Manual Cuantifica Microorganismos en Base A Normas Feb-Jul-2016

Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Colegio de Estudios Científicos y Tecnológicos del Estado de Guanajuato
Manual de prácticas
De: Cuantifica Microorganismos con base a Normas
Academia: Laboratorista Químico
Nombre del Alumno: ____________________________________________
Mesa o equipo de trabajo ___________
Correo electrónico: _____________________________________________
Elaboración del manual: Ing. Fernando Orta Guevara
León, Guanajuato, Enero del 2015. (Impresión 2016)

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Presentación
Este manual se modificó en diciembre de 2014, a raíz de la impartición del curso-

taller de Análisis Microbiológico de Alimentos por parte de la Universidad de
Guanajuato; con la finalidad de tener una propuesta de trabajo para cubrir el
Submódulo 3: Cuantifica microorganismos con base a normas, el cual forma
parte del Módulo III: Ejecuta métodos de análisis cuantitativos químicos y
microbiológicos con base a las normas, el cual se cursa en el cuarto semestre del
programa de Laboratorista Químico, establecido por la COSDAC (Coordinación
Sectorial de Desarrollo Académico), dependiente de la Subsecretaría de Educación
Media Superior (SEMS).
La Reforma Integral de la Educación Media Superior (RIEMS) se orienta a la

construcción de un Sistema Nacional de Bachillerato (SNB), con los propósitos de
confirmar una identidad propia de este nivel educativo y lograr un perfil común del
egresado en todos los subsistemas y modalidades que lo constituyen, siempre dentro
de un marco de pluralidad interinstitucional.
El perfil común del bachiller se construye a partir de las once competencias
genéricas, que se complementan con las profesionales y las disciplinares, las cuales
favorecen la formación integral del estudiante para su mejor desarrollo social, laboral
y personal, desde la posición de la sustentabilidad y el humanismo.
El presente manual, como ya se mencionó, pretende cubrir estos requerimientos, es

perfectible, por lo cual cualquier aportación o sugerencia serán de gran importancia
para su mejoramiento.
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EL MODULO III: EJECUTA MÉTODOS DE ANÁLISIS CUANTITATIVOS

QUÍMICOS Y MICROBIOLÓGICOS CON BASE A LAS NORMAS, PROPONE LAS
SIGUIENTES:
COMPETENCIAS PROFESIONALES
6. Cuantifica microorganismos por métodos directos aplicando normas de

seguridad y siguiendo instrucciones y procedimientos de manera reflexiva.
7. Cuantifica microorganismos por métodos indirectos, aplicando normas de
seguridad y siguiendo instrucciones y procedimientos de manera reflexiva.
DISCIPLINARES BÁSICAS SUGERIDAS
C4.
Obtiene, registra y sistematiza la información para responder a preguntas de
carácter científico, consultando fuentes relevantes y realizando experimentos
pertinentes.
C5.
Contrasta los resultados obtenidos en una investigación o experimento con hipótesis
previas y comunica sus conclusiones.
C14.
Aplica normas de seguridad en el manejo de sustancias, instrumentos y equipo en la
realización de actividades de su vida cotidiana.
GENÉRICAS SUGERIDAS
5 .1
Sigue instrucciones y procedimientos de manera reflexiva, comprendiendo cómo
cada uno de sus pasos contribuye al alcance de un objetivo.
** Notas del programa:
 Competencias disciplinares que se requieren para desarrollar las
profesionales, se desarrollan desde el componente de formación básica
 Los atributos de las competencias genéricas, están incluidos en las
competencias profesionales; por lo tanto no se deben desarrollar por
separado.
ESTRATEGIA DE EVALUACIÓN DEL APRENDIZAJE
La evaluación se realiza con el propósito de evidenciar, en la formación del
estudiante, el desarrollo de las competencias profesionales y genéricas de manera
integral mediante un proceso continuo y dinámico, creando las condiciones en las
que se aplican y articulan ambas competencias en distintos espacios de aprendizaje
y desempeño profesional. En el contexto de la evaluación por competencias es
necesario recuperar las evidencias de desempeño con diversos instrumentos de
evaluación, como la guía de observación, bitácoras y registros anecdóticos, entre
otros. Las evidencias por producto, con carpetas de trabajos, reportes, bitácoras y
listas de cotejo, entre otras. Y las evidencias de conocimientos, con cuestionarios,
resúmenes, mapas mentales y cuadros sinópticos, entre otras. Para lo cual se
aplicará una serie de prácticas integradoras que arroje las evidencias y la
presentación del portafolio.
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REFERENCIAS PROPUESTAS EN EL PROGRAMA
 NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras

de alimentos para su análisis microbiológico.
 NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias
aerobias en placa
 NOM-111-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Métodos para la cuenta de mohos
y levaduras en alimentos
 NOM-115-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para la determinación de
Staphylococcus aureus en alimentos
CRITERIOS DE EVALUACION
Definición.
Una evidencia permite demostrar o poner de manifiesto algo, las evidencias
determinan de manera precisa si la persona es capaz de realizar la función referida
en el elemento de competencia de manera consistente.
Evidencias por desempeño (Trabajo en el laboratorio)
Evidencias por producto (Manual, reportes, videos, cuestionarios, resúmenes,
mapas mentales, cuadros sinópticos, uso de listas de cotejo)
Evidencias de conocimiento (exámenes)
PRIMER PARCIAL SEGUNDO PARCIAL

Interés, iniciativa y Interés, iniciativa y
comportamiento comportamiento
(actitudinal) 10% (actitudinal) 10%
Tareas (TA) y manual de Tareas (TA) y manual de
practicas 10% practicas 10%
Desempeño en el Desempeño en el
Laboratorio 20% Laboratorio 20%
Investigaciones y
exposiciones sobre
Video Sobre toma de Normas y Tipos de
muestra en YouTube 20% Alimentos 20%
Evaluaciones (EV) Evaluaciones (EV)
Exámenes 40% Exámenes 40%
**Nota: para tener derecho a calificación, se **Nota: para tener derecho a calificación, se
deberá cumplir con el 80% de asistencia deberá cumplir con el 80% de asistencia
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TERCER PARCIAL
Interés, iniciativa y
comportamiento
(actitudinal) 10%
Tareas (TA) y manual de
practicas 10%
Desempeño en el
Laboratorio 20%
Fichas Técnicas 20%
Evaluaciones (EV)
Proyecto Final 40%
**Nota: para tener derecho a calificación, se

deberá cumplir con el 80% de asistencia
Rubrica para evaluar el desempeño en el laboratorio
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INDICE
TEMAS Pág.
Fundamentos del Muestreo 7
Práctica 1.- OBTENCION DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA SU ANALISIS 19
MICROBIOLOGICO.
Microorganismos Indicadores 30
Práctica 2.- DETERMINACION DE MESOFILOS AEROBIOS EN ALIMENTOS 39
(NOM-092-SSA1-1994)
Límites permisibles de microorganismos en diversos alimentos 52
Fuentes de Microorganismos en los Alimentos 66
Coliformes 70
Práctica 3.- DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA 72
(En Agua y Productos Alimenticios)
Calidad microbiología normal de los alimentos y su importancia 82
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA´s) 87
Práctica 4.- ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE SUPERFICIES EN CONTACTO 90
CON ALIMENTOS Y BEBIDAS
Práctica 5.- Determinación de bacterias Coliformes totales y Coliformes fecales en hielo 97
y agua para consumo humano, mediante la técnica del Número Más Probable (NMP),
usando tubos de fermentación múltiple
Fichas Técnicas de Microbiología Sanitaria y de Alimentos 113
Practica 6.- CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS 114
TINCION DIFERENCIAL DE GRAM 118
PROYECTO FINAL 120
Notas
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PRACTICA 1.
OBTENCION DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA SU ANALISIS
MICROBIOLOGICO
INTRODUCCION
En el análisis microbiológico de alimentos, la adecuada selección de la muestra, la
toma correcta, los medios de conservación y su transporte al laboratorio, son de
primordial importancia para obtener resultados significativos y confiables. Esto
implica precisar el objetivo del estudio, la naturaleza de las muestras y la cantidad, el
tamaño o el volumen, en lo posible, sean representativos del producto y del lote o
partida de donde provienen.
La recolección de la muestra se debe efectuar evitando toda contaminación externa,
tanto ambiental como humana, para asegurar la integridad de la misma.
Se requiere consignar en el informe con que se entrega la muestra todos los datos
pertinentes que pudieran afectar la prueba o el significado del resultado, a fin de que
el laboratorio lo tome en consideración.
Las condiciones de conservación y transporte, tiempo comprendido entre la
recolección de la muestra, su entrega al laboratorio, así como la realización del
análisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos, ya que la población
microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos. Esto es especialmente
cierto en los alimentos perecederos.
Cabe destacar la importancia del muestreo y la conservación para los alimentos
perecederos, ya que para fines oficiales la Ley General de Salud señala claramente
que después de la notificación de los resultados del análisis practicado, si existe
alguna duda sobre la veracidad de estos, el particular puede impugnar dentro del
plazo contemplado en la misma Ley, lo que da como consecuencia que la Secretaría
de Salud analice la muestra testigo en un laboratorio que ésta señale en presencia
de las partes interesadas y el resultado obtenido sea el que en forma definitiva
acredite si el producto en cuestión reúne o no los requisitos y especificaciones
sanitarias. Sin embargo los alimentos, aún en condiciones apropiadas de
conservación, pueden sufrir cambios significativos en sus características biológicas
y/o fisicoquímicas, provocando que los resultados de las muestras testigo sean
improcedentes.
En la Microbiología de Alimentos nos encontramos con una nueva terminología que
nos serán de uso común de aquí en adelante, en nuestro país, la Norma Oficial
Mexicana NOM -109-SSA1-1994, Bienes y servicios. Procedimientos para la toma,
manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico rige los
procedimientos y consideraciones que se deben tener al realizar un muestreo.
Para fines de esta Norma se entiende por:
 Asépticamente, forma de mantener la ausencia completa de microorganismos
vivos en un medio.
 Fecha de caducidad, fecha límite en que se considera que un producto,
almacenado en las condiciones sugeridas por el fabricante, conserva las
características sanitarias que debe de reunir para su consumo. Después de
esta fecha no debe comercializarse ni consumirse.
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 Muestra representativa, es un número de unidades tomadas de un lote, que

han sido seleccionadas en forma aleatoria y cuyas características son lo más
similar posible a las del lote del que procede.
 Muestra testigo, muestra que queda en poder del interesado y a disposición
de la autoridad competente.
 Productos perecederos, grupo de alimentos que por su naturaleza biológica y
físico-química, su vida útil es de hasta 30 días, dando lugar al establecimiento
de una fecha de caducidad, la cual debe ostentarse en su etiqueta o envase.
 Toma de muestra, es el procedimiento que se requiere para elegir el material
a analizar a partir de la totalidad del lote o partida.
 Vida útil o vida de anaquel, es el tiempo durante el cual un alimento es seguro
y conserva un nivel de calidad sanitaria aceptable para su consumo, bajo
condiciones específicas de procesamiento, envasado y almacenamiento
OBJETIVO:
Aprender la normatividad y procedimientos para la obtención de muestras de

alimentos para su análisis microbiológico.
MATERIALES Y EQUIPO:
 Frascos de boca ancha con tapa de rosca o tapón esmerilado de material
esterilizable, no tóxico y de tamaño acorde con la cantidad de muestra
deseada.
 Bolsas de polietileno estériles de varias medidas.
 Hieleras de poliestireno o de otro material aislante
 Papel aluminio.
 Papel estraza.
 Etiquetas autoadheribles.
 Cinta testigo.
 Marcadores indelebles.
 Algodón.
 Cerillos o encendedor
 Instrumentos para toma de muestra: muestreadores, cucharones, espátulas,
cuchillos, pinzas, etc.(de acero inoxidable o de cualquier otro material que no
provoque cambios que puedan afectar los resultados).
 Lámparas de alcohol.
 Frasco con etanol o isopropanol al 70 %.
 Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio, para toma de muestra.
 Hielo o bolsas refrigerantes.
 Bata, cubre boca, cofia y guantes estériles.
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PROCEDIMIENTOS:
1. Organizados en equipos, diseñarán una etiqueta para la identificación de
muestras, la cual debe contener toda la información adecuada según el
producto de que se trate (ver ejemplos).
Diseña aquí una etiqueta individual
En grupo elijan una de las etiquetas, dibújenla en

este espacio, posteriormente la diseñarán en
computadora y la utilizarán en todos sus
muestreos.
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2. Preparación del Material para la Toma de la Muestra.

 Todo el material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la
toma, manejo y transporte de muestras, que van a estar en contacto
directo con el alimento, debe estar limpio, estéril y libre de substancias
que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos.
 El material para la toma de muestra que requiera esterilización, se
envolverá en forma individual, debidamente identificado, con papel de
estraza antes de esterilizarlo.
 La tapa de los frascos se protegerá con papel de estraza o aluminio
fijándolos adecuadamente.
 Colocar cinta testigo en el material a esterilizar.
 El material que se utilice para la toma de muestra debe ser esterilizado
en autoclave a 121°C durante 15 minutos o en horno a 170°C por dos
horas, de acuerdo a su naturaleza.
 Una vez esterilizado el material debe ser protegido para evitar
contaminación posterior.
 De ser necesario, si se requiere mayor número de utensilios, limpiar los
que hayan sido usados y empaparlos con etanol o isopropanol al 70%,
posteriormente flamearlos y colocarlos en recipientes estériles para
evitar su contaminación o inmediatamente utilizarlos.
3. Obtención de muestras de productos envasados con presentación comercial
 Se muestrea en forma aleatoria y se envía al laboratorio tal como se
presenta al consumidor
4. Obtención de muestras de alimentos preparados sin envasar
 se recomienda que la persona que elabora los alimentos, sea la que
introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estériles con los utensilios
que emplea normalmente. Los alimentos que se muestrean en caliente se
deben conservar y trasladar a la temperatura en que se muestrearon, esto
únicamente si el traslado es menor a una hora, de lo contrario deben
enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de
refrigeración.
5. Obtención de muestras de alimentos líquidos o semilíquidos
 se deberá agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y después
efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles.
6. Obtención de muestras de alimentos sólidos
 Cuando sea necesario cortar el producto, debe muestrearse con ayuda de
utensilios estériles como sacabocados, cucharas, cuchillos, etc.
7. Obtención de muestras de productos a granel
 Tomar la muestra de varios puntos del contenedor para obtener una
muestra representativa (ver la siguiente imagen)
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8. Obtención de muestras en un conducto de salida o una compuerta

 Antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones
del producto para limpiar dicha salida con el flujo.
9. Identificación de la muestra
 Es indispensable identificar el recipiente claramente, inmediatamente
antes o después de colocar en él la muestra, mediante rótulo o etiqueta
(indelebles), con los siguientes datos: Fecha, lugar, hora del muestreo,
número de lote y temperatura de la toma de muestra si es que procede.
 La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco, la caja,
en el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra
sea alterada o violada.
10. Conservación y transporte de la muestra
 El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera
que se impida su ruptura, alteración o contaminación, evitando su
exposición a la luz solar directa.
 Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible.
Los alimentos perecederos se transportarán bajo condiciones de
temperatura de 2 a 8°C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el
momento de realizar las pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las
24 horas siguientes a su recolección.
 En el caso de muestras individuales blandas, evitar que la presión que
puedan ejercer otros recipientes o una cantidad excesiva de las mismas
las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga
en contacto con el exterior de la envoltura.
 En el caso de muestras no perecederas, evitar que se dañen,
humedezcan o contaminen con otras.
 Los productos con presentación comercial que no requieran refrigeración,
deben ser transportados en sus envases originales a temperatura
ambiente, siempre y cuando ésta no exceda de 45°C
 Para la conservación, durante el transporte de las muestras no está
permitido el empleo de sustancias químicas
 Las muestras que se entreguen al laboratorio deberán acompañarse de un
informe que además de contener la identificación de la muestra, incluya
los siguientes datos: Número de unidades y/o cantidad, Clave única que
permita la identificación del domicilio del fabricante, representante y/o
distribuidor, Indicar nombre genérico y específico del producto, así como la
marca comercial y cualquier otra información que se considere importante.
Recomendaciones generales para la toma de muestras
 Tratándose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso
abrir éstos y extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar la
contaminación microbiana.
 Los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no
requieren precauciones estrictamente asépticas.
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 Cuando se requiera tomar muestras asépticamente, éstas no deben

tomarse en áreas donde las condiciones sanitarias puedan dar lugar a la
contaminación de las mismas.
 Es necesario que el personal que lleve a cabo el muestreo se lave las
manos antes de desarrollar éste.
 Para muestreo aséptico debe utilizar: bata, cofia y cubreboca. De ser
necesario el contacto directo de las manos con el producto deberán
usarse guantes estériles.
 La toma de muestra debe hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los
recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al
momento de introducir ésta y cerrarlos de inmediato. No tocar el interior de
los envases y evitar que la tapa se contamine.
 Cuando sea necesario tomar la temperatura, la muestra que se utilice para
tal fin deberá ser diferente de la que se envía para su análisis.
 Para productos envasados que no contengan fecha de caducidad, se
consideran para fines de esta Norma, como no perecederos.
 Para productos perecederos la toma de muestra para efecto de vigilancia
sanitaria será únicamente por
 duplicado, la primera se enviará al laboratorio oficial para su análisis y la
segunda se quedará en poder del interesado para su análisis particular si
es necesario.
 Para cualquier duda consulta la Norma Oficial Mexicana NOM -109-SSA1-
1994, Bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y
transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico
RESULTADOS:
En el espacio correspondiente agrega una fotografía como evidencia:

Una muestra de un producto envasado con presentación comercial:
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Una muestra de un alimento preparado sin envasar:
Una muestra de un alimento líquido o semilíquido:
Una muestra de un alimento sólido
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Una muestra de un producto a granel
Una muestra tomada en un conducto de salida o una compuerta
La muestra deberá estar aparecer perfectamente identificada y en las condiciones de

conservación y transporte adecuadas
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué importancia tiene el muestrear adecuadamente un alimento en un análisis

microbiológico?
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_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
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2. Busca en la página www.cofepris.gob.mx la NOM-109-SSA1-1994 y en la

siguiente hoja, elabora un mapa conceptual de toda la norma, según el siguiente
ejemplo:
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A manera de conclusiones, elabora un cuadro PNI (positivo, negativo interesante):
POSITIVO NEGATIVO INTERESANTE
Entrega y revisión de un video, con el tema de muestreo, la duración del video no

deberá exceder de 5 minutos:
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PRACTICA No 2
DETERMINACION DE MESOFILOS AEROBIOS EN ALIMENTOS
(NOM-092-SSA1-1994)
INTRODUCCION
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un

alimento, la técnica más común utilizada es el recuento en placa, en un medio de cultivo con
un soporte nutricional adecuado y libre de agentes inhibidores.
Recuento Estándar en Placa (REP): también conocido como recuento de aerobios mesófilos,
es el análisis directo mayormente empleado para determinar la calidad microbiológica de
la leche y otros alimentos. El método consiste en hacer diluciones de la muestra y sembrar
en placas de petri con agar estándar; luego de 24 a 48 horas de incubación a 35 ºC ± 2 se
cuentan las colonias observadas las cuales permiten obtener el número de unidades
formadoras de colonias por mililitro o gramo de muestra (UFC/ml. o UFC/gr). Los resultados
obtenidos siempre son inferiores a los reportados con el recuento directo, ya que aquí solo
intervienen microorganismos vivos capaces de formar colonias, además una colonia puede
estar originada por uno o más de una unidad formadora de colonias.
En realidad, esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos
presentes en un alimento determinado, ya que la variabilidad de especies y tipos diferentes
por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxigeno
disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas constituyan una estimación de la
cifra realmente presente. No obstante, cuando se siguen fielmente las condiciones que se
señalan en la técnica para su desarrollo, puede llegar a proporcionar resultados lo
suficientemente reproducibles para darle significado a la prueba.
Cuando la temperatura de incubación ha sido entre los 20 y los 37 ºC se le designa
como bacterias mesofílicas aerobias, cuenta total viable, cuenta estándar en placa viable
general, cuenta total aeróbica o cuenta en placa aeróbica.
Al grupo de bacterias mesofílicas aeróbicas pertenece una gran variedad de
microorganismos, de hecho, están incluidos todos aquellos microorganismos capaces de
desarrollar entre 20 y 37 ºC que son los extremos de las temperaturas a las cuales suele
realizarse este recuento, en condiciones de aerobiosis. En algunos alimentos, este grupo de
microorganismos arroja máximos, pero esto dependerá del predominio de otros grupos como
lo son psicrofílicos, anaerobios, etc.
Dentro de la flora mesofílica aeróbica tendremos bacilos, cocos, Gram positivos y
Gram negativos, aislados o agrupados en todas las variedades que nos son familiares.
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Desde el punto de visita fisiológico de su patogenicidad encontraremos: cromógenos,

proteolíticos, lipolíticos, sacarolíticos, saprofíticos, patógenos etc.
La utilidad de las bacterias mesofílicas aerobias en la microbiología sanitaria se ha
recomendado para los siguientes objetivos:
a) Como indicador de la posible presencia de microorganismos patógenos.
b) Como un indicador del valor comercial del alimento.
c) Como indicador de las condiciones higiénicas en que ha sido manejado el
producto.
d) Como indicador de la idoneidad de un ingrediente cuando se va incorporar a un
alimento.
e) Para seguir la eficiencia de un proceso germicida o de preservación.
f) Para predecir la vida de anaquel de un alimento.
El recuento de mesofílicos aerobios presenta limitaciones que deben tenerse en cuenta:
a) En productos madurados la adición de microorganismos para lograr esta
maduración, impide que puede ser considerado, como grupo indicador de estos
alimentos.
b) En alimento desecados los microorganismos pierden viabilidad por lo tanto no se
puede referir su número al momento en que fue envasado en la planta.
c) La presencia de inhibidores en el producto, impiden la estimación real del número
de mesofílicos aerobios en el alimento.
d) Solo una pequeña porción del alimento es analizada y no puede tener
representatividad suficiente para tomar decisiones justas con respecto a todo un lote
de fabricación.
e) La técnica solo permite el recuento de bacterias viables, por lo tanto, no pueden
ser de manifiesto series violaciones en el manejo de los alimentos previos a un
tratamiento térmico o de otra forma de destruir microorganismos.
f) La precisión del método, refiriéndose a la repetición de resultados dentro de un
cierto rango obtenidos bajo las condiciones que marca el método, admite para el
recuento en placa una variación del 5 % cuando se refiere a datos obtenidos por el
mismos analista y de un 10 % cuando se obtiene resultados por diferentes analistas.
g) Especificidad: El valor del método depende del uso adecuado que se le de. Si se
definen las condiciones de desarrollo de la técnica (potencial Redox, adición de sales,
tiempo de incubación, temperatura, pH del medio, etc.) y el analista se sujeta
rigurosamente a ellas, los recuentos obtenidos adquieren un significado de gran
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utilidad para muchos propósitos. Por ejemplo: para el análisis bacteriológico del agua
potable el tiempo de incubación es de 24 ± 2 horas a 35 ± 2 ºC; en la mayoría de los
alimentos el recuento se realiza a las 48 ± 3 horas y en los alimentos desecados a 72
± 3 horas a la misma temperatura.
MATERIALES
MATERIAL EQUIPO REACTIVOS MUESTRAS

• 1 Par de guantes de • Balanza granataria. Agar para cuenta • Todo tipo de alimentos
asbesto • Autoclave estándar. naturales o procesados
• 7 cajas petri • Incubadora co n • Alimentos líquidos,
• 3 Tubos 16 X 150 mm termostáto. Reactivos para la sólidos o semisólidos.
con tapón de rosca • Contador de solución diluyente: • Ingredientes o materias
conteniendo 9 ml de colonias. - Peptona primas
solución diluyente (en • Licuadora estéril o - Cloruro de • Entre otros.
este caso se utilizará Bolsa W HIRL-PAK sodio
agua peptonada) • Portacajas
• 4 Pipetas de 10 ml • Portapipetas
• 1 matraz erlenmeyer • Atomizador con sol.
para preparar el medio esterilizante
de cultivo
• 1 matraz erlenmeyer con
99 ml de solución
diluyente
• 1 probeta de 50 o 100 ml
• Algodón
• Gasas
• Papel de estraza
• Cinta testigo o Masking
tape
• 1 clip
• 3 mecheros bunsen
• 1 tripie y tela de asbesto
• Cofia o malla
• Cubre bocas
• Piseta
• 1 Vidrio de reloj
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• 1 Espatula
• 1 Gradilla
• 1 Vaso de precipitado de
500 ml
**Preparación de agua peptonada

Peptona 1 gr.
Cloruro de sodio (NaCl) 8.5 gr.
Agua destilada 1.0 L
Disolver los componentes en el agua destilada. Si es necesario, ajustar el pH a 7 con NaCl
1N antes de la esterilización. Distribuir en porciones de 99 o 9 ml. según se requiera.
Esterilizar durante 15 min a 121ºC (+ 2 ºC).
**Nota: Un equipo preparará el agua peptonada para todo el grupo y esta actividad se rolará
PROCEDIMIENTO
La práctica se lleva a cabo en dos momentos distintos, en el primero de ellos, se deben

preparar los materiales necesarios, como el medio de cultivo, soluciones diluyentes,
empapelar el material y su esterilización y en un segundo momento se da el manejo de la
muestra y la siembra propiamente dicha.
MANEJO DE LA MUESTRA:
MUESTRA DE UN ALIMENTO LÍQUIDO:
a) En caso de que el alimento este contenido en un envase cerrado, sanitizar el exterior
del envase (se puede hacer con algún agente químico).
b) Agitar hasta homogeneizar.
c) Abrir en condiciones de esterilidad (dentro del área estéril).
d) Tomar 11 ml de la muestra con una pipeta estéril y mezclar con 99 ml de solución
diluyente para preparar la dilución 1:10 o 10-1. (Dilución primaria)
e) Preparar las diluciones decimales que se requieran, en este caso se sembrarán las
diluciones 10-2, 10-3 y 10-4.
f) De preferencia utilizar agua peptonada estéril como diluyente.
MUESTRA DE UN ALIMENTO SOLIDO:
a) En condiciones asépticas, abrir la envoltura, teniendo cuidado de no tocarlo con las
manos.
42
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
b) Pesar 11 g de la muestra en una bolsa W HIRL-PAK, teniendo cuidado de no tocar el

interior de la misma.
c) Con la mano machacar la muestra hasta disgregarla completamente.
d) En la misma bolsa preparar la dilución 1:10 o 10-1. Con 99 ml de solución diluyente
e) Preparar las diluciones decimales que se requieran, en este caso se sembrarán las
diluciones 10-2, 10-3 y 10-4.
f) De preferencia utilizar solución de fosfato dipotásico al 2 %, estéril.
SIEMBRA:
1. Una vez listas las diluciones decimales a sembrar (10-2, 10-3 y 10-4), rotular cada una
de las cajas según corresponda (la siembra se hace por duplicado)
2. Incluir una caja sin inoculo por cada lote y diluyente preparado como testigo de
esterilidad.
3. Enfriar el medio a 45 ± 1° C (puede hacerse en baño maria).
4. Colocar 1 ml de la muestra diluida a cada caja.
5. Adicionar 12 a 15 ml de Agar Cuenta Estándar a una temperatura entre 40 y 45° C.
6. Homogenizar las cajas teniendo cuidado de no derramar el medio de cultivo
(mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las
manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una
superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el
medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas.
7. Dejar reposar hasta que el medio solidifique.
8. Invertir las cajas.
9. Incubar a 35 ± 2° C, durante 48 horas ± 2 horas.
10. Leer las cajas. Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas
(excepto las de mohos y levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso
del microscopio para resolver los casos en los que no se pueden distinguir las
colonias de las pequeñas partículas de alimento.
11. Comparar resultados con los estándares permitidos.
12. Realizar el lavado y esterilizado del material utilizado.
Nota:
 El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente
hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo de las cajas, no debe exceder de
20 minutos.
43
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
RESULTADOS POR EQUIPO
Mesa No. 1
Muestra:
Límite máximo permisible:
Fuente de información:
Colonias contadas por dilución por duplicado UFC/ ml
Dilución 10-2 Dilución 10-3 Dilución 10-4
Mesa No. 2
Muestra:
Mesa No. 3
Muestra:
Mesa No. 4
Muestra:
Mesa No. 5
Muestra:
44
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Mesa No. 6
Muestra:
Reportar como unidades formadoras de colonias. ________________ UFC/ gr o ml de

bacterias aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura o en agar nutritivo para
cuenta estándar. Incubadas ________horas a ________°C.
Morfología bacteriana
Esta prueba se realizará posterior a la siembra, junto con la tinción de Gram; por equipo,
seleccionaran 2 colonias bacterianas y las describirán según las características del siguiente
cuadro
COLONIA 1
Tamaño Color Forma Borde Elevación Superficie Aspecto Consistencia Producción
de pigmento
COLONIA 2
Características consideradas para describir colonias bacterianas:
Tamaño: Se mide en mm y puede variar desde colonias puntiformes hasta algunas que
pueden llegar a medir 10 mm, o incluso algunas especies cubren toda la superficie de la
caja
Color: Pueden ser de diferentes colores, esto también puede depender del medio de cultivo
que se utilice.
Forma: puede ser puntiforme, granular, rizoide, irregular, filamentosa, circular, etc.
Borde: Puede ser rizado, filamentoso, dentado, lobulado, ondulado, entero, etc.
Elevación: Puede ser plana, elevada, acojinada, umbilicada, invaginada
Superficie: Puede ser lisa, rugosa o granulada.
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Aspecto: Húmedo o seco

Luz reflejada: Brillante o mate.
Luz transmitida: Transparente, translucida y opaca
Consistencia: Suave o dura; esta característica se determina, tocando la colonia con el asa
y por lo tanto, debe ser la última en describirse
Producción de pigmento: Algunas bacterias lo producen, y puede difundirlo a todo el medio
o en la periferia de la colonia formando un halo
Tinción de Gram
Descripción
Descripción
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Para contabilizar los UFC/gr o ml, se debe revisar lo que dice la NOM-092-SSA1-1994,
según el caso, incluso este procedimiento se puede utilizar para otro tipo de análisis (ver la
siguiente información).
Expresión de resultados según la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-092-SSA1-1994,

BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN
PLACA
Cuenta por duplicado.

Ejemplo 1
Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a
250 colonias, usando el contador de colonias y el registrador. Las placas de al menos
una de tres diluciones deben estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando sólo una
dilución está en el intervalo apropiado, Calcular la cuenta promedio por gramo o
mililitro de dicha dilución y reportar el valor redondeado a dos dígitos, véase el
ejemplo 1
Colonias contadas por dilución por duplicado UFC/gr o ml

> 250a 178 16 180000
> 250 190 17
Ejemplo 2
Cuando dos diluciones están en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio
dada por cada dilución antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para
obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro, véase ejemplo 2.
>250 220 25 250000
>250 238 28
Ejemplo 3
Placas con menos de 25 colonias.- Cuando las placas corridas para la menor dilución
muestran cuentas de menos de 25 colonias, contar el número de colonias presentes
en dicha dilución, promediar el número de colonias y multiplicar por el factor de
dilución para obtener el valor estimado de cuenta en placa. Aclarar en su informe esta
situación agregando la leyenda "valor estimado", véase ejemplo 3.
18 2 0 1600 “valor
14 0 0 estimado”
Ejemplo 4
Placas con más de 250 colonias.- Cuando el número de colonias por placa exceda de
250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas
de la distribución de colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del
área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2, respectivamente. Si solamente
pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100
mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. Aclarar en el
informe esta situación agregando la leyenda "valor estimado", véase el ejemplo 4
> 250 > 250 512 5000000
“Valor
47
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
> 250 > 250 495 estimado”
Ejemplo 5
Colonias extendidas.- Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes
formas:
1. Cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser
causadas por la desintegración de un cúmulo de bacterias.
2. Colonias que se desarrollan en película entre el agar y el fondo de la caja.
3. Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la
superficie del agar.
4. Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompañadas de
inhibición del crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o
represión del crecimiento que por sí mismo excede el 25% de la superficie de
la caja.
Cuando es necesario contar en cajas que contienen colonias extendidas que no están
incluidas en el punto 4, contar cualquiera de los tipos 1, 2 ó 3, como provenientes de
una sola fuente. En el caso de las colonias del tipo 1, si la caja contiene una sola
cadena, contar como una sola colonia, si la caja contiene varias cadenas que parecen
originarse de fuentes separadas, contar cada cadena como colonia individual. No
contar cada colonia de la cadena individualmente. Las colonias del tipo 2 y 3
generalmente se observan cómo crecimiento diferenciable de otras colonias y se
cuentan como tales. Los crecimientos tipo 4, reportarlos como crecimiento extendido.
En caso de que una dilución se encuentre dentro del rango y otra dilución presente
colonias de crecimiento extendido, reportar la dilución en la que se pueden contar las
colonias, véase el siguiente ejemplo 5
> 250 240 34 290000
> 250 235 crecimiento

extendido
Ejemplo 6
Placas sin colonias: Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias,
reportar la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más baja
usada, véase el siguiente ejemplo
0 0 0 < 100
Ejemplo 7
Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y
otra con más de 250 colonias.- Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su
duplicado más de 250 colonias, contar ambas placas incluyendo la que está fuera del
intervalo para determinar la cuenta en placa, véase el siguiente ejemplo 7
> 250 240 24 250000
> 250 268 19
Ejemplo 8
Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilución dentro del intervalo de 25 a
250 colonias.- Cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el número
de colonias especificadas en el intervalo, contar el número de colonias de las cuatro
placas para calcular la cuenta en placa, véase el siguiente ejemplo 8
48
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
> 250 216 23 280000
> 250 262 42

Ejemplo 9
Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilución dentro del intervalo de
25 a 250 y sólo una de la otra dilución dentro del mismo. Contar las cuatro cajas
incluyendo aquélla con menos de 25 o más de 250 colonias, para calcular la cuenta
en placa, véase ejemplo 9.
> 250 215 20 230000
> 250 235 26

Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar
por la inversa de la dilución para obtener el número de UFC por mililitro o
gramo de la muestra. Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que
sólo aparezcan dos dígitos significativos al inicio de esta cifra. Para redondear,
elevar el segundo dígito al número inmediato superior cuando el tercer dígito de
la derecha sea cinco o mayor (por ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer
dígito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dígito con cero y el segundo
dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400):
Agrega al menos 3 imágenes de las actividades realizadas en el laboratorio
49
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
CUESTIONARIO
1. ¿Qué son las bacterias mesofilicas aerobias? _______________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
2. ¿Para qué nos sirve cuantificarlas? ________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
3. Investiga al menos 5 géneros de mesófilos aerobios presentes en alimentos
agregando una imagen de ellos
Elabora un cuadro PNI (positivo, negativo interesante):

50
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Conclusión y Discusión. (Éste apartado, se deberá redactar de manera individual)
A continuación, elabora un escrito, considerando los resultados obtenidos, la

muestra, límite máximo permisible, fuentes de información, aciertos y/o dificultades
en la toma de muestra y proceso, sugerencias, etc.; en este apartado, se utilizará la
evaluación por equipos (coevaluación), según el siguiente diagrama.
También deberá entregarse la tabla de cumplimiento siguiente:

En concenso, todos los integrantes del equipo decidiran el cumplimiento en las actividades
No Nombre del alummo % de cumplimiento
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
LIMITES PERMISIBLES DE MICROORGANISMOS EN DIVERSOS ALIMENTOS
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
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FOG 2.01
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FOG 2.01
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Tabla 1. Especificaciones microbiológicas establecidas para diversos alimentos.

ESPECIFICACIONES LÍMITE MÁXIMO
LECHE CRUDA
Microorganismos mesófilos aerobios y facultativos viables: Máx. 1 000 000 ufc/ml
**Fuente: NORMA TECNICA PERUANA NTP 202.001 Leche cruda: Requisitos de
calidad físicos, químicos y microbiológicos
LECHE PASTEURIZADA
Mesofílicos aerobios UFC/ml 30 000
Organismos Coliformes totales UFC/ml en planta 10
Organismos Coliformes totales UFC/ml en punto de venta 20
Salmonella spp en 25 ml Ausente
Staphylococcus aureus en 25 ml Ausente
Listeria monocytogenes en 25 ml Negativo
** Referencia: NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-091-SSA1-1994. BIENES Y SERVICIOS. LECHE PASTEURIZADA DE
VACA. DISPOSICIONES Y ESPECIFICACIONES SANITARIAS.
64
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
NOMBRE DEL PRODUCTO DETERMINACIONES LIMITE MÁXIMO

PERMISIBLE
Ensaladas verdes, crudas o de frutas * Mesofilos aerobios UFC/g 150,000
Coliformes totales NMP/g 100
Salsas y purés cocidos * Mesofilos aerobios UFC/g 5,000
Alimentos cocinados a base de carne de Mesofilos aerobios UFC/g 150,000

mamíferos, aves, pescados *
Coliformes totales NMP/g menos de 10
Aguas preparadas * Mesofilos aerobios UFC/g 150,000
Coliformes fecales NMP/g Negativo
Queso fresco ** Coliformes fecales NMP/g 100
Mohos y levaduras (UFC/g) 500
Salmonella en 25 g Ausente
Staphylococcus aureus (UFC/g) 1000
Listeria monocytogenes en 25 g Negativo
Zumos, néctares, bebidas a base de frutas y Mesofilos aerobios UFC/g 100,000

verduras no pasteurizadas ***
*NOM-093-SSA1-1994 ; ** NOM-121-SSA1-1994; *** Límites microbiológicos de la ICMSF

(International Commission on Microbiological Specifications for Foods).
Especificaciones microbiológicas en superficies vivas e inertes

Las superficies vivas e inertes que estén en contacto con los alimentos deben tener como
límites microbiológicos los siguientes:
2.1 Superficies vivas. Cuenta total de mesofílicos aerobios < 3 000 UFC/cm2 de superficie,
coliformes totales < 10 UFC/cm2 de superficie.
2.2 Superficies inertes. Cuenta total de mesofílicos aerobios < 400 UFC/cm2 de superficie,
Fuente de información: NOM-093-SSA1-1994

65
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
FUENTES DE MICROORGANISMOS EN LOS ALIMENTOS
Organizados en equipos los alumnos realizarán la exposición de los temas Fuentes de

Microorganismos en los Alimentos, para esto deberán ponerse de acuerdo con el profesor
para repartir los temas
66
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
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FOG 2.01
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FOG 2.01
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
COLIFORMES
Consulta la página http://es.wikipedia.org/wiki/Coliforme y contesta las siguientes
preguntas
1 ¿Qué son los coliformes y para qué se utilizan?
2 ¿Cuál es la bacteria principal del grupo y quien la descubrió?
3 ¿Qué propiedades bioquímicas tienen los coliformes?
4 ¿Cuál es el hábitat de los coliformes?
5 ¿Por qué se utilizan como indicadores?
6 ¿Qué bacterias integran el grupo de los coliformes?
7 ¿Cuál es la diferencia entre coliformes totales y coliformes fecales?
70
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
8 ¿Qué importancia tiene la E. coli?
9 ¿Qué relación tienen los coliformes con la higiene de los alimentos?
10 ¿Cuál es la clasificación científica de las bacterias coliformes?
En el siguiente cuadro escribe lo que aprendiste de los coliformes
71
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
PRACTICA No 3
DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA
(En Agua y Productos Alimenticios)
OBJETIVO: Cuantificar Coliformes totales en alimentos, utilizando el método para la cuenta

en placa
FUNDAMENTO:
La definición generalmente aceptada para el término “Coliformes” describe a estos
microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios
facultativos que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas, aunque algunos pueden
ser fermentadores tardíos o no fermentadores, como Citrobacter y Serratia, respectivamente.
La mayoría de los Coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto digestivo del
hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las heces, por ejemplo
Escherichia coli. Por esta razón, su presencia constante en la materia fecal, los Coliformes
son el grupo más ampliamente utilizado en la microbiología de alimentos como indicador de
prácticas higiénicas inadecuadas.
Como los Coliformes también pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre Coliformes
totales y Coliformes fecales. Esta práctica se refiere a Coliformes totales. El uso de los
Coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:
• La detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricación de los
alimentos.
• La evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su presencia no
necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los Coliformes son de origen no-
fecal.
• Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas en el equipo.
• La calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las diferentes
áreas del procesamiento de alimentos.
La demostración y la cuenta de microorganismos Coliformes, puede realizarse mediante el
empleo de medios de cultivos líquidos o sólidos con características selectivas o diferenciales.
Para la cuenta en placa se usa el agar-lactosa-bilis-rojo violeta (ABRV).
Los Coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan en
ABRV, el ácido producido por la fermentación de la lactosa, ocasiona el vire del indicador
rojo neutro y la precipitación de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro
y generalmente están rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro
72
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
o rosa. La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersión y separación,

como se explicó en la técnica de preparación de diluciones.
NOTAS:
Cuando se utiliza el medio de Agar bilis rojo violeta (ABRV) para la cuenta en placa de
Coliformes, debe considerarse lo siguiente:
• Si el alimento contiene mono o disacáridos en altas concentraciones, éstos pueden
ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando colonias semejantes
a las de Coliformes.
• El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar antes de
3 h. a partir de su preparación; en cuanto se disuelva el agar se debe colocar en baño
de agua a 45 °C para mantenerlo fundido, hasta el momento de utilizarlo.
• Debe ponerse una sobrecapa de medio una vez que las placas vertidas han
solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, más adecuadas para
los Coliformes.
• El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de incubación,
especialmente la incubación prolongada, pueden ocasionar la formación de colonias
rojas de cocos Gram positivos.
• El rango estadístico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (de sensibilidad
del método) es de 15 a 150 UFC por placa.
• El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente
hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas con las muestras
de diluciones, no debe exceder de 20 minutos.
• La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a
inocular, dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con
base a los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga del
personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de información,
trabajar con las diluciones de la primera a la sexta. (NOM-110-SSA1-1994
Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico)
73
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
MATERIALES:
MATERIAL EQUIPO REACTIVOS MUESTRAS
• 1 Par de guantes de Balanza granataria. ** Agar bilis • Todo tipo de alimentos
asbesto Autoclave rojo violeta naturales o procesados
• 7 cajas petri Incubadora co n (ABRV)
• 4 Tubos 16 X 150 mm con termostáto. • Alimentos líquidos, sólidos
** Agua
tapón de rosca conteniendo Contador de colonias o semisólidos.
peptonada
9 ml de solución diluyente** de campo oscuro, con
como diluyente
• 4 o 5 Pipetas de 10 o 5 ml luz adecuada, placa de • Ingredientes o materias
• 1 matraz erlenmeyer para cristal cuadriculada y primas
preparar el medio de cultivo lente amplificador.
• 1 Matraz erlenmeyer para • Entre otros.
dilución primaria (cuando
aplique)
• 1 probeta de 50 o 100 ml
• Algodón, Gasas
• Papel de estraza
• Cinta Masking tape
• 1 clip
• 3 mecheros bunsen
• Cofia o malla
• Cubre bocas
• Pizeta
**Preparar la Solución Diluyente (Agua peptonada)

FORMULA
INGREDIENTES CANTIDADES
Peptona 1,0 g
NaCl 8,5 g
Agua 1,0 l
Preparación:
 Disolver los componentes en un litro de agua.
 Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N.
74
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
 Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve

según se requiera.
 Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C.
Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser
iguales a los iniciales.
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro (cubrir con papel
aluminio) a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en
condiciones tales que no alteren su volumen o composición.
PROCEDIMIENTO
1. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la técnica NOM-110-
SSA1-1994 Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis
Microbiológico. Recordar que el rango de sensibilidad del método es de 15 a 150
colonias por placa.
2. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación y la
adición de medio de cultivo se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las
bases de las cajas con los datos pertinentes antes de colocar el inoculo.
3. Inocular por duplicado, 1.0 ml de la dilución correspondiente en cada caja, mediante
pipeta estéril y verter de 15.0 a 20.0 mL del medio ABRV fundido y mantenido a 45 ±
1.0°C en baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución
primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20
minutos.
4. Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio, mediante seis movimientos de
derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis
movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para
adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique
dejando las cajas Petri sobre una superficie horizontal fría. No permitir que se mojen
las tapas de las cajas.
5. En cuanto el medio solidifique, agregar a cada caja, una sobrecapa de 4 ó 5 ml del
mismo medio fundido y mantenido a 45 °C, no permitir que se mojen las tapas de las
cajas. La sobrecapa de agar se coloca para favorecer el crecimiento de los
Coliformes, que son facultativos. Dejar que solidifique.
6. Preparar una caja control con 15.0 a 20.0 ml de medio para verificar la esterilidad.
75
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
7. Solidificado el medio invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante

24 ± 2 h.
8. Después de este periodo, contar las colonias con el contador de colonias. Seleccionar
las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color
rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido
a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es
semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0.5 a 2.0 mm.
9. Si hay desarrollo extendido o un número de colonias superior al del rango de
sensibilidad del método, aplicar las reglas indicadas en NOM-092-SSA1-1994 Método
para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Hacer uso del microscopio para
resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeñas
partículas de alimento.
EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Considerar los ejemplos de la NOM-092-SSA1-1994, solo tomar en cuenta el nuevo número de
colonias
Mesa No. 1
Muestra:
Mesa No. 2
Muestra:
Mesa No. 3
Muestra:
76
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Mesa No. 4
Muestra:
Mesa No. 5
Muestra:
Mesa No. 6
Muestra:
Reportar como se indica a continuación, con dos cifras significativas

___________________ UFC / g (o / mL) de Coliformes totales en placas de agar bilis rojo
violeta, incubadas por 24 + 2 h a 35 ºC
Morfología bacteriana
Por equipo seleccionaran 2 colonias bacterianas y las describirán según las características
del siguiente cuadro
COLONIA 1
Tamaño Color Forma Borde Elevación Superficie Aspecto Consistencia Producción
de pigmento
COLONIA 2
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Características consideradas para describir colonias bacterianas:
Tamaño: Se mide en mm y puede variar desde colonias puntiformes hasta algunas que
pueden llegar a medir 10 mm, o incluso algunas especies cubren toda la superficie de la
caja
Color: Pueden ser de diferentes colores, esto también puede depender del medio de cultivo
que se utilice.
Forma: puede ser puntiforme, granular, rizoide, irregular, filamentosa, circular, etc.
Borde: Puede ser rizado, filamentoso, dentado, lobulado, ondulado, entero, etc.
Elevación: Puede ser plana, elevada, acojinada, umbilicada, invaginada
Superficie: Puede ser lisa, rugosa o granulada.
Aspecto: Húmedo o seco
Luz reflejada: Brillante o mate.
Luz transmitida: Transparente, translucida y opaca
Consistencia: Suave o dura; esta característica se determina, tocando la colonia con el asa
y por lo tanto, debe ser la última en describirse
Producción de pigmento: Algunas bacterias lo producen, y puede difundirlo a todo el medio
o en la periferia de la colonia formando un halo
Tinción de Gram
Descripción
Descripción
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
CUESTIONARIO
Elabora un cuadro PNI (positivo, negativo interesante):

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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Conclusión y Discusión. (Éste apartado, se deberá redactar de manera individual)
A continuación, elabora un escrito, considerando los resultados obtenidos, la

muestra, límite máximo permisible, fuentes de información, aciertos y/o dificultades
en la toma de muestra y proceso, sugerencias, etc.; en este apartado, se utilizará la
evaluación por equipos (coevaluación), según el siguiente diagrama.
También deberá entregarse la tabla de cumplimiento siguiente:

En concenso, todos los integrantes del equipo decidiran el cumplimiento en las actividades
No Nombre del alummo % de cumplimiento
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
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FOG 2.01
Investiga y menciona de que trata la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-112-SSA1-1994,

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Investiga y menciona de que trata la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-093-SSA1-1994
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En este espacio escribe toda la información que contenía la etiqueta de muestreo
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FOG 2.01
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FOG 2.01
ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS
¿ETA ó aquella?
¿Sabes que es una ETA?

Consulta la siguiente dirección:
http://basica.sep.gob.mx/tiempocompleto/pdf/alimentacion/ETAs_SEP_2008.pdf
Contesta las siguientes preguntas en el espacio correspondiente:
1 ¿Cuál es el objetivo de las diapositivas mostradas en el trabajo anterior?
R=
2 Las ETA´s son causadas por la ingestión de cualquier alimento contaminado por:
1.
2.
3.
4.
3 Revisa la diapositiva 6 y escribe las 10 acciones o situaciones más comunes que
pueden originar ETA´s
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
4 ¿Cuál de las acciones o situaciones anteriores tu consideras más importante? ¿Por
qué?
R=
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
5 ¿Cómo influyen la Tierra, el Aire, el Agua contaminada, la Basura, la Fauna nociva, los
Alimentos crudos, el Ser humano y los Utensilios y trapos en la transmisión de ETA´s?
describe brevemente
R=
6 ¿Qué es una epidemia de ETA´s? ¿Quiénes son los más susceptibles?

R=
7 Analiza la diapositiva número 24 y escribe que mensaje te deja
R=
8 ¿Qué es el Vibrio cholerae?
R=
9 ¿Cuáles son los factores químicos que contaminan alimentos?
R=
10 ¿Cuáles son los factores físicos que contaminan alimentos?
R=
11 ¿Qué es la contaminación cruzada?
R=
12 ¿Qué aspectos se deben supervisar para evitar una contaminación cruzada?
R=
13 ¿Cuál es la diferencia entre infección e intoxicación?
R=
14 De las siguientes enfermedades: Hepatitis A, Cisticercosis, Triquinosis, Angina de
Vincet, Teniasis, Cólera, Disentería, Salmonelosis, Tifoidea y paratifoidea, Listeriosis,
Disenteria
Elige una de ellas e investiga en internet un caso que te llame la atención de algún
suceso histórico, a continuación describes brevemente lo que ocurrió y al final agregas
la dirección de internet donde encontraste la información
Para saber más…

Consulta: http://cofepris.blogspot.mx/2011/11/sabes-que-es-una-eta.html
Imprime el folleto y muéstralo al profesor.
Un género de microorganismos, de gran importancia en los alimentos, son los coliformes

Consulta la página: http://es.wikipedia.org/wiki/Coliforme y contesta las siguientes
preguntas
1 ¿Qué son los coliformes y para qué se utilizan?
R=
2 ¿Cuál es la bacteria principal del grupo y quien la descubrió?
R=
3 ¿Qué propiedades bioquímicas tienen los coliformes?
R=
4 ¿Cuál es el hábitat de los coliformes?
R=
5 ¿Por qué se utilizan como indicadores?
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
R=
6 ¿Qué bacterias integran el grupo de los coliformes?
R=
7 ¿Cuál es la diferencia entre coliformes totales y coliformes fecales?
R=
8 ¿Qué importancia tiene la E. coli?
R=
9 ¿Qué relación tienen los coliformes con la higiene de los alimentos?
R=
10 ¿Cuál es la clasificación científica de las bacterias coliformes?
R=
¿Conoces a la Escherichia coli?, hazlo en… Coliformes

http://www.youtube.com/watch?v=uJC9mBoi4mk#
E. coli (Una historia real) http://www.youtube.com/watch?v=Y6W dX7AmsuI
En el siguiente espacio describe a la Escherichia coli
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
PRACTICA No. 4
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE SUPERFICIES EN CONTACTO CON ALIMENTOS
Y BEBIDAS
OBJETIVO: Aprender el procedimiento que se debe aplicar en la selección, toma de muestras

y análisis microbiológicos de superficies vivas e inertes.
FUNDAMENTO: Para realizar esta prueba, es conveniente considerar las siguientes

definiciones:
Hisopo: Instrumento que tiene un extremo recubierto de algodón o de rayón estéril que se
utiliza humedecido con solución diluyente para facilitar la recuperación bacteriana, en el
muestreo de superficies.
Manipulador de alimentos: Toda persona que a través de sus manos toma contacto directo con
alimentos envasados o no envasados, equipos y utensilios utilizados para su elaboración y
preparación o con superficies que están en contacto con los alimentos.
Superficies inertes: Son todas las partes externas y/o internas de los utensilios que están en
contacto con los alimentos, por ejemplo equipos, mobiliario, vajilla, cubiertos, tabla de picar,
etc.
Superficies vivas: Las partes externas del cuerpo humano que entran en contacto con el
equipo, utensilios y alimentos durante su preparación y consumo. Para efectos de la presente
Prueba, se considera a las manos con o sin guantes del manipulador de alimentos.
Vigilancia sanitaria: Conjunto de actividades de observación y evaluación que realiza la
Autoridad Sanitaria sobre las condiciones sanitarias de las superficies que están en contacto
con los alimentos y bebidas, en protección de la salud de los consumidores.
Operaciones en campo: Las operaciones en campo son aquellas que se realizan en el
establecimiento donde se procesan, elaboran, almacenan, fraccionan o expenden alimentos y
bebidas, sea fábrica, almacén, servicios de alimentos, quiosco, puesto, comedor, u otro.
Selección del método de muestreo

La selección del método de muestreo debe estar en función de las características de la
superficie a muestrear.
MÉTODO DE SUPERFICIES A MUESTREAR

MUESTREO
Método del Se utiliza para superficies inertes regulares e irregulares, tales como tabla
Hisopo de picar, bandejas, mesas de trabajo, utensilios, cuchillas de equipos,
cortadora de embutidos, cortadora de pan de molde, fajas transportadoras,
tolvas, mezcladoras, pisos, paredes y otros.
Método de la El método de la esponja se utiliza preferentemente para muestrear
Esponja superficies de mayor área.
Método del Se utiliza para superficies vivas (manos) y para objetos pequeños o para
Enjuague el muestreo de superficies interiores de envases, botellas, bolsas de
plástico, etc.
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Procedimiento para la toma de muestra por el Método del hisopo

a) Descripción:
Consiste en frotar con un hisopo estéril previamente humedecido en una solución diluyente, el
área determinada en el muestreo.
b) Materiales:
 Hisopos de algodón u otro material equivalente, de largo aproximado de 12 cm.
 Tubo de ensayo con tapa hermética conteniendo 10 ml de solución diluyente estéril. Se
agregará una solución diluyente con neutralizante como alternativa. (puede ser agua
peptonada o alguna otra solución).
 Plantilla estéril, con un área abierta en el centro de 100 cm2 (10cm x 10cm) o
alternativamente, plantilla estéril, con un área abierta en el centro de 25 cm2 (5 cm x 5
cm).
 Guantes descartables de primer uso.
 Malla o protector de cabello.
 Cubreboca.
 Plumón marcador indeleble (para vidrio).
 Caja térmica o hielera.
 Refrigerantes o hielo
 Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA)
c) Procedimiento:
Muestreo de superficies.
Colocar la plantilla o bien delimitar un área aproximada de 5,0 x 5,0 cm ó 10,0 x 10,0
cm sobre la superficie que se va a muestrear. Sacar el hisopo asépticamente. Si la superficie
está seca, humedecer el hisopo en la solución diluyente y presionar contra la pared del frasco o
tubo con un movimiento de rotación para quitar el exceso de líquido, en caso contrario no es
necesario hacer esto.
Con el hisopo inclinado (en un ángulo de 30º), frotar la superficie delimitada por la plantilla en
3 sentidos diferentes (horizontal, vertical y oblicuo). Regresar el hisopo al tubo o frasco y
romper la parte que estuvo en contacto con los dedos.
Este método también puede utilizarse para buscar patógenos, substituyendo la solución
diluyente por el caldo de cultivo adecuado.
Muestreo de utensilios de comedor.

Utilizar tubos con l0,0 ml. Tomar un hisopo, mojarlo en la solución diluyente y exprimir el
exceso de líquido sobre la pared del tubo. Tomar la muestra del utensilio con el hisopo
tratando de tomar de la superficie que está en contacto con el alimento o con la boca. Regresar
el hisopo al tubo y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos. Una vez tomada la
muestra, se procede a hacer el recuento, por el método más adecuado, generalmente cuenta en
placa, con los medios de cultivo recomendados para el grupo bajo estudio.
Método de enjuague total

Este método se emplea para tomar muestras de objetos pequeños como son cucharas,
tenedores, biberones, etc. o para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas y
bolsas de plástico, etc.
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Superficies interiores.
Introducir en el envase o bolsa que se va a muestrear 10,0 mL o el volumen adecuado de
solución diluyente. Enjuagar haciendo correr el líquido por toda la superficie, agitar bien.
Regresar el contenido de los envases al frasco.
Notas:
 Para superficies irregulares, en el caso de utensilios, se repetirá la operación con 3
utensilios más (total 4 como máximo), con el mismo hisopo, considerando el área que
está en contacto con el alimento o con la boca.
 Si no se toman las 4 muestras, se debe anotar en la Ficha de Toma de Muestra.
Manos de personal
Cuenta total de Mesofílicos aerobios < 3 000 UFC/manos < 1 500 UFC/mano
Cuenta de coliformes totales < 10 UFC/manos < 5 UFC/mano
Es posible decidir sobre el nivel de contaminación que prevalece sobre las manos del operario.
Tomar un hisopo y sumergirlo en la solución diluyente retirando el exceso de líquido. Limpiar
bien la superficie de la palma de la mano, así como la superficie interna de dedos y uñas.
Repetir la operación tomando muestra de la otra mano. Regresar el hisopo nuevamente al tubo
y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos.
d) Conservación y Transporte de la muestra

Las muestras se colocarán en un contenedor isotérmico con gel refrigerante, el cual se
distribuirá uniformemente en la base y en los laterales, para asegurar que la temperatura del
contenedor no sea mayor de 10°C, a fin de asegurar la vida útil de la muestra hasta su llegada
al laboratorio. El tiempo de transporte entre la toma de muestra y la recepción en el laboratorio
estará en función estricta de dicha temperatura, no debiendo exceder las 24 horas y
excepcionalmente las 36 horas.
Se deberá registrar la temperatura del contenedor al colocar las muestras y a la llegada al
laboratorio con la finalidad de asegurar que las mismas hayan sido transportadas a la
temperatura indicada. Las temperaturas superiores a 10 °C invalidan la muestra para su
análisis.
ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS
1. Transferir volúmenes de 1,0 ml de la muestra o diluciones, a cajas de Petri marcadas

con la clave, fecha, medio de cultivo y dilución inoculada.
2. Agregar el medio de cultivo seleccionado:
• Agar triptona extracto de levadura para cuenta de mesofílicos aerobios
• Agar bilis rojo violeta para cuenta de organismos coliformes totales. Añadir una
doble capa del mismo medio de cultivo una vez solidificada la primera capa, para
crear condiciones de anaerobiosis.
• Agar papa dextrosa acidificado para cuenta de hongos y levaduras. Acidificar a un
pH de 3.5 +/- 0,1 con ácido tartárico estéril a 10,0% (aproximadamente 1,4 ml de
ácido tartárico por cada 100,0 mL del medio).
92
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Cálculo y expresión de resultados

a) Cálculo
Para superficies regulares: el número de colonias obtenidas (ufc) se multiplicará por el factor
de dilución y por el volumen de solución diluyente utilizada en el muestreo (10 ml) y se
dividirá entre el área de la superficie hisopada o muestreada (100 cm2).
Para superficies irregulares: el número de colonias obtenido (ufc) se multiplicará por el factor
de dilución y por el volumen de la solución diluyente usada.
b) Expresión de resultados
Los resultados se expresarán:
- Para superficies regulares en: ufc / cm2:
- Para superficies irregulares en: ufc/ superficie muestreada (ej. cuchilla de licuadora, cuchara,
etc.). Se deberá expresar la cantidad de superficies muestreadas. (ej. ufc/ 4 cucharas).
c) Interpretación de resultados de acuerdo a los límites microbiológicos SEGÚN LA

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-093-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS.
PRACTICAS DE HIGIENE Y SANIDAD EN LA PREPARACION DE ALIMENTOS
QUE SE OFRECEN EN ESTABLECIMIENTOS FIJOS
2. Especificaciones microbiológicas en superficies vivas e inertes
Las superficies vivas e inertes que estén en contacto con los alimentos deben tener como
límites microbiológicos los siguientes:
2.1 Superficies vivas. Cuenta total de mesofílicos aerobios < 3 000 UFC/cm2 de superficie,
2.2 Superficies inertes. Cuenta total de mesofílicos aerobios < 400 UFC/cm2 de superficie,
(**) Indicar el área muestreada, la cual debe ser mayor o igual a 100 cm2.
RESULTADOS
Mesa No. 1
Nombre o domicilio del lugar muestreado:

Utensilio o RESULTADOS
superficie Superficie viva Superficie inerte Método de enjuague
muestreada
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Mesa No. 2

muestreada
Mesa No. 3

muestreada
Mesa No. 4

muestreada
Mesa No. 5

muestreada
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Mesa No. 6

muestreada
CUESTIONARIO
Agrega al menos 3 imágenes de la toma de muestras
95
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
En este espacio escribe toda la información que contenía la etiqueta de muestreo
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
PRACTICA No 5
Determinación de bacterias Coliformes totales y Coliformes fecales en hielo y agua para
consumo humano, mediante la técnica del Número Más Probable (NMP), usando tubos de
fermentación múltiple
OBJETIVO:
Investigar la presencia de bacterias del grupo Coliforme en agua de consumo humano

mediante la técnica del Número Más Probable (NMP), usando tubos de fermentación
múltiple.
INTRODUCCION
La potabilidad del agua es de gran importancia en cuanto a Salud Pública, ya que ésta
puede servir como vehículo de microorganismos patógenos, es decir, productores de
enfermedades llamadas comúnmente "de origen hídrico" tales como Salmonelosis (Tifoidea y
Paratifoidea), Shigelosis, Cólera, Hepatitis, etc. Estos microorganismos son todos de origen
entérico.
Se sabe que los microorganismos patógenos que llegan a los depósitos de agua, proceden
de las descargas intestinales de hombres y animales. Además, ciertas especies de bacterias,
particularmente Escherichia coli, y varios microorganismos similares, denominados
coliformes, Estreptococos fecales (como Streptococcus faecalis) y Clostridium perfringens,
son habitantes normales del intestino grueso de hombres y animales y en consecuencia
siempre están en las materias fecales.
Así pues, la presencia de cualquiera de estas especies en el agua es evidencia de
contaminación fecal y el camino está abierto a los patógenos ya que se encuentran en las
materias fecales.
La evaluación rutinaria del agua en busca de microorganismos patógenos, como Salmonella
spp. y Shigella spp. puede ser difícil de realizar ya que el número de estas bacterias es
relativamente escaso, por lo que se tiene que recurrir a pruebas bacteriológicas del agua
potable que demuestren la presencia de microorganismos indicadores que siempre estén
presentes en materia fecal, fácil de demostrar y que sirva de guía para conocer el grado de
contaminación fecal.
Surge así el concepto de "Indicador de contaminación fecal", el cual será utilizado para la
valoración de la potabilidad bacteriológica de las aguas. De acuerdo con lo anterior, se ha
adoptado con carácter general, el "Grupo Coliforme" como indicador más digno de confianza
en MICROBIOLOGIA APLICADA.
97
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Según la OMS el grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos
Gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa
con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está
conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y
Klebsiella.
El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de

fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este
grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia
coli, todas ellas de claro origen fecal e indicadores de contaminación fecal reciente.
Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades
diarreicas. Estas E. coli se clasifican con base en las características que presentan sus
factores de virulencia únicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo
diferente. Las propiedades de adherencia a las células epiteliales de los intestinos grueso y
delgado son codificadas por genes situados en plásmidos. De manera similar las toxinas son
mediadas por plásmidos o fagos.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas:
 Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC),
 Escherichia coli enteropatógena (EPEC),
 Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC),
 Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC),
 Escherichia coli enteroagregativa (EAEC)
 Escherichia coli enteroadherente difusa (DAEC).
Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores,
las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y
alimentos contaminados
En cuanto a la investigación de patógenos en agua, no existe un método único que permita

aislar e identificar todos estos microorganismos. En general, los métodos con los que se
obtienen mejores resultados comprenden una fase de concentración, seguida de técnicas de
enriquecimiento y aislamiento específicas para cada microorganismo.
98
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
El procedimiento para la recolección de las muestras de agua para el análisis bacteriológico,

depende del tipo de agua que se desee muestrear. Este se hará de acuerdo a la
normatividad mexicana vigente.
FUNDAMENTO
Las muestras para el análisis bacteriológico, se deben tomar en frascos muestreadores que
se hayan lavado con extremo cuidado y esterilizado. En su interior añadir, previo a la
esterilización, 0.1 ml de solución de Na2S2O3 (tiosulfato de sodio) al 10%, por cada 120 ml de
muestra con el propósito de neutralizar la acción del cloro que pudiera contener la muestra,
cubriendo además el tapón del frasco hasta el cuello con papel aluminio.
El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después de su

recolección. Es por ello que se recomienda que de no efectuarse así el análisis, se inicie
dentro de las dos horas próximas a la recolección de la muestra y en ningún caso, este lapso
debe de exceder de 24 horas para agua potable y de 6 horas para otros tipos de agua para
que sea válido el resultado del análisis.
Durante el período que transcurre del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra a 4
°C, con objeto de inhibir la actividad bacteriana para no obtener resultados falsos o dudosos
El método se basa en la inoculación de alícuotas de la muestra sin diluir que pueden ser
volúmenes de 50, 10 y 1 ml, ó de 10, 1 y 0.1 ml, o diluida en caso necesario, en una serie de
tubos por triplicado o quintuplicado con un medio que contiene lactosa (caldo lactosado o
caldo lauril triptosa).
La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más
Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la
lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C ± 1°C durante 24 - 48 h.,
posteriormente se utiliza un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación
consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa.
La valoración del contenido microbiano de una muestra de agua por el método del NMP
supone la utilización de tablas numéricas que tienen en cuenta los volúmenes de agua y las
cantidades de tubos sembrados en una ó más series. Realmente consiste en tratar
estadísticamente el número de tubos de cada serie sembrada que resulten positivos después
de su incubación
99
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el
cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes
en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la
fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el
cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar
tanto las sales biliares como el verde brillante.
La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza

a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de
las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una
temperatura de 44.5 ± 0.1°C por un periodo de 24 a 48 h.
La búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los
cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey,
Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas
(IMViC) a las colonias típicas
MATERIAL EQUIPO REACTIVOS MUESTRA

• 1 Par de guantes de • Balanza analítica  Caldo • Equipos 1, 2 y 3 Hielo
asbesto y/o granataria. lactosado potable
• 15 Tubos 16 X 160 mm • Autoclave (para la • Equipos 4, 5 y 6 agua
con tapón de rosca • Incubadora co n prueba potable de
• 2 Pipetas de 10 ml termostáto. presuntiva) contenedores, no
• 2 pipetas de 1 ml  Caldo envasada
• 1 matraz erlenmeyer En caso de análisis a lactosa bilis
para preparar el caldo alimentos sólidos, podrían verde Cuando el análisis re
lactosado requerirse algunos otros brillante realice en alimentos
• 1 probeta de 50 o 100 ml materiales como (para la sólidos o líquidos, deberán
• Cinta testigo o Masking • Licuadora estéril o prueba tomarse en consideración
tape Bolsa W HIRL-PAK confirmatoria los procesos ya vistos.
• 1 clip )
• 3 mecheros bunsen  Caldo EC
• Cofia o malla
• Cubre bocas
100
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
• Piseta
• 1 Vidrio de reloj
• 1 Espatula
• 1 Gradilla
• 1 Vaso de precipitado de
500 ml
• 1 Frasco de vidrio de 250
ml con tapón de rosca.
• Utensilios esterilizables
para la obtención de
muestras solidas:
cuchillos, pinzas, tijeras,
cucharas, espátulas,
etc.,
• Campanas de
fermentación (tubos de
Durham).
• Gradillas.
• Asa de platino o nicromel
de aproximadamente 3
mm de diámetro.
• Portapipetas
PROCEDIMIENTO:
La técnica del NMP comprende siempre una prueba presuntiva y otra confirmativa;
posteriormente se puede hacer una siembra en placa y finalmente se identifican los
microorganismos con pruebas bioquímicas
Esto es así porque una positividad en un tubo de la prueba presuntiva no indica
necesariamente la presencia del grupo bacteriano a determinar (Coliformes Totales,
Coliformes Fecales o Estreptococos Fecales), sino tan solo es una presunción, que habrá de
confirmarse posteriormente.
Sin embargo, una negatividad en la prueba presuntiva permite dictaminar la ausencia de
dicho grupo bacteriano en el agua examinada.
La denominada prueba presuntiva consiste en una metodología de tipo general para
cualquier grupo de bacterias, mientras que la prueba confirmativa es específica.
101
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
PRUEBA PRESUNTIVA:
Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de asepsia.
1. Preparar tres series sucesivas de 3 o 5 tubos con 10 ml caldo lactosado, una de doble
concentración y las otras dos de concentración sencilla.
2. Etiquetar las series con 10, 1 y 0.1 ml.
3. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces antes de tomar el volumen que se
va a inocular, a efecto de homogeneizar.
4. Antes y después de realizar las inoculaciones, la boca del frasco de la muestra deberá ser
flameada con objeto de evitar contaminación.
5. Inocular con una pipeta de 10 ml este volumen de muestra en la serie de tubos con caldo
de doble concentración, con otra pipeta de 1 ml para 1 ml de muestra en la segunda serie de
tubos con concentración sencilla.
6. Igualmente con la misma pipeta podrá inocularse la tercera serie de tubos con 0.1 ml de
muestra. Normalmente, siempre que no se sospecha que el agua contenga elevada carga
bacteriana, solo se inoculan estas tres primeras series de tubos. En caso contrario, será
necesario inocular otras series y por lo tanto, realizar diluciones de la muestra original.
7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 °C durante 24 - 48 horas.
8. Después de 24 horas de incubación efectuar una primera lectura para observar si hay
tubos positivos, es decir, con producción de ácido, si el medio contiene un indicador de pH,
turbidez y producción de gas en la campana Durham. Al hacer esta verificación es importante
asegurarse que la producción de gas sea resultado de la fermentación de la lactosa en cuyo
caso se observará turbidez en el medio de cultivo y no confundir con burbujas de aire.
Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las campanas Durham antes
de proceder a la inoculación y desechar aquellos que contengan burbujas de aire ó de
alguna manera eliminar éstas y así poder utilizarlos.
9. De los tubos que en esta primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas
confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales.
10. En caso de no apreciarse alguno o todos los cambios mencionados en el resto de los
tubos, continuarán en incubación 24 horas más.
11. Después de 48 horas (±2h) a partir de la inoculación, se hace la lectura final.
12. Si pasadas estas 48 h tampoco se aprecia turbidez ni producción de gas, los tubos se
toman como negativos.
102
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
INTERPRETACION:
· Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la
AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada.
· Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarán
convenientemente y se procederá a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA para Coliformes
Totales y Fecales.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES:
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva,
agitándolos previamente para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo
caldo Lactosa Bilis Verde Brillante.
2. Incubar durante 48 ± 3 h a 35 ± 0.5 °C.
3. Después de la incubación observar la presencia de turbidez y de gas.
INTERPRETACION:
· Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo
anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP.
· Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez:
Se consideran negativos, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo del NMP.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES:
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva,
agitándolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo E.C.
(Escherichia coli).
2. Incubar durante 24 horas a 44 °C (±0.5 °C), observar presencia de turbidez y gas.
INTERPRETACION:
· Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo
anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP.
· Si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: Se reporta la
AUSENCIA DE COLIFORMES FECALES
**NOTAS:
1. De los tubos que resultaron positivos en CT y CF se puede hacer una siembra en
placa, utilizando Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno y posteriormente se
realizan las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.
2. Si la muestra, en lugar de ser agua es un alimento (sólido o liquido) primeramente se
realizan las diluciones y luego se procede de la misma manera que para agua potable
103
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
DIAGRAMA DE FLUJO
Muestra: Agua, hielo o alimentos
Prueba presuntiva, incubar a 35 °C 24 - 48 hrs. (5 tubos a doble concentración)
Agregar 10 ml de muestra Agregar 1 ml de muestra Agregar 0.1 ml de muestra
Los tubos que resultan positivos después de la incubación se inoculan en caldo Lactosa Bilis Verde
Brillante con 2 a 3 asadas/tubo para determinar la prueba confirmatoria para coliformes totates y los
mismos tubos positivos se inoculan ahora en caldo EC para determinar la prueba confirmatoria para
coliformes fecales
Prueba confirmatoria para coliformes totales se incuba a 35 °C por 24-48 hrs.
Se cuenta el número de tubos positivos y se lee el NMP en la tabla de resultados (ejemplo 0,1, 0, = 2)
Prueba confirmatoria para coliformes fecales se incuba a 44 °C por 24 hrs.
Se cuenta el número de tubos positivos y se lee el NMP en la tabla de resultados (1,1,0, = 4)
Si la prueba es positiva en el caldo EC, se realiza una siembra en placa en Agar Mac Conkey, Agar
eosina azul de metileno) y posteriormente se realizan las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las
colonias típicas
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
RESULTADOS
Para obtener los resultados, se deberá consultar alguna de las siguientes tablas,
dependiendo si la serie es de 3 o 5 tubos, en caso de que la serie no se encuentre, se
utilizará la fórmula para calcularlos
105
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
PRUEBA DE COLIFORMES TOTALES

Muestra:
Tubos (+) 10 ml Tubos (+) 1 ml Tubos (+) 0.1 ml Resultado
NMP/100 ml
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
PRUEBA DE COLIFORMES FECALES

Muestra:
Tubos (+) 10 ml Tubos (+) 1 ml Tubos (+) 0.1 ml Resultado
NMP/100 ml
En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos adecuada, emplear para los
cálculos la siguiente ecuación:
NMP/100 ml = No.De tubos positivos x 100___________________________________

√ml demuestra en tubos negativos X ml de muestra en todos los tubos
Ejemplo: En una serie de 5 tubos, los resultados fueron los siguientes: 1, 2, 3
No tubos positivos= 6
ml de muestra en tubos negativos= 40 ml + 3 ml + 0.2 ml= 43.2 ml
ml de muestra en todos los tubos= 50 ml + 5 ml + 0.5 ml=55.5 ml
NMP/100 ml = 6(100)________ = 12.2535 = 12

√(43.2 X 55.5)
TABLA 1.- Límites permisibles de coliformes totales y fecales en agua potable

CARACTERISTICA LÍMITE PERMISIBLE
Organismos coliformes totales 2 NMP/100 ml
2 UFC/100 ml
Organismos coliformes fecales No detectable NMP/100 ml
Cero UFC/100 ml
Fuente: NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-127-SSA1-1994, "SALUD AMBIENTAL, AGUA PARA USO Y CONSUMO
HUMANO-LIMITES PERMISIBLES DE CALIDAD Y TRATAMIENTOS A QUE DEBE SOMETERSE EL AGUA PARA SU
POTABILIZACION".
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Los límites permisibles para alimentos son los siguientes
NOMBRE DEL PRODUCTO DETERMINACIONES LIMITE MÁXIMO

PERMISIBLE
Ensaladas verdes, crudas o de frutas * Mesofilos aerobios UFC/g 150,000
Salsas y purés cocidos * Mesofilos aerobios UFC/g 5,000
Alimentos cocinados a base de carne de Mesofilos aerobios UFC/g 150,000

mamíferos, aves, pescados *
Coliformes totales NMP/g menos de 10
Aguas preparadas * Mesofilos aerobios UFC/g 150,000
Coliformes fecales NMP/g Negativo
Queso fresco ** Coliformes fecales NMP/g 100
Mohos y levaduras (UFC/g) 500
Salmonella en 25 g Ausente
Staphylococcus aureus 1000

(UFC/g)
Negativo
Listeria monocytogenes en
25 g
Zumos, néctares, bebidas a base de frutas y Mesofilos aerobios UFC/g 100,000

verduras no pasteurizadas ***
*NOM-093-SSA1-1994 ; ** NOM-121-SSA1-1994; *** Límites microbiológicos de la ICMSF

(International Commission on Microbiological Specifications for Foods).
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
CUESTIONARIO
4. Investiga las Pruebas del IMViC elabora un cuadro donde describas ¿Qué son?
¿Para qué se utilizan? ¿Cómo se hacen?, etc.
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
5. Consulta la NORMA Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002 y haz un resumen de ella
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Fuentes:
 http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Colif-tot-fecales-
Ecoli-NMP_6529.pdf
 http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/P7_NMPcoliformes_19617.pdf
 NOM-112-SSA1-1994
 NOM-AA-42-1987
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Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
FICHAS TECNICAS
MICROBIOLOGIA SANITARIA Y DE ALIMENTOS
Instrucciones:
1. Elabora una ficha técnica por cada microorganismo que se presenta en la siguiente lista,
utilizando el formato que se presenta a continuación.
Lista del nombre del microorganismo o genero microbiano para elaborar las fichas técnicas:
Salmonella tiphy Salmonella paratyphi Escherichia coli
Shigella Vibrio Cholerae Streptococcus faecalis
Clostridium perfringens Aspergillus Candida albilcans
Penicillium Sacharomyce cerivisiae Neisseria gonorrhoeae
2. Guarda el archivo en tu PC o en tu USB

3. Puedes elaborar las fichas en word, posteriormente imprimir y anexar a tu manual (ver el
ejemplo)
Nombre, grupo y fecha de quien elabora la ficha:
NOMBRE O GENERO DEL MICROORGANISMO:

Salmonella tiphy
INDICA CON UNA X QUE TIPO DE MICROORGANISMO ES:
Bacteria__, Hongo__, Levadura__, “Virus”__, Protozoario__, Alga__
IMÁGENES:
DESCRIPCIÓN O DEFINICION:
PROBLEMAS QUE PUEDE OCASIONAR
BENEFICIOS
COMO SE PUEDE DESTRUIR O CULTIVAR
ALIMENTOS O PRODUCTOS EN QUE SE ENCUENTRA
NORMA QUE APLICA PARA SU DETECCION O CUANTIFICACION
OBSERVACIONES
FUENTES DE CONSULTA:
113
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
PRACTICA No 6
CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS
OBJETIVO
Realizar adecuadamente mediante el método de cuenta en placa, el número de mohos y
levaduras viables presentes en alimentos
Evaluar la calidad microbiológica de un alimento, tomando como referencia las NOM-111-
SSA1-1994
Material
1 matraz de aforación de 500 ml

1 matraz de aforación de 100 ml.
1 vidrio de reloj
1 espátula
1 probeta de 100 ml
2 matraz erlenmeyer de 250 ml
4 tubos de 16 X 150 mm con rosca o tapón de algodón
10 cajas petri
5 pipetas de 10 ml
3 mecheros bunsen
Baño maría a ±45°C
Potenciómetro
Incubadora a 25±1°C
Contador de colonias
Algodón
Papel de estraza
Gasas o manta de cielo
Tijeras
1 clip
Cerillos
Cinta
Preparación de Medios de cultivo, diluyentes y reactivos:
120 ml de agua peptonada al 0.1%, estéril y por equipo (para preparar un litro, se utiliza 1 gr.
de peptona, 8.5 gr. de cloruro de sodio y 1 litro de agua, se disuelven los componentes en el
agua, se ajusta el pH a 7.0 con hidróxido de sodio 1N, se distribuye en porciones de 99, 90 y 9
ml según se requiera. Esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 minutos) Preparar 500 ml
Solución estéril de ácido tartárico al 10%. (Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5,
adicionar por cada 100.0 ml de agar, 1.4 ml de ácido tartárico al 10% esterilizado por
filtración en membrana de de 0,45 µm, o bien esterilizar la solución a 121°C±1°C durante 15
minutos, el cual se prepara disolviendo 10.0 gr. de Acido tartárico en 100 ml de Agua
destilada.) Preparar 100 ml
114
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Agar papa–dextrosa (PDA), comercialmente disponible en forma deshidratada, para la

preparación del medio de cultivo, seguir instrucciones del fabricante y después de esterilizar,
enfriar en baño de agua a 45 ± 1°C. Se utilizarán 200 ml de medio de cultivo por equipo
NOTA
La Norma Oficial Mexicana utiliza únicamente el agar papa dextrosa para la detección y
cuantificación de estos grupos de microorganismos. Sin embargo se sugiere para la
cuantificación de las levaduras, la utilización del agar extracto de malta acidificado ya que es
un medio más rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo microbiano
PROCEDIMIENTO
En 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml de capacidad, agregar 90.0 ml de agua peptonada al 0.1%,
esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 minutos.
En 3 tubos de 16 x 150 mm, agregar 9.0 ml de agua peptonada al 0.1% y esterilizar a 121 ±
1°C durante 15 minutos.
En 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml de capacidad, esterilizar los 200 ml de Agar papa–dextrosa
(PDA), a 121 ± 1°C durante 15 minutos.
Fundir el medio cultivo (agar papa-dextrosa), manteniéndolo a ±45°C, y después acidificar a
un pH de 3.5, (adicionar por cada 100.0 ml de agar, 1.4 ml de ácido tartárico al 10% estéril)
Después de la acidificación, utilizar un tubo de medio acidificado como testigo y medir el pH
para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un potenciómetro.
Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estéril y pasarla al matraz Erlenmeyer que contenga
90.0 ml de agua peptonada al 0.1%, estéril y a temperatura ambiente, homogenizando
mediante movimientos en un arco de 25 cm. Esta es la dilución primaria (10 -1 )
De la suspensión o solución anterior, tomar 1.0 ml y transferirlo a un tubo (identificado) que
contenga 9.0 ml de agua peptonada al 0.1%, agitar y repetir esta operación tantas veces como
diluciones sean necesarias, en este caso llegar hasta la dilución 10 -4 .Se debe utilizar una
pipeta estéril para cada dilución.
Colocar por duplicado en cajas Petri estériles e identificadas, 1.0 ml de cada una de las
diluciones de la muestra (inóculo), utilizando una pipeta estéril.
En cada caja de Petri con inóculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa acidificado,
fundido y mantenido a ±45°C. El tiempo transcurrido entre la preparación de las diluciones y
el momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min.
Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el
sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrás hacia adelante,
sobre una superficie lisa, teniendo cuidado de no humedecer con el medio la tapa de la caja de
Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejándolas reposar sobre una
superficie horizontal fría.
Verificar la esterilidad del medio acidificado, para lo cual se verterá en una caja de Petri sin
inóculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada. Después de la incubación, estas
cajas no deberán presentar desarrollo de colonias.
Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25±1°C.
Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días,
seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias (representatividad
estadística). Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil
contar colonias bien aisladas, considerar la cuantificación de 4 días de incubación o incluso las
de 3 días. En este caso, se informa el período de incubación en los resultados de los análisis.
115
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe.
Multiplicar por el inverso de la dilución.
Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos y
levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a 25±1°C durante 5 días. incubadora
a 25±1°C
NOTA
Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o de un
fragmento de hifa o de un cúmulo de hifas. Debido a esto, el número de UFC/mL puede variar
dependiendo de las condiciones de homogeneización de la muestra (a mayor tiempo de
homogeneización mayor será la ruptura de las hifas y por lo tanto se aumentarían las UFC /
mL), por lo que se debe poner especial cuidado en esta etapa. Los tiempos de
homogeneización citados en una metodología deben ser los recomendados en la Normas
Oficiales.
CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Para elaborar un informe de resultados se sugiere seguir las indicaciones que a continuación se
expresan:
Para hacer un reporte de la parte cuantitativa de este análisis, se deben seleccionar las placas
que contengan entre 10 y 150 colonias (representatividad estadística). Posteriormente, contar
las colonias presentes y calcular el número de hongos y levaduras por separado. De esta
manera se puede calcular las unidades formadoras de colonias por gramo o por mililitro
dependiendo del estado físico de la muestra analizada. Esto se logra multiplicando el número
de UFC encontradas en una caja representativa, por el inverso de la dilución correspondiente a
esa caja.
En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos
y/o levaduras, se debe reportar el número obtenido de UFC indicando la dilución
correspondiente.
En el caso de no encontrar colonias características de hongos y/o levaduras, el resultado a
reportar es: menos de 10 UFC/g ó bien menos de 10 UFC/ml
(Sensibilidad del Método)
Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar el tiempo de incubación en el que se
realizó la cuantificación. Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar por separado
el resultado de la cuantificación de hongos y de levaduras.
Resultados:
116
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
CUESTIONARIO:
Elabora un diagrama de flujo con imágenes, de los pasos a realizar en la práctica
¿Por qué los hongos se consideran como indicadores de contaminación?
¿En qué condiciones se desarrollan los hongos y levaduras?
¿En qué tipos de alimentos, los hongos pueden ser un problema potencial de alteración?
¿Por qué es tan común la presencia de hongos, tanto en alimentos naturales como procesados?
Dibuja la estructura típica de un hongo describiendo sus partes
¿Cuáles son las propiedades fisiológicas para el desarrollo de hongos?
Las levaduras se reproducen por fisión binaria, describe este proceso, incluye dibujos
Elabora una lista sobre los hongos y levaduras más comunes en alimentos
Dibuja una levadura e indica sus partes
117
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
TINCION DIFERENCIAL DE GRAM
OBJETIVO
Distinguir las bacterias Gram positivas de las Gram negativas.
FUNDAMENTO
La técnica de coloración de Gram es de gran utilidad en Bacteriología, ya que permite

diferenciar las bacterias en Gram Positivas y Gram Negativas. Casi la mitad de las bacterias,
son Gram positivas y el resto Gram negativas.
El método fue descubierto por Christian Gram (Danés), en 1884, quien observó que en cortes
histológicos que contenían bacterias coloreadas con violeta de genciana y tratadas con
solución acuosa de yodo, este colorante podría ser removido del corte histológico con el
empleo de alcohol, pero no de las bacterias.
Posteriormente descubrió que no todas las bacterias retenían al violeta de genciana sino que
algunas eran decoloradas por acción del alcohol. A las primeras las llamó Gram positivas y a
las segundas Gram negativas. Estas que quedan incoloras son teñidas luego mediante el
empleo de un colorante de contraste como la safranina, para hacer posible su observación.
Existen muchas modificaciones de esta coloración, pero fundamentalmente es lo mismo.
MATERIAL Y SUBSTANCIAS
- Gradilla.
- Portaobjetos.
- Asa bacteriológica.
- Mechero Bunsen.
- Cerillos ó encendedor.
- Lápiz graso.
- Papel absorbente.
- Hisopos.
- Microscopio.
- Aceite de inmersión.
- Cristal violeta.
- Lugol.
- Alcohol al 95%.
- Safranina.
- Vinagre casero, yogurt y búlgaros (Cultivos bacterianos: A, B y C.)
TECNICA
A. Preparación de Extensiones o Frotis.

· Se deberán emplear portaobjetos perfectamente limpios y sin raspaduras para evitar
interferencias en la observación.
1. Flamear el portaobjetos para desengrasarlo.
2. Si el cultivo es sólido, colocar una gota de agua en el centro del portaobjetos, y con el asa
bacteriológica estéril, tomar una pequeña cantidad de material, emulsionar y extender
uniformemente en una superficie aproximada de 1 cm2.
118
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
3. Si la muestra es líquida, tomar directamente el material con el asa estéril y extenderlo

uniformemente sobre la superficie indicada anteriormente.
4. Dejar secar la extensión al aire.
5. Una vez seca la extensión, fijarla al calor suave, pasando rápidamente el portaobjetos sobre
la flama del mechero, sin calentar demasiado, unas 10 veces.
· Las extensiones deberán ser finas y uniformes para permitir el paso de la luz a través de
ellas y facilitar su observación.
B. Tinción de Gram.
1. Preparar 3 extensiones (frotis) en la forma ya indicada.
2. Cubrir la extensión con cristal violeta y dejar actuar durante un minuto.
3. Lavar con agua corriente, cuidando que no se arrastre la preparación y sacudir para eliminar
el exceso de agua.
4. Cubrir la extensión con solución de lugol y dejar actuar por un minuto.
5. Lavar con agua corriente.
6. Decolorar con alcohol al 95 ó 96%, aproximadamente 10 segundos ó hasta observar el
alcohol transparente.
8. Cubrir la extensión con Safranina y dejar actuar por 1 minuto.
10. Secar la preparación al aire o colocándola entre papel absorbente.
11. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación y observar al microscopio
con objetivo de inmersión.
INTERPRETACION:
· Las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta y se teñirán en azul ó morado.
· Las Gram negativas se tiñen en rojo ó rosa.
Dibujar lo observado:
119
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
PROYECTO FINAL
Submódulo: Cuantifica microorganismos en base a normas
El Distintivo "H", es un reconocimiento que otorgan la Secretaría de Turismo y la

Secretaría de Salud, a aquellos establecimientos fijos de alimentos y bebidas: (restaurantes
en general, restaurantes de hoteles, cafeterías, fondas etc.), por cumplir con los estándares
de higiene que marca la Norma Mexicana NMX-F605 NORMEX 2004.
Con el propósito fundamental de disminuir la incidencia de enfermedades transmitidas por
los alimentos en turistas nacionales y extranjeros y mejorar la imagen de México a nivel
mundial con respecto a la seguridad alimentaria, desde 1990, se implementó en nuestro país,
un programa Nacional de Manejo Higiénico de Alimentos, Distintivo "H", para todos los
establecimientos fijos de alimentos y bebidas. El símbolo que lo identifica es el siguiente:
El objetivo de este trabajo, es recopilar las experiencias adquiridas en el área de

microbiología para lo cual se realizarán las siguientes actividades:
1. Realizar la lectura del boletín Buenas Prácticas de Manufactura (ver archivo).
2. Aplicar la LISTA DE VERIFICACIÓN DE LA NMX-F-605-NORMEX-2004 (ver archivo) en
algún establecimiento del ramo.
3. Aplicar las técnicas de análisis vistas en el laboratorio: Muestreo, determinación de
coliformes totales y fecales, muestreo de superficies, análisis de hielo y agua.
4. Redactar un informe tomando la estructura del artículo: Coliformes fecales y
mesofílicos aerobios en alimentos, superficies y manos del personal y niños de una
guardería (ver archivo). Por lo cual debe contener los siguientes apartados
 RESUMEN.
 INTRODUCCIÓN.
 MATERIAL Y MÉTODOS.
 RESULTADOS.
 DISCUSIÓN.
 CONCLUSIONES.
 REFERENCIAS
5. Enviar el archivo al correo proporcionado, nombrado como se mencionó
anteriormente. La entrega del trabajo impreso y el archivo deberá ser previo a la
exposición del trabajo para su revisión.
6. Cada equipo expondrá su trabajo en el día y hora que se señalarán previamente.
120
Semestre Feb-Jun-16
FOG 2.01
Notas:
121

Manual Cuantifica Microorganismos en Base A Normas Feb-Jul-2016

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Semestre Feb-Jun-16

Colegio de Estudios Científicos y Tecnológicos del Estado de Guanajuato

De: Cuantifica Microorganismos con base a Normas

Academia: Laboratorista Químico

Nombre del Alumno: ____________________________________________

Mesa o equipo de trabajo ___________

Correo electrónico: _____________________________________________

Elaboración del manual: Ing. Fernando Orta Guevara

León, Guanajuato, Enero del 2015. (Impresión 2016)

Este manual se modificó en diciembre de 2014, a raíz de la impartición del curso-

La Reforma Integral de la Educación Media Superior (RIEMS) se orienta a la

El presente manual, como ya se mencionó, pretende cubrir estos requerimientos, es

EL MODULO III: EJECUTA MÉTODOS DE ANÁLISIS CUANTITATIVOS

6. Cuantifica microorganismos por métodos directos aplicando normas de

REFERENCIAS PROPUESTAS EN EL PROGRAMA

 NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras

PRIMER PARCIAL SEGUNDO PARCIAL

Exámenes 40% Exámenes 40%

Fichas Técnicas 20%

Proyecto Final 40%

**Nota: para tener derecho a calificación, se

Rubrica para evaluar el desempeño en el laboratorio

 Muestra representativa, es un número de unidades tomadas de un lote, que

Aprender la normatividad y procedimientos para la obtención de muestras de

Diseña aquí una etiqueta individual

En grupo elijan una de las etiquetas, dibújenla en

2. Preparación del Material para la Toma de la Muestra.

8. Obtención de muestras en un conducto de salida o una compuerta

 Cuando se requiera tomar muestras asépticamente, éstas no deben

En el espacio correspondiente agrega una fotografía como evidencia:

Una muestra de un alimento preparado sin envasar:

Una muestra de un alimento líquido o semilíquido:

Una muestra de un alimento sólido

Una muestra de un producto a granel

Una muestra tomada en un conducto de salida o una compuerta

La muestra deberá estar aparecer perfectamente identificada y en las condiciones de

1. ¿Qué importancia tiene el muestrear adecuadamente un alimento en un análisis

2. Busca en la página www.cofepris.gob.mx la NOM-109-SSA1-1994 y en la

A manera de conclusiones, elabora un cuadro PNI (positivo, negativo interesante):

POSITIVO NEGATIVO INTERESANTE

Entrega y revisión de un video, con el tema de muestreo, la duración del video no

Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un

Desde el punto de visita fisiológico de su patogenicidad encontraremos: cromógenos,

MATERIAL EQUIPO REACTIVOS MUESTRAS

**Preparación de agua peptonada

La práctica se lleva a cabo en dos momentos distintos, en el primero de ellos, se deben

b) Pesar 11 g de la muestra en una bolsa W HIRL-PAK, teniendo cuidado de no tocar el

RESULTADOS POR EQUIPO

Dilución 10-2 Dilución 10-3 Dilución 10-4

Dilución 10-2 Dilución 10-3 Dilución 10-4

Dilución 10-2 Dilución 10-3 Dilución 10-4

Dilución 10-2 Dilución 10-3 Dilución 10-4

Dilución 10-2 Dilución 10-3 Dilución 10-4

Dilución 10-2 Dilución 10-3 Dilución 10-4

Reportar como unidades formadoras de colonias. ________________ UFC/ gr o ml de

Características consideradas para describir colonias bacterianas:

Aspecto: Húmedo o seco

Expresión de resultados según la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-092-SSA1-1994,

NOM-093-SSA1-1994 ; NOM-121-SSA1-1994; Límites microbiológicos de la ICMSF