Taller 4. Tinción

Taller 4: Tinción
Biología Molecular–LAB. 2023-1
Nota: Esta entrega se revisará con el sistema TurnItIn®. Por lo que deben tener en cuenta las reglas de
citación APA para evitar sanciones (RGEP Art 109 y Art. 114)
1. (1.5) Su compañero de laboratorio, que investiga los sistemas de transporte de proteínas

en plantas, hizo una cromatografía de exclusión molecular con el propósito de separar la
proteína Sec24 (de 23kDa) y la proteína Sar1 (de 12kDa). Después de la cromatografía, su
compañero hizo una SDS-PAGE de las fracciones sucesivas (C4-D10) le mostró sus
resultados antes de la reunión del laboratorio. Describa los resultados que obtuvo su
compañero y en caso de que no haya obtenido el resultado esperado, ¿Qué sugerencia le
haría a su compañero para que lograra obtener el resultado esperado?
Gel resultante. M: Marcador de peso molecular (10-75kDa), C4-D10: Fracciones sucesivas

colectadas.
Inicialmente, se puede evidenciar que la cromatografía por exclusión molecular no fue

exitosa. Al ver las fracciones, teniendo en cuenta que la molécula excluida sería la Sec24 y la
fraccionada la Sar1, se puede evidenciar que ambas eluyeron en conjunto. Al ver la fracción C4 se
esperaría que solo se viese la molécula excluída, en mayor cantidad, siendo la Sec24, además de
no poder ver la molécula fraccionada, Sar1. A medida que vemos las bandas, la concentración de
Sec24 debería disminuir, y la Sar1 aumentar, sin embargo, la concentración de Sec24 aumenta y
la concentración de Sar1 es inestable, se ve que crece y decrece en las últimas bandas. Le
sugerimos verificar el procedimiento realizado en la cromatografía por exclusión molecular, ya
sea verificando el limite de exclusión, y el tamaño de las moléculas.
2. Explique el fundamento de la técnica de tinción con Azul del Coomassie. Mencione
brevemente los pasos y los reactivos necesarios en cada paso.
Este colorante se una a los aminoácidos de la proteína en una solución ácida que contiene
ácido acético, metanol y agua desionizada. La forma aniónica de este colorante es quien
formará el complejo con los aminoácidos de la proteína. Debido a fuerzas de van der
Waals e interacciones hidrofóbicas, se unirá a aminoácidos básicos y aminoácidos
débilmente aromáticos, además los residuos sulfónicos se unen a la proteína mediante la
atracción electrostática de estos. Luego de agregar esta proteína entre 1.5 y 3 moléculas
de colorante se unirán por cada carga positiva presente en la proteína ocasionando un
cambio en la absorbancia de la proteína y el colorante
Pasos:
Este proceso consta de 3 pasos: el fijado, la tinción y destinción.
Para la tinción se usa metanol, ácido acético, agua des ionizada y azul de coomasie
Para la preparación de la solución de tinción se agregará 50%, 10%, 40% y 0.05% de los
reactivos anteriormente mencionados respectivamente.
Luego se deja en tinción hasta observar la aparición de bandas
Para el proceso de destinción se usa metanol, ácido acético y dH20, preparando una
mezcla con 50%, 10% y 40% respectivamente.
Luego de descartar la solución de tinción, se enjuaga el gel con agua desionizada y luego
se agrega la solución de destinción, el gel luego se deja en agitación a 50 rpm, a 37 grados
por 10 min o hasta obtener la intensidad de banda deseada, luego el gel estará listo para
ser secado en papel celofán en frío.
3. Investigue otras 2 técnicas de tinción de geles de poliacrilamida, para la visualización de

proteínas y/o ADN. Diga ventajas y desventajas de las técnicas. Compárelas con la
técnica de Azul de Coomassie.
Tabla comparativa
Métodos de tinción
Características
Azul de Coomassie Sales de plata Fluorocromo
Sensibilidad Baja Elevada (hasta 0.1 ng de Elevada debido a
proteína por banda) fluorescencia, visible
incluso en bajo
aumento.
Dificultad Práctico Laburoso Práctico
Costo Bajo Elevado Elevado
Reproducibilidad Alta Baja Baja
Características adicionales:
1. Tinción por Azul de Coomassie:
- Se puede emplear para la determinación de proteínas (cuando estas son abundantes),
pero no para la determinación de pureza de proteínas trazas.
- Requiere un medio ácido para la generación de atracción electroestática entre las
moléculas del colorante y los grupos amino de las proteínas.
- La atracción iónica es a través de las fuerzas de Van Der Walls, que une a las proteínas y
al colorante formando un complejo (esta unión es reversible con las condiciones
apropiadas).
- Es el más aceptado para el revelado de geles de electroforesis.
- Es cuantitativo.
- Es rápido.
- Tiene ausencia de toxicidad.
2. Sales de plata
- Produce generalmente coloraciones carmelitas (café claro) o negro. Esto gracias a la
difracción de la luz en la plata.
- Exclusivamente cualitativo.
- Tanto el costo, laburo, fondo, reproductibilidad se pueden considerar como desventajas.
Asimismo, con esta tinción algunas proteínas no se tiñen y no es totalmente específico de
proteínas, ya que algunos lipopolisacáridos, ácidos nucleicos y polisacáridos también se
tiñen. Otra desventaja es que no puede ser utilizada para cuantificar proteínas.
- Una de sus ventajas es su alta sensibilidad.
3. Fluorocromo
- Es cuantitativo.
- Una de sus ventajas es su alta sensibilidad, pueden ser más sensibles que el azul de
Coomassie, o tan sensibles como la plata. Además, es eficaz en cuanto al tiempo y práctico
desde un punto de vista técnico.
- Se basa en la unión covalente de algunos grupos fluorescentes a ciertos grupos
funcionales de las proteínas entre los que se encuentran el isotiocianato de fluorescamina
o fluoresceína
4. Agregue una imagen del gel correspondiente a su grupo, y explique los resultados con
base en lo aprendido.
Imagen 1. Resultado del gel obtenido.
Teniendo en cuenta el marcador de peso y el control positivo presente en el extremo izquierdo
del gel, pude evidenciarse en las bandas de las muestras sembradas que la molécula de interés
(adn polimerasa I de geobacillus) si se expresó en la bacteria, las bandas que se presentan más
hacia abajo son proteínas también presentes en la muestra sembrada.
Bibliografía
Jorge Guillermo C. S., “Evaluación de Procedimientos de Tinción para el Análisis de
Proteínas por Electroforesis (SDS-PAGE)”, Universidad de Sonora, 2012.
Wheelock, “Electroforesis en gel bidimensional de emisión de resolución temporal

acumulativa”, Hikari Bio Ab, 2012.
Eugenio H. R. y Lila C.S., “Precipitación selectiva de imidazolato de zinc: aplicación a la

detección de biomoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y glicolípidos bacterianos) separadas en
geles de poliacrilamida”, Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. 2019.

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