GUÍA DE PRÁCTICA MOLECULAR Versión Bacterias

CARRERA DE MEDICINA
PRÁCTICA: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

CÓDIGO GUÍA DE PRÁCTICA:
ASIGNATURA: BIOLOGÍA MOLECULAR
MÓDULO:
APOYO CURRICULAR:
Laboratorio asignado Biología Molecular

para la práctica
Tiempo de duración de 2 horas
la práctica (en horas)
Número de estudiantes 12
1. INTRODUCCIÓN
La PCR ha revolucionado la investigación y diagnóstico basado en la Biología Molecular.
La PCR es un proceso simple, exacto y altamente reproducible que proporciona la ventaja
de empezar con una pequeña cantidad de ADN y ser capaz de amplificarlo de forma que se
tenga suficiente para realizar experimentos.
Se han desarrollado gran cantidad de test diagnósticos, también se ha utilizado en mapaje y

secuenciación de ADN en proyectos de genoma y está siendo utilizando en
determinaciones forenses, paternidades, diagnóstico clínico, etc.
En todos los casos se amplifican segmentos de ADN que posteriormente son sometidos a
análisis y estudios varios.
En una reacción de PCR, el primer paso es la preparación de la muestra de ADN que es

extraída de varias fuentes biológicas o tejidos. En la PCR, el ADN o gen a amplificar se
define como “target” (diana) y los oligonucleótidos sintéticos utilizados se definen como
“primers” (cebadores). Un set de 2 cebadores de entre 20-45 nucleótidos son sintetizados
químicamente para que se correspondan con los extremos del gen a amplificar. Cada
cebador se une a uno de los extremos de cada cadena de ADN y es el punto de inicio de la
amplificación.
Una reacción típica de PCR contiene ADN molde, Taq polimerasa y los 4 dNTPS en un
tampón de reacción apropiado. El volumen total de reacción es de 25-50 µl. En el primer
paso de la reacción de PCR, las cadenas complementarias de ADN se separan
(desnaturalizan) la una de la otra a 94ºC, mientras que la Taq polimerasa permanece
estable. En el segundo paso, conocido como emparejamiento, la muestra es enfriada a una
temperatura entre 40-65ºC que permita la hibridación de los 2 cebadores, cada uno a una
hebra del ADN molde. En el tercer paso, conocido como extensión, la temperatura es
elevada a 72ºC y la Taq polimerasa añade nucleótidos a los cebadores para completar la
síntesis de una nueva cadena complementaria.
2. FUNDAMEN
TO El gen 16S rRNA tiene aproximadamente 1500 nucleótidos, codificado por el gen rrs,
TEÓRICO también denominado ADN ribosomal 16S (ADNr 16S), a partir de cuya secuencia se
puede obtener información filogenética y taxonómica de los procariotas.
El ARNr se pliega en una estructura secundaria, caracterizada por la presencia de

segmentos de doble cadena, alternando con regiones de cadena sencilla. En eucariotas el
ARNr 18S es la macromolécula equivalente. Sus secuencias se encuentran altamente
conservadas, presentando regiones comunes a todos los organismos, pero contienen
variaciones que se concentran zonas específicas.
El análisis de la secuencia de los ARNr 16S de distintos grupos filogenéticos reveló la
1
presencia de una o más secuencias características que se denominan oligonucleótidos
firma. Se trata de secuencias específicas cortas que aparecen en todos los miembros de un
determinado grupo filogenético y nunca (o sólo raramente) están presentes en otros grupos,
incluidos los más próximos.
La comparación de las secuencias de los ARNr 16S (o de los genes que los codifican)
permite establecer las relaciones filogenéticas existentes entre los organismos procariotas.
En microbiología clínica la identificación molecular basada en ADNr 16S se utiliza
fundamentalmente para bacterias cuya identificación mediante otro tipo de técnica resulta
imposible, difícil o requiere mucho tiempo.
El método molecular de identificación bacteriana mediante secuenciación del ADNr

16S incluye tres etapas:
-Amplificación por PCR del gen a partir de la muestra apropiada.
-Determinación de la secuencia de nucleótidos del producto de la PCR.
- Análisis de la secuencia.
La amplificación del ADNr 16S se consigue mediante un termociclador gracias a la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como sustrato se utiliza normalmente ADN
purificado a partir de un cultivo puro del agente patógeno. Alternativamente, el ADN
podrá obtenerse directamente de la muestra clínica.
En esta práctica vamos a realizar la amplificación del gen ADNr 16S utilizando unos
primers universales 27F-1492R que producirán un fragmento de 1470 pares de bases,
como ADN molde se utilizará la colonia directamente, y la colonia hervida.
OBJETIVO Observar y realizar la técnica de PCR

GENERAL
OBJETIVOS ● Seguir paso a paso el protocolo de PCR e identificar las etapas indispensables del
ESPECÍFICOS proceso.
● Conocer la utilidad de la PCR
● Realizar ciertas modificaciones en los protocolos de PCR para comparar la calidad de la
amplificación.
● Conocer las aplicaciones y usos de la PCR
● Aprender el uso de los materiales de laboratorio de biología molecular
● Desarrollar el interés y la habilidad de los estudiantes en las técnicas de Biología
Molecular aplicadas actualmente en el diagnóstico médico
Resultado de 4.- Realizar correctamente los procedimientos que de acuerdo a la norma vigente son
aprendizaje de la competencia propia del médico general de atención primaria en salud.
carrera
6.- Integrar con rigurosidad científica los fundamentos de las ciencias básicas, clínicas y
sociales en la práctica de la medicina.
Resultado de Definir los fundamentos de las técnicas de diagnóstico molecular, interpretar los distintos
aprendizaje de la tipos de pruebas, describir las bases de la biotecnología aplicada a la Medicina.
asignatura
Resultado de Se obtendrá ADN amplificado que solo será visible por electroforesis.
aprendizaje de la
práctica
PRERREQUISITOS Conocimientos teóricos de las técnicas de laboratorio de biología molecular.
PREGUNTAS 2.- ¿Cuál es la utilidad del PCR en la práctica clínica?
MOTIVADORAS 3.- ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del PCR?
MATERIALES • Micropipetas
2
• Puntas para micropipetas
• Tubos Eppendorf de 0,5 ml
REACTIVOS • Reactivos de PCR

⮚ Primers
⮚ Agua para PCR
⮚ Polimerasa master mix
● ADN previamente extraído
EQUIPOS • Termociclador
• Refrigeradora a 4°C
• Congelador a -20°C
MATERIAL QUE • Mandil
DEBE TRAER EL • Manual de laboratorio de Biología Molecular impreso
ESTUDIANTE
PROCEDIMIENTO
1. Extracción del ADN
El paso previo a cualquier estudio genético suele ser el aislamiento del ADN genómico,
esto se puede llevar a cabo de diferentes formas (métodos caseros, kits comerciales, etc) y
a partir de diferentes muestras (sangre, tejido,bacterias etc). Para esta práctica lo haremos
por el método de ebullición tomando 4 colonias de una bacteria y colocándolas en 200ul
de agua destilada estéril seguidas de ebullición por 5minutos y finalmente centrifugado a
13.000rpm por 5 minutos, para la PCR se toman 2ul del sobrenadante.
Para PCR de colonia se toca con la punta de pipeta una colonia y se la disuelve
directamente en el tubo de PCR con el Mix.
0. Reacción de la PCR
NOTA: Utilizar siempre puntas con filtro y cambiar de punta cada vez que se
realiza una acción para evitar contaminaciones que puede dar lugar a falsos
resultados.
Se suministran reactivos suficientes para la realización de reacciones de PCR de 25ul (1

ADN colonia, 1 ADN hervido, 1 control negativo)
Este Mix está listo para su uso (ya tiene dntps, polimerasa) permite amplificar
cualquier fragmento a partir de ADN, de forma que el usuario sólo ha de añadir la
muestra del ADN aislado y primers.
Pasos a seguir
1. Utilizar 2 μl del ADN bacteriano obtenido por el método de ebullición.

IMPORTANTE: preparar un control negativo de amplificación, para ello
colocar 2 μl de agua libre de nucleasas en lugar del ADN, esto sirve para saber
si los reactivos, micropipetas o puntas pueden estar contaminados con ADN.
Seguir la mezcla sugerida por el fabricante
2. Mezclar bien.
PROGRAMA 16S ARNr

PASO TEMPERATURA
Desnaturalización inicial 95ºC
95ºC
Ciclos PCR Realizar 35 ciclos 55ºC
72ºC
Extensión final 72ºC
3
Final 4ºC
0. Colocar 10ul del producto de PCR en el gel de agarosa junto con 2ul de buffer
de carga.
0. Cargar 3ul del marcador de peso molecular
3. EVALUACIÓN / LISTA DE COTEJO*
RÚBRICA DE EVALUACIÓN DE PRÁCTICAS

ESCALA DE CALIFICACIÓN
LISTA DE COTEJO DESEMPEÑO Y CUMPLIMIENTO DEL ESTUDIANTE
(Aspectos generales que se evalúan en el desempeño y cumplimiento del estudiante y
puntaje de calificación)
Excelente Muy bueno Bueno Malo
6 4-5 2-3 1
(Identifica, describe, (Identifica, describe, (Identifica, describe, (NO identifica,
12.1.Indicador
aplica, emplea, aplica, emplea, aplica, emplea, describe, aplica,
comunica, integra: comunica, integra: comunica, integra: emplea, comunica o
TODO) LA MAYORÍA) ALGO) integra)
Conoce los fundamentos
teóricos de la técnica de
amplificación de ácidos
nucleicos.
Conoce la función de cada
uno de los componentes
de la técnica de PCR.
Conoce la utilidad o
aplicación de la técnica de
PCR

*CALIFICACIÓN DE
LA PRÁCTICA
(PROMEDIO /6):
*La evaluación en base a la rúbrica establecida, constituye una participación del estudiante y aporta a la
construcción del 60% de la calificación parcial de la asignatura.
4. ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS
1.- Realizar un informe de la práctica realizada.
2.- Responder al siguiente cuestionario

1.- ¿Cuál es el tamaño del fragmento amplificado esperado con ambos primers?
2.- ¿Cuál es la secuencia de los primers empleados en la práctica?
3.- ¿Qué factores pueden influenciar en la PCR?, explicar cómo afectan
4.- ¿Qué pudiera generar una ausencia de amplificado?
5.- ¿Cuáles son los componentes del buffer de reacción de la PCR?
5. BIBLIOGRAFÍA
Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R., Moore D., Seidman, J. G., Smith, J., Struhl, K. (2002). Short Protocols in
Molecular Biology (Quinta ed.). New York: Wiley.
Espín, V.H., Espín, A., Zurita, C., Navas, V. Validación de PCR para el diagnóstico de hepatitis B. Tsafiqui 2013;
3(3): 23-30.
4
5

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Se han desarrollado gran cantidad de test diagnósticos, también se ha utilizado en mapaje y

En una reacción de PCR, el primer paso es la preparación de la muestra de ADN que es

El ARNr se pliega en una estructura secundaria, caracterizada por la presencia de

El análisis de la secuencia de los ARNr 16S de distintos grupos filogenéticos reveló la

El método molecular de identificación bacteriana mediante secuenciación del ADNr

-Amplificación por PCR del gen a partir de la muestra apropiada.

-Determinación de la secuencia de nucleótidos del producto de la PCR.

La amplificación del ADNr 16S se consigue mediante un termociclador gracias a la

OBJETIVO Observar y realizar la técnica de PCR

REACTIVOS • Reactivos de PCR

Se suministran reactivos suficientes para la realización de reacciones de PCR de 25ul (1

1. Utilizar 2 μl del ADN bacteriano obtenido por el método de ebullición.

PROGRAMA 16S ARNr

Extensión final 72ºC

3. EVALUACIÓN / LISTA DE COTEJO*

RÚBRICA DE EVALUACIÓN DE PRÁCTICAS

2.- Responder al siguiente cuestionario

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