Evaluación de Desinfectantes

Microbiología II
Facultad de Ciencias Químicas

Universidad Central del Ecuador
Ing. MSc. Gabriela Chacón
Contenido
• Introducción
• Definición de desinfectante.
• Factores involucrados en las actividades y pruebas de
desinfectantes.
• Características de las pruebas de evaluación de desinfectantes.
• Clasificación y tipos de pruebas
• tipo de microorganismos a prueba
• tipo de metodología
• tipo de prueba objetivo.
• Ejemplos de pruebas.
Introducción
• Sustancias químicas que influyen negativamente sobre las bacterias:
• bacteriostáticos: cuando impiden el crecimiento bacteriano;
• bactericidas: cuando destruyen (matan) las bacterias.
• Si hablamos de varios microorganimos = agentes microbiostáticos y
microbicidas.
• Agentes microbiostático y microbicida dependen de la concentración
de sustancia y del tiempo durante el que actúa.
• ¿Cómo podemos saber que un microorganismo está “muerto”?
• El único criterio válido es la pérdida irreversible de la capacidad de división
celular, es decir, de la pérdida de viabilidad, y se suele comprobar empleando
técnicas con placas de Petri (es decir, confirmando que no crecen en medios
sólidos adecuados).
Introducción
Introducción
*Puede causar daño cosmético y funcional

•http://www.fda.gov/cdrh/ode/germlab.html
•ANSI-AMI ST58:2013 Chemical sterilization and high-level disinfection in health care facilities
Definición de desinfectante
• No hay definiciones universalmente aceptadas de desinfectantes
• Requisito mínimo: Reducción logarítmica 103 efectiva de microorganismos
excluidas las esporas
• Desinfectante de bajo nivel
• La mayoría de las bacterias vegetativas
• Virus envuelto en lípidos (VIH)
• Nivel intermedio
Virus no lipídico o pequeño (Poliovirus)
• Alto nivel
• Mycobacteria spp. incluido M.tuberculosis
• Esterilizante
• Reducción logarítmica 106 de las esporas más resistentes lograda en el medio
tiempo del ciclo regular
Características de los desinfectantes
• Materiales utilizados para la eliminación de microorganismos
– Aspecto físico (Efecto limpieza)
– Aspecto biológico (actividad antimicrobiana)
• Diversas aplicaciones y regulaciones– médicas, veterinarias, alimentarias,
industriales, etc.
– Varios métodos de aplicación
– Las regulaciones difieren de un país a otro - Asociaciones de Químicos Analíticos Oficiales,
Associations Francaise de Normalization, British Standards Institution, etc.
Características de los desinfectantes
• Amplio espectro
• Estabilidad frente a la materia orgánica
• Compatibilidad con el material de los equipos
• Actividad y concentración medible
• Rapidez de acción
• Vida media prolongada
• Ausencia de olor
• Degradable en el medio ambiente
• Baja toxicidad
• Costo-efectivo
Factores implicados en la actividad de los
desinfectantes
• Factores relacionados con los agentes antimicrobianos
• Factores relacionados con los microorganismos
–Naturaleza de los microorganismos
– Estado fisiológico de los microorganismos
– Comunidades microbianas (Flora) y biofilms
– Resistencia natural y adquirida
• Entorno físico, fisicoquímico y químico de los microorganismos
– Concentración
– Temperatura
– Presencia de materia orgánica
– Electrolitos
– Aditivos y componentes de excipientes
Factores que interfieren con las pruebas de
evaluación y los criterios de actividad
• Cepas de prueba: representatividad y fiabilidad
• Criterios para la actividad
• Punto crítico en el método de prueba
– Preparación de inóculos
– Neutralización o lavado por filtración por membrana
– Detección y recuento de supervivientes
o Recuperación cuantitativa de microorganismos
o Tamaño del muestreo
o Subcultura y renacimiento de los sobrevivientes
– Parámetros físicos de exposición: tiempo, temperatura, humedad, pH
Características de las pruebas de desinfectantes
• Diferente de la evaluación de agentes antimicrobianos
– No se puede utilizar la concentración inhibitoria mínima
o No inhibición sino matar->Se requiere neutralizador o eliminación de desinfectantes
– Diferentes mecanismos y de actividad

o Curva de eliminación no lineal del desinfectante
o La tasa de matanza logarítmica disminuye a medida que disminuye el inóculo
– Efecto inhibitorio y efecto postexposición
• Amplio espectro de eficiencia según el entorno en uso

– Tiempo, concentración, pH y temperatura
– Tipo y cantidad de microorganismos
Características de las pruebas de desinfectantes
• No hay un método aceptable para la evaluación objetiva del procedimiento de desinfección
• Varios y numerosos métodos de prueba específicos
• Solo un estudio exhaustivo de las capacidades desinfectantes
– Se evalua el aspecto biológico
• Efecto bactericida, fungicida, viricida, esporicida, etc.
– Las cepas estándar de diferentes especies deben cubrir
• Un espectro suficientemente grande
• Al menos el área objetivo
– Consideraciones técnicas
• Métodos estandarizados para obtener resultados reproducibles
• Los medios de detección de microbios supervivientes
Clasificación desinfectantes basado en el tipo de
microorganismo
• Prueba bactericida
• Prueba micobactericida
– Prueba tuberculocida
• Prueba esporicida
– Las esporas bacterianas son altamente resistentes al agente
químico
• Prueba fungicida
• Prueba virucida
Prueba bactericida
Destrucción de bacterias*
Tiempo de exposición: 30 segundos a 15 minutos
• Sustancia interferente: simulación de la condición práctica
• Interpretation criteria
– Reducción logarítimica 105 en 5 minutos
Prueba micobactericida
• Tiempo de exposición: 15 a 60 minutos – Variar según la formación de las pruebas

• Criterios de interpretación – Reducción logarítmica de 104
Prueba esporicida
• Organismos de prueba
– B. cereus, B. subtilis y Clostridium sporogenes
• El inóculo de esporas es importante
– Solo esporas, no células vegetativas
– Calentar la suspensión durante 1 a 5 min a 80 a 85°C
• Criterios interpretativos
– Prueba de actividad básica
• Reducción de 5 log en 1 hora a 20°C o en 5 min a 75°C
– Prueba de aplicación
Prueba fungicida
• Varias pruebas en muchos países

– Prueba de suspensión
– Prueba de portador
– Reducción de 4 logs en 15 minutos (o más)
Prueba Virucida
Características de la prueba virucida
– Medición del poder infeccioso del virus
– Dificultades en el cultivo celular
o El desinfectante en sí mismo es altamente tóxico
* Lisis celular e inhibición de la penetración y replicación viral
* Dilución de la mezcla virus-desinfectante requerida
o Los neutralizadores también pueden tener efectos citotóxicos
• Organismos probados (AFNOR)
– Enterovirus, adenovirus y poxvirus
– Reducción de 4 logs en 15 a 60 minutos
Clasificación basada en principios metodológicos
• Las condiciones experimentales descritas con precisión
– Tiempo de contacto, temperatura, sustancias interferentes, cepas de
referencia e inóculo
• Tipos de prueba metodológica

– Prueba de suspensión
– Prueba de portador
– Prueba en uso y de campo
– Prueba en biopelículas
Prueba de suspensión
Objetivo
– La actividad potencial de un desinfectante
– La actividad en condiciones que simulan la práctica
– Se pueden probar todo tipo de microorganismos
• Método
– Mezcla de volúmenes fijos de diluciones conocidas de desinfectante
con un volumen fijo de inóculo
– Tiempo de contacto definido (Incubación)
– Cultura microbiana para contar
Prueba de portador
Objetivo
– Desinfectantes potenciales para superficie e instrumento en condiciones que
simulan la aplicación
– Se pueden probar bacterias, hongos y esporas
• Método
– Clasificado por el modo de aplicación del producto
o Desinfectante directamente vertido sobre la superficie del portador
ü Producto utilizado para la desinfección de superficies (vidrio, acero
inoxidable, plástico)
ü Método recomendado y tiempo a temperatura ambiente
Después de la incubación, cultivo para la cuantificación del sobreviviente
Prueba de portador
– Clasificado por el modo de aplicación del producto
o Portador sumergido en la dilución desinfectante
o Desinfectante disperso por pulverización o aerosol
– La actividad evaluada varia según el método de aplicación

– Durante la etapa de secado, las bacterias mueren
- Control posterior requerido
Prueba de uso y campo
• Objetivo
– Eficiencia de un desinfectante aplicado a un procedimiento definido
– Prueba del desinfectante y procedimiento de aplicación
– Verificar las condiciones de aplicación en suspensión o prueba de portador
– Dificultad para comparar varios procedimientos
• Método
– Prueba realizada en procedimientos en campo como plantas alimenticias, hospitales, etc.
– Después de la desinfección, no se debe detectar contaminación residual
• Interpretación
– Interpretación de endpoints (Sin supervivientes)
– Enfoque no cuantitativo para la reducción de la flora
Clasificación basada en el objetivo
• Prueba básica
– Evaluar las cualidades intrínsecas de un desinfectante
– Pruebas bactericidas, fungicidas, esporicidas o virucidas
• Prueba de aplicación
– Determinar las mejores condiciones de aplicación
– Cepas comunes y especificadas en un procedimiento definido
– Concentración, tiempo de exposición y temperatura
• Prueba en uso y de campo

– Evaluar el resultado de un desinfectante
– Verificar la eficacia en un procedimiento definido
Actividad bactericida básica – EN 1040
Prueba de suspensión de fase 1

• EN 1040 es una prueba de suspensión de
fase 1 para la evaluación de la actividad
bactericida básica en desinfectantes
químicos.
• Aplicable a las sustancias activas (biocidas
antibacterianos) y a las formulaciones en
desarrollo.
Condiciones de la prueba y requerimientos
Método
• Se agregan 8 partes del producto de prueba a 1 parte de microorganismo
de prueba y 1 parte de agua.
• Se permite que la mezcla interactúe durante el tiempo de contacto.
• Se agrega una parte de la mezcla a 8 partes de neutralizador y 1 parte de
agua durante 5 minutos para detener la actividad bactericida.
• A continuación, se adquiere la mezcla final y se incuba durante 2 días para
permitir que proliferen las bacterias supervivientes (si las hubiera).
• La colonia bacteriana se cuenta y se compara con el tamaño del cultivo
original.
Reducción logarítmica
• La reducción logarítmica se refiere a la medida en que un producto es
capaz de reducir la cantidad de microbios.
• Por ejemplo, una reducción de 4 log significa que la cantidad de
microorganismos en una superficie se ha reducido 10 000 veces.
• Se dice que un producto que tiene una eficacia del 99,9 % contra cierto
microbio ha logrado una reducción logarítmica de 3 contra ese microbio.
• Para que un producto pase la norma EN 1040, debe poder lograr una
reducción logarítmica de 5 frente a los microorganismos de prueba.
• En otras palabras, el producto debe poder matar el 99,999 % de las
bacterias mientras cumple con todos los demás requisitos de la Estándar
europeo
Resultados de las pruebas
Resultados de las pruebas - Investigaciones
Fuente: Rajabi, O., Bazzaz, B. S. F., Vaseghi, A. R., & Salari, R. (2011).
Actividad bactericida básica
Método y referencia EN 1040 (1997) – Fase 1 Prueba de suspensión
Neutralización por dilución (preferencia) Filtración de membrana
(si la neutralización falla)
Objetivo Actividad bactericida básica de desinfectantes químicos y antisépticos (Clasificación como
bactericida)
Cepa P. aeruginosa ATCC 15442
S. aureus ATCC 6538
Inóculo Suspensión ajustada del cultivo de agar obtenido en condiciones especificadas
Número de células viables en presencia de antiséptico o desinfectante: 1,5 x 107 a 5 x 107
ufc/mL
Diluyente para el producto y Agua destilada; la solución de prueba del producto es 1,25 veces la concentración de
concentraciones probadas prueba requerida (máximo probado 80%). Al menos tres diluciones, incluidas al menos
dos diluciones en el rango activo
Tiempo de contacto y 1, 5, 15, 30, 45, or 60 min a 20°
temperatura
NTC 5150 Antisépticos y desinfectantes Actividad Bactericida Básica. Método de prueba y requisito.
https://dokumen.tips/documents/ntc-5150-antisepticos-y-desinfectantes-actividad-bactericida.html?page=8

Eliminación del producto Transferencia de la mezcla desinfectante de Transferencia de la mezcla
ensayado en las subculturas microorganismos (1 ml) en neutralizador desinfectante de microorganismos (0,1
adecuado validado simultáneamente – ml) al aparato de filtración. Lavado en
(Dilución: 1/10) condiciones validadas
simultáneamente con el posible uso de
neutralizador – (Dilución: 1/10)
Recuento de supervivientes Recuento de supervivientes en la mezcla Membrana colocada en medio de agar
neutralizada por inclusión en medio agar
Incubación Incubación a 36°C o 37°C durante 48h

Interpretación Compruebe que todos los controles se ajustan a los valores fijos y que el neutralizador (o
el procedimiento de filtración) está validado.
Calcular la reducción de viabilidad.
El producto pasa la prueba si demuestra una reducción de 105 (o más) en la viabilidad en
60 minutos (o menos) con ambos microoragnismos.
Incubación a 36°C o 37°C durante 48h
Se requieren pruebas adicionales (fase 2, paso 1 y paso 2) para calificar el producto para
un uso específico.
Actividad fungicida básica - EN 1275
EN 1275 es una prueba de

suspensión de fase 1 para la
evaluación de la actividad
bactericida básica en desinfectantes
químicos.
• Se agregan 8 partes del producto de prueba a 1 parte de microorganismo
de prueba y 1 parte de agua.
• Se permite que la mezcla interactúe durante el tiempo de contacto.
• Se agrega una parte de la mezcla a 8 partes de neutralizador y 1 parte de
agua durante 5 minutos para detener la actividad fungicida o levuricida.
• Se adquiere la mezcla final y se incuba durante 3 días para permitir que
proliferen las levaduras u hongos supervivientes (si los hay).
• La colonia levuricida o fungicida se cuenta y se compara con el tamaño del
cultivo original.
Reducción Logarítmica
reducción logarítmica de 4 frente a los microorganismos de prueba
respectivos para actividades fungicidas y levuricidas.
• El producto debe ser capaz de matar el 99,99 % de levaduras u
hongos y cumplir con todos los demás requisitos de la norma
europea.
Resultados de las pruebas
Actividad fungicida básica
Objetivo Actividad fungicida básica de desinfectantes químicos y antisépticos (Clasificación como
bactericida)
Cepa C. albicans ATCC 10231
A. niger ATCC 16404
ufc/mL
Diluyente para el producto y Agua destilada; la solución de prueba del producto es 1,25 veces la concentración de
concentraciones probadas prueba requerida (máximo probado 80%). Al menos tres diluciones, incluidas al menos
dos diluciones en el rango activo
Tiempo de contacto y 5, 15, 30 o 60 min a 20°
temperatura
Eliminación del producto Transferencia de la mezcla desinfectante de Transferencia de la mezcla
ensayado en las subculturas microorganismos (1 ml) en neutralizador desinfectante de microorganismos (0,1
Recuento de supervivientes Recuento de supervivientes en la mezcla Membrana colocada en medio de agar
neutralizada por inclusión en medio agar
Incubación Incubación a 30°C (Más 24h o más con A. niger)

Calcular la reducción de viabilidad. El producto pasa la prueba si demuestra una
reducción de 104 (o más) en la viabilidad en 60 minutos (o menos) con ambos
microoragnismos.
Se requieren pruebas adicionales (fase 2, paso 1 y paso 2) para calificar el producto para
un uso específico.
Prueba de aplicación: Actividad bactericida
• La norma se refiere a los parámetros a ser observados al
ensayar productos para desinfección general en las áreas
alimenticia, industrial, doméstica e institucional.
• Esto incluye el microorganismo de prueba, la temperatura
de prueba, el tiempo de contacto y la sustancia que
interfiere.
• Microorganismo de prueba se refiere a la lista obligatoria de
microbios. Microorganismos obligatorios representan a todos
los microbios de su grupo.
• La temperatura de prueba se refiere a la temperatura en la
que se debe realizar la prueba.
• La suposición general es que los desinfectantes son menos
efectivos a bajas temperaturas en comparación con
temperaturas más altas.
• El tiempo de contacto se refiere a la duración mínima que un
producto debe permanecer en contacto con los microbios
para que el producto sea efectivo.
• La sustancia que interfiere se refiere a la sustancia utilizada en
la prueba para simular los posibles contaminantes que
coexisten con los microbios en el entorno actual.
Prueba de aplicación: Actividad bactericida EN
1276
1276
• En una prueba de suspensión de fase 2, paso 1, se agregan 8 partes del producto
de prueba a 1 parte de microorganismo de prueba y 1 parte de sustancia de
interferencia.
• Se permite que la mezcla interactúe durante el tiempo de contacto. Se agrega
una parte de la mezcla a 8 partes de neutralizador y 1 parte de agua durante 5
minutos para detener la actividad bactericida.
• A continuación, se adquiere la mezcla final y se incuba durante 2 días para
permitir que proliferen las bacterias supervivientes (si las hubiera).
• La colonia bacteriana se cuenta y se compara con el tamaño del cultivo original.
1276
1276
Reducción logarítmica
reducción de 5 log frente a los microorganismos de prueba.
• En otras palabras, el producto debe poder matar el 99,999 % de las
bacterias mientras cumple con todos los demás requisitos de la
Estándar europeo
1276
Método y referencia EN 1276 (1997) – Fase 2 Paso 1 Prueba de suspensión
Objetivo Actividad bactericida de desinfectantes químicos y antisépticos utilizados en áreas
alimentarias, industriales, domésticas e institucionales
E. coli ATCC 10536
S. aureus ATCC 6538
E. hirae ATCC 10541
Cepas adicionales: S. typhimurium, Lactobacillus brevis, E. cloacae o cualquier cepa
adecuada según las prescripciones de la norma
ufc/mL
Diluyente para el producto y Agua dura estandarizada (Agua destilada para productos listos para usar). La solución de
concentraciones probadas prueba del producto es 1,25 veces la concentración de prueba requerida (máximo
probado 80%). Al menos tres diluciones, incluyendo al menos una en el rango activo y una
en el rango inactivo.
Interfering substances Albúmina bovina: condiciones limpias (0,3 g/L) y sucias (3 g/L); leche desnatada (1% v/v);
extracto de levadura; sacarosa; tampones, sulfato de laurio de sodio según el uso del
producto
Contact time and 5 min y tiempo adicional: 1, 15, 30 y 60 min 20°C y temperaturas adicionales: 4°C, 10°C o
temperature 40°C
Elimination of the tested Transferencia de la mezcla desinfectante de Transferencia de la mezcla

product in the subcultures microorganismos (1 ml) en neutralizador desinfectante de microorganismos (0,1
Incubación Incubación a 36°C o 37°C durante 48h (o condiciones adaptadas para cepas adicionales)
Calcular la reducción de viabilidad for each strain and each experimental condition.
• Para aplicación general: el producto es bactericida a la concentración que demuestra
una reducción de 105 (o más) de la viabilidad en 5 min a 20°C, en condiciones limpias o
sucias, con cada una de las cuatro cepas de referencia.
• Para aplicación específica: el producto es bactericida a la concentración que demuestra
una reducción de 105 (o más) de la viabilidad en 5 min a 20 °C, con cada una de las cuatro
cepas de referencia y, si es necesario, con cepas adicionales, en condiciones
experimentales adicionales (tiempo de exposición, temperatura, sustancias interferentes).
Se requieren pruebas adicionales (fase 2, paso 2) para calificar el producto para un uso
específico.
Prueba de aplicación: prueba de superficie
cuantitativa de acitividad bactericida
Método y referencia WI 216028 (CEN Requerimiento 1999) – Fase 2 Paso 2 Prueba de superficie
Prueba de superficie sin acción mecánica
Objetivo Actividad bactericida en superficies de desinfectantes químicos y antisépticos utilizados

en áreas alimentarias, industriales, domésticas e institucionales
E. coli ATCC 10536
S. aureus ATCC 6538
E. hirae ATCC 10541
Cepas adicionales: S. typhimurium, Lactobacillus brevis, E. cloacae o cualquier cepa
adecuada según las prescripciones de la norma
1,5 x 108 a 5 x 108 ufc/mL
Suspensión ajustada mezclada con un volumen igual de la sustancia interferente elegida
0,05 ml de la mezcla dejada caer sobre el portador, seca a 37 °C
Diluyente para el producto y Agua dura estandarizada (Agua destilada para productos listos para usar). Al menos tres
concentraciones probadas diluciones, incluyendo al menos una en el rango activo y una en el rango inactivo. 0,1 ml
de dilución del producto aplicada sobre el portador contaminado
Sustancias interferentes Albúmina bovina: condiciones limpias (0,3 g/L) y sucias (3 g/L); leche desnatada (1% v/v);
extracto de levadura; sacarosa; tampones, sulfato de laurio de sodio según el uso del
producto
Tiempo de contacto y 5 min y tiempo adicional: 1, 15, 30 y 60 min - 18 °C a 25 °C y temperaturas adicionales: 4
temperatura °C, 10 °C o 40 °C
Eliminación del producto Transferencia del portador al neutralizador adecuado (validado simultáneamente) en
ensayado en las subculturas presencia de perlas de vidrio y agitación en condiciones específicas.
Portador Discos de acero inoxidable (2 cm de diámetro), lavados, enjuagados y tratados
con isopropanol en condiciones especificadas
Recuento de sobrevivientes Recuento de supervivientes en la mezcla neutralizada (sin diluir y diluida) por inclusión
en medio agar. Inclusión del transportín en el medio de agar en condiciones
especificadas
Incubación Incubación a 36°C o 37°C durante 48h
Interpretación Compruebe que la muerte espontánea de las células del inóculo en el portador es
inferior a 2 log.
Compruebe que el neutralizador validó.
Compruebe que para las concentraciones activas el número de células. el resto en el
transportista es inferior a 100.
Calcular la reducción de viabilidad para cada cepa y cada condición experimental.
• Para aplicación general: El producto es bactericida a la concentración que
demuestra una reducción de 104 (o más) de la viabilidad en 5 min a 20 °C, en
condiciones limpias o sucias, con las cuatro cepas de referencia.
Para aplicación específica: El producto es bactericida a la concentración que
demuestra una reducción de 104 (o más) en la viabilidad en 5 min a 20 °C, en
condiciones limpias o sucias, con las cuatro cepas de referencia y, si es necesario, con
cepas adicionales, en condiciones experimentales adicionales (tiempo de exposición,
temperatura, sustancias interferentes).
Trabajo de investigación
• Trabajo individual
• Realizar un estudio y diferenciación de los diferentes tipos de
desinfectantes aplicados en la industria, validar su uso y
efectividad.
• Fecha de entrega: Jueves 25 de Agosto
Referencias
• Rajabi, O., Bazzaz, B. S. F., Vaseghi, A. R., & Salari, R. (2011).
Standardizing the bactericidal activities of silver nanoparticles
made by electrochemical reduction and comparing it with Deconex
53 instrument. Iranian Journal of Pharmaceutical Research:
IJPR, 10(3), 481.
• Microbiological testing services
https://www.viroxylabs.com/microbiological-testing-services/

Evaluación de Desinfectantes

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Evaluación de Desinfectantes

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Evaluación de Desinfectantes

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Microbiología II

Facultad de Ciencias Químicas

*Puede causar daño cosmético y funcional

– Diferentes mecanismos y de actividad

– Efecto inhibitorio y efecto postexposición

• Amplio espectro de eficiencia según el entorno en uso

• Tiempo de exposición: 15 a 60 minutos – Variar según la formación de las pruebas

• Varias pruebas en muchos países

• Tipos de prueba metodológica

– La actividad evaluada varia según el método de aplicación

• Prueba en uso y de campo

Prueba de suspensión de fase 1

Método y referencia EN 1040 (1997) – Fase 1 Prueba de suspensión

Incubación Incubación a 36°C o 37°C durante 48h

EN 1275 es una prueba de

Incubación Incubación a 30°C (Más 24h o más con A. niger)

Elimination of the tested Transferencia de la mezcla desinfectante de Transferencia de la mezcla

Objetivo Actividad bactericida en superficies de desinfectantes químicos y antisépticos utilizados

También podría gustarte