ADN mitocondrial (mtADN) El genoma mitocondrial (mtADN) tiene un tamaño de 15 a 17 kb (Brown et al.

1979) y su longitud varía considerablemente entre especies: 20 micrómetros en Neurospora; 25

micrómetros en levaduras; 30 micrómetros en plantas superiores; 5 micrómetros en algunos animales
metazoarios (multicelulares). Se considera que la mayoría del mtADN de hongos y plantas no codifica, ya
que el mtARN contiene intrones. El mtARN de animales carece de intrones y se transcribe como ARN
policistrónico que se parte en ARN monocistrónico antes de la traducción (Stansfield, 1992). Las moléculas
de cloroplasto y mitocondria son especialmente importantes para trazar historias filogeográficas y de
estructura poblacional genética estrechamente relacionada al linaje, porque son de herencia uniparental y
no recombinan. También nos permiten inferir cambios demográficos y de dispersión entre especies
(Dirienzo y Wilson, 1991).

ADN de cloroplasto (clADN) En los organismos fotosintéticos con cloroplastos existe un ADN típicamente
bacteriano circular, de 120 a 200 kb (Brown et al. 1979), con intrones y exones que se considera muy
conservado, ya que se trata fundamentalmente del mismo genoma desde las hepáticas hasta las plantas
superiores. Cada cloroplasto contiene varias regiones nucleotídicas, cada una con 8 a 10 moléculas de ADN.
Un organismo unicelular como Euglena puede contener de 40 a 50 cloroplastos, por lo que la celula entera
puede contener más de 500 copias del genoma del cloroplasto (Stansfield, 1992).

RAPDs Los RAPDs (polimorfismos de ADN amplificados al azar) son marcadores que amplifican
aleatoriamente segmentos de ADN en una gran variedad de especies. Los RAPDs se basan en la
probabilidad estadística de que se presenten sitios complementarios al oligonucleótido de 10 pares de
bases (pb) a lo largo del genoma.Los RAPDs son útiles en la elaboración de mapas genéticos, en el estudio
de parentesco y en el análisis de la estructura poblacional, ya que ayudan a estimar tamaño efectivo,
aislamiento reproductivo y niveles de fecundación cruzada. Entre las principales ventajas de los RAPDs esta
que amplifican regiones tanto codificantes del ADN como las no codificantes y revelan niveles de variación
más altos que los RFLPs e isoenzimas.

Microsatélites: Los microsatélites o secuencias simples repetidas (SSRs; Litt y Luty, 1989) son secuencias de
ADN formadas de 1 a 4 pares de bases, por ejemplo mononucleótidos (TT)n , dinucleótidos (AT)n , o
tetranucleótidos (AAGG)n . Estos loci se encuentran en regiones codificantes y no codificantes del ADN y es
probable que se formen por eventos de rompimiento que generan polimorfismos con valores superiores al
90%. Los microsatélites de ADN nuclear han sido detectados en múltiples grupos de plantas y animales, y
han sido utilizados fundamentalmente para estudios de variación genética intra e interespecífica. como el
cloroplasto (SSRc; Powell et al., 1995a, b; Vendramín et al., 1996; figura 3 ) y la mitocondria (SSRm; Soranzo
et al., 1998) lo que ha enriquecido la fuente de estudios evolutivos. Los microsatélites han tomado ventaja
sobre otros marcadores genéticos como los AFLPs, RAPDs, RFLPs, debido a que: i) tienen el más alto grado
de polimorfismo; ii) segregan de manera mendeliana y son codominantes; iii) la presencia de un solo locus
genético por microsatélite hace que la lectura de las bandas sea clara y fácil de interpretar y iv) son
selectivamente neutros. secuencias, es que la mutación es homogénea: en la mayoría de los SSR las
mutaciones son de un paso (una unidad repetitiva) siguiendo el modelo mutacional SSM de Ohta y Kimura
(1973).

ISSRs Es un marcador molecular conocido como secuencias repetidas intersimples. Esta es una técnica
relativamente nueva y es similar a los RAPDs, excepto que en los ISSRs el primer es un di ó trinucleotido
repetido. Los ISSRs han sido utilizado en especies cultivadas desde 1994, pero sólo recientemente se han
utilizado en estudios de la variación poblacional en especies silvestres. Entre las ventajas principales de los
ISSRs es que tienen un gran número de bandas polimorficas. En un estudio realizado en Viola pubescens
una planta cleistogamica se reportó una gran variación genética. A nivel de especie, el 100% de los loci
fueron polimorficos aún cuando los primers (se utilizaron tres) fueron seleccionados al azar. Dentro de cada
población cerca del 71% de 83 loci fueron polimórficos.
RFLPs: primer marcador de ADN utilizado por biólogos poblacionales (Parker et al., 1998). Este método
expresa diferencias específicas del ADN que fueron reconocidas por enzimas de restricción particulares
(endonucleasas). Cada una de las endonucleasas (de origen bacteriano), reconoce y corta solamente una
secuencia específica de bases nitrogenadas en el ADN, siempre y cuando éstas no estén protegidas
(metiladas). Para detectar RFLPs hay dos técnicas: southern blots e hibridización, y PCR.

Southern blots e hibridización Es necesario en primer lugar aislar el ADN del organismo de interés (véase el
capítulo 15 de este libro, purificarlo y cortarlo con una o más endonucleasas de restricción. Los fragmentos
resultantes se separan en geles de agarosa por electroforesis y se transfieren a una membrana que puede
ser de nylon o de nitrocelulosa (southern blotting). La subsecuente hibridación con una sonda marcada y
detección con autorradiografía, luminografía o quimioluminiscencia hará visible un fragmento de ADN
específico, que puede ser comparado con el fragmento resultante de otros genomas tratados de la misma
forma (Parket et al., 1998). La sonda marcada se obtiene de fragmentos de ADN nuclear, de organelos o
bien de ADN complementario, también denominado ADN copia (ADNc) que es una molécula de una sola
hilera producida en el laboratorio usando mRNA como molde y transcripción reversa.

FLP-PCR El segundo método que se utiliza para la técnica de RFLPs es la PCR. Los RFLPs son causados por
rearreglos del ADN, tales como pérdidas, inserciones o sustituciones de secuencias o nucleótidos únicos, lo
que genera una ganancia o pérdida de sitios de restricción. Los RFLPs generalmente se han utilizado para
construir mapas genéticos, para la clonación de genes basados en mapas y para ayudar a resolver
problemas taxonómicos o filogenéticos.

AFLPs Los AFLPs (polimorfismos de longitud de los fragmentos amplificados) son una técnica que combina
la digestión de dos enzimas de restricción. Esta técnica detecta múltiples loci polimórficos y es útil para
generar huellas genéticas y mapeo; también se ha utilizado para la caracterización de germoplasma,
estudios filogenéticos en plantas, bacterias, hongos y en estudios de genética de poblaciones. Entre las
ventajas que se pueden encontrar en los AFLPs está que no requieren ninguna información previa de la
secuencia para su análisis; se producen una gran cantidad de bandas polimórficas; la técnica es altamente
reproducible y existen kits estandarizados.

El método de la secuencia polimórfica amplificada escindida ( CAPS ) es una técnica

en biología molecular para el análisis de marcadores genéticos . Es una extensión del método
de Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restricción (RFLP), que utiliza la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) para analizar más rápidamente los resultados.
Al igual que el RFLP, CAPS se basa en el principio de que las diferencias genéticas entre
individuos pueden crear o anular los sitios de restricción de endonucleasas de restricción y que
estas diferencias pueden detectarse en la longitud del fragmento de ADN resultante después de la
digestión.
En el método CAPS, la amplificación por PCR se dirige a través del sitio de restricción alterado y
los productos se digieren con la enzima de restricción. Cuando se fraccionaron
por agarosa o acrilamida electroforesis en gel , los productos de PCR digeridos darán patrones
fácilmente distinguibles de bandas. Alternativamente, el segmento amplificado puede analizarse
mediante sondas de oligonucleótidos específicas de alelo (ASO), un proceso que a menudo se
puede realizar mediante una simple transferencia de puntos .
La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas. En primer lugar, tienen que
romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A
continuación, debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por último,
hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que
precipite en alcohol. La función de cada uno de los reactivos se define así:  Agua: Es el
disolvente empleado para casi cualquier tipo de disolución, incluida esta.  Alcohol (C2H6O):
Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero
cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interface entre el alcohol y el agua.
Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los
cuales son dejados en la solución acuosa.  Bicarbonato de sodio (NaHCO3): El bicarbonato
neutraliza la acidez de la disolución consiguiendo un pH neutro.  Detergente: Las membranas de
las células están formadas por dos capas de lípidos con proteínas transmembrana a través de
estas. El detergente ayuda a romper la bicapa de fosfolípidos de las membranas plasmáticas y la
envoltura nuclear. Los lípidos de la membrana se descomponen debido al detergente que deshace
las uniones que mantienen la membrana junta. Cuando el detergente se pone en contacto con los
lípidos éstos se separan de la membrana rompiéndola. La estructura de los lípidos es similar a la
del detergente y eso hace que se combinen, formando una burbuja de detergente y lípidos. Sal
(NaCl): En disolución actúa disminuyendo la solubilidad de las proteínas, lo que hace que
precipiten y se separen más fácilmente del ADN.
Un marcador genético o marcador molecular es un segmento de ADN con una ubicación física
identificable (locus) en un cromosoma y cuya herencia genética se puede rastrear. Un marcador
puede ser un gen, o puede ser alguna sección del ADN sin función conocida. Dado que los
segmentos del ADN que se encuentran contiguos en un cromosomatienden a heredarse juntos, los
marcadores se utilizan a menudo como formas indirectas de rastrear el patrón hereditario de un gen
que todavía no ha sido identificado, pero cuya ubicación aproximada se conoce. Los marcadores se
usan para el mapeo genético como el primer paso para encontrar la posición e identidad de un gen.
Son ampliamente utilizados en genética humana, vegetal, animal y microbiana. Permiten evidenciar
variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos, modifiquen éstas o no su
fenotipo. Funcionan como señaladores de diferentes regiones del genoma.

Un marcador genético es una secuencia de ADN específica cuya localización exacta ha sido

identificada en su correspondiente cromosoma y cuya herencia puede ser rastreada. La secuencia
de ADN que forma un marcador genético puede ser un gen completo o sólo una secuencia sin
función conocida o no codificante. Se utilizan principalmente en el mapeo genético como
señaladores de regiones del genoma de un determinado organismo.
Una de las características más destacadas de los marcadores genéticos es que ponen de
manifiesto el polimorfismo genético dentro de una misma especie. Por ejemplo, el marcador
genético de la zona que codifica para el tipo de sangre en el humano; todos los humanos necesitan
sangre pero la sangre puede ser muy diferente de un individuo a otro debido a este polimorfismo.
Isoenzimas Se definen como diferentes formas moleculares de una enzima, que poseen una
actividad catalítica común, es decir actúan sobre el mismo sustrato. Ciertos cambios en el ADN que
codifica estas enzimas (mutaciones) pueden resultar en cambios en la composición de
aminoácidos, originando proteínas con la misma actividad biológica pero con diferente carga neta y
por tanto con diferentes velocidades de migración en un campo eléctrico. Estas diferencias
determinan patrones característicos de migración electroforética de las formas iso-enzimáticas.
Varios factores determinan el patrón de bandas o zimograma: 1) Número de genes que las
codifican. La presencia de varios genes codificando para una misma enzima ha sido atribuida a
procesos de duplicación génica y subsecuente divergencia a través de mutaciones diferentes en
cada caso. 2) Estados alélicos. El proceso más simple de generación de nuevas formas
enzimáticas es la mutación de un gen estructural; las variantes alélicas se denominan aloenzimas.
Estos marcadores muestran codominancia 3) Estructura cuaternaria de los productos proteicos.
La enzima funcional puede estar compuesta por un número variable de sub-unidades. En las
formas más simples o monoméricas los individuos homocigotas presentan una banda y los
heterocigotas simplemente la suma de ambas. Cuando la estructura cuaternaria se vuelve más
compleja, encontramos enzimas activas compuestas por dímeros, tetrámeros, etc.. En este caso el
individuo heterocigota presenta bandas adicionales no presentes en los homocigotas, que se
generan por la combinación de subunidades codificadas por los distintos alelos o loci. (Fig. 1). 4)
Compartimentalización subcelular. Se encuentran formas enzimáticas localizadas en citoplasma,
cloroplasto o mitocondria, codificadas todas por genes nucleares pero con diferentes velocidades
de migración. Las isoenzimas se obtienen por homogenización del tejido (semilla, raíz, hoja).
Proteínas de reserva El endosperma de los cereales es el principal componente de la semilla ya
que representa aproximadamente el 80-90% de su peso seco. Almidón y proteínas son las dos
macromoléculas más importantes. El contenido de proteína varía según la especie y el manejo de
cultivo a campo. Los valores más altos se dan en trigo y avena (10-17%) y los más bajos en maíz y
arroz (6%). La concentración de proteínas en los cereales es apreciablemente menor que en las
leguminosas ya que en éstas los órganos de reserva o cotiledones son capaces de almacenar
hasta un 40% de su peso seco en proteínas. Las proteínas del endosperma fueron estudiadas ya a
comienzos del siglo pasado por Osborne, quién dio las bases para las clasificaciones actuales. La
misma se basa en la solubilidad relativa en diferentes solventes: albúminas solubles en agua,
globulinas en solución salina, prolaminas en alcohol y glutelinas en ácidos o álcalis. Para el grupo
de las prolaminas se ha asignado un nombre específico para cada uno de los cereales. De esta
manera en maíz se la denomina zeína, en cebada hordeína, en avena avenina y en trigo gliadina.
En el caso específico de trigo a las glutelinas se las conoce con el nombre de gluteninas. En la
mayoría de los cereales las prolaminas y glutelinas están codificadas por varios genes relacionados
conformando familias. Durante la evolución de estos genes se han detectado duplicaciones,
translocaciones, inserciones de elementos móviles entre otros re-arreglos cromosómicos. Estos
cambios genéticos han generado un alto nivel de polimorfismo proteico entre especies, así como
entre variedades de la misma especie. Además, el análisis genético de cruzamientos ha
demostrado que la variación en el patrón de proteínas es debida a la existencia de variantes
alélicas en cada locus.