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AGRADECIMIENTOS

Este proyecto de investigación fue financiado por Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(CONACYT) con el No. de beca 494272.

Gracias a la Dra. Ilaria Palchetti por permitirme realizar la estancia en el departamento de química
“Ugo Schiff” de la Universidad de Florencia, también agradezco a la Dra. Marcela Ayala por
permitir el uso de los recursos de supercomputación de la UNAM para realizar los cálculos teóricos,
optimizaciones de geometría y análisis de frecuencia (Proyecto LANCAD-UNAM-DGTIC-293).

También quiero agradecer a la Vicerrectoría de Investigación y Estudios de Posgrados (VIEP) por


el apoyo otorgado dentro del Programa IV. Investigación y Posgrado. con No. de oficio
VIEP/2423/2019, así como al Posgrado en Ciencias Ambientales y al Instituto de Ciencias (ICUAP)
por las facilidades en las gestiones de apoyo que siempre me brindaron.

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Contenido

1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 8

La necesidad del uso de los plaguicidas .......................................................................................... 8

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................. 11

3. JUSTIFICACIÓN...................................................................................................................... 15

4. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN ..................................................................................... 16

5. HIPÓTESIS ............................................................................................................................... 16

6. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 16

6.1 Objetivo General ..................................................................................................................... 16

6.2 Objetivos Particulares ............................................................................................................. 16

7. MARCO TEÓRICO .................................................................................................................. 17

7.1 Plaguicidas .............................................................................................................................. 17

7.2 Glifosato .................................................................................................................................. 17

7.2.1 Producción........................................................................................................................ 19

7.2.2 Usos .................................................................................................................................. 21

7.3 Aspectos toxicológicos del glifosato ....................................................................................... 22

7.3.1 Intoxicaciones por glifosato ............................................................................................. 23

7.3.2 Toxicodinámia y toxicocinética del glifosato .................................................................. 23

7.3.3 Mutagenicidad .................................................................................................................. 24

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7.3.4 Carcinogenicidad.............................................................................................................. 26

7.4 Presencia del glifosato en los diferentes compartimentos ambientales ................................... 27

7.4.1 Suelo ................................................................................................................................. 27

7.4.2 Aire ................................................................................................................................... 28

7.4.3 Agua ................................................................................................................................. 29

7.4.4 Seres humanos .................................................................................................................. 30

7.5 Persistencia de glifosato en diferentes compartimentos ambientales ...................................... 31

8. DESARROLLO DEL MÉTODO PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE


GLIFOSATO EN AGUA .................................................................................................................. 35

8.1 Métodos instrumentales de detección de glifosato en agua..................................................... 35

8.2 MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................... 38

8.2.1 Método con lacasa ................................................................................................................ 38

8.2.1.1 Actividad catalítica estándar de la lacasa ...................................................................... 38

8.2.1.2 Determinación de la inhibición enzimática por el glifosato .......................................... 39

8.2.1.3 Optimización de las condiciones de inhibición ............................................................. 39

8.2.1.4 Diseño Central Compuesto (DCC) ................................................................................ 39

8.2.2 Método con Bis 5-Fenildipirrinatode níquel (II) .................................................................. 40

8.2.2.1 Síntesis del compuesto Bis 5-Fenildipirrinato de níquel (II) [Ni(PhDP)2] .................... 41

8.2.2.2 Interacción entre el compuesto [Ni(PhDP)2] con glifosato ........................................... 42

8.2.2.3 Estequiometría del complejo ......................................................................................... 42


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8.2.2.4 Determinación de la constante de disociación (Kd) ....................................................... 42

8.2.2.5 Análisis en muestras de agua......................................................................................... 43

8.2.2.6 Interferentes................................................................................................................... 43

8.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 44

8.3.1 Detección de glifosato con lacasa ........................................................................................ 44

8.3.1.1 Velocidad de reacción ................................................................................................... 44

8.3.1.2 Perfil catalítico de la lacasa contra cambios de pH ....................................................... 45

8.3.1.3 Constantes cinéticas ...................................................................................................... 46

8.3.1.4 Efecto inhibitorio del glifosato en la enzima ................................................................. 46

8.3.1.5 Optimización de la detección ........................................................................................ 48

8.3.2 Detección con Bis 5-Fenildipirrinato de níquel (ll) [Ni(PhDP)2] ......................................... 52

8.3.2.1 Síntesis y caracterización del compuesto [Ni(PhDP)2] ................................................. 52

8.3.2.2 Estequiometria............................................................................................................... 54

8.3.2.3 Constante de disociación (Kd) ....................................................................................... 55

8.3.2.4 Selectividad del método ................................................................................................ 56

8.3.2.5 Análisis de muestras de aguas fortificadas con glifosato .............................................. 57

8.4 CIFRAS DE MÉRITO DEL MÉTODO DESARROLLADO ................................................ 61

9. VIDA SOCIAL DE LOS CAMPESINOS DE SAN SIMÓN ATZITZINTLA Y SU


RELACIÓN CON EL GLIFOSATO EN EL AGUA ....................................................................... 63

9.1 Cultura Campesina .................................................................................................................. 63


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9.2 MATERIALES Y METODOS ............................................................................................... 64

9.2.1 Zona de estudio .................................................................................................................... 64

9.2.2 Detección de glifosato en agua de diferentes matrices de San Simón Atzizintla por el
método ELISA .............................................................................................................................. 69

9.2.3 Técnicas de recolección de datos ......................................................................................... 69

9.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................. 70

9.3.1 Campesinado y transmisión de saberes de generación en generación en los grupos


familiares de San Simón Atzitzintla .............................................................................................. 70

9.3.2 Grado marginación y pobreza de San Simon Atzitzintla ..................................................... 73

9.3.3 Tipos de cultivo y plaguicidas más utilizados ...................................................................... 76

9.3.4 Glifosato en agua de la localidad de San Simón Atzitzintla ................................................ 85

9.3.5 Estado actual de la PTAR en San Simón Atzitzintla............................................................ 86

10. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .......................................................................... 90

11. REFERENCIAS .................................................................................................................... 92

12. ANEXOS............................................................................................................................. 114

12.1 ANEXO 1. Detección espectrofotométrica de glifosato en agua por formación de complejo


entre bis 5-fenildipirrinato de níquel (II) y glifosato ................................................................... 114

12.3 ANEXO 3. Un método espectroscópico simple para determinar dimetoato en muestras de


agua por formación complejo...................................................................................................... 131

12.4 ANEXO 4. Guía de entrevista ............................................................................................. 153

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“Desarrollo de un método para la detección y cuantificación del
plaguicida glifosato y su aplicación en muestras de agua de San
Simón Atzitzintla, Puebla”
1. INTRODUCCIÓN

La necesidad del uso de los plaguicidas

El aumento incontrolado de la población ha traído una clara amenaza mundial en el desarrollo


económico, social e incluso para la sostenibilidad ambiental. En 2019 se registró una población de
7.7 billones de habitantes, la cual se estima que aumente a 11 billones de personas en 2055 (United
Nations, 2019). El aumento de la población exige constantemente mejorar los sistemas de
abastecimiento de alimentos(Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la
Agricultura, 2009). Tal como ocurrió a nivel mundial (incluido México) en la década de 1950, con
la llamada revolución verde, debido al aumento en las tendencias demográficas de la población, fue
necesario implementar un programa de desarrollo agrícola con el fin de aumentar las tasas de
productividad a partir de una producción extensiva a gran escala, aplicando paquetes tecnológicos
con plaguicidas sintéticos, sistemas de riego, semillas mejoradas, entre otros (Grieve et al., 2019).
Con el objetivo de abastecer las necesidades de alimentos de la población y que a su vez generara
beneficios económicos y políticos (Keswani, Dilnashin, Birla, & Singh, 2019). A pesar de que han
transcurrido más de 60 años de la llegada de la revolución verde, hoy en día continúan vigentes los
paquetes tecnológicos a base de plaguicidas sintéticos, siendo México uno de los países que más
consume plaguicidas sintéticos (Chilón Camacho, 2017).

Sin duda el uso de plaguicidas sintéticos en la agricultura ha ayudado a incrementar la producción


de alimentos; sin embargo, el uso de estos productos también ha generado un devastador impacto en
los recursos naturales y en la salud humana (Pesticide Action Network Europe, 2018). La
implementación de la agricultura extensiva a partir de plaguicidas sintéticos fue con el objetivo de
aumentar las tasas en la producción de alimentos para abastecer las necesidades humanas. Pero a
pesar de que en 2018 de acuerdo al reporte global de las Naciones Unidas se produjo una cantidad
suficiente para alimentar a toda la población mundial, ocurrió la peor crisis de seguridad
alimenticia, puesto que más de 113 millones de personas en 53 países experimentaron hambre
aguda, revelando que el uso de plaguicidas sintéticos, entre otros paquetes tecnológicos agrícolas no
han contribuido a reducir el hambre mundial, debido a que los alimentos se aglomeran

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principalmente en países industriales, concluyendo que la agricultura extensiva y el uso de
plaguicidas sintéticos no son la solución para producir la cantidad de alimentos necesarios para
satisfacer las necesidades humanas, ni mucho menos para combatir el hambre mundial (Food
Security Information Network, 2019).

Un plaguicida se define como una sustancia natural o sintética o inclusive una mezcla de estas
destinada a prevenir, controlar o destruir todo aquello que se considere como una plaga, (Thundiyil,
Stober, Besbelli, & Pronczuk, 2008) incluyendo a todos aquellos vectores (mamíferos, pájaros,
artrópodos e insectos) denominados como causantes de enfermedades humanas y animales o
simplemente indeseables por causar algún tipo de daño o interferencia en la producción,
elaboración, almacenamiento, transporte o también en la comercialización de alimentos para
humanos o animales, así como otros productos agrícolas y ganaderos (Hancock et al., 2008). El
término plaguicida también incluye, a todas las sustancias que son destinadas para ser usadas como
reguladoras del crecimiento de las plantas, con características defoliantes y desecantes, siendo
también agentes para reducir la densidad de fruta, o evitar su caída prematura. Siendo los
plaguicidas todas las sustancias aplicadas a los cultivos antes o después de la cosecha para proteger
al producto contra su deterioro durante el almacenamiento y transporte (Organización de las
Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, 2009).

Los plaguicidas constituyen una herramienta importante en el desarrollo de la agricultura y su uso


ha contribuido a aumentar la producción de alimentos y materias primas (Satorre, 2005). Los
primeros plaguicidas de origen sintético se formularon entre los años 1930 y 1940, como resultado
de investigaciones que estaban enfocadas originalmente al desarrollo de armas químicas, los cuales
fueron probados por primera vez en insectos (Molina, 2013).

Uno de los primeros plaguicidas sintéticos que se creó fue el diclorodifeniltricloroetano, mejor
conocido como DDT, fue sintetizado por Zeidler en 1874, y sus propiedades insecticidas fueron
descritas por Paul Müller en 1939. El DDT se utilizó por primera vez durante la segunda Guerra
Mundial con el propósito de proteger a los soldados estadounidenses contra enfermedades
transmitidas por los mosquitos causantes de malaria y se comercializó en los EE.UU. en 1945 (J.
Kim et al., 2015).Donde la industrialización, los intereses económicos de los grandes productores
de plaguicidas, así como la necesidad de controlar a las plagas, rápidamente favoreció su
fabricación y consumo a escala mundial (Frederick Rowe, 2019).

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La introducción de los plaguicidas en México fue apoyada por fuertes inversiones internacionales
durante la revolución verde, con el fin de convencer a las autoridades de que el uso de plaguicidas
era un camino rápido y seguro para “modernizar” la agricultura mexicana. El gobierno mexicano
contribuyó a su prosperidad otorgando fuertes contribuciones a los insumos para convencer a los
grandes agricultores que las variedades de alto rendimiento y el uso masivo de agroquímicos les
serían muy redituables (Lilia Albert, 2005).

Entre los apoyos internacionales más importantes a esta revolución destaca el que dio la Fundación
Rockefeller a las escuelas más reconocidas de agronomía del país con el fin de destacar los
monocultivos de especies híbridas de alto rendimiento, así como el uso intensivo de plaguicidas
sintéticos y fertilizantes. Promoviendo a los plaguicidas como métodos para mejorar la
productividad agrícola, dando como resultado la formación de muchas generaciones de agrónomos
mexicanos que conocieran estos métodos de manera exclusiva o predilecta (Ortíz, Irmene; Avila-
Chavez, Marco A; Torres, 2013).

Para México en 2009, el mercado de plaguicidas fue aproximadamente de 700 millones de dólares,
lo cual representó un incremento del 5% anual dentro de los 5 años previos. En 2011 de los
plaguicidas registrados ante COFEPRIS (Comisión Federal para la Protección contra Riesgos
Sanitarios), alrededor del 90% fueron de origen químico y únicamente el 10% de origen biológico;
de estos el 4% eran extremadamente tóxicos, 9% altamente tóxicos, 22% moderadamente tóxicos, y
el 65% ligeramente tóxicos (COFEPRIS, 2012).

Hoy en día son evidentes los efectos de los plaguicidas sobre la salud del ser humano, animales,
plantas y el medio ambiente (Lee, den Uyl, & Runhaar, 2019). Independientemente de sus
beneficios, es evidente que los plaguicidas son sustancias químicas deliberadamente tóxicas,
creadas para interferir en sistemas biológicos, careciendo de una selectividad real (Del Puerto,
Suárez, & Palacio, 2014). Afectando simultáneamente en mayor o menor grado, tanto a la
humanidad como a otras categorías de seres vivos (Özkara, Akyil, & Konuk, 2016). Por todo lo
anterior, en este trabajo se aborda una breve descripción de la situación actual de los plaguicidas,
particularmente en el herbicida glifosato, el cual es catalogado mundialmente como el plaguicida
más utilizado, haciendo hincapié en la necesidad de desarrollar métodos para su detección de
manera rápida y sensible en el compartimiento ambiental agua.

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2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En México se encuentran registrados alrededor de 900 formulaciones de plaguicidas, de los cuales


anualmente se rocían entre 395 y 13,163 toneladas en cultivos que son de consumo cotidiano para
los mexicanos como maíz, tomate, frijol, papa, etc., (Hernández-Antonio & Hansen, 2011). Dentro
de los estados con mayor consumo de plaguicidas se encuentra: Sinaloa, Veracruz, Jalisco, Nayarit,
Colima, Sonora, Baja California, Tamaulipas, Michoacán, Tabasco, Estado de México, Puebla y
Oaxaca, que usan hasta un 80% de las 900 formulaciones de plaguicidas (L Albert, 2005; Bejarano
et al., 2017a), inclusive se ha llegado a reportar el uso de 24 plaguicidas prohibidos por la Secretaría
de Salud y 13 de uso restringido en cultivos y en zonas urbanas en estos estados (Bejarano et al.,
2017b).

La información a detalle en cuanto al volumen y tipos de plaguicidas que se aplican anualmente en


los campos agrícolas, así como el grado de contaminación orgánica es prácticamente inexistente
(Mendoza Cantú & Ize Lema, 2017), sin mencionar la falta de normas y regulaciones de muchos
plaguicidas que se usan ampliamente como el glifosato. Dentro de las Norma Oficiales Mexicanas
existe la NOM-201-SSA1-2015, la cual establece las concentraciones que deben de cumplir el agua
y hielo para consumo humano, fijando un límite máximo permisible para glifosato de 0.1 mg/L. Por
otro lado el glifosato en México aún continúa dentro de la clasificación toxicológica lV
(ligeramente tóxico) (Cicoplafest, 2004), mientras que en países como Italia, Francia y Dinamarca
está prohibido o es de uso restringido (Malkanthi, Sandareka, Wijerathne, & Sivashankar, 2019).

El problema ambiental producido por el glifosato, y en general los plaguicidas es muy complejo,
debido a que intervienen diferentes sectores, los cuáles se relacionan íntimamente, como es la parte
cultural que desde la introducción del glifosato en el mercado (1960), en pocos años se ha cambiado
la forma de preparar las tierras antes de ser cultivadas, hoy en día simplemente con rociar el
plaguicida en el área a cultivar es suficiente para que en unas horas quede listo para ser cultivado,
por lo que la aplicación de glifosato se vuelve una técnica más rápida, sencilla y económica. Debido
a su gran efectividad se ha convertido en el plaguicida más vendido en el mundo, generando una
gran cantidad de intereses monetarios a nivel mundial por empresas agrícolas trasnacionales como
Monsanto (hoy en día Bayer) (Dill et al., 2010). Actualmente en México no existen normativas o
políticas que prohíban o restrinjan el uso de este plaguicida, por lo que su venta continúa en el
mercado sin ninguna restricción. El uso de glifosato se ha caracterizado por ser un herbicida
eficiente de amplio espectro, donde estos factores fueron clave para desarrollar semillas
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modificadas genéticamente para ser resistentes especialmente al glifosato (Beckie, Busi,
Bagavathiannan, & Martin, 2019). Sin embargo el uso desmedido del glifosato ha provocado una
gran cantidad de afectaciones en la salud humana, animal, así como un ruinoso deterioro de los
recursos ambientales (Fernandes et al., 2019a; G. E. Séralini, Mesnage, Defarge, & Spiroux de
Vendômois, 2014; Xu, Smith, Smith, Wang, & Li, 2019), lo cual ha provocado múltiples
movimientos sociales a escala mundial para prohibir el glifosato, junto con las semillas transgénicas
resistentes a éste herbicida (Klein & Agroecology, 2017) (Figura 1). Por lo tanto, la interrelación de
los distintos sectores, hace necesario que la atención requerida para combatir este problema
complejo sea a diferentes niveles (político, social, ambiental, académico, cultural, tecnológico, entre
otros).

Figura 1. Esquema representativo de los distintos sectores que interactúan en la problemática


compleja del glifosato. (Elaboración propia)

El uso desmedido de glifosato ha provocado su presencia en los distintos compartimentos


ambientales, inclusive ha sido catalogado por distintos autores como un contaminante común
(Myers et al., 2016a; Vandenberg et al., 2017), quedando la población expuesta a los efectos
nocivos que este provoca. Algunas afectaciones se resumen en la Tabla 1.
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Tabla 1. Afectaciones del glifosato en distintos sistemas. (Elaboración propia)
Sistema Afectaciones Referencias
 Posible disruptor endócrino (International Agency for
 Posible carcinogénico Research on Cancer, 2017a;
 Afectación en el sistema nervioso Myers et al., 2016a; Patel &
Salud humana Disfunción respiratoria, falla renal Sangeeta, 2019; Smith et al.,
y cardiaca, así como coma y 2019; Szepanowski et al.,
muerte 2018; Zouaoui et al., 2013)

 Reducción de la expectativa de la (Dai et al., 2016; Gill et al.,


vida acuática, así como reducción 2018; Guilherme, Gaivão et
en las tasas de reproducción al., 2012; Mondal,
 Mutaciones letales Mukherjee et al., 2018;
 Daño al ADN en pruebas de Williams et al., 2016)
laboratorio con tejidos y órganos
Biodiversidad de ratón
 Trastornos reproductivos
 Carcinogénesis en ratas macho y
de cáncer tiroideo en hembras
Pérdida de especies en peligro de
extinción.

 Reducción en la absorción de (Gaupp-Berghausen et


nutrientes esenciales para los al., 2015; Mertens, Höss
cultivos et al., 2018; Rose et al.,

Suelo-Planta  Disminución en la fijación de 2017)


nitrógeno
 Mayor vulnerabilidad hacia
enfermedades de plantas

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Ante esta situación aún se necesitan estudios científicos para la completa comprensión de la
complejidad del problema asociado al uso del glifosato, ya que parte del problema tiene que ver con
la falta de datos certeros sobre la presencia del herbicida en los diferentes compartimentos
ambientales. La detección y cuantificación del glifosato está basado en métodos y técnicas
sofisticadas que requieren instrumentos modernos, personal capacitado, pre-tratamientos costosos y
largos; por lo que darles seguimiento a estudios de impacto ambiental o análisis de riesgo ambiental
es poco probable, ya que solo contadas instituciones tienen acceso a aplicar estos métodos. El
método oficial para determinar el herbicida glifosato es el 547 (U.S. Environmental Protection
Agency, 1990), el cual se basa principalmente en tres pasos:

 Inyección-acuosa-directa en HPLC
 Derivatización post-columna
 Detección por fluorescencia

El primer paso de este método consiste en la separación del glifosato de la muestra de agua por
medio de la inyección en una columna HPLC de intercambio catiónico. Después de la elución por
HPLC los componentes separados de la muestra de agua son oxidados con hipoclorito de calcio,
para mezclar el producto con o-ftalaldehído-2-mercaptoetanol (OPA), para conferirle la propiedad
de absorber luz y fluorescer, lo cual finalmente es detectado por espectrofluorimetría, durando todo
el procedimiento alrededor de 15 horas (Figura 2).

Figura 2. Procedimiento de detección de glifosato usando el método 547 certificado por la Agencia
de Protección Ambiental (EPA). (Elaboración propia)
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Las ventajas que tiene este método es que permite realizar mediciones de alta selectividad y
sensibilidad, pero a la vez es un método complejo, costoso ya que requiere de instrumentos
analíticos como la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) y el espectrofluorímetro
acoplado, requiriendo de tiempos largos de análisis por las reacciones post-columna (8 horas), así
como personal capacitado. Lo anterior ha traído como consecuencia que muy pocas instituciones
tengan la capacidad analítica para darle seguimiento a los estudios de impacto ambiental del
plaguicida glifosato.

Dada la importancia de la determinación de glifosato en agua de manera rápida, sensible y


confiable, en este trabajo se propuso desarrollar una alternativa para la determinación de glifosato
en diferentes matrices de agua (potable, urbana, subterránea, superficial y residual tratada),
mediante un método innovador. Al método desarrollado se le determinaron sus cifras de mérito
(sensibilidad, selectividad, exactitud, reproducibilidad y precisión). Adicionalmente se planteó que
el método desarrollado tuviera tiempos cortos de detección, fácil aplicación y bajo costo en
comparación al método oficial de la EPA.

3. JUSTIFICACIÓN

La amplia distribución del glifosato en el agua demanda métodos de detección y cuantificación,


para su monitoreo. Los métodos actuales requieren de instrumentos sofisticados de alto costo,
tiempos largos de análisis, infraestructura compleja y personal altamente capacitado. Debido a lo
anterior se decidió plantear el desarrollo de un método espectrofotométrico a partir de la inhibición
de la enzima lacasa o por formación de complejo empleando el compuesto metálico Bis 5-
Fenildipirrinatode níquel (II), para la detección y cuantificación del herbicida glifosato en agua en
tiempos cortos de detección, alta sensibilidad, reproducibilidad, y bajo costo, así como la capacidad
de determinar glifosato en diferentes matrices de agua (potable, urbana, subterránea y residual
tratada, provenientes de la localidad de San Simón Atzitzintla). El desarrollo de un método
alternativo y viable permitiría el análisis a un mayor número de muestras en un menor tiempo.
Además, el presente trabajo aborda la situación actual de los plaguicidas en México, enfocándonos
principalmente en el herbicida glifosato, útil para generar información científica valiosa.
Finalmente, el trabajo se justifica dado que permitió identificar las relaciones causales mediante el
estudio cualitativo con entrevistas en profundidad hacia los campesinos de la localidad de San
Simón Atzitzintla.

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4. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN

 ¿Cuál es el desempeño del método desarrollado en términos de sensibilidad y rapidez de la


detección por medio de la interacción con sitios metálicos para ser aplicada a distintas
matrices de agua provenientes de San Simón Atzitzintla?
 ¿Cuáles son las relaciones causales que explican la presencia de glifosato en agua residual
tratada de San Simón Atzitzintla?

5. HIPÓTESIS

 A través del desarrollo de un método espectrofotométrico se podrá detectar el glifosato, de


manera sencilla y rápida en comparación a otros métodos ya desarrollados.
 El uso desregulado de herbicidas comerciales que contienen el ingrediente activo glifosato,
dentro de las actividades socioeconómicas de San Simón Atzitzintla, favorece su
distribución en agua superficial de la localidad.

6. OBJETIVOS

6.1 Objetivo General

Desarrollar un método de detección y cuantificación del herbicida glifosato en agua para detectar
dicho herbicida en distintas matrices de agua provenientes de la localidad de San Simón Atzitzintla.

6.2 Objetivos Particulares

 Determinar la capacidad del compuesto metalado para detectar glifosato por formación de
complejo.
 Determinar las condiciones óptimas de inhibición catalítica de la lacasa por la presencia de
glifosato.
 Determinar las cifras de mérito del método al ser aplicado en las diferentes muestras de
agua de la localidad de San Simón Atzitzintla.
 Identificar las relaciones causales de la presencia de glifosato en el agua residual tratada de
San Simón Atzitzintla, desde un enfoque ambiental, social y económico.

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7. MARCO TEÓRICO

7.1 Plaguicidas

La humanidad desde antes del 2000 a. C. ha utilizado los plaguicidas con el fin de proteger a los
cultivos de las plagas (Ranga Rao, Rupela, Rameshar Rao, & Reddy, 2007). Un estudio hecho por
Ritter, menciona que el primer registro de plaguicida fue el azufre elemental utilizado en la antigua
Mesopotamia, incluso en el texto más antiguo de la India “El Rigveda”, hace mención del uso de
plantas venenosas para el control de plagas, el uso extensivo de plaguicidas a base de arsénico
comenzó poco después de la segunda guerra mundial (Ritter, 2009). En 1948, Paul Müller recibió el
premio Nobel en medicina por el descubrimiento del insecticida conocido como DDT (Gamboa
Fuentes, 1874), convirtiéndose en el plaguicida organoclorado más empleado a nivel mundial, por
su extraordinaria eficacia. Sin embargo, para 1975 los plaguicidas organoclorados fueron
reemplazados a causa de su alta toxicidad para la biodiversidad en general, por los plaguicidas
organofosforados y carbamatos, a partir de ese momento los compuestos de piretrina, se
convirtieron en los insecticidas dominantes en la industria (Barr & Angerer, 2006). El uso cotidiano
de los herbicidas comenzó en la década de 1960 posterior a la revolución verde, siendo la triazina y
ácidos carboxílicos (ácido 2,4-diclorofenoxiacético y glifosato) los más usuales (Ritter, 2009).

7.2 Glifosato

El glifosato es un análogo aminofosfónico del aminoácido natural glicina (Lajin & Goessler, 2019),
el cual es utilizado principalmente como plaguicida, dentro de la denominación herbicida defoliante
con uso agrícola, urbano y doméstico. El glifosato pertenece a la familia de los plaguicidas
organofosforados (C. Zhang et al., 2018), que por su alto grado de toxicidad su uso ha sido
restringido en diversos países de primer mundo (Austria, Bélgica y Noruega) (Brookes, Taheripour,
& Tyner, 2017).

Hoy en día el glifosato (N-fosfonometilglicina o N-(fosfonometil) glicina-isopropilamina,


C3H8NO5P) (Figura 3) es el plaguicida más utilizado y producido en el mundo (Soumis, 2018). Los
productos a base de glifosato están registrados en más de 130 países, incluido México (Richmond,
2018) y están aprobados para el control de malezas en más de 100 cultivos. No existen otros
ingredientes activos de herbicidas que se le comparen en cuanto al número de usos aprobados
(Tanveer, Ali, Manalil, Raza, & Chauhan, 2018).

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Figura 3. Estructura química del glifosato (Elaboración propia)

El glifosato fue por primera vez sintetizado en 1950 por el químico suizo, Dr. Henri Martin, sin
embargo, el trabajo nunca fue publicado (Dill et al., 2010). En 1964 Stauffer Chemical patentó el
glifosato como agente quelante, por su gran capacidad de unirse y remover minerales en el siguiente
orden: Ca2+ < Mn2+ < Zn2+ < Mg 2+ < Fe 3+ < Al3+ (Mertens et al., 2018). La empresa trasnacional
conocida como Monsanto en 1960 mejoró la fórmula del glifosato para que tuviera mayor actividad
herbicida, la cual fue sintetizada por el químico John E. Franz (Dill et al., 2010).

El mecanismo de acción del herbicida glifosato consiste en la inhibición de la enzima 5-


enolpiruvilsikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), la cual participa metabólicamente en la producción
de aminoácidos aromáticos y otros componentes aromáticos esenciales para la sobrevivencia de las
plantas (Petter et al., 2016). La inhibición de la EPSPS evita que la planta produzca los compuestos
esenciales para el crecimiento de la planta, incluyendo aquellos involucrados en la defensa de la
planta (Caetano, Ramalho, Botrel, da Cunha, & de Mello, 2012), perturbando el crecimiento
microbiano esencial para la nutrición vegetal (Johal & Huber, 2009).

El glifosato como producto químico puro muestra las siguientes propiedades físicas y químicas
(Tabla 2), las cuales son esenciales para tener una noción cercana en cuanto a la distribución en los
compartimientos ambientales, así como el impacto que puede causar en la biodiversidad.

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Tabla 2. Propiedades físicas y químicas del glifosato (International Agency for Research on Cancer,
2017a)
Nombre Químico (N-fosfonometil) glicina
Apariencia y olor Sólido cristalino blanco e inodoro
Peso Molecular 169.7 g/mol
Densidad 1.70 g/cm3
Punto de Fusión 184.5°C (se descompone a 187°C)
Soluble: agua 11.6 g/L (25°C). Insoluble en solventes orgánicos:
Solubilidad
Acetona, etanol y xileno.
Inflamabilidad No es inflamable
Corrosivo al acero y al zinc.
Corrosividad
No corrosivo al acero inoxidable y al polietileno
Estabilidad 32 días (25°C) y pH= 3-9
Presión de vapor 1.84x10-7 mm de Hg (45°C)
Volatilidad 1.31x10-2 mPa (25°C)

Por su alta solubilidad en agua el glifosato puede distribuirse a grandes distancias de donde es
normalmente aplicado, a través de las corrientes acuosas. Por otro lado, para su aplicación el
glifosato debe ser disuelto en agua y rociado por aspersión, y que por su baja sedimentabilidad se
distribuye por aire como aerosoles. Además, sus zonas apolares de las moléculas permiten que sea
adsorbido rápida y fuertemente por las partículas del suelo, lo cual impide su movilidad y su
lixiviación (Okada, Costa, & Bedmar, 2016; Sprankle, Meggitt, Penner, & Penner2, 2014;
Vereecken, 2005).

7.2.1 Producción

Dentro del mercado agrícola tan solo en EE. UU. existen más de 750 productos que contienen el
ingrediente activo glifosato. La manufacturación del glifosato está autorizada en 20 diferentes
países, siendo China el principal productor, con más del 40% del suministro global con 53
fabricantes autorizados y exporta alrededor del 35 %, seguido de India con 9 productores y 5 en EE.
UU., otros de los países que producen glifosato son: Australia, Egipto, Malasia, España, Hungría,
Turquía, Reino Unido, Venezuela, Singapur, Israel y México (Soumis, 2018). Como se mencionó
anteriormente el glifosato es el plaguicida más empleado en el mundo, debido a la gran demanda

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que tiene, en 2008 tuvo una producción aproximada de 600,000 toneladas, la cual aumentó en 2011
a 650,000 toneladas y 720,000 toneladas en 2012 (Brookes et al., 2017). En 1987 tan solo en EE.
UU. fueron usadas aproximadamente 4,000 toneladas de glifosato, incrementando esta cifra
drásticamente en 2007 con 80,000 toneladas. Este aumento también se ha registrado en Asia en un
del 30% en la demanda en los últimos 3 años (Duke, 2018).

Dentro del mercado agrícola mexicano el glifosato se puede encontrar como sal de amonio, sal
amina isopropil, glifosato ácido o sal potásica, dependiendo al uso destinado; también se formula a
diferentes concentraciones del ingrediente activo por litro: 120, 240, 360, 480, 680 g (Tabla 3)
(Cerdeira, Gazziero, Duke, Matallo, & Spadotto, 2007).

Tabla 3. Presentaciones comerciales más vendidas de glifosato en México (Coordinación General


de Contaminación y Salud Ambiental, 2018)
Nombre Comercial Firmas Productoras Concentración
Faena 320 Proficol SA 320 g/L
Fuete SL Monsanto 480 g/L
Ranger SL Monsanto 240 g/L
Rocket SG Monsanto 74-75%
Rocky SL Monsanto 120 g/L
Roundup madurante Monsanto 480 g/L
SL
Roundup SG Monsanto 74-75%
Roundup SL (Sal) Monsanto 480 g/L
Glifosato 48 SL Coagro Ltda 48%
Clinofox Cedar Crystal Chemical 480 g/L

La principal razón por la que los agricultores han acogido rápidamente el uso de glifosato es por la
sencillez que ofrece para el control de malezas, además de que han reducido el número de
herbicidas que anteriormente usaban, lo cual significa un ahorro en cuanto costes y tiempo en el
mantenimiento de los cultivos (Steinmann, Dickeduisberg, & Theuvsen, 2012).

En 1996, comenzó la introducción de los cultivos transgénicos resistentes al glifosato, los


denominados cultivos Roundup Ready, de la empresa Monsanto (hoy Bayer). Las primeras semillas
genéticamente modificadas que se desarrollaron fueron: soya, maíz, sorgo, canola, alfalfa, algodón

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y trigo. Dichos cultivos dieron a los agricultores la capacidad de controlar malezas de una forma
rápida y sencilla, por la capacidad que tienen las semillas transgénicas para ser resistentes al
glifosato. El uso de las semillas transgénicas ha tenido un gran auge dentro de la agricultura ya que
año con año aumenta su uso, ya que en 2017 se registró que el 87 % de los cultivos de soya en EE.
UU. fueron de la variedad transgénica (United States Department of Agriculture, 2018).

Es particularmente importante destacar que México, en 2011 importó 9 millones 515,000 toneladas
de maíz provenientes principalmente de EE. UU., donde tratan sus cultivos con grandes cantidades
de glifosato (Coordinación General de Contaminación y Salud Ambiental, 2018).

7.2.2 Usos

7.2.2.1 Agricultura

Dentro de la agricultura el glifosato está autorizado para combatir más de 100 especies de malezas
anuales y pasto, así como más de 60 especies de malezas perenes. Las tazas de aplicación son
alrededor de 1.5-2 kg/ha para antes de cosechar, después de plantar y antes del brote del cultivo,
cerca de 4.3 kg/ha son directamente rociados en huertos, pasturas, bosques e industrias para control
de malezas, al igual se utiliza como herbicida acuático alrededor de 2 kg/ha (C. Zhang et al., 2018).
Los métodos de aplicación del glifosato más comunes son: el aéreo y rociado directo (Malone &
Foster, 2019). El uso del glifosato en un principio se limitó únicamente a ser rociado después de
cosechar como control de malezas, pero con la introducción de los cultivos transgénicos resistentes
al glifosato permitió su aplicación en cualquier momento del cultivo, las veces que sea necesario.
Sin embargo, el uso intensivo y continuo del herbicida en los cultivos transgénicos ha creado un
mecanismo de resistencia en cuanto a la eliminación de malezas, provocando que los agricultores
aumenten la dosis del herbicida (Grube, Kalnenieks, & Muter, 2019).

6.2.2.2 Residencial

El glifosato es extensamente usado para el control de malezas en el hogar en todo el mundo. En EE.
UU. entre el 2001 y el 2007 el glifosato se posicionó como el segundo plaguicida más usado para el
hogar y el sector de jardín, con un consumo anual entre 2000-4000 toneladas (Myers et al., 2016a).
Para el caso de México, se tiene autorizado el glifosato para uso urbano y de jardinería, para control
de hierbas no deseadas en campos de golf, parques, y otras áreas urbanas públicas.

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6.2.2.3 Otros usos

El glifosato también es utilizado para el control de especies invasivas acuáticas o sistemas de


humedales. En EE. UU. aproximadamente entre el 1-2% del glifosato es utilizado en el sector
forestal (Fernandes et al., 2019b). Este herbicida se ha rociado en gran escala de forma aérea desde
el año 2000 en un programa que tiene como propósito reducir la producción de cocaína en
Colombia. Mientras que en México y Sudamérica se utiliza para combatir cultivos de marihuana
(Bernal Cáceres, 2019).

7.3 Aspectos toxicológicos del glifosato

Las industrializaciones químicas junto con la modernidad han orillado a los agricultores a sustituir
el laboreo mecánico y manual en el campo, por la aplicación de sustancias químicas sintéticas con
toxicidad elevada, las cuales representan una amenaza potencial a la agricultura sustentable, tal es el
caso del herbicida glifosato. El uso intensivo de plaguicidas implica la exposición de los
operadores, así como el efecto residual en alimentos rociados directamente, quedando
potencialmente expuestos a sus efectos nocivos quienes los consume. Por lo tanto, en general la
población se encuentra en constante riesgo de entrar en contacto con plaguicidas, ya sea de forma
directa o indirecta(C. Zhang et al., 2018).

Alrededor del 50% de la población humana, ha estado expuesto a plaguicidas de forma directa
(fabricantes, transportadores, expendedores, agricultores, etc.) y el 100 % ha estado expuesto a los
residuos presentes en alimentos, agua, aire, suelo (Van Bruggen et al., 2018a).El incremento
constante en la producción y aplicación del glifosato ha provocado fuertes afectaciones en la salud
humana y animal, debido a su toxicidad, a los malos manejos y disposición de residuos, la falta de
normativas de regulación adecuadas y programas que promueven su uso. Por lo anterior, no es de
extrañar que el herbicida glifosato haya sido frecuentemente detectado en los diferentes
compartimentos ambientales (suelo, atmósfera, aguas superficiales y subterráneas) (Richmond,
2018).

Por otro lado, se ha reportado que en las formulaciones del herbicida además del ingrediente activo
glifosato se encuentra en concentraciones entre 6% al 18%, dependiendo de la formulación
comercial, el surfactante polioxietilenamina (POEA), el cual es principalmente utilizado como
emulsionante y agente humectante. Estudios experimentales han hecho mención de que la toxicidad

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del POEA, es aún mayor que la del glifosato, lo cual potencializa la toxicidad aguda de las
formulaciones del herbicida (Moore et al., 2012).

7.3.1 Intoxicaciones por glifosato

La mayoría de las intoxicaciones accidentales por glifosato ocurren por el hecho de que el herbicida
no se encontraba en su envase original (siendo confundidos por productos comestibles); por otro
lado, los casos por exposiciones ocupacionales generalmente ocurren por la falta de información y
capacitación en el uso del herbicida, debido a que la mayoría de los trabajadores no utilizan el
equipo de protección personal durante la aplicación; así como en la preparación de la mezcla para
su aplicación. Los síntomas por intoxicación aguda vía oral (5 a 150 mL), se presentan dentro de los
primeros minutos después de la ingesta (<30 min), principalmente gastrointestinales, como náuseas,
vómito, diarrea y dolor abdominal. En casos por intoxicación grave se ha reportado disfunción
respiratoria, falla renal, falla cardiaca, coma y hasta muerte (Kranawetvogl, Siegert, Eyer,
Thiermann, & John, 2018; Zouaoui et al., 2013).

Hasta el momento no existe un antídoto especial para tratar intoxicaciones por glifosato, sin
embargo, algunos tratamientos que se administran al presentar síntomas por intoxicación de
glifosato son reposición de suero bicarbonato molar, reposición hidroeléctrica, hipotensión arterial
mantenida, fármacos presores, administración de carbón activado y lavado gástrico para
intoxicaciones graves (Zouaoui et al., 2013).

7.3.2 Toxicodinámia y toxicocinética del glifosato

En la década de los 90, comenzaron a darse las primeras consultas por intoxicación de glifosato,
cifra que aumentan constantemente debido a su constante uso (Burger & Fernández, 2004; Zouaoui
et al., 2013). Las vías de ingreso del herbicida a los organismos pueden ser oral, cutáneo-mucosa y
respiratoria, el herbicida ya formulado tiene una toxicidad aguda en base a la DL50 oral en agua para
ratas de 10537 mg/kg, una DL50 dérmica de 7500 mg/kg y una CL50 inhalatoria (durante 4 horas) de
3180 mg/m3 de aire (Myers et al., 2016b).

De acuerdo a estudios toxicocinéticos en animales de experimentación, la mayor absorción ocurre a


nivel tubo digestivo entre un 30-36 %, mientras que por las demás vías es escasa la absorción. Una
vez absorbido el glifosato, se distribuye en todo el organismo, depositándose principalmente en
huesos (1% de la dosis oral). Entre el 15-29 % es excretado por la orina, el 2% por aire expirado y
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el 70% por heces. El glifosato en el organismo tiene escasa metabolización, ya que se logra excretar
sin alteración el 97 % de la dosis total absorbida (Gill et al., 2018).

El único metabolito reportado del glifosato es el ácido amino-metil-fosfónico (AMPA), el cual tiene
una vida media entre 26 días a 148 días, dependiendo de las condiciones a la que se encuentre
(Degenhardt et al., 2012). Recientemente se comprobó que el herbicida comercial Roundup, es
causante de la enfermedad de hígado graso no alcohólico a dosis que son permitidas por los
organismos reguladores a nivel mundial (Mesnage, Renney, Séralini, Ward, & Antoniou, 2017).
Algunas ratas expuestas a glifosato han mostrado alteraciones significativas en las actividades de
las enzimas hepáticas, de las cuales se extrajeron microsomas y mostraron una inhibición superior
al 50% del citocromo P450 (CYP). La inhibición del CYP impide la metabolización de sustancias
endógenas y exógenas como fármacos antineoplásicos (Larsen et al., 2014).

7.3.3 Mutagenicidad

Algunos estudios han demostrado que el glifosato tiene la capacidad de bioacumularse en los
organismos, por ejemplo, en leche materna (Steinborn et al., 2016; Vannini et al., 2016), en tejidos
animales (Samanta, Mukherjee, Pal, Kole, & Ghosh, 2016) y en huesos (Krüger et al., 2014). El
peligro potencial que representa para la humanidad al estar expuesto a este tipo de herbicidas, hace
indispensable determinar el daño genético que podría causar.

La amplia distribución de plaguicidas y otros compuestos tóxicos ha interferido en la identificación


de poblaciones expuestas a glifosato que cumplan con los parámetros para realizar un análisis
epidemiológico representativo, confiable y además bioético. Por lo anterior, ha sido necesario
recurrir a herramientas epidemiológicas para evaluar, como primera instancia la actividad
mutagénica, con la finalidad de indagar sobre su potencial carcinogénico (Tabla 4).

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Tabla 4. Estudios mutagénicos por exposición de glifosato. (Elaboración propia)
Técnica Glifosato Conclusiones Referencias
Ensayo cometa 4-6.5 mM Se evidenció daño en (Monroy et al., 2005)
el ADN para células
humanas normales y
células humanas de
fibrosarcoma in vitro

Ensayo cometa 10.3 L/ha Las formulaciones de (Paz-y-Miño et al.,


glifosato aplicadas por 2007)
aspersión aérea
causan daño en el
ADN en individuos
expuestos
Ensayo cometa 5, 10 y 15 ppm Se encontró daño en (Çavaş & Könen,
el ADN en eritrocitos 2007)
de peces (Carassius
auratus) in vivo

Ensayo cometa 0.62-8.43 mM Después de 96 h de (Sandrini et al., 2013)


exposición presento
daño en el ADN en
peces (Danio reriro y
Jenynsia
multidentata)
Prueba de Salmonella 1.44 y 2.88 mg/L Se encontró un (Shehata et al., 2013)
aumento significativo
en las aberraciones
cromosómicas a partir
de extracciones de
médula ósea de ratón
tratados con Roundup

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7.3.4 Carcinogenicidad

Existen cuestionamientos sobre la seguridad del glifosato y sus formulaciones comerciales en la


salud humana, debido a que el glifosato afecta la estabilidad del ciclo celular, a partir del retraso de
la activación de CDK1/ciclina B, provocando daños genéticos (de Oliveira et al., 2019; Seneff &
Nigh, 2017), los cuales son cruciales en la generación de cáncer humano (Greim, Saltmiras,
Mostert, & Strupp, 2015). Hasta el momento no existen estudios epidemiológicos que muestren
evidencia suficiente para asociar la incidencia de cáncer por exposición de glifosato en humanos.
Sin embargo, se ha demostrado a través de estudios en animales de experimentación una asociación
positiva al cáncer (Tabla 5).

Tabla 5. Estudios sobre incidencia de cáncer asociados al glifosato. (Elaboración propia)

Tipo de cáncer Glifosato Conclusiones Referencias


Cáncer de piel 25 mg/kg Todos los ratones del grupo (George et al.,
lll comenzaron a presentar 2010)
tumorigénesis después de
52 días en la región dorsal
de la piel

Cáncer de mama 5x10-5, 400 y Ratas hembra presentaron (Séralini et al.,


2.25x103mg/L tumores en las glándulas 2014)
mamarias (principalmente
fibroadenomas y
adenocarcinomas): 5/10
(50%), 9/10 (90%) y 10/10
(100%)

Carcinoma renal 1000, 500 y Ratones macho presentaron (Williams et al.,


30000 ppm adenomas renales 2016)

A partir de los estudios anteriores la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer,
concluye en su reporte que existe suficiente evidencia carcinogénica en animales de

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experimentación por exposición a glifosato, catalogando al glifosato dentro de la categoría 2A,
como probablemente cancerígeno (International Agency for Research on Cancer, 2017b).

7.4 Presencia del glifosato en los diferentes compartimentos ambientales

Debido a su naturaleza química, a sus propiedades fisicoquímicas y a su uso intensivo, el glifosato


ha sido detectado en suelo, aire, agua superficial, en agua subterránea, incluso en seres vivos
(Figura 4) (Fernandes et al., 2019b; Maqueda, Undabeytia, Villaverde, & Morillo, 2017; Peruzzo,
Porta, & Ronco, 2008; Ruiz-Toledo, Castro, Rivero-Pérez, Bello-Mendoza, & S??nchez, 2014; Van
Bruggen et al., 2018b).

Figura 4. Ciclo biogeoquímico del glifosato. El plaguicida ha sido detectado en agua, suelo, seres
vivos y en algunos alimentos como maíz, soya, algodón(Rubio, Guo, & Emily, 2014; Torretta,
Katsoyiannis, Viotti, & Rada, 2018). (Elaboración propia)

7.4.1 Suelo

El suelo es el recurso con mayor presencia de glifosato, por lo tanto, es el compartimento más
analizado en cuanto al comportamiento de este plaguicida. Se encuentra reportado que la adsorción
del glifosato es alta en cualquier tipo de suelo, sin embargo tiene una particular afinidad por los
suelos arcillosos (De Gerónimo, Aparicio, & Costa, 2018; Sprankle, Meggitt, & Penner, 1975). Un
estudio realizado por (Veiga, Zapata, Fernandez Marcos, & Alvarez, 2001), monitoreo durante 8
semanas el comportamiento que tiene el glifosato en el suelo, encontrando que el glifosato tiene una
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alta movilidad vertical ya que el suelo tratado contenía concentraciones prácticamente inexistentes
de glifosato, mientras que el subsuelo presentó altas concentraciones del herbicida. La presencia de
glifosato en subsuelos es alarmante ya que la degradación ocurre de manera más lenta. Otro estudio
enfocado en el transporte del glifosato en suelo, monitoreo las concentraciones de glifosato, tanto en
suelos tratados con el herbicida, como en los suelos aledaños sin tratamiento, encontrando una
diferencia del 0.24% de glifosato entre los suelos labrados y fumigados con glifosato, respecto a los
no perturbados, no existiendo diferencias significativas entre ellos (Okada et al., 2016). En la Tabla
6 se muestra distintas investigaciones en diferentes países, que han determinado presencia de
glifosato en suelo.

Tabla 6. Concentraciones de glifosato en suelo (Elaboración propia)

Ubicación Concentraciones Referencias


glifosato (mg/kg)
Australia 1-1.2 mg/kg (Rose et al., 2017)

Argentina 0.093–0.163μg/g (Lupi et al., 2015)

México 320.6-607.7 mg/kg (Muñoz et al., 2019)


Unión 0.01-2 mg/kg (V. Silva et al., 2018)
Europea

Como se mencionó anteriormente el suelo es el compartimento ambiental con mayor presencia de


glifosato, donde dicha presencia ha traído afectaciones en las propiedades del suelo, de acuerdo al
estudio realizado por (Obour, Stahlman, & Holman, 2016) sobre cultivos de maíz y soya tratados
con glifosato en EE. UU. determinó las propiedades químicas del suelo, mostrando una afectación
en las concentraciones de P, NO3- N , SO4 -S y Fe.

7.4.2 Aire

Existen muy pocos estudios en cuanto a la presencia del glifosato en la atmósfera, debido a que es
prácticamente desconocido su comportamiento en este compartimento (Ravier et al., 2019). Una de
las primeras investigaciones enfocadas en la medición de glifosato en aire fue en 1991 por
Jauhiainen, quien reportó concentraciones de glifosato de15.7 µg/m3 durante los periodos de
fumigación silvícolas (International Agency for Research on Cancer, 2017b). En otro estudio se

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cuantificó el glifosato utilizando muestras de aire y agua de lluvia en tres áreas de EE. UU.
(Mississippi, Iowa e Indiana), encontrándose un rango entre el 60 - 100% de muestras positivas por
glifosato, y un rango de concentración de <0.01-9.1 ng/m3 en muestras de aire y <0.1- 2.5 ng/m3 en
muestras de agua de lluvia (F. chih Chang, Simcik, & Capel, 2011).

7.4.3 Agua

Después del suelo, el agua es el segundo compartimento con mayor presencia de glifosato. La
presencia del herbicida en aguas superficiales por aplicación directa, deposición atmosférica y por
deposición de partículas de suelo suspendidas, es muy común como (Tabla 7). Inclusive se ha
llegado a determinar su presencia en agua subterránea, de acuerdo a los resultados obtenido en un
estudio realizado por (Sanchís et al., 2012), reportando concentraciones máximas de 2.5 µg/L y una
concentración media de 200 ng/L de glifosato.

Tabla 7. Concentraciones de glifosato en aguas superficiales. (Elaboración propia)


Ubicación Concentraciones Referencias
glifosato (µg/L)
Argentina 0.1-1.7 (Pérez et al., 2017)
EE. UU. 0.04-73 (Coupe et al., 2012)
Argentina 0.6 (Ronco et al., 2016)
Canadá 30-41 (Struger et al., 2008)
Hungría 0.5-1 (Mörtl et al., 2013)

También existen estudios en México donde reportar presencia de glifosato en agua superficial,
subterránea, inclusive en agua para beber (Tabla 8).

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Tabla 8. Presencia de glifosato en diferentes matrices de agua en México
Ubicación Concentraciones Características Referencias
glifosato (µg/L)
Chiapas <0.13-36.71 23 sitios de muestreo, incluyendo (Ruiz-Toledo et
campos de cultivo y 2 áreas al., 2014)
naturales protegidas (Gancho-
Murillo y Cabildo-Amatal)

Campeche 0.47-1.42 La concentraciones más elevadas de (Rendón-Von et


glifosato se encontraron en muestras al., 2017a)
de agua subterránea y agua para
beber

La presencia de glifosato en agua se ha logrado determinar inclusive en lugares completamente


lejanos de donde fueron aplicados, tal es el caso del estudio realizado por (Ruiz-Toledo, Castro,
Rivero-Pérez, Bello-Mendoza, & Sánchez, 2014), donde encontraron presencia del herbicida en
agua de río que pertenecen a áreas naturales protegidas, lejanas a las zonas donde se practica
agricultura.

7.4.4 Seres humanos

Como se documentó arriba el glifosato se encuentra en los diferentes compartimentos ambientales,


por lo que la población en general se encuentra expuesta potencialmente a su presencia. Diversos
estudios que no están enfocados principalmente a la exposición ocupacional al glifosato, han
encontrado la presencia de este plaguicida no solo en trabajadores sino también en personas ajenas a
esta plaguicida, los datos detallados se encuentran en la Tabla 9.

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Tabla 9. Presencia de glifosato en seres humanos (Elaboración propia)
Ubicación Concentraciones Características Referencias
de glifosato
EE.UU. 3-233 ppb Se monitoreo la presencia de glifosato (Acquavella et al.,
en orina de agricultores, como de sus 2004)
familiares. Algunos familiares
(esposas e hijos) se les detectó
concentraciones del herbicida
EE. UU. 5-37 ppb Se analizaron muestras de orina tanto (Curwin et al.,
a trabajadores como a la población en 2007)
general, donde personas ajenas a la
jardinería presentaron concentraciones
de glifosato
México 0.22-0.47 µg/L Analizaron 81 muestras de orina de (Rendón-Von
agricultores de diferentes estados Osten et al., 2017b)
Tailandia 0-2.92 ng/mL Se analizaron muestras de sangre de (Wongta et al.,
agricultores y personas ajenas a 2018)
prácticas agrícola, dando positivo a
presencia de glifosato los trabajadores
agrícolas

La presencia de glifosato dentro del organismo humano, también se ha logrado determinar en leche
materna, de acuerdo a los resultados encontrados en el estudio estadounidense realizado por
(Honeycutt, Zen.; Rowlands, 2014), donde reporta concentraciones de glifosato entre 76 ug/L-166
ug/L, los cuales exceden 760 a 1600 veces el límite máximo permisible de plaguicidas de la Unión
Europea.

7.5 Persistencia de glifosato en diferentes compartimentos ambientales

La vida media en aguas naturales del glifosato es de un promedio de >60 días, de acuerdo a
distintos estudios (Bonnet, Bonnemoy, Dusser, & Bohatier, 2007; Primost, Marino, Aparicio, Costa,
& Carriquiriborde, 2017), y su persistencia va a depender de acuerdo a las condiciones en la que se
encuentre el glifosato, así como en el compartimento ambiental, en la Tabla 10 reporta la vida

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media del glifosato en suelo, sedimentos y diferentes matrices de agua (Mercurio, Flores, Mueller,
Carter, & Negri, 2014).

Tabla 10 Vida media de glifosato en suelo, sedimentos y agua.


Vida media (días) Matriz
4-180 Suelo
87 Sedimento
>63 Agua de lago
70 Agua de estanque
63 Agua de pantano
49 Agua de Ciénega
49-70 Agua natural

La persistencia del glifosato depende de la temperatura y la cantidad de luz a la que se encuentra


expuesto. El estudio realizado por (Mercurio et al., 2014); expone que el glifosato es
moderadamente persistente en agua marina (47 días), bajo condiciones de poca luz y altamente
persistente en la oscuridad (267-315 días) a una temperatura entre 25 y 30°C.

Por todo lo anterior, el estudio del impacto del glifosato aún requiere de varias vías de trabajo para
una completa comprensión del tamaño y de la complejidad del problema. Algunas de las áreas que
requieren atención para abordar la complejidad relacionada con el glifosato son la toxicología,
degradación, migración, así como su detección (siendo esta última donde se centra este trabajo).

Para cumplir con los objetivos establecidos de la investigación fue necesario dividirla en tres
secciones como se muestra en la figura 5.

1. Recopilación de información. Consistió en una continua recopilación de información


científica, técnica y normativa, para documentar la problemática actual de los plaguicidas
en México, enfocándose principalmente en el glifosato, además se generó información
acerca del impacto ambiental del glifosato en los diferentes compartimentos ambientales,
principalmente agua.
2. Parte experimental de laboratorio. Radicó en desarrollar un método de detección de
glifosato en agua en el Laboratorio de Bioinorgánica aplicada del Centro de Química-
ICUAP, así como la aplicación del método desarrollado, en distintas matrices de agua

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(potable, urbana, residual tratada, subterránea) provenientes de la localidad de San Simón
Atzitzintla.
3. Parte experimental de campo. Consistió tomar muestras de agua (potable, urbana,
superficial, residual, residual tratada, subterránea, y canales de riego) provenientes de la
localidad de San Simón Atzitzintla, Puebla; así como identificar las relaciones causales de
la presencia del glifosato en la matriz agua en dicha localidad, desde un enfoque ambiental,
social y económico, a partir de entrevistas en profundidad, complementadas con
observación hacia los campesinos de la localidad.

Figura 5. Estrategia de trabajo. (Elaboración propia)

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Parte
experimental
de laboratorio

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8. DESARROLLO DEL MÉTODO PARA LA DETECCIÓN Y
CUANTIFICACIÓN DE GLIFOSATO EN AGUA

8.1 Métodos instrumentales de detección de glifosato en agua

Hoy en día el herbicida glifosato está considerado como el contaminante más común a nivel global
(Hu, Zhao, & Sorohan, 2011; Ruiz-Toledo, Castro, Rivero-Pérez, Bello-Mendoza, & Sánchez,
2014), debido a que ha sido determinado en los diferentes compartimentos ambientales (Martínez et
al., 2018; Valle, Mello, Alves-Balvedi, Rodrigues, & Goulart, 2018; Van Bruggen et al., 2018b). El
desarrollo de métodos de detección rápidos y confiables para determinar glifosato en agua es
considerado como un área relevante de investigación. Como ya fue mencionado el método oficial
para determinar glifosato en agua es el desarrollado por la EPA nombrado como EPA-547 (U.S.
Environmental Protection Agency, 1990), el cual requiere de una derivatización post-columna del
herbicida con OPA (Kaczyński & Łozowicka, 2015). Otros métodos emplean cromatografía líquida
de alto rendimiento (HPLC) (M. Kim, Stripeikis, Iñón, & Tudino, 2007) acoplado a masas (E.a.
Lee, a.P. Strahan, 2002; Ibáñez, Pozo, Sancho, López, & Hernández, 2005, 2006; Wu et al., 2005),
fluorescencia (Padilla-Alonso et al., 2017) o electroforesis capilar (M. P. Moraes, Gonçalves, &
Pereira, 2018). Sin embargo, estos métodos son complejos, ya que las muestras requieren de pre
tratamiento y tiempos largos de análisis, por lo que no siempre es posible analizar un gran número
de muestras in situ (Botero-Coy, Ibáñez, Sancho, & Hernández, 2013; Yoshioka et al., 2011).
Recientemente, se han desarrollado otros métodos alternativos para monitorear muestras
ambientales in situ con la característica de tiempos cortos de análisis. Además, algunos otros
métodos analíticos han logrado notablemente límites de detección bajos: espectrofotométricos (Y.
Chang, Zhang, Hao, Yang, & Tang, 2016; De Almeida, Chigome, Torto, Frost, & Pletschke, 2015;
Rawat et al., 2016; Waiman, Avena, Garrido, Fernández Band, & Zanini, 2012), electroquímicos
(Bettazzi, Romero Natale, Torres, & Palchetti, 2018; Sánchez-Bayo, Hyne, & Desseille, 2010;
Songa et al., 2009), y por la técnica de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (Mörtl
et al., 2013; Sanchís et al., 2012). El desarrollo de nuevos métodos rápidos, sensibles, reproducibles
y económicos representan una alternativa viable a los métodos instrumentos actuales, permitiendo
el análisis de un mayor número de muestras ya sea en el campo o en el laboratorio (Farkas et al.,
2018; Noori, Dimaki, Mortensen, & Svendsen, 2018; Vaghela, Kulkarni, Haram, Aiyer, & Karve,
2018).

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Dada la importancia de detección de glifosato en agua de manera rápida, sensible y confiable, en
este trabajo, se propone el desarrollo de una alternativa para la determinación de glifosato en
diferentes matrices de agua, mediante un método innovador basado en la capacidad que tiene el
glifosato de unirse e incluso remover minerales como calcio, magnesio, níquel, cubre y zinc (Gros,
Ahmed, Kühn, & Leinweber, 2019; Ramrakhiani, Ghosh, Mandal, & Majumdar, 2019).

Para ello es necesario hablar de la enzima lacasa (Figura 6), la cual debe su nombre debido a que
fue aislada por primera vez del árbol laca Rhus vernicifera (Zhou, Deng, Pan, Chen, & Mo, 2010) y
proveniente de la cepa Coriolopsis gallica UAMH 8260, con un peso molecular de 66 kDa y se
caracteriza por tener en su centro activo cuatro átomos de cobre. Tiene un amplio rango de
compuestos que puede reconocer como sustratos, es decir, moléculas que pueda transformar,
además de las propiedades catalíticas que presenta (Kupski et al., 2019). Dentro de las propiedades
catalíticas estudiadas, la lacasa tiene la capacidad de catalizar la oxidación de plaguicidas
organofosforados, (Rangelov & Nicell, 2019). Sin embargo, en materia de biosensores, hasta la
fecha existen pocos reportes, por lo que se considera un elemento innovador en este trabajo. De esta
enzima se conoce su comportamiento cinético, mecanismo de reacción, su estructura tridimensional,
y es posible simular su interacción con sustratos mediante métodos computacionales. Todo ello se
utilizó para el desarrollo del presente trabajo. Cabe resaltar que en el centro activo de la enzima
lacasa tiene 4 átomos de cobre, dicha característica dio lugar a trabajar con esta enzima para
desarrollar un método de detección de glifosato en agua, puesto que existen diversos estudios que
han logrado la detección de glifosato por medio de la interacción con cobre, (F. C. Moraes,
Mascaro, Machado, & Brett, 2010; Pintado, Montoya, Rodríguez-Amaro, Mayén, & Mellado,
2012).

Figura 6. Estructura tridimensional de la enzima lacasa

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Por otro lado se encuentran los dipirrometenos, los cuáles son agentes quelantes bipirrólicos
monoácidos, donde su química de coordinación ha sido ampliamente estudiada debido a sus
propiedades ópticas y fluorescentes para formar compuestos estables con metales (Yamamura et al.,
2014), este tipo de ligantes son estructuralmente rígidos, completamente conjugados y capaces de
funcionalizar diferentes posiciones de su estructura (1, 5 y 9) (Figura 7b). La coordinación con
iones metálicos por dipirrometenos meso-sustituidos (posición 5) permite la introducción de nuevos
fragmentos aromáticos sustituidos, para poder aumentar la conjugación de la molécula, dicha
característica ha logrado que los dipirrometenos sean aplicados para diseñar sensores (Pereira,
Lemos, Serra, & Pinho E Melo, 2013) volviéndose una alternativa a los métodos de detección
cromatográficos.

El estudio de (Zhai et al., 2012) basado en pruebas fluorescentes con el dipirrometeno de boro
funcionalizado con un grupo de ácidos fenilborónicos (BODIPY-PBA) tiene la capacidad de
detectar diferentes monosacáridos en un rango de concentración entre 0.1–100 mM, con buena
reproducibilidad y fotoestabilidad. En otro estudio se desarrolló un biosensor electroquímico
utilizando un dipirrometeno-Cu (II) para determinar la forma oligomérica de beta amiloide (Aβ16-
23) con concentraciones en el rango de 0.001–1.00 μM, que induce la disfunción neuronal asociada
con la enfermedad de Alzheimer (Jargilo et al., 2013). La investigación realizada por (Jarocka et al.,
2015) reporta sobre un biosensor desarrollado a partir de un dipirrometeno-Cu electroactivo para
detectar anticuerpos contra el virus de la gripe aviar tipo H5N1 en sueros de gallinas.

Para esta investigación se trabajaron con dos procedimientos para desarrollar un método de
determinación de glifosato en agua. El primero consistió en determinar el glifosato a partir de la
inhibición de la enzima lacasa, partiendo de que el centro activo de la enzima contiene 4 átomos de
cobre, particularmente uno de los cobres se encuentra en la superficie de la enzima, susceptible de
interaccionar con el glifosato. El segundo procedimiento consistió en explorar la capacidad quelante
del glifosato para unirse con el compuesto el Bis 5-fenildipirrinato de níquel (II) [Ni(PhDP)2]
(Figura 7c). En más casos, la espectroscopia UV-visible es empleada para caracterizar a estos
compuestos por la facilidad de absorber luz ya sea por los productos de reacción de la enzima, o del
compuesto de níquel, por lo que la posible interacción con glifosato es potencialmente medible por
esta técnica.

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8.2 MATERIALES Y MÉTODOS

8.2.1 Método con lacasa

Reactivos de la compañía Sigma Aldrich, sustratos estándar de la enzima lacasa: acetato de tionina
(AT), 3,3´, 5, 5´tetrametilbencidina (TMB), 4, 6, dimetildibenzotiofeno (DMDBT) y 3,4-
dihidroxifenialanina (L-DOPA), glifosato como analito, así como sales y disolventes necesarios
para el medio de reacción. La enzima lacasa del hongo Coriolopsis gallica fue adquirida de la
compañía Altazymes Alberta Canada.

8.2.1.1 Actividad catalítica estándar de la lacasa

Para la determinación de las velocidades de reacción se utilizó el espectrofotómetro UV-Vis Varian


Cary 50 equipado con una lámpara de Xenon, donde se monitorearon los cambios en la
concentración de los sustratos oxidados (AT), o en la concentración del producto generado ( TMB,
L-DOPA), respecto al tiempo de reacción, conocida como velocidad de reacción enzimática. Para
ello se realizaron mezclas de cada uno de los sustratos a una concentración 10 µM (AT, TMB,
DMDBT y L-DOPA), con la lacasa (2.04x10 -04 mM) en un medio amortiguador a diferentes pH y
temperaturas, todo en 1mL de reacción. El progreso de la reacción se monitoreo por los cambios de
absorción de luz. Para el sustrato AT se monitorearon los cambios a 598 nm; TMB a 450 nm, L-
DOPA a 460 nm. El sustrato DMBT, también fue monitoreado por fluorescencia a λexc =240 nm y
λem = 340 nm con slits= 5, 5. El cambio de absorbancia o emisión de luz respecto al tiempo son las
velocidades de reacción que al ser divididas entre la concentración de la enzima y el coeficiente de
absortividad molar de los compuestos, se obtuvo la velocidad en moles del sustrato oxidado por mol
de enzima por minuto.

Para determinar las constantes cinéticas se calcularon las velocidades de reacción a diferentes
concentraciones del sustrato estándar dentro de un intervalo suficientemente amplio para ajustar los
datos al modelo de Michaelis Menten (Ecuación 1). Con ellos se determinaron los valores de Vmax y
Km

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑉= 𝐾𝑚 +[𝑆]
(1)

Donde V representa la velocidad de reacción, Vmax es la velocidad máxima, Km es igual a la


constante de Michaelis Menten y [S] es la concentración del sustrato. El cálculo de las constantes se

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realizó ajustando los datos experimentales al modelo de Michaelis-Menten por medio de un ajuste
no lineal usando el algoritmo de Marquardt - Levenberg no lineal de mínimos cuadrados incluido en
el Software Origin 8.0.

8.2.1.2 Determinación de la inhibición enzimática por el glifosato

En un primer acercamiento para determinar la inhibición de la lacasa por el glifosato se calculó la


velocidad de reacción a una concentración fija del sustrato (L-DOPA), como se explicó en el
apartado anterior, en presencia de diferentes concentraciones de glifosato (0.0011 a 0.0116 mM). A
partir de estos ensayos se calculó el grado de inhibición como un porcentaje de la actividad
catalítica en ausencia y en presencia de glifosato, mediante la siguiente fórmula (Ecuación 2):

𝑉0 −𝑉1
𝐺𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = ( 𝑉0
) ∗ 100 (2)

Dónde V0 representa las velocidades de reacción sin glifosato y V1 es igual a las velocidades de
reacción con glifosato

8.2.1.3 Optimización de las condiciones de inhibición

Se aplicó un diseño central compuesto (DCC), con tres variables a dos niveles para optimizar la
respuesta en la determinación de glifosato (medida como una inhibición de la enzima). Las
variables que se ensayaron fueron concentración de enzima, concentración de sustrato y pH. El
DCC se aplicó para optimizar la inhibición enzimática (variable respuesta, usando L-DOPA como
sustrato) mediante el método de superficie respuesta (Tabla 11).

Tabla 11. Variables y valores para la optimización (Elaboración propia)


Factor Unidades Nivel -1 Nivel +1
Lacasa µM 0.05 0.22
L-DOPA mM 1 4
pH 4.5 5.5

8.2.1.4 Diseño Central Compuesto (DCC)

A partir del diseño factorial 23 se construyó DCC, tomando puntos axiales y centrales, lo cual
resultó a 20 experimentos, como se muestra en la Tabla12. Se ensayaron los factores a tres niveles

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de composición (inferior, intermedio y superior) para sus análisis mediante la metodología de
superficie de respuesta por medio del programa Design Expert 7.0.0 trial. Las respuestas obtenidas
del DCC, se evaluaron por medio de un análisis de varianza (ANOVA) de tres vías, con un
intervalo de confianza del 95%.

Tabla 12. Matriz de experimentos resultantes a ensayar (Elaboración propia)


Std Corrida Factor 1 Factor 2 Factor 3 Respuesta: %de
A: Lacasa B: L- C: pH inhibición
µM DOPA enzimática
mM
11 1 0.13 5.00 5.25
15 2 0.13 10.00 5.25
6 3 0.20 5.00 6.00
7 4 0.05 15.00 6.00
8 5 0.20 15.00 6.00
4 6 0.20 15.00 4.50
9 7 0.05 10.00 5.25
3 8 0.05 15.00 4.50
20 9 0.13 10.00 5.25
14 10 0.13 10.00 6.00
2 11 0.20 5.00 4.50
19 12 0.13 10.00 5.25
10 13 0.20 10.00 5.25
5 14 0.05 5.00 6.00
1 15 0.05 5.00 4.50
16 16 0.13 10.00 5.25
18 17 0.13 10.00 5.25
13 18 0.13 10.00 4.50
17 19 0.13 10.00 5.25
12 20 0.13 15.00 5.25

8.2.2 Método con Bis 5-Fenildipirrinatode níquel (II)

Glifosato, gel de sílice, pirrol, ácido trifluoroacético (TFA), benzaldehído, trietilamina (Et3N), 2,3-
dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ) son de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.),
Cloruro de metileno (CH2Cl2), hexano, metanol (CH3OH) son de Fermont (Monterrey, México),
acetato de etilo de JT BAKER (Center Valley, EE. UU.), Todos los reactivos usados son de grado
reactivo. El instrumento analítico que se utilizó fue el espectrofotómetro UV-Vis (Varian Cary 50).

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8.2.2.1 Síntesis del compuesto Bis 5-Fenildipirrinato de níquel (II) [Ni(PhDP)2]

Empleando el procedimiento usado por (Brückner, Karunaratne, Rettig, & Dolphin, 1996) para
sintetizar el compuesto [Ni(PhDP)2]. En un primer paso fue necesario sintetizar el 5-
Fenildipirrometano (Figura 7a) a partir de benzaldehído (1 mmol), pirrol (25 mmol) y 5 gotas ácido
trifluoroacético (TFA). Posteriormente se adicionó 2,3-Diclhloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone (1
mmol) y se dejó en agitación durante 30 min a temperatura ambiente. Después se agregó a la
solución Et3N (0.5 mL), dejándose nuevamente en agitación (30 min) a temperatura ambiente.
Posterior a la eliminación del solvente, el producto fue disuelto en CH2Cl2 para ser filtrado con el
fin de remover los precipitados. Después de remover nuevamente el solvente, se llevó a cabo una
columna de cromatografía corta con gel de silice para purificar el producto, empleando acetato de
etilo como eluyente. La primera fracción color amarillo fue recolectada para llevarla a sequedad,
siendo este el 5-fenildipirrometeno (Figura 7b). Se tomó una relación 2:1 de 5-Fenildipirrometeno
(2mmol) respecto de sulfato de níquel hexahidratado (1 mmol) disueltos en una mezcla de CHCl3 y
CH3OH. La solución se agitó y calentó bajo reflujo durante 4 h. Finalmente la solución se concentró
en el rotavapor hasta obtener un sólido café oscuro. El remanente seco se disolvió en CH2Cl2 y
CH3OH (1:1), dejándolo en evaporación lenta hasta la obtención de cristales. El compuesto Bis-5-
Fenildipirrinato de Ni(II) (Figura 7c) presenta un espectro UV-Vis (λ nm): 330 y 480.

Figura 7. a) 5-Fenildipirrometano, b) 5-Fenildipirrometeno y c) Bis-5Fenildipirrinato de Ni(ll).


(Elaboración propia)

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8.2.2.2 Interacción entre el compuesto [Ni(PhDP)2] con glifosato

Debido a la adaptabilidad y flexibilidad estructural del [Ni(PhDP)2], se procedió a trabajar con él


para desarrollar un método de detección de glifosato, por formación del complejo [NiGlyp(PhDP)2].
La formación del complejo se monitoreo a partir de los cambios obtenidos en los espectros de
absorción del compuesto [Ni(PhDP)2] anterior y posterior a la adición del glifosato en 1 mL de
reacción (99% CH3OH y 1% agua). Se construyó una curva de calibración donde se registraron los
cambios de absorbancia debido a la formación de una nueva banda a 362 nm, adicionando
diferentes concentraciones de glifosato (5.9x10-7 a 1.1x10-5 mol/L).

8.2.2.3 Estequiometría del complejo

Fue aplicado el método de Job (Renny, Tomasevich, Tallmadge, & Collum, 2013a) para determinar
la estequiometría del complejo [NiGlyp(PhDP)2]. El cual consistió en preparar dos soluciones
madre, para ser mezcladas de tal manera que el total de la concentración se mantuviera constante
(5x10-5 y 1x10-4 mol/L para los dos diferentes ensayos). Se monitoreó la absorbancia a 362 nm
después de ser mezclada en 1 mL de reacción durante 10 s (99% CH3OH – 1% agua).

8.2.2.4 Determinación de la constante de disociación (Kd)

Se construyeron dos curvas para determinar la constante de disociación, las cuáles consistieron en
registrar los cambios de absorbancia a 362 nm del compuesto [Ni(PhDP)2] a dos diferentes
concentraciones (3.6x10-5 y 1.08x10-4 mol/L), donde se adicionaron diferentes concentraciones de
glifosato (5.9x10-7-2.3x10-4 mol/L), hasta alcanzar la saturación del compuesto [Ni(PhDP)2], por la
presencia de glifosato. La unión entre el glifosato y el compuesto [Ni(PhDP)2] se puede representar
como: Glifosato + [Ni(PhDP)2]→ [NiGlyp(PhDP)2].

Los cambios de absorbancia a 362 nm del complejo [Ni (PhDP)2] a una concentración diferente de
glifosato se transformaron en un porcentaje de cambio y se ajustaron al modelo de unión de un sitio
(Ecuación 3) para determinar Kd:

∆𝐴𝑚𝑎𝑥 ∗ 𝐺0
∆𝐴 =
𝐾𝑑 + 𝐺0

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Donde ΔA es el porcentaje de cambio de absorbancia a 362 nm al agregar concentraciones de
glifosato, ΔAmax es el porcentaje máximo de cambio (100%) cuando [Ni(PhDP)2] está saturado por
glifosato, y G0 es la concentración total de glifosato. Los valores reportados son la media de tres
repeticiones, donde dichos datos fueron ajustados a la ecuación de Hill mediante un procedimiento
de iteración siguiendo el algoritmo de mínimos cuadrados no lineales de Marquardt-Levenberg
utilizando el software Origin 8.0 (Originlab Corporation, Northampton, MA, EE. UU.).

8.2.2.5 Análisis en muestras de agua

Se analizaron cuatro diferentes matrices de agua (potable, urbana, subterránea y residual tratada)
con el fin de conocer el potencial del método desarrollado, a dichas muestras se le adicionó
intencionalmente concentraciones de glifosato (4.1x10-6 y 5.9x10-6 mol/L), llevándose a cabo los
análisis en 1 mL (99% CH3OH – 1% agua) de reacción, para determinar la precisión del método a
través del coeficiente de variación (C.V), el cual se expresa como la desviación estándar como
porcentaje de la media aritmética, mostrando una interpretación relativa del grado de variabilidad.
También se determinó el porcentaje de recuperación para conocer la exactitud del método que mide
el grado de concordancia entre el valor obtenido y el valor real de cada muestra. Para el caso
particular del agua residual tratada esta fue filtrada para remover los sólidos suspendidos. Las
cuatro muestras de agua en todo momento se mantuvieron almacenadas a 4 °C hasta su
caracterización fisicoquímica por métodos convencionales: pH, conductancia específica, demanda
química de oxigeno (DQO) y Demanda Biológica de Oxigeno (DBO5). Se determinaron distintos
aniones y cationes: Ca2+, Fe2+, SO42−, Mg2+, NO3−, NO3-N, PO43−, P2O5 y cloro libre.

8.2.2.6 Interferentes

Para identificar posibles factores de interferencia, fueron incorporados distintas sales a las
concentraciones máximas encontradas en las distintas muestras de agua: FeCl3·6 H2O (6.6x10-4
mol/L), CaCl2·2 H2O (9.8x10-4 mol/L), NaNO3 (1.2x10-2 mol/L) y MgCl2·6H2O (4.9x10-5 mol/L),
así como las sales de fosfatos Na2PO4·H2O, Na2HPO4·7H2O y (NH4)2HPO4 a una concentración de
4.1 x10-6 mol/L. Al igual se probaron, otros plaguicidas organofosforados con el mismo propósito:
paratión, dimetoato y diclophention a una concentración de 4.1x10-6 mol/L, para cada uno de ellos.
Evaluándose también el efecto que ocurre la mezcla de las sales; así como la mezcla de los
plaguicidas. Para estos análisis, el tiempo de ensayo fue de 10 s, estableciendo una concentración de
glifosato de 4.1x10-6 mol/L y 1.08x10-4 mol/L de [Ni(PhDP)2]. Todos los ensayos experimentales se

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realizaron por triplicado para evaluar la repetibilidad de los resultados. El análisis estadístico de los
datos se realizó utilizando Origin Software V 8.0.

8.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

8.3.1 Detección de glifosato con lacasa

Las reacciones enzimáticas de oxidación de los sustratos: AT, TMB y DMDBT no presentaron
ningún efecto debido a la presencia del glifosato, por esta razón los sustratos AT, TMB y DMDBT
fueron descartados y se continuó trabajando únicamente con el sustrato L-DOPA.

8.3.1.1 Velocidad de reacción

En un primer ensayo se adiciono el sustrato L-DOPA a una concentración de 10 mM, en un


volumen total de reacción de 1 mL, se agregaron 5 µL de lacasa de concentración 2.7 mg/mL y el
resto de amortiguadores acetatos a pH 4.5, 5 y 5.5 (60 mM), para completar el volumen de reacción,
a temperatura ambiente (25°C), con la finalidad de medir la absorbancia del producto de oxidación
del sustrato en el espectrofotómetro UV-Vis en un tiempo total de 2 minutos. El cambio de
absorbancia con respecto al tiempo durante los primeros 20 segundos representa la pendiente, que
se utiliza para calcular la velocidad inicial de reacción (Figura 8), la cual a su vez se divide por el
coeficiente de extinción de producto (3.9 mM-1 cm-1) y la concentración de la enzima. La figura 9
ilustra la cinética de reacción y el cálculo de la velocidad. Como puede observarse, la reacción
enzimática genera la aparición rápida del producto desde los primeros segundos, con un incremento
lineal, indicativo de que la concentración de sustrato es suficientemente alta para tener a la enzima
reaccionando a su máxima velocidad.

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Figura 8. Transformación del L-DOPA por la enzima lacasa. El incremento en la señal indica que
aparece el producto de oxidación que absorbe luz a medida que incrementa su concentración al
avanzar la reacción. La velocidad se calcula respecto a la pendiente inicial, que representa los
cambios de absorbancia con respecto al tiempo. (Elaboración propia)

8.3.1.2 Perfil catalítico de la lacasa contra cambios de pH

Un factor importante que gobierna en la inhibición es el pH, dado que la misma depende del estado
de ionización de la enzima, del sustrato y del glifosato, por ellos se determinó el perfil de actividad
contra diferentes valores de pH. El pH de mayor actividad de la lacasa con el sustrato L-DOPA fue
de 5.5 (Figura 9), también se encontró que la enzima lacasa tiene una alta actividad catalítica entre
pH 4.5 y 5.5.

0.30
Velocidad de reaccion ( Abs/min)

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

3 4 5 6 7 8
pH

Figura 9. Perfil de pH de la lacasa. (Elaboración propia)

Página | 45
8.3.1.3 Constantes cinéticas

Para conocer el comportamiento cinético de la lacasa se determinaron las contantes cinéticas Vmax y
Km, se determinaron las velocidades de reacción a diferentes cantidades de L-DOPA en un rango de
0.5 a 4.5 mM.

Los datos obtenidos se graficaron contra la concentración del sustrato, para el cálculo de la Vmax y
Km, se realizó un cálculo no lineal de la ecuación Michaelis-Menten usando el Sofware Origin 8.0
(Figura 10).

0.35

0.30
Velcidad de reaccion ( Abs/min)

0.25

0.20

0.15 Equation y=Vmax*x^n/(k^n+x^n)

Adj. R-Square 0.99269


Value Standard Error
Velocidad de re Vmax 0.44227 0.0638
0.10 accion
Velocidad de re k 1.72796 0.50693
accion
Velocidad de re n 1.14935 0.22217
accion

0.05
0 1 2 3 4 5
L-DOPA (mM)

Figura 10. Comportamiento cinético de la lacasa por la oxidación del L-DOPA. (Elaboración
propia)

Como puede observarse en la figura 10, la lacasa sigue un comportamiento tipo Michaelis Menten
al ajustar los datos de velocidad con en excelente coeficiente de determinación. Los valores de Vmax
y Km fueron 0.44 Abs/min y 1.71 mM, los cuáles se encuentran en el intervalo reportado para esta
etsa enzima con otros sustratos.

8.3.1.4 Efecto inhibitorio del glifosato en la enzima

Una vez determinadas las constantes cinéticas en la oxidación del sustrato L-DOPA por la enzima
lacasa, se realizó un primer ensayo de inhibición de la enzima por la presencia del glifosato. Para

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ello, fue necesario determinar las velocidades de oxidación del L-DOPA en presencia de diferentes
concentraciones del glifosato (Figura 11).

0.35

0.30

Velocidad de reaccion ( Abs/min)


0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

0.0000 0.0005 0.0010 0.0015 0.0020 0.0025


Glifosato (mol/L)

Figura 11. Perfil de inhibición de la lacasa en presencia de glifosato. (Elaboración propia).


Empleando una concentración de 10 µM del sustrato L-DOPA.

En la Figura 12 se muestra la parte lineal de la curva de inhibición, conocida como rango dinámico.
La parte lineal abarca desde 1x10-5 hasta 1.7x10-3 mol/L de glifosato. La Ecuación 4 describe la
relación entre las variables. Siendo V igual a la velocidad inicial (Abs/min -1) y [G] igual a la
concentración del Glifosato (mol/L).

𝑉 = −148.76[𝐺] + 0.3148 (4)

Página | 47
0.35

0.30

Velocidad de reaccion ( Abs/min)


0.25

0.20

0.15

0.10

0.05
2
R = 0.991
0.00
0.0000 0.0004 0.0008 0.0012 0.0016 0.0020
Glifosato (mol/L)

Figura 12. Curva de calibración del glifosato en solución modelo. (Elaboración propia)

A partir de esta curva de calibración se podría aplicar para detectar y cuantificar glifosato en
mezclas modelos con una certeza de 99%, dado su coeficiente de determinación. Donde a partir de
la Ecuación 4, fue posible determinar el límite de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ). El
LOD obtenido fue de 8.2x10-5 mol/L y el LOQ de 1.8x10-4 mol/L.

8.3.1.5 Optimización de la detección

La optimización de la inhibición de la enzima por el glifosato, medida como disminución del


porcentaje de actividad catalítica de la enzima se llevó a cabo por medio de un DCC (Diseño
Central Compuesto) y el método de superficie respuesta, para lo cual se ensayaron las variables
independientes: concentración de sustrato, concentración de enzima y pH a tres niveles (Tabla 13).
Los ensayos se realizaron usando una concentración de glifosato de 6x10-4 mol/L.

Tabla 13. Parámetros de las variables del diseño central compuesto (DCC). (Elaboración propia)
Factor Unidades Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3
Lacasa µM 0.05 0.14 0.22
L-DOPA mM 1 2.5 4
pH - 4.5 5 5.5

La Tabla 14 ilustra los 20 experimentos que componen el DCC, junto con sus porcentajes de
inhibición determinados experimentalmente. Como se puede observar, la máxima inhibición de la
Página | 48
enzima fue del 19.93% (corrida 10), con las condiciones: pH= 4.5, L-DOPA 1 mM y lacasa
0.05µM.

Tabla 14. Matriz experimental del DCC. (Elaboración propia)

L-DOPA
Corrida Lacasa (µM) (mM) pH Inhibición (%)
1 0.14 2.5 5 0.00
2 0.05 4 4.5 0.00
3 0.14 4 5 8.79
4 0.05 1 5.5 13.45
5 0.05 4 5.5 9.54
6 0.22 2.5 5 1.96
7 0.22 4 4.5 8.93
8 0.14 2.5 5 0.00
9 0.14 2.5 5 0.00
10 0.05 1 4.5 19.93
11 0.14 1 5 10.08
12 0.14 2.5 5 0.00
13 0.22 1 4.5 11.49
14 0.05 2.5 5 13.74
15 0.22 4 5.5 0.00
16 0.14 2.5 4.5 0.02
17 0.14 2.5 5 0.44
18 0.14 2.5 5.5 0.00
19 0.14 2.5 5 0.00
20 0.22 1 5.5 0.00

Utilizando las condiciones de la corrida 10 obtenidas del DCC, se midieron las velocidades de
oxidación del sustrato a diferentes cantidades de glifosato en un rango de 2.0x10-5-1x10-3 mol/L
(Figura 13).

Página | 49
0.07

0.06

Velocidad de reaccion ( Abs/min)


0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 0.0012 0.0014


Glifosato (mol/L)

Figura 13. Perfil de Inhibición a condiciones: pH: 4.5, L-DOPA: 1mM y lacasa: 0.05 mM.
(Elaboración propia)

A partir del rango lineal dinámico de la Figura 14, se obtuvo la Ecuación 5, la cual se podría aplicar
para detectar y cuantificar el glifosato con una certeza del 94%.

𝑉 = −39.292[𝐺] + 0.0644 (5)

0.07

0.06
Velocidad de reaccion ( Abs/min)

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01 2
R =0.940
0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 0.0012 0.0014
Glifosato (mol/L)

Figura 14. Curva de calibración a condiciones de pH= 4.5, L-DOPA: 1mM y lacasa: 0.05 mM.
(Elaboración propia)
Página | 50
Con base en la ecuación 4, se determinó el LOD=1.92x10-5 mol/L y un LOQ= 6.4x10-5 mol/L, que
en comparación con las primeras pruebas (Tabla 15), se logró mejorar la sensibilidad de la
detección, Sin embargo, estos límites aún se encuentran por arriba del límite máximo permisible en
agua para beber de la EPA de 0.7 ppm (4x10-6 mol/L) (United States Environmental Protection
Agency, 2019).

Tabla 15. Resumen de Límites de detección y cuantificación. (Elaboración propia)


pH L-DOPA Lacasa LOD LOQ R2
(mM) (µM) (mol/L) (mol/L)
4.5 1 0.05 1.92x10-5 6.4x10-5 0.94
4.5 1 0.22 2.38x10-5 1.3x10-4 0.91
5 1 0.22 2.69x10-5 9x10-5 0.90
-5 -4
5.5 3 0.20 8.19x10 2x10 0.99

Una característica que se busca al desarrollar este método es que los límites de detección y
cuantificación se encuentren cercanos o por debajo del límite máximo permisible (4x10-6 mol/L)
establecido por la EPA y por la NOM-014-COAGUA-2003, que establece los requisitos para la
recarga artificial de acuíferos con agua residual tratada. Sin embargo, con los resultados obtenidos
anteriormente aún no se cumple esta particularidad por lo que se continuó trabajando con el
compuesto 5-Fenildipirrinato de níquel (ll) [Ni(PhDP)2], con el propósito de mejorar las
condiciones de ensayo para alcanzar los límites mencionados.

El compuesto Bis 5-Fenildipirrinato de níquel (ll), se probó para desarrollar un nuevo método de
detección y cuantificación de glifosato, debido a la gran diversidad de aplicaciones que tienen este
tipo de compuestos y principalmente por la capacidad que tienen para la formación de complejos
estables que presentan espectros electrónicos de absorción en la zona ultravioleta visibles (Brückner
et al., 1996). La formación de complejo entre el compuesto [Ni(PhDP)2] y el glifosato ocurre por la
gran afinidad que tiene el glifosato hacia distintos metales como es el níquel (Mertens et al., 2018;
Rawat et al., 2016).

Página | 51
8.3.2 Detección con Bis 5-Fenildipirrinato de níquel (ll) [Ni(PhDP)2]

8.3.2.1 Síntesis y caracterización del compuesto [Ni(PhDP)2]

El compuesto [Ni(PhDP)2] fue sintetizado de acuerdo a procedimiento reportado por (Brückner et


al., 1996) y se caracterizó por UV-Vis (λ nm): 330, 480; así como por y por espectrometría de
masas 1H. Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) basada en la simetría
estructural por señales para los protones aromáticos. Se caracterizó al compuesto [Ni(PhDP)2] por
RMN 1H para tener (500 MHz, CDCL3) δ = 9,426 (s, 4, α-dipirrina),7.500 (d, J = 2.5 Hz, 6H, Ar-
H), 7483–7.331 (m, 8H, Ar-H, β-dipirrina), 6.741 (d, J = 3.5 Hz, 4H, β-dipirrina), que corresponde
con lo informado (Wang, Xue, Dong, & Zhu, 2015).

La formación del complejo entre [Ni(PhDP)2] y el glifosato [NiGlyp(PhDP)2] consistió en


monitorear los cambios de absorbancia del [Ni(PhDP)2] antes y después de la adición de glifosato,
en un volumen total 1 mL (CH3OH al 99% y agua al 1%). El espectro de absorción electrónico de
[Ni(PhDP)2] (1.08x10-4 mol/L) presenta una banda característica a 480 nm, indicativa de la
transferencia de carga del doble enlace (Fig. 15, línea negra), la cual aumentó notablemente en
presencia de glifosato (1.1x10-5 mol/L). Además, se observó una nueva banda de absorción a 362
nm. El cambio en la absorbancia a 480 nm, así como la formación de la nueva banda de absorción
se atribuye a la formación de un complejo entre ambas especies, con características medibles en la
región límite visible ultravioleta.

0.4

0.3
Absorbancia

0.2

0.1

[Ni(PhDP)2]
[NiGlyp(PhDP)2]
0.0
300 350 400 450 500 550 600 650
Longitud de onda (nm)

Figura 15. Espectro de absorción electrónica de [Ni(PhDP)2] (1.08x10-4 mol/L) en ausencia (negro)
y en presencia de glifosato (1.1x10-5 mol/L) (rojo). (Elaboración propia).
Página | 52
Como el propósito del presente estudio es la cuantificación del glifosato en muestras de agua, se
determinó la dependencia del cambio de absorbancia en la concentración del glifosato. Como se
puede ver en la Figura 16, la absorbancia a 362 nm dependía de la concentración del glifosato, con
un rango lineal de 5.9x10-7 a 1.1x10-5 mol/L de glifosato.

0.54

0.52

0.50

0.48
Absrobancia a 362 nm

0.46

0.44

0.42

0.40

0.38

0.36 2
R = 0.999
0.34
0 2 4 6 8 10 12
Glifosato (mol/L)

Figura 16. Curva de calibración para la detección de glifosato (5.9x10-7-1.1x10-5 mol/L) basada en
la interacción con el compuesto [Ni (PhDP)2] (1.08x10-4 mol/L). Condiciones de reacción: 99%
CH3OH -1% agua. (Elaboración propia)

La Ecuación 6 describe la relación entre las dos variables, donde Abs es la absorbancia a 362 nm y
[G] es la concentración de glifosato (mol/L). El modelo de regresión lineal tiene un buen ajuste
respecto a los datos, con un coeficiente de determinación superior al 0.99. Además, otros resultados
estadísticos (análisis de varianza y gráficos dinámicos) respaldan la calidad del modelo lineal.

Abs = 0.0128[G] + 0.3629 (6)

Usando la Ecuación 6, se calcularon el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación


(LOQ). El LOD y el LOQ son numéricamente iguales a 3 y 10 veces la absorbancia media más la
desviación estándar del compuesto [Ni (PhDP)2] en ausencia de glifosato. Sustituyendo estos
valores en la Ecuación 6, se determinó un LOD de 2.01x10-7 mol/L (34.98 µg/L) y un LOQ de
9.87x10-7 mol/L (166 µg/L). Estos valores son lo suficientemente buenos de acuerdo al límite
máximo de glifosato en agua potable para beber (700 µg/L) establecido por la EPA de EE. UU.

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(United States Environmental Protection Agency, 2018). Sin embargo aún es necesario mejorar la
sensibilidad de la detección para la aplicación del método en países europeos donde el nivel
máximo de glifosato no debe ser superior a 0.1 µg/L (Z. Li & Jennings, 2017). Los valores de LOD
y LOQ están dentro del rango de otros métodos alternativos para detectar el herbicida en una
muestra de agua, con las ventajas de que el tiempo de respuesta es más corto y no hay necesidad de
derivatización o adición de precursores de reacción (Tabla 16).

Tabla 16. Comparación de distintos métodos de determinación de glifosato con el desarrollado en


este proyecto (Elaboración propia)
Método LOD LOQ Observaciones Referencias
(mol/L) (mol/L)
Este método 2.01x10-7 9x10-7 Rápido, efectivo, fácil y -
sensible
-6 -6
Espectrofotometría 1x10 3x10 Rápido, efectivo y selectivo, (Silva et al., 2011)
necesita pretratamientos

Fluorescencia 6x10-7 - Rápido, efectivo y selectivo, (Yuan et al., 2017)


necesita equipo costoso

Electroquímica 2x10-6 - Rápido, efectivo y selectivo, (Noori et al.,


necesita equipo y reactivos 2018)
costosos
Colorimetría 6x10-7 - Efectivo y sensible, requiere (De Almeida et
de pasos complejos de al., 2015)
síntesis

8.3.2.2 Estequiometria

Para la estequiometria del complejo [NiGlyp(PhDP)2], la determinación de los cambios de


absorbancia se puede presentar en función de la fracción molar en función del glifosato o del
compuesto [Ni(PhDP)2] (Figura 17), el experimento se realizó a dos concentraciones totales. Una
vez medidos los cambios de absorbancia a 362 nm, respecto a la fracción mol del compuesto de
níquel, estos se graficaron mostrando una forma triangular que, de acuerdo a la literatura, esta
apariencia sugiere una interacción molecular fuerte entre los compuestos. Además de que el punto
máximo en las curvas tiene lugar a una fracción molar de 0.5, lo que indica que la asociación

Página | 54
molecular se produce con estequiometria 1: 1 (Hill & MacCarthy, 1986; Renny, Tomasevich,
Tallmadge, & Collum, 2013b).

Figura 17. Gráfico de Job indicando estequiometria 1: 1 para el complejo [NiGlyp(PhDP) 2]. A dos
concentraciones totales a) 5x10-5 mol/L y b) 1x10-4 mol/L. (Elaboración propia)

8.3.2.3 Constante de disociación (Kd)

La Kd se determinó ajustando los datos al modelo de enlace de un sitio utilizando un análisis de


regresión no lineal (Figura 18). Obteniendo valores de Kd de 1.75x10-6 y 6.9x10-6 mol/L a dos
concentraciones de [Ni(PhDP)2] (3.6x10-5 y 1.08x10-4 mol/L), lo cual explica que el [Ni(PhDP)2]
tiene una afinidad por el glifosato.

Figura 18. Modelo de ajuste de un sitio con concentraciones de [Ni (PhDP)2] a) 1.08x10-4 mol/L y
b) 3.6x10-5 mol/L, en presencia de glifosato (5.9x10-7-2.36 x10-4 mol/L). (Elaboración propia)
Página | 55
De acuerdo a los estudios de (Chenprakhon, Sucharitakul, Panijpan, & Chaiyen, 2010; Y. Pan et al.,
2016) un valor pequeño de Kd se refiere a una alta afinidad de unión del ligando por su objetivo,
que en este caso el ligando es el [Ni(PhDP)2] y por ende el objetivo sería el glifosato. Aunque los
valores de afinidad son tres órdenes de magnitud más bajos en comparación con el sistema
antígeno-anticuerpo, el ligando dipirrinato tiene la ventaja de que la respuesta analítica no necesita
pasos adicionales para la separación y cuantificación como en el método por inmunoensayo.

8.3.2.4 Selectividad del método

Con el fin de conocer la aplicabilidad del método, se determinaron componentes que regularmente
se encuentran presentes en el agua, para conocer si estos interfieren en la detección del glifosato. Es
bien sabido que el glifosato puede formar enlaces de coordinación fuertes con iones metálicos de
Fe2+, Ca2+ y Mg 2+ (Caetano et al., 2012; Ololade et al., 2014). Los resultados mostraron que la
presencia de cationes no interfirieron significativamente en la formación del complejo
[NiGlyp(PhDP)2]. El mismo conjunto de experimentos se llevó a cabo con otros plaguicidas
organofosforados, que se utilizan continuamente en la agricultura, como el paratión (Yola, 2019), el
dimetoato (Mondal et al., 2018) y el diclofentión (Ccanccapa, Masiá, Navarro-Ortega, Picó, &
Barceló, 2016), así como sus mezclas. Los valores de absorbancia del complejo [NiGlyp(PhDP)2]
en presencia de los plaguicidas organofosforados y sus mezclas no mostraron una interferencia
superior al 10%, por lo que se pueden descartar como interferentes. Se probó una mezcla entre
[NiGlyp(PhDP)2] y AMPA, debido a que el metabolito AMPA se encuentra frecuentemente en agua
junto con glifosato (Demonte et al., 2018; Fernandes et al., 2019a). El metabolito no mostró ningún
cambio adicional en la detección del glifosato. Finalmente, se probaron diferentes sales de fosfato,
ya que se sabe que el ion fosfato puede formar complejos con otros metales como el níquel
(Menelaou et al., 2009; Peleka, Mavros, Zamboulis, & Matis, 2006; Subramaniam & Hoggard,
1988), los cuales tampoco mostraron interferencia. Por lo tanto, todos los ensayos sugieren una
buena selectividad del método ante la presencia de otros componentes (Tabla 17).

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Tabla 17. Efectos de sales, plaguicidas organofosforados y fosfatos en la selectividad del método.
(Elaboración propia)

Absorbancia a 362
Compuestos D. S. Interferencia (%)1
nm

Control

[NiGlyp(PhDP)2] 0.42 0.012 0.0


Sales
FeCl3 ·6 H2O 0.43 0.008 2.57
CaCl2 · 2 H2O 0.41 0.008 0.19
NaNO3 0.42 0.007 0.78
MgCl2 · 6 H2O 0.44 0.008 3.66
Mezcla de sales 0.45 0.010 5.49
Plaguicidas Organofosforados
Paration 0.42 0.012 1.47
Dimetoato 0.45 0.011 4.28
Diclofenthión 0.43 0.002 0.22
Mezcla de
plaguicidas 0.46 0.002 7.51
Fosfatos
Na2PO4 ·H2O 0.41 0.003 2.57
Na2HPO4 ·7 H2O 0.41 0.003 2.75
(NH4)2 HPO4 0.42 0.008 0.81
Mezcla de
fosfatos 0.43 0.005 0.67
Metabolito del glifosato
AMPA 0.42 0.12 0.0

1
Se calculó el porcentaje de interferencia, tomando como 0% de interferencia la absorbancia de
0.42 obtenida del complejo formado entre [Ni(PhDP)2] (1.08x10-4 mol/L) y glifosato (4.1x10-6
mol/L), menos la absorbancia del complejo en presencia de los posibles interferentes entre la
absorbancia del complejo multiplicado por cien.

8.3.2.5 Análisis de muestras de aguas fortificadas con glifosato

Se analizaron cuatro muestras de agua de diferentes matrices (potable, residual tratada, urbana y
subterránea) para cotejar la aplicabilidad del método propuesto. A cada una de las muestras de agua
intencionalmente se les adicionaron concentraciones de glifosato (4.1X10-6 y 5.9X10-6 mol/L).
Página | 57
Antes de la adición del glifosato la muestra de agua residual tratada, fue filtrada para eliminar los
sólidos en suspensión.

Las muestras de agua urbana, residual tratada y agua subterránea fueron recolectadas dentro de la
localidad de San Simón Atzitzintla, Puebla (de acuerdo a la NOM-230-SSA1-2002). Cabe señalar
que las cuatro muestras de agua desde su recolección hasta su uso permanecieron almacenadas a 4 °
C, y se caracterizaron fisicoquímicamente mediante métodos convencionales de pH, conductividad,
temperatura, demanda química de oxígeno (DQO) y demanda bioquímica de oxígeno (DBO);
también se realizaron análisis de aniones y cationes: Ca2+, Fe2+, SO42-, Mg2+, NO3-, NO3-N, PO43-,
P2O5 y cloro libre.

La Tabla 18 muestra los resultados de los parámetros fisicoquímicos de las cuatro matrices de agua
analizadas. Las 4 muestras de agua previamente a las pruebas, fueron analizadas por el método
ELISA disponible comercialmente (PN 500086) por Abraxis LLC (Warminster, PA, EE. UU.), para
verificar que las muestras no tuvieran concentraciones de glifosato.

Las mayoría de las muestras analizadas se encuentran dentro de los parametros permisibles, con
excepcion del agua residual tratada que de acuerdo a la NOM-067-ECOL-1994, la DQO se
encuentra fuera de los límites máximos permisibles (250 mg/L), también se presentaron altos
valores de nitratos (NO3-) en todas las matrices de agua, con respecto a la NOM-127-SSA1-1994
(10 mg/L), los cuales podrían estar asociados con las actividades agrícolas (Brena et al., 2005).

Página | 58
Tabla 18. Análisis fisicoquímico de las diferentes matrices de agua. (Elaboración propia)
Matrices de agua
Parámetros Residual
Potable Urbana Subterránea
Tratada
pH 7 7 7 7
Conductividad
0.055 424 523 1448
(µs/cm)
Temperatura
25 25.3 25.3 24.7
(°C)

DQO (mg/L) 2 152.7 97.2 651.38

DBO (mg/L) 0.73 76.48 42 320.62

Ca2+ (mg/L) 20 75 115 145

Fe2+ (µg/L) 51 68 67.5 178.5

SO4 2- (mg/L) 0 27.5 40 90

Mg2+ (mg/L) 0 10 30 10

NO3-N (mg/L) 1.1 1.65 18.35 24

NO3- (mg/L) 5 82.75 99.45 104

PO43- (mg/L) 0.1 4.8 0.94 40.2

P2O5 (mg/L) 0.08 4.53 0.67 31

Cloro libre
0.065 0.35 0.065 0.1
(mg/L)

Página | 59
Posteriormente las diferentes muestras de agua fueron fortificadas intencionalmente con glifosato
(4.1x10-6 y 5.9x10-6 mol/L) para monitorear los cambios de absorbancia en presencia del compuesto
[Ni(PhDP)2] (1.08x10-4 mol/L), con el objetivo de verificar si las absorbancias correspondían a las
concentraciones adicionadas de acuerdo a la ecuación 6.

Tabla 19. Detección de glifosato en diferentes matrices de agua fortificadas intencionalmente


(Elaboración propia)
Glifosato
adicionado Glifosato C.V. Recuperación
Matriz de
determinado
agua
(x10-6 (x10-6 mol/L) (%) (%)
mol/L)
4.1 3.72 2.89 89.58
Potable
5.9 5.14 0.34 87.20

4.1 3.66 2.09 88.64


Urbana
5.9 5.32 0.61 89.97

4.1 4.02 2.38 96.49


Subterránea
5.9 6.32 0.82 106.99

Residual 4.1 4.90 1.31 118.67


tratada 5.9 7.03 0.99 119.04

Los porcentajes de recuperación de acuerdo a los resultados obtenidos en las muestras de agua
varían entre 87.20-119.04% (Tabla 19), indicando que el método tiene una buena exactitud.
Además, se obtuvo una alta precisión como se refleja en los coeficientes de variación (C.V.), debido
a que no hubo variaciones superiores al 10% (Westgard, Barry, Quam, & Ehrmeyer, 2010). En
general, la presencia de distintas sales y metales a diferentes concentraciones no afectó la detección,
por lo que el método se puede aplicar para diferentes fuentes de agua.

Los resultados anteriores se publicaron en la revista “Water”, de la editorial MDPI, con


doi:10.3390/w11040719. En colaboración de la Dra Mayra Avelar de la Universidad Nacional
Autónoma de México (Anexo 1), se logró modelar la estructura molecular del complejo
[NiGlyp(PhDP)2], donde los resultados teóricos muestran que el níquel de [Ni(PhDP)2] forma
enlaces de coordinación con los átomos de nitrógeno y oxígeno del glifosato en una geometría
molecular octaédrica distorsionada (Anexo 2).

Página | 60
Por otro lado, el compuesto [Ni(PhDP)2], también tiene la capacidad de formar complejo con el
plaguicida dimetoato, dicha capacidad dio lugar a desarrollar un nuevo método de detección de
dicho plaguicida, los resultados fueron enviado para ser publicados en la revista “Journal of
envionmental science and health part b” (Anexo 3).

8.4 CIFRAS DE MÉRITO DEL MÉTODO DESARROLLADO

Empleando la enzima lacasa y el sustrato L-DOPA se logró determinar glifosato (LOD= 1.92x10-5 y
LOQ= 6.4x10-5 mol/L) en muestras de agua modelo, sin embargo, los límites de detección y
cuantificación exceden los límites máximos permisibles de la NOM-014-CONAGUA-2007A
(4.14x10-6 mol/L). Por otro lado, empleando el [Ni(PhDP)2] ha sido posible determinar glifosato por
formación de complejo con estequiometria 1: 1, logrando un LOD de 2.07x10-7 mol/L y un LOQ de
9.8x10-7 mol/L. El método desarrollado garantiza repetibilidad de los datos, alta sensibilidad y
detección rápida (10 s).

El método desarrollado a partir del compuesto [Ni(PhDP)2] fue aplicado para determinar
concentraciones conocidas de glifosato (4.1x10-6 y 5.9x10-6 mol/L) en diferentes matrices de agua
(potable, urbana, subterránea y residuales tratada). Los porcentajes de recuperación y los
coeficientes de variación obtenidos muestran una buena precisión y exactitud del método para poder
ser aplicado en muestras ambientales. La presencia de las sales; otros plaguicidas organofosforados,
y fosfatos, así como sus mezclas en el agua, no interfieren con la detección de glifosato.

Página | 61
Parte
experimental
de campo

Página | 62
9. VIDA SOCIAL DE LOS CAMPESINOS DE SAN SIMÓN
ATZITZINTLA Y SU RELACIÓN CON EL GLIFOSATO EN EL
AGUA

9.1 Cultura Campesina

En México, la agricultura siempre ha sido parte fundamental de las actividades económicas del país,
por ello a lo largo de la historia esta ha sido constantemente manipulada, intervenida y con el
tiempo modernizada (Gómez-Oliver, 1959). Una de las primeras transformaciones que sufrió la
sociedad campesina, ocurrió con la llegada de los españoles y la introducción de técnicas como el
monocultivo y las herramientas de metal, lo que permitió una agricultura extensiva con fines
mercantiles. Previo a este suceso los campesinos practicaban el policultivo, manteniendo un
equilibrio socio-espacial entre el campo y la ciudad, el cual fue alterado por completo con la
introducción de las prácticas agrícolas europeas.(Troyo-Diéguez et al., 2010).

Pichardo González (2006) argumenta que la Revolución Verde desarrollada durante la época de los
años 50´s ha sido el suceso con mayor impacto dentro de la historia agrícola en México, ya que a
partir de apoyos políticos, sociales y económicos se consiguió la implementación de paquetes
tecnológicos, provenientes de Estados Unidos de América, con la promesa de resolver el desabasto
de alimentos que se vivía en ese tiempo. El campo era considerado anticuado respecto al desarrollo
de la ciudad por el hecho de emplear fuerza animal y humana durante el proceso de producción y no
una fuerza mecanizada. Los paquetes tecnológicos introducidos durante la revolución verde,
mantienen su vigencia al día de hoy, con herramientas tan diversas como presas, sistemas de riego,
semillas mejoradas, plaguicidas y fertilizantes de origen químico; así como maquinaria y
herramienta que requieren de combustible para su funcionamiento (Pichardo González, 2006).

Distintos autores como (Ceccon, 2008; Qaim, 2016) reportan que la implementación de los
paquetes tecnológicos de la revolución verde, han generado más perjuicios que beneficios, en
distintos sectores. Por un lado, la sociedad campesina está siendo diferenciada y marginada
espacialmente debido a la diversificación social, donde la palabra campesino ha pasado a ser
sinónimo de pobreza, tal como ocurre en la zona de estudio (San. Simón Atzitzintla), donde ellos
mismos dicen “a nosotros nadie nos apoya” refiriéndose a la falta de apoyos de las mismas
autoridades, la incertidumbre de las ganancias sobre sus productos, así como la desprotección que
sufren en caso de pérdida de las cosechas y la constante alza de precios de los fertilizantes,
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plaguicidas y cualquier tipo de herramienta que empleen, viéndose marcada la visión de que la
ciudad y el campo son completamente opuestos en sus actividades.

De acuerdo con (Bartra, 2019), la modernización del campo no ha cumplido con la promesa de una
seguridad alimenticia, sino el de garantizar poder político; así como el enriquecimiento de los
productores de agroquímicos, a costa del deterioro devastador de los recursos naturales y de las
propias tierras de cultivo.

Ante el deterioro del estado de los recursos ambientales, diversos organismo internacionales como
el Informe del Club Roma (1972), la Conferencia de las Naciones Unidas sobre Medio Ambiente
(1972), el Informe Brundtland de la Comisión Mundial de Medio Ambiente y Desarrollo (1987) y la
Conferencia de las Naciones Unidas sobre Medio Ambiente y Desarrollo (Río de Janeiro, 1992)
(González, 2005), además de grupos ambientalistas y personalidades, han conformado un
movimiento de presión con la finalidad de poder adquirir productos agrícolas libres de
agroquímicos, además de exigir alternativas de producción menos agresivas para el medio ambiente
así como para la salud (Artaraz, 2002; Guimaraes & Bárcena, 2002; UNEP, 2017).

Recientemente debido a la magnitud de los problemas ambientales y de salud que han provocado el
uso descontrolado de plaguicidas y fertilizantes sintéticos, se ha retomado la práctica milenaria del
manejo sustentable de plagas, el cual se conforma de distintas estrategias para controlar las plagas
agrícolas, pero de una forma armónica con el ambiente y los seres vivos. Hoy en día se le ha
denominado con el concepto de Manejo Integrado de Plagas (MIP), el cual consiste en la aplicación
de distintas tecnologías agrícolas amigables con el medio ambiente que influyen sobre la
conservación y disponibilidad espacio-temporal de los recursos naturales desde un enfoque
ambiental, socioeconómico, cultural, religioso, político; así como las decisiones y consecuencias de
su aplicación. Sin embargo, la adopción del MIP se ha convertido en un gran desafío principalmente
por el bajo grado de estudios de los campesinos, la falta de políticas de fomento integral
agropecuario que implique el desarrollo rural junto con los campesino, falta de difusión de estas
tecnologías amigables con el medio ambiente y la falta de conocimiento y sensibilización de todos
los actores relacionados con estas tecnologías sintéticas con los problemas de su entorno social
(Garcerán-Sáez & García-Sánchez, 2019; Holland et al., 2017; Molina, 2013; Zepeda Jazo, 2018).

9.2 MATERIALES Y METODOS

9.2.1 Zona de estudio


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La presente investigación se realizó en la localidad de San Simón Atzizintla (Figura 19), que
pertenece al municipio de San Salvador el Verde, en el estado de Puebla, ubicado en las
coordenadas 098 ° 28'21" longitud oeste, 19 ° 15'58" latitud norte y una altitud de 2320 metros
sobre el nivel del mar (INEGI, 2010). El municipio de San Salvador el Verde está catalogado como
urbanización metropolitana, sin embargo, San Simón Atzitzintla conserva las características de una
zona rural: "la vida del campo". Tiene una población de 3,404 habitantes, ubicada aproximadamente
a 5 km de la cabecera municipal. El clima es subhúmedo, con una temperatura media anual de entre
12 y 18 ° C, aunque la temperatura puede descender hasta los -3 ° C en invierno. Tiene un suelo
Haeolic Phaeozem, que se caracteriza por ser rico en materia orgánica y nutrientes (CONABIO,
2012), lo que permite que la agricultura de riego se practique ampliamente durante todo el año.
Presenta lluvias en verano y un bajo porcentaje de precipitación en invierno. Durante el verano los
campos son regados con agua proveniente de pozos profundos. La principal actividad económica en
la localidad es la agricultura, y los principales cultivos son granos, flores y vegetales (INEGI,
2010).

La agricultura que se practica se caracteriza por ser dependiente de plaguicidas y fertilizantes


sintéticos. De acuerdo a otros estudios se ha reportado que los mismos campesinos están
conscientes de que los fertilizantes y plaguicidas son los causantes de que año con año se vuelva
más evidente la degradación de sus tierras de cultivo, pero argumentan que si no emplearan estos
paquetes tecnológicos sería imposible producir y pondrían en riesgo su fuente de ingresos (Misnaza,
2010).

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Figura 19. Ubicación del Municipio de San Salvador el Verde, sus localidades, Planta de
tratamiento de Aguas Residuales y fuentes de agua (Elaboración propia con asistencia de Sánchez-
Porras, con datos de INEGI, 2010)

Dentro de la localidad de San Simón Atzitzitla se encuentra instalada una planta de tratamiento de
aguas residuales (PTAR), que recibe descargas de cuatro localidades diferentes (San Simón
Atzitzintla, Tlacotepec de José Manzo, Analco y San Gregorio) provenientes de diferentes
actividades (domésticas, agrícolas e industriales). La PTAR tiene una capacidad instalada de 24 L/s,
conformada por un pretratamiento que consta de dos canales de arena, una estación de bombeo, un
reactor anaeróbico que consta de seis tanques de ocho metros de profundidad, un reactor biológico
de lodo activado con cuatro aireadores, operando a 3.5 L de aire/s, un espesador de lodos con una
capacidad máxima de 400 Kg y un sistema de cloración, administrando cuatro mililitros de
hipoclorito al 11% por cada diez litros de agua (Figura 20). El lodo resultante es tratado para
producir fertilizante, el cual es obsequiado cada seis meses a los campesinos de la zona.

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Figura 20. Diagrama de flujo de la PTAR de instalada en San Simón Atzitzintla

El agua tratada es descargada directamente en el río Santa Elena, que pertenece a la cuenca del río
Atoyac, que a su vez forma parte de la región hidrológica de Balsas 18-A (DOF, 1998) (Figura 21).
Las descargas están reguladas de acuerdo a la NOM-003-SEMARNAT-1997, que establece límites
permisibles para contaminantes básicos (coliformes, sólidos suspendidos totales, huevos de
helmintos, DBO5, grasas y aceites). El encargado de la PTAR menciona que las descargas son
analizadas por CONAGUA cada tres meses para asegurarse de que cumplan con los límites
establecidos. Sin embargo, esta normativa no regula otros contaminantes, como los plaguicidas.

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Figura 21. Ubicación del río Santa Elena y río Atoyac (Elaboración propia con asistencia de
Sánchez-Porras, con datos de INEGI, 2010 y CONAGUA)

Durante las visitas de campo se observó que el río Santa Elena representa una fuente de agua
importante para la región, ya que por un lado es empleado por las distintas actividades socio-
económicas, como un cuerpo receptor de desechos, así como una fuente de agua gratuita
principalmente para muchos campesinos ya que es empleada para regar los cultivos aledaños al río.

El criterio de selección de la localidad de San Simón Atzitzintla fue debido a que su principal
actividad económica es la agricultura con dependencia a plaguicidas como el glifosato de acuerdo a
datos obtenidos por INEGI (2010) y encuestas realizadas a vendedores de agroquímicos dentro de la
región, esto siempre dependiendo de la accesibilidad a la localidad y la disponibilidad de
participación de los campesinos.

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9.2.2 Detección de glifosato en agua de diferentes matrices de San Simón Atzizintla
por el método ELISA

Para tener un primer indicio sobre la calidad del agua de la localidad de San Simón Atzitzintla en
cuanto a presencia de glifosato, se analizaron 6 diferentes muestras de agua (potable, urbana,
subterránea, canal de riego, residual y residual tratada) empleando el kit comercial de Abraxis LLC
(Warminster, PA, USA).

9.2.3 Técnicas de recolección de datos

Para explicar las interrelaciones de la presencia de glifosato en diferentes matrices de agua de la


localidad de San Simón Atzitzintla, se realizó trabajo de campo seguido de una observación no
participativa y se desarrolló una estrategia de corte cualitativa. Lo anterior implicó la realización del
trabajo etnográfico y el desarrollo de 10 entrevistas en profundidad a jefes de familia de campesinos
que viven en un área de aproximadamente 300 ha, en las cercanías de la PTAR de San Simón
Atzizintla. Los campesinos entrevistados fueron hombres entre 38 y 65 años, dueños de sus tierras
de cultivo. Las entrevistas fueron transcritas y analizadas, con la finalidad de conocer usos y
prácticas de los campesinos de San Simón Atzitzintla en relación con el uso de glifosato en su vida
cotidiana; así como identificar los diferentes aspectos de la vida cotidiana de los campesinos
locales.

Las entrevistas fueron e profundidad (no estructuradas), en las que se incluyó contenido sobre
patrones de uso de la tierra, adopción de tecnología agrícola, aplicación de plaguicidas, razones para
aplicar plaguicidas adicionales y actitudes hacia el medio ambiente, así como los efectos que
provoca el uso de plaguicidas en su salud. También fueron entrevistados 7 vendedores de
plaguicidas de San Simón Atzitzintla para obtener información sobre su percepción de la
dependencia de plaguicidas y para observar la interacción entre el agricultor y el vendedor cuando
los agricultores compran los plaguicidas. Durante las entrevistas se permaneció durante la
aplicación de plaguicidas y otras actividades agrícolas. El análisis socioeconómico se realizó a
través de una caracterización del área de estudio utilizando datos del Instituto Nacional de
Estadística Geografía e Informática (INEGI), y de la Comisión Nacional para el Conocimiento y
Uso de la Biodiversidad (CONABIO). La información se descargó de los sitios web y se analizó
con el software ArcGIS 10.3. El Anexo 4 incluye la guía que se empleó para realizar las entrevistas.

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9.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

9.3.1 Campesinado y transmisión de saberes de generación en generación en los


grupos familiares de San Simón Atzitzintla

Una práctica típica que se logró identificar al realizar las entrevistas respecto el aprendizaje del
oficio campesino, es que este es enseñado a los hijos a través de la experiencia directa de los padres,
para que también se dediquen a la agricultura con el argumento de que puede ser una oportunidad
de trabajo y fuente de ingresos. Manifestando que siempre han sido gente de campo durante
generaciones y que disfrutan de su oficio. Este proceso de transmisión de conocimientos incluye
factores como la preparación de la tierra, identificación de plagas y la preparación de plaguicidas.
La agricultura de la zona depende de fertilizantes y plaguicidas de origen químico, siendo estos
insumos parte de la instrucción de los padres a los hijos y, muchas veces, la única capacitación que
reciben al respecto de la aplicación de plaguicidas. Tal como lo expuso el señor Alberto, cuando se
le pregunto sobre si había recibido capacitaciones para aplicar plaguicidas, el contesto: (2018,
entrevista en profundidad, campesino de 58 años), “no como tal, pero si me enseño mi papá a como
se usa la herramienta y se aplican los venenos, no es tan difícil hacerlo” o como dice Don Augusto
(2018, entrevista en profundidad, campesino de 56 años) “¿Ya para qué?, si mi padre me enseño
todo lo que tenía que saber”.

Por otro lado, con el paso de los años las fórmulas y concentraciones van cambiando, por lo tanto,
los plaguicidas que aplican actualmente, no son los mismos que solían aplicar con sus padres. La
resistencia de hierbas no deseadas, entre otras plagas, ha llevado a los campesinos a utilizar
concentraciones más elevadas a las indicadas en las etiquetas de los envases de plaguicidas. Otra
práctica común de los campesinos ante la resistencia de plagas es recurrir a las tiendas de
agroquímicos para pedir información sobre qué hacer ante la resistencia de plagas o para que se les
recomiende un producto nuevo y efectivo, como dice Don Cosme (2018, entrevista en profundidad,
campesino de 74 años): “pues hay que seguirle luchando contra las malezas ya sea aumentando o
cambiando a otro y le pregunto a los ingenieros para que me digan que hacer, el chiste es no
perder la cosecha”, o como dice el señor Cristóbal (2018, entrevista en profundidad) “nosotros le
seguimos echando el matapasto y ya si nomás no se puede pues ya ahí en las tiendas nos van
diciendo que hacer, ahí nos venden todo lo que vayamos a necesitar”. Así como Don Cosme que
aplica dosis mayores a las establecidas en las etiquetas o recomendadas por los vendedores de las
tiendas de agroquímicos para combatir la resistencia de hierbas no deseadas, esta es una práctica

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cotidiana de los campesinos entrevistados, ya que de manera habitual ocurren estas conductas que
se van transmitiendo de padres a hijos. Favoreciendo con estas prácticas la persistencia de glifosato
en el agua.

La principal razón por la que se recurre a las casas de agroquímicos, es para mantenerse informados
sobre cuáles son las nuevas y más efectivas herramientas, tratamientos, así como plaguicidas que
los ayuden a facilitar su labor. Para los campesinos es muy importante siempre estar a la
vanguardia, para poder cosechar a tiempo y así continuar en el mercado, tal como lo expresa el
señor Cristóbal (2018, entrevista en profundidad) "si, nosotros vamos a las tiendas con los
ingenieros para que nos vayan diciendo que es lo que debemos utilizar, porque si queremos seguir
produciendo es necesario cambiar, si no, nos quedamos atrás en la competencia” o como dice el
señor Heradio (2018, entrevista en profundidad, campesino de 54 años) “pues por eso vamos con
los expertos en las tiendas, ellos nos dicen todo desde qué plaga nos está atacando, qué producto
debemos utilizar y pues cómo se debe de aplicar, todo se va cambiando, no se puede uno quedar
porque si uno se queda, pues ya no produce”. Siendo evidente la despreocupación que existe de los
campesinos sobre los efectos adversos que puede producir el glifosato en el ambiente, así como en
su salud y en la de su familia

Los campesinos entrevistados tienen un promedio de escolaridad de 6.8 años, lo que equivaldría
entre el primero y segundo de secundaria, solo uno de los campesinos entrevistados tiene carrera
profesional. Por ejemplo está Don Cosme que sólo estudió hasta el segundo de primaria, expresando
(2018, entrevista en profundidad) “mi padre no me pudo mandar más tiempo a la escuela, es que
éramos muchos hijos y pues no se podía, no había dinero para todos y pues ya mejor desde chico
me quede trabajando en el campo, además de que me gusta” o como el caso del señor Cristóbal que
estudio hasta el bachiller (2018, Entrevista a Profundidad, campesino de 44 años) “cuando termine
el bachiller pues ya tenía suficiente edad para trabajar y ayudarle a mi padre, es que antes así se
acostumbraba, estudiabas el bachiller y pues ya no era necesario seguir estudiando pues porque ya
te ibas a dedicar al campo”. Es necesario aclarar que independientemente de la escolaridad que
tengan, los campesinos recurren a las tiendas de agroquímicos para ser orientados en la aplicación o
en las dosis que deben de ser aplicadas principalmente cuando se trata de nuevos productos a
utilizar, tal es el caso de Hugo que estudió la carrera de agronomía (2018, Entrevista en
profundidad, campesino de 38 años) “…sé cómo se aplican los plaguicidas porque me enseño mi
papá en un principio y ya más adelante en la universidad me volvieron a enseñar aunque yo ya
sabía, pero a veces cuando voy a utilizar un producto nuevo, en las tiendas donde los compro me
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dicen más o menos cuanto ponerle, cada cuanto tiempo y algunos detalles, es que ahí ellos ya le
saben porque pues los han probado sus clientes y luego ellos pues les dicen cómo sale mejor el
producto, aquí muchas veces es de maña…” Es evidente que el conocimiento empírico, así como
por sus propias experiencias sobre cómo se aplican los plaguicidas como el glifosato, prevalece en
esta localidad sin importar el grado de estudio que tengan.

Hoy en día el acceso a internet es una herramienta básica, sobre todo de fácil acceso en localidades
como San Simón Atzitzintla, ya que el 90 % de los entrevistados dicen tener teléfonos móviles con
acceso a internet, el cual podría ser utilizado para buscar información sobre alternativas de
herramienta, plaguicidas naturales o nuevas técnicas, sin embargo, ellos prefieren acudir a las casas
de agroquímicos para adquirir conocimientos relacionados con el uso y manejo de plaguicidas. Solo
uno de los campesinos entrevistados ha sido capacitado formalmente en el manejo de plaguicidas y
el resto de los campesinos entrevistados realizan las aplicaciones de manera empírica. Esta conducta
puede explicarse a partir de que todo lo relacionado con el campo y el trabajo asociado a ello, es
transmitido de padres a hijos y a pesar de la vocación agropecuaria del municipio, no existe en su
territorio Centros de Bachillerato Tecnológico Agropecuario, que son los institutos que el gobierno
federal ha dispuesto para capacitar en el área, ni a nivel de educación básica (desde formación
prescolar hasta la secundaria), ni media básica (bachillerato), ni mucho menos profesional; pues en
ese rubro la universidad más cercana es la Universidad Tecnológica de San Martín Texmelucan, lo
anterior pone de manifiesto la gran distancia que existe entre la política educativa y las necesidades
de capacitación para el trabajo en las diferentes localidades del municipio. A este rubro puede
sumarse, que las trayectorias educativas de sus habitantes, es breve y al menos en los entrevistados
se reduce al nivel básico de forma incompleta; con lo que además se reproduce la falsa idea y
estigma de que los más ignorantes e incapaces son los que deben dedicarse al campo.

Por otro lado, la cultura de leer los envases de los plaguicidas aplicados es prácticamente nula, ya
que los mismos campesinos dicen tener la experiencia suficiente para aplicar los diferentes
productos químicos sin leer las indicaciones, además de que los vendedores de agroquímicos les
informan sobre las dosis que deben de ocupar. Como argumenta el señor Augusto (2018, entrevista
en profundidad) “no ya nosotros con la experiencia vamos viendo si se necesita más o menos
químico, primero pues le ponemos lo que nos recomiendan los ingenieros, pero ya de ahí pues va
por nuestra cuenta, es que luego aquí es conforme nos van pasando las cosas uno va preparando
las cantidades porque no aplicamos uno a la vez se le ponen dos o tres o más productos”

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O lo que dice el productor Cristóbal, que solo lee las etiquetas en caso de que un producto sea
nuevo (2018, entrevista en profundidad) “normalmente cuando es un producto nuevo, sí, sí las
leemos, ya cuando lo conocemos pues ya no lo leemos, leemos la etiquetas porque no lo conocemos
o porque queremos saber qué tipo de propiedades trae, en este caso pueden ser proteínas,
nitrógeno, fósforo, magnesio, potasio, entonces queremos saber cuánta cantidad y qué es lo que
necesitamos en este caso, no sé a lo mejor quiero este producto pero lo quiero con proteínas pero
también quiero que tenga de nitrógeno y pues por eso tenemos que recurrir a las tiendas para que
ellos nos vendan justamente lo que necesitamos, al fin ellos son los que saben”. Es evidente que los
campesinos tienen mucha confianza en los vendedores, quizá aún mayor que en las mismas
etiquetas de los plaguicidas, ignorando su lectura casi por completo.

De todo lo anterior, es indudable que, entre los hábitos adquiridos o aprendidos relacionados con
minimizar los riesgos sobre el uso inadecuado de los diferentes plaguicidas, como el glifosato es
una constante en la vida cotidiana de la comunidad. La invisibilidad del riesgo debido al manejo de
glifosato en la localidad, probablemente no sean manifiestos de forma inmediata, pero si afectan a
los procesos medioambientales en todo el municipio y deja expuestos no solo a la vulnerabilidad
social a los campesinos, sino también a la vulnerabilidad medioambiental a largo plazo.

9.3.2 Grado marginación y pobreza de San Simon Atzitzintla

De acuerdo a INEGI (2015) la localidad tiene un tipo de urbanización metropolitano, que dispone
de alumbrado público, calles pavimentadas, pozo de agua comunitario, mercado fijo, una red de
agua potable y drenaje que descarga finalmente en la PTAR de San Simón Atzitzintla. La localidad
cuenta con un total de 841 viviendas censadas, de las cuales 597 el jefe de familia es hombre, 699
con piso de tierra y 706 disponen de luz eléctrica, agua entubada de la red pública y drenaje, 709
con televisor, 404 con refrigerador, 113 con computadora, 206 con teléfono, 409 celular y 55 con
acceso a internet (Instituto Nacional de Etadística y Geografía, 2015).

Los servicios de salud que se disponen dentro de la localidad son un centro de salud y consultorios
médicos particulares, 455 habitantes son derechohabientes para recibir servicios médicos ya sea por
el IMSS o ISSSTE, sin embargo, para recibir este servicio es necesario acudir hasta el municipio de
San Martín Texmelucan. Los servicios de IMSS e ISSSTE se encuentran a 5.4 Km de la localidad,
siendo necesario tomar 2 transportes públicos, que tienen un costo de $7.00 MXN por cada uno,
tardándose alrededor de 45 minutos desde la localidad de San Simón hasta la dependencia médica.

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En cuestión de servicios educativos la localidad cuenta con niveles desde preescolar hasta
bachillerato, teniendo un promedio de escolaridad de 8.36 años, que corresponde aproximadamente
al segundo año de secundaria (INEGI, 2010; SEDESOL, 2010).

La localidad se caracteriza por ser rica en abastecimiento de alimentos, principalmente de semillas,


carne y lácteos, ya que es muy común observar traspatios en la localidad en donde se encuentran
desde pequeños sembradíos, principalmente de maíz, frijol y alfalfa, hasta animales como vacas,
cerdos, borregos, gallinas y guajolotes; producción destinada principalmente para el autoconsumo.

Hacer mención de los servicios con los que cuenta la localidad, es necesario puesto que son
indicadores esenciales para conocer el grado de marginación, rezago social y así como carencia de
vivienda en la localidad (Gutiérrez-Pulido & Gama-Hernández, 2010). Retomando la definición de
pobreza y rezago social del CONEVAL (2010), el cual define a la pobreza como un problema social
que impone graves limitaciones en el desarrollo intelectual y social de las personas que la padecen,
la cual a su vez niega la igualdad de oportunidades entre individuos y evidencia en materia del
ejercicio de los derechos humanos, económicos y sociales de una sociedad y define al rezago social,
como una medida ponderada que resumen 4 indicadores de carencias sociales (educación, salud,
servicio básicos y espacios en la vivienda) en un solo índice que tiene como finalidad ordenar a la
unidades de observación según sus carencias sociales (Consejo Nacional de Evaluación de la
Política de Desarrollo Social, 2010). También es necesario retomar el concepto de marginación
empleado por el Consejo Nacional de Población, expresándola como la persistente desigualdad en
la participación de los ciudadanos y grupos sociales de desarrollo y en el disfrute de sus beneficios
(Cortés, 2002).

Dentro del municipio de San Salvador el Verde, la única localidad catalogada con alto grado de
marginación es San Antonio Chautla, mientras que existen otras 10 localidades de las cuáles no
existen datos sobre el índice de marginación (SEDESOL, 2010). San Simón Atzitzintla, se
encuentra catalogada dentro de un rezago social bajo. En 2005 la localidad se catalogó con un bajo
grado de marginación, el cual aumento a medio en 2010. Al ser una localidad con bajo rezago social
y con un grado de marginación medio (Figura 22). San Simón Atzitzintla no está catalogada como
una zona que requiera atención prioritaria en materia de acciones urgentes para superar
insuficiencias y rezagos para el desarrollo social y fortalecimiento del desarrollo regional
equilibrado (Gutiérrez-Pulido & Gama-Hernández, 2010). Sin embargo, durante las entrevistas se

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observó que los campesinos presentan carencias y limitaciones en la igualdad de oportunidades de
servicios básicos, salud y educación.

Figura 22. Mapa de índice de marginación en el Municipio de San Salvador el Verde (Elaboración
propia con asistencia de Sánchez-Porras, con datos de INEGI, 2010 y SEDESOL, 2013)

Al ser clasificada la localidad de San Simón en Rezago medio, no se está considerada para
programas como el Programa para el Desarrollo de Zonas Prioritarias (SEDESOL, 2013a), que
atiende rezagos vinculados con la infraestructura básica comunitaria, y la carencia de servicios
básicos en las viviendas, ni en la Cruzada Nacional contra el Hambre (SEDESOL, 2013b), que
busca abatir la pobreza, desnutrición y la marginación social en México; este tipo de programas son
otorgados únicamente a zonas con un alto grado de marginación y rezago social.

A pesar de que la población de San Simón está catalogada como zona urbana conforme a los
criterios estadísticos del INEGI, su modo de vida, de acuerdo a los campesinos entrevistados es de
gente de campo (Salvador & Lamo de Espinosa, 2006) definen este estilo de vida como aquella
clase social que se conforma por familias rurales que explotan la tierra, obteniendo una baja
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remuneración de capital y a partir de un fuerte empleo de la fuerza de trabajo por parte de la familia,
con el fin de utilizar lo producido para el sustento y reproducción de la unidad familiar, lo cual
coincide con lo registrado en las entrevistas y observaciones que se realizaron a los campesinos de
la localidad de San Simón Atzitzintla.

También existe la definición dada por la Real Academia Española, que define al campesinado como
conjunto de personas que viven y trabajan de forma habitual en el campo; sin embargo, la
definición de campesinado de Salvador y Lamo (2006), se considera la más adecuada para este
trabajo puesto que describe una serie de costumbres que se identificaron durante las observaciones
de esta investigación. Por ejemplo, la participación del núcleo familiar durante todo el proceso de
producción, tanto en la horticultura, como en la floricultura, así como la costumbre de utilizar las
ganancias en beneficio de la misma familia y en la compra de insumos para la producción, como
plaguicidas, semillas y herramienta que deba ser sustituida.

En la localidad se identificaron conflictos por la propiedad de tierras, originados por el desempleo y


la migración indocumentada en su mayoría con destino a Estados Unidos, para integrarse en el
sector primario o terciario; además de que en años recientes se ha incrementado notablemente la
delincuencia, debido al robo y distribución ilegal de hidrocarburos, puesto que San Simón
Atzitzintla se encuentra dentro del triángulo rojo del estado de Puebla (Observatorio Nacional
Ciudadano, 2019). Estos problemas se ven agravados por la falta de un cuerpo de policía preventiva
en la zona, por lo que los pobladores de la localidad se ven afectados directamente (Instituto
Nacional de Etadística y Geografía, 2015).

9.3.3 Tipos de cultivo y plaguicidas más utilizados

Los dos sistemas de producción agrícola que se identificaron durante las entrevistas fueron 7
horticultores y 3 floricultores. Los horticultores entrevistados acostumbran cultivar espinacas, frijol,
avena, haba, alfalfa, cilantro, cebolla y rábano, aproximadamente cada 3 meses cambian de cultivo,
ya que no suelen sembrar lo mismo dos cosechas seguidas, una parte de la cosecha es destinada para
consumo de la familia y el resto es comercializado en la central de abastos de la ciudad de Puebla o
en el mercado El Hoyo de San Martín Texmelucan. Los productos son vendidos por medio de
subasta a los “acaparadores” que ofrecen el mejor precio, por lo que es imposible establecer un
precio fijo por sus productos. Dentro de los plaguicidas que utilizan en sus campos de cultivo son:
Arrivo, Candela Super, Folicur, Manzate, Faena, Coloso, Flama y Rodeo (Tabla 20).

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Tabla 20. Plaguicidas utilizados por los horticultores (Elaboración propia)

Nombre Ingrediente Tipo de CT Clasificación


comercial activo plaguicida
Arraza glifosato herbicida lV organofosforado
Candela glifosato herbicida lV organofosforado
super
Coloso glifosato herbicida lV organofosforado
Desafío glifosato herbicida lV organofosforado
Faena glifosato herbicida lV organofosforado
Rodeo glifosato herbicida lV organofosforado
Flama paraquat herbicida ll bipiridilo
Folicur tebuconazole fungicida lV benzimidazol
Manzate mancozeb fungicida lV ditiocarbamato
Arrivo cipermetrina Insecticida lll piretroide

Todos los herbicidas que emplean los horticultores contienen el ingrediente activo glifosato
(Arraza, Candela Super, Coloso, Desafío, Faena y Rodeo), y estos se aplican cada dos o tres meses,
como un control para eliminar las hierbas no deseadas en los campos antes de ser cultivados.
También hacen uso de fungicidas (Folicur y Manzate) para atacar la cenicilla, la roya, septoriosis y
un hongo que llaman pudrición gris. Por último, como insecticida utilizan “Arrivo” para combatir
gusanos y arañas.

En el caso de los floricultores producen rosa, gladiola, crisantemo y astromelia, sus productos son
comercializados en la central de abastos de la Ciudad de México o en la de Puebla. Cabe resaltar
que dos de los floricultores entrevistados son el presidente y el secretario de Floricultores de
Texmelucan Sociedad Rural de Responsabilidad Ilimitada, mencionando que el principal beneficio
que han logrado con esta asociación es una zona especial para la venta de sus productos en la
central de abastos de México. La venta se lleva a cabo por subasta al igual que los horticultores, sin
embargo, el tener un espacio asignado facilita la comercialización. Algunos de los herbicidas que
utilizan para controlar las hierbas no deseadas de los linderos y canales de riego alrededor de sus
invernaderos son Gramoxone, Arraza, Faena, Flama y Rival, ya que los floricultores suelen remover
las hierbas de forma manual. De los fungicidas para combatir la cenicilla y la Peronóspora, son
”Folicur” y “Mazate”, además del insecticida “Floley” para los gusanos (Tabla 21).
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Tabla 21. Plaguicidas utilizados por los floricultores (Elaboración propia)

Nombre Ingrediente Tipo de CT Clasificación


comercial activo plaguicida
Gramoxone paraquat herbicida ll bipiridilo
Faena glifosato herbicida lV organofosforado
Rival glifosato herbicida lV organofosforado
Flama paraquat herbicida ll bipiridilo
Folicur tebuconazole fungicida lV benzimidazol
Manzate mancozeb fungicida lV ditiocarbamato
Foley clorpirifos etil insecticida lll organofosforado

Los floricultores no aplican herbicidas durante el proceso de producción ya que ellos mismos
remueven las hierbas no deseadas de forma manual. Pero, por otro lado, los herbicidas los llegan a
emplear en época de lluvias con el fin de controlar el crecimiento excesivo del pasto en los
senderos, para evitar que animales venenosos se escondan en estos y así prevenir que los
campesinos sean mordidos o picados por animales venenosos. Otro de los usos del “Faena”
(herbicida con el ingrediente activo glifosato) es su aplicación en canales de riego con el propósito
de eliminar pastos u otras hierbas que impidan el paso del agua.

En promedio en ambos sistemas de producción cumplen con una jornada de trabajo de 8 horas al
día, utilizando agua proveniente de pozos profundos para regar sus campos de cultivo. Ante todo lo
anterior podemos concluir que ambos sistemas de producción utilizan el ingrediente activo
glifosato, además de que dentro de las mismas entrevistas se logró identificar que este herbicida
también es utilizado en los alrededores de sus hogares, para el control de hierbas no deseadas.

La clasificación de los plaguicidas de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud se basa en


la peligrosidad o grado de toxicidad de acuerdo con su dosis letal (LD), considerando las siguientes
categorías: Clase lA (extremadamente peligrosos); Clase lB (altamente peligrosos), Clase ll
(moderadamente peligrosos); clase lll (ligeramente peligrosos). Para México existe un ajuste en la
Categoría Toxicológica (CT), que respeta la clasificación realizada por la OMS, designando como
CT l, ll, lll, y lV de acuerdo al Catálogo de plaguicidas de la Comisión Intersecretarial para el
Control del Proceso y Uso de Plaguicidas, Fertilizantes y Sustancias Tóxicas (CICOPLAFEST,
2004). De acuerdo con esta clasificación, en los campos de cultivo los horticultores aplican

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plaguicidas de la categoría altamente peligrosos, como es el caso del plaguicida “Flama”. Los
floricultores también utilizan plaguicidas de esta misma categoría como el “Gramoxone” y el
mismo“Flama”. El glifosato dentro de la regulación mexicana se encuentra dentro de la CT IV
(ligeramente peligroso), mientras que para otros países es de uso restringido o ya se encuentra
prohibido (Malkanthi et al., 2019).

Se revisaron las fichas técnicas y de seguridad de las seis fórmulas comerciales que contienen el
ingrediente activo glifosato y que son utilizadas por los campesinos entrevistados. Se compararon
las acciones tomadas por los agricultores con respecto a las indicaciones de las hojas técnicas y de
seguridad con el fin de buscar relaciones causales entre la presencia de glifosato en aguas de la
localidad y las actividades agrícolas de la misma. Por último, se realizó una revisión de los efectos
ambientales señalados en las fichas técnicas con respeto a la literatura (Tabla 22).

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Tabla 22. Procedimientos, instrucciones de uso y efectos señalados de las marcas comerciales que contienen el ingrediente activo glifosato
(Elaboración propia)

Marca Concentración Presentación Procedimientos de Instrucciones de la Efectos señalados por la


comercial de glifosato manipulación de acuerdo a compañía compañía
(%) la compañía
RODEO 35.5 Emulsión Aceite en Uso reservado para Prever un sistema de lavado Provoca irritación ocular
(MONSANTO) Agua agricultores y aplicadores ocular cerca de las zonas, en grave, poco peligro para el
profesionales las que pueda producirse un medio ambiente
contacto con los ojos.
Mantenerlo alejado de
desagües, alcantarillas, fosos
y corrientes de agua
ARRAZA 41.00 Emulsión Aceite en No se recomienda su uso en Aplicación dirigida a la Es fitotóxico para todas las
Agua mezclas maleza en los cultivos de plantas verdes y puede
aguacatero. Limón, naranjo, dañar a las especies que no
toronjo, pomelo, plátano son objeto de control
FAENA Fuerte 35.6 Emulsión Aceite en Realice triple lavado de los Destruya los envases vacíos y No tiene actividad en el
360 Agua envases vacíos al momento de sus residuos conforme lo suelo por lo que no daña la
(MONSANTO) hacer la mezcla del producto establece la Ley General para emergencia del cultivo
para su aplicación, la Prevención y Gestión
depositando el agua en el Integral de los Residuos.
tanque de la aspersora.
CANDELA* 66.89 Emulsión Aceite en Evite que el material fluya Utilice overol o uniforme de Movilidad baja; no se
SUPER Agua hacia lagos, corrientes de manga larga y cubierta para la espera que llegue a las
agua, estanques y drenajes. cabeza aguas subterráneas. Muy
tóxico para los organismos

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acuáticos, con efectos
nocivos duraderos
RIVAL 68 Gránulos No aplique directamente Quítese la ropa se encuentra en un rango de
(MONSANTO) sobre el agua o cerca de inmediatamente si es prácticamente no tóxico a
cuerpos de agua contaminada con plaguicidas ligeramente tóxico en una
y lávela cuidadosamente. gran variedad de especies
acuáticas y aves
DESAFÍO 62 Gránulos Dispóngase los envases para prevenir el desarrollo de la biodegradación
vacíos de acuerdo al poblaciones resistentes, microbiana es completa
Reglamento de la Ley de siempre respete las dosis y las formándose finalmente
Equilibrio Ecológico y frecuencias de aplicación; compuestos naturales: co2,
Protección al Ambiente en evite el uso repetido de este agua, n y fosfato. se adsorbe
material de residuos producto fuertemente en el suelo por
peligrosos. lo que no se lixivia, siendo
su vida media de más de 60
días. en el suelo se inactiva
rápidamente.

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La indicación de mantener el producto alejado de desagües, alcantarillas, canales y todo tipo
corrientes de agua para evitar su contaminación se encuentra en todas las hojas de seguridad
revisadas, siendo una de las indicaciones más ignorada ya que el 100% de los campesinos
entrevistados realizan la limpieza de los equipos de fumigación en los canales de riego. Otra mala
práctica registrada durante las entrevistas es la aplicación del herbicida en los canales de riego para
el control de hierbas no deseadas que crecen dentro de los canales, con el fin de evitar que estas
obstaculicen el paso de la corriente de agua. Al igual es muy común abandonar los recipientes
vacíos en, o cerca de los canales de agua, el 70% de los entrevistados afirma haberlo hecho, además
de que se encontró evidencia de ello durante el proceso de las entrevistas (Figura 23).

Figura 23. Evidencia de abandono de envases de plaguicidas en el campo, cercano a canales de


riego (Elaboración propia, 2017)

El equipo de seguridad recomendado para poder cumplir con una aplicación segura del herbicida
incluye gorra, overol de algodón, mascarilla, lentes de tipo químico, guantes y botas de neopreno;
posterior a la aplicación es necesario descontaminar en el lugar de aplicación con detergente y una
solución alcalina (lejía), tanto al equipo de protección como al de aplicación. Los entrevistados
afirman hacer uso de todo el equipo de protección, sin embargo, durante las visitas se observó en
múltiples ocasiones la aplicación de plaguicidas, constatando que como equipo de protección se
usan únicamente gorra o sombrero y botas de neopreno (Figura 24). Por otro lado, los agricultores
no suelen realizar una descontaminación adecuada de sus equipos: las mochilas de motor y botas se
lavan en los canales de riego únicamente con agua, sin ningún tipo de detergente y la ropa de
trabajo la lavan las mujeres de la casa empleando detergentes comerciales.

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Figura 24. Campesino aplicando mezcla de plaguicidas (Elaboración propia, 2018)

Para prevenir el desarrollo de poblaciones resistentes se recomienda siempre respetar las dosis y
frecuencias de aplicación; así como evitar el uso repetido del producto. El 70% de los agricultores
entrevistados no respetan esta indicación y tienden a aumentar las concentraciones y frecuencias de
aplicación del producto hasta lograr eliminar las hierbas no deseadas.

En las fichas técnicas se encuentra el apartado de identificación de los peligros, indicando que el
producto al estar en contacto con los ojos provoca lesiones oculares graves, información que se
corroboró durante las entrevistas. El 70% de los agricultores afirmó presentar irritación en los ojos
por tener contacto ocular con el producto, incluso aseguran tener problemas visuales por estar
expuestos a este tipo de productos.

El 90% de los campesinos nunca han recibido una capacitación oficial, salvo el ingeniero agrónomo
que recibió capacitaciones a lo largo de sus estudios profesionales. El resto de los agricultores dicen
que la única capacitación recibida para aplicar plaguicidas es la enseñada por sus padres cuando
aprendieron el oficio, seguido de las recomendaciones recibidas por los vendedores de las tiendas
de agroquímicos. Las hojas de seguridad, sin embargo, limitan el uso del herbicida a agricultores
capacitados, y en el caso especial de la fórmula comercial RODEO está se restringe aún más, ya que
hace indicación de que el producto solo debe ser aplicado por agricultores y aplicadores
profesionales, además de que es necesaria la instalación de un sistema de lavado ocular en caso de

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salpicaduras, sin embargo ninguno de los campos de cultivo de los agricultores entrevistados
cuenta con este tipo de instalaciones.

El herbicida comercial ARRAZA recomienda no realizar mezclas con otros plaguicidas, sin
embargo, el 100% de los entrevistados dicen realizar mezclas con la finalidad de ahorrar tiempo en
las aplicaciones y conseguir una mejor apariencia de los productos.

Las hojas de seguridad afirman que la presencia de su producto en el suelo tiene baja movilidad por
lo que no es posible su migración a aguas subterráneas, sin embargo, existen estudios que
demuestran lo contrario. El estudio realizado por (Rendón-Von Osten & Dzul-Caamal, 2017a),
determinó concentraciones de glifosato en el 100 % de sus muestras (agua embotellada,
subterránea). Otra investigación realizada por (Sanchís et al., 2012) también determinó en agua
subterránea concentraciones de glifosato que excedían los límites máximos permisibles en agua.

Las hojas técnicas de las fórmulas comerciales aseguran que el uso de los productos representa poco
peligro para el medio ambiente, pero por otro lado, existe evidencia de la afectación a diferentes
servicios ambientales que proporcionan distintos organismos, como es el caso de la población de
lombrices de tierra (fundamentales en la fertilidad del suelo, redistribución de la materia orgánica,
así como el incremento en la penetrabilidad del suelo) (Gaupp-Berghausen et al., 2015). Del mismo
modo, la población microbiana del suelo, que ayuda a descomponer los residuos de las plantas y a
mineralizar la materia orgánica, se ve afectada debido al incremento de patógenos y el consumo de
nutrientes (Zaller, Heigl, Ruess, & Grabmaier, 2014; Zobiole et al., 2010). También existe un
estudio sobre afectaciones en los mecanismos de defensa de las plantas debido a la presencia de
glifosato en el medio (Johal & Huber, 2009).

Respecto a la disposición de los residuos y envases vacíos, las hojas de seguridad dictan que estos
deben de ser destruidos conforme a lo establecido en la Ley General para la Prevención y Gestión
Integral de los Residuos. De acuerdo con la información obtenida en las entrevistas a profundidad,
los productores de la zona no conocen de la existencia de alguna ley en materia de plaguicidas o
residuos peligrosos, por lo que el 20% los desecha en la basura, el 40% los suele dejar abandonados
en el campo y el 30% dice llevarlos a un centro de acopio, sin embargo, durante el tiempo que se
realizaron las entrevistas nunca paso la camioneta encargada de la recolección de residuos. Cabe
señalar que durante las visitas se observaron envases vacíos abandonados dentro y cerca de los
invernaderos. La Ley general para la prevención y gestión integral de los residuos, establece que los

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residuos peligrosos como los plaguicidas deben de ser confinados en centros de acopio, donde los
residuos serán destruidos por incineración o por termólisis, con el fin de reducir el volumen y
descomponer o cambiar la composición física, química o biológica del residuo.

Se compararon las composiciones químicas de las fórmulas comerciales CANDELA SUPER y


RIVAL, encontrándose contradicciones entre cada formula comercial, por un lado, la hoja de
seguridad del herbicida CANDELA, cataloga al producto como muy tóxico para los organismos
acuáticos, con efecto nocivo duradero, caso contrario del RIVAL, ya que se encuentra en un rango
de prácticamente no tóxico a ligeramente tóxico, haciendo mención de que se realizaron numerosos
experimentos en especies acuáticas y aves. Sin embargo en una revisión bibliográfica se
encontraron distintos estudios donde demuestran que por sí solo el ingrediente activo glifosato
provoca efectos nocivos en las poblaciones acuáticas así como a aves (de Brito Rodrigues et al.,
2019; Fan, Geng, Ren, & Wang, 2013; Kelly, Poulin, Tompkins, & Townsend, 2010; Tsui & Chu,
2003).

9.3.4 Glifosato en agua de la localidad de San Simón Atzitzintla

Empleando el Kit comercial de Abraxis para determinar glifosato en agua, se analizaron 6


diferentes muestras de aguas, de las cuales solo el agua de canal de riego, el agua residual y el agua
residual tratada resultaron positivas a la presencia de glifosato. La tabla 23 muestra las
concentraciones de las muestras que dieron positivo a presencia de glifosato.

Tabla 23. Detección de glifosato en matrices de agua provenientes de la Localidad de San Simón
Atzitzintla, empleando el Kit ELISA de Abraxis (Elaboración propia)

Matriz de agua Glifosato (ppt) D. S.


Canal de riego 72.91 0.009
Agua residual 1162.69 0.002
Agua residual tratada 1486.01 0.007

Por lo tanto, la presencia de glifosato en diferentes matrices de agua, nos confirma que en la
localidad de San Simón Atzitzintla, el glifosato es utilizado ampliamente durante sus actividades
agrícolas, puesto que se detectó en los canales de riego. Además, la presencia de glifosato en agua
residual tratada, quiere decir que el tratamiento recibido por la PTAR es inadecuado.

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9.3.5 Estado actual de la PTAR en San Simón Atzitzintla

Fueron realizadas visitas en distintos momentos a la PTAR de San Simón Atzitzintla; en las que se
observó que su ubicación está en el centro de una zona habitacional, pues en un radio de 20 metros
se encuentran asentamientos humanos (casas), que descargan sus aguas residuales de uso
habitacional al caudal del rio Santa Elena, que finalmente llegan a la PTAR, dentro del mismo radio
el principal uso del suelo está referido a tierras cultivo (Figura 25), donde habitantes y campesinos
cercanos a la PTAR son potencialmente vulnerables a la exposición directa de gases, malos olores,
e indirectamente debido a los lodos residuales generados durante el tratamiento. Por lo que se
decidió platicar con habitantes cercanos a la PTAR sobre los beneficios o afectaciones que han
presenciado, desde que comenzó a operar esta. Se platicó con la Sra. Rosa que llego a vivir en la
zona hace 17 años (antes de la construcción de la PTAR), su domicilio se encuentra
aproximadamente a 200 metros de donde se encuentra instalada la PTAR, la cual argumenta (56
años, 2018) “nunca fuimos avisados sobre su construcción, sino que supimos de su existencia por
los malos olores que se comenzaron a producir por su operación”. Lo que pone de manifiesto la
separación o distancia existente entre el ciudadano común y los órganos de gobierno, pues a pesar
de que el proyecto se implementa siguiendo los procedimientos establecidos por las legislaciones
ambientales vigentes, los habitantes no reconocen la necesidad de dicha planta de tratamiento ni el
impacto benéfico de la misma en la región.

Figura 25. Campos de cultivo y casas habitacionales cercanos a la PTAR de San Simón Atzitintla

(Elaboración propia, 2017)

Durante el desarrollo de la investigación, otro informante encargado en la operación de la PTAR


señalaba (2019): “uno de los problemas que afecta constantemente el tratamiento son las descargas
de textileras, las cuales provocan la desestabilización de la planta dejándola inactiva por hasta tres
meses o más”. Ante este problema los responsables de su operación han optado por cerrar el flujo
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de la entrada a la planta, cada vez que el operador detecta descargas coloridas, con el fin de evitar la
desestabilización de la misma (Figura 26).

Figura 26. Contaminación de agua por colorantes rojo y azul. (Elaboración propia, 2017)

Es notable que otro problema que aqueja a la PTAR, conforme a los expuesto por nuestros
infromantes es es la falta de mantenimiento (Figura 27), así como la capacitación técnica de los
operadores, ademas de que no existe un programa de capacitación oficial para operar la planta.
Estas deficiencias (falta de capacitación y mantenimiento) podrían ser factores fundamentales que
influyen potencialmente en el adecuado tratamiento de las aguas residuales.

Figura 27. Evidencia de corrosión en reactor anaeróbico provocada por los gases en la PTAR de
San Simón Atzitzintla. (Elaboración propia, 2017)

La PTAR en San Simón Atzitzintla se encuentra regulada unicamente en contaminantes básicos, por
lo que el tratamiento en si es inadecuado para el resto de contaminantes. La implementación de un
tratamiento eficiente en la PTAR de San Simón Atzitzintla es necesaria, puesto que algunos
campesinos de las localidades de Analco y Tlacotepec de José Manzo continuan regando sus
campos de cultivo con agua del río Santa Elena, sin tener conocimiento sobre la calidad del agua y

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con ello, se sigue produciendo para el autoconsumo y la comercialización de hortalizas y flores que
en su mayoria se comercializa en el mercado local. Los campesinos de Analco y Tlacotepec de José
Manzo cosechan usualmente calabazas, lechugas y tomates; que son distribuidas en el mercado “El
Hoyo” de San Martín Texmelucan o en las centrales de abasto de las ciudades de Puebla y México,
debido a su cercanía. Por otra parte, los informantes refieren que hay campesinos que han
suspendido el riego de sus cultivos con agua del río Santa Elena, debido a que sufren de irritación
en piel y ojos al estar en contacto con el agua. Además de que en 2016 el río Santa Elena se
catalogó como un cuerpo de agua con alto grado de contaminación debido a los malos olores que
genera y efectos negativos que provocaba a los campesinos por usar agua del río (Espinoza Galindo,
2016). Sin embargo, no se pueden identificar estudios científicos que comprueben ese dicho que
refieren, ni los parametros en los que se atribuye dicha causalidad.

La presencia tanto de plaguicidas y otros contaminantes emergentes en el agua, es un riesgo


potencial importante para la salud, ya que puede estar contribuyendo a la incidencia de
enfermedades crónico degenerativas (Scarsi et al., 2017). Más del 50% de las PTAR en México han
sido calificadas a nivel global por tener un pésimo funcionamiento, debido a que ninguna aplica
medidas específicas para la remoción de contaminantes emergentes. Donde la mayoría de las PTAR
en México emplea la cloración como tatamiento en la eliminación de microorganismos, sin
embargo estudios revelan que la cloración no es una practica segura, puesto que no garantiza la
eliminación completa de microorganismos resistetes como virus y parásitos (Merino-Pérez &
Velázquez-Montes, 2018).

El agua contaminada con glifosato arriba al cauce del río Santa Elena, junto con descargas
industriales que contienen una gran cantidad contaminantes desconocidos. Dichos contaminantes
son desplazados a distancias lejanas de donde fueron aplicados en un principio, debido al flujo del
cauce del río Santa Elena, el cual tiene una trayectoria hacia el río Atoyac, quedando
potencialmente expuestos a los efectos negativos que provoca el glifosato, tanto la población; como
los compartimentos ambientales que tienen contacto con esta agua. La PTAR de San Simón
Atzitzintla trata solo una parte del cauce del río Santa Elena; sin embargo, como se mencionó
anteriormente este tratamiento es inadecuado, debido a la presencia de glifosato que se determinó
en la muestras de aguas tomadas, por lo tanto la población y los compartimentos continuan
expuestos a los efectos adversos del glifosato, ya que el agua residual tratada es nuevamente
descargada al cauce del río Santa Elena (Figura 28).

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Figura 28. Causas de la presencia de glifosato en agua superficial de San Simón Atzitzintla
(Elaboración propia)

Debido a las observaciones durante las visitas a la PTAR de San Simón Atzitzintla, se puede decir
que la ineficiencia del tratamiento ocurre por la falta de mantenimiento de está, seguido de la gran
cantidad de contaminantes desconocidos que llegan a la planta, los cuales impiden un eficaz
tratamiento, debido a que la planta esta normalizada únicamente para tratar contaminantes básicos.
A la fecha no existe estudios ni análisis sobre los efectos adversos a través de diferentes
compartimentos ambientales en contacto con el río Santa Elena, así como las poblaciones cercanas
al mismo río.

El oficio de campesino es transmitido de generación en generación, lo que ha permitido la


supervivencia de diversas generaciones de campesinos que mantienen la esperanza de que seguirán
siendo beneficiados de esta fuente de agua para regar sus cultivos y en general como eje de su vida
cotidiana en casas, traspatios y demas espacios en lo individual y en lo comunitario.

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10. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

En este estudio se han abordado diversas causas de la presencia de glifosato en diferentes matrices
de agua de la localidad de San Simón Atzitzintla. Una de las que mayor peso tiene es la cultura
agrícola dependiente de plaguicidas sintéticos que se practica en esta zona, se logró identificar que
el glifosato es uno de los herbicidas preferidos por los campesinos entrevistados, por la familiaridad
que tienen con el mismo y la relevancia que les dan a las recomendaciones de los técnicos de las
tiendas de agroquímicos. Adicionalmente, los campesinos no tienen una cultura de prevención de la
contaminación, es necesario fomentar la toma de conciencia y difusión de la información puesto
que existe una falta de conciencia y desinformación. Es una realidad que los campesinos no reciben
capacitaciones oficiales, lo que ha traído como consecuencia una serie de malas prácticas al aplicar
los plaguicidas, ya sea en la forma de aplicaciones directas o cercanas a los cuerpos de agua, el uso
de concentraciones mayores a las recomendadas o inclusive desconocidas por los mismos
campesinos y mala disposición de envases.

Por otro lado, las políticas y programas gubernamentales de capacitación agrícola se enfocan en el
uso seguro de plaguicidas, sin proponer el dejar de utilizarlos. Donde el garantizar este uso seguro
de plaguicidas significa excluir la complejidad de los efectos que ocasionan este tipo de compuestos
tanto en la salud como en los recursos naturales, que en el caso particular del glifosato aún existe
una controversia sobre sus efectos. Es necesario un cambio de paradigma tecnológico en el campo,
con el que se pueda implementar un manejo integrado de plagas puesto que se trata de un problema
complejo que requiere de atención en múltiples sectores y disciplinas, para poder defender a la
biodiversidad, mejorar la calidad ambiental y lograr una sostenibilidad del ambiente a largo plazo
que garantice el bienestar de la población humana, así como el de su entorno.

A pesar de que en el mercado ya existen paquetes tecnológicos agrícolas amigables con el medio
ambiente, estos no han logrado una aceptación inmediata en comparación a los introducidos durante
la revolución verde. Para una implementación exitosa de un manejo integrado de plaguicidas a
partir de tecnologías amigables con el medio ambiente, es necesario realizar capacitaciones sobre
conocimiento técnico, seguido de cambios culturales regulados bajo proyectos de educación
ambiental, así como estudios socioculturales sobre la implementación de estos paquetes en el
entorno donde son aplicados.

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En este estudio se desarrolló un método espectrofotométrico para determinar glifosato en agua por
formación de complejo empleando el compuesto [Ni(PhDP)2], el método presenta como
características detección rápida, alta sensibilidad ya que puede determinar concentraciones de
glifosato inferiores al límite máximo permisible establecido por la EPA de EE. UU y por la NOM-
014-CONAGUA-2007 (0.7 mg/L), además de que el método puede ser aplicable para monitorear
las diferentes matrices de agua de la localidad de San Simón Atzitzintla y de otras matrices de agua
que presenten las mismas características fisicoquímicas como las que se analizaron en San Simón
Atzitzintla. Monitorear las concentraciones de glifosato con el método desarrollado permitiría
conocer si realmente las concentraciones de glifosato presentes en el agua cumplen con los límites
establecidos por la EPA y por la NOM-014-CONAGUA-2007, con el fin de dar a conocer si la
población se encuentra en riesgo a los efectos adversos que provoca este herbicida.

En la localidad de San Simón Atzitzintla se logró identificar tanto por entrevistas, observación y por
análisis que el glifosato es el herbicida más empleado en esta zona, debido a que la agricultura que
se practica es dependiente de plaguicidas. Por otro lado, las razones por las que se encuentra
presente el glifosato en diferentes matrices de la localidad, es principalmente por la cultura de la
región que carece totalmente de una prevención, tanto de los campesinos que aplican este herbicida
sin ninguna capacitación oficial, como de las tiendas de agroquímicos que los distribuyen y los
recomiendan sin control alguno, así como la falta de programas gubernamentales y políticas
públicas, donde está falta de prevención pone en constante riesgo el bienestar de la población en
general, así como el bienestar de los recursos ambientales.

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11. REFERENCIAS

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12. ANEXOS

12.1 ANEXO 1. Detección espectrofotométrica de glifosato en agua por formación de


complejo entre bis 5-fenildipirrinato de níquel (II) y glifosato

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12.2 ANEXO 2. Estructura teórica del complejo [NiGlyp(PhDP)2]

Todos los cálculos se realizaron utilizando la Teoría Funcional de Densidad (DFT) (Hohenberg &
Kohn, 1964; Kohn & Sham, 1965)implementada en Gaussian 16 (Frisch et al., 2016). Las
optimizaciones de geometría y el análisis de frecuencia se realizaron al vacío con B3LYP funcional
y el conjunto de bases LANLD2Z. Los mínimos locales se identificaron con un número cero de
frecuencias imaginarias (NIMAG = 0). Todos los cálculos se realizaron sin restricciones de
simetría.

Para predecir el posible complejo entre [Ni(PhDP)2] y glifosato, se realizaron cálculos a partir de la
optimización de la geometría de los compuestos probables en el nivel de DFT.

Figura A1. Estructura optimizada del complejo [NiGlyp(PhDP)2] (Elaboración propia)

El complejo estructural que se muestra en la Figura A1 es el compuesto más estable y probable que
se encontró durante la modelación de la reacción entre [Ni(PhDP)2] y el glifosato. Dicha estructura
muestra como el níquel en el complejo [NiGlyp(PhDP)2] expande su número de coordinación de 4 a
6 con un átomo de nitrógeno y uno de oxígeno del grupo carboxilo del glifosato, a distancias entre
1.89-2.08 Å en una geometría molecular octaédrica distorsionada. Los valores de las distancias que
se calcularon (Tabla 19), son similares a los reportados por Menelaou et al. (2009), Subramaniam
(1988) y Xue et al (2017), lo cuáles se realizaron bajo condiciones experimentales (Menelaou et al.,
2009; Peleka et al., 2006; Subramaniam & Hoggard, 1988; Xue, Dong, Ma, wang, & Zhu, 2017).

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Los átomos de oxígeno del grupo fosfónico no interactuaron con el átomo de níquel debido a que
durante la optimización este complejo no presenta estabilidad. La distancia más corta del oxígeno
del grupo carboxilo indica una interacción más fuerte del glifosato con el compuesto [Ni(PhDP) 2].

Tabla 19. Distancias de enlace (Å) para los átomos de coordinación de la estructura optimizada
[NiGlyp(PhDP)2]. Los valores experimentales del fragmento [Ni(PhDP)2] (a) y Ni(Glyp)2 (b) de la
literatura se proporcionan para comparación (Menelaou et al., 2009; Xue et al., 2017).

[Ni(PhDP)2] (a) and Ni(Glyp)2


[NiGlyp(PhDP)2]
(b)
Distancia
Enlace Enlace Distancia (Å)
(Å)
Ni-N(1) 1.93 Ni-N (a) 1.88
Ni-N(2) 1.93 Ni-N(b) 2.01
Ni-N(3) 1.94 Ni-O(b) 2.05
Ni-N(4) 1.90
Ni-N(5) 2.08
Ni-O 1.89

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12.3 ANEXO 3. Un método espectroscópico simple para determinar dimetoato en
muestras de agua por formación complejo

A simple spectroscopic method to determine dimethoate in water samples


by complex formation

Aline Romero-Natale1, Georgette Rebollar-Pérez2, Irmene Ortiz3, María


Guadalupe Tenorio-Arvide1, Ricardo Munguía-Pérez1, Ilaria Palchetti4,
Eduardo Torres1*

1
Posgrado en Ciencias Ambientales, ICUAP, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla,
Edificio IC 6 Ciudad Universitaria, Col. San Manuel, 72570, Puebla, México; 2Facultad de
Ingeniería Química, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 18 Sur y Av. San Claudio, Col.
San Manuel, 72579, Puebla, México; 3 Depto. Procesos y Tecnología. Universidad Autónoma
Metropolitana-Cuajimalpa. Av. Vasco de Quiroga 4871, Col. Santa Fe. C.P. 05348, México City,
Mexico; 4 Dipartimento di Chimica, Università Degli Studi di Firenze, Via della Lastruccia 3, Sesto
Fiorentino (Fi), C.P. 50019 Firenze, Italia

Abstract

A simple and rapid method for the determination of dimethoate in water was
developed based on the monitoring of the complex formation between Bis 5-
phenyldipyrrinate of nickel (II) and the herbicide dimethoate. The method showed a
short response time (10 s), high selectivity (very low interference from other sulfate
and salts), high sensitivity (limit of detection (LOD) 0.45 µM, limit of quantitation
(LOQ) of 1.39 µM), and a Kd of 2.4 µM. Stoichiometry experiments showed that
complex formation occured with a 1:1 relation. The method was applied to different
environmental water samples such as lagoon, stream, urban, and groundwater
samples. The results indicated that independently from the water source, the method
exhibited high precision (0.25%–2.47% variation coefficient) and accuracy (84.42%–
115.68% recovery). In addition, the method was also tested using an effluent from a

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wastewater treatment plant from Mexico; however, the results indicated that the
presence of organic matter had a pronounced effect on the detection.

_______________________________________

*Address correspondence to Eduardo Torres, Centro de Química, ICUAP, Benemérita Universidad


Autónoma de Puebla, 14 Sur y Av. San Claudio, Col. San Manuel, Puebla 72570, México; Phone:
+52-222-2295500 ext. 7273; E-mail: eduardo.torres@correo.buap.mx

KEYWORDS: Dimethoate, detection assay, metal dipyrrinate, organophosphorus pesticide

Introduction

Organophosphorus pesticides (OPs) are widely used in crop management and agricultural
productivity due to their high efficiency and low cost to ensure harvest. [1,2] Although OPs show a
higher degradability compared to other pesticides, [3] their widespread usage and improper handling
practices mean that, they can migrate between environmental settings, causing serious
environmental pollution and food safety issues. [4–6] Numerous negative health effects have been
reported, as well as their acute toxicity effects, particularly in humans. [3,7–9]

Dimethoate (O,O-dimethyl S-(2-(methylamino)-2-oxoethyl) dithiophosphate) (Fig. 1a) is one of the


most used OPs in the cultivation of vegetables and fruit trees, particularly olive trees. [1,10,11] It is
widely used in the treatment of plant diseases and insect pests, which have made its application
quite feasible in the food industry but at a very high health cost, because it can cause adverse effects
to human health by bioaccumulation in the food chain. [12,13] The Electronic Code of Federal
Regulations of the United States has published a list of Tolerances and Exemptions for Pesticide
Chemical Residues in Food. [14] In the European Union, several countries set limits for dimethoate
in water or food at 0.02 mg/kg or 87 nM. [2,15] However, information of maximum acceptable
concentrations of dimethoate is still scarce.

According to the World Health Organization guidelines for drinking-water quality, dimethoate can
be determined by gas-liquid chromatography, with a detection limit of 0.5 µg/L. [16] Liquid
chromatography coupled to mass spectrometry or diode array detectors, as well as
spectrophotometric methods, have been proved to be reliable for dimethoate detection in olive oil
samples. [17]
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Recently, several methods have been developed to determine dimethoate from aqueous solutions,
i.e., colorimetric, [2,18–21] fluorescence, [22–25] electrochemical, [26–28] and Raman (SERS) assays,
[10,29,30]
with high sensitivity, reproducibility, and a short detection time, representing potential
alternatives to traditional methods, which are expensive and require trained personnel. Nevertheless,
alternative methods still have some drawbacks, such as complexity in the preparation of recognizing
elements or in the sample pretreatment.

Previously, the bis 5-phenyldipyrrinate of nickel (II) [Ni(PhDP)2] compound was used for the
detection of the herbicide glyphosate by a complex formation with specific spectroscopic properties
in such a way that the presence of several organophosphorus pesticides or inorganic salts did not
interfere. [31] In this work, we extend the application of the metal [Ni(PhDP)2] for the detection of
dimethoate in water samples. The resulting complex exhibited different spectroscopic properties
compared to that glyphosate complex, which allowed for selective, fast, and sensitive detection of
dimethoate.

Materials and method

Materials

Dimethoate, parathion, dichlofenthion, terbufos, silica gel, pyrrole, trifluoroacetic acid (TFA),
benzaldehyde, triethylamine (Et3N), and 2,3-Dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone (DDQ) were
supplied from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Methylene chloride (CH2Cl2), chloroform
(CHCl3), hexane, and methanol (CH3OH) were procured from Fermont (Monterrey, Mexico). Ethyl
acetate was purchased to JT BAKER (Center Valley, USA). All the reagents used were of
analytical grade (purity > 99%).

Instrumentation

Electronic absorbance spectra measurements were obtained using a Varian Cary 50


spectrophotometer equipped with a xenon lamp (Australia). To perform electronic spectra
measurements, quartz cuvettes (1 cm path length) were used.

Synthesis of the [Ni(PhDP)2]

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The synthesis of the nickel compound was based on the work of Brückner. [32] Briefly, the 5-
phenyldipyrrometane with benzaldehyde (1 mmol), pyrrole (1 mmol), and trifluoroacetic acid were
synthesized. Then DDQ (1 mmol) was added and stirred for 30 min at room temperature. After that
Et3N (0.5 mL) was added to the solution and stirred for another 30 min at room temperature. After
the elimination of the solvent, the residue was dissolved in CH2Cl2, and the solution was filtered to
remove precipitates. The solvent was removed, and the product was purified by short silica gel
column chromatography using ethyl acetate as an eluent. The first eluted yellow fraction was
evaporated to afford the crude product. Then, 2 mmol of 5-Phenyldipyrromethene and 1 mmol of
nickel sulfate hexahydrate were dissolved in a mixture of CHCl3 and CH3OH. The solution was
agitated and heated under reflux for 6 h, and then 0.5 mL of Et3N was added and heated again under
reflux for 4 h. The solution was evaporated in a rotary evaporator until a dark brown solid was
obtained. The dried remainder was dissolved in CH2Cl2 and CH3OH (1:1), leaving it to slowly
evaporate until crystals were obtained.

Dimethoate detection

The formation of the complex between [Ni(PhDP)2] and dimethoate was evidenced by the changes
in the electron absorption spectrum of [Ni(PhDP)2] (72 µM) after the addition of dimethoate (2 µM)
in 1 mL of a solution of 99% CH3OH and 1% water. This CH3OH–H2O mixture was necessary for
the solubility of [Ni(PhDP)2] compound, and also because allows the best interaction with
dimethoate (data not shown).

A calibration curve was obtained registering the absorbance changes of the new band at 422 nm
using 72 µM [Ni(PhDP)2] and different dimethoate concentrations (0.4 to 2.6 µM).

Stoichiometry

The stoichiometry of the [NiDmt(PhDP)2] complex was determined using the Job method of
continuous variation. [33] To this end, an equimolar stock solution was prepared and mixed so that
the total concentration was kept constant (50 µM). The absorbance at 422 nm was measured as
described above.

Dissociation constant

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The dissociation constant (Kd) was determined by adjusting the absorbance changes at 422 nm to
the following one-site binding model (Equation 1):

∆A= ∆Amax x D0/ (Kd + D0) (1)

where ΔA is the increase of percentage change upon addition of each dimethoate concentration,
ΔAmax is the maximum percentage of change (100%) when the [Ni(PhDP)2] is saturated with
dimethoate, and D0 is the concentration of dimethoate. The reported values are the mean of three
replicates. The data were fit to the Hill equation using an iteration procedure following the
Marquardt–Levenberg nonlinear least-squares algorithm using Origin 8.0 software (Originlab
Corporation, Northampton, MA, USA).

Dimethoate analysis in water samples

Five different water matrices were employed to assess the potential of the method: lagoon, stream,
urban, groundwater, and treated wastewater. Each of them contained dimethoate added intentionally
at different concentrations (0.44 – 2.62 µM). Treated wastewater was previously filtered to remove
suspended solids. The five water samples were stored at 4°C until used, and were
physicochemically characterized to determine pH, conductivity, temperature, Chemical Oxygen
Demand (COD), and Biochemical Oxygen Demand (BOD); several anion and cation analyses were
performed as well: Ca2+, Fe2+, SO42-, Mg2+, NO31-, NO3-N, PO43-, Ni2+, and free chlorine. For the
analysis, 999 µL of the [Ni(PhDP)2] solution were mixed (72 µM in CH3OH) with 1 µL of spiked
water samples. After mixing, the dimethoate detection was carried out as described previously.

Method selectivity

To identify possible interfering factors, various salts were added at the maximum concentrations
found in the environmental water samples: 112.2 µM of CaCl2·2 H2O (16.5 mg/ L), 3153.3 µM of
NaNO3 (268 mg/ L), and 147.5 µM of MgCl2·6 H2O (30 mg/ L), as well as the phosphates salts
Na2HPO4·7 H2O, and (NH4)2HPO4 at a concentration of 397.28 µM (106.5 mg/ L). Furthermore,
other organophosphorus pesticides were tested with the same purpose (terbufos, parathion,
glyphosate, and dichlofenthion) all of them at a concentration of 1.4 µM. The effect of the mixture
of salts and pesticides was also evaluated. For these studies, the assay time was 10 s, and the

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concentrations of dimethoate (concentration determined as limit of quantitation (LOQ)) and
[Ni(PhDP)2] used were 1.4 μM and 72 μM, respectively.

All the experiments were made in triplicate to assess the repeatability of the results. The statistical
analysis of the data was done using Origin Software V 8.0.Results and discussion

Characterization of the [Ni(PhDP)2] compound

The [Ni(PhDP)2] compound was characterized by UV-Vis (λ nm: 330, 480), and by 1H NMR
spectroscopy based on the structural symmetry by signals for the aromatic protons. 1H NMR (500
MHz, CDCL3) δ= 9.426 (s, 4, α-dipyrrin), 7.500 (d, J=2.5 Hz, 6H, Ar-H), 7483-7.331 (m, 8H, Ar-
H, β-dipyrrin), 6.741 (d, J = 3.5 Hz, 4H, β-dipyrrin), as reported by Xue et al. [34]

Dimethoate detection

As previously reported, the electronic absorption spectrum of [Ni(PhDP)2] showed a characteristic


band at 480 nm, indicative of double-bond electron transition metals (Fig. 2, dashed line). [34] The
absorbance of this band significantly decreased in the presence of dimethoate; in addition, a new
signal at 422 nm was observed (Fig. 2, dotted line). The absorbance change at 480 nm, as well as
the formation of the new peak at 422 nm, may be explained by the formation of a complex between
both species. As previously reported, [Ni(PhDP)2] interacts with nitrogen and oxygen atoms from
glyphosate in a distorted octahedral molecular geometry, producing a stable chemical complex. The
presence of an isosbestic point indicates that two chemical species are related linearly by
stoichiometry. Indeed, Figure 3 shows that the absorbance at 422 nm followed an increasing linear
behavior with the dimethoate concentration ranging from 0.43 to 6.54 µM. Equation 2 describes the
relationship between the two variables.

Absorbance = 0.0401[Dimethoate] + 0.2872 (2)

Using Equation 2, the calculated limit of detection (LOD) and the limit of quantitation (LOQ) were
0.45 µM and 1.39 µM, respectively. The European Union set the maximum permissible level of
OPs at 0.5 µg/L (2x10-3 µM) in drinking water. [8] Meanwhile, the maximum allowable
concentration of dimethoate in surface water is 0.03 mg/ L (0.1 µM), established by the World
Health Organization. [35] Therefore, a pre concentration step would be necessary to apply this
method in drinking and surface water samples, which is a very common step for pesticides analysis.

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Nevertheless, the LOD and LOQ obtained in this work are in the same range with other values
reported in the literature (Table 1). The method developed in this work presents the advantage of
shorter response time without the need for the derivatization step or the addition of reaction
precursors.

Stoichiometry of the [NiDmt(PhDP)2] complex

As the observed isosbestic points remained stable after 15 min, which indicated that the
stoichiometry of the complex remained unchanged and that no secondary changes occurred during
the considered time range, the next step was the determination of stoichiometry using the Job plot.
Figure 4a shows a triangular shape at the total concentration of 50 µM, which suggests a strong
molecular interaction between the compounds. The maximum change was observed at the mole
fraction of 0.45, which suggests that the molecular association occurred with stoichiometry of 1:1 or
1:2. [33,36] In the case of glyphosate detection, the complex was formed with a 1:1 stoichiometry,
where the nickel interacted with the nitrogen and oxygen atom of the glyphosate carboxyl group.
The titration experimental data were fitted by nonlinear regression analysis to the one-site binding
model to determine Kd, as shown in Figure 4b. The non-linear regression model fit the data very
well, with a correlation coefficient higher than 0.98. In addition, the residual distribution,
distributed randomly, indicated the model correctness (Fitting the data to two-site binding model
resulted in a minor r2 value and in a less random distribution of residuals). The calculated Kd value
was 2.4 μM. According to Chenprakhon et al. [37] and Pan et al. [38], a micromolar Kd value indicates
a high binding affinity of the ligand for its target. The Kd values obtained in this work were
comparable with some studies that determined the Kd for pesticide detection (Table 2); however, the
Kd value was still far from those reported for antibodies as recognizing elements in immunoassays.
As previously reported, the Kd values using [Ni(PhDP)2] for glyphosate detection were similar to
the one obtained in this work, which suggests similar affinities for both pesticides.

Method selectivity

The potential applicability of the method was also evaluated by determining the interference caused
by other components usually present in environmental water. In general, the experimental results
showed that the presence of inorganic salts (MgCl2·6 H2O, CaCl2·2 H2O, and NaNO3 with an
interference between 0.5% and 1.5%) did not interfere significantly in the complexation of
dimethoate with [Ni(PhDP)2]. Additionally, different phosphate salts were tested ((NH4)2 HPO4 and

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[Na2HPO4]·7 H2O) with a negative effect between 1.2% and 8.9%. It is already known that the
phosphate ion may form complexes with nickel and other metals,[39–41] but in this case the phosphate
salts did not show an interference greater than 10%. On the other hand, an interference of 16% was
determined with (NH4)2SO4, which means that the sulfate salts somehow affected the complex
formation. The same set of experiments was carried out with other organophosphorus pesticides that
are continuously used in agriculture, such as terbufos, [42] parathion, [43] glyphosate, [44] and
dichlofenthion, [45] as well as their mixtures. The absorbance values of the [NiDim(PhDP)2]
complex in the presence of the organophosphorus pesticides did not show an effect greater than
10% and thus they were discarded as an interferent. As mentioned before, glyphosate did not
influence the detection of dimethoate, because the absorbance changes were observed at different
wavelengths. The mixture 1, composed of sulfate and phosphates salts, showed pronounced effects
at 71%. On the contrary, the mixtures 2 and 3 did not show interference; thus, it follows that the
sulfate had a negative role in the complex formation. All the assays suggested that for a good
selectivity of the method, the sulfate ions should first be removed (Table 3).

Analysis of water in samples spiked with dimethoate

The physicochemical parameters of the five water matrices from different sources are shown in
Table 4. As no dimethoate was detected in either of the analyzed samples using this method, the
samples were spiked with dimethoate (0.44-2.62 µM) and added to the [Ni(PhDP)2] solution. The
dimethoate concentrations in the samples were calculated using Equation 2. The percentages of
recovery varies between 84.42% and 115.68% for groundwater, urban, lagoon, and stream water,
which indicated good accuracy of the method for these samples. On the contrary, for the treated
wastewater sample it showed a low accuracy, probably due to the presence of sulfate ions, which
were shown to be the main interferents (Table 3). Additionally, a high precision was obtained, as
reflected by the coefficients of variation (0.37%–3.30%), for all water samples (Table 5). For
groundwater, urban, lagoon and stream water, it seems that the presence of several salts and metals
at different concentrations did not affect the dimethoate detection, and the method may be applied
for different water sources. It is important to note the proposed method may be used for screening
purposes in different water samples; a pre-concentration step is necessary because environmental
concentrations of pesticides are usually in the ng/ L level. [46,47]

Conclusion

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This work presented a spectrophotometric method for the determination of dimethoate in water
samples by using [Ni(PhDP)2] as the selective ligand. The stoichiometry of the complex formation
was 1:1. With the optimized method, the LOD and the LOQ were calculated to be 0.45 µM and
1.39 µM, respectively. The developed method assures repeatability, high sensitivity, and rapid
determination (10 s) of dimethoate in complex matrices. The method was successfully applied to
determine known concentrations of dimethoate (0.44-2.62 µM) in groundwater, urban water,
lagoon, and stream water samples, with good precision and accuracy. The presence of inorganic and
phosphate salts and other organophosphorus pesticides did not interfere with the dimethoate
determination. For more complex samples, like residual treated water, both parameters were
compromised.

Acknowledgment

This research project was funded by the Ph.D. Grant Number 494272 from Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnología (CONACYT).

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FIGURE CAPTIONS

Figure 1. Chemical structure of (a) dimethoate and (b) [Ni(PhDP)2]

Figure 2. Electronic absorption spectrum of [Ni(PhDP)2] compound (72 µM) in the absence
(dashed line) and in the presence of dimethoate (2 µM) (dotted line). Reaction conditions: 99%
CH3OH -1% water, and dimethoate (2 µM) (line) dissolved in water

Figure 3. Calibration curve for the detection of dimethoate (0.43-6.54 µM) based on the interaction
with the compound [Ni(PhDP)2] (72 µM). Reaction conditions: 99% CH3OH -1% water

Figure 4. (a)Job plot for the [NiDim(PhDP)2] complex. With a total concentration of 50 μM. (b)
Hyperbolic saturation curve with dissociation constant results of fitting at 36 µM of [Ni(PhDP)2] in
the presence of dimethoate (0.43 to 11 µM)

Página | 145
Fig. 1

Fig. 2

Fig. 3

Página | 146
Fig. 4

Table 1. Comparison between other methods of detemination of dimethoate in water with the one
developed in this work.

Technique LOD (µM) Remarks


GC/MS [47] 1x10-3 Sensitive and selective, but it needs pre-treatments like
solid-phase extraction, sample optimization, expensive
equipment and reagents, complex procedure, and long
determination time (19 min)
GC-µECD [46] 1x10-4 Effective, sensitive and selective but it needs complex
synthetizing steps of the magnetic nanocomposite, pre-
treatments, expensive equipment, complex procedure,
pH control for the sample, and approximately 3 min for
the determination
GC‑NPD [48]
2x10 -3
Sensitive and selective but it needs expensive
equipment, long determination time (14 min),
microextraction treatment with a modified
microsyringe, and high temperature control (up to
320°C)
Fluorescence [22] 0.01 Selective, sensitive, and rapid determination but it
needs expensive reagents like gold-nanoparticle-based,
several extraction and centrifugation are required

Página | 147
Fluorescence [49] 0.02 Sensitive, selective and rapid determination but it needs
synthetizing steps of ZnO quantum dots based
molecularly imprinting polymer, and long pre-
treatments
Raman and SERS [10] 0.5 Sensitive, selective and rapid but it needs sample
preparation, expensive equipment and expensive
reagents (silver nanoparticles),
This study 0.4 Rapid (10 s), sensitive, effective, selective, and facile

Table 2. Comparison of the Kd between other pesticide detection methods with the developed
method in this work

Study Ligand Pesticide: Kd (µM)


This study [Ni(PhDP)2] Dimethoate: 1.35
[31]
Romero-Natale et al [Ni(PhDP)2] Glyphosate: 1.75 and 6.9
Kwon et al (2015) [50] EIA2 aptamer, Iprobenfos: 1.67 and

Edifenphos: 0.038
Mazouz et al (2017) [51] Polypyrole Glyphosate

Electrochemical: 1.6

Gravimetric: 0.3
Jiao et al (2018) [52]
Broad-specific monoclonal Parathion: 1.4x10-3
antibodies (mAbs)
Methyl-parathion: 4.2X10-3

Fenitrothion: 0.012
Hong & Sooter (2017) [53] single-stranded DNA Fipronil: 0.048

Table 3. Effects of the added salts, phosphates, sulfate, and organophosphorus pesticides on the
method selectivity.
Página | 148
Absorbance at 422 nm

Compounds ± Standard deviation Interference (%)

[NiDmt(PhDP)2] 0.36 ± 0.001 0.00


Inorganic salts
MgCl2 ·6 H2O 0.37 ± 0.002 1.48
CaCl2 ·2 H2O 0.36 ± 0.002 0.55
NaNO3 0.37 ± 0.012 1.53
Sulfate salt
(NH4)2SO4 0.31 ± 0.009 16.15
Phosphate salts
(NH4)2 HPO4 0.36 ± 0.013 1.22
[Na2HPO4]·7 H2O 0.34 ± 0.006 8.93
Organophosphorus pesticides
Parathion 0.36 ± 0.010 0.70
Dichlofention 0.37 ± 0.003 0.95
Terbufos 0.37 ± 0.010 0.56
Glyphosate 0.36 ± 0.006 0.00
Mixtures*
Mixture 1 0.10 ± 0.012 71.18
Mixture 2 0.33 ± 0.011 9.43
Mixture 3 0.37 ± 0.011 1.28

* Mixture 1: mixture of inorganic salts, sulfate salt, phosphates salts and organophosphorus
pesticides; Mixture 2: mixture of inorganic salts, organophosphorus pesticides and phosphates salts
and Mixture 3: mixture of parathion, dichlofention, terbufos and glyphosate.

Table 4. Physicochemical analysis of the different water matrices

Parameters Water matrix


Lagoon Stream Urban Groundwater Treated Wastewater
pH 8.84 7.50 7.34 7.00 7.27
Specific conductance 593.00 872.00 685.00 523.00 1423.00
(µs cm-1)
COD (mg L-1) 0.60 16.50 6.00 2.00 0.85
BOD (mg L-1) 92.70 137.20 98.00 42.00 481.30

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Ca2+ (mg L-1) 103.50 10.00 0.00 115.00 0.00
2+ -1
Fe (µg L ) 42.10 36.00 66.00 67.50 78.25
SO42- (mg L-1) 74.00 137.00 52.5 40.00 97.00
Mg2+ (mg L-1) 15.00 20.00 30.00 30.00 15.00
NO3-N (mg L-1) 6.35 8.20 17.83 18.35 60.45
- -1
NO3 (mg L ) 27.45 39.7 80.45 99.45 268.00
PO43- (mg L-1) 1.78 0.51 0.81 0.94 106.50
Ni+2 (mg L-1) 0.03 0.06 0.03 0.00 0.00
Free chlorine (mg L-1) 0.08 0.16 0.08 0.07 0.05

Table 5. Detection of dimethoate in spiked water samples*.

Dimethoate Coefficient of
Water matrix Dimethoate added (µM) Recovery (%)
determined (µM) variation (%)

0.44 0.50 1.77 115.30


0.87 0.92 2.47 105.39
1.31 1.42 1.83 108.82
Groundwater
1.74 1.94 1.45 111.39
2.18 2.42 1.50 110.80
2.62 2.69 1.85 102.69

0.44 0.43 1.46 97.95


0.87 0.82 0.37 93.57
Urban 1.31 1.37 2.87 104.75
1.74 1.78 1.76 102.24
2.18 2.29 2.14 104.85
2.62 2.56 1.71 97.76

0.44 0.39 1.30 88.81


0.87 0.74 1.98 84.42
Lagoon 1.31 1.31 2.62 100.31
1.74 1.78 0.25 101.96
2.18 2.19 1.44 100.55
2.62 2.62 1.34 100.27
Stream
Página | 150
0.44 0.50 2.42 115.68
0.87 0.90 1.50 103.58
1.31 1.35 1.12 103.23
1.74 1.87 1.32 107.44
2.18 2.27 1.50 103.86
2.62 2.54 1.39 97.16

0.44 0.27 2.43 62.51


0.87 0.57 2.85 64.89
Treated
Wastewater 1.31 0.89 2.10 68.23
1.74 1.33 3.30 76.42
2.18 1.93 1.91 88.39
2.62 2.35 2.32 89.63

*The results are the average of three water samples. Reaction conditions: 99% CH3OH -1% water

SUPPORTING MATERIALS

Figure 1S. Electronic absorption spectrum of [Ni(PhDP)2] and [NiDim(PhDP)2] with (a) parathion,
(b) dichlofention, (c) terbufos, (d) glyphosate, and (e) mixture of parathion, dichlofention, terbufos,
and glyphosate. Reaction conditions: 99% CH3OH -1% water

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12.4 ANEXO 4. Guía de entrevista

BENEMÉRITA UNIVERSIDAD
AUTÓNOMA DE PUEBLA
Doctorado en Ciencias Ambientales-ICUAP

Área: Tecnología Ambiental

“Desarrollo de un método para la detección y cuantificación del plaguicida glifosato y su


aplicación en muestras de agua de San Simón Atzitzintla”

Datos generales (estadístico)

N° de Encuesta: __________ Edad: __________ años Sexo: M F

Lugar de residencia:

San Simón Atzitzintla Otro_____________________________________________

¿Cuánto tiempo lleva viviendo en la región? _________

¿Tiene una ocupación diferente a la de agricultor? Sí No

Ocupación (es) _______________________________

¿Habla una lengua indígena? ________________________

Escolaridad: ________________________

Estado civil: Soltero Casado Divorciado Viudo

¿Cómo considera su estado de salud? ______________________

Fuma________ Consume alcohol______________

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¿Considera que tiene una alimentación balanceada? Sí No

Peso

a) Peso bajo b) Peso normal c)Sobrepeso


d) Obesidad

GUÍA DE ENTREVISTA SOBRE PLAGUICIDAS

 Aspectos sobre calidad de vida


1. ¿Cuánto tiempo lleva trabajando como agricultor?
2. ¿Por qué se dedica a trabajar en el campo?
3. ¿Tuvo otras opciones además de trabajar en el campo?
4. ¿Le gusta trabajar en el campo?
5. ¿Cuánto tiempo lleva viviendo en la región?
6. ¿Cuántas horas al día trabaja en el campo?
7. ¿Cuáles son sus principales gastos?
8. ¿Qué tipo y cuantos vehículos tiene? (auto, moto, bicicleta, tractor, etc.)
9. ¿Usted acostumbre salir de vacaciones?
10. ¿Cada cuándo acostumbra salir de vacaciones?
11. ¿Normalmente cómo se divierten, usted y su familia?
12. ¿Considera que tiene usted y su familia tienen una alimentación balanceada?
13. ¿En que gasta sus ahorros?
14. ¿Normalmente usted toma alguna capacitación o cursos en general?
15. ¿La casa que habita es propia o paga renta? (¿cuánto paga de renta?)
16. ¿Cuántas personas viven en su hogar?
17. ¿Cuántos hijos tiene?
18. ¿Sus hijos van a la escuela? en caso de ser adultos ¿Sus hijos fueron a la escuela?
19. ¿Hasta qué grado escolar?
20. ¿Quién(es) es el miembro de familia que tiene mayor grado académico?
21. ¿Número de años en la escuela del miembro de familia que tiene mayor grado
académico?
22. ¿A parte de la casa donde habita, usted es dueño de otra casa?
23. En su hogar:
Tipo de techo y suelo:
Numero de cuartos:

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Estufa de gas:
Internet:
Televisión de paga (cable):
Cuenta de ahorro:
Numero de baños:
Número de celulares de las personas que habitan en su hogar:

NOTA IMPORTANTE: Antes de pasar a la pregunta 24, es necesario primero entablar una
conversación de confianza (Hacer comentario de que la información es confidencial y que será
utilizada para términos estadísticos).

24. ¿Cuánto gasta aproximadamente en la quincena en los siguientes rubros?:


Vestido o ropa:
Transporte:
Gasolina:
Alimento:
Vivienda:
Educación:
Salud:
Teléfono:
Gas:
Luz:
25. ¿Compra sus alimentos o los cocina?
26. ¿Consume los alimentos que produce?
27. ¿Quién prepara los alimentos?
28. ¿Pertenece a algún programa o apoyo de política pública? (CATÁLOGO DE
PROGRAMA FEDERAL PARA MUNICIPIOS 2017 SEGOB INAFED)
Posibles opciones SAGARPA, SEDESOL, PROSPERA, PROSOFT, FONDO
NACIONAL (FNE), Programa de Apoyo al Empleo PAE).
 Dinámica Familiar
29. ¿Quién toma las decisiones sobre cómo se distribuye el dinero dentro de la
familia?
30. ¿En su familia quien tiene el mayor ingreso?
31. ¿Cómo se distribuyen las actividades de la casa y/o el cuidado de los hijos?
32. Quién se encarga de las decisiones sobre el cuidado de:
Salud:
Educación:
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Valores:
Alimentación:
Iglesia:
Actitudes que son perjudiciales para la familia:
33. ¿Quién distribuye el salario o las ganancias dentro de la familia?
34. ¿Cómo se distribuye el tiempo del cuidado de los hijos? (Roles de género)
35. ¿Su familia participa durante todo el proceso de la producción? ¿Por qué?
 Aspectos Económicos
36. ¿Vende sus productos?
37. ¿Cuánto le pagan por sus productos?
38. ¿Quién le compra sus productos?
39. ¿Porque le vende sus productos a esa persona?
40. ¿Ha pensado en vender en otros lugares?
41. ¿Tiene un crédito para sostener su producción?
42. ¿Están aseguradas sus tierras o que ocurriría en caso de un desastre natural?
43. ¿Qué hace en caso de pérdida de sus cultivos?
44. ¿Sabe si existe un apoyo gubernamental en caso de pérdida de cultivos por un
evento meteorológico?
45. ¿Ha recibido algún apoyo para la producción?
46. ¿Quién le ayuda a gestionarlo?
47. ¿Qué tanto estos apoyos influyen en su producción?
48. ¿Cada cuando recibe ingresos por sus cultivos?
49. ¿Cuánto invierte en herramienta para trabajar?
50. ¿Cuánto invierte en plaguicidas?
51. ¿Cuánto invierte en el glifosato?
52. ¿Aplicar glifosato le deja mayor ganancia?
53. ¿Qué ingresos reciben por la producción?
54. ¿Les paga un ingreso a sus familiares?
55. ¿Tiene usted empleados?
56. ¿Cómo se distribuyen los ingresos, en cuanto al salario?
57. ¿Les paga a lo mismo a los hombres que a las mujeres?
58. ¿Tiene otro ingreso, además de dedicarse a la agricultura?
59. ¿Tiene familiares en USA que lo apoyan económicamente?
60. ¿Qué hace con el dinero que le envían de USA?
 Aspectos sobre plagas y malezas (malas hierbas)
61. ¿La presencia de plagas ha significado un problema fuerte en sus cultivos?
62. ¿Cuáles son las plagas que afectan a los cultivos de la zona?
63. ¿Cuáles son las plagas más frecuentes en su cultivo?
64. ¿Cuáles son las malezas más frecuentes en sus cultivos?
65. ¿En qué cantidad son más frecuentes las malezas con respecto a otras plagas?
66. ¿Cada cuánto aplican el glifosato?
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67. ¿Qué cantidades aplica de glifosato para sus cultivos?
68. ¿Quién le enseño a identificar las malezas?
69. ¿Qué tanto pueden ser las malezas atacadas de forma natural?
70. ¿Qué hace en caso de resistencia de malezas?
 Aspectos sobre producción
71. ¿Qué es lo que cultiva?
72. ¿Cuál es el volumen de la producción?
73. ¿Cómo prepara sus tierras antes de cultivarlas?
74. ¿Siembra lo mismo todo el año? ¿Por qué?
75. ¿Qué plaguicidas utiliza en sus cultivos?
76. ¿Cuál es el herbicida más común que conoces?
77. ¿Usted utiliza el glifosato para sembrar?
78. ¿Por qué utiliza glifosato?
79. ¿Quién le beneficia los herbicidas?
80. ¿Ha recibido una capacitación para el uso de los plaguicidas?
81. ¿Pertenece a alguna asociación de agricultores? (¿A cuál?)
82. ¿Cómo se ha visto beneficiado por esta asociación(es)?
83. ¿Quién le proporciona las semillas que utiliza para sembrar?
84. ¿Quién le proporciona las herramientas y vehículos de trabajo?
85. ¿Quién le enseño a trabajar en el campo también utilizan glifosato?
86. ¿Es más barato o caro producir con glifosato?
87. ¿Su producción aumentó o disminuyó con el uso del glifosato?
88. ¿Cada cuando aplican el glifosato?
89. ¿Cuánto tiempo lleva usando los plaguicidas?
90. ¿Cómo quedan mejor sus productos con o sin plaguicidas, incluyendo el glifosato?
91. ¿Cómo se informa sobre qué tipo de plaguicidas debe utilizar y como se lleva a
cabo la producción del campo?
92. ¿A su forma de ver sus productos, piensa que tienen mejor aspecto usando
glifosato?
93. ¿Qué características tienen sus productos rociados con glifosato en cuanto: altura,
grosor, tamaño; sabor etc.?
94. ¿Qué les hace a sus productos?
95. ¿Usted consume los productos de sus cultivos?
96. ¿Alguna vez ha dejado de cultivar? ¿Por qué?
 Percepción de riesgo
97. ¿Ha recibido pláticas o cursos de capacitación para proteger sus cultivos de algún
evento meteorológico? (¿Quién lo impartió?)
98. ¿Viven familias en los alrededores de los terrenos de cultivo? (¿A qué distancia
aproximadamente?)
99. ¿Se encuentran escuelas cercanas en los terrenos de cultivo? (¿A qué distancia
aproximadamente?)

Página | 157
100. ¿Se ha percatado de muertes de animales en la región causados por los
plaguicidas?
101. ¿Considera que el uso de plaguicidas ha afectado al ganado? (¿Qué
síntomas han presentado?)
102. ¿Considera que el uso de plaguicidas afecta a la vegetación alrededor de la
zona de cultivo? ¿Por qué?
103. ¿En qué lugar almacena los plaguicidas? ¿Por qué los almacena ahí? (en su
hogar, almacén especial para plaguicida; etc.)
104. ¿Utiliza los plaguicidas en su hogar? (¿Por qué? ¿Qué plaguicidas?)
105. ¿Cómo y/o en que transporta los plaguicidas hasta el sitio de aplicación?
106. ¿Conoce alguna legislación o ley en materia de plaguicidas? (¿Cuál
legislación? ¿Le ha servido de algo saber de esta?)
107. ¿Quién y cómo lavan la ropa que utiliza para fumigar
 Aspectos ambientales Datos INEGI: sobre pozos y flora y fauna de la
región
108. ¿Qué tipo de animales se pueden ver por la zona?
109. ¿Cuáles son los recursos naturales de su localidad más importantes? (suelo,
agua, aire, flora, fauna, etc.)
110. ¿Considera que los recursos naturales se han deteriorado? ¿En qué grado?
111. ¿Cuál es la causa del deterioro?
112. ¿Se ha percatado de muertes de animales en la región causados por los
plaguicidas?
113. ¿Considera que el uso de plaguicidas ha afectado a los animales?
114. ¿Considera que el uso de plaguicidas afecta a la vegetación alrededor de la
zona de cultivo?
115. ¿De dónde proviene el agua que se utiliza para regar? Si viene de pozo
¿Cómo se llama?
116. ¿Paga una cuota por el agua que utiliza para regar sus cultivos?
117. ¿Cuánto paga?
118. ¿Se preocupa por la calidad del agua? ¿Por qué?
119. ¿Usted utiliza esta agua para otras actividades, como: bañarse beber,
lavandería y cocina?
120. ¿Cada cuando tiene acceso al agua que utiliza para regar?
121. ¿Cada cuánto tiempo riega?
122. ¿Cómo considera la calidad del agua a su percepción?
123. ¿Cuenta con un sistema de captación de agua en su hogar?
124. ¿Qué características tiene el agua que utiliza para regar: color olor, sabor,
etc.?
125. ¿Por qué utilizan esa agua para regar sus cultivos?
126. ¿Conoce si existen fuentes de agua cercanas de dónde cultiva? (ríos,
lagunas, pozos, manantiales; etc.)
127. ¿Sabe que el glifosato se acumula en el suelo y en el agua?

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128. ¿Considera que es importante conocer si hay y cuánto hay de glifosato en el
agua? ¿Por qué?
129. ¿Estaría de acuerdo en la implementación de un dispositivo capaz de
detectar glifosato en agua? ¿Por qué?
130. ¿Tienen una práctica para cuidar la calidad del suelo, para que no pierda sus
propiedades?
131. ¿Ha observado un cambio de temperatura de un año a otro?
132. ¿Cuáles son los cambios en el clima o fenómenos meteorológicos que
pueden interferir en su producción?
133. ¿Se ha visto afectado en sus ingresos debido a un fenómeno meteorológico?
(lluvias, granizo, heladas negras, tormentas eléctricas, calor y frío extremo)
134. ¿Ha notado construcción de casas en tierras de cultivo? ¿Por qué
considera que este ocurriendo la construcción de casas en zonas de cultivo?
135. ¿Tiene usted la capacidad de tomar medidas de prevención para proteger a
su familia y a sus cultivos de un evento meteorológico extremo como los
anteriores? (¿Cómo cuáles?)
136. ¿Cómo se entera cuando va a ocurrir un fenómeno meteorológico extremo?
137. ¿En su localidad acostumbran realizar trabajos comunitarios para resolver
problemas relacionados con fenómenos meteorológicos? (¿Quienes participan y
que medidas toman?)
138. ¿Usted o alguien de su familia ha tenido que emigrar en busca de trabajo,
debido a la afectación de sus cultivos por un fenómeno meteorológico?
 Condiciones de aplicación / seguridad en el trabajo.
OBJETIVO DE ESTAS PREGUNTAS. La finalidad de estas preguntas es para conocer cómo
los agricultores interactúan y en qué condiciones se encuentran expuestos regularmente a los
plaguicidas durante la jornada de trabajo. Además de que estas preguntas nos pueden revelar o
dar un indicio de la relación causal de la presencia de glifosato en el agua de la planta de
tratamiento de aguas residuales.

139. ¿Qué actividades desarrollan los hombres y mujeres dentro de la jornada?


140. ¿Reciben apoyo de mano de obra de otra localidad? ¿Por cuánto tiempo y
que temporadas?
141. ¿Tienen acceso a un servicio de salud los trabajadores?
142. ¿Cómo se protegen sus trabajadores en caso de algún accidente? (seguro
médico, acuden a un médico particular, médico de farmacias del ahorro o
similares, huesero, homeópata u otros)
143. ¿Qué método utiliza para aplicar los plaguicidas? (espolvoreo, pistola
pulverizadora manual, mochila pulverizadora, fumigación, aplicación directa
en el suelo)
144. ¿A qué hora del día aplica los plaguicidas? ¿Por qué?
Página | 159
145. ¿Cuántas veces a la semana aplica los plaguicidas?
146. ¿Quién o quienes aplican el plaguicida? ¿Por qué ellos?
147. ¿Cómo prepara el glifosato antes de aplicarlo?
148. ¿Qué medida de seguridad utiliza para la mezcla y/ o aplicación de
plaguicida? (guantes, mascarilla, lentes de seguridad, botas, overol, delantal,
máscara de cobertura)
149. ¿Quién le enseño a tomar estas medidas de seguridad?
150. ¿Conoce la peligrosidad de los plaguicidas que aplica?
151. ¿Realiza lectura de etiquetas/ hojas de seguridad antes de aplicar el
producto? ¿Por qué?
152. ¿Mezcla los plaguicidas?
153. ¿Con que mezcla los plaguicidas? ¿Obtiene mejores resultados al realizar
estas mezclas? (aditivos, fertilizantes, surfactantes, otros plaguicidas)
154. ¿Qué hace con el plaguicida sobrante? (guardarlos ¿Dónde?, tirarlos
¿Dónde?, llevarlos a un centro de acopio especial para plaguicidas ¿Por qué
toma esa medida?)
155. ¿Qué hace con los envases vacíos? (guardarlos ¿Dónde?, tirarlos
¿Dónde?, llevarlos a un centro de acopio especial para plaguicidas ¿Dónde se
encuentra el centro de acopio para plaguicida?, ¿Por qué toma esa medida?)
156. ¿Qué hace con los plaguicidas caducos? (guardarlos ¿Dónde?, tirarlos
¿Dónde?, llevarlos a un centro de acopio especial para plaguicidas, ¿Por qué
toma esa medida?)
157. ¿Ha aplicado alguna vez plaguicidas caducos en sus cultivos? (¿Observó
alguna diferencia o un cambio por haberlo aplicado? ¿Por qué lo realiza?)
158. ¿Tienen una disposición especial los plaguicidas que utiliza?
 Aspectos sobre salud (Se tomarán datos del Centro de salud o clínica de
la localidad)
159. ¿Cuáles son las enfermedades humanas, más comunes que usted ha
observado en la comunidad, en su familia o incluso amigos y conocidos?
160. ¿Considera que su estado de salud, el de su familia o alguien que usted
conozca se ha deteriorado por el uso de plaguicidas? (¿El de quién? ¿De qué
manera?)
161. ¿Alguna vez ha tenido un accidente mientras aplicaba algún plaguicida?
162. ¿Qué parte de su cuerpo estuvo expuesto al plaguicida durante el accidente?
163. ¿Presento algún síntoma cuando tuvo el accidente con el plaguicida? (¿Qué
síntoma(s)?)
164. ¿Recibió algún tratamiento después del accidente? (¿Qué tratamiento?
¿Quién lo atendió y en donde fue atendido?)
165. ¿Ha manifestado síntomas después de aplicar algún plaguicida? (síntomas
relacionados de acuerdo a intoxicaciones con glifosato: vómito, irritación
mucosa, vías respiratorias, piel, diarrea, mareos, abortos espontáneos)
166. ¿Con que plaguicida ha manifestado estos síntomas?

Página | 160
167. ¿Qué enfermedades presentan o han presentado usted y su familia?
(enfermedades que se le asocian con el glifosato: fallas renales, cardiacas, en el
sistema nervioso, abortos espontáneos, defectos de nacimiento, autismo,
Alzheimer, cáncer, depresión, malformaciones)
168. ¿Algún familiar suyo se ha visto afectado por el uso de plaguicidas?
(¿Cómo se han visto afectados?, ¿Cómo piensa o como ocurrió?, ¿Estado de
salud actual? ¿Qué tratamiento recibió?)
169. ¿Conservan alguna tradición indígena en cuanto a su producción del
campo?
170. ¿Utiliza las mismas herramientas, plaguicidas, procedimientos y
tecnologías que usaba la persona que le enseño a cultivar?
171. ¿Ha cambiado algunas herramientas, plaguicidas, procedimientos y
tecnologías, desde que inicio a laborar en la agricultura? ¿Por qué?
172. ¿Utiliza los mismos plaguicidas que la persona que le enseño a trabajar en
la agricultura?
173. ¿Qué maquinaria y herramientas utiliza para todo el proceso de cultivo?
174. ¿Quién le proporciona esa maquinaria?
175. ¿Ha recibido una oferta para cambiar su maquinaria o los plaguicidas? (¿Sí
o no porque lo han tomado?

Página | 161

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