ENSAYO DE CUANTIFICACIÓN DE LIGANDOS CONJUGADOS

A PROTEÍNAS POR ESPECTROFOTOMETRÍA UV

EN MARCACIÓN INDIRECTA CON 99mTc

Autores: Basualdo, D.A.; Rabiller, G.; Poch, C.; El Tamer, E.A.

Radiofarmacia Hospitalaria – Centro de Medicina Nuclear del Hospital de Clínicas José
de San Martín U.B.A. – C.N.E.A.
Correo electrónico: [email protected]

Palabras claves: HYNIC – Conjugación – Relación de sustitución.

Objetivo

Cuantificar HYNIC conjugado a IgG para obtención de relación de sustitución, y como

método de control de calidad para marcación de esta inmunoglobulina con 99mTc.

Introducción

La Guía Operacional en Radiofarmacia Hospitalaria del Organismo Internacional de

Energía Atómica (OIEA) establece que los procedimientos realizados en un Laboratorio
de Radiofarmacia pueden clasificarse en tres niveles operativos. Cada nivel es
acumulativo, es decir, conserva las implicancias del nivel anterior [1].

Nivel operativo 1a
Consiste en la administración de radiofármacos dispensados en su forma final,
monodosis o multidosis, que provienen de laboratorios productores.

Nivel operativo 1b
Se suma la administración de yodo radioactivo y otros radiofármacos listos para el uso
en terapia o tratamientos paliativos.

Nivel operativo 2a
La preparación de radiofármacos a partir de kits de reactivos aprobados y generadores
de radionucleídos. Este es el nivel operativo más común en servicios de medicina
nuclear.

Nivel operativo 2b
La marcación de células de sangre autóloga. Esto abarca glóbulos rojos, plaquetas, y
glóbulos blancos.

Nivel operativo 3a
El preparado de radiofármacos a partir de drogas y radionucleídos para diagnóstico; la
modificación de kits comerciales; producción de kits de reactivos propios incluyendo
los liofilizados; investigación relacionada y desarrollo.

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Nivel operativo 3b
El preparado de radiofármacos a partir de drogas y radionucleídos con fines
terapéuticos, junto con la investigación y el desarrollo relacionados.

Nivel operativo 3c
La síntesis de radiofármacos para tomografía por emisión de positrones (PET). Incluye
la preparación de 18-fluordesoxiglucosa (18FDG). También valida la preparación de
radiofármacos de 68Ga , 188Re y otros radionucleídos.

Actualmente, el Centro de Medicina Nuclear del Hospital de Clínicas José de San

Martín cuenta con un nivel operativo 2b. Es objetivo del Centro alcanzar un nivel
operativo 3a, es decir, aquel que nos permita preparar radiofármacos “in house”, y
previa autorización de la ANMAT, darles uso diagnóstico.
En busca de ese objetivo, se abordó la optimización de conjugación de proteínas y
péptidos con S-HYNIC, de manera de llevar a punto los procedimientos involucrados.

El S-HYNIC fue desarrollado para incorporar grupos hidrazinonicotinamida en aminas

contenidas en biomoléculas vía éster N-hidroxisuccinimida activado, actuando como
agente quelante bifuncional (BCA) en la marcación indirecta de proteínas y péptidos
con 99mTc.
En el abordaje indirecto de marcación, el BCA es unido primero a una proteína para
formar un BCA-proteína conjugado. En segundo lugar, el conjugado es marcado con
99m
Tc, ya sea directamente por reducción de 99mTcO4− o indirectamente por intercambio
de ligandos con un 99mTc-complejo intermedio (como el 99mTc-glucoheptonato, 99mTc-
difosfonato, o 99mTc-tricina). En general, el segundo enfoque es fácil de llevar a cabo y
tiene una química bien definida.
La succinimidil-hidrazinonicotinamida (S-HYNIC), desarrollada por Abrams y
colaboradores, parece ser un BCA ideal para marcación con 99mTc, debido a que permite
un marcado rápido y eficiente de proteínas. Además, puede ser usado en
concentraciones relativamente bajas. Por lo tanto, las preparaciones pueden ser
producidas con altas actividades específicas.
El abordaje con S-HYNIC consiste en un paso de conjugación y un paso de marcación.
En el paso de conjugación, el S-HYNIC reacciona con el grupo amino de los residuos
de lisina de la proteína, obteniéndose un conjugado HYNIC-proteína. Este conjugado
puede marcarse con 99mTc en el segundo paso [2]. Ver figura 1.

En este trabajo, se conjugó Inmunoglobulina G policlonal inespecífica humana (IgG)

con S-HYNIC. Nuestro interés estuvo abocado en calcular cuánto HYNIC se sustituyó
en IgG para que en etapas ulteriores pueda obtenerse un correlato con el rendimiento de
marcación.

El conjugado de IgG-HYNIC obtenido, al poseer un grupo hidracina, puede reaccionar

con ácido benzaldehído o-sulfónico para formar una hidrazona [3].
Se obtiene una bisarilhidrazona con varios dobles enlaces conjugados y por lo tanto
puede cuantificarse mediante espectrofotometría UV. Ver figura 2.

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Materiales y métodos

Ver tabla 1.

Método

Una muestra de conjugado IgG-HYNIC de 0,2 ml se diluyó en 4 ml de solución de

ácido benzaldehído o-sulfónico (1 mg/ml, NaAc 0.1 M, pH 4,7). La reacción fue
incubada a temperatura ambiente durante la noche en oscuridad. Como control negativo
se tomaron 0.2 ml de conjugado IgG-HYNIC en 4 ml de buffer NaAc 0.1 M. Se utilizó
como blanco 3 ml de ácido benzaldehído o-sulfónico (1 mg/ml 0.1 M NaAc, pH 4,7).
La absorción de la hidrazona se leyó a 343 nm.
La concentración de hidracina fue calculada usando un coeficiente de extinción molar
de ε(343nm) = 17000 M-1cm-1 [4]. El ensayo se realizó por duplicado.

Resultados

Ver tabla 2.

Relación de sustitución molar (MSR)

La relación de sustitución molar indica el número de grupos HYNIC incorporados al

conjugado IgG-HYNIC, determinados por el ensayo espectrofotométrico.

MSR =
[HYNIC ]
[IgG ]
El valor de MSR obtenido fue:

MSR = 0.195 ± 0.018

Intervalo de confianza (IC) = 95 %

Esto significa que aproximadamente una molécula de HYNIC se unió cada cinco
moléculas de IgG.

Discusión:

La marcación con 99mTc dependerá de la Relación de Sustitución Molar. Si esta es muy

baja, el radiofármaco tendrá una consecuente baja actividad específica. Esto conllevaría
la necesidad de aumentar la cantidad de biomolécula a suministrar al paciente para
obtener una buena imagen de diagnóstico, sabiendo que dosis elevadas de algunas
podría causar efectos colaterales.
Una Relación de Sustitución Molar elevada provocaría que la gran cantidad de grupos
HYNIC en el conjugado generen efectos estéricos disminuyendo el porcentaje de unión
al receptor in vivo, y obteniendo una menor calidad de imagen.

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Conclusiones:

Es importante en las marcaciones, mediante un agente quelante bifuncional, conocer la

Relación de Sustitución Molar de quelantes a péptidos o proteínas. Ésta, debe ser la
adecuada para cada biomolécula a marcar. En particular, es útil conocer cuántas
moléculas de HYNIC se unieron por molécula de IgG.
El método espectrofotométrico de cuantificación de la unión del quelante bifuncional a
proteínas o péptidos, propuesto por Bridger y Abrams, resultó ser rápido, sencillo y
viable en la Radiofarmacia Hospitalaria previo a la marcación con 99mTc de una
biomolécula.

Bibliografía:

[1] “Operational Guidance on Hospital Radiopharmacy. A Safe and Effective

Approach” International Atomic Energy Agency (IAEA), Vienna 2008.

[2]“Labeling proteins with Tc-99m via hydrazinonicotinamide (HYNIC): optimization

of the conjugation reaction” Huub J. J. M. Rennen, ,, Otto C. Boerman, Emile B.
Koenders, Wim J. G. Oyen and Frans H. M. Corstens. Nuclear Medicine and Biology,
Volumen 27, Tema 6, Junio de 2000, Páginas 599-604.

[3] “A comparison of cleavable and noncleavable hydrazinopyridine linkers for the

99mTc labeling of Fab’ Monoclonal antibody fragments” Bridger GJ, Abrams MJ,
Padmanabhan S, Gaul F, Larsen S, Henson GW, Schwartz DA, Longley CB, Burton
CA, Ultee Me. Bioconjug. Chem. 1996;7:255-264.

[4] “99mTc labeled interleukin-8 for imaging of infection and inflammation” Huub J. J.
M. Rennen. Año 2003, Capítulo 2, Páginas 36-37.

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Apéndice

Figura 1. Molécula de S-HYNIC.

Figura 2. Reacción del conjugado para lectura por espectrofotometría UV.

Tabla 1. Material utilizado.

Item Utilizado
Micropipeta 20-200 ul (HTL) 1 pieza
Micropipeta 2-20 ul (Labnet) 1 pieza
Tips estériles c.s
Cubeta de cuarzo (macro) 1 pieza
Buffer de acetato de sodio 0,1 M, pH = 4,7 (preparado en el momento) 15 ml
Ácido 2-formilbencenosulfónico, sal sódica (Sigma-Aldrich) 11 mg
Conjugado IgG-HYNIC (4 mg/ml NaAc 0,15 M, pH 6,4) 0,6 ml

Tabla 2. Lecturas obtenidas.

Muestras Absorbancia Concentración (M) MSR IgG/HYNIC
1 0,085 5,00E-06 0,188 5,319
2 0,091 5,35E-06 0,201 4,975
Negativo 0 - - -

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 Ligand-protein conjugated quantification assay by UV spectrophotometry
In 99mTc indirect labeling
Authors: Basualdo, D.A.; Rabiller, G.; Poch, C.; El Tamer, E.A.
Radiofarmacia Hospitalaria – C. M. Nuclear del Htal.de Clínicas U.B.A. – C.N.E.A.
Correo electrónico: [email protected]

Objective:
Quantify IgG-HYNIC conjugated for obtaining substitution ratio and as a chemical
quality control for 9mTc labeling of this immunoglobulin.
Introduction:
The Operational Guidance on Hospital Radiopharmacy by IAEA states that the
procedures performed in a Radiopharmacy Laboratory fall into three operational levels.
At present, Nuclear Medicine Centre of Hospital de Clínicas has an operational level 2b
which requires the preparation of radiopharmaceuticals from approved reagent kits and
radionuclide generators, and labeling of autologous blood cells.
Centre’s goal is to reach an operational level 3a, which allows us to compounding
radiopharmaceuticals from drugs and radionucleides for diagnosis; modification to
existing commercial kits; related research and development.
In approach of that goal, we addressed the optimization of conjugation of proteins and
peptides with S-HYNIC so as to bring about the procedures involved.
In this work, was conjugated nonspecific polyclonal immunoglobulin G (IgG) with S-
HYNIC. Our interest was focused in calculate how many HYNIC groups were
incorporated per IgG molecule so that in later stages can be obtained a correlate with
labeling efficiency.
Materials and methods:
A sample of IgG-HYNIC conjugate of 0.2 ml was diluted in 4 ml of benzaldehyde o-
sulfonic acid (1 mg / ml, 0.1 M NaAc, pH 4.7). The reaction was incubated at room
temperature overnight in darkness. As a negative control took 0.2 ml of IgG-HYNIC
conjugate in 4 ml of NaAc buffer 0.1 M. 3 ml of benzaldehyde o-sulfonic acid (1 mg /
ml 0.1 M NaAc, pH 4.7) was used as blank. The absorption of the hydrazone was read
at 343 nm.
The hydrazine concentration was calculated using a molar extinction coefficient ε
(343nm) = 17000 M-1cm-1.
Results:
Molar substitution ratio (MSR) was calculated. The MSR indicates the number of
HYNIC groups incorporated in the IgG-HYNIC conjugate determined by the
spectrophotometric assay.
Conclusions:
In labeling with a bifunctional chelating agent, it is important to know the molar
substitution ratio of ligands to peptides or proteins, since an excess of substitutions can
modify the specific binding of the radiolabel to the receptor and defect can result in low
specific activity after attached the radionuclide.
The ligand-protein conjugate quantification assay, proposed by Bridger and Abrams,
proved to be useful, fast, and workable in Hospital Radiopharmacy previous to 99mTc
labeling.