Unidad 1: Métodos básicos de manipulación de ácidos nucleicos y

técnicas de análisis.
Los ácidos nucleicos pueden ser extraídos de una amplia variedad de células vivas,
incluyendo células animales, células vegetales, bacterias y hongos. La elección de las
células a partir de las cuales se extraen los ácidos nucleicos dependerá de la finalidad de
la extracción.

Factores a considerar:

- Tipo de célula: presencia/ausencia de pared celular.

- Origen de la célula: aislada o en tejidos, cultivo puro o muestra ambiental.
- Contaminantes: efecto en rendimiento y pureza.
- Tipo de ácido nucleico: ADN, ADN plasmidial o ARN.
- Rendimiento y pureza: deseado según la finalidad del material extraído.

Macroetapas del proceso:

1. Extracción: lisis celular con inactivación de nucleasas.
2. Clarificación: centrifugación o filtración.
3. Purificación: eliminación de proteínas, ácidos nucleicos no deseados, lípidos,
sales y compuestos orgánicos.
Bonus: verificación y cuantificación de los AN obtenidos.

1. Extracción: lisis celular

En esta etapa se rompen las células para liberar el material genético y se inactivan las
nucleasas para evitar la degradación del ácido nucleico. Se pueden utilizar diferentes
métodos de lisis, como la utilización de agentes químicos o mecánicos, o la combinación
de ambos.

Métodos mecánicos:

- Homogeneización: consiste en triturar las células utilizando un homogeneizador,

que puede ser de alta o baja velocidad, o un mortero y pistilo. Esta técnica se
utiliza principalmente para células vegetales o tejidos duros. Maquinaria:
mortero, blender, prensa francesa, Potter-Elvehjem, polytron. (hardcore)

- Ultrasonido: es una técnica que utiliza ondas sonoras de alta frecuencia para
romper las células. Se utiliza un dispositivo ultrasónico para producir vibraciones
en la muestra, lo que causa la ruptura de las células, utilizado para células
animales, bacterias y levaduras. (regular)
 - Molino de bolas: es un dispositivo que se utiliza para romper las células y los
tejidos utilizando perlas o bolas de vidrio o cerámica que se agitan violentamente
dentro de un tubo que contiene la muestra. (delicado)
- )
Métodos químicos:

- Detergentes: se utilizan para disolver las membranas celulares y las envolturas

virales, forman micelas con los lípidos de membrana, desestabilizándolos.

- Solventes orgánicos: lopermeabilizan las membranas celulares, disolviendo

componentes hidrofóbicos de la pared, como los fosfolípidos de membrana
interna en Gram (-).

- Agentes caotrópicos: como la urea y la guanidina interfieren con los enlaces no

covalentes (puentes de H, fuerzas de van der Walls), desestructurando al agua.

- Enzimas: se utilizan para romper las paredes celulares de los microorganismos.

Estas enzimas hidrolizan los componentes de la pared celular, liberando el
material genético y otros componentes celulares.

• Lisozima: hidrólisis de las uniones beta 1,4 entre los residuos de ácido
N-acetilmurámico y N-acetil-Dglucosamina en un peptidoglicano.
Para bacterias
• b-1.3 de glucanasa : rompe glucanos. Uso para levaduras y hongos
• Proteasas: para todo tipo de células especialmente para tejidos.

Comparación de métodos:

Métodos Mecánicos Métodos no mecánicos

Ventajas -Efectividad: más efectivos. -Delicado
-Escalamiento: suelen ser más fáciles de -Harmless: no genera
escalar. daño a las células.
-Útiles: especialmente útiles para células -Especificidad: más
resistentes. específicos.
-Costos: menos costoso
Desventajas -Inespecificidad -Suficiencia: requieren
-Operación: a altas temperaturas y de otros métodos para
mayor consumo de energía. lograr su objetivo.
-Daño -Retirar: se requiere
-Denaturación: debido al aumento de retirar detergentes y
temperatura. enzimas del medio.
- Separar: el producto de interés del Proteínas pueden
resto de los componentes celulares. generar alergias.
-Escalamiento: poco
escalables a nivel
industrial.
-Caro
Métodos de lisis aplicables según células a romper:

Tejido Tejido Tejido Levadura Hongos Bacteria

blando animal vegetal
animal duro
Mortero X X X X
Polytron X X X X X
Molino de X X
bolas
Ultrasonido X

Lyzosima X
Liticasa,
zimolasa, X
glucasa

2. Clarificación: eliminación de restos materiales

Tiene como objetivo eliminar las partículas sólidas y las impurezas presentes en la
muestra celular lisada. Esto se logra a través de técnicas de centrifugación o filtración.
La clarificación permite obtener una muestra más pura y limpia, lo que facilita la
posterior etapa de purificación de los ácidos nucleicos deseados.

- Filtración: técnica que utiliza una membrana para separar las partículas sólidas
de la muestra líquida. La filtración se utiliza para eliminar partículas de mayor
tamaño, como células o restos celulares, y es útil para muestras de baja
viscosidad.

- Centrifugación: utiliza la fuerza centrífuga para separar las partículas en la

muestra según su densidad. La centrifugación se utiliza para separar partículas
de mayor tamaño, como células o tejidos, y es útil para muestras de alta
viscosidad.

- Los métodos mixtos combinan la filtración y la centrifugación para lograr una

mayor claridad en la muestra. Por ejemplo, se puede utilizar una centrifugación
inicial para eliminar las partículas más grandes y luego filtrar la muestra para
eliminar las partículas más pequeñas.

3. Purificación:

El paso de purificación en el proceso de extracción y purificación de ácidos nucleicos

tiene como objetivo separar los ácidos nucleicos de otras moléculas y contaminantes
presentes en la muestra.
Extracción de proteínas con fenol:

El fenol es un compuesto orgánico que es inmiscible con el agua, pero soluble en otros
disolventes orgánicos. El fenol se utiliza para extraer proteínas y separarlas de los ácidos
nucleicos, lípidos y otros contaminantes. El fenol se añade a la mezcla de proteínas y
luego se agita para permitir la separación de las fases acuosas y orgánicas. Las proteínas
se disuelven en la fase orgánica, mientras que los contaminantes se quedan en la fase
acuosa.

Precipitación con etanol:

La precipitación con etanol se basa en la solubilidad de las proteínas en soluciones

salinas. Se añade una cantidad adecuada de sal para precipitar las proteínas y luego se
añade etanol para precipitar las proteínas que están en solución. La precipitación se
produce porque el etanol reduce la solubilidad de las proteínas al disminuir la polaridad
del disolvente y formar puentes de hidrógeno con las proteínas.

Salting out:

El salting out es un método de purificación que se basa en la reducción de la solubilidad

de las proteínas en agua por la adición de sales. Las proteínas se precipitan a
concentraciones críticas de iones salinos, lo que provoca la formación de una malla de
iones que rodea las proteínas y reduce su solubilidad. A medida que aumenta la
concentración de sal, se produce una mayor precipitación de proteínas.
Cromatografía:

Se basa en la separación de componentes en una mezcla mediante la interacción entre

la muestra y una fase estacionaria y móvil. En términos generales, la muestra se aplica
a una columna o placa de un material que interactúa selectivamente con los
componentes de la muestra, y se separan por el efecto combinado de la adsorción y la
desorción de los componentes en la fase estacionaria.

- Intercambio iónico:

La cromatografía por intercambio iónico es un método de separación basado en la carga

eléctrica de los componentes de la muestra. En este método, se utiliza una matriz de
resina con grupos funcionales cargados positiva o negativamente. La muestra se aplica
a la columna y se lavan con una solución tampón para equilibrar la columna. Los
componentes de carga opuesta a la resina se unen a ella y se separan de la muestra,
mientras que los componentes de carga similar a la resina se eluyen* mediante la
aplicación de una solución tampón de mayor fuerza iónica.
 - Adsorción de ADN a sílica:

En este método, la fase estacionaria es una matriz sólida, como la sílica gel, que se
empaqueta en una columna y se equilibra con una solución tampón adecuada. La
muestra se aplica a la parte superior de la columna, y se eluyen* los componentes
mediante el lavado de la columna con dicha solución.

La separación de los componentes se basa en las diferencias de afinidad entre los

componentes de la muestra y la fase estacionaria. Los componentes más hidrofóbicos
(hidrófobos) tienden a adsorberse más fuertemente en la fase estacionaria, mientras
que los componentes más hidrofílicos (hidrófilos) se eluyen más rápidamente. La
selectividad y la capacidad de separación de la columna se pueden modificar mediante
la variación de las condiciones de la fase móvil y la fase estacionaria.
 - Otros:

Otros tipos de cromatografía incluyen la cromatografía de afinidad, en la que se utilizan

ligandos específicos para la purificación de proteínas y otras moléculas biológicas, y la
cromatografía de intercambio iónico, en la que se utilizan resinas con cargas opuestas
para separar moléculas cargadas. En general, la cromatografía es un método muy útil y
versátil para la purificación de moléculas biológicas y químicas.

* El término "eluir" o "elución" en cromatografía se refiere al proceso de separar un componente específico de una muestra que se
ha unido a la fase estacionaria (columna o papel) y recuperarlo. Eluyente es el líquido que fluye a través de la fase estacionaria,
disolviendo los componentes de la muestra a medida que se mueven a través de la columna. Eluyente es la solución que se usa para
desplazar el componente específico de la fase estacionaria y recuperarlo. Cuando el eluyente entra en contacto con la muestra, se
produce una interacción química que separa los componentes de la muestra en función de sus propiedades físicas y químicas, y
luego el componente específico se eluye o se separa de la fase estacionaria.

4. Verificación y cuantificación de la extracción:

Es importante verificar y cuantificar la cantidad de ácidos nucleicos extraídos para

asegurarse de que se obtiene una muestra pura y de alta calidad para su uso posterior
en aplicaciones experimentales, como la amplificación de ADN o la secuenciación de
genes. La precisión y exactitud en la medición de la cantidad de ácidos nucleicos son
fundamentales para garantizar la reproducibilidad y fiabilidad de los resultados
experimentales.

- Espectrofotometría: se basa en la capacidad de los ácidos nucleicos para

absorber la luz a una longitud de onda específica, lo que permite determinar su
concentración y pureza.
 - Electroforesis: utiliza una corriente eléctrica para separar y analizar los ácidos
nucleicos según su tamaño y carga eléctrica, lo que permite determinar la
cantidad y calidad de los fragmentos obtenidos durante la extracción.

Extracción de ADN plasmidial:

La extracción de ADN plasmidial es diferente a la extracción de ADN genómico u otro

tipo de ADN porque los plásmidos son moléculas de ADN pequeñas y circulares que se
encuentran en el citoplasma de las células bacterianas, mientras que el ADN genómico
se encuentra en el núcleo de las células y es mucho más grande. Además, los plásmidos
a menudo requieren una purificación más rigurosa debido a la presencia de endotoxinas
y proteínas que pueden interferir con la manipulación del ADN plasmidial. Puede ser
resumido en los siguientes pasos:

- Resuspensión: se resuspende pellet en el buffer con EDTA.

- Lisis: ruptura con SDS y degradación de gDNA con NaOH.
- Neutralización: se neutraliza el medio y se precipitan contaminantes.
 - Clarificación: se centrifuga y extrae el sobrenadante.
- Precipitación: se centrifuga y precipita con etanol.
- Centrifugación: se centrifuga y resuspende en buffer TE.

Verificación y cuantificación de la extracción:

El análisis de DNA plasmidial mediante electroforesis es una técnica utilizada para

visualizar y analizar el tamaño y la cantidad de fragmentos de DNA plasmidial obtenidos
en una extracción.

Sobre la electroforesis: la presencia de bandas de 28S y 18S en un gel de electroforesis

sugiere que el ADN analizado es de origen eucariota, ya que estos son fragmentos de
ARN ribosómico que se encuentran en células eucariotas. La banda de 28S corresponde
al ARNr 28S del ribosoma grande y la banda de 18S al ARNr 18S del ribosoma pequeño.
La relación entre la intensidad de estas bandas puede ser utilizada para estimar la
integridad del ARN y evaluar su calidad para diferentes aplicaciones, como por ejemplo
la realización de ensayos de expresión génica o análisis de secuencias.

¿Cómo elimino RNA de una preparación si quiero aislar DNA genómico?¿Cómo elimino
DNA de una preparación si quiero aislar RNA?

Para eliminar RNA de una preparación y aislar DNA genómico, se pueden utilizar enzimas
llamadas ribonucleasas (RNasas), que degradan el RNA específicamente. Las RNasas son
altamente específicas para el RNA y no degradan el DNA. Estas enzimas se pueden
agregar a la preparación y se incuban a temperatura adecuada y por un tiempo
determinado, para asegurar la completa eliminación del RNA.

Para eliminar el DNA de una preparación y aislar RNA, se pueden utilizar enzimas
llamadas desoxirribonucleasas (DNasas), que degradan el DNA específicamente. Las
DNasas son altamente específicas para el DNA y no degradan el RNA. Estas enzimas se
pueden agregar a la preparación y se incuban a temperatura adecuada y por un tiempo
determinado, para asegurar la completa eliminación del DNA. Es importante tener en
cuenta que, además de las DNasas, se pueden utilizar otras técnicas, como la extracción
con fenol-cloroformo, para eliminar completamente el DNA de una preparación de RNA.
PCR
PCR son las siglas de "Reacción en Cadena de la Polimerasa" (en inglés, Polymerase Chain
Reaction). Es una técnica de laboratorio utilizada para amplificar una pequeña cantidad
de ADN o ARN hasta obtener una cantidad suficiente para su análisis y estudio.

Se lleva a cabo en un termociclador, un instrumento de laboratorio que es capaz de

controlar la temperatura en diferentes etapas de la reacción. La PCR consta de las
siguientes etapas:

1. Activación de la ADN polimerasa

2. Desnaturalización: En esta etapa, se calienta la muestra de ADN o ARN a una

temperatura alta (entre 90 y 95 grados Celsius) para romper los enlaces de
hidrógeno entre las dos hebras de la molécula de ADN o ARN y separarlas. Esto
da como resultado la obtención de hebras individuales de ADN o ARN.
 3. Hibridación: En esta etapa, se enfría la muestra a una temperatura específica
(generalmente entre 50 y 60 grados Celsius) para permitir que los cebadores
(pequeñas secuencias de ADN diseñadas específicamente para unirse a una
región específica del ADN o ARN objetivo) se unan a las hebras individuales de
ADN o ARN en la región objetivo.

4. Extensión: En esta etapa, se aumenta la temperatura a una óptima para la

actividad de la enzima Taq polimerasa (generalmente entre 72 y 75 grados
Celsius) para que la Taq polimerasa, una enzima termoestable, pueda extender
los cebadores a lo largo de la hebra de ADN o ARN objetivo y sintetizar nuevas
hebras de ADN complementarias. La Taq polimerasa utiliza dNTPs (nucleótidos
de desoxirribosa trifosfato) para construir una cadena complementaria de ADN,
de manera que a partir de una molécula de ADN se puedan obtener dos copias,
luego cuatro, luego ocho, y así sucesivamente, amplificando exponencialmente
la cantidad de ADN presente en la muestra.

Estas tres etapas se repiten en ciclos en el termociclador, con la temperatura y el tiempo

ajustados para cada etapa, hasta que se obtiene la cantidad deseada de copias de la
región objetivo. De esta manera, la PCR permite obtener una cantidad suficiente de ADN
o ARN para su análisis o diagnóstico.

Para llevarla a cabo se necesita:

- ADN o ARN de la muestra que se quiere amplificar.

- Cebadores (primers) específicos para la región del ADN o ARN que se quiere
amplificar, de 18 a 23 nucleótidos. Evitar secuencias repetidas y el contenido de
G-C debe ser mayor a 45%-60%. Para evitar que forme dimeros u horquillas.

- Taq polimerasa o alguna otra enzima de polimerasa termoestable que pueda

sintetizar ADN complementario a partir de los cebadores.

- Deoxinucleótidos: nucleótidos de desoxirribosa trifosfato (dNTPs) son los

bloques de construcción de ADN. Si están en exceso, pueden acomplejarse con
el Mg+2.

- Un buffer o solución que contenga los iones necesarios para la actividad de la

enzima de polimerasa. (Se protona en un ambiente ácido, se desprotona en un
ambiente básico)

- Magnesio en forma de 𝑀𝑔𝐶𝑙! , es un cofactor de la Taq polimerasa. Bajas [Mg+2],

implica tener un bajo rendimiento de producto alcanzado. Altas [Mg+2], inducen
la amplificación de productos inespecíficos.
Tipos de PCR

RT-PCR

Convierte el ARN en ADN complementario (cDNA) utilizando la enzima transcriptasa

inversa. Se utiliza un cebador específico complementario a la secuencia de ARN de
interés para sintetizar el cDNA. Luego, la región de interés se amplifica mediante la PCR
convencional a partir del cDNA.

Nested PCR

Técnica altamente sensible y específica que utiliza dos pares de cebadores. El primer par
de cebadores se utiliza para amplificar una región del ADN de interés en la muestra, y el
segundo par se diseña específicamente para amplificar una región más corta y más
interna dentro del primer producto de amplificación. Esta segunda ronda de
amplificación se realiza utilizando el producto de la primera ronda como plantilla.

La técnica de Nested PCR se utiliza para aumentar la sensibilidad y especificidad de la

PCR convencional, ya que se logra una mayor amplificación del ADN de interés. Además,
esta técnica ayuda a reducir la amplificación de productos no específicos que pueden
interferir con la detección del producto final.

La Nested PCR es más específica que la PCR convencional porque utiliza dos pares de
cebadores específicos, lo que reduce la probabilidad de amplificación de productos no
específicos. En la primera ronda de amplificación, los cebadores externos amplifican una
región de interés más grande, lo que permite la detección de una cantidad mayor de
ADN, incluyendo el ADN no específico. Sin embargo, en la segunda ronda de
amplificación, los cebadores internos se diseñan específicamente para amplificar una
región más corta y más interna dentro del primer producto de amplificación, lo que
asegura una mayor especificidad.
PCR inversa

La PCR inversa o Reverse PCR (R-PCR) es una variante de la PCR que se utiliza para
amplificar una región de ADN desconocida contigua a una secuencia conocida. Esta
técnica se utiliza cuando se dispone de una secuencia conocida de un extremo del ADN
y se necesita amplificar la secuencia desconocida adyacente.

En la PCR inversa, se utiliza un solo cebador que se diseña en la dirección opuesta a la

secuencia conocida, de modo que el cebador se une en la región desconocida y amplifica
el ADN en la dirección opuesta a la secuencia conocida. La amplificación se realiza
mediante ciclos de desnaturalización, hibridación y extensión, como en la PCR
convencional.

PCR múltiple

Permite la amplificación simultánea de múltiples secuencias de ADN utilizando varios

pares de cebadores específicos. En lugar de amplificar una sola secuencia de ADN, la PCR
múltiple permite la detección y amplificación de múltiples secuencias en una sola
reacción.
qPCR

La qPCR (PCR cuantitativa en tiempo real) es una técnica que permite la cuantificación
precisa y sensible de ADN o ARN en una muestra. La qPCR se basa en la amplificación de
una región específica del ADN o ARN de interés mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) en presencia de un fluoróforo (reportero) que se une específicamente
al producto amplificado. A medida que se produce la amplificación, el fluoróforo emite
una señal que se mide en tiempo real y se utiliza para cuantificar la cantidad de ADN o
ARN en la muestra original. El reportero fluorescente cambia de acuerdo a la técnica
empleada:

- Ensayos basados en hidrólisis: TaqMan, Beacons, Scorpions

- Ensayos basados en unión de moléculas fluorescentes: SYBR Green.

Umbral de ciclo: es el número de ciclos de amplificación necesario para que la señal

fluorescente de la sonda utilizada en la PCR en tiempo real alcance un nivel de detección
preestablecido.

El ct se utiliza como una medida de la cantidad de material genético objetivo presente

en una muestra. Cuanto menor sea el número de ciclos necesarios para alcanzar el
umbral de ciclo, mayor será la cantidad de material genético objetivo presente en la
muestra original.
Por lo tanto, el valor de ct es un indicador de la cantidad inicial de material genético en
la muestra. Los valores de ct se utilizan comúnmente en qPCR para comparar la cantidad
relativa de material genético entre diferentes muestras y condiciones experimentales.

Distintos Ct obtenidos con distintas amplificaciones de un mismo templado, indican

abundancias diferenciales en la cantidad inicial de dicho templado en la muestra

Técnicas de detección de ácidos nucleicos

La hibridación de ácidos nucleicos (AN) es una técnica que se utiliza para detectar la
presencia o ausencia de una secuencia específica de ácido nucleico en una muestra. La
técnica se basa en la capacidad de los ácidos nucleicos para formar uniones
complementarias específicas con sus pares complementarios mediante la formación de
enlaces de hidrógeno.

En la hibridación de ácidos nucleicos, una sonda específica de ADN o ARN (lo que
queremos encontrar) se marca con una molécula que se puede detectar (por ejemplo,
una enzima o un fluoróforo) y se hibrida con una muestra de ácido nucleico en una placa
o una membrana. Si la secuencia objetivo está presente en la muestra, se formará una
unión específica entre la sonda y el objetivo, lo que permitirá la detección de la señal de
la sonda marcada.
Producto de la hibridación de ácidos nucleicos se pueden generar homoduplex y
heteroduplex. Un homoduplex se forma cuando el DNA objetivo se reensambla con su
complementario original, también es llamado homoduplex cuando la sonda se
reensambla con la correspondiente sonda complementaria. Heteroduplex se llama a la
unión sonda/ADN (lo que estábamos buscando).

Cinética de reasociación en hibridación de ácidos nucleicos

La reasociación del ADN de hebra doble luego de una denaturación por calor depende
de la concentración inicial de ADN y de la temperatura. La velocidad de reasociación de
secuencias de ADN en solución depende del encuentro al azar de las cadenas
complementarias y es proporcional al número de veces que se encuentra presente una
secuencia en particular. En un ensayo de hibridación, si la concentración del ADN (o
ARN) blanco es elevada, el tiempo necesario para la formación del heterodúplex
sonda/ADN es menor. Esto significa que los genes o transcritos presentes en bajo
número de copias hibridarán más lentamente y generarán señales más débiles en un
ensayo de hibridación que aquellos presentes en múltiples copias.

Conceptos a considerar en una hibridacón de ácidos nucleicos:

- Estabilidad del dúplex (tanto del blanco como de la sonda): puede dificultar la
denaturación y depende de factores como la cantidad de uniones G-C y el largo
del ADN blanco, ya que más largo implica más puentes de hidrógeno.
¿Cómo se mide la estabilidad? Mediante la temperatura de melting.

- Estrictez: es una medida combinada de la probabilidad de disociación de una

molécula de ADN de doble hebra en hebras simples y la capacidad de una
molécula de hebra simple para discriminar entre moléculas de mayor o menor
complementariedad para formar una doble hebra estable. En general, una
 mayor estrictez se refiere a una menor probabilidad de disociación de una
molécula de ADN de doble hebra y una mayor capacidad de discriminación entre
moléculas de diferentes grados de complementariedad para formar una doble
hebra estable.

Si la estrictez es muy alta, falla la denaturación y la sonda no forma heterodúplex,

ahora, si la estrictez es muy baja, falla la denaturación y la sonda forma
heterodúplex inespecíficos.

Objetivo final: generar las mejores condiciones para favorecer la formación de

heterodúplex, esto se logra manejando: composición de secuencias (CG),
complementariedad, concentración de sales y formamida, pH, temperatura.

Técnicas para la extracción y cuantificación:

Northern Blot:

Se utiliza para la detección y cuantificación de ácidos ribonucleicos (ARN) específicos

presentes en una muestra. Esta técnica se basa en la separación de los ARN por tamaño
mediante electroforesis en gel y su posterior transferencia a una membrana de
nitrocelulosa o nylon. Luego, se realiza una hibridación entre una sonda de ADN o ARN
marcada con un isotopo radiactivo o un tinte fluorescente y la secuencia
complementaria del ARN de interés presente en la membrana. Finalmente, se lleva a
cabo la detección de la señal radiactiva o fluorescente para identificar la presencia y
cantidad del ARN de interés.

è Lo buscado es una molécula de ARN o mRNA.

è La sonda es una molécula de ADN.
è Permite identificar transcritos o variantes de splicing.
è Generalmente se utiliza para medir la expresión de un gen.
Southern Blot:

Se basa en la separación de fragmentos de ADN por tamaño mediante electroforesis en

gel, la transferencia de los fragmentos a una membrana y la hibridación con una sonda
de ADN específica que se une a la secuencia objetivo. La detección de la sonda se realiza
mediante radioactividad o una enzima que produce una señal de color o luz.

è Lo buscado es ADN.
è La sonda es una molécula de ADN.
è Pemite detectar la presencia y el número de copias de un gen en un genoma.
è Permite detectar cambios en la estructura del ADN.
è Detección de mutaciones en enfermedades genéticas.

Hibridación in situ:

La hibridación in situ es una técnica utilizada para detectar y localizar secuencias

específicas de ácidos nucleicos en células o tejidos. En esta técnica, se utilizan sondas de
ADN o ARN marcadas que se hibridan con las secuencias complementarias de ácidos
nucleicos en la muestra.
La hibridación in situ se puede realizar en células individuales, tejidos enteros o
secciones de tejidos. Dependiendo de la aplicación, se pueden utilizar diferentes tipos
de sondas y marcadores, como sondas fluorescentes, enzimas o partículas de oro.

è Blanco: mRNA.
è Sonda: ADN o ARNc.
è Objetivo: detección de la ecpresion de un gen.
è Aplicación: detección in vivo de transcritos.
Unidad 2: Métodos para la formación de ADN recombinante,
clonamiento y mutagénesis.
Esta unidad se enfoca en las técnicas utilizadas en biología molecular para la
manipulación del ADN con el fin de crear moléculas recombinantes, es decir, construir
nuevas secuencias de ADN que no existen en la naturaleza. Esto se logra mediante la
unión de fragmentos de ADN de diferentes fuentes en una secuencia nueva, lo que
permite la generación de proteínas recombinantes y la modificación de genes.

¿Qué es un clon?

Un clon se refiere a un conjunto de entidades biológicas (células, individuos), que son

genéticamente idénticas, estas copias son generadas mediante reproducción asexual o
clonal.

Alternativas metodológicas para clonar un gen: en bacterias, generación de múltiples

copias de un vector recombinante que porta un inserto de interés; ampliación mediante
PCR de la secuencia de interés.

Estrategias para identificar y aislar genes

¿Qué es una genoteca?

Conjunto de clones recombinantes que contiene todo el ADN presente en un individuo

u organismo.

Genoteca de ADN genómico (cromosómico):

Corresponde a una colección de fragmentos de ADN que representan todo el genoma

de un organismo. Incluye ADN codificante y no codificante.

¿Cómo obtengo una genoteca?

1. Aislar el ADN genómico.

2. Fragmentación hasta el tamaño apropiado (depende del vector a utilizar).
3. Incorporación de los fragmentos de ADN genómico al vector.
Usos de las librerías genómicas:

- Primera etapa de un proyecto de secuenciación de ADN genómico.

- Para comprender la complejidad de los genomas.
- Identificación de genes de importancia farmacéutica.
- Identificación de secuencias silentes y no silentes.

Fragmentación del DNA genómico:

- Fragmentación mecánica: jeringa o sonicación.

- Digestión mediante endonucleasas de restricción.

¿Cuál es el número óptimo de recombinantes? Este número dependerá del tamaño del
genoma en cuestión y la longitud promedio de los insertos, es preferible la redundancia
de secuencias (varios recombinantes portan la misma secuencia) versus la omisión de
secuencias. Debe incluir de 5 a 10 veces el genoma para aumentar la probabilidad de
encontrar una secuencia particular. Es beneficioso que los extremos se sobrepongan así
es más fácil hacer una reconstrucción. Si son muchos es mucha pega.

Linkers: se utilizan para introducir sitios para enzimas de restricción cohesivos, tienen un
sitio de reconocimiento para una enzima de restricción, se unen al extremo romo del
ADN mediante ligasas. Los sitios de restricción agregados no deben estar presentes en
el ADN genómico.

Genoteca de cDNA (ADN complementario):

Representa solamente los transcritos en un tipo celular o tejido (se prepara de lo

transcrito, la parte activa del genoma), o sea solo los exones.

Para generar una genoteca de cDNA

1. Obtener el ARN total de la célula o tejido de interés.

2. Extraer el ARNm usando técnicas de purificación de ARNm.
3. Convertir el ARNm en cDNA utilizando una transcriptasa inversa y un
oligonucleótido específico llamado primer aleatorio.
4. Añadir adaptadores específicos para la clonación en ambos extremos del cDNA.
5. Clonar el cDNA en un vector de clonación adecuado, como un vector plasmídico
o un vector viral.
6. Transformar las células huésped (bacterias o células eucariotas) con la biblioteca
de cDNA.

No siempre se expresa el cADN que estamos buscando, para aquellos casos se genera
un estimulo y se ocupa la hibridación sustractiva.
Hibridación sustractiva:

Permite la comparación de dos muestras de ADN o ARN para identificar las diferencias
entre ellas. En esta técnica, se usa una muestra de referencia y otra experimental, y se
elimina la información común a ambas muestras mediante la hibridación de una con la
otra y la eliminación de los productos híbridos. De esta manera, se pueden identificar y
aislar las secuencias específicas de la muestra experimental que no están presentes en
la muestra de referencia. La hibridación sustractiva es útil para el descubrimiento de
genes nuevos o diferencialmente expresados en diferentes condiciones experimentales
o patológicas.

Como utilizar una genoteca: sondas

Para utilizar una sonda en una genoteca, primero se debe diseñar una secuencia de ADN
que sea complementaria a la secuencia de interés que se desea detectar. Esta sonda
puede ser marcada con una molécula que permita su detección, como radioactividad,
enzimas o fluorescencia.

Luego, la sonda se hibrida o une a la genoteca, específicamente a los clones que

contienen la secuencia de interés. La hibridación se realiza en condiciones específicas
que permiten la unión de la sonda solo a secuencias específicas de ADN
complementarias a la sonda.

Una vez que la sonda se ha unido a los clones de interés, se pueden detectar utilizando
técnicas de detección apropiadas, dependiendo del tipo de marcador utilizado. Esta
técnica es muy útil para identificar clones de interés en una genoteca grande y compleja.
Tipos de sondas:

- Sondas homólogas: si ya tengo un fragmento del gen de interés, si interesa

encontrar las regiones regulatorias de un gen que ya se tiene clonado, si se
tiene un clon de cDNA pero se quiere clonar el gen desde el ADN genómico.

- Sondas heterólogas: si se tiene el gen, pero de otro origen.

- Sondas oligonucleotídicas generadas por retrotraducción.(al ojo(¿))

Análisis de librerías genómicas:

Ensamble del genoma: si contamos con la posibilidad de secuenciar un genoma el

ensamblaje se puede realizar mediante secuenciación shotgun o con el método
jerarquico, mas existen técnicas indirectas para obtener información sobre la
organización y estructura del genoma, como la construcción de mapas de restricción o
mapas físicos. Estos mapas utilizan enzimas de restricción para cortar el ADN en
fragmentos de tamaño conocido, y luego se organizan estos fragmentos en un mapa que
muestra su posición relativa en el genoma. A partir de estos mapas, se pueden inferir
las características del genoma, como la longitud total y la organización de los genes. Sin
embargo, estas técnicas son limitadas y no proporcionan la misma información detallada
que se obtiene mediante la secuenciación directa del ADN.

Un mapa físico representa el orden de los fragmentos clonados en el genoma, con el

objetivo de saber qué genes son vecinos.
Fingerprint map:

Técnica utilizada para mapear grandes fragmentos de ADN y ayudar en el ensamblaje

del genoma. Se basa en la identificación y comparación de patrones de restricción en
fragmentos de ADN mediante el uso de enzimas de restricción específicas. Los
fragmentos de ADN se separan mediante electroforesis en gel y se identifican mediante
la creación de huellas digitales o "fingerprints". Estos patrones se comparan para
identificar solapamientos y ayudar a construir un mapa físico del genoma.

1. ADN de cada clon se digiere con una enzima de restricción.

2. Los fragmentos se separan por electroforesis en gel de agarosa, obteniéndose
patrones característicos de cada clon.
3. Los patrones se comparan para identificar bandas comunes entre clones.
4. Clones que comparten una banda muy probablemente son vecinos en el
genoma.

STS Fingerprint map:

"Sequence Tagged Site" se refiere a secuencias cortas de ADN de 100 a 1000 pares de
bases que se han asociado con una ubicación específica en el genoma. Un mapa de
huellas dactilares STS utiliza estas secuencias para construir un mapa físico del genoma,
donde se colocan las secuencias STS en un orden determinado según su ubicación
relativa en el cromosoma. Este tipo de mapa es útil para estudiar la organización del
genoma y para identificar genes específicos asociados con enfermedades o rasgos
hereditarios. Se infiere que dos clones se superponen si se encuentra que ambos
contiene el mismo STS.
Secuenciación:

La secuenciación shotgun y la jerárquica son dos enfoques diferentes para secuenciar

un genoma completo.

En la secuenciación shotgun, se fragmenta el ADN en pequeños trozos que se secuencian

de forma aleatoria. Luego, se utiliza un software para ensamblar todas las secuencias en
una sola secuencia continua. Este enfoque es más rápido y económico, pero puede ser
más difícil de ensamblar correctamente debido a la falta de orden en las secuencias.

En la secuenciación jerárquica, se utiliza un enfoque de "abajo hacia arriba". Primero se

secuencia y ensambla fragmentos grandes de ADN, llamados "contigs". Luego, estos
contigs se ensamblan en orden utilizando marcadores genéticos, como STS o SNPs.
Tener un primer mapa, incluso de baja resolución, reduce mucho el coste
computacional.

Izquierda secuenciación shotgun, derecha secuenciación jerárquica

Unidad 3: Técnicas de análisis y modificación del genoma y

transcriptoma