BIOLOGIA MOLECULAR

Dr. Ramón Villacrés Pástor Msc.

 TECNOLOGÍA DEL
ADN RECOMBINANTE
 LA MANIPULACION DE LA
INFORMACION GENETICA
En las ultimas décadas, la capacidad de manipular el genoma de
organismos tanto procariontes como eucariontes alcanzo niveles
antes inimaginables.

LA TECNOLOGIA DEL
ADN RECOMBINANTE
Al revelar los métodos mediante los cuales las células procesan,
añaden, eliminan y transfieren información genética.
Se desarrollaron técnicas de ingeniería genética que permitieron
analizar y manipular el ADN
CONCEPTO
La tecnología del ADN recombinante permite el aislamiento de un
gen de un organismo para introducirlo en otro.

El ADN recombinante es un proceso

que consiste en tomar una molécula
de ADN de un organismo, sea un
virus, planta o una bacteria y en el
laboratorio manipularla y ponerla de
nuevo dentro de otro organismo.
Esto se puede hacer para estudiar la
expresión de un gen e incluso en
algunos casos, para tratar
una enfermedad genética humana
A partir de los años 70 se desarrollaron las herramientas de la
biología molecular o la ingeniería genética o lo que se ha
llamado técnicas del ADN recombinante.

El ADN recombinante, o recombinado, es una molécula de ADN

artificial formada de manera deliberada in vitro por la unión de
secuencias de ADN provenientes de dos organismos de especies
diferentes que normalmente no se encuentran juntos.

Al introducirse este ADN recombinante en un organismo se

produce una modificación genética que permite la adición de un
nuevo ADN al organismo, conllevando a la modificación de
rasgos existentes o la expresión de nuevos rasgos.
 Aplicaciones de la tecnología de
ADN recombinante

Hormona del
Insulina humana Cultivos Arroz dorado Vacuna contra la crecimiento h
recombinante. resistentes a hepatitis umano
insectos B recombinante recombinante
(HGH,
somatotropin
a)
Cultivo Diagnóstico de
Quimosina recombinante resistente a infección Factor de coagulación
herbicida con VIH VIII recombinante
La tecnología del ADN
recombinante se
desarrolla en 3 pasos:
1. El aislamiento del
gen de interés
2.La clonación y la
expresión de dicho
gen
3.Producción a gran
escala de la proteína
codificada por el gen.
Estas técnicas permiten manipular el DNA, cortar y pegar fragmentos
de material genético, insertarlos en vectores que los transportan a los
hospedadores deseados y posteriormente localizar, secuenciar y
modificar esos fragmentos de ácidos nucleicos.

HERRAMIENTAS TÉCNICAS PARA MANIPULAR ADN

MOLECULARES 1. Aislar segmentos específicos ADN
1. DNA 2. Hibridación
Clonación
2. Vectores 2. Secuenciación de DNA
Molecular
3. Enzimas: catalizadores 3. PCR
4. Hospedadores Expresión
de genes

APLICACIONES EN BIOTECNOLOGÍA MODERNA

1. Estudios de regulación genética
2. Animales transgénicos
3. Plantas transgénicas
4. Secuenciación de genomas enteros
 a. Para modificar DNA, nucleótidos,
moléculas de DNA: oligonucleótidos.
Materias
primas Sirven para
b. Vector “amplificar una
secuencia de DNA”
 LAS MATERIAS PRIMAS

a. Para modificar moléculas de DNA es

necesario:

1. Manipulación in vitro de material genético:

los oligonucleótidos sintéticos
2. amplificar una secuencia de DNA, esta
pueda insertarse en un vector
3. mantener la secuencia de DNA de interés,
y que se replique en las células hospedadoras
que reciben y procesan la información
genética introducida.
CELULAS: que se utilizan como
hospedadoras, Mas utilizada es la bacteria E.
coli, Bacillus subtlis, Saccharomyces
cerevisiae
Vectores para procariontes
VECTORES PARA EUCARIONTES

Los organismos eucariontes, como levaduras,

hongos, plantas o mamíferos o sus células en
cultivo, procesan material genético de una
manera diferente de las bacterias.

Pero las células eucariontes, requieren otro tipo

de vectores que contengan señales de origen de
replicación, regulación, selección y marcadores
que ellas puedan reconocer, se pueden utilizar
los plásmidos
Con plantas se utiliza los vectores que provienen
del virus del mosaico de tabaco o del plásmido
SHUTTLE
Para trabajar con células de mamíferos se
utilizan los vectores derivados del DNA viral.
LAS HERRAMIENTAS DEL OFICIO

UNA BATERIA DE ENZIMAS

➢Todos los organismos tienen enzimas
que copian, corrigen, cortan, degradan,
pegan y modifican las moléculas de
ADN.
➢Las enzimas permiten realizar
funciones esenciales, como replicar,
reparar y expresar la información
genética
 Las Herramientas del oficio
Enzimas de restricción
• Son un tipo de endonucleasas, su función es proteger a las bacterias
del DNA extraño.
• La característica esencial, es que escinden el DNA solo en secuencias de
nucleótidos específicas, secuencias de reconocimiento.

Enzimas que agregan nucleótidos: las polimerasas

• Permiten sintetizar in vitro nuevas moléculas de DNA y RNA, rellenar
secuencias faltantes en el DNA de doble cadena o agregar nucleótidos en el
extremo de ácidos nucleicos.
La transcriptasa inversa
• Es una DNA polimerasa viral, que depende del RNA, permite sintetizar ADN de
cadena doble, usando como molde cualquier molécula de RNA obtenida de una
célula. Las moléculas de ADN sintetizadas por la transcriptasa inversa a partir de
una molécula de ARNm, se conoce como ADN complementario o, ADNc.
Otras enzimas
• Las DNA ligasas como la obtenida de las bacterias infectadas por el fago T
 ENZIMAS UTILIZADAS EN LA
TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE
ENZIMA FUNCION

Endonucleasas de restricción tipo II Cortan el DNA en secuencias especificas

DNA ligasa Une dos moléculas o fragmentos de DNA

DNA polimerasa I (E. coli) Rellena los huecos en el DNA duplex por adición
secuencial de nucleótidos en los extremos 3`

Transcriptasa inversa Hace una copia del ADN a partir de una molécula de
ARN
Polinucleotido quinasa Añade un grupo fosfato al grupo OH del extremo 5`de
un polinucleótido para marcarlo o para permitir su
ligación
Transferasa terminal Añade colas homopolimericas al grupo OH del
extremo 3`de un duplex lineal

Exonucleasa III Elimina nucleótidos de los extremos 5`de una hebra

de DNA
Exonucleasa del bacteriófago l Elimina nucleótidos de los extremos 5`de un duplex
para exponer los extremos 3`monohebra

Fosfatasa alcalina Elimina fosfatos terminales tanto del extremo 5`como

del 3`(o de ambos)
 TÉCNICAS UTILIZADAS

Rotura especifica del ADN mediante las nucleasas de

restricción, facilitando enormemente el aislamiento y
AISLAMIENTO DE SEGMENTOS
la manipulación de los genes individualmente.
ESPECIFICOS DE ADN

Hace posible determinar los limites precisos de un gen

SECUENCIACIÓN y la secuencia de aminoácidos que codifica .

Se puede conseguir que un fragmento de ADN se

integre en un elemento génico autorreplicante, de tal
manera que de una molécula de ADN puede ser
CLONACIÓN DEL ADN reproducida generando muchas copias idénticas .

Hace posible localizar secuencias de ADN o de ARN,

con una gran exactitud y sensibilidad, utilizando la
capacidad que tienen esas moléculas de unirse a
HIBRIDACIÓN DE LOS ACIDOS NUCLEICOS secuencias complementarias de otros ácidos nucleicos.
AISLAMIENTO DE SEGMENTOS ESPECÍFICOS DE
ADN
Una de las formas de obtener segmentos específicos de ADN es:
a) Cortando moléculas de ADN con enzimas de restricción
b) Transcribiendo el ARNm a ADN con la enzima transcriptasa inversa
c) Por medio de la síntesis de oligonucleótidos sinteticos en el laboratorio.
Las enzimas de restricción se
encuentran en la naturaleza de las
células bacterianas y en algunos
bacteriófagos.
Escinden las moléculas de ADN
en secuencias de reconocimiento
específicas, que típicamente tienen
de 4 a 8 nucleótidos de longitud.
Su función en las células bacterianas
es degradar moléculas de ADN
extrañas.
Algunas enzimas de
restricción producen cortes
de la molécula que dejan
extremos rectos.
Otras enzimas cortan de
manera escalonada, dejando
extremos pegajosos que
luego pueden unirse, por
apareamiento de bases
complementarias, con otros
fragmentos producidos por
la misma enzima.
Esto hace posible combinar
segmentos de ADN de
fuentes diferentes.
La piedra angular de la tecnología del DNA recombinante es
un tipo de enzimas denominadas Endonucleasas
de Restricción.
Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben este nombre
por que limitan o previenen las infecciones víricas
degradando el ácido nucleico invasor.
Las enzimas de restricción reconocen una secuencia
específica de nucleótidos (denominada sitio de
restricción) de una molécula de DNA de doble cadena, y
cortan el DNA por esa secuencia.
Las enzimas de Tipo I- No se utilizan en investigación de
DNA recombinante, el sitio de corte no es preciso.
Las enzimas de Tipo II - reconocen una secuencia
específica y cortan las 2 cadenas de DNA con absoluta
precisión, Se usan ampliamente en investigación de DNA.
 B. TRANSCRIPTASA INVERSA
• Otra herramienta para obtener fragmentos específicos de ADN es la
transcriptasa inversa, que fue aislada de ciertos virus que contienen
genomas de ARN, los retrovirus.
• En el laboratorio, la transcriptasa inversa puede utilizarse para sintetizar ADN a partir
del molde de ARN, segmentos que se conocen como ADN complementario o
ADNc.
 2. TRANSCRIPTASA INVERSA

Otra herramienta de obtención : es la

transcriptasa inversa, que fue
aislada de ciertos virus que
contienen genomas de ARN, los
retrovirus.
• En el laboratorio, la transcriptasa
inversa puede utilizarse para
sintetizar ADN a partir del molde de
ARN, segmentos que se conocen
como ADN complementario o
cADN.
Este proceso se lleva a cabo de la siguiente
forma:
a) La cápside del retrovirus se fusiona
con la membrana celular del nuevo
hospedador, permitiendo que el virus
entre en la célula.
b) El ARN viral se libera de la cápside y
se transcribe a una única cadena de
ADN complementaria
c) Comienza de inmediato la síntesis de
la segunda cadena de ADN
produciéndose una molécula de
cADN de doble cadena.

Estas acciones son catalizadas por la

enzima transcriptasa inversa.
C. OLIGONUCLEOTIDOS SINTETICOS
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
HIBRIDACION
 Híbrido (biología)
Un híbrido es el organismo vivo animal o vegetal procedente del cruce de
dos organismos por la reproducción
sexual de razas, especies o subespecies distintas
Los híbridos entre caballo y asno, oveja y cabra, perro y lobo, cerdo y
jabalí han sido algunos de los más conocidos
• Hibridación natural: cuando el híbrido se cruza en ambientes naturales,
sin intervención humana.

• Hibridación artificial: cuando el híbrido se logra por un mecanismo como

puede ser un inseminador artificial, o simplemente porque en estado de
cautividad el hombre aparea animales.
• En el caso de vegetales se utiliza el procedimiento
de polinización artificial.

• Cíbrido: se trata de una célula viable que resulta de la fusión de un

citoplasto (citoplasma tras la enucleación celular) con una célula completa
 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
La hibridación de ácidos nucleicos (ADN o ARN), es un proceso por el cual se combinan dos
cadenas de ácidos nucleicos anti-paralelas y con secuencia de bases complementarias, en una
única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde las bases
nitrogenadas quedan ocultas en el interior.

Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A—T. G—U
DESNATURALIZACIÓN
Y
RENATURALIZACIÓN
POR EFECTO DE LA
TEMPERATURA
Principio básico del ensayo de hibridación

Para que la 1. La presencia de la secuencia

hibridación permita diana, obtenidos usando
enzimas de restricción.
identificar : en un
genoma, u otra
muestra cualquiera
de ácido nucleico,
2. El empleo de una sonda
una secuencia molecular, o de hibridación), que
particular se es un oligonucleótido (fragmento
requieren 2 corto de ácido nucleico) de
secuencia conocida, marcado de
elementos básicos: para su detección.
Rigor de hibridación
• Es el grado de especificidad en el apareamiento
conseguido en los híbridos; capacidad de
reconocimiento mutuo de dos secuencias, con el
fin de detectar el DNA.
• El rigor depende de factores experimentales:
1.Tiempo y temperatura de re-naturalización
2.Longitud y concentración de las cadenas
3.Composición de bases y ambiente químico
MÉTODOS DE ENSAYO CON HIBRIDACIÓN
 Hibridación en fase líquida

a. Utiliza una muestra de

DNA o RNA, en
disolución,
b. se realiza hibridación
con la sonda
 Hibridación en soporte sólido

a. permite procesar varias muestras de forma

simultánea y facilita el control de la hibridación.
b. Son válidas para el análisis de ácidos nucleicos y el
diagnóstico de enfermedades moleculares con base
genética.
c. Es el método empleado para identificar, de entre
varias colonias bacterianas en placas de cultivo con
agar, las que contienen un gen o fragmento de DNA de
interés bajo la forma de plásmido recombinante
En Biología Molecular experimentalmente se lleva a cabo 2 tipos de hibridación
a. Tipo Northern, para uniones ADN- ARN.
b. Tipo Southern, para uniones ADN-ADN .
 NORTHERN

A. Se utiliza para identificar las cadenas de ARN de

secuencia semejante al ADN que se usa como sonda.

B. Se utiliza para estudios de expresión génica, para

obtener información sobre el tamaño de ARN

C. para conocer qué genes están activos formando

ARNm, en qué tejidos o tipos celulares.

D. El ARN se extrae y se fracciona en tamaños

variables, mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida o agarosa, en condiciones que
mantenga las cadenas de ARN, desnaturalizado.
 Hibridación de SOUTHERN

Se prepara ADN con enzima de restricción y los

fragmentos se separan por tamaños, mediante
electroforesis en un gel.

Luego los fragmentos son desnaturalizados y se

separan las 2 hebras componentes de ADN en sus
cadenas sencillas.

Posteriormente, el ADN inserto en el gel , es

transferido a un filtro de nitrocelulosa, y queda
representado una réplica de la disposición de los
fragmentos de ADN presentes en el gel.

Finalmente el filtro se incuba, con la sonda;

durante la incubación, la sonda se va hibridando a
las moléculas de ADN de cadena sencilla de
secuencia complementaria
DIFERENCIAS ENTRE SOUTHERN BLOT Y NOTHERN BLOT
 Hibridación in situ (uso de sondas radioactivas)
,Las sondas están marcadas con colorantes
fluorescentes.
El color indica la localización de una secuencia de
DNA diferente:
rojo, localización en el cromosoma X del gen de la
distrofia muscular infantil

verde, región del cromosoma 21 donde se encuentra

el gen del Síndrome de Down;

blanco, un oncogén en el cromosoma 8;

violeta, un gen que codifica una proteína de

membrana de los glóbulos blancos

amarillo, una secuencia sin determinar en el

cromosoma 5.
Aplicaciones de la Hibridación in situ tisular
a. Se realiza sobre cortes de tejido, células intactas, núcleos
aislados, etc.
b. para detectar virus patógenos.
c. para diagnosticar células cancerosas como consecuencia de
cambios genéticos.
d. para estudiar cambios en la expresión génica, detectando
secuencias en el RNA celular.
e. En este caso, tras una fijación suave de la preparación, se
añaden sondas de DNA complementario (cDNA), monocatenario.
f. La detección se realiza por autorradiografía y examen de la
película fotográfica bajo el microscopio, o por microscopia de
fluorescencia, si se empleó este marcaje para la sonda.
EJEMPLOS
 Hibridación in situ cromosómica

A. Se realiza sobre preparaciones de

cromosomas metafásicos o prometafásicos,
tratadas con reactivos fijadores para
preservar las características morfológicas del
cromosoma.
B. Se trata la muestra con enzimas
proteolíticas y se desnaturaliza el DNA
mediante calor, álcali o formamida para
permitir su hibridación con la sonda.
C. Elevado potencial diagnóstico en
cromosomopatías, genes tumorales, virología,
trasplantes.
 LAS TÉCNICAS
Y LAS
HERRAMIENTAS
EN ACCIÓN
Las bibliotecas genómicas
Para clonar una secuencia
determinada recurrimos a
una biblioteca genómica o
genoteca, que es una
colección de fragmentos de
ADN genómicos clonados
en vectores que totalizan el
genoma del organismo.
 Para construir estas bibliotecas:

1. El genoma se 2. El vector y los 3. Los fragmentos

corta en fragmentos plásmidos se tratan se unen a las
aislados mediante el con enzimas que los vectores por medios
uso de enzimas de cortan en un sitio de acción de ADN
restricción único, dejando sus ligasa, que sella las
adecuadas. extremos pegajosos. uniones.
El Resultado es una mezcla de vectores: algunos no habrán recibido ningún
fragmento de ADN y otros tendrán en fragmento inserto.

A continuación los vectores con su ADN son introducidos en bacterias para que
se repliquen.
La elección del hospedador es también
dada dependiendo del producto que se
quiere expresar. (Ciertos genes solo se
expresan en determinadas tipos de
celulas)
Por ejemplo:
Algunos péptidos requieren la adición de
moléculas de hidrato de carbono para
activarse y esta función solo la llevan a
cabo células eucariontes.