarditis, fiebre
tifoidea y brucelosis.
c. Intermitentes : Focos de infección que de tiempo en tiempo permitía la salida
del germen en circulación. UEM: abscesos.

Estas bacteriemias pueden hacer Septicemia es sensible: Riñones, corazón.

PRINCIPIOS GENERALES:

• Es la prueba más útil y más frecuentemente usada para demostrar la

presencia de bacterias en la corriente sanguínea.
• El método del Hemocultivo consiste en obtener sangre con la más rigurosa
técnica de asepsia y añadirla a un frasco que contiene un medio de cultivo
elegido para aislar un determinado microorganismo (bacteria).
• Las muestras de sangre para Hemocultivo deben obtenerse, antes que el
paciente reciba terapia antimicrobiana.
• Es importante obtener la muestra de sangre, en el momento en que la
temperatura del paciente se encuentra elevada. Esto da una probabilidad
más elevada de tener resultados positivos en el Hemocultivo.
 • Se requiere de un mínimo de tres hemocultivos seriados por pacientes
antes de considerar el caso como negativo.

ELECCIÓN DEL MEDIO PARA HEMOCULTIVO

➢ La elección del medio depende del microorganismo que se desea aislar.

➢ Para la mayor parte de hemocultivos,, resultan satisfactorios los medios
generales.

• Infusión corazón – cerebro con agar, este medio permite el desarrollo

de bacterias tanto aerobias como anaerobias.
• El caldo de Thioglicolato, que se emplea principalmente para cultivar
bacterias anaerobias.

OBTENCION DE LA MUESTRA

1. Generalmente se extrae sangre del

pliegue del codo, con la más rigurosa
técnica de asepsia.

2. Sembrar la mayor cantidad posible de sangre (entre 5 y 10 ml)

3. El medio de elección se calienta a

37ºC en una estufa de cultivo, y el
tapón de caucho del frasco se
flamea con alcohol para destruirlos
microorganismos
contaminantes en su superficie.

4. Para llevar el frasco a la cabecera del paciente se cubre el tapón con un

algodón mojado de alcohol
5. Obtenida la muestra de sangre, se retira el
algodón del frasco y la aguja de la jeringa se
introduce a través del tapón de caucho del
frasco, se expulsa la sangre ene el medio, se
retira la aguja y se mezcla el contenido del frasco

6. Cada frasco debe rotularse: nombre del

paciente, fecha y hora de obtención de
la muestra.

LECTURA DEL HEMOCULTIVO

• Los frascos de hemocultivos inoculados deben inmediatamente incubarse a

35 – 37 ºC.

• Examinar el frasco diariamente durante la primera semana para detectar la

aparición de turbidez en el medio, hemólisis, signos de producción de gas o
crecimiento de colonias directamente encima de la sangre.

• Si los hemocultivos son negativos deben seguir en observación hasta por

21 días antes de informarse como negativos.

• Los hemocultivos “visualmente positivos” (turbidez del contenido del frasco)

deben teñirse por el método de Gram y subcultivarse (resiembras).

• Retirar una gota del Hemocultivo positivo con todas las precauciones de
asepsia, utilizando una jeringa pequeña, con este material se siembra.

• Sembrar en medios de agar sangre y otros medios selectivos

dependiendo de los resultados de la coloración Gram. UEM: Medio de
Agar Mac Conkey, para investigar la presencia de microorganismos
entéricos gram negativos. Las placas incubarse tanto bajo condiciones
aerobias como anaerobias.
 • Una vez que se han logrado colonias aisladas, debe determinarse su
identificación.

• Los resultados, tanto positivos como negativos, deben comunicarse lo

antes posible al médico que lo solicitó

MICROORGANISMOS QUE SE PUEDEN ENCONTRAR EN LOS

HEMOCULTIVOS.

• Streptococcus viridans
• Streptococcus pyogenes
• Staphylococcus aureus y albus
• Diplococcus pneumoniae
• Neisseria meningitides
• Brucella sp.
• Proteus providence
• Pseudomona aeruginosa
• Enterococos
• Estreptococcos anaerobios
• Salmonella sp.
• Pasteurella tularensis
• Leptospira sp
• Streptobacillus moniliformis
• Escherichia
• Citrobacter
• Klebsiella
• Haemophilus influenzae.

PREGUNTAS

1. ¿Porqué se recomienda tomar la muestra a un paciente en estado febril?

2. En que entidasdes clìnicas se recomienda solicitar un hemocultivo.
 PRACTICA Nº 9 BACILOSCOPIA

La Baciloscopia es el examen básico para el diagnostico de la Tuberculosis

y también el control de la evolución del tratamiento

MATERIALES

• Frascos con muestra de esputo

• Set de colorante Ziehl Neelsen
• Bajalenguas
• Laminas portaobjetos
• Mechero

PREPARACIÓN DEL EXTENDIDO

• Colocar sobre la mesa de trabajo una hoja doble de papel periódico o una
bandeja metálica de 80x50 cm. Con papel periódico, humedecido con el fenol
al 5%
• Colocar la muestra de esputo previamente rotulado sobre la mesa de trabajo,
de la misma forma colocar las láminas portaobjetos sobre soporte de madera,
en orden correlativo.
• Numerar las láminas portaobjetos con un lápiz graso trazando una línea en
cada uno que divida su superficie en una tercera parte destinada a la
numeración y dos terceras partes para hacer el extendido que hará en la cara
inferior de la lámina para evitar que se borre al ejecutar la coloración
• Destapar cuidadosamente el envase de la muestra que se va procesar
colocándola cerca del mechero.
• Dividir un aplicador de madera en dos o tres partes y tomar entre el pulgar y
el índice de la mano, para luego seleccionar la partícula útil que es la porción
mucopurulenta de color amarillo verdoso, enrollándola en el aplicador.
• Colocar la partícula útil sobre el portaobjeto y extender, haciendo
movimientos de vaivén, hasta lograr que el extendido sea homogéneo (ni
muy fino ni muy grueso), que no llegue a los bordes de la lámina a fin de que
al manipular no se contamine el operador. Por ningún motivo debe calentarse
la lámina mientras se haga el extendido, debido a que por el calor se forman
círculos concéntricos y precipitadas gránulos.
• Pasar por la llama del mechero los bordes de la lámina extendido, colocar
sobre el soporte de madera y dejar secar a temperatura ambiente.
• Terminando el extendido, descartar los aplicadores en el receptáculo de
incineración, cerrar envase y proseguir en igual forma las demás muestras.
 • Fijar cada lamina, una vez seca mediante dos o tres pasajes rápidos sobre
la llama del mechero con el extendido hacia arriba, colorear con Ziehl
Neelsens.

PRIMER PASO : COLORACIÓN DE BACILOS

• Colocar sobre el soporte de coloración (alambre o varilla de vidrio) la serie,

las láminas con el extendido hacia arriba, el número hacia el operador y con
la varilla mas próxima al operador, ligeramente mas allá que la otra
• Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con el colorante fuscina
básica fenicada , previamente filtrada.
• Calentar suavemente con la llama de hisopo de algodón humedecido en
alcohol hasta la emisión de vapores repetir el proceso por tres veces, no debe
hervir la preparación . si e volumen de coloración disminuye por evaporación,
debe agregarse mas hasta cubrir totalmente el extendido, deja enfriar. El
tiempo mínimo de coloración con fuscina es de 5 minutos.
• Eliminar la fuscina tomando la lamina por el extremo numerado, entre el
pulgar y el índice de la mano o con una pinza, inclinándola hacia delante y
dejando caer agua corriente a baja presión sobre la parte que no contenga
el extendido.

SEGUNDO PASO : DECOLORACIÓN

• Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con la solución de alcohol

ácido durante dos minutos hasta obtener una coloración clara o rosa pálido,
de ser necesario decolorar nuevamente, efectuando movimientos en vaivén
la lámina.
• Una vez eliminado el alcohol ácido lavar nuevamente la lamina con agua a
baja presión, cuidando de no desprender la película.

TERCER PASO : COLORACIÓN DE FONDO

• Cubrir la superficie del extremo extendido con el colorante azul de metileno

previamente filtrado, durante 30 segundos a un minuto.
• Eliminar el azul de metileno y lavar cada lamina con agua a baja presión,
tanto la cara que tiene l extendido, como la cara interior.
• Colocar las laminas coloreadas en orden numérico sobre el soporte de
madera y dejar secar al medio ambiente.
• Aclarar la numeración antes de su observación al microscopio.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

La observación microscópica, debe cumplir dos objetivos importantes.

1. Determinar si en el extendido hay Bacilo Acido Alcohol Resistente (BAAR).

2. Establecer su número aproximado.
METODO DE LECTURA

• Los bacilos aparecerán como bastoncitos delgados, ligeramente curvos,

teñidos de rojo, generalmente con gránulos mas coloreados en su interior,
aislados, en parejas o en grupos sobre un fondo azul claro.
• Es aconsejable seguir una pauta uniforme de observación, leyendo de
izquierda a derecha del extendido un mínimo de 100 campos útiles
equivalentes a 5 minutos. Se considera campo microscópico útil aquel en el
cual se observa elementos celulares de origen bronquial (leucocitos, fibras
mucosas y células ciliadas). Los campos en que no aparezcan dichos
elemento no deben contaminarse en la lectura.
• El observador irá tomando nota del número de bacilos observados y que el
numero de campos viajara según la cantidad de bacilos que contenga la
muestra.

Al termino de la lectura retirar la lámina dela platina del microscopio, limpiar

el aceite de inmersión con tolueno y guardar la lamina. Limpiar con papel
lente humedecido con tolueno el exceso de aceite del objetivo de inmersión
del microscopio.

INFORME DE RESULTADOS

(-) : No se encuentra bacilos ácidos alcohol resistentes en 100 campos

microscópicos observados.
( + ) : Menos de un BAAR por campo en 100 campos observados (de 10 – 99
BAAR)
(++) : Uno a 10 BAAR por campo, en 50 campos observados
(+++) : Más de 10 BAAR por campo en 20 campos observados.

BAAR: Bacilo ácido alcohol resistente.

Si en un extendido se encuentra de 1 a 9 bacilos en 100 campos observados,

observar 100 campos mas. Si persiste el resultado, realizar otro extendido de la
misma muestra e informar lo contrario y solicitar nueva muestra.

PREGUNTAS:
1. ¿Qué ventajas ofrece la Baciloscopia en el estudio y control de la
tuberculosis?
2. ¿En que medios de cultivo se aísla el mycobacterium tuberculoso?

PROTOCOLO:
Observar una làmina de baciloscopìa y dibuje la observación de la làmina
mencionando el informe (si es negativa o positiva, señalando el número decruces).
PRACTICA Nº 10 : METODOS SEROLOGICOS EN EL DIAGNOSTICO DE
SALMONELOSIS

PRINCIPIOS GENERALES

• La serología del género Salmonella constituye el complemento necesario

para el diagnostico de la fiebre tifoidea.
• El genero Salmonella tiene principalmente dos clases de antígenos.

o El antígeno “O” o antígeno somático termoestable.

o El antígeno “H” o antígeno flagelar termolábil.

• A partir de la segunda semana, el paciente que sufre de fiebre tifoidea,

contiene anticuerpos en la sangre, que pueden ser identificados probandoel
suero del paciente contra antígenos de Salmonellas , los cuales pueden ser
demostrados por la reacción de Widal.

AGLUTINACIÓN EN PLACA

• Se encuentra en el comercio antígenos de O y H de Salmonella para

realizar la prueba. Este método es rápido y exacto.
• Es preciso agitar bien el vial de antígeno, antes de usarlo, para garantizar
una suspensión uniforme y lisa. No deben congelarse.
• Almacenar los viales con antígeno a 2 – 8 ºC.

MATERIALES

•Antigeno de Salmonella typhi H y O

•Materiales para obtención de suero del paciente
•Pipetas serológicas de 0,2 ml
•Placa de vidrio grande (20 x 20 cm) dividida con lápiz de cera y regla en
cuadrados (2.5 – 1.7 cm) de preferencia, 5 hileras de 6 cuadrados.
• Un aplicador o un palito de dientes.
METODO

1. Depositar en los cuadrados de cada hilera o en cada lámina las siguientes

medidas del suero del paciente: 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 y 0,005 ml.
2. Añadir a cada medida del suero una gota de la suspensión de antígeno.
3. Mezclar con un aplicador o un palito de dientes, comenzar con la dilución
de suero de 0,005 ml y continuar hasta la dilución de 0,08 ml
4. Rotar (oscilar) la placa de vidrio suavemente 15 – 20 veces (durante 2
minutos). Proceder a la lectura inmediatamente.
LECTURA E INFORME

1. Observar la presencia de grumos, indicativo de aglutinación.

2. Las diluciones y títulos son las siguientes:

• 0,08 ml de suero 1/20

• 0,04 ml de suero 1/40
• 0,02 ml de suero 1/80
• 0,01 ml de suero 1/160
• 0,005 ml de suero 1/320

3. Título del suero

El título del suero que se informa corresponde a la ultima dilución del suero
en que se produce una aglutinación.

4. Ejemplo de cálculos

Placa 1 Placa 2 Placa 3 Placa 4 Placa 5 Resultados

Dilución Dilución Dilución Dilución Dilución
0,08 ml 0,04 ml 0,02 ml 0,01 ml 0,005 ml
2+ 1+ - - - Positivo 1/20
3+ 2+ 1+ - - Positivo 1/40
4+ 3+ 2+ 1+ - Positivo 1/80
4+ 4+ 3+ 2+ 1+ Positivo 1/160
4+ 4+ 4+ 3+ 2+ Positivo 1/320

PREGUNTAS:

1. ¿Con que titulo se considera que una persona tiene tifoidea?

2. ¿Con cual prueba se hace el diagnòstico definitivo de F. Tifoidea?
3. Señale las entidades clìnicas que produce la Sallmonella tific
PRACTICA Nº 11 : DIAGNOSTICO INMUNOLÓGICO : REACCION
INMUNOENZIMATICA

PRINCIPIOS GENERALES

❖ Para hacer el diagnostico de infección por VIH, se emplean pruebas para

un diagnostico preliminar (tamizaje) y confirmatorias, que detectan
anticuerpos en muestras de sueros.

❖ Las pruebas inmunológica ligadas a enzimas (ELISA) se usan para un

diagnostico preliminar basado en al detección de los anticuerpos contra
VIH.

❖ El suero o plasma son los elementos más comunes usados para la

detección de anticuerpos. Deben guardarse congelados en el caso de que
la prueba no pueda realizarse inmediatamente luego de la recolección.

❖ Los procedimientos mas comúnmente usados se clasifican como pruebas

de ELISA indirecto, competitivo y de captura.

❖ Los antigénos usados en estas pruebas pueden ser derivados de virus

lisados o producidos por recombinación genética y sintéticamente.

❖ Los anticuerpos son producidos en animales y pueden ser monoclonales

o policlonales.

❖ Estos reactivos se incluyen en los paquetes (kits) de las pruebas

comerciales, ya sea fijados o fase sólida o empaquetadosseparadamente
junto con otros reactivos.

❖ Todos los juegos delas pruebas incluyen especimenes de control positivo

y negativo que deben ser incluidos durante cada examen para asegurar
la validez de los resultados de la prueba.
PRUEBA DE ELISA INDIRECTA

FUNDAMENTO

❖ La muestra de suero se diluye en el soporte en el que se encuentra

inmovilizado el antígeno. Se incuba por un período especifico de tiempo y
a una temperatura exacta de acuerdo a las instrucciones de fabricante.

Enzima Substrato

Anticuerpo
antihumano
conjugado a
la enzima
Anti VIH
(suero del Antígeno
paciente) VIH

Pozo de
Se produce poliestireno
no se produce color

Prueba reactiva Prueba no reactiva

❖ Si las muestras de suero contienen los anticuerpos específicos, estos

formaran un complejo antigeno – anticuerpo y permanecerán unidos al
soporte. La muestra de suero se elimina por lavado

❖ Luego, agregar anticuerpos antiinmunoglobulinas totales humanas

conjugadas con Peroxidasa. Incubar a la temperatura indicada por el
fabricante.

❖ Este conjugado se unirá al complejo antígeno – anticuerpo, si esto último se

produjo en el paso 2 del proceso.

❖ Realizar un nuevo lavado y agregar el substrato enzimático.

❖ En los casos en que se haya unido el conjugado, la reacción genera un

producto coloreado proporcional ala concertación de anticuerpos de
la muestra.

❖ La concentración de anticuerpos es detectada por el espectrofotómetro a una

longitud de onda determinada según los procedimiento del fabricante.
 ❖ La lectura de resultados positivos se basa en la aparición de un color
que se pude detectar ya sea visualmente o con un espectrofotómetro.

❖ Es la prueba más usada.

PREGUNTAS

1. Las siglas ELISA que significan

2. ¿Qué es un periodo de ventana?
3. ¿Qué es la prueba de Wester Blot?
4. Que otras utilidades tiene la prueba de ELISA aparte de su uso para el
descarte del virus del SIDA
PRACTICA Nº 12 : DIAGNOSTICO DE MICOSIS SUPERFICIALES

GENERALIDADES:

La Micología Médica estudia las manifestaciones patológicas causadas directa o

indirectamente por los hongos, distinguiéndose lo siguiente:

a. Las Micosis, grupos de enfermedades causadas directamente por los hongos.

b. Las Alergias Fúndicas, cutáneas y respiratorias.
c. Micotoxicosis, intoxicación debido a la ingestión de toxinas o substancias pre-
formadas en los alimentos contaminados por hongos.

El hongo es un organismo eucarionte o pluricelular que carece de clorofila, cuya

nutrición e por absorción y su reproducción es de forma asexual y/o sexual.

La clasificación general de los hongos se basa en la presencia (fungi perfecti) o

ausencia ( fungi imperfecti) de forma sexual de reproducción.

Ambas formas de reproducción dan lugar a esporas, las cuales toman diferentes
nombres de acuerdo a su forma de origen.

En este capítulo nos ocuparemos del estudio de los hongos que causan Micosis: I
superficiales, II Subcutáneas y II Profundas en el Hombre.

MICOSIS SUPERFICIALES

Sólo invaden la superficie de la piel u otros tejidos queratinizados (piel, pelos,

uñas). Pueden ser producidas por:

a) Dermatofitos: Hongos queratinolíticos que son agentes de diferentes

entidades clínicas, dependiendo del lugar que afectan y del agente etiológico.
Existen 4 géneros y 39 especies, la identificación de estas especies se hace
teniendo en cuenta la macromorfología de las colonias en los medios de
cultivo y la morfología de la macroconidias y microconidias.

b) Levadura: Pityrosporum ovale, el cual puede causar potoriasis versicolor,

infección crónica del estado córneo, generalmente asintomático,
caracterizadas pro máculas pequeñas hipo o hipercrómicas con
descamación fina.
 Diversas especies de Cándida entre ellas Cándida albicans, hongo
endosaprofito del hombre, el cual se encuentra normalmente en el tacto
digestivo y en regiones mucocutáneas. Es capaz de producir infecciones
oportunistas variadas.
Las formas clínicas más frecuentes son aquellas de compromiso muco-cutáneo
(oral , vaginal) y cutáneo tropicalis, Cándida pseudotropicalis, Cándida parasilosis,
para cuya identificación es necesario la combinación de observaciones
,morfológicas y reacciones fisiológicas.

c) Otros:
Piedraria hortae
Trichosporum beigelii

Ambos productores de Piedra, infección micótica caracterizada por nódulos

irregulares y firmes que envuelven al pelo.

PROTOCOLO:

Dibujar las observaciones en KOH al 10%

Hacer un esquema de la observación microscópica.

 PRUEBA DEL TUBO GERMINATIVO
El tubo germinal es una extensión filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su
origen, cuyo ancho suele ser la mitad de la célula progenitora y su longitud tres o cuatro
veces mayor que la célula madre.
Sólo C. albicans es capaz de producir verdaderos tubos germinales; sin embargo, otras
especies como C. tropicalis pueden producir pseudohifas precoces de aspecto similar a
los tubos germinales pero con una zona de constricción característica dyacente a la célula
madre, por lo que esta prueba es útil para diferenciar C. albicans del resto de las especies
de Candida, aunque no está exenta de falsos negativos.
PROCEDIMIENTOS

1. Suspender un inóculo muy pequeño de la levadura en estudio en 0,5 ml de suero de

oveja (o de suero humano, procedente de un individuo sano).
2. Incubar los tubos a 35-37o C, no superando las 2 horas para evitar falsos positivos dado
que en algunos casos candida tropicales da tubo germinal positivo en 3 horas.
3. Después de la incubación, tomar una gota de la suspensión y colocarla sobre un
portaobjetos.
4. Observar al microscopio con el objetivo de 40 x.
5. Un tubo germinativo positivo se define como la presencia de levaduras con un apéndice
con la mitad de ancho y 3 a 4 veces el largo de la célula de la cual emerge presentes en
por lo menos un 80% de las levaduras por campo. En la mayor parte de los casos no
existe constricción en el origen del tubo germinativo.

K. L. Lee, H. R. Buckley y C. C. Campbell. 1975. An amino acid liquid

synthetic medium for the development of yeast and mycelial forms of
Candida albicans. Sabouradia 13:148-155.
 IDENTIFICACIÓN DE DERMATOFITOS
DE ACUERDO A LAS CARACTERISTICAS EN AGAR MYCOSEL

Aspecto Aspecto del Tiempo de

DERMATOFITO Color
anverso reverso desarrollo

Pigmento rojo
T. rubrum Blanco Algodonoso 14 días
púrpura
Pulverulenta,
Amarrillo
granulosa,
parduzco, o
T. yesosa
Blanco o crema ámbar, o 7 a 10 días
mentagrophytes zoofílicos,
marrón, o rojo
algodonosa
castaño.
antropofílicos.
Amarillo
Placa poco
inicialmente Rojo caoba
pulverulenta
crema, inicialmente
T. tonsurans inicialmente y 14 días
grisácea o rojizo oscuro
plegada
marrón después.
posteriormente.
posteriormente.

Amarillento o Finamente Amarillo

E. flocosum 10 a 14 días
verde oliva velloso azufrado

Pigmento
Poco elevado,
M. canis Blanquecina naranja amarillo 6 a 10 días
escaso
o marrón

Plana finalmente
M. grypseum Canela granulosa y Canela o crema 6 días
pulverulenta.