Practica: Protocolo para La Determinación de Azúcares Totales en Hortalizas Mediante El Método de Dns I. Introducción

UNIVERSIDAD NACIONAL HERMILIO VALDIZAN
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA

AGROINDUSTRIAL
COMPOSICIÓN DE RECURSOS AGROINDUSTRIALES Código: CC. RR. AA
Jefe de prácticas Ing. César Cueto Rosales Pág. : 04
PRACTICA: Fecha : 20/07/17 (G2)
PROTOCOLO PARA LA DETERMINACIÓN DE
AZÚCARES TOTALES EN HORTALIZAS
MEDIANTE EL MÉTODO DE DNS
I. Introducción
Los carbohidratos, junto con las proteínas y los lípidos, son los constituyentes principales de los
organismos vivos y se clasifican en mono, oligo y polisacáridos además de ser fuente abundante de
energía. Los monosacáridos son compuestos que no pueden ser hidrolizados a compuestos más
simples como, por ejemplo, la glucosa (aldosis) y la fructosa (cetosis). Los oligosacáridos y los
polisacáridos se forman por moléculas de monosacáridos unidos por enlaces hemiacetálicos. Las
pruebas de azúcares se basan en reacciones de óxido-reducción por el grupo hidroxílico
hemiacetálico del monosacárido, que puede reaccionar con iones y formar complejos de color
(BOBBIO y BOBBIO, 2005) o por reacciones de color procedentes de la condensación de
productos de degradación de los azúcares en ácidos Con varios compuestos orgánicos como fenol y
antrona. Los monosacáridos son azúcares reductores. La prueba de DNS (ácido dinitrosalicílico) se
basa en la reacción entre el azúcar reductor y el ácido 3,5-dinitrosalicílico (color amarillo), que se
reduce a un compuesto coloreado rojizo, el ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, oxidando El
monosacárido reductor (Figura 1).
Figura 1. Esquema de las reacciones implicadas en el método DNS.

Objetivo: Determinar los azúcares reductores totales en hortalizas por el método de DNS.
II. Materiales y métodos
Reactivos
Glucosa P.A.
Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)
Metabisulfito de sodio
Hidróxido de sodio (NaOH 2N)
Fenol
Ácido clorhídrico (HCl 2N)
Tartrato doble de sodio y potasio tetrahidrato
(KNaC4H4O6.4H2O)
Equipos y materiales de vidrio

Balanza analítica
Baño termostático con circulación de agua
Agitador de tubos de ensayo
Pipetas graduadas (1 mL, 10 mL y 20 mL)
Tubos de ensayo de 16 mL
Matraz volumétrico de 100 mL
Vasos de precipitados diversos
Frascos ámbar
Cronómetro digital
Espectrofotómetro
Cubetas de vidrio
Preparación de soluciones
 Solución estándar de glucosa o fructosa a 1,0 g / L

Pesar en balanza analítica 0,1000 g de glucosa o fructosa, luego disolver en aproximadamente
20 mL de agua destilada bajo agitación constante, transferir analíticamente a un matraz
volumétrico de 100 mL, completar el volumen con agua destilada y homogeneizar
vigorosamente. Esta solución debe prepararse y utilizarse el día del análisis.
 Reactivo DNS
Para la preparación del reactivo DNS, inicialmente pesar 10,6 g de ácido 3,5 dinitrosalicílico
y 19,8 g de NaOH y disolver en 1416 mL de agua destilada. A continuación, añadir 7,6 mL
de fenol (fundido a 50 ° C) y 8,3 g de metabisulfito de sodio. Agitar y almacenar la solución
en frasco ámbar en refrigerador, por un máximo de 30 días.
 Solución de tartrato doble de sodio y potasio

Pesar 15,1 g de tartrato doble de sodio y potasio tetrahidratado y disolver en un litro de agua
destilada. Almacenar la solución en frasco ámbar a temperatura ambiente hasta 30 días.
 Solución de NaOH 2N
Pesar 40 g de hidróxido de sodio anhidro, diluir en agua destilada y ajustar el volumen a 500
mL en un balancín volumétrico.
 Solución de HCl 2N
Medir 85 mL de ácido clorhídrico (HCl) en una capilla, diluir en agua destilada y ajustar el
volumen a 500 mL en un balón volumétrico.
Curva estándar de azúcar reductor
Realizar diluciones de la solución estándar de 1,0 g / L de glucosa o fructosa con agua destilada en
tubos de ensayo, como se muestra en la Tabla 1. Agitar los tubos para homogeneizar, retirar una
alícuota de 1,0 mL y hacer la prueba de DNS.
Tabla 1. Preparación de las diluciones de la solución patrón de glucosa o fructosa a 1,0 g / L.
Concentración Volumen de
Agua destilada
de glucosa solución patrón
(mL)
(g/L) (mL)
0.10 1.0 9.0
0.20 2.0 8.0
0.30 3.0 7.0
0.40 4.0 6.0
0.50 5.0 5.0
0.60 6.0 4.0
0.70 7.0 3.0
0.80 8.0 2.0
0.90 9.0 1.0
1.00 10.0 0.0
Determinación de la curva patrón

En la ecuación de la recta, en una hoja de cálculo o calculadora científica, la concentración de
glucosa (g/L) en el eje Y y la absorbancia (ABS) obtenida con la prueba de DNS en el eje X, como
se muestra en la Figura 2, y calcular la ecuación de la recta.
Figura 2. Ejemplo de curva estándar de azúcar reductor (AR) en g/L. Ecuación de la recta:
Concentración AR (g/L) = 1,3894 * ABS + 0,0762 (R² = 0,9965).
Preparación de la muestra
Pesar 100 g de la hortaliza y homogeneizar en mezclador o licuadora por 3 minutos. Retirar una
alícuota de 10 g y añadir agua destilada hasta completar 50 ó 100 mL, en matraz volumétrico. El
volumen final dependerá de la concentración de azúcar presente en la muestra, por lo que el
volumen final puede variar según el tipo de hortalizas. La concentración final de azúcares
reductores de la muestra debe situarse entre 0,1 y 1,0 g / L, según la curva de calibración. La
muestra diluida deberá centrifugarse a 15.000 rpm durante 15 minutos. Retirar 1,0 mL del
sobrenadante y hacer la prueba de DNS.
Si la muestra contiene azúcares no reductores como la sacarosa, es necesario hacer hidrólisis de la

muestra. En este caso, extraer 2,0 ml del sobrenadante y añadir 2,0 mL de HCl 2N y calentar en
baño maría en ebullición por 10 minutos. Enfriar la muestra en baño de hielo y añadir 2,0 mL de
NaOH 2N y agitar. Retirar 1,0 mL del sobrenadante y realizar la prueba de DNS.
Prueba de DNS: procedimiento de determinación de azúcares reductores
Pipetear 1,0 mL de la muestra en un tubo de ensayo y añadir 1,0 mL del reactivo DNS. Agitar y
Calentar en baño de agua a 100 ° C (en ebullición) durante 5 minutos. Enfriar el tubo en baño de
hielo durante 5 minutos. Añadir 16 ml de la solución de tartrato doble de sodio y potasio. La lectura
de la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm, después de poner a cero el aparato con el blanco.
El blanco consiste en sustituir el volumen de muestra o solución de glucosa por agua destilada (1,0
mL) y realizar la prueba de DNS.
OBS. La muestra debe diluirse convenientemente de manera que su concentración sea, como
máximo, 1,0 g / L.
Cálculo
A partir de la ecuación de la recta, calcular la concentración de azúcar reductora en la muestra. Se

deben considerar en los cálculos las diluciones efectuadas en la muestra, multiplicando el resultado
por ese factor.
Ejemplo:
En 10 g de camote homogeneizada y diluida
Para 50 ml con agua destilada, tenemos:
ABS (abssorvancia) = 0.780
Concentración final de la solución = 1.3894*0.78 + 0.0762 = 1.16 g/L
Concentracion final en base humeda = (1.16 g * 50 mL)/1000 mL = 0.0058 g AR/g de camote o
0.58% (p/p).
Referencias
BOBBIO, F. O.; BOBBIO, P. A. Química de Alimentos. São Paulo: Varela, 2005.

CECCHI, H. M. Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos. 2.ed. Campinas:
Unicamp, 2003. p. 73.
MALDONADE, I. R.; RODRIGUEZ-AMAYA, D.; SCAMPARINI, A. R. P. Carotenoids yeasts
isolated from the Brazilian ecosystem. Food Chemistry, London, v. 107, n. 1, p. 145-150, Mar.
2008.
MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical
Chemistry, Washington, US, v. 31, n. 3, p. 426-428, Mar. 1959.

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Figura 1. Esquema de las reacciones implicadas en el método DNS.

II. Materiales y métodos

Equipos y materiales de vidrio

 Solución estándar de glucosa o fructosa a 1,0 g / L

 Solución de tartrato doble de sodio y potasio

Curva estándar de azúcar reductor

Tabla 1. Preparación de las diluciones de la solución patrón de glucosa o fructosa a 1,0 g / L.

Determinación de la curva patrón

Si la muestra contiene azúcares no reductores como la sacarosa, es necesario hacer hidrólisis de la

Prueba de DNS: procedimiento de determinación de azúcares reductores

A partir de la ecuación de la recta, calcular la concentración de azúcar reductora en la muestra. Se

BOBBIO, F. O.; BOBBIO, P. A. Química de Alimentos. São Paulo: Varela, 2005.

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