Practica 5 y 6

Universidad Autónoma de Baja California
“UABC” Facultad de ciencias químicas e ingeniería.
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA.
Químico Farmacobiólogo.
Profesor: Laderos Sánchez Bertha
Práctica de laboratorio #5 & 6: DETERMINACION DE LINFOCITOS T Y B
Alumno:
Liera Jimenez Jezreel Daniel
Grupo 451-2
Laboratorio de Inmunologia
Semestre 2022-2
Tijuana, B.C. Octubre 10 de 2022
Practica 5 y 6
DETERMINACION DE LINFOCITOS T Y B
INTRODUCCION
Los linfocitos son las células centrales del aparato inmunocompetente. En la

etapa embrionaria se originan en saco vitelino, hígado y bazo; más adelante,
solamente en médula ósea, de donde migran y colonizan otros órganos. Los que
llegan al timo, por influencia hormonal, se diferencian funcionalmente en una
población llamada linfocitos T, capaces de llevar acabo funciones conocidas
genéricamente como respuesta inmunológica celular. Existe otra población, que
para su diferenciación no requiere del timo; en las aves esta diferenciación se lleva
acabo en la bolsa de Fabricio, órgano que no existe en los mamíferos y cuyo
equivalente funcional es la medula ósea. A esta población corresponde los linfocitos
B, que son los precursores de las células formadoras de anticuerpos, mediadores
de la inmunidad humoral.
Ambas poblaciones de linfocitos colonizan a los llamados órganos linfoides

periféricos (nódulos linfáticos, bazo, amígdala, apéndice, y tejido linfoide asociado
a mucosa), donde ocupan áreas definidas. Tanto los linfocitos T como los B, no
permanecen indefinidamente dentro de estos órganos, si no que pueden migrar
utilizando tanto la circulación sanguínea periférica como la linfática.
Morfológicamente los linfocito T y B, son indiferenciables entre si, sin embargo en

su membrana celular poseen diferentes moléculas, algunas de las cuales son
exclusivas de una u otra población (marcadores). Esto ha permitido diseñar métodos
que permiten distinguir, enumerar y purificar poblaciones celulares.
A las moléculas antes citada, se les conoce genéricamente como CD (del

Ingles cluster of differentiation, o grupos de diferenciación). Con el uso de los
anticuerpos monoclonales es posible identificar una enorme variedad de CD; por
ejemplo, CD3, CD4, CD8 y CD19, que identifican a los linfocitos T totales, T
cooperadores, T citotóxicos y linfocitos B, respectivamente.
En la inmunofluorescencia introducida por Coons en 1941, células y tejidos a

los que se han unido anticuerpos específicos marcados con un fluorocromo, se
irradian con luz ultravioleta para producir una excitación en los electrones no
conjugados que brincan a niveles energéticos mayores, los que al regresar a su
nivel original liberan la energía absorbida, en forma de luz visible.
Existen diferente fluorocromos, los más usuales son la fluorosceina y la

rodamina que emiten luz de tonalidad verde y roja respectivamente.
La inmunofluorescencia puede ser directa o indirecta. En la directa, el
anticuerpo específico para el antígeno lleva unido el fluorocromo; en la indirecta el
anticuerpo que lleva unido el fluorocromo está dirigido contra las cadenas pesadas
del anticuerpo que reconoce específicamente al antígeno de superficie.
OBJETIVO
Que el alumno determine la presencia de moléculas en la superficie de

células linfoides útiles en la identificación de las distintas subpoblaciones celulares.
DETERMINACION DE LINFOCITOS T Y B POR EL METODO DE ROSETAS
Todos los linfocitos T humanos poseen un receptor para alguna sustancia

presente en la membrana de los eritrocitos de carnero, de modo que si estos se
agregan a una población enriquecida o purificada de linfocitos, solamente los que
sean T quedaran recubiertos por los glóbulos rojos dando el aspecto de una roseta,
que en esta caso se conoce como roseta E o roseta directa. Los linfocitos B también
pueden formar rosetas siempre y cuando los glóbulos rojos estén recubiertos con
anticuerpos y el subcomponente C3b del complemento (rosetas EAC o rosetas
indirectas).
MATERIAL POR GRUPO
Centrifuga clínica.
Microscopio óptico.
Platina caliente.
Una cámara de Neubauer.
MATERIAL POR EQUIPO
Un frasco de torundas por alcohol
Una ligadura.
Una jeringa desechable de 10 mL.
2 tubos de ensaye de 10 X 75 mm.
13 tubos de ensaye de 13 X 100 mm.
Un tubo cónico graduado en decimas de mL.

5 pipetas serológicas de 1 mL.
3 pipetas serológicas de 5 mL.
6 pipetas Pasteur.
6 portaobjetos y 6 cubreobjetos.
10 mL de solución salina amortiguada (SSA)
5 mL de solución de Ficoll-Hypaque (F-H).
50 mL de solución salina 0.85 % (SS).
1 mL de hemolisina (IgM anti-GRC).
1 mL de suero humano normal fresco.
3 mL de eritrocitos de carnero conservados en Alsever, ajustados a una

concentración al 5%.
1 mL de heparina con 1000 U.I. / mL.
A. TITULACION DE HEMOLISINA A UNA DILUCION SUBAGLUTINANTE
Método
1. Lavar los eritrocitos de carnero por centrifugación con SS 3 veces a 1500 rpm
durante 8 minutos y preparar al final 5 mL de una suspensión al 1% en SS.
2. Hacer una serie de diluciones dobles de la hemolisina hasta el tubo número

8, (dilución 1: 256), (volumen final de cada dilución = 0.25 mL). En un noveno tubo
poner solo 0.25 mL de SS. Agregar a todos los tubos 0.25 mL de la suspensión de
eritrocitos de carnero al 1% e incubar en baño María a 37°C, durante 30 min.
Agitando frecuentemente.
3. Reposar a temperatura ambiente durante 18 horas tomar como dilución

subaglutinante la dilución siguiente a la última donde todavía se observo
aglutinación
4. Hacer la dilución de trabajo con SSA. Se recomienda dividir en fracciones de

5 mL y guardar a -70°C.
B. PREPARACION DEL COMPLEMENTO
Método
1. Es posible usar como fuentes de complementos el suero de ratón o suero
humano. Se usa este último pro mayor facilidad de obtención.
2. Hacer una dilución 1:40 del suero humano fresco normal con SSA y dividir en
fracciones de 5 mL y guardar a -70°C.
C. PREPARACION DE ERITROCITOS PARA LA DETERMINACION DE

ROSETAS B.
Método
1. Preparar 5 mL de una suspensión de eritrocitos de carnero al 5 % en SSA.
2. En un tubo de ensaye colocar la suspensión de eritrocitos y agregar 5 mL de

la hemolisina diluida.
3. Incubar a 37°C, durante 30 minutos con agitación frecuente.
4. Lavar los eritrocitos con SSA 3 veces por centrifugación a 3500 rpm durante
8 minutos. Al final resuspender en 5 mL de SSA.
5. Agregar 5 mL de suero humano diluido e incubar durante 30 minutos a 37°C,

con agitación frecuente.
6. Lavar los eritrocitos como se indica en le paso 4.
7. Resuspender el paquete de eritrocitos hasta una concentración final del 1 %

en SSA.
E. PREPARACION DE UNA POBLACION ENRIQUECIDA DE CELULAS

MONONUCLEARES
Método
1. Obtener 5 mL de sangre venosa en una jeringa conteniendo 1 mL de

heparina. Mezclar bien por inversión.
2. Con la misma jeringa tomar 5 mL de SSA y mezclar por inversión.
3. Estratificar la sangre diluida sobre F-H en una proporción de 4 mL de sangre

por cada 2 mL de F-H, en tubos de ensaye de 13 X 100 mm.
4. Centrifugar a 1500 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente.
5. Recuperar el anillo de la interface F-H- Plasma con una pipeta Pasteur y

transferir a otro tubo de 13 X 100 mm.
6. Lavar las células con SSA por centrifugación a 1500 rpm durante 8 minutos
y retirar el sobrenadante con pipeta Pasteur.
7. Contar y ajustar la suspensión celular a 4 x 10⁶ en SSA.
F. DETERMIANCION DE ROSETAS EAC (INDIRECTAS)
Método
1. Trasferir 0.25 mL de la suspensión de eritrocitos sensibilizados con

hemolisina y complemento a un tubo de ensaye de 10 X 75 mm y agregar 0.25 mL
de la suspensión enriquecida de células mononucleares.
2. Centrifugar a 700 rpm durante 2 minutos y dejar reposar a temperatura

ambiente durante 15 minutos.
3. Aspirar aproximadamente la mitad del sobrenadante con una pipeta Pasteur

y agitar muy cuidadosamente el paquete celular.
4. Con una pipeta Pasteur tomar una gota de la suspensión y colocarla sobre
un portaobjetos. Colocar encima un cubreobjetos.
5. Sellar la preparación con parafina y observar al microscopio utilizando el

objetivo de inmersión.
6. Contar 200 células con apariencia de linfocitos y tomar como rosetas aquellos
que tengan 3 o mas eritrocitos adheridos a su superficie.
RESULTADOS
Los resultados normales varían dependiendo del tipo de célula T que se

analice. En adultos, un conteo normal de células CD4 va de 500 a 1,200
células/mm3 (de 0.64 a 1.18 x 109/L).
Linfocitos: 20% a 40% Monocitos: 2% a 8% Eosinófilos: 1% a 4% Basófilos: 0.5% a

1%
OBSERVACIONES
Durante las semanas que duro la practica debido a el periodo en que se necesitan
incubar los linfocitos, y además de que se requirió de ir a buscar linfocitos de carnero
que se disponía para ser sacrificado, podemos observar en las imagen siguientes
un pequeño precipitado de color rojo, en el cual se buscaba reducir la cantidad de
linfocitos siendo aislados en solución salina.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Warner, N.L. and Fahey, J.L. 1986. Manual of Clinical Laboratory

immunology. 3α. ed. American Society for microbiology, N.Y.
2. Examen de diferencial sanguíneo. (s. f.). Recuperado 10 de octubre de 2022, de
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003657.htm

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Liera Jimenez Jezreel Daniel

Los linfocitos son las células centrales del aparato inmunocompetente. En la

Ambas poblaciones de linfocitos colonizan a los llamados órganos linfoides

Morfológicamente los linfocito T y B, son indiferenciables entre si, sin embargo en

A las moléculas antes citada, se les conoce genéricamente como CD (del

En la inmunofluorescencia introducida por Coons en 1941, células y tejidos a

Existen diferente fluorocromos, los más usuales son la fluorosceina y la

Que el alumno determine la presencia de moléculas en la superficie de

DETERMINACION DE LINFOCITOS T Y B POR EL METODO DE ROSETAS

Todos los linfocitos T humanos poseen un receptor para alguna sustancia

MATERIAL POR GRUPO

Una cámara de Neubauer.

MATERIAL POR EQUIPO

Un frasco de torundas por alcohol

Una jeringa desechable de 10 mL.

2 tubos de ensaye de 10 X 75 mm.

13 tubos de ensaye de 13 X 100 mm.

Un tubo cónico graduado en decimas de mL.

3 pipetas serológicas de 5 mL.

10 mL de solución salina amortiguada (SSA)

5 mL de solución de Ficoll-Hypaque (F-H).

50 mL de solución salina 0.85 % (SS).

1 mL de hemolisina (IgM anti-GRC).

1 mL de suero humano normal fresco.

3 mL de eritrocitos de carnero conservados en Alsever, ajustados a una

1 mL de heparina con 1000 U.I. / mL.

A. TITULACION DE HEMOLISINA A UNA DILUCION SUBAGLUTINANTE

2. Hacer una serie de diluciones dobles de la hemolisina hasta el tubo número

3. Reposar a temperatura ambiente durante 18 horas tomar como dilución

4. Hacer la dilución de trabajo con SSA. Se recomienda dividir en fracciones de

B. PREPARACION DEL COMPLEMENTO

C. PREPARACION DE ERITROCITOS PARA LA DETERMINACION DE

1. Preparar 5 mL de una suspensión de eritrocitos de carnero al 5 % en SSA.

2. En un tubo de ensaye colocar la suspensión de eritrocitos y agregar 5 mL de

3. Incubar a 37°C, durante 30 minutos con agitación frecuente.

5. Agregar 5 mL de suero humano diluido e incubar durante 30 minutos a 37°C,

6. Lavar los eritrocitos como se indica en le paso 4.

7. Resuspender el paquete de eritrocitos hasta una concentración final del 1 %

E. PREPARACION DE UNA POBLACION ENRIQUECIDA DE CELULAS

1. Obtener 5 mL de sangre venosa en una jeringa conteniendo 1 mL de

2. Con la misma jeringa tomar 5 mL de SSA y mezclar por inversión.

3. Estratificar la sangre diluida sobre F-H en una proporción de 4 mL de sangre

4. Centrifugar a 1500 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente.

5. Recuperar el anillo de la interface F-H- Plasma con una pipeta Pasteur y

7. Contar y ajustar la suspensión celular a 4 x 10⁶ en SSA.

F. DETERMIANCION DE ROSETAS EAC (INDIRECTAS)

1. Trasferir 0.25 mL de la suspensión de eritrocitos sensibilizados con

2. Centrifugar a 700 rpm durante 2 minutos y dejar reposar a temperatura

3. Aspirar aproximadamente la mitad del sobrenadante con una pipeta Pasteur

5. Sellar la preparación con parafina y observar al microscopio utilizando el

Los resultados normales varían dependiendo del tipo de célula T que se

Linfocitos: 20% a 40% Monocitos: 2% a 8% Eosinófilos: 1% a 4% Basófilos: 0.5% a

1. Warner, N.L. and Fahey, J.L. 1986. Manual of Clinical Laboratory

2. Examen de diferencial sanguíneo. (s. f.). Recuperado 10 de octubre de 2022, de

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