11 Practica MICRO 2DA FASE 23

Dra.
Ruth Álvarez Monge
UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA GENERAL Y
ESTOMATOLÓGICA
III SEMESTRE
2DA FASE
47
Dra. Ruth Álvarez Monge
UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
III SEMESTRE
Microbiología 12
GRUPO 2
INTEGRANTES:
● Callahuanca Peñaloza Milagros Fabiola

● Peralta Anconeira Jose Adrian
● Ticona Mamani Katherinne Claudia Rosa
● Zavala Linares Milagros
Arequipa - Perú 2023
47
PRACTICA Nº 11
DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE
ESTREPTOCOCOS ORALES
1. COMPETENCIAS
● Efectuar la toma de la muestra y el examen directo.
● Realizar la siembra para el aislamiento de colonias de Estreptococos en
muestras provenientes de los alumnos.
● Realizar la observación de las características morfológicas de las colonias y
tinción de Gram.
● Identificar Streptococcus mediante pruebas bioquímicas.
● Efectuar la observación microscópica de S. mutans con tinción de Gram.
2. MARCO TEÓRICO
Según la edición de 1984 del Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática,

la familia Streptococcaceae se divide en 10 géneros, incluído Streptococcus.
Posterior a dicha publicación se han propuesto y aceptado varias modificaciones
en lo que respecta a la taxonomía de los estreptococos y las bacterias similares a
los estreptococos. Según estudios de hibridación de DNA-RNA ribosómico y de
análisis de secuencias de rRNA, los microorganismos incluidos anteriormente en el
género Streptococcus han sido subdivididos en tres géneros: Streptococcus,
Enterococcus y Lactococcus.
El género Streptococcus comprende los estreptococos piógenos (es decir, los

estreptococos de los grupos A, B, C de Lancefield), los estreptococos grupo D no
enterococos, los estreptococos viridans y los neumococos. El género Enterococcus
incluye los antiguos Enterococos del grupo D, mientras que el género Lactococcus
(estreptococos del ácido láctico) incluye los estreptococos que presentan el
antígeno del grupo N de Lancefield.
En la cavidad oral las especies del género Streptococcus se aíslan en mayor

cantidad y frecuencia. Son cocos gram positivos agrupados en cadenas cortas o
48
largas, son anaerobios facultativos, crecen en agar sangre, algunas cepas se

desarrollan en una atmósfera de 5-10% de CO2, son oxidasa negativos, catalasa
negativos, su metabolismo es homofermentativo (el único producto de la
fermentación de la glucosa es el ácido láctico). Las colonias son pequeñas con 3
hemolisis. En los medios de cultivo líquidos (caldos) el crecimiento es variable con
turbidez homogénea o granular, su temperatura óptima de crecimiento es de 37°C.
3. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE ESTREPTOCOCOS ORALES
Material Biológico.
a. Muestras procedentes de la cavidad oral,
b. pieza dental con caries,
c. cepa certificada de Streptococcus mutans.
Material de Laboratorio y Equipos.
d. Placas Petri con agar sangre,
e. Placas Petri con agar mitis salivarius (MSA),
f. tubos de ensayo con caldo BHI,
g. tubos de ensayo con agar manitol 6.5%,
h. tubos con inulina,
i. tubos con Esculina,
j. tubos con Rafinosa,
k. tubos con arginina dehidrolasa/descarboxilasa (ADH)
l. discos de bacitracina2U/ml,
m. hisopos de 6", hisopos pequeños,
n. bajalenguas, portaobjetos, mechero de Bunsen, colorantes y reactivos de

la tinción de Gram, aceite de inmersión, instrumental, lupas, estufa de
cultivo, refrigeradora y microscopio.
4. PROCEDIMIENTO
49
a. Toma de la muestra.- Con un hisopo tomar la muestra de la orofaringe y

con el asa bacteriológica o el instrumental apropiado obtener la muestra de
la pieza dental con caries.
b. Examen directo.- Se efectúa realizando el frotis de la muestra y la tinción

de Gram. Se observa una muestra del dorso de lengua con tinción Gram a
100X, la flecha señala una cadena de estreptococos gram positivos.
c. Cultivo.- Efectuar la siembra para el aislamiento de colonias en agar

sangre y agar selectivo para estreptococos. Después de 24 - 48 horas de
incubación a 37°C observar las características morfológicas de las
colonias. Las colonias de los estreptococos del grupo viridans son alfa
hemolíticas en cambio las colonias de los estreptococos patógenos son
beta hemolíticas, las colonias en el agar MSA presentan margen irregular,
superficie granular y a veces están rodeadas por una zona clara debido a
la producción in vitro de polisacáridos extracelulares.
d. Cultivo de la muestra en caldo. Inocular la muestra en un tubo con caldo

BHI observar el aspecto del desarrollo en la superficie del cultivo (película,
membrana, anillo), la turbidez presente o ausente, (homogénea o granular)
y el sedimento cantidad y consistencia (escaso o abundante, granular o
cremoso).
Hacer la tinción de Gram de las colonias y del cultivo en caldo.
e. Identificación. - Comprende los siguientes pasos según el esquema de la

Tabla N° 3. Identificación de estreptococos orales.
50
● Las pruebas de manitol, inulina, rafinosa y lactosa detectan la producción de

ácidos a partir de estos compuestos.
● La resistencia a 2 U/ml de bacitracina puede realizarse en un caldo conteniendo

manitol, indicador de pH y el antibiótico, la prueba positiva (o cepa resistente)
está dada por el crecimiento y acidificación del medio. Esta prueba también se
realiza en una placa de agar sangre con un disco de bacitracina de 0.04 U para
la identificación de estreptococos del grupo A p-hemolíticos.
● La prueba de la esculina detecta su hidrólisis en esculetina y glucosa.
● La producción de acetoina permite detectar este compuesto en el curso de la

vía metabólica 2-3-butilenglicólica.
● La prueba de la ADH o arginina dehidrolasa/descarboxilasa pone de manifiesto

estas enzimas que a partir de la arginina producen una amina, putrescina y
amoniaco que alcalinizan el medio.
● Las pruebas B-glucosidasa y N-acetilglucosaminidasa detectan enzimas

hidrolíticas preformadas que, actuando sobre el sustrato liberan productos
coloreados.
51
Tabla N° 4: Identificación de estreptococos y enterococos
● Optoquina (halo de inhibición de 14 mm o más con un disco que contenga 5

ug de clorhidrato de etilhidroxicupreína).
● Solubilidad en la bilis (tisis en presencia de sales biliares).
● BEA: bilis esculina agar (hidrólisis de la esculina en glucosa y esculetina en

presencia de sales biliares al 4%).
● CINa 6.5% (crecimiento en presencia de CINa al 6.5%).
● PYR: pirrolidonilarilaminopeptidasa (liberación de (3-naftilamida a partir de

L-pirrolidonil-p-naftilamida).
● Bacitracina (halo de inhibición de 14 mm o más con un disco que contenga

0.04 U de bacitracina).
● CAMP: aumento de la hemolisis de una estría de la cepa problema en la

zona próxima a otra estría (3 -hemolítica de un estafilococo).
● Hidrólisis del hipurato (acción de una enzima, hipurásica, que transforma el

ácido hipúrico en benzoato de sodio y glicina).
52
5. RESULTADOS
a. Esquematizar o insertar fotografías de la toma de muestra y siembra

realizada en la práctica.
Esquematizar o insertar fotografías de las colonias que han desarrollado en

los cultivos de agar sangre y agar MSA
i. Dibujar o insertar fotografías de tinción de Gram de los cultivos de agar

sangre y agar MSA.
53
Colonia Agrupaci Reacción

ón tintoreal al
De la muestra
Gram
A Estafiloco Positiva
s.Epidermidis cos
B s. Salivarius Streptococ Positiva
os
Visibles en el microscopio con
Aumento del Aumento Aumento total
ocular del
objetivo
10x 40x 400x
10x 10x 100x
b. Dibujar el Gram del cultivo en caldo. Responder en los espacios del siguiente
cuadro.
Colonia Agrupación Reacción

BHI tintoreal al Gram
Muestra Streptococcus positiva

s. salivarius
Visibles en el microscopio con
Aumento Aumento del Aumento total

del ocular objetivo
10x 100x 1,000x
54
c. Esquematizar o insertar fotografías de las pruebas bioquímicas utilizadas

en el laboratorio para la identificación de estreptococos orales.
Pruebas
bioquímicas
Catalasa
Manitol
6.5%
Bacitracina
2 µ/ml
55
Inulina
Otras pruebas
56
d. Dibujar o insertar fotografías de la observación microscópica de la colonia

de una cepa certificada de S. mutans con tinción de gram.
6. CUESTIONARIO
a. ¿Se requiere realizar antibiograma? ¿Por qué?

➔ Si, Las pruebas de sensibilidad o antibiogramas determinan la susceptibilidad de un
microorganismo frente a los medicamentos antimicrobianos, a partir de la exposición de
una concentración estandarizada del germen a estos fármacos. Las pruebas de
sensibilidad pueden hacerse para bacterias, hongos o virus. Para algunos
microorganismos, los resultados obtenidos con un fármaco permiten predecir los resultados
que se obtendrán con fármacos similares. Así, no todos los medicamentos potencialmente
útiles necesitan probarse.
1. Vazquez-Pertejo MT. Pruebas de sensibilidad o antibiogramas [Internet]. Manual MSD
versión para profesionales. [citado el 15 de mayo de 2023]. Disponible en:
https://www.msdmanuals.com/es/professional/enfermedades-
57
infecciosas/diagn%C3%B3stico-de-laboratorio-de-las-enfermedades-
infecciosas/pruebas-de-sensibilidad-o-antibiogramas
b. ¿De qué lugares de la cavidad oral se aísla S. mutans? ¿Por qué?
La diversidad genotípica de S.mutans en cuatro sitios de muestreo (saliva, dorso de la

lengua, mucosa alveolar y biopelícula dental) de niños parece ser homogénea, sin
embargo, la biopelícula dental es un lugar muy importante dado el gran número de
genotipos de S.mutans y las cepas aisladas.
1. Berkowitz RJ. Streptococcus mutans: adquisición y transmisión. Odontología Pediatrica.

2006;28(2):106-9; discusión 192-8. http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120-
971X2013000100005
c. ¿Qué tipo de hemólisis presentan las colonias de S. mutans?
Streptococcus mutans es un estreptococo a-hemolítico o no hemolítico, que se visualiza

como bacilo cuando se aísla de un medio con pH ácido y como cocácea cuando se sub-
cultiva en un medio neutro o alcalino
1. Porte L, Lorena, Braun J, Stephanie, Dabanch P, Jeannette, Egaña, Alicia, & Andrighetti, Daniela.
(2009). Streptococcus mutans: Una bacteria que hace honor a su nombre. Revista chilena de
infectología, 26(6), 571. https://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182009000700017
d. ¿Qué pruebas bioquímicas identifican a S. mutans?
Prueba de la oxidasa: S. mutans es oxidasa negativa, es decir, no produce la enzima

oxidasa. Al aplicar una tira o reactivo de oxidasa a una colonia de S. mutans, no se
producirá un cambio de color o desarrollo de un color azul oscuro.
Prueba de la fermentación de carbohidratos: S. mutans es capaz de fermentar varios

carbohidratos, como la glucosa, la lactosa y la sacarosa. La fermentación de estos
azúcares produce ácido láctico como producto final, lo que reduce el pH y puede contribuir
a la formación de caries dental.
Prueba de la catalasa: S. mutans es catalasa negativa, lo que significa que no produce la

enzima catalasa. Se aplica peróxido de hidrógeno a una colonia de S. mutans, y si no se
produce burbujeo de oxígeno, se confirma la negatividad para catalasa.
1. Ojeda-Garcés Juan Carlos, Oviedo-García Eliana, Salas Luis Andrés.

Streptococcus mutans y caries dental. CES odontol. [Internet]. enero de 2013
58
[citado el 15 de mayo de 2023]; 26(1): 44-56. Disponible en:

http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120-
971X2013000100005&lng=en.
7. BIBLIOGRAFÍA PARA CONSULTAR
Liébana Ureña, J.; Castillo Pérez, A. Ma.; Rodríguez-Avial López-Dóriga, C.

Género Streptococcus y bacterias relacionadas. En Liébana Ureña, José.
Microbiología Oral. 2a edición. Editorial McGraw-Hill Interamericana. España,
2002. p.325-344.
59

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Dra.

Ruth Álvarez Monge

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA

● Callahuanca Peñaloza Milagros Fabiola

Arequipa - Perú 2023

Según la edición de 1984 del Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática,

El género Streptococcus comprende los estreptococos piógenos (es decir, los

En la cavidad oral las especies del género Streptococcus se aíslan en mayor

largas, son anaerobios facultativos, crecen en agar sangre, algunas cepas se

3. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE ESTREPTOCOCOS ORALES

a. Muestras procedentes de la cavidad oral,

b. pieza dental con caries,

c. cepa certificada de Streptococcus mutans.

Material de Laboratorio y Equipos.

d. Placas Petri con agar sangre,

e. Placas Petri con agar mitis salivarius (MSA),

f. tubos de ensayo con caldo BHI,

g. tubos de ensayo con agar manitol 6.5%,

h. tubos con inulina,

i. tubos con Esculina,

j. tubos con Rafinosa,

k. tubos con arginina dehidrolasa/descarboxilasa (ADH)

m. hisopos de 6", hisopos pequeños,

n. bajalenguas, portaobjetos, mechero de Bunsen, colorantes y reactivos de

a. Toma de la muestra.- Con un hisopo tomar la muestra de la orofaringe y

b. Examen directo.- Se efectúa realizando el frotis de la muestra y la tinción

c. Cultivo.- Efectuar la siembra para el aislamiento de colonias en agar

d. Cultivo de la muestra en caldo. Inocular la muestra en un tubo con caldo

Hacer la tinción de Gram de las colonias y del cultivo en caldo.

e. Identificación. - Comprende los siguientes pasos según el esquema de la

● Las pruebas de manitol, inulina, rafinosa y lactosa detectan la producción de

● La resistencia a 2 U/ml de bacitracina puede realizarse en un caldo conteniendo

● La prueba de la esculina detecta su hidrólisis en esculetina y glucosa.

● La producción de acetoina permite detectar este compuesto en el curso de la

● La prueba de la ADH o arginina dehidrolasa/descarboxilasa pone de manifiesto

● Las pruebas B-glucosidasa y N-acetilglucosaminidasa detectan enzimas

Tabla N° 4: Identificación de estreptococos y enterococos

● Optoquina (halo de inhibición de 14 mm o más con un disco que contenga 5

● Solubilidad en la bilis (tisis en presencia de sales biliares).

● BEA: bilis esculina agar (hidrólisis de la esculina en glucosa y esculetina en

● CINa 6.5% (crecimiento en presencia de CINa al 6.5%).

● PYR: pirrolidonilarilaminopeptidasa (liberación de (3-naftilamida a partir de

● Bacitracina (halo de inhibición de 14 mm o más con un disco que contenga

● CAMP: aumento de la hemolisis de una estría de la cepa problema en la

● Hidrólisis del hipurato (acción de una enzima, hipurásica, que transforma el

a. Esquematizar o insertar fotografías de la toma de muestra y siembra

Esquematizar o insertar fotografías de las colonias que han desarrollado en

i. Dibujar o insertar fotografías de tinción de Gram de los cultivos de agar

Colonia Agrupaci Reacción

Colonia Agrupación Reacción

Muestra Streptococcus positiva

Visibles en el microscopio con

Aumento Aumento del Aumento total

10x 100x 1,000x

c. Esquematizar o insertar fotografías de las pruebas bioquímicas utilizadas

d. Dibujar o insertar fotografías de la observación microscópica de la colonia

a. ¿Se requiere realizar antibiograma? ¿Por qué?