1223 Val Métodos Alternativos

DocId: GUID-D3D4C54C-B00B-4720-9846-F2A4F4589838_3_es-ES
No Distribuir Fecha Oficial: Oficial desde 01-may-2018 Tipo de Documento: Capítulos Generales @2023 USPC
DOI Ref: c237c DOI: https://doi.org/10.31003/USPNF_M99943_03_02
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á1223ñ VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

ALTERNATIVOS
INTRODUCCIÓN
Este capítulo provee una guía sobre la selección, la evaluación y el uso de métodos microbiológicos como alternativas a los
métodos farmacopeicos. A fin de implementar adecuadamente los métodos alternativos, se deben considerar diversos factores
importantes antes de seleccionar la tecnología analítica y de calificar dicho método con el producto real. Dichos factores
incluyen, entre otros, la identificación de metodología alternativa adecuada, el desarrollo de especificaciones del usuario para
la selección de equipos, la demostración de la aplicabilidad del método como reemplazo de un método farmacopeico estándar, y
la calificación del método en el laboratorio.
Este capítulo abarca:
• Requisitos del usuario
○ Calificación del instrumento
○ Validación de tecnologías alternativas
○ Aptitud del método
• Las limitaciones en el uso de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) como señal estándar para métodos microbiológicos.
• Cuatro opciones novedosas para demostrar la equivalencia
○ Procedimientos aceptables
l
○ Equivalencia del desempeño
○ Equivalencia de los resultados
○ Equivalencia de las decisiones
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• Aplicación del concepto de no inferioridad a la validación del método
• Guía sobre métodos estadísticos que pueden emplearse en la validación del método
Al final de este capítulo se incluye un glosario de los términos utilizados.
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Los métodos microbiológicos, distintos a los métodos de identificación microbiana y de tipificación de cepas (tratados en
el capítulo Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas á1113ñ), descritas en el compendio caen en dos
categorías generales:
1. Métodos cualitativos (no enumerativos) que se usan para evaluar la calidad microbiológica general de los artículos
farmacopeicos. Esta categoría incluye valoraciones destinadas a demostrar la presencia o ausencia de microorganismos
en un artículo farmacopeico.
2. Métodos cuantitativos que producen un resultado numérico (enumerativo) en términos del contenido microbiano de un
O
artículo farmacopeico.
Existen factores analíticos inherentes que deben tenerse en cuenta al implementar métodos microbiológicos y en la
comparación de un método alternativo candidato con un método farmacopeico existente. Con respecto a (“la ausencia de”)
análisis cualitativo, es crítico considerar que en microbiología, la determinación de la “no presencia de microorganismos” no
significa en términos absolutos que en realidad haya cero células presentes en el artículo farmacopeico. Un resultado de
“ausencia de crecimiento” en un método farmacopeico vigente se interpreta adecuadamente como “no se detectó crecimiento
en la muestra de prueba del artículo farmacopeico en las condiciones especificadas”.
Nunca se han establecido cuantitativamente los límites reales de detección de los métodos microbiológicos farmacopeicos, y
se entiende que son muchas las variables que pueden afectar la recuperación de microorganismos. Estas variables incluyen la
selección del medio de crecimiento, las condiciones de incubación, los requisitos nutricionales de los microorganismos que
pudieran estar presentes, la condición física de los microorganismos y las características del artículo farmacopeico en análisis.
Los estudios sobre la recuperación de microorganismos de agua potable y ambiental han demostrado que los métodos
tradicionales de recuento en placa que informan estimaciones de recuentos celulares como unidades formadoras de colonias
(ufc) pueden recuperar 0,1%–1% de las células microbianas reales presentes en una muestra (1), en comparación con los
métodos alternativos que usan citometría de flujo y que, por tanto, producen una señal distinta (recuento celular). La presencia
de un número mayor de células determinadas por medio de un método alternativo que se basa en una señal distinta a las ufc
no se ha correlacionado con un mayor riesgo para el paciente ni con la probabilidad de una mayor presencia de patógenos
cuando existe un registro de seguridad establecido. Estos resultados indican que en algunos tipos de muestras, la media estimada
para el recuento celular que se registra usando una valoración farmacopeica basada en crecimiento puede dar como resultado
un valor de media estimada de recuento celular muy diferente al derivado de un método microbiológico alternativo que se
base en una señal distinta a las ufc. Asimismo, se debe considerar que en microbiología analítica, el concepto de resultados
falso positivo o falso negativo es difícil desde el punto de vista científico y conceptual. Por ejemplo, no sería apropiado considerar
en una comparación entre un método farmacopeico estándar y un método alternativo candidato que un resultado negativo
obtenido con el método estándar signifique que los resultados positivos observados en el método alternativo sean falsos
positivos. Es una característica normal de un método convencional basado en crecimiento que recupere adecuadamente algunas
especies y que no pueda recuperar otras. Aunque no es necesario para un método alternativo y para el método convencional
generar una correspondencia en términos del resultado, lo que es importante es que el método candidato sea capaz de permitir
al microbiólogo tomar una decisión equivalente con respecto a la calidad del producto de manera consistente.
Es extremadamente importante en la aplicación de este capítulo que los usuarios tomen en cuenta que la microbiología es
una ciencia logarítmica. Aunque es posible distinguir entre 100 y 1000 ufc (una diferencia de 1 log10), puede no ser posible
distinguir diferencias menores (menos de 0,3–0,5 log10). La variabilidad inherente de estos métodos es sustancialmente mayor
https://online.uspnf.com/uspnf/document/4_GUID-D3D4C54C-B00B-4720-9846-F2A4F4589838_3_es-ES 1/15
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que la de los métodos químicos analíticos. Esta variabilidad analítica inherente siempre debe considerarse durante la selección,
el desarrollo y la validación de métodos alternativos. La expectativa de un grado de concordancia entre los métodos
microbiológicos alternativos y los métodos tradicionales basados en crecimiento más allá de lo que es técnicamente factible
podría complicar la implementación de tecnologías analíticas novedosas independientemente de su modo específico de análisis.
En microbiología no es posible lograr el mismo nivel de caracterización (variabilidad del método) de los métodos químicos
modernos (p.ej., cromatografía líquida de alta resolución con una precisión de desviación estándar relativa de 1%–2%) . Es
razonable considerar que el nivel típico de precisión por lo general estará en el orden de una desviación estándar relativa de
15%–35%, aunque los resultados fuera de este intervalo en los extremos superior e inferior son ciertamente posibles. Asimismo,
la enorme cantidad y diversidad de microorganismos potenciales así como la variabilidad inherente de niveles de actividad
metabólica en la naturaleza pueden complicar la recuperación. No se debe pensar que la disponibilidad de nuevos métodos
microbiológicos alternativos, que en algunos casos pueden recuperar recuentos celulares mayores que los típicamente
observados usando métodos farmacopeicos existentes, significa nuevos riesgos para los pacientes que no habían sido
reconocidos con anterioridad.
Perspectiva de la USP sobre la Implementación de Métodos o Procedimientos Alternativos

La Farmacopea de los EE.UU. (USP) ha provisto desde hace mucho tiempo mecanismos para la implementación de métodos o
procedimientos alternativos de valoración para analizar los artículos farmacopeicos. Las Advertencias y Requisitos Generales,
6.30 Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados indica que, “Se pueden usar métodos y/o procedimientos alternativos
que proporcionen alguna ventaja en cuanto a exactitud, sensibilidad, precisión, selectividad o adaptabilidad a la
automatización o a la reducción de datos computarizados o en otras circunstancias especiales.” Esta declaración permite al
usuario libertad con respecto a la decisión de usar un procedimiento alternativo para la liberación habitual del producto, siempre
que se preste atención técnica y científica apropiada a la selección, calificación e implementación del método. Cuando se ha
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demostrado que un producto es seguro para uso amplio al momento de su liberación o cuando se ha controlado usando los
métodos vigentes, la implementación de un método alternativo que puede estar bien correlacionado con el método existente
debe ser sencilla.
ia
Métodos y Procedimientos USP como Pruebas de Arbitraje
Todos los métodos y procedimientos descritos en los capítulos generales USP sobre pruebas microbiológicas, con una
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numeración menor de á1000ñ, están destinados como pruebas de arbitraje para cualquier producto comercializado legalmente
en los Estados Unidos. Esto significa que, en caso de cualquier tipo de disputa, solo el resultado obtenido usando el método o
procedimiento publicado en la USP será concluyente. Por ende, los métodos o procedimientos alternativos implementados y
calificados por un usuario no servirán como reemplazo legal del método oficial USP, que continuará sirviendo como prueba de
arbitraje en caso de disputa.
Consideraciones Generales Con Respecto a las Valoraciones de Control de Calidad para la

O
Liberación del Producto

Aunque los métodos y procedimientos descritos en los capítulos generales USP están destinados como métodos de prueba
de arbitraje oficiales, se reconoce que dichos sistemas pueden no funcionar sin modificación de manera óptima como pruebas
de control de calidad para artículos farmacopeicos específicos. Los métodos oficiales USP requerirán evaluaciones para
determinar su aptitud de uso al aplicarlos a productos específicos y dichas evaluaciones deberán llevarse a cabo teniendo en
cuenta los conocimientos específicos que posea el usuario acerca del producto. Los procedimientos para demostrar la aptitud
de este método (verificación; inhibición/mejoramiento) se proveen en los capítulos de pruebas farmacopeicas pertinentes. Por
ejemplo, algunos artículos farmacopeicos pueden tener propiedades antimicrobianas inherentes que de no ser modificadas (o
neutralizadas), podrían afectar de manera adversa la aptitud de un método o procedimiento farmacopeico dado. Cuando dichos
métodos o procedimientos se incluyen en las presentaciones reglamentarias y el producto resulta aprobado, estos se usarán
como pruebas de liberación del producto y pruebas de vida útil.
Capítulos Armonizados
Algunos métodos o procedimientos microbiológicos de la USP contienen una declaración de que han sido armonizados con
métodos o procedimientos correspondientes encontrados en la Farmacopea Europea y la Farmacopea Japonesa. En los capítulos
que contienen esta declaración, el texto que describe el método o el procedimiento se considera intercambiable (para
información adicional, ver Armonización Farmacopeica á1196ñ). Si se lleva a cabo un método o procedimiento farmacopeico
usando texto armonizado tal como se encuentre redactado en la USP, la Farmacopea Europea o la Farmacopea Japonesa, se
considera legalmente intercambiable. Sin embargo, la implementación de un método alternativo como prueba de control de
calidad para reemplazar un método descrito en la USP, no significa que dicho método o procedimiento sería intercambiable
desde la perspectiva de todas las jurisdicciones, a menos que cumpla con los criterios para métodos alternativos conforme se
especifiquen en la otra farmacopea.
Presentación de Métodos o Procedimientos Alternativos ante la USP

Las Advertencias y Requisitos Generales, 6.30 Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados estipulan que los métodos
alternativos deben ser presentados ante la USP para su evaluación en caso de que una organización desee que se tenga en
cuenta el método alternativo para su inclusión como método farmacopeico. Esta oportunidad de promover análisis
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microbiológicos a menudo ignorada por las partes interesadas de la USP. La presentación de métodos o procedimientos
alternativos permite a la USP considerar cualquier método como una adición o reemplazo de un método o procedimiento
estándar existente. La presentación de un método alternativo debe incluir detalles completos analíticos y del equipo, así como
datos analíticos detallados de las pruebas experimentales de calificación pertinentes.
Para que cualquier método o procedimiento sea considerado como reemplazo o método de arbitraje adicional, no debe
tratarse de un método o procedimiento patentado con reactivos o instrumentación disponible de una sola fuente. Asimismo,
cualquier método candidato de reemplazo o adicional debe tener una amplia aplicabilidad, ser adecuado para uso de rutina y
debe ser compatible con un espectro amplio de artículos farmacopeicos pertinentes.
Capítulos USP Adicionales Relacionados con la Implementación de Métodos Microbiológicos

Alternativos
Diversos capítulos de información general USP proveen información habitual relacionada con la implementación de
métodos y procedimientos alternativos. El capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos á1225ñ provee información
detallada sobre presentaciones de métodos alternativos para los compendios, así como una guía general sobre validación y la
evaluación de características de desempeño analítico. El capítulo Validación de Recuperación Microbiana de Artículos Farmacopeicos
á1227ñ provee información útil con respecto a la validación de métodos usados para la recuperación de microorganismos
viables a partir de artículos farmacopeicos (neutralización de propiedades antimicrobianas de los artículos). El capítulo á1113ñ
provee información sobre la calificación de métodos de identificación microbiana. Finalmente, el capítulo Calificación de
Instrumentos Analíticos á1058ñ provee información sobre la calificación de los equipos analíticos.
Aunque el capítulo Análisis de Valoraciones Biológicas á1034ñ está centrado principalmente en la determinación de la potencia
del producto usando valoraciones biológicas, también trata principios fundamentales con respecto a varianza, error y aspectos
biométricos que pueden proveer información para aquellos que se encuentran desarrollando y validando métodos o
l
procedimientos microbiológicos alternativos.
ia
Información y Reglamentos Adicionales Relacionados con el Uso de Métodos Alternativos
En los reglamentos de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes de la U.S. Food and Drug Administration o FDA
(Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU.), que aparecen en el título 21 del CFR, Parte 211.194, se describen
los requisitos para métodos de prueba usados para evaluar el cumplimiento de los artículos farmacéuticos con las
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especificaciones aprobadas. Los reglamentos indican que los métodos de prueba deben tener capacidad adecuada con
respecto a exactitud y confiabilidad. Esta subsección de los reglamentos también reconoce el fundamento legal de las normas
de la USP y del Formulario Nacional (NF) y aclara que es responsabilidad del usuario validar los métodos o procedimientos que
difieran de aquellos estandarizados en dichos compendios.
El documento Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology [Q2(R1)] (Validación de Procedimientos Analíticos:
Texto y Metodología [Q2(R1)]) de la International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use o ICH (Conferencia Internacional sobre Armonización de Requisitos Técnicos para el Registro
O
de Productos Farmacéuticos para Uso Humano) también puede ser una referencia útil para el desarrollo y la validación de
métodos o procedimientos alternativos. Este documento de la ICH provee información útil sobre la presentación de
procedimientos analíticos junto con solicitudes de registro de producto presentadas en los Estados Unidos, así como en Japón y
Europa.
REQUISITOS PARA EL USUARIO
Es esencial determinar los requisitos técnicos precisos necesarios para un método microbiológico alternativo antes de poder
seleccionar la tecnología y el equipo apropiados que cumplirán los requisitos pertinentes de la valoración. Por lo tanto, se sugiere
que las organizaciones que deseen desarrollar y validar un método alternativo candidato elaboren un documento de
especificaciones sobre requisitos para el usuario (URS, por sus siglas en inglés). Este documento debe incluir todas las funciones
críticas de la tecnología, los requisitos críticos de interfase del usuario, los requisitos de espacio, ambientales, operativos, y todas
las demás características importantes de un método alternativo para el uso previsto. Estos requisitos serán específicos para la
compañía u organización, así como para el uso previsto del método alternativo, por lo que los requisitos deben ser generados
por el usuario.
Al generar un documento de especificaciones sobre requisitos para el usuario, se deben considerar tres componentes
independientes del método de validación microbiológica alternativo:
1. Calificación del instrumento. La mayoría de los métodos microbiológicos alternativos dependerán del equipo específico.
Este equipo analítico está sujeto a los requisitos estándar de calificación de instrumentos de la industria (ver el capítulo
á1058ñ para más información).
2. Validación de tecnologías alternativas. La justificación básica para usar una metodología alternativa es mejorar en algún
aspecto la tecnología existente del método farmacopeico vigente sin sacrificar características esenciales de dicha
tecnología (p.ej., recuento en placa y filtración por membrana). La tecnología vigente para los métodos microbiológicos
farmacopeicos consiste en la detección del crecimiento de microorganismos viables en (o dentro) de un medio nutritivo.
La tecnología alternativa debe ser al menos equivalente a la tecnología vigente en términos de desempeño para el uso
previsto. La mayor parte del soporte técnico para equivalencia puede provenir de bibliografía revisada por expertos en
el campo o de una presentación reglamentaria previa (p.ej., un proveedor presentó el Archivo de Fármaco Maestro ante
la FDA, o una presentación previa de una compañía sobre esta tecnología), pero esto debe confirmarse según sea
adecuado para el uso previsto.
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3. Aptitud del método. Esta consideración debe tratar tanto la aptitud de la tecnología para la prueba específica y la falta de
inhibición del producto como el mejoramiento de los resultados de la prueba.
A. Aptitud de la tecnología para la prueba específica. Muchas pruebas microbiológicas farmacopeicas exigen
requisitos de prueba. Un ejemplo de esto serían planes de muestra que constan de la cantidad de material que se
va a analizar (p.ej., 10 g o 20 unidades de un volumen específico). Debido a que los resultados de prueba se usan
con frecuencia para determinar el cumplimiento con las especificaciones del producto terminado, y las
especificaciones dependen del volumen o cantidad de muestra, la tecnología alternativa debe ser capaz de
satisfacer los requisitos de volumen de muestra conforme a lo requerido en el método de prueba general. No se
recomienda el uso de un volumen o tamaño de muestra menor y esto requeriría ser justificado cabalmente por el
usuario o para cada caso. La tecnología alternativa se considera adecuada si puede cumplir con todos los
parámetros críticos de la prueba farmacopeica.
B. Inhibición y mejoramiento. Algunos productos específicos pueden interferir o mejorar la señal de diversas
tecnologías de medición para la señal específica de interés (ver el capítulo á1227ñ). Este componente del método
de validación microbiológica alternativo (es decir, la aptitud) debe demostrarse para cada producto analizado.
Componentes de la Calidad de los Datos

El capítulo de información general á1058ñ describe cuatro componentes diferentes de la calidad de los datos. El componente
más fundamental es la calificación del instrumento; es decir, una demostración de que el instrumento funciona para lo que está
diseñado. El siguiente punto en importancia es la validación del método, que es una demostración de que la tecnología funciona
según lo esperado. Por ejemplo, esta puede ser una demostración de que un método microbiológico alternativo es al menos
adecuado para su papel en el método de prueba como lo fue el recuento en placa tradicional o la recuperación en el caldo
nutritivo. A continuación en importancia se encuentra la inclusión de controles pertinentes en la prueba para demostrar la
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aptitud continua del sistema de prueba. El componente final de la calidad de los datos es el uso de muestras de control de
calidad, una práctica que no se usa comúnmente en la microbiología debido a que los analistas buscan excluir cultivos vivos
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de un área de análisis de producto. Estos componentes diferentes de la calidad de los datos son un aspecto importante a
considerar al validar una prueba microbiológica alternativa a medida que ayudan a darle forma al documento de especificaciones
sobre requisitos para el usuario.
Métodos Microbiológicos Clásicos

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Las ufc se han usado durante aproximadamente 125 años y continúan siendo especificadas como la unidad de recuento
microbiano en todas las monografías USP vigentes. Sin embargo, es importante entender que las ufc siempre han sido una
estimación de los microorganismos presentes, más que un conteo real. La conceptualización de ufc como señal requiere una
comprensión fundamental del proceso de plaqueo de bacterias, levaduras u hongos filamentosos en medios sólidos, así como
el conocimiento de lo que se requiere para producir una colonia individual.
El método de recuento en placa provee una estimación del número de microorganismos presentes basándose en el
O
crecimiento de colonias discretas contables en una placa individual; por lo tanto, el recuento en placa no es un recuento celular
real. Aunque es teóricamente posible para una célula viable individual generar una ufc, es poco probable que naturalmente una
célula individual desarrolle una colonia sobre una placa. La “viabilidad de una célula” se define como la capacidad de
multiplicarse mediante fisión binaria de modo que aparezca una colonia. Para que aparezca una colonia, las células viables
deben encontrar condiciones específicas de medio de crecimiento nutritivo, incubación y tiempo. Sin embargo, las células
individuales son de naturaleza extraña y es mucho más probable que cualquier colonia que crece sobre medios sólidos surja de
un grupo, cadena o masa de células depositadas en conjunto. Entonces, la señal de ufc es propensa a subestimar el número
real de células presentes en una muestra. El grado de subestimación variará dependiendo de la naturaleza del microorganismo y
de la forma en que se haya preparado la muestra.
La señal de ufc también depende completamente de la recuperación de microorganismos de condiciones ambientales, lo
cual produce estrés en la capacidad del organismo para sobrevivir. Es importante tomar en cuenta que todos los organismos
que están fuera de su nicho ambiental preferido presentarán algún grado de estrés. Además, fuera del laboratorio, los
microorganismos en cultivo son menos propensos a encontrarse en la fase de crecimiento exponencial más óptima para su
transferencia a medios microbiológicos para recuperación y crecimiento. En un sentido muy real, la mayoría de los
microorganismos presentes en los artículos farmacopeicos, en ambientes secos y exentos de nutrientes, a temperaturas elevadas,
alta concentración iónica, pHs extremos o en presencia de químicos antimicrobianos, se encuentran severamente estresados y
pueden ser difíciles o imposibles de recuperar. Claramente, estos factores de estrés desempeñan un papel en la anomalía del
recuento en placa mencionada anteriormente. Si las condiciones de crecimiento, nutricionales o de incubación presentes para
los microorganismos no son suficientes para lograr la recuperación y el crecimiento de colonias, la señal puede ser 0 ufc, o no
crecimiento, incluso cuando estén presentes células viables. Estos factores de estrés pueden no ser consideraciones importantes
con los métodos alternativos que no se basan en el crecimiento de los microorganismos y dichos métodos pueden producir
señales a partir de células que no crecerán en medios. La precisión puede verse comprometida aún más cuando los organismos
están presentes en grupos grandes, a menudo asociados con el material orgánico y se rompen en unidades más pequeñas
durante la preparación. En este caso, dependiendo del procesamiento o manipulación de la muestra, un grupo puede
presentarse como una colonia individual o como múltiples colonias. Además, el número de ufc en una placa debe estar dentro
de un intervalo contable, por ejemplo bacterias, 25–250, para un recuento razonablemente confiable.
Por ende, los métodos microbiológicos basados en crecimiento representan una ciencia logarítmica con una señal de
recuento (ufc) la cual es en verdad una estimación más que un recuento celular preciso. Comprender las fortalezas y las
debilidades de las ufc como señal es vital para la validación de un método alternativo que emplee una señal alternativa. Por lo
tanto, las ufc no pueden considerarse como la unidad única de recuento microbiológico.
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Señales de Métodos Microbiológicos Alternativos

Los métodos microbiológicos rápidos o modernos por lo regular producen señales en unidades distintas a las ufc para la
estimación y recuento microbiano. Estas señales a menudo se procesan mediante instrumentos más que por la vía visual. Se
han realizado estudios extensos sobre las capacidades de los diversos métodos que se pueden aplicar a la evaluación microbiana
de artículos farmacopeicos y, en la mayoría de los casos, el usuario prospecto sabrá las características del método y la señal que
produce antes de seleccionar dicho método como una alternativa. Se provee una guía sobre la selección del método en la
sección Validación de Tecnologías Alternativas y en publicaciones científicas revisadas por expertos.
La mayoría de los métodos microbiológicos rápidos son, hasta cierto punto, métodos de recuento celular directo. Por lo
tanto, pueden proveer una estimación de recuento celular mayor que el método de ufc para una muestra dada, dependiendo
de la forma de uso del método y del artículo farmacopeico que esté siendo evaluado.
Algunos métodos alternativos o rápidos detectan y estiman recuentos celulares teniendo como fundamento la actividad
metabólica, lo cual da lugar a una señal que puede medirse de manera instrumental. Algunos ejemplos de estos tipos de señales
incluyen el contenido de ATP, trifosfato de adenosina, (bioluminiscencia), fluorescencia inducida por láser, actividad
enzimática y cambios fisicoquímicos en la composición de un caldo nutritivo o en la fase gaseosa que se encuentra por encima
del caldo.
Los métodos alternativos también pueden basarse en la tinción vital, en donde las células se tiñen o presentan
autofluorescencia (basándose en los componentes de las células) y después se cuentan directamente usando un microscopio u
otros instrumentos. Para aumentar la probabilidad de que solo se cuenten las células vivas, se pueden usar múltiples colorantes,
lo cual puede (1) incrementar la sensibilidad basándose en la función de la membrana celular, (2) mejorar la reacción con ácidos
nucleicos o (3) mejorar la detección de la actividad metabólica.
Existen también métodos basados en ácidos nucleicos que se pueden usar, así como una variedad de otros métodos
fisicoquímicos de análisis que se han utilizado en la microbiología farmacéutica, biofarmacéutica, clínica y de los alimentos.
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Estos métodos pueden enfocar, amplificar, detectar o cuantificar una secuencia de ácidos nucleicos, y es importante entender
el tipo de señal que resulta del método analítico. Además, se deben entender las características fisiológicas del microorganismo
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que dan origen a la señal, lo cual posibilita la enumeración de las células.
CRITERIOS DE ÉXITO
Los métodos alternativos para obtener un recuento celular pueden proveer recuentos celulares mayores o menores que los
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provistos por los métodos farmacopeicos tradicionales durante el análisis de recuento de los artículos farmacopeicos. Sin
embargo, sin importar si los recuentos celulares son mayores o menores con el método alternativo, por lo general es posible
detectar tendencias adversas en comparación con las estimaciones obtenidas usando un método farmacopeico.
Las observaciones de recuentos celulares que difieren de los resultados de ufc no representan una preocupación cuando los
diferentes métodos y sus diferentes señales de presencia celular son equivalentes o no son inferiores a los métodos de arbitraje
en lo que respecta a la evaluación de la seguridad microbiológica de un artículo. Los recuentos celulares más altos no
necesariamente deben considerarse una indicación de un riesgo mayor debido a la variabilidad inherente de los métodos de
crecimiento estándar y a la naturaleza física y química de los artículos farmacopeicos sujetos al análisis. Esto es especialmente
O
cierto en el recuento de microorganismos en artículos que tienen un largo historial de uso seguro y efectivo. En tales casos,
determinar que un artículo contiene un recuento celular mayor que lo previamente conocido no significa un deterioro en su
seguridad.
Con los métodos cualitativos, es decir, que determinan la presencia o ausencia, las comparaciones de resultados falsos
negativos y positivos obtenidos en estudios controlados con los métodos microbiológicos farmacopeico y alternativo pueden
ser una medición de la equivalencia. Existen mejoras disponibles comercialmente para los métodos basados en crecimiento que
permiten la lectura más rápida de colonias en medios sólidos, con un tiempo de incubación sustancialmente menor, en
comparación con la lectura a simple vista. Sin embargo, estos métodos aún requieren el crecimiento de organismos sobre o en
medios de cultivo. Por lo tanto, muchos de estos métodos no son, en el sentido más estricto, diferentes de los métodos
farmacopeicos existentes, sino que son meras mejorías que proveen una detección más rápida de colonias. En la implementación
de estos métodos mejorados para la detección de crecimiento de colonias, únicamente la capacidad de detección del método
requiere de verificación.
TAMAÑO DE LA MUESTRA
Cualquier método de prueba microbiológico alternativo (dentro de su propósito previsto) puede usar cualquier tamaño de
muestra y número de pruebas que sea suficiente para producir una decisión equivalente (o mejor) con respecto a la calidad
microbiológica en comparación con el método de referencia. Puede ser más simple para muchos, si no es para la mayoría de
los métodos alternativos, cumplir con las instrucciones de muestreo que se proveen en el método farmacopeico oficial. Para los
casos en que se utiliza el enfoque de muestreo definido en el método farmacopeico oficial, no se requiere justificación del
tamaño de la muestra.
Estadísticas y Métodos Alternativos

Los intentos para usar estadísticas para comparar los resultados de ufc con las señales que surgen de los métodos de análisis
bioquímicos, fisiológicos o genéticos pueden tener un valor limitado. Debido a las diferencias entre estos métodos, no se puede
esperar que produzcan señales que puedan compararse estadísticamente en términos de los valores medios y la variabilidad.
Por ende, los valores numéricos, provistos como resultados en ufc asociados con los métodos de referencia, por lo regular no
pueden usarse como criterio de aceptación para la evaluación de artículos mediante métodos alternativos candidatos. En su
lugar, es responsabilidad de los usuarios proponer valores, sustentados por bibliografía científica cuando así se requiera, que
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puedan demostrar como apropiados para el método que han seleccionado y validado. Estos pueden llevarse a cabo
independientemente de las normas existentes expresadas en términos de ufc.
CALIFICACIÓN DE INSTRUMENTOS
La calificación de instrumentos debe apegarse, al menos de manera general, a lo tratado en el capítulo á1058ñ. La calificación
de instrumentos para equipos críticos para el funcionamiento de un método microbiológico alternativo implica cuatro fases
distintas:
1. Establecimiento de Especificaciones sobre Requisitos para el Usuario con respecto a los atributos críticos del método, los
cuales deben formalizarse en un documento de especificaciones sobre requisitos para el usuario.
2. Calificación de la instalación—Determinar si se instaló correctamente el instrumento
3. Calificación operativa—Determinar si el instrumento cumple con las especificaciones del fabricante para su correcto
funcionamiento
4. Calificación del desempeño—Determinar si el instrumento cumple con las especificaciones sobre requisitos para el usuario
con respecto al desempeño
VALIDACIÓN DE TECNOLOGÍAS ALTERNATIVAS
Especificación de Requisitos para el Usuario

La preparación del documento de especificaciones sobre requisitos para el usuario debe incluir retroalimentación de todas
l
las partes interesadas para el método de prueba microbiológico. Estas partes interesadas pueden incluir representantes de los
grupos de Microbiología, Calidad, Asuntos Reglamentarios, Operaciones, entre otros. El tiempo empleado en este paso debe
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considerarse una inversión para lograr un entendimiento claro de las necesidades de la compañía antes de comprar el equipo,
lo cual guiará la calificación de desempeño. Como mínimo, este documento debe incluir lo siguiente:
• Propósito y uso previsto (necesidad definida del instrumento)
• Descripción de quien usará el equipo
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• Requisitos operativos (formato de los datos, interfases de usuario y ambiente operativo)
• Limitaciones (cronogramas, tiempos muertos, mantenimiento, niveles de capacidad de los usuarios, compatibilidad del
producto, límite de detección, exactitud y rapidez)
• Ciclo de vida (desarrollo, prueba, transferencia, validación, capacitación y caducidad)
• Capacidad (tiempo de inicio, capacidad de la prueba y rendimiento, y requisitos de trabajo)
• Sustentabilidad (consumibles, calibración, validación y mantenimiento preventivo)
Ver el capítulo á1058ñ para información sobre la calificación de instrumentos analíticos. Los principios descritos en el capítulo
O
á1058ñ por lo general son aplicables a la calificación de instrumentos usados para realizar análisis microbiológicos alternativos.
El usuario puede requerir ajustar las recomendaciones específicas del capítulo á1058ñ a sus especificaciones para la calificación
de instrumentos particulares.
Criterios de Validación
Los parámetros de validación generalmente recomendados para pruebas microbiológicas cualitativas y cuantitativas se
presentan en la Tabla 1. Entre los ejemplos de pruebas cualitativas se encuentran la prueba de esterilidad y la prueba para
determinar la ausencia de microorganismos específicos. Una prueba cuantitativa sería el recuento microbiano. Se debe tomar
en cuenta que la prueba cualitativa es binaria y que por esta razón generalmente no es necesario definir la equivalencia de
unidades de medición, solo la equivalencia del resultado.
Tabla 1. Parámetros de Validación por Tipo de Prueba Microbiológica

Parámetro de Validación Pruebas Cualitativas Pruebas Cuantitativas
Exactitud No Sí
Precisión No Sí
Especificidad Sí Sí
Límite de detección Sí Sí
Límite de cuantificación No Sí
Linealidad No Sí
Intervalo (dinámico) operativo No Sí
Robustez Sí Sí
Repetibilidad Sí Sí
Tolerancia Sí Sí
Equivalencia Sí Sí
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ESPECIFICIDAD
Definición: La especificidad de un método microbiológico cualitativo alternativo se define como su capacidad para detectar
una variedad de microorganismos de desafío específicos de dicha tecnología. La “variedad de microorganismos” puede definirse
como un número limitado de microorganismos que representan un riesgo para el paciente o el producto, de microorganismos
hallados en el ambiente de fabricación y las fallas del producto, microorganismos que son apropiados para medir la efectividad
del método alternativo, y microorganismos que son representativos en términos de atributos morfológicos y fisiológicos
apropiados para el método y el producto.
Demostración: La especificidad se demuestra mediante la recuperación comparable del panel de microorganismos de desafío
en los métodos farmacopeicos y alternativos. El desafío microbiano está por encima del límite de detección o de cuantificación
pero a un nivel que provee una medición de la eficacia de los métodos.
Basado en crecimiento—Agregar cantidades bajas (alrededor de 100 ufc) de cada microorganismo en el panel y llevar a cabo
los métodos farmacopeico y alternativo para demostrar la recuperación del microorganismo.
No basado en crecimiento—Usar controles negativos y positivos adecuados para demostrar que la materia extraña que pudiera
estar en el sistema (p.ej., trifosfato de adenosina extracelular, ADN o factores de inhibición y mejoramiento) no interfiere con
la detección de la variedad definida de microorganismos.
Todos los microorganismos de desafío deben ser recuperados e identificados en métodos basados en crecimiento. En el caso
de los métodos no basados en crecimiento, los microorganismos deben ser recuperados e identificados en la medida de lo
posible.
LÍMITE DE DETECCIÓN
Definición: El límite de detección de un método microbiológico alternativo se define como el número más bajo de
microorganismos en un volumen definido de muestra que puede ser detectado, aunque no necesariamente cuantificado, en
l
las condiciones experimentales declaradas. Esto debe llevarse a cabo con los organismos de control de calidad citados en el
ia
capítulo Pruebas de Eficacia Antimicrobiana á51ñ, Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano
á61ñ, Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos á62ñ, Pruebas para Micoplasmas
á63ñ y Pruebas de Esterilidad á71ñ conforme resulte apropiado para el método alternativo.
Demostración
Método 1
fic
• Inocular una solución diluyente adecuada con un intervalo de diluciones en serie de cada uno de los microorganismos de
desafío, apropiado para el uso previsto del método y la tecnología. En la mayoría de los casos, puede ser suficiente el panel
farmacopeico de prueba de promoción de crecimiento en medios.
• El nivel de inoculación debe ajustarse para obtener un 50% del resultado esperado en las muestras diluidas que presenten
crecimiento en la prueba farmacopeica.
• Realizar las pruebas farmacopeica y alternativa.
• Las pruebas deben repetirse un número suficiente de veces (riesgo alfa estadísticamente significativo: 0,05; riesgo beta:
O
0,20) para ambas pruebas farmacopeica y alternativa.

• Estadística: Usar la prueba de chi cuadrado u otro enfoque apropiado para demostrar la recuperación equivalente de los
microorganismos de desafío.
• Como alternativa, usar el Método 2.
Método 2 (Método del Número más Probable, NMP)
• Crear una serie de diluciones de los organismos de desafío en una solución diluyente adecuada de modo que incluya al
menos el intervalo de 101 ufc a 10−2 ufc (para una serie de diluciones al décimo) o de 5 ufc a 10−1 ufc/volumen de inóculo
(para una serie de diluciones al medio).
• Realizar las pruebas farmacopeica y alternativa con al menos 5 determinaciones repetidas simultáneas de cada dilución a
partir de las series seleccionadas.
• Determinar el número más probable a partir de tres diluciones en serie que provean crecimiento positivo o negativo (o
señal).
• Estadística: Usar la prueba de chi cuadrado u otro enfoque apropiado para demostrar la recuperación equivalente de los
microorganismos de desafío.
ROBUSTEZ
Definición: La capacidad del método para no ser afectado por variaciones pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros
del método, p.ej., volumen de reactivo, tiempo de incubación o temperatura ambiente, representa un indicador de su
confiabilidad durante uso normal. La medición de la robustez no es una comparación entre el método farmacopeico y el
alternativo, sino un componente necesario de la validación del método alternativo de manera que el usuario entienda los límites
de los parámetros operativos del método. El usuario puede confiar en los datos provistos por el fabricante del método de prueba.
TOLERANCIA
Definición: El grado de precisión de los resultados de la prueba obtenidos mediante el análisis de las mismas muestras en
diversas condiciones normales de prueba, tales como el empleo de diferentes analistas (por ejemplo, tres), instrumentos y lotes
de reactivos (el método para la demostración puede seguir las recomendaciones del proveedor de instrumentos o materiales, o
podría basarse únicamente en datos provistos por el fabricante del método).
Para obtener las definiciones de otros parámetros de validación, ver el Glosario.
8
APTITUD DEL MÉTODO
Para cada producto nuevo que se va a analizar usando el método microbiológico alternativo validado, realizar la prueba de
aptitud conforme a lo descrito en los métodos de prueba general (ver los capítulos á51ñ, á61ñ, á62ñ, á63ñ, y á71ñ), usando el
número de unidades y cantidades prescritas y la preparación de la muestra apropiada para el producto, así como la sensibilidad
de la prueba requerida para determinar la ausencia de un efecto del producto que obstruya la señal del método.
La aptitud del método se puede demostrar usando tres pruebas independientes. Para los métodos cuantitativos, solo se
requieren los parámetros de validación de la exactitud y la precisión. Para métodos cualitativos, la recuperación de organismos
de desafío según se indica en el capítulo á62ñ, á71ñ y á1227ñ es suficiente.
Después de que un método alternativo ha demostrado ser equivalente a la prueba farmacopeica con un producto, no es
necesario repetir los parámetros de equivalencia para cada producto nuevo; únicamente es necesario verificar la aptitud del
método para cada producto adicional. Por ejemplo, al emplear un método basado en ácidos nucleicos, con cada producto
nuevo, se debe demostrar que los residuos del producto no interfieren con la concentración, extracción, purificación y
recuperación del ácido nucleico diana, o con la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la sonda química
de detección para la secuencia genética de ácido nucleico ribosómico diana (ARNr).
EQUIVALENCIA
Todas las pruebas microbiológicas se llevan a cabo para permitir tomar decisiones informadas con respecto a la calidad
microbiológica de un producto, materia prima, componente o etapa del proceso. En relación con esto, el propósito de las
pruebas microbiológicas puede ser evaluar la presencia o ausencia de microorganismos (como en la prueba de esterilidad) o
estimar el número de organismos presentes. Los procedimientos tecnológicos mediante los cuales los métodos de prueba
l
evalúan la calidad microbiológica y permiten tomar una decisión sobre la calidad del producto pueden diferir de los
procedimientos basados en crecimiento, típicos de los métodos de referencia. Las unidades de medición (señal) de una
ia
evaluación de calidad microbiológica realizada usando métodos de pruebas microbiológicas alternativos por lo general no serán
ufc, sino que usarán un enfoque distinto para obtener un recuento celular estimado. Por lo tanto, la validación de los métodos
microbiológicos alternativos debe incluir dos componentes: (1) demostración de la equivalencia y (2) calificación del método
analítico y del equipo.
fic
Demostración de la Equivalencia
Las Advertencias y Requisitos Generales, 6.30 Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados indican que se pueden usar
métodos alternativos que proporcionen alguna ventaja en cuanto a exactitud, sensibilidad, precisión, selectividad o
adaptabilidad a la automatización o a la reducción de datos computarizados. Asimismo, estipulan que se pueden implementar
métodos alternativos en otras circunstancias especiales. Dichos métodos alternativos deben ser validados según se describe en
el capítulo á1225ñ y se debe demostrar que producen resultados equivalentes o mejores que el método de referencia para
O
cualquier atributo de calidad dado. Al comparar dos procedimientos de prueba para demostrar el desempeño equivalente o
mejor, se ensambla la evidencia estadística para demostrar la equivalencia o, en términos estadísticos, la no inferioridad. Por
ejemplo, con el recuento microbiano, se puede demostrar equivalencia siempre que no exista una diferencia estadísticamente
significativa entre las dos medias generadas al efectuar el recuento con los métodos farmacopeico y alternativo. Sin embargo,
esto puede no ser posible cuando los dos métodos generan distintas señales. Algunos ejemplos de esta situación son cuando
el método de recuento microbiano emplea tinción vital de células microbianas o la medición de material genómico en lugar
de ufc.
De manera similar, el documento Guidance for Industry Analytical Procedures and Methods Validation: Chemistry, Manufacturing,
and Controls Documentation (Guía para la Industria: Validación de Procedimientos y Métodos Analíticos: Documentación de
Aspectos Químicos, de Fabricación y de Control) de la FDA indica que un procedimiento alternativo validado debe presentarse
únicamente si demuestra un desempeño igual o mejor que el procedimiento analítico reglamentario. Asimismo, la sección
2.7 del documento Test Procedures and Acceptance Criteria for New Drug Substances and New Drug Products: Chemical
Substances (Q6A) (Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptación para Nuevos Fármacos y Nuevos Medicamentos) de la
ICH indica que los procedimientos alternativos son aquellos que pueden usarse para medir un atributo en el momento en que
dicho procedimiento controla la calidad de un fármaco o medicamento a un grado comparable o por encima del método oficial.
Sin embargo, se encuentran disponibles otras opciones para demostrar la equivalencia las cuales se tratan en Demostración de
la Equivalencia.
Demostración de la Equivalencia
Se encuentran disponibles cuatro opciones para establecer la equivalencia de un método analítico alternativo candidato: (1)
procedimientos aceptables (es decir, simplemente cumplir un requisito de desempeño o aceptación mínimo sin necesidad de
demostrar equivalencia con el método farmacopeico); (2) equivalencia del desempeño con el método farmacopeico; (3)
equivalencia de los resultados con el método farmacopeico y (4) equivalencia de decisiones con el método farmacopeico (1).
La Tabla 2 provee una comparación de estas cuatro opciones de equivalencia. Las múltiples opciones de equivalencia reflejan
la diversidad de tecnologías y aplicaciones de las metodologías de pruebas alternativas y pueden verse como un cambio
paradigmático en la sección Demostración de la Equivalencia.
9
Tabla 2. Matriz de Opciones de Equivalencia

Comparación con el Basada en los Resulta-
Método Farmacopeico dos o Conclusión Número
Opción Demostración Oficial Numéricos de Características
1. Procedimientos aceptables Aceptable No Resultados Múltiples
2. Equivalencia del desempeño Equivalente Sí Resultados Múltiple
3. Equivalencia de los resultados Equivalente Sí Resultados Individuales
4. Equivalencia de las decisiones Equivalente Sí Conclusiones Individuales
OPCIÓN 1: PROCEDIMIENTO ACEPTABLE

Esta no es estrictamente una opción de equivalencia que requiere comparación directa entre el método alternativo
candidato y un método farmacopeico oficial. Con esta opción, se puede usar un material de referencia con propiedades
conocidas, tales como un inóculo estándar de un microorganismo específico, una cantidad de genoma bacteriano altamente
purificado, un nivel de ATP, trifosfato de adenosina, u otra señal apropiada. En algunos casos, puede ser necesario que el método
alternativo mida la señal en presencia de la muestra de prueba, con criterios de validación que sean congruentes con la capacidad
de la tecnología, conforme a lo descrito en la bibliografía científica.
OPCIÓN 2: EQUIVALENCIA DEL DESEMPEÑO
l
La equivalencia del desempeño requiere la demostración de resultados equivalentes o mejores con respecto a los criterios
de validación—tales como exactitud, precisión, especificidad, límite de detección, límite de calificación, robustez y tolerancia
ia
—que pueden ser apropiados para el uso previsto del método cualitativo o cuantitativo alternativo. Es posible que el método
alternativo pueda no cumplir con algunos de los parámetros de validación citados en comparación con el método oficial y aún
así ser aceptable debido a las ventajas que presenta. Este puede ser el caso si el método alternativo presenta alguna de las
ventajas indicadas en las Advertencias y Requisitos Generales, 6.30 Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados. Otras
circunstancias especiales incluirían mejoras en el tiempo para obtener un resultado o el costo de correr la prueba. Si un método
fic
alternativo candidato es adecuado para evaluar la calidad del material analizado, aún puede ser aceptable incluso si difiere del
método oficial en uno o más parámetros de validación. Los criterios finales de calificación analítica deben reflejar solo los criterios
que los microbiólogos consideran necesarios para lograr una equivalencia del desempeño.
OPCIÓN 3: EQUIVALENCIA DE LOS RESULTADOS

Cuando se requiere la equivalencia de los resultados, la hipótesis que se va a analizar es que los métodos de prueba
alternativo y farmacopeico provean resultados numéricos equivalentes. Esto contrasta con la evaluación de los parámetros de
O
validación, como se lleva a cabo en la equivalencia del desempeño. Debido a que en microbiología no se puede analizar la
misma muestra, se establece por lo general un intervalo de tolerancia al comparar los dos métodos, en el que se determina que
el método alternativo es numéricamente superior o no inferior. Los informes sobre el uso de métodos alternativos no basados
en crecimiento han demostrado que estos pueden producir estimaciones de recuentos celulares significativamente mayores
que un método de crecimiento que informe resultados en ufc. En este caso, el analista podría usar una curva de calibración que
muestre una correlación entre los dos métodos en el intervalo de especificación del producto.
OPCIÓN 4: EQUIVALENCIA DE LAS DECISIONES

Una equivalencia de las decisiones es similar a la equivalencia de los resultados pero difiere en que no se genera un resultado
numérico; en lugar de eso, se obtiene un resultado de cumple/no cumple. Con este enfoque, la frecuencia de los resultados
positivos y negativos generados no debe ser inferior a la del método farmacopeico. Este requisito de no inferioridad se basa en
el largo historial de calidad de productos analizados y liberados con la prueba de arbitraje farmacopeica. Para los propósitos de
la calificación, se pueden considerar estudios de laboratorio que impliquen la adición de niveles bajos conocidos de
microorganismos. Las secciones siguientes proveen enfoques sugeridos para demostrar que el procedimiento alternativo es
equivalente o mejor que el procedimiento farmacopeico. Los usuarios pueden usar otros métodos válidos para la demostración
de equivalencia con justificación científica de sustento.
Demostración de la Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos Cualitativos Alternativos

Los resultados obtenidos mediante los procedimientos de los capítulos á62ñ, á63ñ y á71ñ son indicadores de la presencia o
ausencia de microorganismos en la muestra analizada. Estas pruebas generan una decisión (p.ej., el artículo farmacopeico pasa o
falla la prueba). Este tipo de datos caben dentro de la categoría de equivalencia de las decisiones según se describe en el
artículo de Estímulo (2). El Enfoque 1 (ver a continuación) se basa en demostrar la equivalencia de las decisiones. El Enfoque 2
(ver a continuación) es una alternativa que convierte los resultados cualitativos en cuantitativos usando el procedimiento de
número más probable. Ambos enfoques usan una hipótesis de no inferioridad (3).
Para demostrar la aceptabilidad del procedimiento alternativo con respecto al procedimiento microbiológico vigente, el
laboratorio debe demostrar que el nuevo procedimiento es tan bueno o mejor que el procedimiento vigente en términos de la
capacidad para detectar la presencia de microorganismos. En general, un enfoque recomendado para comparar el
procedimiento alternativo con el procedimiento farmacopeico es usar una prueba de no inferioridad (unilateral, como en las
pruebas de no inferioridad realizadas en los ensayos clínicos para medicamentos nuevos) (4) en lugar de equivalencia bilateral
10
[como en el caso de la bioequivalencia (5)]. La no inferioridad es un enfoque apropiado por dos razones. Primero, desde la
perspectiva del paciente, es beneficioso para promover un procedimiento alternativo que es potencialmente más sensible que
el procedimiento de arbitraje. Por el contrario, un enfoque bilateral penaliza mejor la recuperación de microorganismos. Para
aquellos que implementen el método alternativo será importante tener en cuenta que deberán evaluar el riesgo relacionado
con el cambio en el procedimiento, debido a que un procedimiento más sensible puede generar más resultados positivos.
Segundo, el procedimiento alternativo tiene beneficios (principalmente, un tiempo reducido para conseguir un resultado) que
lo vuelven preferible sobre el procedimiento farmacopeico, incluso si no es tan sensible, siempre y cuando permita tomar una
decisión sobre calidad con respecto al producto que sea no inferior al método farmacopeico.
ENFOQUE 1: USO DE RESULTADOS DE PRESENCIA Y AUSENCIA

La hipótesis de no inferioridad para este enfoque es que la proporción de muestras que producen una señal para el nuevo
procedimiento (PN) es no mayor que alguna cantidad (Δ > 0) menor que la proporción para el procedimiento farmacopeico
vigente (PC) (6):
Resultado = PN − PC ≥ −Δ
La Δ es el margen de no inferioridad. A menos que el laboratorio requiera un margen más estrecho, usar Δ = 0,20 en los
experimentos descritos anteriormente. Calcular un intervalo de confianza unilateral del 90% para PN − PC (7). Se determina la
no inferioridad si el límite de confianza inferior excede de −0,20. Si el experimento es capaz de concluir a favor de la hipótesis
de no inferioridad, entonces se puede determinar, con un 95% de confianza, que PN ≥ PC − 0,20 al nivel de biocarga estudiado.
Esta evaluación debe realizarse usando tipos de microorganismos seleccionados por el laboratorio como representativos de
los tipos generales de microorganismos encontrados. Las selecciones pueden guiarse por el capítulo á71ñ o los organismos de
l
prueba de aptitud apropiados recuperados del análisis del producto y/o microorganismos que representen aquéllos que pueden
presentar riesgos para los pacientes debido a la vía de administración del producto.
ia
El laboratorio debe realizar una evaluación para determinar si el procedimiento alternativo puede demostrar ser no inferior
al procedimiento microbiológico en términos de sensibilidad según lo medido por la proporción de muestras que entregan un
resultado positivo para recuperación y crecimiento microbiano. En una prueba cualitativa, realizar tres evaluaciones para cada
organismo. La primera usa muestras preparadas mediante dilución en serie para que sean exactamente o alrededor de 100, es
decir, 1 ufc, en la que es probable que no se observe crecimiento (por lo que el procedimiento microbiológico basado en
fic
crecimiento no detectará ninguna señal) para caracterizar la sensibilidad del nuevo procedimiento en este nivel. El segundo usa
muestras de exactamente o alrededor de 102 (100–200 ufc), donde se esperaría que el procedimiento microbiológico detectase
crecimiento a un porcentaje relativamente alto de aproximadamente 75% o mayor, para determinar la aceptabilidad del nuevo
procedimiento. El tercero es una comparación de los dos procedimientos a una carga en la que se esperaría que 50%–75% de
las muestras presentaran crecimiento de colonias [a menudo una dilución en serie hasta alrededor de 101 (10–50 ufc)] para
analizar la hipótesis de no inferioridad según lo descrito anteriormente. En el experimento de no inferioridad para pruebas
microbiológicas cualitativas, se deben analizar un mínimo de 75 muestras en cada procedimiento. El uso de 75 muestras provee
una potencia de aproximadamente 80%. Si el laboratorio determina que es necesaria una mayor potencia estadística dados los
O
requerimientos del análisis para un producto dado, incrementar el número de muestras analizadas a 100 resultará en una
potencia de aproximadamente 90%. Estos procedimientos son apropiados para los propósitos de concluir la no inferioridad si
los dos procedimientos son en realidad sensibles usando Δ = 0,20. Si el laboratorio concluye que su nuevo procedimiento es
menos sensible que el procedimiento farmacopeico, se requerirá un mayor número de muestras para mantener estos niveles
de potencia.
Muestras independientes: Suponer que NA muestras han sido analizadas con el procedimiento alternativo candidato, de las
cuales XA muestras son positivas, y que NC muestras (no las mismas que aquéllas analizadas con el candidato) han sido analizadas
con el procedimiento farmacopeico y que XC muestras son positivas. Calcular lo siguiente:
11
l
ia
fic
donde R es el cociente de las varianzas en las cuales se determina la potencia.
O
Concluir la no inferioridad si Z > zα donde zα es el punto porcentual superior α de una distribución normal estándar.
Muestras apareadas: Suponer que N muestras han sido analizadas mediante los procedimientos candidato alternativo y
farmacopeico. Los resultados pueden mostrarse en una tabla de 2 × 2 (ver la Tabla 3).
Tabla 3. Resultados para Muestras Apareadas

Procedimiento Farmacopeico
Procedimiento Alternativo Positivos Negativos Totales por Fila
Positivos X11 X10 XA
Negativos X01 X00 N − XA
Totales por columna XC N − XC N
Calcular lo siguiente:
Concluir la no inferioridad si Z > zα donde zα es el punto porcentual superior α de una distribución normal estándar.
12
ENFOQUE 2: COMPARAR RESULTADOS DE NÚMERO MÁS PROBABLE

Para la referencia farmacopeica y los procedimientos alternativos, realizar un estudio comparativo de número más probable
usando procedimientos estándar para número más probable para cada una de las N muestras. Idealmente, se usan las mismas
muestras para los dos procedimientos, aunque no es estrictamente necesario.
Para el Enfoque 2, la hipótesis de no inferioridad es
µA − µC ≥ log(R) o antilog(µA − µC) ≥ R
donde µA y µC son las medias en la escala logarítmica para los procedimientos alternativo y farmacopeico, respectivamente.
Muestras independientes: Determinar el número más probable para NA muestras mediante el procedimiento alternativo,
convertir todos los valores a logaritmos y determinar la media de la muestra de los valores logarítmicos (xA) y la varianza de la
muestra de los valores logarítmicos (S2A). De forma similar, determinar xC y S2C a partir de los logaritmos de NC muestras
analizadas con el procedimiento farmacopeico. Calcular lo siguiente:
donde tα, df es el punto porcentual superior α de la distribución t con df grados de libertad y
l
ia
fic
Si se usa un software que solo permite números enteros para grados de libertad (p.ej., Excel), usar interpolación lineal para
obtener el valor t. Concluir la no inferioridad si antilog(Linf) ≥ R.
Datos apareados: Determinar el número más probable para N muestras mediante el procedimiento alternativo y para las
O
mismas N muestras mediante el procedimiento farmacopeico, convertir todos los valores 2N a logaritmos y determinar la media
de la muestra (x) y la varianza (S2) de las diferencias del valor logarítmico alternativo menos el valor logarítmico farmacopeico.
Calcular lo siguiente:
Linf = x − tα,N−1S/√N
donde tα,N−1 es el punto porcentual superior α de la distribución t con N − 1 grados de libertad. Concluir la no inferioridad
si antilog(Linf) ≥ R.
Demostración de la Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos Cuantitativos Alternativos

Una característica clave de algunos procedimientos cuantitativos alternativos es que su señal puede diferir significativamente
de las ufc del procedimiento microbiológico farmacopeico. En consecuencia, la equivalencia, según se entiende comúnmente,
no puede ser demostrada; es decir, se espera que los resultados numéricos difieran en magnitud y unidades. En su lugar, este
capítulo sugiere dos criterios para la verificación de los procedimientos cuantitativos alternativos candidatos:
1. Los resultados obtenidos del procedimiento candidato tienen al menos una precisión aceptable (repetibilidad).
2. Los resultados obtenidos del procedimiento candidato están altamente correlacionados con aquéllos del procedimiento
farmacopeico. Una alta correlación se considera una indicación de que los criterios de aceptación cuantitativos expresados
en ufc pueden calibrarse a criterios en las unidades del procedimiento alternativo.
PRECISIÓN
Preparar un mínimo de seis muestras a un mínimo de dos niveles de biocarga cercanos a los límites de especificación
relevantes para el laboratorio. Correr el procedimiento alternativo candidato para las muestras preparadas.
[NOTA—Esto se usa para corresponderse con las condiciones de repetibilidad; ver el capítulo á1225ñ.]
En cada nivel, determinar la varianza de la muestra (S2) de los logaritmos (log10) de los resultados de la muestra. Calcular lo
siguiente:
13
Donde n es el número de muestras (n ≥ 6) y χ2,05,N−1 es el valor del 5% inferior de una distribución de chi cuadrado con n
−1 grados de libertad. La precisión es aceptable si *UL ≤ σ, donde σ es el coeficiente geométrico porcentual predeterminado
de repetibilidad máxima aceptable, %GCV. (Para valores pequeños, el %GCV será aproximadamente la %RSD.)
Cuanto más grande sea el número de muestras (n) mayor será la probabilidad (potencia, en términos estadísticos) de que
un procedimiento, cuya precisión es en realidad aceptable, generará datos que cumplan con este criterio y que, por ende, se
pueda declarar aceptable. El laboratorio puede usar datos anteriores para determinar un valor de n que cumpla con sus
necesidades.
Ejemplo: Para los datos del procedimiento alternativo de la Tabla 4, calcular lo siguiente:
n = 10
l
S2 = 0,000241 y
ia
fic
= 3,325113, de modo que
UL = 6,06%
Por lo tanto, este procedimiento alternativo tiene una precisión de repetibilidad aceptable siempre que el criterio de éxito σ
previamente especificado haya sido al menos 6,06%.
O
CORRELACIÓN (LINEALIDAD)
Preparar un mínimo de dos muestras en cada uno de cuatro niveles de biocarga diferentes que abarquen el intervalo desde
el límite cercano de calificación hasta un logaritmo por encima del límite de especificación definido en la valoración
farmacopeica estándar con la que se está comparando el método alternativo. Determinar la actividad para todas las muestras
usando los procedimientos alternativo candidato y farmacopeico. Graficar y determinar la correlación entre el logaritmo de los
valores del procedimiento alternativo candidato (y) y el logaritmo de valores del procedimiento farmacopeico (x). La correlación
es aceptable si al menos 0,95 (o R2 al menos 0,9025).
Aunque por lo regular se espera una relación lineal entre dos conjuntos de resultados, puede ser aceptable una relación no
lineal. En el caso de una relación no lineal, usar la correlación Spearman (no paramétrica) en lugar de la correlación Pearson.
Tabla 4
Farmacopeico Alternativo
(ufc) (recuento celular)
70 970
71 965
75 950
92 990
100 1000
105 1051
116 1046
123 1039
127 985
130 1020
La Figura 1 presenta la gráfica de estos datos después de la conversión a logaritmos en base 10. Debido a que R2 no cumple
con el requisito declarado, los resultados de estos dos procedimientos no presentan una correlación suficiente.
14
l
ia
fic
Figura 1.
Los procedimientos alternativos candidatos que pueden ser adecuados para tomar decisiones sobre la calidad microbiológica
de una muestra (como en la Figura 1) pueden no presentar una correlación suficientemente buena con el procedimiento
farmacopeico para cumplir con el requisito de correlación anterior. En tal caso, la otra opción es aplicar el enfoque de
equivalencia de la decisión según se describió anteriormente para pruebas cualitativas. Durante el desarrollo del proceso, el
laboratorio debe determinar una especificación para el método alternativo para que se corresponda con la especificación
O
farmacopeica para el nivel requerido de calidad microbiológica. Por ejemplo, si el nivel requerido de calidad microbiológica es
no más de 102 ufc, cuyo recuento farmacopeico máximo aceptable es 200 ufc, el laboratorio necesitará determinar un criterio
de aceptación para el procedimiento alternativo candidato que se corresponderá con el valor partiendo de la perspectiva de
tomar una decisión con respecto a la calidad microbiana. Por tanto, el experimento de validación para confirmar esta opción
procede según lo descrito anteriormente para las pruebas cualitativas.
GLOSARIO
Exactitud: La proximidad de los resultados de la prueba obtenidos mediante el método de prueba alternativo con respecto
al valor obtenido por el método farmacopeico que se va a demostrar a lo largo del intervalo dinámico (operativo) del método.
Método microbiológico alternativo: Procedimiento de prueba microbiológica moderno o rápido que es diferente del
método tradicional basado en crecimiento, tal como el recuento en placa o la recuperación en caldo líquido. El método
alternativo o rápido puede usar diferentes tecnologías, instrumentos y software para manejar las pruebas y los análisis de datos y
puede proveer resultados de prueba microbiana cuantitativos (recuento) o cualitativos (detección).
Unidad formadora de colonias (ufc): Estimación del número de microorganismos obtenidos por medio de métodos
tradicionales de recuento en placa. El recuento depende de la capacidad de los microorganismos de la muestra para crecer en
los medios de cultivo microbiológicos en las condiciones de incubación. Debido a que no es posible saber con certeza si una
colonia se derivó del crecimiento de una o incluso mil células, los resultados se informan en ufc/mL (para un líquido) o ufc/g
(para un sólido) y no como células/mL o células/g.
Método microbiológico convencional: Método basado en crecimiento clásico o tradicional, tal como recuento en placa
de agar o detección en un caldo líquido cuando se incuba durante un tiempo y temperatura específicos. Estos métodos se usan
en los capítulos á51ñ, á61ñ, á62ñ, á63ñ y á71ñ.
Equivalencia: Cuando los resultados de las pruebas a partir de dos procedimientos son lo suficientemente cercanos para
el uso previsto de los procedimientos. La demostración de la equivalencia requiere una medición previamente especificada del
grado de similitud requerido de los resultados.
Falso negativo: Resultado de prueba que se determina incorrectamente como negativo (p.ej., un resultado de ausencia
de microorganismos viables cuando en realidad se encuentran microorganismos presentes). Un error de tipo II, también
conocido como error del segundo tipo, ocurre cuando la hipótesis nula es falsa pero por error no es rechazada. Es decir, no se
es capaz de indicar lo que en realidad está presente—una falla. Un error de tipo II puede compararse con un denominado falso
negativo en una prueba (y considerarse una “falla”) en la que se verifica una condición individual con un resultado definitivo
de verdadero o falso. La tasa del error de tipo II se denota mediante la letra griega β y se relaciona con la potencia de una prueba
(que es igual a 1 − β).
15
Falso positivo: Resultado de prueba que se determina incorrectamente como positivo (p.ej., un resultado de detección
microbiana viable cuando en realidad no hay microorganismos presentes). En la teoría de pruebas estadísticas, la idea de un
error estadístico es una parte integral del análisis de la hipótesis. Estos se describen como errores de tipo I y tipo II. Un error de
tipo I, también conocido como error del primer tipo, ocurre cuando la hipótesis nula (H0) es verdadera, pero se rechaza. Significa
indicar que algo existe cuando en realidad está ausente (es decir, una indicación falsa). Un error de tipo I puede compararse
con un denominado falso positivo (un resultado que indica que una condición dada está presente cuando en realidad no lo
está) en pruebas en las que se analiza una condición individual. La tasa del error de tipo I se denomina “tamaño” de la prueba y
se denota mediante la letra griega α. Por lo regular es igual al nivel de importancia de una prueba. En el caso de una hipótesis
nula simple, α es la probabilidad de un error de tipo I.
Muestras independientes: Muestras seleccionadas de la misma población o de diferentes poblaciones que no tiene un
efecto entre sí. Es decir, que no existe correlación entre las muestras.
Límite de detección: La concentración más baja de microorganismos en una muestra de prueba que puede ser detectada,
aunque no necesariamente cuantificada, en condiciones experimentales definidas.
Límite de cuantificación: La concentración más baja de microorganismos en una muestra de prueba que puede ser
detectada, con exactitud y precisión, en condiciones experimentales definidas.
Linealidad: La capacidad para generar resultados que sean proporcionales a la concentración de microorganismos
presentes en la muestra dentro de un intervalo dado.
Aptitud del método: Demostración de la falta de mejoría o inhibición por parte del producto de la señal generada por
el método.
No inferioridad: Demostración de que el método alternativo no es peor que el método farmacopeico en más de una
cantidad pequeña previamente especificada. Esta cantidad se conoce como margen de no inferioridad o δ. La no inferioridad
es diferente de la equivalencia en que en un ensayo de equivalencia, la conclusión deseada es que dos métodos microbiológicos
no son inaceptablemente distintos entre sí. En una prueba de no inferioridad, el objetivo es demostrar que un producto nuevo
no es inaceptablemente peor que uno anterior.
l
Muestras apareadas: Muestra de pares correspondientes de unidades similares.
ia
Intervalo-Dinámico u Operativo: Intervalo entre los niveles superior e inferior de microorganismos que han sido
demostrados que se va a determinar con exactitud, precisión y linealidad especificadas.
Precisión de la repetibilidad: Grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando el
procedimiento se aplica repetidamente a muestreos múltiples de la misma suspensión de microorganismos y utiliza diferentes
suspensiones a lo largo del intervalo de la prueba. También conocida como “repetibilidad”.
Robustez: La capacidad del método para no ser afectado por variaciones pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros
fic
del método, tales como volumen de reactivo, tiempo o temperatura de incubación, representa un indicador de su confiabilidad
durante uso normal.
Tolerancia: Precisión intermedia (dentro del laboratorio) asociada con los cambios en las condiciones operativas. Los
factores que contribuyen a la precisión intermedia implican cualquier cosa que puede cambiar dentro de un laboratorio dado y
que pueden afectar la valoración (p.ej., días diferentes, analistas diferentes, equipo diferente).
Especificidad: Capacidad para detectar una variedad de microorganismos, la cual demuestra que el método sirve al uso
previsto. Estos microorganismos pueden incluir un número limitado de microorganismos que representan un riesgo para el
O
paciente o el producto, de microorganismos hallados en el ambiente de fabricación y las fallas del producto, microorganismos
que son apropiados para medir la efectividad del método alternativo, y microorganismos que se especifican en las pruebas
farmacopeicas pertinentes que son apropiados para el método y el producto.
Responsabilidad del Usuario: La responsabilidad con respecto a la calificación de la instalación, operativa y de
desempeño puede ser una responsabilidad conjunta del fabricante del instrumento y del usuario del método microbiológico
alternativo. La validación del método puede ser llevada a cabo por el fabricante del instrumento, cuando así se justifique. La
prueba de aptitud del método realizada para cada producto específico debe ser responsabilidad exclusiva del usuario.
Validación: Proceso de demostración y documentación de que las características de desempeño de un procedimiento y
su método subyacente cumplen con los requisitos para la aplicación prevista y que el procedimiento es, por tanto, adecuado
para su uso previsto. Las validaciones formales se realizan de manera prospectiva con respecto a un plan por escrito que incluye
criterios de aceptación justificables sobre procedimientos de validación.
REFERENCIAS
1. Staley, JT and Konopka, A. Measurement of in situ activities of non-photosynthetic microorganisms in aquatic and
terrestrial habitats. Ann. Rev. Microbiol. 1985;39:321–346
2. Hauck WW, DeStefano AJ, Cecil TL, Abernethy DR, Koch WF, Williams RL. Acceptable, equivalent, or better: approaches
for alternatives to official compendial procedures. Stimuli to the Revision Process. Pharmaceutical Forum. 2009;35(3).
3. ReChen JJ, Tsong Y, Kang S-H. Tests for equivalence or noninferiority between two proportions. Drug Info J. 2000;34:569–
578.
4. FDA. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for
Human Use. E9 Statistical principles for clinical trials. Guidance for Industry. Sep 1998.Washington: U.S. Food and Drug
Administration.
5. Schuirmann DJ. A comparison of the two one-sided tests procedure and the power approach for assessing the equivalence
of average bioavailability. J Pharmacokinet Biopharm. 1987;15(6):657–680.
6. Farrington CP, Manning G. Test statistics and sample size formulae for comparative binomial trials with null hypothesis
of non-zero risk difference or non-unity relative risk. Stat Med. 1990;9(12):1447–1454.
7. Lachenbruch PA, Lynch CJ. Assessing screening tests: extensions of McNemar’s test. Stat Med. 1998;17(19):2207–2217.

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á1223ñ VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

Perspectiva de la USP sobre la Implementación de Métodos o Procedimientos Alternativos

Consideraciones Generales Con Respecto a las Valoraciones de Control de Calidad para la

Liberación del Producto

Presentación de Métodos o Procedimientos Alternativos ante la USP

Capítulos USP Adicionales Relacionados con la Implementación de Métodos Microbiológicos

REQUISITOS PARA EL USUARIO

Componentes de la Calidad de los Datos

Métodos Microbiológicos Clásicos

Señales de Métodos Microbiológicos Alternativos

Estadísticas y Métodos Alternativos

VALIDACIÓN DE TECNOLOGÍAS ALTERNATIVAS

Especificación de Requisitos para el Usuario

Tabla 1. Parámetros de Validación por Tipo de Prueba Microbiológica

Intervalo (dinámico) operativo No Sí

0,20) para ambas pruebas farmacopeica y alternativa.

APTITUD DEL MÉTODO

Tabla 2. Matriz de Opciones de Equivalencia

2. Equivalencia del desempeño Equivalente Sí Resultados Múltiple

3. Equivalencia de los resultados Equivalente Sí Resultados Individuales

4. Equivalencia de las decisiones Equivalente Sí Conclusiones Individuales

OPCIÓN 1: PROCEDIMIENTO ACEPTABLE

OPCIÓN 2: EQUIVALENCIA DEL DESEMPEÑO

OPCIÓN 3: EQUIVALENCIA DE LOS RESULTADOS

OPCIÓN 4: EQUIVALENCIA DE LAS DECISIONES

Demostración de la Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos Cualitativos Alternativos

ENFOQUE 1: USO DE RESULTADOS DE PRESENCIA Y AUSENCIA

Tabla 3. Resultados para Muestras Apareadas

Procedimiento Alternativo Positivos Negativos Totales por Fila

Positivos X11 X10 XA

Negativos X01 X00 N − XA

Totales por columna XC N − XC N

ENFOQUE 2: COMPARAR RESULTADOS DE NÚMERO MÁS PROBABLE

µA − µC ≥ log(R) o antilog(µA − µC) ≥ R

donde tα, df es el punto porcentual superior α de la distribución t con df grados de libertad y

Demostración de la Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos Cuantitativos Alternativos

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