ENZIMOLOGÍA EXPERIMENTAL - Informe 2

ENZIMOLOGÍA EXPERIMENTAL
Integrantes: Francisca Pizarro

Ignacia Soto
Natalia Valderrama
Sofía Vergara
Profesora: Lidia Zuñiga Condor
Asignatura: Bioquímica Básica
Fecha: 14 de junio del 2023
Objetivos de la actividad
1.- Calcular las constantes cinéticas: Vmax y Km de la enzima Fosfatasa ácida.
Este objetivo es para establecer dos constantes cinéticas de la enzima, su Km y su Vmax.
Con esto se puede comparar mecanismos de acción e identificar los mecanismos de
inhibición enzimática. Para cada concentración de sustrato evaluado preparar: Ensayo
completo y blanco enzima.
2.- Calcular la cantidad de producto formado, o-Nitrofenol:
Utilizar el factor de calibración (K) del p-Nitrofenol y la ecuación de Lambert-Beer.
Para cuantificar los sustratos debemos disponer de métodos analíticos que permitan
detectar y cuantificar estas moléculas. Utilizamos La ley de Lambert-Beer que permite
conocer la concentración de una sustancia con solo medir la absorbancia de la misma.
3.- Calcular la Velocidad de reacción (Vo):
Utilizar la cantidad de producto (p-Nitrofenol) formado en 10 minutos de reacción:
Para esto es necesario disponer de una curva de progreso que permita determinar el tiempo
de incubación, establecer que el producto formado en un tiempo de reacción determinado
esté dentro de los límites de detección del método de cuantificación.
4.- Graficar - Calcular la Vmax y Km:
Método de Michaelis-Menten: Graficar en un plano XY los valores de Vo y la [S], en el eje Y
y el eje X respectivamente. Calcular la Vmax y la Km del gráfico. Método de Michaelis-
Menten.
Método de Lineweaver-Burk: Graficar en un plano XY los valores recíprocos 1 / Vo y el 1 /
[S], en el eje Y y el eje X respectivamente. Calcular la Vmax y la Km por extrapolación de la
recta hacia el eje X negativo. Método de Lineweaver-Burk.
Aprendizajes obtenidos:
La actividad que se realizó en el laboratorio fue sobre el efecto de concentración de sustrato
sobre la velocidad de reacción de la enzima Fosfatasa Ácida.
- El efecto de aumento en la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción
enzimática está establecida por la ecuación de Michaelis-Menten, cuya
representación gráfica corresponde a una hipérbola rectangular asintótica.
- Su estudio permite determinar el valor de las dos constantes cinéticas de la enzima,
su Km y su Vmax. Estas nos permiten comparar los mecanismos de acción de
distintas enzimas e identificar los mecanismos de inhibición enzimática.
- Calcular estas constantes cinéticas de manera aproximada, donde se utilizó el
gráfico de Michaelis-Menten, igualmente para obtener de modo exacto se puede
utilizar el gráfico de los dobles recíprocos propuesto por Lineweaver-Burk.
- Se puede calcular la velocidad de reacción con un espectrofotómetro y la relación
existente entre la concentración y la absorbancia planteada. Se puede graficar para
generar una curva de calibración, es decir, una representación gráfica de la
absorbancia.
Procedimientos
1º El ensayo enzimático se preparará con 7 concentraciones diferentes de sustrato
2º Para cada concentración de sustrato se prepara 2 tubos: un blanco enzima (BE) y un

ensayo completo (EC) según indica las tablas adjuntas 1 y 2.
● Tabla 1: Correspondiente a los tubos con blanco enzima.
● Tabla 2: Correspondiente a los tubos ensayo completo (EC)
3º Una vez que todos los tubos BE y EC contengan la mezcla de amortiguador, el sustrato y
el agua correspondientes, serán pre-incubados por 2 minutos a 45ºC.
también se deberá pre-incubar el tubo que contiene sólo enzima por el mismo tiempo
4º Transcurrido el tiempo de pre-incubacion, se procederá a adicionar una alícuota de

enzima solos a los tubos EC, iniciando la reacción
5º la reacción se realizará a 45ºC por 10 minutos y se detendrá adicionado NaOH a todos

los tubos, cumpliendo el tiempo de incubación
6º preparará el blanco para calibrar el espectrofotómetro mezclando 1 ml de 0,4 M de NaOH

+ 4 ml de H2O
Resultado Experimental
En la tabla adjunta podemos ver los resultados correspondiente de cada tubo de manera
ordenada, con estos valores podremos extraer la concentración de sustrato inverso y la
velocidad de la reacción inversa, que nos permiten hacer el gráfico del método lineweaver-
burk.
volumen concentra 1/[p-NFF] Absor Absor Absor Cantidad de velocidad 1/vo

de ción de (mM) bancia bancia bancia producto p- de la (umol/min
sustrato sustrato BC EC correg nitrofenol reacción .)-1
ida (umol) (umol/min.)
0,2 0,15 6,7 0,016 0,175 0,159 0,041 0,004 245,28
0,4 0,3 3,3 0,019 0,218 0,199 0,051 0,005 195,98
0,6 0,45 2,2 0,026 0,265 0,239 0,061 0,006 163,18
0,8 0,6 1,7 0,032 0,23 0,198 0,051 0,005 196,97
1 0,75 1,3 0,036 0,309 0,273 0,070 0,007 142,86
1,5 1,125 0,9 0,052 0,364 0,312 0,080 0,008 125,00

Al hacer el gráfico podemos obtener la ecuación de la recta que nos ayudaran al cálculo.
Para sacar la velocidad máxima tenemos que Km y Vmax. son constantes por lo que
corresponde a la pendiente que es 18,106 y el intercepto corresponde a b en la ecuación
que en este caso es 129,63, entonces para sacar el Vmax tengo que dividir 1 sobre 129,63,
lo que da 0,0077 umol/min.
Luego podemos calcular la constante de Michaelis Menten, donde la pendiente es igual a
Km dividido en Vmax, para poder tener un resultado debemos de despejar, por lo que nos
quedaría que Km es igual a pendiente por Vmax como resultado tenemos que es 0,1397
mM.
Valores obtenidos:
b velocidad
máxima
129,63 0,0077
Pendiente Km
18,106 0,1397
Es decir el valor máximo de reacción que puede tener la reacción es de 0,0077 umol/min. y
la afinidad de la enzima con el sustrato es de 0,1397 mM
Conclusión
En conclusión, la realización de esta actividad experimental permitió calcular las constantes

cinéticas Vmax y Km de la enzima Fosfatasa ácida. Estas constantes son importantes para
comprender los mecanismos de acción de la enzima y detectar posibles mecanismos de
inhibición enzimática.
Se utilizó la ecuación de Michaelis-Menten para analizar el efecto de la concentración de

sustrato en la velocidad de reacción enzimática. A través de gráficos, se obtuvieron los
valores de Vmax y Km. Además, se empleó el método de Lineweaver-Burk, que utiliza
gráficos de los dobles recíprocos, para obtener de manera más precisa las constantes
cinéticas.
Para cuantificar la cantidad de producto formado, se utilizó la ecuación de Lambert-Beer

junto con el factor de calibración del p-Nitrofenol. Esto permitió determinar la concentración
del sustrato a partir de la medición de la absorbancia.
En base a los resultados experimentales obtenidos, se calcularon los valores de Vmax y Km

utilizando los gráficos de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk. Se determinó que el valor
máximo de la velocidad de reacción era de 0,0077 umol/min, mientras que la afinidad de la
enzima con el sustrato (Km) fue de 0,1397 mM.

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ENZIMOLOGÍA EXPERIMENTAL

Integrantes: Francisca Pizarro

2º Para cada concentración de sustrato se prepara 2 tubos: un blanco enzima (BE) y un

● Tabla 1: Correspondiente a los tubos con blanco enzima.

● Tabla 2: Correspondiente a los tubos ensayo completo (EC)

4º Transcurrido el tiempo de pre-incubacion, se procederá a adicionar una alícuota de

5º la reacción se realizará a 45ºC por 10 minutos y se detendrá adicionado NaOH a todos

6º preparará el blanco para calibrar el espectrofotómetro mezclando 1 ml de 0,4 M de NaOH

volumen concentra 1/[p-NFF] Absor Absor Absor Cantidad de velocidad 1/vo

0,2 0,15 6,7 0,016 0,175 0,159 0,041 0,004 245,28

0,4 0,3 3,3 0,019 0,218 0,199 0,051 0,005 195,98

0,6 0,45 2,2 0,026 0,265 0,239 0,061 0,006 163,18

0,8 0,6 1,7 0,032 0,23 0,198 0,051 0,005 196,97

1 0,75 1,3 0,036 0,309 0,273 0,070 0,007 142,86

1,5 1,125 0,9 0,052 0,364 0,312 0,080 0,008 125,00

En conclusión, la realización de esta actividad experimental permitió calcular las constantes

Se utilizó la ecuación de Michaelis-Menten para analizar el efecto de la concentración de

Para cuantificar la cantidad de producto formado, se utilizó la ecuación de Lambert-Beer

En base a los resultados experimentales obtenidos, se calcularon los valores de Vmax y Km

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