S2.Investigación de Proteinas-ENZIMAS PDF

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA Y
FISIOLOGÍA ANIMAL
BIOQUÍMICA AMBIENTAL
INVESTIGACIÓN DE PROTEÍNAS: Extracción. Separación: Cromatografía.

Electroforesis.
ENZIMAS: generalidades, especificidad, centro activo, clasificación. Mecanismos de

catálisis: estado de transición, energía de activación, estrategias de catálisis.
CÁTEDRA DE BIOQUÍMICA
Para entender los procesos biológicos que se producen en el nivel molecular
es necesario identificar las proteínas que participan en dichos procesos,
aislarlas y analizar su:
❑ Función
❑ Secuencia aminoacídica
❑ Estructura espacial
Condiciones generales a evaluar
Calidad: % de pureza del producto de acuerdo a mis objetivos.

❑ Secuenciación, cristalización
❑ Ensayo de actividad, productos alimenticios médicos
Cantidad: técnicas de alta capacidad y de baja capacidad.

❑ Preparativas
❑ Analíticas
Costos
Pasos a seguir en una purificación
• Definir un ensayo específico que identifique a la proteína (actividad biológica) (específico,
1 sensible, rápido y barato).
•Elegir la fuente (matriz biológica).

2
•Extraer la proteína de la fuente (proteínas intraceluares o extracelulares).

3
•Estabilización de la molécula.
4
•Aislamiento y concentración (fraccionamiento).

5
• Determinar la pureza y calidad del producto final.

6
Actividad biológica
Cantidad de proteína que produce, por su acción biológica, un determinado cambio.
Este cambio • Un efecto biológico (Muerte celular, hemólisis, protección inmunológica)

puede ser: •Variación en la cantidad de una sustancia química (producto de una
reacción)
De esta forma podemos definir a la unidad de actividad biológica como:

Una unidad de Actividad Biológica es la cantidad de proteína que produce una determinada
cantidad de “efecto”.
1. Toxina
Una unidad de AB para una toxina es la cantidad de proteína que produce la muerte del 23% de los
ratones de tal especie (siguen especificaciones…)
2. Enzima
Una unidad de AB para una enzima es la cantidad de proteína que produce 5.98 moles de producto
en 1 minuto en condiciones …(siguen especificaciones…)
Elección de la fuente
Matriz donde se encuentra la proteína de interés:

• Concentración
• Accesibilidad
• Costo
• Facilidad de la extracción
Extracción de la proteína de la fuente
Lisis osmótica: técnica muy suave. Uso de sn hipotónicas + fuerzas mecánicas. Para bacterias
y células vegetales: lisozimas u otras enzimas.
Molienda: a. Morteros b. Batidoras. Uso de sustancias abrasivas.
Ultrasonido: Sonicador. Eleva mucho la temperatura de la muestra.

Métodos de rotura celular y extracción de proteínas
Estabilización
Factores a tener en cuenta en cada etapa del fraccionamiento:
1. pH
2. Grado de oxidación (-SH)
3. Presencia de Metales pesados. Sustancias Contaminantes
4. Polaridad y fuerza iónica de la solución
5. Presencia de proteasas
6. Temperatura
7. Actividad de la molécula
Aislamiento y Concentración
Fraccionamiento del extracto crudo
Implica una serie de pasos en los cuales se aprovechan propiedades fisicoquímicas o biológicas
de la proteína de interés para separarla del resto de las moléculas.
Cada paso debe ser monitoreado adecuadamente para evaluar el rendimiento en la

purificación, pureza y actividad específica de cada fracción obtenida.
Si bien no hay una sola secuencia de técnicas a seguir, en general se recomienda

empezar por técnicas de alta capacidad y seguir con las de baja capacidad.
En general se desea obtener una gran pureza (según los objetivos)

acompañada de un gran rendimiento.
Actividad vs. Actividad específica
Efecto del pH y de la fuerza iónica
sobre la solubilidad de las
proteínas
Fraccionamiento por desnaturalización (Precipitación Diferencial)
Salting-out (Precipitación salina):
o Sultafo de amonio
o Fosfato de potasio
Formas de obtener la precipitación

✓ En forma de producto seco
✓ En forma de sn saturada de la sal
Tanto si se trabaja con el precipitado o con el sobrenadante esta técnica en general va seguida de
una técnica de “de-salado”.
Uso de solventes orgánicos:

• Etanol
• Acetona
• Butanol
→ Producen algo de desnaturalización. Requieren de bajas temperaturas.
La fuerza iónica
es una medida
adecuada del
efecto de las
interacciones, ion-
ion y ion-solvente,
en una solución
electrolítica.
Aplicaciones para su
fraccionamiento y purificación
Cromatografía
Electroforesis
Isoelectroenfoque
CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas diferentes presentes en una misma
muestra. El método está basado en la circulación de una fase móvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a
separar), a través de una fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los
distintos compuestos presentes en la mezcla resultará su separación.
Las columnas son tubos de vidrio, metal o plástico,

según la técnica empleada, de diámetro constante y
preferentemente de un material biocompatible; es
decir, que no cambie la función biológica del material
en estudio ni interacciones con el eluente.
Las interacciones que dan lugar a la separación se

dan sobre la matriz o soporte y pueden ser de diversa
naturaleza. Así se tiene la cromatografía de
intercambio iónico, de interacción hidrofóbica, de
filtración o exclusión molecular, de afinidad, etc.
Cromatografía de Intercambio Iónico
La matriz contiene un grupo cargado que puede interaccionar con la macromolécula en estudio de
forma que se une a ella por interacciones electrostáticas. Los grupos iónicos se hallan unidos a la
matriz.
Una característica importante es su capacidad. La

capacidad es mayor cuanto más sustituida esté la matriz,
más fuerte sea la interacción con la macromolécula y
mayor sea el tamaño de poro de la matriz.
ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica

para la separación de moléculas
según la movilidad de estas en
un campo eléctrico a través de
una matriz porosa, la cual
finalmente las separa por
tamaños moleculares y carga
eléctrica, dependiendo de la
técnica que se use.
Electroforesis en papel
Electroforesis en geles de poliacrilamida
Isoelectroenfoque
Electroforesis bidimensional
Técnica de alta resolución cuyo objetivo es la separación de mezclas de proteínas altamente complejas.
La base de su elevado poder de resolución está precisamente en la bidimensionalidad, es decir, en que las
proteínas son separadas secuencialmente por dos criterios físicos.
Debido a su elevada resolución, ha sido una técnica ampliamente utilizada en la confección de mapas de
referencia, es decir, en la disección de la composición proteica de un determinado orgánulo o tipo celular
(metabolómica).
Diálisis
Centrifugación
Exclusión molecular
DIALISIS
CENTRIFUGACIÓN
CENTRIFUGACIÓN
CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN MOLECULAR
Las biomoléculas de diferente naturaleza y

tamaño pueden separarse en base a su tamaño
en columnas de filtración molecular o filtración
en gel. Las biomoléculas pasan a través del gel y
tienen a su disposición caminos de diferente
longitud de acuerdo con su tamaño.
Las moléculas pequeñas capaces de penetrar los

poros de la matriz se verán retardadas en
comparación con aquellas de mayor tamaño, que
son excluidas del interior de la partícula y por lo
tanto verán su tránsito acelerado a través de la
columna.
CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN MOLECULAR
Determinación total de proteínas:
Lowry, Biuret, Bradford
Determinación específica de
proteínas: Western Blot, ELISA
DETERMINACIÓN TOTAL DE PROTEÍNAS
DETERMINACIÓN ESPECÍFICA DE PROTEÍNAS
Western Blot (Electroforesis + Inmunodetección)
DETERMINACIÓN ESPECÍFICA DE PROTEÍNAS
ELISA
Características generales.
Holoenzima.
Apoenzima.
Energía libre.
Cinética enzimática, Km consideraciones generales.

ENZIMAS. Características Generales
1. Composición
Casi todos son de naturaleza

proteica, excepto moléculas de
RNA catalíticamente activas
(ribozimas).
En los viroides de plantas, como los que producen la

mancha de los paltos y la mancha de la planta del tabaco.
Estas ribozimas contienen secuencias de RNA, que tienen
esta posibilidad de cortar otras cadenas RNA, en
secuencias de nucleótidos bien determinadas.
La actividad catalítica de muchos enzimas depende de la presencia de pequeñas
moléculas llamadas cofactores.
COFACTORES
Enzimas que requieren
elementos inorgánicos
Citocromo oxidasa Fe2+, Fe+,
Catalasa, peroxidasa
Citocromo oxidasa Cu2+
DNA polimerasa
Anhídrasa carbónica Zn2+
Alcohol deshidrogensa
Hexoquinasa Mg2+
Glucosa 6-fosfatasa
Arginasa Mn2+
Piruvato quinasa K+, Mg2+
Ureasa Ni2+
Nitrato reductasa Mo2+
2. Poder catalítico
Aumentan las velocidades de las

reacciones hasta 106 veces, sin El enzima no se modifica tras
afectar el equilibrio de la reacción. su actuación catalítica.
3. Especificidad
Radica en el centro activo del enzima (responsable de la

interacción).
4. Requieren de condiciones ambientales: pH
Enzima pH óptimo
Pepsina 1.5
Tripsina 7.7
Catalasa 7.6
Arginasa 9.7
Fumarasa 7.8
Ribonucleasa 7.8
5. Requieren de condiciones ambientales: Temperatura
Enzima Temp.
Ópt.
Mamíferos (oC) 37
Bacterias y algas apróx. 100
Bacterias Árticas apróx. 0
Bacterias en muestra de hielo

antigua
DIVERSAS APLICACIONES:
Medicina Transaminasas
Industria
Penicilina
Química
Transformación Fermentaciones
de Alimentos Quesos
Vinos
Agricultura Rhyzobium
ENZIMAS. Clasificación
De acuerdo al tipo de reacción catalizada, los
enzimas se agrupan en seis clases:
1. Oxidorreductasas 2. Transferasas
Transfieren grupos funcionales entre

dadores y aceptores. Transfieren grupos
amino, acilo, fosfato, glucosilo y los grupos
Catalizan reacciones de oxidorreducción, transferencia monocarbonados.
de hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro.
3. Hidrolasas 4. Liasas
La reacción generalizada implica la rotura Añaden o eliminan los elementos del agua,
hidrolítica de enlaces C-C, C-O, C-N, O- amoniaco o dióxido de carbono.
P y C-S; la rotura del enlace peptídico es Las descarboxilasas eliminan unidades de
un buen ejemplo de esta reacción. CO2 de  y -cetoácidos o aminoácidos.
5. Isomerasas 6. Ligasas
Catalizan la unión de dos moléculas

Catalizan isomerizaciones de diversos tipos
acopladas a la hidrólisis de ATP.
dentro de una molécula. Interconversiones
El término sintetasa se reserva para este
cis – trans y aldosa – cetosa.
tipo de enzimas.
La energía libre (G) es una función termodinámica útil para la
comprensión de los enzimas.
Energía libre: La primera ley de la Termodinámica establece que la energía total de un sistema y su
entorno permanece constante.
Para comprender el funcionamiento de los enzimas, es necesario conocer:
La diferencia de la energía libre (ΔG) entre los La energía que se requiere para iniciar la
productos y los reactantes conversión de los reactantes en productos
(energía de activación ΔG++.).
ΔG negativo: Reacción espontánea (exergónica)

ΔG es cero: Equilibrio. Determina la velocidad de la reacción
ΔG positivo: Reacción no espontánea
(endergónica)
ΔG no proporciona información Intervienen los enzimas, favoreciendo

sobre la velocidad de reacción. La formación del estado de transición.
El ΔG para una reacción puede ser mayor, menor o igual que ΔG°’ según las concentraciones de los
reactantes y los productos.
El criterio de espontaneidad para una reacción es ΔG, no ΔG°’.
Las reacciones que no son espontáneas basadas en su ΔG°’ pueden volverse espontáneas ajustando
las concentraciones de los reactantes y de los productos.
Los enzimas alteran la velocidades de una reacción

pero no el equilibrio
Una enzima no puede alterar el equilibrio

de una reacción química.
Los enzimas aceleran la consecución el equilibrio, pero no varían su

posición. La posición del equilibrio es una función que depende sólo de la
diferencia de energía libre entre los reactantes y los productos.
Los enzimas aceleran las reacciones mediante la
facilitación de la formación del estado de transición
De S → P: estado de transición (X++) que

X++ tiene mayor energía libre que S y P.
Energía liberada por interacciones débiles entre

el E y el S (energía de unión) permite que la
energía de activación disminuya.
ΔG entre X++ y el S: energía libre de Gibbs o

energía de activación: ΔG++.
La esencia de la catálisis es la estabilización

específica del estado de transición .
GRACIAS POR
SU ATENCIÓN

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FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INVESTIGACIÓN DE PROTEÍNAS: Extracción. Separación: Cromatografía.

ENZIMAS: generalidades, especificidad, centro activo, clasificación. Mecanismos de

Calidad: % de pureza del producto de acuerdo a mis objetivos.

Cantidad: técnicas de alta capacidad y de baja capacidad.

•Elegir la fuente (matriz biológica).

•Extraer la proteína de la fuente (proteínas intraceluares o extracelulares).

•Aislamiento y concentración (fraccionamiento).

• Determinar la pureza y calidad del producto final.

Este cambio • Un efecto biológico (Muerte celular, hemólisis, protección inmunológica)

De esta forma podemos definir a la unidad de actividad biológica como:

Matriz donde se encuentra la proteína de interés:

Extracción de la proteína de la fuente

Molienda: a. Morteros b. Batidoras. Uso de sustancias abrasivas.

Ultrasonido: Sonicador. Eleva mucho la temperatura de la muestra.

Factores a tener en cuenta en cada etapa del fraccionamiento:

2. Grado de oxidación (-SH)

3. Presencia de Metales pesados. Sustancias Contaminantes

4. Polaridad y fuerza iónica de la solución

Cada paso debe ser monitoreado adecuadamente para evaluar el rendimiento en la

Si bien no hay una sola secuencia de técnicas a seguir, en general se recomienda

En general se desea obtener una gran pureza (según los objetivos)

Formas de obtener la precipitación

Uso de solventes orgánicos:

Las columnas son tubos de vidrio, metal o plástico,

Las interacciones que dan lugar a la separación se

Una característica importante es su capacidad. La

La electroforesis es una técnica

Las biomoléculas de diferente naturaleza y

Las moléculas pequeñas capaces de penetrar los

Cinética enzimática, Km consideraciones generales.

Casi todos son de naturaleza

En los viroides de plantas, como los que producen la

Aumentan las velocidades de las

Radica en el centro activo del enzima (responsable de la

Bacterias y algas apróx. 100

Bacterias Árticas apróx. 0

Bacterias en muestra de hielo

Transfieren grupos funcionales entre

Catalizan la unión de dos moléculas

Para comprender el funcionamiento de los enzimas, es necesario conocer:

ΔG negativo: Reacción espontánea (exergónica)

ΔG no proporciona información Intervienen los enzimas, favoreciendo

El criterio de espontaneidad para una reacción es ΔG, no ΔG°’.

Los enzimas alteran la velocidades de una reacción

Una enzima no puede alterar el equilibrio

Los enzimas aceleran la consecución el equilibrio, pero no varían su

De S → P: estado de transición (X++) que

Energía liberada por interacciones débiles entre

ΔG entre X++ y el S: energía libre de Gibbs o

La esencia de la catálisis es la estabilización

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