Cuestionario Bioquimica

Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la pared, la
membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos
se liberen. Se utilizan soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que permiten
disolver la membrana celular.
Un agente caotrópico es una sustancia que altera la estructura de, y desnaturaliza ,

macromoléculas tales como proteínas y ácidos nucleicos (por ejemplo ADN y ARN ). Los
solutos caotrópicos aumentan la entropía del sistema al interferir con las interacciones
intermoleculares mediadas por fuerzas no covalentes como enlaces de hidrógeno , fuerzas
de van der Waals y efectos hidrófobos . La estructura y función macromolecular depende
del efecto neto de estas fuerzas (ver plegamiento de proteínas ), por lo tanto, se deduce que
un aumento de solutos caotrópicos en un sistema biológico desnaturalizará las
macromoléculas, reducirá la actividad enzimática e inducirá estrés en una célula (es decir,
una célula tendrá que sintetizar protectores de estrés). El plegamiento de la proteína
terciaria depende de las fuerzas hidrófobas de los aminoácidos a lo largo de la secuencia de
la proteína. Los solutos caotrópicos disminuyen el efecto hidrofóbico neto de las regiones
hidrofóbicas debido al desorden de las moléculas de agua adyacentes a la proteína. Esto
solubiliza la región hidrófoba en la solución, desnaturalizando así la proteína. Esto también
es directamente aplicable a la región hidrófoba en bicapas lipídicas ; si se alcanza una
concentración crítica de un soluto caotrópico (en la región hidrófoba de la bicapa), la
integridad de la membrana se verá comprometida y la célula se lisará,
Las sales caotrópicas que se disocian en solución ejercen efectos caotrópicos a través de
diferentes mecanismos. Mientras que los compuestos caotrópicos como el etanol interfieren
con las fuerzas intramoleculares no covalentes como se ha descrito anteriormente, las sales
pueden tener propiedades caotrópicas al proteger las cargas y prevenir la estabilización de
los puentes salinos. Los enlaces de hidrógeno son más fuertes en medios no polares, por lo
que las sales, que aumentan la polaridad química del disolvente , también pueden
desestabilizar los enlaces de hidrógeno. Mecánicamente, esto se debe a que no hay
suficientes moléculas de agua para solvatar eficazmente los iones. Esto puede resultar en
interacciones ion-dipolo entre las sales y las especies de puentes de hidrógeno que son
más favorables que los enlaces de hidrógeno normales . Algunos ejemplos son la urea, la
tiourea o el cloruro de guanidinio.
● La molécula de ARN es sumamente lábil, por lo que la clave en la extracción es

evitar su degradación por acción de ribonucleasas propias de la célula. Los
protocolos existentes se basan en una rápida inactivación de ARNsas endógenas,
muy estables y que no requieren de cofactores para funcionar. Es muy importante
tomar precauciones para evitar la contaminación con ARNsas exógenas, por
ejemplo, tratar el agua y soluciones salinas con inhibidores de ARNsas −como el
DEPC al 0.1%−, que inactiva las ribonucleasas por modificaciones covalentes. Si es
posible, se recomienda el empleo de pipetas, puntillas y soluciones exclusivas para
trabajar con ARN. El material de vidrio debe esterilizarse por calor seco por 4 horas
a 150°C, mientras que el material plástico debe ser nuevo y estéril, o bien debe
enjuagarse con cloroformo, ya que la esterilización por autoclave no inactiva por
completo las ARNsas.
● Para la lisis celular suele optarse por la lisis mecánica o enzimática. La disrupción
mecánica se emplea con más frecuencia para tejidos frescos o células, usando un
homogeneizador mecánico. La disrupción de tejido congelado es más laboriosa y se
recomienda el uso de un homogeneizador eléctrico. La homogeneización del tejido
se realiza habitualmente en una solución comercial fenólica con tiocionato de
guanidina, llamada Trizol.®
● En el mercado se encuentran disponibles soluciones comerciales estabilizadoras
para el ARN (RNAlater®, Ambion), que permiten preservar la muestra sin congelarla.
Estas soluciones mantienen el ARN estable en el tejido a 37°C por un día, a 25°C
por una semana, a 4°C por un mes y a temperaturas bajo cero por tiempo indefinido.
● Por otro lado, la disrupción enzimática se utiliza con más frecuencia para lisar
células que contienen envoltura o cápsula, como bacterias y levaduras. La digestión
con lisozima, zimoliasa o lisostafina suele seguirse de una sonicación,
homogeneización o vórtex vigoroso en un buffer de lisis que contiene hidrocloruro de
guanidina. Los métodos enzimáticos también pueden emplearse para tejidos
eucariotes ricos en colágena, con la finalidad de digerir antes de la lisis celular.
● La concentración de la muestra de ADN se calcula teniendo en cuenta el valor de

absorbancia obtenido a una longitud de onda de 260nm. Mientras que la relación de
absorbancias A260/280 y A260/230 se utilizan para evaluar la pureza de las
muestras.
● La relación A260/280 es muy estable y se considera que un ADN de pureza óptima
tiene un valor entre 1.8-2.0. Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una
relación A260/280 > 1.6. Un valor A260/280 < 1.6 indica una posible contaminación
por compuestos aromáticos como fenoles y proteínas. Un radio A260/280 > 2.1
podría deberse a la presencia de ARN en la muestra.
● A 230nm absorben contaminantes como sales caotrópicas, fenoles o carbohidratos.
En general, se considera que el ADN es puro cuando el ratio A260/230 se sitúa en
torno 1.8-2.2. Un ratio menor de 1.8 se relaciona con presencia de contaminantes en
la muestra. Cuanto menor sea este ratio la presencia de contaminantes en la
muestra será mayor. Un ratio < 1.5 estaría indicando una impureza relevante en la
muestra que podría comprometer su funcionalidad.
● No obstante, esta relación resulta mucho más variable que la relación A260/280
dependiendo de factores como la concentración de ADN o de la composición del
tampón de resuspensión de la muestra.
d. ¿Por qué considera usted que es necesario realizar la estimación de la
concentración del ADN aislado?
La concentración de ADN aislado indica la eficiencia del método de extracción. Además, en

el caso de ADN genómico o de doble cadena, una densidad óptica equivale a 50 ug/ml. Se
debe considerar el factor de dilución para obtener la concentración en
nanogramos/microlitro (ng/ul). En el caso de algunos equipos como el espectrofotómetro
Nanodrop, no es necesario diluir la muestra y el equipo nos proporciona directamente la
concentración en ng/ul. Considerando que para una reacción de PCR se requieren de 10 a
200 ng debemos obtener al menos, 5 ng/ul de ADN en cada muestra, si se recuperaron 50
ul, el rendimiento neto de la extracción sería de 0.25 ug. Concentraciones menores
dificultan la estandarización de la PCR u otras técnicas.

Cuestionario Bioquimica

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Cuestionario Bioquimica

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Cuestionario Bioquimica

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la pared, la

Un agente caotrópico es una sustancia que altera la estructura de, y desnaturaliza ,

● La molécula de ARN es sumamente lábil, por lo que la clave en la extracción es

● La concentración de la muestra de ADN se calcula teniendo en cuenta el valor de

La concentración de ADN aislado indica la eficiencia del método de extracción. Además, en

También podría gustarte