GUÍA PRÁCTICA DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL – E.A.P.

DE INGENIERÍA AMBIENTAL

PRACTICA Nº 04
MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACION

I. GENERALIDADES:
Los medios de cultivo son sustancias nutritivas líquidas, sólidas o semi–sólidas, que pueden ser usados para
el crecimiento y desarrollo de los microorganismos, los cuales deben contener compuestos básicos necesarios
para el desarrollo bacteriano, entre ellos:
• Sustancias nutritivas apropiadas, como: Proteínas, carbohidratos, sales minerales y vitaminas.
• Tener un pH comprendido entre 6.8 a 7.6.
• Estar previamente esterilizados y protegidos de la contaminación.
Se considera además para el crecimiento:
• Necesidades de oxígeno (aerobios) y CO2 parcial o total (microaerófilos o anaerobios) y,
• Temperatura de incubación.
Los extractos de carne son nutrientes básicos de muchos medios de cultivo, a los cuales suelen añadírseles
carbohidratos y sales inorgánicas.
El agar-agar es el solidificante de un medio líquido al igual que le gelatina. Se prepara a partir de algas al
estado seco, entre ellos: Gelidium y Pterocladia, cuyo principal componente es un polisacárido constituido
por D-galactopiranosa.
Los medios de cultivos sirven para los siguientes propósitos principales:
• Fomentar el crecimiento microbiano de tal forma que se puedan AISLAR dichos microorganismos.
• Facilitan algunas Reacciones Bioquímicas que luego pueden ser demostrables por observación directa o
bien indirectamente por subsecuente reacción en presencia de algunos reactivos adicionales, logrando su
IDENTIFICACION y posterior CLASIFICACION.

CLASIFICACION:
A) POR SU ESTADO FISICO: Sólidos, líquidos o semi-sólidos.
B) SEGÚN APLICACIÓN: Se conoce cuatro tipos perfectamente diferentes de medios:
➢ Medios Básicos o Comunes: Contiene los mínimos requerimientos para los microorganismos.
Ejm.: Caldo nutritivo Agar nutritivo
Caldo Triptosa Agar Triptosa
Caldo peptonado Agar peptonado
Agar almidón, etc.
➢ Medios Enriquecidos: Son aquellos medios básicos los que han sido complementados con líquidos
corporales, Vitaminas específicas, aminoácidos, proteínas y otros nutrientes claramente definidos
como tales. Por ello contienen requerimientos de microorganismos más exigentes.
Ejm.: Caldo Cerebro – Corazón Agar Cerebro – Corazón
Caldo tripticasa-soya Agar tripticasa-soya
Agar sangre, Agar chocolate, etc.
➢ Medios Selectivos: Son usualmente medios de Agar básicos no enriquecidos, a los cuales se les
han agregado ciertos reactivos que impiden el crecimiento de la mayoría de las bacterias,
permitiendo por lo tanto el aislamiento de unas cuantas, seleccionadas, en los especímenes que
contengan grandes números de organismos indeseables.
Ejm.: Agar TCBS, Ruiz Castañeda, Ogawa o Lowensetein Jensen, Agar SS, Agar XLD.
➢ Medios Diferenciales: Son medios básicos o enriquecidos, a los cuales se les ha agregado ciertos
reactivos que reaccionan con algunos tipos específicos de bacteria en cierta forma observable.
Ejm.: Agar TSI, Agar LIA, Agar Citrato Simons, Caldo Urea y Agar Urea, etc.

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ESTERILIZACION:
En Microbiología esterilización implica la eliminación o destrucción de todo organismo vivo, que se
encuentra en un medio determinado.

METODOS DE ESTERILIZACION (CLASIFICACION)

A) Métodos Químicos.- La presencia de algunas sustancias químicas en un medio, da lugar a la destrucción
de organismos. Ej.: Cristales de timol en el caldo urea (esterilización química)
Cajas petri roceadas con algunas gotas de metanol, prendidas con fuego y cerradas inmediatamente,
dan lugar a que el formaldehído esterilice “in situ”.
B) Métodos Físicos.- En los cuales se lleva a cabo la destrucción por calor o radiaciones o bien eliminando
los micrororganismos por filtración o centrifugación.

𝐶𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑑𝑖𝑟𝑒𝑐𝑡𝑜 (𝐹𝑙𝑎𝑚𝑒𝑎𝑑𝑜 )

𝐸𝑏𝑢𝑙𝑙𝑖𝑐𝑖ó𝑛
− 𝐶𝑎𝑙𝑜𝑟 𝐶𝑎𝑙𝑜𝑟 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑜 { 𝑉𝑎𝑝𝑜𝑟 𝑓𝑙𝑢𝑒𝑛𝑡𝑒
𝑀é𝑡𝑜𝑑𝑜𝑠 𝑓í𝑠𝑖𝑐𝑜𝑠 𝑉𝑎𝑝𝑜𝑟 𝑠𝑎𝑡𝑢𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑖ó𝑛
{ 𝐶𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑠𝑒𝑐𝑜
− 𝐹𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛
{ − 𝑅𝑎𝑑𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛

Flameado: Exposición directa del material a la llama. De uso frecuente para la esterilización del asa de
Kolle antes y después de su empleo, en el mechero de gas o alcohol.
Ebullición: Su empleo más frecuente es en la esterilización de jeringas y agujas. No recomendable para
trabajos bacteriológicos por ser deficiente.
Vapor Fluente: Es un vapor que esteriliza por su temperatura, sin recurrir a presión.
Vapor Saturado a Presión: Es el medio de esterilización más usual y más efectivo. Se consigue con las
autoclaves, en los que se regula a voluntad, tanto la presión como la temperatura.
Calor Seco: Se requiere alta temperatura y tiempo prolongado (Horno: 170ºC x 2 Hrs).
Filtración: Consiste en separar los gérmenes de un medio líquido por pasaje a través de bujías o discos
de porosidad variable. Los filtros más usados son los filtros de infusorios o de asbesto o los de C.M.C.

II. OBJETIVOS:
• Conocer las composiciones químicas variadas de los medios de cultivos, sus características y propiedades
físico – químicas particulares, a fin de establecer un desarrollo bacteriano.
• Aprender a relacionar un medio de cultivo, según las exigencias nutritivas de los m.o., para dar lugar a su
aislamiento, identificación, clasificación y conservación.
• Demostrar que la esterilización es una acción letal que tiene por finalidad eliminar gérmenes en un medio
determinado y que es un aspecto básico en la técnica bacteriológica.
• Demostrar que la esterilización puede ser por agentes físicos o químicos sobre los m.o.

III. MATERIALES:
• Placas petri  10 cm.
• Tubos de ensayo – 13 x 100 mm.
• Matraces de 250 cc.
• Probeta de 250 cc.
• Balanza, potenciómetro.
• Espátulas.
• Autoclave de 14 lts.
• Mechero de Bunsen.
• Baño María (BM).

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• Sangre de carnero desfibrinada.

• Medios de Cultivo.

IV. PROCEDIMIENTO:
• Pesar los medios de cultivo indicados, calculando las cantidades en relación con los volúmenes
requeridos.
• Diluirlos en cantidades suficiente de agua destilada, según nuestro requerimiento.
• Licuar el medio en baño BM a ebullición, hasta completa disolución.
• Ajustar el pH con el potenciómetro.
➢ Si la lectura es menor de 7 agregar gota a gota NaOH/10 hasta llegar al pH deseado.
➢ Si la lectura es mayor de 7 agregar gota a gota HCI N/10 hasta llegar al pH deseado.
I. Repartir el medio de cultivo en los tubos y esterilizar después (Medio sólido o líquido).
II. Para el caso de Placas, pueden quedar en el matraz esterilizar y luego ser repartido.

Nota:
❖ Los medios de cultivo sean sólidos o líquidos pueden esterilizarse en los matraces y/o en los frascos y
luego ser repartidos en tubos y placas en un ambiente estéril y siempre frente a una llama. Considerando
dar inclinación respectiva antes que enfríen y solidifiquen.
❖ Es usual esterilizar en frascos grandes y/o matraces y almacenarlos en refrigeración a 4C
aproximadamente, recordando que antes de plaquear o entubar un medio sólido será necesario licuarlo
previamente en BM.
❖ Esterilizar a 121C x 15’ a 15 lb/pulg2.
❖ Comprobar esterilidad en estufa a 37C x 24 horas.
❖ Al final el medio queda listo para su empleo, se colocará en bolsas plásticas de polietileno (primer uso) y
se almacenará en la refrigeradora a temperatura de 4ºC, a fin de evitar deterioro por deshidratación.
❖ En algunos casos, dependiendo de su naturaleza podrán conservase al ambiente.

V. RESULTADOS:

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PROTOCOLO
Esquematice y dibuje los pasos para la preparación de un medio de cultivo, esterilización y almacenamiento.

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PREGUNTAS

1. ¿Considera importante la medida de pH durante la preparación de un medio de cultivo? ¿Por qué?

Rpta.:……................................................................................................................................................................
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2. Mencione y describa procedimientos de esterilización:

Rpta.:……................................................................................................................................................................
……………..............................................................................................................................................................
……………..............................................................................................................................................................
……………..............................................................................................................................................................

3. En qué caso debe utilizarse la filtración como medio de esterilizar un producto:

Rpta.:……................................................................................................................................................................
……………..............................................................................................................................................................
……………..............................................................................................................................................................
……………..............................................................................................................................................................

4. Busca información sobre la obtención y la estructura química del agar ¿A partir de qué algas se obtiene?
Rpta.:……................................................................................................................................................................
……………..............................................................................................................................................................
……………..............................................................................................................................................................
……………..............................................................................................................................................................

5. Diga usted cuál es el tiempo, temperatura y presión que suele utilizarse para esterilizar, haciendo uso de
autoclave. Fundamente: ¿Por qué se utiliza estos parámetros?
Rpta.:……................................................................................................................................................................
……………..............................................................................................................................................................
……………..............................................................................................................................................................

6. Mencione qué tipos de bacterias pueden crecer en los siguientes medios de cultivo, y por qué:
AGAR SANGRE:.....................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................................

AGAR CHOCOLATE: ...........................................................................................................................................

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AGAR TCBS: ..........................................................................................................................................................

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AGAR MAC CONKEY: .........................................................................................................................................
……………..............................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................................

AGAR MANITOL SALADO: ................................................................................................................................

……………..............................................................................................................................................................
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AGAR BAIRD PARKER: ……………………………………………………………………………………….

……………..............................................................................................................................................................
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AGAR TSI: ……………………………………………………………………………………………………….

……………..............................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................................

AGAR LÖWENSTEIN-JENSEN: ……………………………………………………………………………….

……………………………………………………………………………………………………………………..
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AGAR CITRATO DE SIMMONS: ………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………..
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AGAR CEREBRO CORAZÓN: ………………………………………………………………………………….

……………………………………………………………………………………………………………………..
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7. Busca en internet al menos dos medios de cultivo cromogénico ¿Para qué se utilizan? ¿Qué permiten
diferenciar? ¿Cómo crece cada microorganismo en dicho agar?
Rpta.:........................................................................................................................................................................
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PRÁCTICA N° 05
MÉTODOS DE SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO

I. GENERALIDADES
Para realizar el estudio de las bacterias es necesario recuperarlas del hábitat natural donde se encuentran y
hacer que proliferen en medios artificiales, que les proporcionen sus requerimientos nutricionales. Este
procedimiento se le conoce como cultivo bacteriano in vitro.
Las bacterias para su metabolismo necesitan donadores y aceptores de hidrógeno, fuentes de carbono, fuentes
de nitrógeno y minerales. Además del uso de un medio nutritivo adecuado para el cultivo bacteriano, es
necesario considerar factores ambientales tales como la temperatura, pH, humedad relativa y atmósfera de
incubación.
Los métodos de siembra de bacterias en medios de cultivo están directamente relacionados con la
consistencia de los mismos. Estos pueden ser líquidos (pruebas bioquímicas y medios de enriquecimiento),
semisólidos (pruebas de motilidad de cepas), sólidos (pruebas bioquímicas, conservación de cepas, pruebas
de susceptibilidad a quimioterapéuticos o realizar aislamientos en cultivo puro).
Medios Sólidos para Conservación de Cepas: el medio es envasado en tubos y se permite su solidificación
de manera inclinada de tal manera que se logre una superficie (Fig. 1). El uso de tubos con tapón de baquelita
disminuye la deshidratación del medio.

Fig. 1. Medio de cultivo envasado en tubo y salificado de manera

inclinada para realizar la siembra del cultivo bacteriano a
conservar.
Medios Sólidos para Pruebas de Susceptibilidad a Quimioterapéuticos: el medio es envasado en cajas de
Petri y la inoculación se hace por medio de estrías continuas en toda la superficie por medio del asa o por
medio de un hisopo (Fig. 2).

Fig. 2. Medio de cultivo solido en caja Petri, la superficie debe ser lisa y el nivel de llenado debe
estar parejo, (b). Inoculación de la cepa bacteriana para realizar la prueba de sensibilidad.

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Medios Sólidos para el Aislamiento en Cultivo Puro: el medio para cultivo bacteriano se envasa en cajas
de Petri, con el objetivo es obtener un crecimiento uniforme de colonias bacterianas, es decir, “colonias
puras”, libres de otros gérmenes contaminantes, con el fin de estudiar e identificar la especie bacteriana. La
inoculación se realiza con el asa graduada (Fig. 3).

Fig. 3. (a) Distribución del medio de cultivo en cuadrantes envasado en caja Petri para el
aislamiento bacteriológico (b) modo de sembrado con el asa bacteriológica y el sentido de
la dilución.
El estudio de la morfología de las colonias es de gran importancia debido a que gracias a ésta puede iniciarse
una identificación preliminar de los microorganismos aislados. Las colonias bacterianas presentan
características morfológicas muy variadas, mismas que son constantes para cada especie de bacterias en
idénticas condiciones de cultivo. Estas características pueden modificarse cuando factores tales como la
humedad relativa, medio de cultivo, temperatura, atmósfera de incubación varían.
La descripción de las colonias bacterianas debe realizarse cuando éstas se encuentran separadas unas de otras
en el medio de cultivo, tomando en cuenta las siguientes características: tamaño, color, superficie, borde,
opacidad, elevación, estructura interna.
Las características de la superficie, borde, opacidad, elevación y estructura interna están sujetas a la
interpretación del observador. Para describirlas es necesario el uso de un microscopio estereoscópico, por lo
que su valor descriptivo es menos relevante (ver Anexo 3). De acuerdo a estos criterios, las colonias pueden
clasificarse de la siguiente forma:
- Superficie: lisas, rugosas.
- Estructura interna: mucoide, granular, filamentosa.
- Opacidad: translúcidas, opacas, brillantes.
- Borde: enteras, onduladas, lobuladas, erizadas, filamentosas.
- Elevación: umbilicales, difusas, planas, convexas.
Otro dato útil en la identificación preliminar de colonias bacterianas es la producción de hemolisinas. Estas
se ponen de manifiesto en medios de cultivo adicionados con sangre, tales como el agar sangre y el caldo
sangre. En el agar sangre la producción de hemolisinas conduce a la formación de un halo de lisis de
eritrocitos alrededor de las colonias. Si dicho halo es transparente se interpreta como hemólisis completa
(hemolisis β) mientras que si el halo es de color gris verdoso se trata entonces de hemólisis incompleta
(hemolisis α).
Al hacer la identificación de las colonias bacterianas aisladas no siempre será necesario detallar todas las
características morfológicas mencionadas; generalmente se toman en cuenta aquellas que son relevantes.
II. OBJETIVO
• Analizar las diferentes técnicas de siembra para el cultivo de bacterias in vitro, utilizando medios de
cultivos según su utilidad y describir la morfología colonial.
• Describir la importancia del cultivo de bacterias in vitro.
• Identificar las condiciones necesarias para el cultivo in vitro de las bacterias.
• Realizar las técnicas de siembra en medios de cultivo líquidos semisólidos y sólidos.
• Analizar la utilidad diagnóstica de la morfología colonial bacteriana, y categorizar con base en las
siguientes características: tamaño, color de la colonia, pigmentación de medio, estructura interna, borde y
hemólisis.

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III. MATERIALES
- Asa bacteriológica
- Asa de Driglasky
- Papel secante
- Marcador permanente
- Mechero
- Gradilla
- Placas Petri
- Estufa bacteriológica a 37 ºC (temperatura constante).
- Cultivo microbiano
- Medios de cultivo (sólido y líquido)

IV. PROCEDIMIENTO
A. Siembra en estría:
1. Rotular la placa en la que se vaya a realizar la siembra por la parte inferior. Mantenerla cerrada boca
abajo, junto con el resto de material a utilizar en las inmediaciones de la llama.
2. Esterilizar el asa de siembra calentándola al rojo vivo con la llama. Esperar a que se enfríe, sin alejar
de la zona de esterilidad, sujetándola con la mano dominante.
3. Si la muestra procede de otra placa Petri, tomar una colonia con el asa. Si la muestra procede de un
tubo con medio líquido, abrir el tubo sujetando el tapón con el dedo meñique de la mano dominante
(en la que se sigue sosteniendo el asa), flamear la boquilla del tubo, introducir el asa sumergiéndola en
el medio, sacar el asa y cerrar el tubo.
4. Abrir la placa cogiéndola con la mano no dominante. Posar el asa de siembra con el inóculo y deslizar
por la superficie con un movimiento en zigzag, cubriendo alrededor de una tercio de la misma (Fig. 3).
5. Esterilizar el asa en la llama y dejar enfriar.
6. Girar la placa Petri 90°. Tocar con el asa el final de la superficie sembrada y deslizar de nuevo con un
movimiento en zigzag hasta cubrir otro tercio de la superficie.
7. Repetir punto 5 y 6, si desea, realizar una cuarta estría repitiendo los pasos 5 y 6 nuevamente.
8. Esterilizar el asa. Cerrar la placa e incubarla.
B. Siembra por extensión en superficie:
1. Rotular las placas a sembrar por la parte inferior.
2. Ajustar el volumen de la micropipeta (0.1 mL)
3. Poner una punta estéril a la micropipeta.
4. Abrir el recipiente que contenga la muestra. Si es de vidrio, flamear la boquilla. Si es un tubo,
mantener el tapón sujeto con el dedo meñique de la mano con la que se está sujetando la micropipeta.
5. Introducir la punta de la pipeta en el recipiente y tomar la muestra. Se debe tener cuidado de no tocar
los bordes del recipiente con la pipeta para no contaminarla y coger el volumen de manera adecuada.
6. Tomar la placa Petri y verter el líquido tomado con la micropipeta sobre su superficie.
7. Esterilizar el asa Drigalsky, para ello sumergir en alcohol preparado al 70%, flamear y dejar enfriar al
aire.
8. Posar el asa sobre la superficie de la placa y extender la muestra hasta que todo el líquido sea
absorbido. Tapar la placa.
9. Volver a esterilizar el asa.
10. Incubar las placas invertidas.
C. Siembra en por incorporación:
1. Rotular la placa que se vaya a sembrar por la superficie inferior.
2. Preparar un tubo con aproximadamente 20 mL de medio de cultivo a 45°C (agar)
3. Abrir la pipeta cerca de la llama, por el lado opuesto a la punta y sacarla del envoltorio. No se debe
tocar la parte que va a entrar en contacto con la muestra.
4. Abrir el tubo con la muestra, sujetando el tapón con el dedo meñique y flamear la boquilla.
5. Introducir la pipeta en el tubo y tomar 1 mL de muestra.
6. Cerrar el tubo y dejarlo en la gradilla.
7. Coger el tubo con el medio de cultivo, introducir la pipeta y resuspender la muestra.
8. Verter el contenido del tubo en una placa de cultivo estéril y dejar solidificar en reposo en las
inmediaciones de la llama.
9. Una vez solidificado, incubar la placa en la estufa.

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D. Siembra en tubo en medio sólido inclinado:

1. Colocar los tubos que se vayan a sembrar en una gradilla y rotularlos.
2. Esterilizar el asa de siembra acercándola a la llama del mechero hasta la incandescencia del filamento.
Mantener el asa en las inmediaciones de la llama para mantener la esterilidad y esperar a que se enfríe.
3. Sostener con la mano no dominante el tubo o la placa en la que se encuentra la muestra de bacteria
que se va a sembrar. En caso de que sea una placa, abrir la tapa. En caso de que sea un tubo, quitar el
tapón con el dedo meñique de la mano dominante (en la que se encuentra el asa de siembra),
manteniéndolo cerca de la llama. La parte inferior del tapón, la que está en contacto con el interior del
tubo, deberá mirar hacia abajo para evitar contaminaciones y no tocar ninguna superficie (palma de la
mano)
4. Flamear ligeramente la boca del tubo, introducir el asa y coger el inóculo.
5. Sacar el asa de siembra del tubo evitando tocar las paredes del mismo.
6. Flamear la boca del tubo, cerrarlo y dejarlo en la gradilla.
7. Coger el tubo que se ha rotulado en el paso 1 para su siembra con el microorganismo. Abrirlo como en
el paso 3 y flamear ligeramente la boca del mismo.
8. Introducir el asa por la parte del bisel hasta el extremo inferior del mismo, depositar el inóculo sobre
el agua de condensación que pudiera haber e ir deslizando el asa de siembra hacia la zona superior
haciendo un zigzag hasta cubrir toda la superficie.
9. Flamear la boca del tubo, cerrarlo y dejarlo en la gradilla.
10. Esterilizar el asa de siembra con el mechero.
11. Incubar los tubos.
E. Siembra en medio líquido:
1. Seguir los pasos del 1 al 7 del procedimiento anterior.
2. Introducir el asa con el inóculo en el medio y agitarla dentro, o tomar el inóculo con la pipeta y
resuspender el contenido en el medio de cultivo.
3. Flamear la boca del tubo, cerrarlo y dejarlo en la gradilla
4. Esterilizar el asa de siembra.
5. Incubar los tubos en la estufa.
V. RESULTADOS
Esquematice

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VI. CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué se debe trabajar cerca del mechero?
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2. ¿Qué es un cultivo puro?
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3. ¿Qué estudios se realizan aislando un microorganismo?
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4. ¿Qué sucede si se recolecta una colonia bacteriana con el asa caliente?
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ANEXOS

Anexo 1. Técnicas de siembra en placa

Anexo 1. (a) Inicio de la inoculación y distribución de la muestra con asa bacteriológica, (b) y (c) distribución de
los cuadrantes 2 y 3 se toca una o dos estrías del cuadrante anterior (d) el cuarto cuadrante se toca una o
dos estrías del tercer cuadrante y se hace la distribución con estrías separadas con la finalidad de obtener
colonias aisladas. Terminada la distribución en cada cuadrante se flamea el asa. Nótese que el
procedimiento es en sentido a las manecillas del reloj.

Anexo 2. Técnica de sembrado en tubo

Anexo 2. (a) Se flamea el asa bacteriológica. (b) Se enfría y se recolecta la muestra. (c) Se introduce en el tubo con
medio líquido y se gira el asa para que se desprenda la muestra. (d) Se cierra el tubo y se flamea el asa. El
proceso se realiza cerca de la flama del mechero.

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Anexo 3. Morfología de las colonias bacterianas

Anexo 3. Características morfología de las colonias bacterianas en cultivos primarios (Stanchi N. O., et al 2007).

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