Técnicas para el estudio de localización y función de proteínas

A. Origen de las muestras a anilizar: provenientes de modelos experimentales o personas que consultan al equipo
de salud. Se obtienen muestras.
B. Formas de analizarlas: conservando su estructura, se observan con microscopio 
inmunohistoquimica/inmunofluresencia. Tejido homogéneo, no se conserva la estructurafraccionamiento
celular y western blot, es la técnica para analizar bioquímicamente dichas muestras

Los estudios científicos pueden realizarse a distintos niveles de integración y aislamiento de las variables:

 In vitro: animales sometidos a distintas condiciones

 In vivo: células cultivadas, sometidos a distintas condiciones ambientales. Se aleja de condición fisiológica, pero
permite controlar mejor las variables
 Libres de células: componentes celulares aislados de su entorno. Regular mejor las variables, pero se aleja de lo
fisiológico. Ej: fraccionamiento subcelular

Dependiendo de qué tipo de análisis se quiera realizar de las muestras, dependerá el tipo de proceso. Si se pretende
obtener información sobre la localización de los componentes celulares o moleculares o moléculas, debe
conservarse la estructura del tejido o celular para poder observarse bajo un microscopio. Si se pretende obtener
información sobre la presencia o cantidad de la molécula, la muestra puede ser procesadas sin conservar la
estructura de los tejidos. Se pueden realizar estudios bioquímicos, como el westerblot, o purificar la muestra para
analizar estructuras en particular, fraccionamieneto celular

Anticuerpos como herramienta de investigación

Un antígeno es toda sustancia que al introducirla en un organismo genere una respuesta inmune. Al ingresar, es
reconocido y degradado por células presentadoras, que posteriormente los presentan a los linfocitos. Un linfocito T
reconoce a un determinante antígeno del antígeno y activa a los linfocitos B. Actúan reconociendo a otro de los
determinantes y proliferando clones: plasmocitos, secretan anticuerpos y células de memoria, tienen en su
superficie anticuerpos que reconocen a dicho determinante. Es una respuesta pollicloneal, distintos clones producen
distintos anticuerpos que reconocen un mismo determinante
Existen la resp monoclonar, en la cual se aisla uno de estos clones, los plasmocitos, y se los hace inmortales al
fusionarlos con una celula tumoral. Se utilizan únicamente sus anticuerpos.

Los estudios de inmunohistoquimica y westerblot utilizan la reacción antígeno– anticuerpo para reconocer
proteínas. Los anticuerpos (monoclonares o policlonares), al reconocer específicamente a un determinante
antigenico, se los puede utilizar para localizar otras moléculas (en este caso proteínas) indirectamente, a través de
alguno de sus antígenos que presente dicho determinante que reaccionan con el anticuerpo agregado.

En el microscopio se podrá localizar la presencia de la molécula buscada de diferentes modos:

 En inmunohistoquimica: se le agrega al anticuerpo involucrado en la reacción un marcador de color o una

enzima, a la que después se le agrega un sustrato. Los productos que precipiten tendrán color y su ubicación
determinara el lugar de la molecula buscada
 En inmunofluoresencia: se le agrega al anticuerpo un fluoroforo (sustancia que al ser estimulada emite luz) que
fluorece
Tipos de inmunohistoquimica/inmunofluoresencia

 Directa: se marca cada anticuerpo primario que determinara, una vez producida la reacción antígeno anticuerpo,
la ubicación de la proteína
 Indirecta: se utiliza un anticuerpo primario no marcado, especifico de un determinante, y un anticuerpo
secundario marcado, que reconoce la parte cte del primario. Este previamente se produjo en otro organismo y
los anticuerpos que genero como respuesta son los utilizados. Es el mecanismo mas utilizado, mas economico y
genera mayor amplificación, ya que se utiliza un único tipo de anticuerpos secundarios que reconocen distintos
primarios de la misma especie y se unen a más de uno a la vez, habrá más marcadores por lo que la
amplificación es mayor.

Se pueden localizar en un mismo cultivo más de 1 proteína a la vez. Se agregan distintos anticuerpos marcados que
reaccionarán con antígenos presentes en las proteínas en cuestión, y podrán ser visualizados al microscopio en
diferentes colores.

Evidencia, gracias a las marcas, su localización espacial en la célula o tejido que fue conservado y da una noción
sobre su cantidad, según se vean más o menos coloreadas las zonas. Es una medición cualitativa

Fraccionamiento celular: técnica que tiene como objetivo obtener fracciones puras de un determinado componente
celular. No es de analisis

Procedimiento
1. Ruptura mecánica del tejido. Un embolo gira sobre el tejido en medio acuoso y se homogeniza, se obtiene un 
homogenato (incluye el solvente, citosol, matriz extra, mitondrias, nucleos, etc). Si se agregan detergentes o
enzimas se rompen las membranas, si no, se mantienen.
2. Separación del componente a analizar por centrifugación diferencial, que aumenta la fuerza gravitatoria. Los
componentes de mayor densidad quedan en el fondo (pellet), y los de menos flotan (sobrenadante). Se pueden
realizar sucesivas centrifugaciones con distintas velocidades para ir fraccionando los componentes deseados
3. El grado de pureza se puede verificar agregando distintos anticuerpos que marcaran enzimas que se presenten
siempre en un componente determinado. Si hay reacción únicamente en el componente en cuestión, es puro.
También haciendo una microscopia electrónica se los reconoce según la morfología

Westernblot- inmunoblot: determina la presencia y expresión de proteínas en un homogenato o fracción subcelular.

Inmuno porque utiliza la reacción antígeno-anticuerpo para evidenciar la presencia de una proteína y blot porque
implica transferencia
Procedimiento
1. Corrida electroforética. Se les da la misma carga negativa a todas las proteínas del para después hacerlas correr.
Se siembran en el cátodo, con carga negativa, y migraran hacia el ánodo, con carga positiva a través de un del gel
que forma una malla. Las proteínas más pesadas migraran más lento debido su tamaño, y las más chicas más
rápido.
Se agregan también marcadores de peso molecular de proteínas de peso conocido que se toman como
referencia. Por comparación se puede determinar el peso de la nueva muestra
De esta forma se obtiene como resultado la separación de todas las proteínas del homogenato según su peso.
Para saber si la proteina buscada esta allí se debe realizar un 2do paso
2. Transferencia y agregado de anticuerpos. Se transfieren las proteínas a una superficie sólida, para esto se
somete al gel a la electricidad de nuevo y las proteínas correrán desde el gel hacia la otra superficie.
Posteriormente se agrega un anticuerpo marcado específico para con el determinante antigénico de la proteína
buscada, de forma que solo se marque esa banda y se la puede identificar. Se puede comprar los resultados de
distintas muestras y según estén más o menos marcadas las bandas significara que hay más proteínas
Da noción cuantitativa sobre su estimado peso molecular y constata su presencia, permite comparar muestras. Si se
realiza la técnica a partir de un homogenato, dará información sobre su presencia y en qué cantidad se presenta,
pero no podrá saberse en que compartimentos celulares esta. Para saber su ubicación se tiene que realizar un
fraccionamiento subcelular previamente.
Técnicas de amplificación o clonación de acidos nucleicos in vitro y técnicas de recombinación del adn

Dos tipos

 Clonación in vitro, reacción en cadena de la pol (PCR)

 Clonación in vivo, técnicas de recombinación de adn

Técnicas de recombinación de adn

 Enzimas de restricción. Son endonucleasas, permiten reconocer y cortar una secuencia del adn de forma roma o
con extremos monocatenarios, que pueden volver a unirse por complementariedad de bases. A partir de
distintas moléculas se la puede pegar y formar un mecano de genes.
Moléculas de adn producidas por pcr, pueden ser cortados por la enzima dejando extremos cohesivos (o
pegajosos) capaces de, por complementariedad de bases, unirse a otra molecula y una ligasa los une. Se generan
moléculas hibridas

 Formacion de moléculas hibridas: formada por vectores e insertos. Los vectores o casets son adn bacteriano,
tienen capacidad autorreplicante (tienen ori, regiones promotoras y regiones de resistencia a antibióticos), se
pueden cortar sus extremos no cohesivos por una enzima de restricción y unirle un inserto, son fragmentos de
adn de interés que se pretende estudiar. Se introduce el hibrido en una bacteria que proliferara generando
muchas copias. Estas pueden ser introducidos en otros tipos celulares, que comenzaran a expresar dicho gen de
interés. Se estudia que produce, si esta mutado, que cambios implica.
Tipos de vectores: plasmidos, virus, cromosomas artificiales de bacterias y virus estos sirven para grandes
segmentos de ADN.
Funciones
- Producción de genes: El gen a estudiar se coloca en la región promotora del vector. Una vez en la celula será
reconocido por la maquinaria de transcripción y comenzaran a transcrbirse arnm y traducido en proteínas.
Se puede seguir la su localización y asi estudiar su funcionamiento
- Producción de proteínas hibridas: se fusiona el gen codificante de una proteína de interés con el gen que
codifica a una proteina que se puede identificar (tagear) y seguir su localización
- Estudio de enfermedades que producen mutaciones en secuencia de adn: se generan vectores con la
codificación de control (secuencia correcta, sin mutar) y vectores con la codificación mutada. Se introducen
en células distintas, y a partir de la expresión de sus genes: como afecta cada mensajero y los aa de cada
mutados o normales de las proteína
- Modificaciones en genoma: para entender la funcionalidad, se puede reemplazar un gen también en el caso
de estar mutado, corregirlo. Eliminar secuencias, genera una perdida de funcion de ese gen. Adicion de
genes, que coeexistan el gen normal y el mutante
 - Utilización de estrategias de modificaciones del genoma para generar un organismo con una mutacion,
reemplazo génico, intercambio de genes, etc. Se obtiene modificando las células madre por recombinación
genética o clonación: se introducen vectores de transcripción en un cultivo para generar una colonia de
células madre modificadas. Se introduce en un blastocisto, que se denominara ahora quimera: tiene una
mezcla de células modificadas y la otra del blastocisto donante. El organismo al reproducirse y generar
descendencia tendrá también el genoma mutado
- Modificación por tecnología CRISPR/CAS9. La enzima CAS9 (endonucleasa) utiliza un adn guia que la dirige a
un sitio del genoma con el que tiene homologia. Se produce un acercamiento y posterior corte doble cadena
en esa zona, se activan mecanismos de repacion por union de extremos no homologos (mas frecuente puede
introducir inserciones o deleciones provocando corrimientos en el marco de lectura) o recombinación
homologa

Metodología para estudiar la funcion de los genes

 Aumento de la expresión: se pueden expresar los genes de endógenas, proteínas con cambios en su estructura
primaria (por la recombinación del gen) y proteínas de otro organismo (se le introdujo un gen mutado). Se
pueden marcar dichas proteínas con fluorcentes y asi seguir su recorrido y estudiar sus efectos. Mecanismos:
- En funcion del sitio promotor que tenga el gen, tendrá un alto nivel de expresión o bajo. Pueden elegirse
según se prefiera, distintos promotores
- Se utilizan CDNA o adn complementarios para introducir al genoma. Se obtiene a partir de una
retrotanscripcion del arnm maduro, que permite obtener el cDNA que ahora si puede introducirse en un
vector.
 Disminución de la expresión: controlando los reguladores negativos o arn de interferencia para regular de
manera negativa la expresión génica. No se van a traducir sus proteínas. Se puede estudiar cómo afecta a la
célula la falta de función de dichas proteínas. Mecanismos
- Generación de un vector con un sitio promotor que codifique para un arn de interferencia específico para
reducir la expresión de un mensajero. Silencian la expresión de mARN endógenos

Vectores
Una vez obtenido el vector (molecula circular proveniente de bacterias) con origen de replicación, sitio promotor,
secuencias reguladoras y regiones de resistencia a antibióticos se puede introducir en la célula (transfeccion) por
distintos mecanismos:
 Combinación con lípidos catiónicos: se empaqueta al vector en una estructura de liposomas, que son
reconocidos por la mem plasmática de la celula. El DNA es liberado en el citoplasma que ira al nucleo y será
utilizado como molécula modificadora de la expresión
 Electroporacion: implica un shock eléctrico que provoca la permeabilidad de la mem y posteriormente se vuelve
a estabilizar
En función del tipo de vector (molécula) dependerá el tiempo de expresión posible de dicho gen introducido:
 Plasmidos, molecula circulary procariota. La transcripción será transitoria. Al ser de origen procariota, no se van
a poder replicar así que al célula al dividirse podría diluirse su expresión
 Moléculas lineales o con estrategias virales. La molecula lineal puede tener homología de inserción en sus
extremos lo que favorece su inserción en el genoma. La expresión será estable, aunque las células se dividan se
replicaran las secuencias introducidas a las células hijas

Uso de proteínas fluorescentes

 Proteína GFP (Green fluorescent protein), se ilumina en el rango de luz verde al ser estimulada. Por transfeccion
se pueden introducir a un plasmido y expresar estas proteínas fluorecentes en un cultivo.
 Se puede fusionar a determinadas proteínas y asi estudiar su funcionamiento normal, en el caso de ser una
proteína normal. Y si en cambio esta mutada, al introducir la fluoresencia se podrá ver directamente como se
afecta su funcionamiento en la celula y comparar ambos resultados