Biologia Mole

Resumen
Durante muchos años, la microbiología ha sido una disciplina muy manual basada en el

cultivo, pruebas bioquímicas o la observación y tinción de propiedades físicas. El diagnóstico de
las enfermedades infecciosas ha sufrido grandes cambios en los últimos años debido a los
avances en los métodos de diagnóstico basados en la biología molecular.
Estas tecnologías permiten un diagnóstico más temprano y confiable, al tiempo que permiten el
seguimiento de la enfermedad, el pronóstico y mejores tasas de supervivencia. Dentro de los
métodos de biología molecular, existen muchas variantes que se pueden utilizar para la
amplificación, detección y secuenciación de ácidos nucleicos (dependiendo de la
sospecha clínica de ADN o ARN). El método más simple es la reacción en cadena de la
polimerasa con varias modificaciones para mejorar el proceso de diagnóstico e
interpretación, que incluye PCR cuantitativa o en tiempo real, RT-PCR, micromatrices y
secuenciación. En el transcurso del trabajo se describen en detalle varios métodos que permiten
el análisis de diferentes muestras de uno o más microorganismos (mediante paneles).
Uso de técnicas moleculares para la detección del COVID-19
El especialista a cargo de la prueba molecular usa un hisopo especial para tomar una muestra de
mucosidad de tu nariz o garganta, esta es sellada en un envase estéril y enviada a un laboratorio.
Es importante que las pruebas sean transportadas a una cierta temperatura para asegurar la
certeza del resultado. La muestra debe llegar al laboratorio en un máximo de 72 horas.
En un tubo de ensayo se mezcla la muestra con reactivos fluorescentes, si el virus está presente
se adhiere a estos componentes. El proceso puede tomar varias horas por lo que es fundamental
que un laboratorio especializado se encargue de realizar las pruebas.
Esta prueba detecta el RNA (o ARN) viral en la sangre, lo cual sirve como indicador para
determinar que una persona está infectada. Se estima que los resultados pueden llegar a tener una
certeza de hasta un 90%.
Es la prueba más útil para pacientes que se encuentren dentro de las 2 primeras semanas de la
enfermedad.
El avance de la tecnología en el campo de la biología molecular ha permitido el desarrollo de

ensayos de detección basados en ácidos nucleicos que se han convertido en una tecnología
importante y en el método más utilizado para la detección de virus. La detección de ácidos
nucleicos ha desempeñado un papel importante en el diagnóstico precoz. Las técnicas
moleculares utilizan el material genético del virus y se basan en el principio de la especificidad
del emparejamiento de bases con hebras homólogas (Machado et al., 2020). En función de cómo
se procesa y detecta el ARN viral, existen tres métodos moleculares principales que se han
propuesto a partir de la secuenciación genética del SARS-CoV-2, estos son:
1- RT-PCR en tiempo real (Retrotranscripción seguida de amplificación por reacción
en cadena de la polimerasa).
También conocida como prueba molecular, esta prueba de COVID-19 detecta el material
genético del virus mediante una técnica de laboratorio llamada reacción en cadena de la
polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés). Un profesional de
atención médica recolecta una muestra de líquido con un hisopo largo (muestra nasofaríngea)
que se introduce en la fosa nasal para extraer líquido de la parte posterior de la nariz. La muestra
se puede recolectar con un hisopo más corto (muestra del cornete medio) o un hisopo muy corto
(hisopado de narinas anteriores). En algunos casos, el profesional de atención médica inserta un
hisopo largo en la parte posterior de la garganta (muestra bucofaríngea) o puede pedirte que
escupas en un tubo para obtener una muestra de saliva.
Los resultados pueden estar listos en minutos si se analizan de forma interna, o en 1 a 3 días si se
envían a un laboratorio externo, o quizás más tiempo en lugares donde haya retrasos en el
procesamiento de los análisis. Las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción inversa son muy exactas cuando las realiza un profesional de atención médica de
manera adecuada, pero la prueba rápida puede no detectar algunos casos.
¿Como funciona?
Se toma una muestra de una parte del cuerpo donde se acumula el virus de la COVID-19, por
ejemplo, la nariz o la garganta; se le aplican diversas soluciones químicas para eliminar ciertas
sustancias, como las proteínas y las grasas, y extraer solo el ARN de la muestra. Este extracto de
ARN consiste en una mezcla del material genético de la persona y, de estar presente, del ARN
del virus.
Se procede a la transcripción inversa del ARN para convertirlo en ADN mediante una enzima
específica. A continuación, los científicos añaden pequeños fragmentos adicionales de ADN que
complementan determinadas partes del ADN vírico transcrito. De estar el virus presente en la
muestra, esos fragmentos se adhieren a partes específicas del ADN vírico. Algunos de los
fragmentos genéticos añadidos se emplean para crear la cadena de ADN durante la
amplificación, y otros para producir ADN y añadir marcadores a las cadenas, que se utilizan
posteriormente para detectar el virus.
A continuación, se introduce esa combinación en un aparato de RT-PCR donde se somete a
ciclos de calor-frío para provocar determinadas reacciones químicas que dan lugar a nuevas
copias idénticas de partes específicas del ADN vírico. Esos ciclos se repiten una y otra vez para
seguir copiando las partes específicas del ADN vírico. En cada uno de ellos se duplican las
cantidades: de dos copias se pasa a cuatro; de cuatro, a ocho, y así sucesivamente. Un sistema
habitual de RT-PCR en tiempo real suele constar de 35 ciclos, es decir, que al final del proceso
se habrán creado unos 35 000 millones de copias nuevas de las partes del ADN vírico de cada
una de las cadenas de los virus presentes en la muestra.
A medida que se producen nuevas copias de las partes del ADN vírico, los marcadores se
acoplan a las cadenas de ADN y emiten una fluorescencia que la computadora del aparato
medirá y presentará en tiempo real en la pantalla. La computadora hace seguimiento de la
magnitud de la fluorescencia de la muestra tras cada ciclo. Cuando la fluorescencia supera un
determinado nivel, se confirma la presencia del virus. Los científicos supervisan también el
número de ciclos que se tarda en alcanzar ese nivel para determinar así la gravedad de la
infección: cuanto menor sea el número de ciclos, más grave será la infección vírica.
¿Porque utilizarlo?
La RT-PCR en tiempo real es una técnica muy sensible y precisa que puede ofrecer un
diagnóstico fiable en tan solo tres horas, aunque a los laboratorios les lleva entre seis y ocho
horas de media. En comparación con otros métodos disponibles de aislamiento de virus, la
RT-PCR en tiempo real es bastante más rápida y presenta menos posibilidades de contaminación
o error, ya que todo el proceso puede llevarse a cabo en tubos cerrados. De los métodos
existentes, sigue siendo el más exacto para detectar el virus de la COVID-19.
Con todo, la RT-PCR en tiempo real no sirve para detectar infecciones superadas, información
que resulta importante para comprender el desarrollo y propagación del virus, que solo está
presente en el organismo durante un período determinado. Para detectar, seguir y estudiar
infecciones pasadas, en particular las que han podido cursarse o propagarse de manera
asintomática, se precisan otros métodos.
PROS Y CONTRAS DE LA PCR
La RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) es la prueba más común que se
usa con frecuencia para detectar el material genético del virus en el cuerpo. Con esta prueba, los
pacientes pueden saber si tienen o no una infección activa por COVID-19 y pueden ajustar su
estilo de vida en consecuencia (es decir, en cuarentena).
Pros
–Mínimamente invasivo: se realiza con hisopos nasales, hisopos de garganta y pruebas de saliva
u otros fluidos corporales
– Permite el distanciamiento social: si bien algunas pruebas moleculares, incluida la RT-PCR,
se suelen realizar en un hospital o clínica, también se pueden organizar tomas de hisopos desde
el automóvil del paciente o en su casa.
– Menos falsos negativos en algunos casos: los hisopos nasales profundos tendrán menos falsos
negativos en comparación con otras pruebas, como hisopos de garganta o pruebas de saliva
Contras
– Tiempos de respuesta prolongados: en algunos casos, las pruebas de RT-PCR pueden
producir resultados en el mismo día o en uno o dos días, pero se han informado resultados de
pruebas que demoran hasta una o dos semanas durante la pandemia.
– Sensibilidad de la prueba: al ser una prueba tan sensible, puede detectar restos de material
genético del coronavirus SARS-CoV-2 (restos inactivos) una vez el paciente ha superado la
enfermedad, y por tanto seguir dando positivo durante cierto periodo de tiempo.
– Incómodo para algunas personas: los hisopos nasales profundos pueden ser incómodos para
algunas personas, especialmente los niños pequeños.
2- Amplificación Isotérmica de ácidos nucleicos

La técnica molecular LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) es una prueba de
principio isotérmico; es decir, se ejecuta a una única temperatura. Por lo tanto, las pruebas
diagnósticas basadas en ella pueden practicarse en cualquier lugar, inclusive en aquellos con
recursos limitados, debido a que solo se requiere un equipo que pueda ser ajustado a una única
temperatura. Los abordajes colorimétricos de la LAMP incluyen la detección de la turbidez de la
reacción, provocada por la acumulación de pirofosfato de magnesio, y también, cambios de color
que ocurren cuando colorantes sensibles a cambios de pH o incluso, colorantes interpuestos de
ADN, se incorporan en la reacción
3- Ensayos basados en Repeticiones Palindrómicas Cortas Intercaladas Regularmente
Agrupadas (Cluster regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)
Los sistemas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas
(CRISPR)-Cas (proteínas asociadas a CRISPR) son mecanismos inmunitarios adaptativos
procariotas que se utilizan para escindir ácidos nucleicos invasores en la naturaleza. Hasta la
fecha, las herramientas basadas en CRISPR se han utilizado para muchas aplicaciones, como
ingeniería del genoma y el transcriptoma, la edición del epigenoma y la terapia génica. Además,
existen en la bibliografía un número creciente de estudios NUEVOS SISTEMAS RÁPIDOS DE
DETECCIÓN DEL SARS-COV-2 10 sobre el uso de sistemas CRISPR-Cas para la detección de
ácidos nucleicos y el diagnóstico de patógenos. Estos métodos tienen la ventaja de ser rápidos,
de bajo coste, portátiles, fáciles de usar, muy sensibles y específicos, y no requieren dispositivos
complejos. Dado que algunos de estos métodos pueden detectar el SARS-CoV-2 con alta
precisión y un tiempo de respuesta rápido, pueden ayudar a superar algunas de las de las
limitaciones de las pruebas RT-qPCR de laboratorio y aumentar el número total de pruebas
diarias realizadas. Además, como los métodos de diagnóstico basados en CRISPR pueden
realizarse con equipos sencillos y sin necesidad de grandes conocimientos técnicos, pueden
utilizarse fuera de los laboratorios centralizados, incluyendo aeropuertos, clínicas y entornos con
recursos limitados. En consecuencia, estos métodos alternativos tienen el potencial de ser
complementarios a la RT-qPCR en la lucha contra el COVID-19 (Palaz et al., 2021).
La mayoría de los métodos de detección del SARS-CoV-2 basados en CRISPR utilizan enzimas
Cas12 para el reconocimiento específico de la secuencia viral, lo que resulta en el corte de
ssDNAs fluorescentes o de flujo lateral. Broughton et al. adoptaron el DNA Endonuclease-
Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR), una plataforma de diagnóstico rápido basada en
Cas12a para la detección del SARS-CoV-2. El método DETECTR utiliza la transcripción inversa
mediada por bucle para la preamplificación de regiones genéticas conservadas en los genes N y
E de SARS-CoV- 2, y los amplicones se detectan aprovechando la actividad de escisión colateral
del ssDNA de Cas12a (Broughton et al., 2020).
Finalmente, En comparación con otras pruebas disponibles, estos métodos son mucho más
sensibles y pueden detectar los virus mucho antes en las muestras clínicas. Son pruebas versátiles
y pueden utilizarse para detectar el virus en una serie de muestras, como saliva, esputo,
secreciones del tracto respiratorio inferior, sangre, orina o heces.

Biologia Mole

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Biologia Mole

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Biologia Mole

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Resumen

Durante muchos años, la microbiología ha sido una disciplina muy manual basada en el

El avance de la tecnología en el campo de la biología molecular ha permitido el desarrollo de

2- Amplificación Isotérmica de ácidos nucleicos

También podría gustarte