Bioquimia

ISSN: 0185-5751
[email protected]
Sociedad Mexicana de Bioquímica A. C.
México

Bonilla, Edmundo; Párraga, Mario; López, Luis A.; Escolar, Fernando; Mazo, Jesús del
Cuantificación de la expresión génica a partir de un número limitado de células mediante RT-PCR en
tiempo real
Bioquimia, vol. 27, núm. 1, enero-marzo, 2002, pp. 3-7
Sociedad Mexicana de Bioquímica A. C.
Distrito Federal, México

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=57611570001

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 ARTICULOS CIENTIFICOS
GENETICA

Cuantificación de la expresión génica

a partir de un número limitado de células
mediante RT-PCR en tiempo real
Edmundo Bonilla *2, Mario Párraga1, Luis A. López1, Fernando Escolar1 y Jesús del Mazo1
Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Madrid, España;
1
2
Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, México
*Sobretiros: Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa , Av- Michoacán y Purísima s/n
Col. Vicentina, CP 09340, México DF, Fax: 58 04 47 27, e-mail: [email protected]
Recibido: 21/09/2001 Aceptado: 24/10/2001

Resumen Abstract

La cuantificación de la expresión génica mediante los métodos Quantification of gene expression by classical methods requires
clásicos requiere de cantidades de RNAm difíciles de obtener cuando amounts of mRNA difficult to obtain when the number of
el número de muestras experimentales es limitado. Recientemente experimental samples is limited. Recently, a new detection
ha sido introducida una nueva tecnología que permite la technology that facilitates real-time detection of specific
cuantificación precisa de los amplicones durante cada ciclo del amplification product during PCR has been introduced
PCR (LightCycler; Roche). En este estudio hemos utilizado esta (LigthCycler; Roche). In this study, we have used this
tecnología para analizar la expresión de algunos genes en ovocitos technology to analyze the expression of single genes in fetal
fetales de ratón en cultivo. Las reacciones de RT-PCR se llevaron a mouse oocytes. RT-PCR was performed on whole oocytes lysates
cabo a partir de lisados completos de ovocitos para evitar la pérdida in order to avoid RNA loss during its isolation. Amplification of
de RNAm causada por su aislamiento. La amplificación de DNA genomic DNA was prevented by digesting it with RNase-free
genómico se previno mediante su digestión con DNAsa libre de DNase. The method used allowed us specific PCR amplification
RNAsas. La metodología empleada nos permitió la amplificación y and quantification of abundant (e.g. S16 ribosomal protein)
cuantificación de RNAms con expresión alta (e.g. proteína ribosomal and moderate (copper-zinc superoxide dismutase) mRNAs from
S16) y moderada (Cu/Zn superóxido dismutasa) a partir de sólo dos as few as two oocytes, while specific amplification and
ovocitos. Para la amplificación y cuantificación de transcritos quantification of less abundant transcripts (Metaxin) required 8
escasos (Metaxina) se requirió de un mínimo de ocho ovocitos. La oocytes as starting material. PCR amplification using this
amplificación por PCR usando esta metodología puede ser muy útil technology provides a unique opportunity to study gene
en el análisis de la expresión génica en condiciones en las que el expression in conditions where the amount of experimental
material biológico disponible es muy limitado. material is very limited.

Palabras clave: Cuantificación de la expresión génica, RT-PCR en Key words: Quantification of gene expression, Real time RT-PCR.
tiempo real.

Introducción valorar la cantidad de DNA presente en cada ciclo de amplificación

de PCR2. Así, el aumento de fluorescencia se corresponde con la
La evaluación de la expresión génica mediante los métodos clásicos
cantidad de producto formado, y al comparar estos resultados con
requiere de una gran cantidad de RNAm que es difícil de obtener
los obtenidos en una curva estándar, se logra la cuantificación de
cuando el número de muestras es limitado o cuando el material
los amplicones en cada ciclo. Esta tecnología permite, además,
biológico es una población de diferentes tipos celulares. Aunque
diferenciar las amplificaciones específicas de aquellas inespecíficas
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha tenido un fuerte
(debidas a la formación de dímeros de los oligonucleótidos
impacto en esta área, su uso en la cuantificación de la expresión
utilizados), determinando el punto de fusión de los amplicones y
génica ha sido problemática, principalmente debido a la naturaleza
considerando que los productos específicos tienen generalmente
exponencial del PCR, donde pequeñas diferencias en la eficiencia
un mayor punto de fusión que los productos inespecíficos. Una
de la amplificación pueden alterar de manera significativa el
ventaja adicional de esta metodología se basa en que el marcador
rendimiento del producto de la amplificación (amplicón) 1 .
fluorescente SYBR Green I es al menos 10 veces más sensible que el
Recientemente ha sido introducida una nueva tecnología que
bromuro de etidio, lo que facilita el análisis de los productos de
permite la cuantificación precisa de los amplicones durante cada
ciclo del PCR (LightCycler; Roche diagnostics, Indianapolis, USA).
En ésta se emplean marcadores fluorescentes, como el SYBR Green I, Este trabajo contó con el apoyo de DGICYT (PB95-0119), EU (PL 960183)
y CAM (07B/0022/1997). E. Bonillacontó con el apoyo de UAM y CONACYT
que mediante su unión a ácidos nucleicos de doble cadena permite para la realización de estudios de doctorado en el CIB, Madrid, España.

ENERO-MARZO 2002 3
 BONILLA Y COL.

PCR cuando se trabaja con cantidades limitadas de DNA. Y de Petri de 10 cm, y se incubaron a 37oC en una atmósfera con 5%
finalmente, es una metología que consume muy poco tiempo: un de CO2. Después de 2 días, cuando los explantos de ovario estaban
experimento de RT-PCR se realiza en unos 20-30 minutos. adheridos a la placa (fig. 1A), los bloques flexiPERM fueron retirados,
y se añadieron 10 mL de medio de cultivo por placa. Se observó
Durante los últimos años, en nuestro laboratorio hemos diariamente el crecimiento y desarrollo de los ovocitos. Después de
estudiado la expresión génica en la gametogénesis [proceso de 6 días de cultivo, la mayoría de los ovocitos alcanzaron el estadio
diferenciación que lleva a la formación de espermatozoides de vesícula germinal (VG), mostrando un tamaño de
(espermatogénesis) o de ovocitos (ovogénesis)] de los mamíferos3,4. aproximadamente 70 µm (fig. 1C). Los ovocitos en el estadio de VG
La diferenciación de células germinales en la espermatogénesis se se aislaron de los explantos de ovario mediante pipeteo repetido
inicia en la etapa prepuberal, y es un proceso continuo en el que hasta que los ovocitos fueron liberados (fig. 1D). Estos se lavaron
después de la primera oleada meiótica se mantiene en PBS-DEPC y se almacenaron en tubos para PCR a -70°C (10
ininterrumpidamente hasta la vida adulta, y a lo largo de ésta, por ovocitos por tubo en 0.5 µL de agua-DEPC).
lo que el análisis molecular de este proceso es algo más conocido
que el correspondiente del sexo femenino en mamíferos. En este
sentido, los estudios sobre la oogénesis son escasos, dado que la
diferenciación de los ovocitos se lleva a cabo únicamente en estadios

A
fetales, por lo que son relativamente inaccesibles a la manipulación
experimental, y la cantidad de material biológico disponible para
su análisis es escaso. La cuantificación de la expresión génica
mediante RT-PCR en tiempo real a partir de un escaso número de
células ha sido reportado recientemente 5. En este estudio sin
embargo, sólo se llevó a cabo la amplificación de transcritos
abundantes, y no se tomaron en cuenta las amplificaciones
inespecíficas debidas a DNA genómico (especialmente mitocondrial),
que son frecuentes cuando se lleva a cabo la amplificación a partir de
lisados celulares completos. B
Con el objetivo de disponer de una herramienta que nos
permitiera el análisis sensible de la expresión génica empleando un
bajo número de células, en el presente estudio se utilizó la
tecnología del LightCycler y se estandarizaron las condiciones
metodológicas para eliminar las amplificaciones inespecíficas
debidas a la presencia de DNA genómico, y poder así llevar a cabo
el análisis de la expresión de genes expresados alta, mediana o
escasamente en ovocitos fetales de ratón cultivados in vitro.
C

Material y métodos

El cultivo in vitro de ovocitos fetales se llevó a cabo básicamente

según la metodología descrita6. Ovarios de embriones de ratón de
17 días post-coito (dpc) fueron disectados en medio de recolección D
[medio MEM (Gibco) suplementado con 1mg/mL de BSA fracción V
(Sigma) y 100 µg/mL de penicilina y estreptomicina]. Cada ovario se
cortó en fragmentos de 0,5-1 mm utilizando agujas finas (G 5/8)
bajo el estereomicroscopio. Los fragmentos se colocaron en 250 µL
de medio de cultivo [medio Waymouth (Gibco) suplementado con Figura 1. Cultivo in vitro de ovocitos fetales. A: explanto de
5% de suero de caballo, 2.5% de suero fetal de ternera, y 100 µg/mL ovario adherido a la placa Petri después de 2 días de cultivo. B:
explanto a los 4 días de cultivo. C: ovocitos en estadio de vesícula
de penicilina y estreptomicina] en los pozos formados por la adhesión
germinal a los 6 días de cultivo. D: ovocitos aislados de los
de los bloques para cultivos celulares flexiPERM (Heraeus) a placas explantos de ovario.

4 BIOQUIMIA VOL. 27 NO. 1, 3 -7, 2002

 CUANTIFICACION DE LA EXPRESION GENICA

Cuadro 1. Oligonucleótidos empleados en las amplificaciones por PCR

RNAm diana Oligonucleótido U Oligonucleótido L Tamaño del

amplicón (pb)
Citocromo c oxidasa
(subunidad II) 5’-AGGGCACCAATGATACTGAA-3’ 5’-TCTAGGACAATGGGCATAAA-3’ 335
Cu/Zn superóxido dismutasa 5’-TATGGGGACAATACACAAGG-3’ 5’-GTTTGAGGGTAGCAGTTGAG-3’ 363

Proteína ribosomal S16 5’-AGGAGCGATTTGCTGGTGTGGA-3’ 5’-GCTACCAGGCCTTTGAGATGGA-3’ 102

Metaxina 5’-ATCAGAGAACGAGGAGGAAC-3’ 5’-GATAGAAACGATGCCACTGA-3’ 406

Las reacciones de retrotranscripción (RT) se realizaron se utilizaron para la amplificación. Varias diluciones (1:100, 1:1000
directamente sobre lisados completos de ovocitos, para evitar la y 1:5000) de la proteína ribosomal S16 se amplificaron
pérdida de RNA durante su aislamiento 7. La amplificación de DNA simultáneamente para elaborar una curva patrón que serviría para
genómico se impidió mediante la digestión de los lisados con realizar la cuantificación de los productos de PCR mediante
DNAsa libre de RNAsas antes de la reacción de RT, siguiendo la interpolación. Las condiciones para la reacción de PCR fueron:
metodología descrita a continuación. desnaturalización inicial a 94 °C durante 2 min; 40 ciclos de
desnaturalización a 94 °C durante 1 s, anillamiento durante 10 s a
Inmediatamente antes de iniciar el experimento, 10 ovocitos la temperatura óptima para cada par de oligonucleótidos, extensión
fueron lisados mediante dos pasos de congelación y descongelación a 72 °C durante 16 s. La intensidad de la fluorescencia se registró
rápida a –70 oC. Los reactivos para la RT [tampón de RT 1X (Gibco), al final de cada fase de anillamiento.
10 mM DTT, 0.5% NP40, 1.5 U/µL de inhibidor de RNAsas (Promega),
0.5 µL de cada nucleótido (Pharmacia) y 3.75 µM de oligo(dT)17] se Después de la amplificación se determinaron los puntos de
mezclaron y 7.5 µL de ésta mezcla se añadieron a los lisados de fusión de los amplicones, generando curvas de fusión de la siguiente
ovocitos. Las muestras se calentaron a 65 °C 1 min para lisar las manera: las muestras se mantuvieron a 50 °C durante 5 s para
membranas mitocondriales, y se mantuvieron en hielo. A facilitar la unión del marcador SYBR Green al DNA de doble cadena,
continuación, se añadieron 2 U de DNAsa libre de RNAsas, y la generando una fluorescencia máxima. La temperatura se elevó
digestión se realizó a 37 °C durante 5 min. Al finalizar, la DNAsa se lentamente (0.2 °C/s) hasta alcanzar 95 °C para permitir la
inactivó mediante incubación a 65 °C durante 5 min, y los tubos desnaturalización del DNA. Cuando se alcanza este punto, las
se dejaron enfriar a temperatura ambiente para permitir el cadenas de DNA se separan, y también por tanto el marcador SYBR
anillamiento del oligo(dT)17. Se añadieron 160 U de la transcriptasa Green, lo que origina un notable decaimiento en la fluorescencia.
reversa Superscript (Gibco) a los lisados de ovocitos, y la RT se Las curvas de fusión generadas se convirtieron en picos de fusión
llevó a cabo a 37 °C durante 15 min. La transcriptasa reversa fue graficando el negativo de la derivada de la fluorescencia con respecto
omitida en los controles negativos. Al término de la reacción, la a la temperatura (-dF/dT), contra la temperatura.
enzima fue inactivada por incubación a 65 °C 10 min, y el cDNA
formado se almacenó a -20 °C hasta su uso.
Resultados
La expresión de transcritos abundantes, como la subunidad
II de la citocromo c oxidasa (CCOII) y la proteína ribosomal S16, Las curvas de amplificación de las muestras estándar (S16 amplifi-
moderados, como la Cu/Zn superóxido dismutasa (SOD), y escasos, cado a partir de varias diluciones de cDNA de testículo) se muestran
como metaxina, fueron entonces analizadas. Los oligonucleótidos en la figura 2. La curva patrón generada a partir de estos datos
empleados en las reacciones de PCR se indican en el cuadro 1. tenía un coeficiente de correlación r = -0.9.

Las reacciones de PCR y la determinación de los puntos de Las curvas de fluorescencia generadas por la amplificación de
fusión de los amplicones se efectuó en tubos capilares de vidrio con los transcritos de CCOII, S16 y SOD se muestran en la figura 3. Estas
capacidad para 20 µL. La mezcla para PCR se preparó de la siguiente amplificaciones son específicas, lo que se deduce del análisis de las
forma: 10.8 µL de agua, 3.2 µL de MgCl2 (25 mM), 1 µL de cada curvas de temperatura de fusión (figura 4) y del análisis de los
oligonucleótido a 5 pmol/µL y 2 µL del kit “LightCycler DNA-Master productos de PCR en geles de agarosa (figura 5). Algunos de los
SYBR Green I”. 2 µL de cDNA de ovocitos (equivalentes a 2 ovocitos) controles negativos de (S16 y SOD) mostraron curvas de

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F 25
l
u 1:100
o 20
r
e 1:1000
s
c 15
e
n
c 10
i 1:5000
a
5

0 5 10 15 20 25 30 35

Número de ciclo

18
Figura 4. Curvas de temperatura de fusión de DNA en tiempo real
del DNA amplificado de CCOII (1), S16 (2) y SOD (3), y sus
17
correspondientes controles negativos (4, 5 y 6).
16

C 15
Los puntos de fusión para los productos de PCR de los
i
14
c transcritos de CCOII, S16 y SOD fueron, respectivamente, 83.6 oC,
l 13
o 84.5 oC y 86.8 oC (figura 4). Los dímeros de oligonucleótidos
12

11 formados en los controles negativos de SOD y S16 mostraron, como

se esperaba, puntos de fusión más bajos que los de los productos
-4 -3 -2 específicos de SOD y S16.
Log. Fluorescencia

Figura 2. A. Curvas de amplificación por PCR en tiempo real de las

muestras estándar. Varias diluciones (1:100, 1:1000 y 1:5000) de
cDNA de testículo de ratón se usaron como molde para la
amplificación de S16. B. Curva patrón (cantidad de cDNA/
amplificación) generada a partir de las curvas de amplificación de
las muestras estándar.

amplificación. Estas amplificaciones inespecíficas son debidas a

amplificación de dímeros de oligonucleótidos (ver curvas de
temperatura de fusión, figura 4, y el análisis de los productos de
PCR por electroforesis, figura 5).
Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa de los productos de la
amplificación por PCR en tiempo real de CCOII, SOD, S16 y sus
respectivos controles negativos.

En la figura 5 se observa el análisis electroforético en geles de

agarosa de los mismos productos de la amplificación de los
transcritos de CCOII, SOD, S16 y sus respectivos controles negativos.
La amplificación específica de los transcritos de CCOII (335 pb),
SOD (363 pb) y S16 (102 pb) está presente sólo en los controles
positivos. Acorde a los resultados obtenidos en el análisis de las
curvas de amplificación y temperaturas de fusión, tanto en el caso
de SOD como de S16 se detectan en los controles negativos
amplificaciones inespecíficas de dímeros de oligonucleótidos.
La amplificación específica de transcritos poco abundantes,
como el de metaxina, sólo se pudo llevar a cabo a partir de un
Figura 3. Amplificación por PCR en tiempo real de CCOII (1), SOD número mayor de ovocitos (ocho). Al intertarlo con una menor
(2) y S16 (3) a partir de muestras de 2 ovocitos. La transcriptasa
cantidad (dos o cuatro), se generaba una gran cantidad de productos
reversa fue omitida de los controles negativos (4, 5 y 6,
respectivamente). inespecíficos, lo que impide una cuantificación precisa (figura. 6).

6 BIOQUIMIA VOL. 27 NO. 1, 3 -7, 2002

 CUANTIFICACION DE LA EXPRESION GENICA

F fue esencial al amplificar transcritos mitocondriales como CCOII. En

l
u 4 c este caso, la amplificación del DNA genómico ocurre probablemente
o
r
a debido al elevado número de mitocondrias (y por tanto, de copias
e 3
s de los genes mitocondriales) presentes en las células. La digestión
c
e 2 del DNA mitocondrial, sin embargo, no se consiguió fácilmente.
n
c b
i 1 b Esto sólo se logró después de seguir la metodología descrita
a
c a anteriormente, que incluye la lisis de los ovocitos por medio de
0
congelación y descongelación, y la disrupción de las membranas a
-(dF/dT)
65 oC utilizando NP40 antes de la adición de la DNAsa.
65 70 75 80 85 90
Temperatura ( oC)
En conclusión, la amplificación por PCR utilizando la
Dímeros de Amplificaciones tecnología del LightCycler nos proporciona una herramienta muy
oligos específicas
útil para el estudio de la expresión génica cuando se dispone de
Figura 6. Curvas de temperaturas de fusión de los productos de la cantidades muy limitadas de material experimental. En el método
amplificación por PCR en tiempo real de metaxina. Dos (a), cuatro descrito aquí, el número mínimo de células que pueden ser utilizadas
(b) u ocho ovocitos (c) se usaron como molde.
está condicionado por el nivel de expresión de los genes a ser
analizados. Dos células son suficientes para la amplificación
Discusión específica de RNAms expresados abundante o moderadamente, en
tanto que se requieren ocho células en el caso de transcritos menos
Debido a su gran sensibilidad, reproducibilidad y velocidad, la abundantes. Esta técnica abre posibilidades para ser utilizada en el
metodología de RT-PCR en tiempo real es muy ampliamente usada análisis molecular de células obtenidas de fluidos fisiológicos o
en la actualidad para la realización de análisis de la expresión mediante microdisección con láser 9. A partir de los resultados
génica8. Sin embargo, se requiere la implementación de modifica- obtenidos es posible cuantificar de una manera precisa la expresión
ciones de la metodología básica cuando no se dispone de un de genes en situaciones biológicas como los mismos estadios
suficiente número de células para llevar a cabo el análisis. Steuerwald postcigóticos, en los que la cantidad de material biológico es
y cols. 5 realizaron la cuantificación del RNAm de β-actina e limitante. Otros procesos patológicos, como los derivados de
hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa a partir de ovocitos y oncogénesis, donde se encuentran presentes diferentes poblaciones
embriones individuales por medio de RT-PCR en tiempo real. Estos celulares pueden ser disectados molecularmente10 en base a la
autores, sin embargo, sólo llevaron a cabo la amplificación de aplicación de la tecnología desarrollada en el presente estudio.
transcritos abundantes, y no tomaron en cuenta las amplificacio-
Referencias
nes inespecíficas debidas a DNA genómico (especialmente mitocondrial),
que son frecuentes cuando se lleva a cabo la amplificación a partir de 1. Foley KP, Leonard MW, Engel JD. Quantitation of RNA using the polymerase
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lisados celulares completos. Si no se considera este factor, los resulta- 2. Morrison TB, Weis JJ, Wittwer CT. Quantification of low-copy transcripts
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ENERO - MARZO 2002 7