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ESTUDIO DE LA IMPLICACIÓN DE LOS
GENES Rv1686c-Rv1687c y Rv3161c DE

Mycobacterium tuberculosis EN LA
RESISTENCIA A FÁRMACOS
ANDROMEDA CELESTE GÓMEZ CAMACHO
2013

Departament de Genètica i de Microbiologia

Institut de Biotecnologia i de Biomedicina
Estudio de la implicación de los genes

Rv1686c-Rv1687c y Rv3161c de
Mycobacterium tuberculosis en la
resistencia a fármacos
Tesis Doctoral presentada por

Andromeda Celeste Gómez Camacho
para optar al Grado de Doctora
Visto bueno de los Directores de la Tesis,
Dr. Isidre Gibert González Dra. Núria Andreu Martín

A mi familia y a Gustavo
Nuestra recompensa se encuentra en el esfuerzo y no en el resultado. Un
esfuerzo total es una victoria completa
Mahatma Gandhi
Índice
Índice
Índice
Resumen ........................................................................................ vii
Abstract ........................................................................................... ix
Abreviaturas ................................................................................... xi
1. Introducción ................................................................................ 1
1.1. La Tuberculosis en el mundo ........................................................................... 1
1.2. Mycobacterium tuberculosis ............................................................................ 4
1.2.1. Características generales del género Mycobacterium .................................. 4
1.2.2. Genoma de M. tuberculosis .......................................................................... 6
1.2.3. Proteoma de M. tuberculosis......................................................................... 8
1.2.4. Envuelta de M. tuberculosis ........................................................................ 10
1.2.4.1. Membrana celular ................................................................................. 12
1.2.4.2. Pared celular......................................................................................... 12
1.2.4.3. Cápsula ................................................................................................. 13
1.2.4.4. Proteínas similares a porinas ............................................................... 13
1.3. Patogénesis ...................................................................................................... 14
1.4. Interacciones huésped-patógeno ................................................................... 16
1.4.1. Factores de virulencia ................................................................................. 16
1.4.2. Respuesta inmune ...................................................................................... 17
1.4.2.1. Mecanismos de evasión de la respuesta inmune ................................. 19
1.5. Diagnóstico ...................................................................................................... 21
1.6. Prevención ........................................................................................................ 23
1.6.1. BCG ............................................................................................................. 23
i
Índice
1.6.2. Nuevas vacunas .......................................................................................... 24
1.7. Tratamiento ...................................................................................................... 27
1.7.1. Esquema general ........................................................................................ 27
1.7.2. Tratamiento de cepas resistentes y multirresistentes ................................. 29
1.7.3. Tratamiento de pacientes VIH positivo........................................................ 30
1.7.4. Nuevos fármacos ........................................................................................ 31
1.8. Resistencia ....................................................................................................... 32
1.8.1. Mecanismos de Resistencia ........................................................................ 33
1.8.1.1. Sistemas de eflujo ................................................................................ 34
1.8.1.1.1. Transportadores ABC .................................................................... 36
1.8.1.1.2. Transportadores MFS .................................................................... 37
1.8.1.1.3. Transportadores MATE .................................................................. 38
1.8.1.1.4. Transportadores SMR .................................................................... 38
1.8.1.1.5. Transportadores RND .................................................................... 39
1.8.1.2. Resistencia por modificación o degradación enzimática del antibiótico 39
1.8.1.2.1. Hidrólisis ......................................................................................... 40
1.8.1.2.2. Resistencia por transferencia de grupo ......................................... 41
1.8.1.2.3. Otros mecanismos de resistencia enzimática ................................ 42
1.8.1.2.3.1. Enzimas redox ......................................................................... 42
1.8.1.2.3.2. Liasas ...................................................................................... 42
1.8.1.3. Resistencia por alteración de la diana .................................................. 43
1.8.2. Papel de los biocidas en resistencia ........................................................... 43
1.8.2.1. Triclosán ............................................................................................... 44
1.8.3. Mecanismos de resistencia en M. tuberculosis ........................................... 47
1.8.3.1. Resistencia intrínseca ........................................................................... 48
1.8.3.1.1 Sistemas de eflujo ........................................................................... 48
ii
Índice
1.8.3.1.2. Sistemas de modificación .............................................................. 53
1.8.3.2. Resistencia adquirida ........................................................................... 54
1.8.3.3. Inducción de sistemas de detoxificación en M. tuberculosis ................ 57
1.8.3.3.1. Posibles sistemas de detoxificación de M. tuberculosis Rv1685c-

Rv1686c-Rv1687c y Rv3160c-Rv3161c ........................................................ 57
2. Objetivos ...................................................................................... 3
3. Materiales y métodos ................................................................ 63
3.1. Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos ....................................... 63
3.2. Métodos microbiológicos ............................................................................... 65
3.2.1. Medios de cultivo, antibióticos y otras soluciones ....................................... 65
3.2.1.1. Medios de Cultivo ................................................................................. 65
3.2.1.2. Antibióticos ........................................................................................... 67
3.2.1.3. Otras soluciones ................................................................................... 68
3.2.2. Condiciones de crecimiento y conservación de cepas................................ 68
3.3. Métodos genéticos .......................................................................................... 69
3.3.1. Transformación ........................................................................................... 69
3.3.1.1. Transformación de E. coli ..................................................................... 70
3.3.1.2. Electroporación de Mycobacterium ...................................................... 71
3.4. Métodos de manipulación de DNA ................................................................. 73
3.4.1. Miniextracción de DNA plasmídico de E. coli .............................................. 73
3.4.2. Extracción de DNA plasmídico de Mycobacterium ..................................... 76
3.4.3. Electroforesis de DNA en geles de agarosa ............................................... 77
3.4.4. Purificación de fragmentos de DNA de geles de agarosa........................... 79
3.4.5. Digestión con enzimas de restricción .......................................................... 80
3.4.6. Clonación en vectores plasmídicos ............................................................. 80

iii
Índice
3.4.6.1 Obtención de extremos romos ............................................................... 80
3.4.6.2. Desfosforilación .................................................................................... 81
3.4.6.3 Ligación ................................................................................................. 81
3.4.7. Amplificación y secuenciación de DNA ....................................................... 82
3.4.7.1. PCR ...................................................................................................... 82
3.4.7.2. Secuenciación ...................................................................................... 84
3.4.8. Mutagénesis ................................................................................................ 85
3.5. Métodos de manipulación de RNA ................................................................. 92
3.5.1. Extracción de RNA total .............................................................................. 92
3.5.2. Análisis cuantitativo y cualitativo del RNA ................................................... 95
3.5.2.1. Cuantificación por espectrofotometría .................................................. 96
3.5.2.2. Cuantificación por Nanodrop ................................................................ 96
3.6. Métodos de manipulación de proteínas ........................................................ 96
3.6.1. Obtención de extractos proteicos ................................................................ 96
3.6.2. Determinación de la concentración de proteínas ........................................ 97
3.6.3. Electroforesis de proteínas .......................................................................... 98
3.6.4. Geles bidimensionales (2DE) .................................................................... 101
3.6.4.1. Obtención de extractos proteicos para 2DE ....................................... 102
3.6.4.2. Determinación de la concentración de proteínas para 2DE ............... 103
3.6.4.3. Limpieza de la muestra para el IEF .................................................... 104
3.6.4.4. Primera dimensión (IEF) ..................................................................... 105
3.6.4.5. Segunda dimensión ............................................................................ 110
3.6.4.6. Tinción con plata ................................................................................. 113
3.6.4.7. Análisis de Imágenes .......................................................................... 114
iv
Índice
3.6.4.8. Extracción de spots ............................................................................ 115
3.6.4.9. Desteñido de spots ............................................................................. 115
3.6.4.10. Digestión enzimática ......................................................................... 115
3.6.4.11. Purificación de la muestra ................................................................ 116
3.6.5. Espectrometría de masas ......................................................................... 116
3.6.6. Electroforesis en Gel Diferencial 2-D (2D-DIGE) ...................................... 120
3.6.6.1. Preparación de la Muestra para 2D-DIGE .......................................... 121
3.6.6.2. Reconstitución de los fluoróforos ........................................................ 121
3.6.6.3. Marcaje de las muestras ..................................................................... 122
3.6.6.4. Preparación de las muestras para la primera dimensión (IEF) .......... 122
3.7. Análisis de la expresión génica .................................................................... 123
3.7.1. RT-PCR ..................................................................................................... 123
3.7.2. PCR en Tiempo Real (Real time-PCR) ..................................................... 124
3.8. Métodos de caracterización fenotípica ........................................................ 126
3.8.1. CMI ............................................................................................................ 126
3.8.1.1. Ensayo en microplaca de la resazurina (REMA) ................................ 126
3.8.2. Ensayo de permeabilidad .......................................................................... 129
3.9. Métodos de manipulación de cultivos celulares ........................................ 130
3.9.1. Mantenimiento y manipulación de líneas celulares ................................... 130
3.9.1.1. Congelación de las células ................................................................. 130
3.9.1.2. Descongelación de las células ........................................................... 131
3.10. Análisis de la virulencia de M. tuberculosis en macrófagos ................... 131
3.10.1. Preparación de stocks de cultivos de para la infección........................... 131
3.10.2. Ensayo de infección ................................................................................ 131
v
Índice
3.10.3. Ensayo de resistencia al peróxido de hidrógeno..................................... 133
4. Resultados ............................................................................... 135
4.1. Estudio del efecto del triclosán sobre la expresión de los genes Rv1687c y
Rv3161c ................................................................................................................. 135
4.2. Construcción de los mutantes Rv1686c-Rv1687c y Rv3161c en M.

tuberculosis ........................................................................................................... 135
4.2.1. Mutante del transportador ABC (Rv1686c-Rv1687c) ................................ 136
4.2.2. Mutante de la dioxigenasa (Rv3161c) ....................................................... 138
4.3. Construcción de cepas sobreproductoras de Rv1686c-Rv1687c y Rv3161c

................................................................................................................................ 140
4.3.1. Comprobación de las cepas sobreproductoras ......................................... 140
4.4. Caracterización fenotípica de las cepas mutantes y sobreproductoras .. 146
4.4.1. Crecimiento y morfología colonial ............................................................. 146
4.4.2. Análisis de susceptibilidad a compuestos ................................................. 146
4.4.3. Estudio de la virulencia ............................................................................. 148
4.4.4. Estudio de la resistencia al H2O2 ............................................................... 149
4.5. Estudio de la resistencia a triclosán en M. tuberculosis ........................... 150
4.5.1. Implicación de bombas de eflujo ............................................................... 150
4.5.2. Implicación de la envuelta celular ............................................................. 151
4.5.3. Análisis proteómico ................................................................................... 152
5. Discusión ................................................................................. 159
6. Conclusiones ........................................................................... 167
7. Bibliografía .............................................................................. 169
vi
Resumen
Resumen
Resumen
La tuberculosis es considerada como una de las enfermedades infecciosas

más importantes del mundo. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud un
tercio de la población mundial ha estado expuesta al agente causal Mycobacterium
tuberculosis, que causa cerca de dos millones de muertes al año. La complejidad y
duración del tratamiento, así como la aparición de cepas resistentes, exigen mejorar el
conocimiento de los mecanismos de resistencia así como desarrollar nuevos fármacos
o inhibidores que sean más eficaces.
La resistencia de M. tuberculosis a antimicrobianos es debida a varios

mecanismos operan en muchos casos simultáneamente. Entre ellos están las
mutaciones en genes diana, la producción de enzimas que modifican o inactivan
fármacos, la baja permeabilidad de la pared celular y las bombas de eflujo. Muchos de
estos mecanismos de detoxificación son inducidos por diferentes compuestos incluidos
los fármacos utilizados para el tratamiento. Estudios previos mostraron que el
triclosán, un biocida con alta actividad antimicrobiana, induce en M. tuberculosis dos
posibles sistemas de detoxificación: una posible dioxigenasa codificada por Rv3161c y
un posible transportador tipo ABC codificado por Rv1686c-Rv1687c, sugiriendo que
estos sistemas podrían tener un papel en el bajo efecto del triclosán en M.
tuberculosis. También, se ha observado que el transportador ABC Rv1686c-Rv1687c
se induce en macrófagos activados, en respuesta al H2O2 y a la privación de nutrientes
sugiriendo que podría tener un papel en la virulencia de la bacteria.
En este contexto, el objetivo de este trabajo fue evaluar el papel de estos

sistemas en la resistencia al triclosán y otros compuestos así como en la virulencia de
M. tuberculosis. Para ello se estudió el efecto del triclosán a nivel transcripcional en la
cepa H37Rv en donde se detectaron altos niveles de expresión de los genes Rv1687c
y Rv3161c, confirmando que estos sistemas se inducen en presencia del biocida tal y
como había sido reportado en la literatura. Posteriormente, se obtuvieron mutantes
deficientes y cepas sobreproductoras de ambos sistemas que se usaron para evaluar
la CMI del triclosán y otros fármacos. Sin embargo, contrario a lo que se esperaba, no
se observaron diferencias en las CMIs de estas cepas y las de los controles. Así
mismo, se estudió el papel de estas proteínas en la virulencia, infectando macrófagos
murinos con cepas deficientes y sobreproductoras de ambos sistemas. Los resultados
no mostraron ningún efecto en la virulencia ni en la proliferación del bacilo en el interior
de los macrófagos.
vii
Resumen
A continuación se estudiaron otros factores que podrían estar implicados en la

resistencia intrínseca de M. tuberculosis al triclosán. Así se comprobó que la
impermeabilidad de la envuelta celular estaría en parte implicada en la resistencia al
biocida. También se estudió el papel de las bombas de eflujo utilizando inhibidores de
las mismas. Los resultados no mostraron evidencia de la participación de bombas de
eflujo en la resistencia al biocida. Finalmente se analizó el efecto del triclosán a nivel
proteómico detectándose un aumento en la abundancia de la proteína codificada por
Rv3161c y una disminución de las proteínas ThiC y PepQ.
Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que aunque la dioxigenasa

Rv3161c y el transportador ABC Rv1686c-Rv1687c se inducen en presencia del
triclosán, no están implicados en la resistencia de M. tuberculosis a este biocida ni a
otros fármacos ensayados en este trabajo. La inducción de estos sistemas podría
estar relacionada con algún mecanismo de detoxificación de metabolitos generados en
respuesta al daño celular provocado por el triclosán.
viii
Abstract
Abstract
Abstract
Tuberculosis remains one of the most widespread infectious diseases in the

world. According to the World Health Organisation, a third of the world’s population has
been exposed to Mycobacterium tuberculosis, the causative agent, which causes
around two million deaths a year. The complexity and duration of the treatment, as well
as the emergence of drug-resistant strains, require a better knowledge of the drug-
resistance mechanisms and the development of new drugs or inhibitors that are more
effective.
The resistance of M. tuberculosis to antimicrobials is due to multiple

mechanisms operating simultaneously in many cases. These include mutations in the
target genes, production of enzymes that modify or inactivate drugs, low cell-wall
permeability and efflux pumps. Many of these detoxification mechanisms are induced
by different compounds, including the drugs used in treatment. Previous studies have
shown that triclosan, a biocide with high antimicrobial activity, induces two possible
detoxification systems in M. tuberculosis: a dioxygenase encoded by Rv3161c and an
ABC transporter encoded by Rv1686c-Rv1687c, suggesting that these systems could
play a role in the limited effect of triclosan on M. tuberculosis. It has also been
observed that the ABC transporter Rv1686c-Rv1687c is induced in response to H2O2
and to the lack of nutrients, suggesting that this could play a role in the virulence of the
bacteria.
In this context, the objective of this work was to assess the role of these
systems in the resistance to triclosan and other compounds as well as in the virulence
of M. tuberculosis. To do this, the effect of triclosan on transcriptional activity was
assessed in the strain H37Rv in which high levels of expression of the genes Rv1687c
and Rv3161c were detected, confirming that these systems are induced in the
presence of the biocide, as had been reported in the literature. Then, deficient mutants
and overproducing strains of both systems were used to assess the MIC of triclosan
and other drugs. However, contrary to what was expected, no differences were
observed in the MICs between these strains and the control. The role of these proteins
in the virulence was also studied by infecting murine macrophages with deficient and
overproducing strains of both systems. The results did not show an effect on either the
deficiency or overproduction in the virulence and proliferation of the bacillus inside the
macrophages.
ix
Abstract
In order to identify the mechanisms related to the intrinsic resistance of M.

tuberculosis to triclosan, the role of the cell envelope was assessed, and it was
confirmed that biocide resistance may be related to its impermeable nature. The role of
other possible efflux pumps was studied using inhibitors, and there was no evidence of
the participation of any pump mediating in the biocide resistance. The effect of triclosan
on M. tuberculosis proteome was also assessed in which an increase in the protein
encoded by Rv3161c and a reduction in the proteins ThiC and PepQ were detected.
The results obtained in this work suggest that although the dioxygenase
Rv3161c and the ABC transporter Rv1686c-Rv1687c are induced in the presence of
triclosan, they are not involved in the resistance of M. tuberculosis to this biocide or to
other drugs tested in this work. The induction of these systems could be related to a
detoxification mechanism of metabolites generated in response to the cell damage
caused by triclosan.
x
Abreviaturas
Abreviaturas
Abreviaturas
2DE 2 Dimensional electrophoresis, electroforesis bidimensional

ABC ATP-binding cassette, cassette de unión a ATP
ACN Acetonitrilo
AES Alellic Exchange Substrate, sustrato de intercambio alélico
ASB-14 Amidosulfobetaine-14, amidosulfobetaina 14
ATCC American Type Culture Collection, colección americana de cultivos tipo
BCG Bacilo de Calmette y Guérin
BrEt Bromuro de Etidio
BSA Bovine Serum Albumin, albúmina de suero bovino
CCCP Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone, carbonilcianuro-m-
clorofenilhidrazona
CD Cluster of differentiation, grupo de diferenciación
CDC Centers for Disease Control and Prevention, centro para el control y la
prevención de enfermedades
CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate,
3-[(3-cloroamido propil) dimetilamonio]-1-propanosulfato
CMI Concentración Mínima Inhibitoria
CTAB Cetyl trimethylammonium bromide, bromuro de cetiltrimetilamonio
DIGE Difference Gel Electrophoresis, electroforesis en gel diferencial
DMF Dimetilformamida
DNA Deoxyribonucleic acid, acido desoxirribonucleico
dsDNA double stranded DNA: DNA de doble cadena
DTT Dithiothreitol, ditiotreitol
FBS Fetal Bovine Serum, suero fetal bovino
Fc Fc Receptor, receptor de la fracción cristalizable
GC Guanina y Citosina
GTC Tiocianato de Guanidina
Hyg Higromicina
HCCA Ácido α-ciano-4-hidroxicinámico
IEF IsoElectric Focusing, enfoque isoeléctrico
IL Interleuquina
IFN-γ Interferón γ
INH Isoniacida
IPG strip Immobiline™ DryStrip gel, tira de gradiente de pH inmovilizado
xi
Abreviaturas
KM Kanamicina
MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight,
desorción/ionización láser asistida por matríz-tiempo de vuelo
MATE Multidrug and toxic compound extrusión, familia de extrusión de
múltiples compuestos tóxicos y fármacos
MCS Multiple Cloning Site, sitio de clonación múltiple
MDR-TB Multidrug Resistant-Tuberculosis, tuberculosis multirresistente
MFS Major Facilitator Superfamily, superfamilia de facilitadores principales
MHC Major Histocompatibility Complex, complejo mayor de
histocompatibilidad
miscRNA Miscellaneous other RNA, otros ácidos ribonucleicos
MOI Multiplicity of infection, multiplicidad de infección
MPTR Major Polymorphic Tamdem Repeats, principales repeticiones
polimórficas en tandem
MR Mannose Receptors, receptores de manosa
mRNA Messenger RNA, ácido ribonucleico mensajero
MSD Membrane-Spanning Domains, dominio transmembranal
MSF Major Facilitator Superfamily, superfamilia de facilitadores principales
MTBC M. tuberculosis complex, complejo M. tuberculosis
MW Masa molecular
NBD Nucleotide-Binding Domain, dominio de unión a nucleótido
ncRNA Non-coding RNA, ácido ribonucleico no codificante
NK Natural Killer, célula asesina natural
OD Optical Density, densidad óptica
OMS Organización Mundial de la Salud
ORF Open Reading frame, marco abierto de lectura
PBS Phosphate buffered saline, tampón fosfato salino
PCR Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la polimerasa
PDIM Phthiocerol Dimycocerosates, dimicocerosato de ftiocerol
PGRS Polymorphic CG rich Sequences, secuencias polimórficas ricas en GC
pI Punto isoeléctrico
PMF Peptide mass fingerpint, huella peptídica
PPD Purified Protein Derivative, derivado proteico purificado
REMA Resazurin microtiter assay, ensayo en microplaca de la resazurina
RFF Relative Final Fluorescence, fluorescencia final relativa
RNA Ribonucleic acid, ácido ribonucleico
rRNA Ribosomal RNA, ácido ribonucleico ribosomal
xii
Abreviaturas
RND Resistance-Nodulation-Division, superfamilia de resistencia-nodulación-

división
RNI Reactive Nitrogen Intermediates, intermediarios reactivos del nitrógeno
ROI Reactive Oxygen Intermediates, intermediarios reactivos del oxígeno
RT-PCR Reverse Transcription-PCR, PCR con transcripción inversa
SBP Substrate Binding Protein, proteína de unión a sustrato
SDS Sodium dodecyl sulfate, dodecilsulfato sódico
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,
electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
SMR Small Multidrug Resistance, familia menor de resistencia a múltiples
fármacos
TAE Tris-Acetato-EDTA
TB Tuberculosis
TE Tris-EDTA
TFA Trifluoroacetic acid, ácido trifluoroacético
TLR Toll-like Receptor, receptor Toll-like
TNF-α Tumor Necrosis Factor-α, factor de necrosis tumoral-α
TRC Triclosán
tRNA Transfer RNA, RNA de transferencia
XDR-TB Extensively Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis, tuberculosis
extremadamente resistente.
xiii
Introducción
Introducción
1. Introducción
1.1. La Tuberculosis en el mundo
Aunque el impacto de la tuberculosis en el mundo ha sido muy fuerte en los

dos últimos siglos, la enfermedad ha coexistido con la humanidad por milenios. Existen
evidencias de la enfermedad en esqueletos del antiguo Egipto así como descripciones
de enfermedades respiratorias con síntomas similares a los de la tuberculosis en la
antigua Grecia, Asiria, China e India [1, 2]. Otros estudios han mostrado que contrario
a lo que se pensaba, la tuberculosis existió en el nuevo mundo 500 años antes del
descubrimiento; y prueba de ello fue el hallazgo de DNA bacteriano en una momia [3].
Varias hipótesis apuntan a que la tuberculosis se originó como resultado de un

cuello de botella evolutivo ocurrido hace 20.000 a 35.000 años probablemente en el
este africano y que posteriormente pudo haberse adaptado a animales (posiblemente
ganado) para luego ser transmitido a la población humana en la medida que los
animales fueron domesticados para la agricultura; sin embargo el origen preciso de la
tuberculosis es desconocido [4, 5].
Con el aumento de la industrialización en los siglos XVIII y IX junto con las

concentraciones urbanas en condiciones insalubres generaron un ambiente propicio
para la propagación de la enfermedad que se consideraba incurable, convirtiéndose en
una causa frecuente de muerte [6]. La epidemia en Europa y en los Estado Unidos
alcanzó su pico a finales de 1700 y principios de 1800; incluso llegando a desplazar a
enfermedades como el tifus o el cólera en Inglaterra [3]. Mucho se especulaba sobre la
enfermedad pero no fue hasta 1865 que el cirujano Jean-Antoine Villemin demostró
que la enfermedad era contagiosa, inoculando ratones con muestras provenientes de
lesiones humanas, aunque se desconocía el agente causal [6]. El 24 de marzo de
1882 se llevó a cabo uno de los anuncios más importantes en la historia de la
medicina de la época en el que Robert Koch demostró que una bacteria que tenía en
cultivo, aislada de lesiones tuberculosas era capaz de infectar animales de laboratorio
y reproducir la enfermedad con lo que pudo establecer que dicho microorganismo era
el agente causal de la tuberculosis [3, 6].
Koch continuó sus investigaciones encaminadas a obtener una cura para la

enfermedad y logró producir un extracto bacteriano al que llamó tuberculina, que utilizó
sin éxito como agente inmunizante y luego como tratamiento, pero que posteriormente
pudo ser usado como herramienta diagnóstica y que aún hoy es utilizada en una
versión más moderna [3]. Otro avance importante fueron los rayos X descubiertos en
1
Introducción
1895 por Wilhelm Konrad que permitió establecer la severidad de la enfermedad y

hacer un seguimiento del progreso de los pacientes [3]. A finales de 1800 se importó
de Europa a Estados Unidos un modelo en el que los pacientes eran internados en
sanatorios donde estaban bajo supervisión y se les brindaba cuidados en la
alimentación y se mantenían en reposo, por lo que se retiraron de las ciudades las
fuentes de contagio de la enfermedad. Por otro lado, a principios del siglo XX, se
realizaron campañas educativas en las que se enfatizaba en la importancia de la
buena higiene y los buenos hábitos de salud [3].
En los años veinte se implementó el uso de la vacuna Bacilo Calmette-Guerin

(BCG), derivada de una cepa de Mycobacterium bovis que inicialmente fue aislada en
1908 usando un medio específico y que se atenuó mediante una serie de pases en el
laboratorio. Los ensayos clínicos en India y África confirmaron su eficacia,
particularmente para la tuberculosis del sistema nervioso central y miliar; pero ensayos
posteriores mostraron que no era efectiva en algunas poblaciones [3, 7].
Una nueva etapa se dio con la introducción de fármacos anti-tuberculosos lo

que produjo una importante disminución de la mortalidad. Las sulfamidas y penicilinas
habían sido ya usadas durante varios años para tratar enfermedades infecciosas, pero
éstas eran ineficaces contra la tuberculosis [3]. En 1940 el grupo de Selman A.
Waksman logró aislar la actinomicina que mostró un efecto anti-tuberculoso, pero con
el inconveniente de que era tóxico en animales y humanos [7]. En 1943 se obtuvo la
estreptomicina, que mostró una máxima inhibición de la bacteria y una baja toxicidad
por lo que a finales de 1944 se implementó su uso en pacientes [8]. Aunque muchos
enfermos se curaron, una proporción importante sufrió recaídas de la enfermedad y
aislados de dichos pacientes mostraron resistencia al tratamiento [8]. Una sucesión de
nuevos fármacos anti-tuberculosos empezaron a aparecer en los siguientes años
como la tiazetazona y el ácido p-aminosalicílico (1948) que cuando se combinaban
con estreptomicina aumentaba la tasa de curación y disminuía la tasa de resistencia;
la isoniacida (INH) usada en 1951 en Nueva York que mejoró los resultados clínicos y
se introdujo para un uso más amplio; la pirazinamida (1952), cicloserina (1952),
etionamida (1956), rifampicina (1957) y el etambutol (1962) [7, 8].
Con la llegada de nuevos fármacos, se produjo la selección de mutaciones que

conferían resistencia y fue así como se implementó el uso de una terapia combinada
[8]. La mejora de la calidad de vida, la vacunación junto con la implementación de un
tratamiento hizo que algunos expertos declararan que la tuberculosis había sido
eliminada como problema de salud pública y fue así como en Estados Unidos se
2
Introducción
redujeron los fondos federales destinados a la investigación y por consiguiente se vio

afectado el descubrimiento de nuevos fármacos, el desarrollo de nuevos métodos
diagnósticos y la obtención de una vacuna más efectiva [8]. En 1985 hubo un
importante incremento en la incidencia de la enfermedad y en sitios como el África
subsahariana el aumento fue de hasta un 500%. Sin duda el VIH jugó un papel
importante en el resurgimiento de la tuberculosis en el mundo, donde factores como la
pobreza, el consumo de drogas y la falta de vivienda promovieron la co-infección con
el virus, también como la aparición de cepas de tuberculosis multirresistentes (MDR-
TB, Multidrug Resistance Tuberculosis) a fármacos por su uso inadecuado [7, 8].
En el año 1993 la Organización Mundial de la Salud (OMS) declaró la

tuberculosis como una emergencia de salud pública global por lo que en los años 1994
y 1995, se implementó un programa conocido como terapia de corta duración
observada directamente (DOTS, Directly Observed therapy Short-Course) [8, 9]. Este
programa consta de 5 componentes dirigidos al asegurar el compromiso político con
una financiación adecuada y sostenida, garantizar la detección temprana de casos y el
diagnóstico mediante pruebas de alta calidad, implementar una terapia estandarizada
con la supervisión y apoyo al paciente, asegurar la oferta y gestión de medicamentos
eficaces y hacer un seguimiento de los pacientes tratados [9]. En el año 2004 esta
estrategia fue adoptada por 183 países incluyendo 22 en los cuales la incidencia de la
enfermedad era muy alta. Adicionalmente, la OMS creó el programa DOTS-Plus
dirigido al control de cepas MDR-TB [7, 9].
Pese a los esfuerzos hechos a nivel mundial para contrarrestar la tuberculosis,

actualmente ésta permanece como una de las enfermedades infecciosas más
importantes. Así en el año 2011 se presentaron cerca de 9 millones de nuevos casos y
1.4 millones de muertes (Fig. 1.1), de las cuales 990.000 fueron de pacientes VIH
negativo y 430.000 pacientes VIH positivo [9]. En el año 2006 la OMS lanzó la
estrategia “Stop TB” como parte de los objetivos de desarrollo del milenio con el fin de
reducir la incidencia de la tuberculosis para el año 2015 y que la tasa de prevalencia y
mortalidad disminuyan a la mitad en comparación con los niveles obtenidos en 1990.
Los objetivos de esta estrategia son: el acceso a una atención de calidad, la protección
de poblaciones vulnerables, el soporte al desarrollo de nuevas herramientas
diagnósticas, así como de fármacos y vacunas facilitando su uso oportuno y efectivo; y
la promoción de la prevención y el cuidado y el control de la enfermedad [9].
3
Introducción
Incidencia
por
100.000
habitantes
No estimada
No aplicable
Figura 1.1. Incidencia global estimada de casos de tuberculosis en el 2011. Modificado de [9].
1.2. Mycobacterium tuberculosis
1.2.1. Características generales del género Mycobacterium
El género Mycobacterium introducido por Lehmann y Neuman en 1896 es el

único miembro de la familia Mycobacteriaceae perteneciente al orden Actinomycetales.
Este género es el más conocido por sus dos especies patógenas Mycobacterium
tuberculosis y Mycobacterium leprae, agentes causales de la tuberculosis y la lepra
respectivamente. Existen 158 especies y 13 subespecies pertenecientes a este
género, registradas en la base de datos “List of Prokaryotic names with Standing in
Nomenclature” hasta marzo de 2013 [10]. Los miembros de este género son bacilos
rectos o ligeramente curvos que miden de 0.2 a 0.6 µm por 1 a 10 µm, son aerobios o
microaerófilos, no móviles ni formadores de esporas, son resistentes a la decoloración
por una combinación ácido-alcohol, poseen un alto contenido de guanina-citosina (GC,
58%-70%) también como una alta concentración de lípidos en su pared y ácidos
micólicos de 60-90 carbonos lo que las hace muy hidrofóbicas [11, 12].
A nivel fenotípico, las especies de este género se pueden diferenciar en base a

su velocidad de crecimiento, siendo de crecimiento rápido las que requieren de una
semana o menos para crecer en medio sólido como por ejemplo Mycobacterium
smegmatis, y de crecimiento lento cuando requieren de más de una semana como M.
tuberculosis, esta diferenciación coincide con la clasificación a nivel filogenético [11]
(Fig. 1.2). También se pueden diferenciar teniendo en cuenta la temperatura de
4
Introducción
crecimiento que puede ser de 20°C a 50°C, el tiempo de duplicación (2-24 horas), la
morfología de las colonias (rugosas o lisas), la producción de pigmentos en presencia
o ausencia de luz en donde se denominan fotocromógenas (requieren de la luz para
formar pigmentos), escotocromógenas (forman pigmento en presencia o ausencia de
luz) y no cromógenas (no productoras de pigmentos) [11]. Además, son de utilidad las
propiedades bioquímicas específicas como la presencia o ausencia de algunas
enzimas como la ureasa, la arilsulfatasa y la catalasa, producción de niacina,
reducción de nitratos y susceptibilidad a pirazinamida y hidracida del ácido tiofeno-2
carboxílico (TCH) [11].
Micobacterias de
crecimiento
rápido
Micobacterias de
crecimiento lento
Figura 1.2. Árbol filogenético de 44 micobacterias a partir de las secuencias del rDNA 16S.
Tomado de [11].
Hasta los años ochenta, las características fenotípicas eran la única

herramienta disponible para clasificar las especies de micobacterias aunque éstas no
permitían en muchos casos precisar la identificación. En este contexto, herramientas
como la secuenciación de DNA, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR,
Polymerase Chain Reaction) y la hibridación DNA-DNA han permitido una clasificación
más adecuada así como la descripción y subsecuente adición de nuevas especies
[11].
Desde el punto de vista clínico, las micobacterias se pueden clasificar en tres

grupos principales: (1) patógenos estrictos, los cuales incluyen los patógenos
5
Introducción
humanos M. tuberculosis y M. leprae, así como el patógeno animal M. bovis; (2)

patógenos oportunistas o potencialmente oportunistas que incluyen a Mycobacterium
simiae, Mycobacterium avium y Mycobacterium xenopi y (3) patógenos raros que
incluyen saprófitos tales como M. smegmatis y Mycobacterium phlei [11, 13, 14].
También las micobacterias se agrupan en complejos: complejo M. tuberculosis (MTBC,
M. tuberculosis complex) que comprende siete miembros estrechamente relacionados:
M. tuberculosis, M. bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium pinnipedii,
Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti y Mycobacterium canettii; complejo
Mycobacterium avium- Mycobacterium intracellulare (MAC, M. avium-M. intracellulare
complex) cuyos miembros causan infecciones oportunistas en pacientes
inmunocomprometidos y complejo otras micobacterias (MOTT, Mycobacteria other
than the M. tuberculosis complex) para micobacterias no tuberculosas que incluye el
resto de las especies, algunas de las cuales han sido asociadas con enfermedades en
humanos [11, 13, 14].
Los miembros del complejo M. tuberculosis se caracterizan por tener sus

secuencias de rRNA 16s idénticas y una alta similitud genética (99.9%) aunque
exhiben fenotipos, patologías y huéspedes diferentes. Se ha sugerido que los
miembros de este complejo surgieron como resultado de la expansión clonal derivada
de un cuello de botella evolutivo y que pueden ser vistos como ecotipos que se han
adaptado a huéspedes diferentes [13]. La tuberculosis humana es causada
principalmente por M. tuberculosis también como por M. africanum que ha sido
principalmente aislada en países africanos, M. bovis que afecta también a bovinos y
M. canetti asilado en raras ocasiones. M. pinnipedii afecta pinnípedos, M. caprae
afecta cabras y cerdos y M. microti a roedores [13].
1.2.2. Genoma de M. tuberculosis
Uno de los avances más importantes en la investigación de la tuberculosis fue

la secuenciación del genoma de la cepa H37Rv en 1998, ya que ha proporcionado
información en cuanto a su fisiología, mecanismos de infección, patogénesis,
virulencia y persistencia [15]. Aunque queda mucho por dilucidar, la disponibilidad de
la secuencia completa del genoma abre nuevas perspectivas en la investigación
encaminada al desarrollo de nuevos tratamientos, herramientas diagnósticas y una
vacuna más eficaz [15, 16].
El genoma de M. tuberculosis H37Rv posee 4.4 Mb que de acuerdo con la

base de datos Tuberculist (versión R27 de marzo de 2013) tiene 4018 genes predichos
(incluyendo 13 pseudogenes, 45 tRNA, 3 rRNA, 30 ncRNA, 2 miscRNA) que
6
Introducción
representan un 91.2% de potencial codificante y un contenido de GC del 65.9% que es

constante en todo el genoma a excepción de las regiones polimórficas ricas en GC
(PGRS, Polymorphic CG rich Sequences) que tienen un porcentaje mayor [15, 16]. El
genoma es rico en DNA repetitivo principalmente secuencias de inserción (16 copias
de IS6110 y 6 de IS1081) incorporadas en regiones intergénicas o no codificantes,
también tiene secuencias de repeticiones polimórficas en tándem (MPTR, Major
Polymorphic Tamdem Repeats) que junto con los PGRS codifican proteínas ricas en
glicina que generan polimorfismos asociados con variación antigénica y además posee
dos profagos [16, 17].
Cada ORF (Open Reading frame, Marco abierto de lectura) es asignado a una
categoría funcional como muestra la figura 1.3. Un cuarto de las regiones codificantes
tienen función desconocida, aunque su número podría reducirse a medida que más
proteínas sean caracterizadas. El codón de inicio más utilizado es el ATG (61%) y sólo
cerca del 59% de los genes se transcriben en la misma dirección de la replicación, lo
que podría estar relacionado con el crecimiento lento y los infrecuentes ciclos de
replicación [15-17].
0- Virulencia, Detoxificación, Adaptación
1- Metabolismo de Lípidos
2- Vías de información
3- Pared celular y proceso celular
4- RNAs estables
5- Secuencias de inserción y fagos

6- PE/PPE
7- Metabolismo intermediario y
respiración
8- Desconocidos
9- Proteínas regulatorias
10- Proteínas conservadas hipotéticas
Figura 1.3. Proporción de categorías funcionales del genoma de M. tuberculosis. Tomado de

[18].
De la información procedente del genoma de M. tuberculosis H37Rv se deduce

que éste tiene el potencial metabólico para adaptarse a ambientes aeróbicos,
microaerófilos y anaerobios así como la capacidad de sintetizar todos los aminoácidos
esenciales, vitaminas y co-factores enzimáticos, aunque algunas de las vías
implicadas pueden diferir de las encontradas en otras bacterias. M. tuberculosis puede
metabolizar carbohidratos, alcoholes, quetonas, ácidos carboxílicos y oxidar una
amplia variedad de sustratos; igualmente posee las enzimas necesarias para la
glicólisis, la vía de la pentosa fosfato, los ciclos tricarboxílico y glioxilato así como
muchas funciones relacionadas con la biosíntesis y degradación de lípidos en donde el
6% de los genes conocidos y predichos están implicados en este proceso [15, 16].
7
Introducción
En cuanto a sistemas regulación se han detectado 13 factores sigma que

controlan la expresión génica, más de 100 proteínas reguladoras, 11 sistemas de dos
componentes y 11 serina/treonina proteína quinasas que funcionan como sistemas de
transducción de señales [16]. Por otro lado, aunque M. tuberculosis es naturalmente
resistente a muchos antibióticos debido a la naturaleza hidrofóbica de su pared celular,
muchos otros determinantes de resistencia están codificados en su genoma. Éstos
incluyen enzimas hidrolíticas o que modifican fármacos como las β-lactamasas y las
aminoglucósido acetil transferasas así como muchos otros sistemas potenciales de
eflujo como 16 miembros de la familia de los facilitadores principales (MSF, Major
Facilitator Superfamily) y numerosos transportadores de tipo cassette de unión a ATP
(ABC, ATP-binding cassette) [16].
1.2.3. Proteoma de M. tuberculosis
El análisis de las proteínas de M. tuberculosis comenzó con la producción de la

tuberculina y luego de la PPD (Purified Protein Derivative, derivado proteico purificado)
como herramienta diagnóstica, siendo estas preparaciones los primeros extractos
proteicos a los que se les evaluaron sus propiedades bioquímicas e inmunológicas
[19]. Posteriormente otros estudios estuvieron dirigidos a la identificación de los
principales inmunógenos de M. tuberculosis (antígeno 85, el antígeno 5, MPT64,
GroES, GroEL y MPT32) a los que después se les quiso definir su función fisiológica,
lo cual fue facilitado por la implementación de técnicas de manipulación genética. Sin
embargo la disponibilidad de la secuencia del genoma de M. tuberculosis facilitó el
desarrollo en el campo de la genómica funcional, la transcriptómica y la proteómica
cambiando la forma en la que la investigación sobre la tuberculosis era conducida [19].
El término proteoma fue inicialmente acuñado para describir el conjunto de

proteínas codificadas por un genoma, pero éste término se refiere más al conjunto de
proteínas de un sistema biológico en un punto del tiempo determinado bajo unas
condiciones definidas en las que las proteínas variarán en respuesta al estado
funcional, fisiológico y ambiental [15, 20]. La proteómica implica la separación y
análisis de mezclas complejas de proteínas derivadas de muestras biológicas y a
diferencia de la transcriptómica, con la proteómica se obtiene información en cuanto a
las modificaciones traduccionales y post traduccionales que determinarán la topología
y función proteica [15, 20].
Como en otros sistemas, la obtención del proteoma completo de M.

tuberculosis se ha visto dificultada por la multitud de respuestas a estímulos
8
Introducción
fisiológicos y ambientales. Igualmente, el estudio del proteoma ha sido difícil por el

hecho de que M. tuberculosis es un patógeno intracelular, en el que su aislamiento y la
obtención de proteínas es más compleja, ya que generalmente hay contaminación con
proteínas del huésped, lo que limita el acceso a las proteínas micobacterianas menos
abundantes. Sin embargo se cuenta con modelos de cultivo que pueden ser usados
para analizar el proteoma bajo condiciones que se asemejen a las situaciones in vivo
[20].
En los últimos años se han llevado a cabo numerosos estudios de proteómica

en M. tuberculosis que han permitido la identificación de una variedad de proteínas del
lisado total, del filtrado de cultivo, del citosol, de la pared celular, así como la
caracterización de proteomas generados en respuesta a diferentes condiciones
(ambientes aeróbicos, anaeróbicos/hipoxia, privación de nutrientes y tratamientos con
fármacos) [15, 20]. Estas proteínas incluyen candidatos vacunales, marcadores
diagnósticos putativos, factores de virulencia, dianas para fármacos, proteínas
secretadas, antígenos para linfocitos T, proteínas diana de intermediarios reactivos del
oxígeno y proteínas de vías de señalización (Tabla 1.1) [20]. De acuerdo con la base
de datos Tuberculist cerca de 2828 proteínas han sido identificadas por estudios de
proteómica y dicha identificación ha permitido validar la predicción de genes anotados
en el genoma, demostrando que se expresan y se traducen [15, 20].
Además del mapeo e identificación de proteínas, la proteómica ha sido usada

para evaluar las variaciones fenotípicas entre cepas, lo que es importante para
entender la patogénesis del bacilo [19, 21]. Por ejemplo el análisis comparativo entre
las cepas H37Rv y CDC1551 mostró que estas cepas tienen perfiles proteicos
similares [22]. Igualmente el análisis comparativo entre la cepa H37Rv y dos aislados
clínicos de los cuales uno de ellos pertenecía a la familia Beijing no mostraron grandes
diferencias que explicaran por que la cepas Beijing son más prevalentes que otras
cepas clínicas [23]. Por otro lado, también se han comparado los proteomas de M.
tuberculosis y BCG que mostró la presencia de proteínas únicas en el proteoma de M.
tuberculosis (60 proteínas), algunas de ellas ya identificadas a nivel genómico y otras
identificadas por primera vez [24]. El análisis entre las cepas H37Rv y su contraparte
atenuada H37Ra mostró una abundancia relativa similar en la mayoría de proteínas,
sin embargo en H37Rv 19 proteínas asociadas a membrana y lipoproteínas fueron
más abundantes sugiriendo que los sistemas de secreción y transporte
transmembranal pueden ser determinantes importantes en la patogénesis [25].
9
Introducción
Tabla 1.1. Principales estudios de proteómica en M. tuberculosis. Adaptado de [26-29].

Fracción Número de proteínas
Año Cepa Subcelular identificadas
1997 M. tuberculosis H37Rv FC 32
M. tuberculosis H73Rv,
1999 Erdman y M. bovis BCG L, FC 107
2000 M. tuberculosis H37Rv L, FC 167
2001 M. tuberculosis FC, C 30
2003 M. tuberculosis H37Rv M 739
M. tuberculosis H37Rv, M.
2004 bovis BCG L 361
2005 M. tuberculosis H37Rv PC, M, C 1044
2010 M. tuberculosis H37Rv PC 234
M. tuberculosis. Aislados
2010 clínicos del linaje Beijing L 1668
M. tuberculosis CDC1551 y
2010 Aislados clínicos FC, C 238
2010 M. tuberculosis H37Rv Ex 41
M. tuberculosis H37Rv y
2011 H37Ra M 1578
2011 M. tuberculosis H37Rv PC, C, M, FC 1051
2011 M. tuberculosis H37Rv L, FC 3176
M. bovis BCG Moreau,
2011 Pasteur FC 101
2012 M. bovis BCG PC, C, M 3434
FC: Filtrado de cultivo, L: Lisado, C: Citosol, M: Membrana, PC: Pared celular, Ex: exosoma
En resumen, la proteómica ha permitido la identificación, localización y

cuantificación relativa de una variedad de proteínas de M. tuberculosis y se espera que
las investigaciones adelantadas en este campo respondan cuestiones acerca de la
fisiopatología del bacilo en el contexto de las interacciones huésped-patógeno, aunque
aún deben desarrollarse métodos que solventen las limitaciones existentes como el
acceso selectivo a proteínas de menor abundancia in vitro e in vivo [18, 30].
1.2.4. Envuelta de M. tuberculosis
La envuelta de las micobacterias es una eficiente barrera impermeable que

constituye una interfase vital entre la bacteria y el huésped, protegiéndola del
ambiente, dándole forma y controlando la transferencia de sustancias fuera y dentro
de la bacteria [31]. Además, la envuelta juega un papel esencial en la resistencia
natural a fármacos y la modulación de la respuesta inmunológica. Sus componentes
son altamente complejos y han sido objeto de numerosos estudios durante décadas en
10
Introducción
donde se ha evidenciado que algunos tienen actividad biológica y están implicados en

la patogénesis de la tuberculosis. Por ello, las enzimas implicadas en la síntesis de
estos compuestos son buenas dianas para el desarrollo de nuevos fármacos [32]. La
naturaleza de la envuelta hace que la bacteria requiera mecanismos especializados
para que la división celular ocurra y que le permita mantener una arquitectura celular
normal durante y después del proceso, así como coordinar la síntesis de los
componentes de la envuelta y regular el proceso de división en respuesta a estímulos
del medio ambiente. Los principales componentes estructurales de la envuelta son:
membrana, pared celular y cápsula (Fig. 1.4) [31-33].
Cápsula
LL
AM Lipoarabinomanano
Cabezas
de Manosa
Pared A
Celular AG
G
A
PG Núcleo
de
Manano
Membrana
Celular
Proteínas Anclaje
Fosfatidilinositol
Figura 1.4. Esquema de la envuelta de M. tuberculosis. AM: ácidos micólicos, AG:

arabinogalactano, LL: lípidos libres, A: arabinano, G: galactano. Modificado de [34, 35].
Taxonómicamente las micobacterias se clasifican como gram positivas, sin

embargo su envuelta celular tiene diferencias a nivel funcional por lo que también
comparte características con las gram negativas como el hecho de que no retienen el
complejo lugol-cristal violeta de la tinción del gram [33]. Por otro lado, el contenido
lipídico de la envuelta celular de las micobacterias es mucho mayor (40% del peso
seco) comparado con el de las gram positivas (5%) y las gram negativas (10%). El alto
contenido de lípidos puede explicar la tendencia de las micobacterias a crecer en
agregados y su baja permeabilidad [33, 36].
11
Introducción
1.2.4.1. Membrana celular
La membrana celular está compuesta de lípidos polares, principalmente

fosfolípidos que se asocian entre ellos formando una bicapa lipídica junto con
proteínas que pueden estar implicadas en el transporte de aminoácidos, carbohidratos
y ácidos orgánicos [12]. Los lípidos polares están compuestos de cabezas hidrofílicas
unidas a cadenas de ácidos grasos rectas insaturadas y monometil ramificadas con
menos de 20 carbonos. Los principales ácidos grasos aislados de la membrana celular
son: el ácido palmítico (C16:0), el ácido octadecenoico (C18:1) y el ácido
metiloctadecanoico (C19r). Los fosfolípidos más importantes son el fosfatidilinositol
manosa (PIM), el fosfatidilglicerol, la cardiolipina y el fosfatidiletanolamina. El
fosfatidilinositol se encuentra en pequeñas cantidades [36]. Además de los
fosfolípidos, otros lípidos pueden estar presentes, entre ellos se encuentran las
menaquinonas que son parte esencial del sistema respiratorio en membranas
bacterianas, los lípidos de ornitina y los carotenoides. Otro lipopolisacárido que puede
estar unido a la membrana celular es el lipomanano (LM) también como el
lipoarabinomanano (LAM) que está compuesto de un grupo fosfatidilinositol unido
covalentemente al arabinomanano y del que se desconoce su posición exacta en la
envoltura [12, 36].
1.2.4.2. Pared celular
El esqueleto de la pared celular puede ser descrito como peptidoglicano que

está unido covalentemente a cadenas de arabinogalactano esterificadas en su
extremo distal con ácidos micólicos [12]. Este complejo se organiza para formar una
capa hidrofóbica con otros lípidos. El peptidoglicano es una estructura común en
bacterias y es la responsable de darles el tamaño y la forma. En las micobacterias, el
peptidoglicano está compuesto por unidades repetitivas de N-acetilglucosamina y
ácido N-acetilglicolilmurámico conectadas por péptidos cortos [12, 33]. El
arabinogalactano es el mayor heteropolisacárido de la pared celular, contiene
arabinano y galactano en forma furanosa siendo estos dos azúcares poco comunes.
Las micobacterias de crecimiento lento contienen un residuo de galactosamina por
unidad de arabinogalactano [33]. Los ácidos micólicos son ácidos grasos de cadena
larga que contienen hasta 90 carbonos α y β hidroxilados que se unen al
arabinogalactano por enlaces de tipo éster, siendo el determinante primario de la
permeabilidad de las micobacterias [12, 36].
12
Introducción
Otros lípidos que se encuentran asociados a la pared pero no covalentemente

son el dimicocerosato de ftiocerol (PDIM, Phthiocerol Dimycocerosates), dimicolato de
trealosa (TDM, Trehalose Dimycolate), glicolípidos fenólicos (PGL, Phenolic
Glycolipid), sulfolípidos (SL), poliaciltrealosas (PAT), triaciltrealosas (TAT),
monomicolatos de trealosa (TMM, Trealose Monomycolate) y diaciltrealosas (DAT);
adicionalmente, algunas cepas de M. tuberculosis producen lipooligosacáridos (LOS)
especie específicos de alta polaridad. Muchos componentes de la membrana celular
son considerados factores de virulencia [12, 37].
1.2.4.3. Cápsula
La cápsula está compuesta por proteínas y polisacáridos (~97% del material

total) con pequeñas cantidades de lípidos (2-3%). La cápsula constituye la interfase
entre la bacteria y su medio ambiente y probablemente tiene una función protectora
[38].
Tres tipos de polisacáridos se encuentran en el material capsular: α-D-glucano,

D-arabino-D-manano (AM) y D-manano. El α-D-glucano es el principal carbohidrato
presente en la capsula y representa cerca del 80% de los polisacáridos extracelulares.
Varias funciones biológicas se han asociado a los polisacáridos de la cápsula
sugiriendo un posible papel en la inmunopatogénesis [38].
1.2.4.4. Proteínas similares a porinas
Dada la impermeabilidad de la pared y la falta de proteínas homólogas a las

presentes en gram negativos, surge el interrogante de cómo las micobacterias toman
nutrientes y exportan sus productos de desecho. La respuesta a este interrogante está
dada por la presencia de proteínas similares a porinas que forman canales no
específicos que permiten el paso de compuestos hidrofílicos y que han sido
detectadas en extractos de M. tuberculosis y de M. smegmatis [39]. Una de estas
proteínas es la MspA que fue purificada y su gen identificado en M. smegmatis y cuya
deleción reduce la permeabilidad a glucosa, fosfatos, iones metales y aminoácidos lo
que indica que esta porina es la principal vía de difusión en M. smegmatis [32, 39]. La
pérdida de las porinas tipo Msp reduce la tasa de crecimiento indicando que el influjo
de nutrientes hidrofílicos a través de las porinas es requerido para su crecimiento
normal [32]. M. tuberculosis no tiene un homólogo de MspA y esta carencia ha sido
relacionada con el tiempo de generación más lento comparado con el de M.
smegmatis; sin embargo se ha detectado la proteína OmpATb que forma canales y
13
Introducción
que tiene una cierta similitud con la familia de proteínas de membrana externa OmpA
de gram negativos como E. coli [32, 39].
1.3. Patogénesis
La ruta más común de infección de la tuberculosis es por la inhalación del

bacilo presente en los aerosoles producidos por pacientes con tuberculosis pulmonar
activa al toser, estornudar o hablar. Las pequeñas gotitas generadas pueden
permanecer en el aire por minutos u horas después de la expectoración. El número de
bacilos en las gotitas, su virulencia, la exposición a luz UV y grado de ventilación
influyen en la transmisión de la enfermedad [40, 41].
Una vez las bacterias son inhaladas, éstas pueden establecer una infección
primaria en el pulmón en donde los bacillos son fagocitados por macrófagos alveolares
[40, 41]. La infección primaria puede: (1) convertirse en enfermedad activa, (2)
convertirse en infección latente o (3) ser erradicada por el sistema inmune [42]. Se
estima que cerca del 5-10% de los pacientes infectados progresan a enfermedad
activa mientras que cerca del 90-95% de los casos pueden resolver la infección
primaria por medio de la inmunidad innata y adquirida o permanecer en un estado de
latencia con el riesgo de una reactivación a lo largo de sus vidas, lo que se conoce
como tuberculosis post primaria [40, 41] (Fig. 1.5). Los mecanismos por los que el
sistema inmunológico controla la enfermedad, no están completamente definidos, pero
en general se cree que la inmunidad celular juega un papel crítico [40, 41].
M. tuberculosis es capaz de sobrevivir a la destrucción de los macrófagos

alveolares y multiplicarse en su interior gracias a que es capaz de inhibir la fusión de la
vacuola fagocítica con los lisosomas [43]. Cuando la infección se localiza en el
pulmón, se forma un foco inflamatorio que atrae células mononucleares y linfocitos T,
formando una la lesión primaria que madura a granuloma cuya función es segregar la
infección para evitar su diseminación por otras partes del pulmón u otros órganos,
también como concentrar la respuesta inmune en el sitio de la infección. En este
punto, el sistema inmunológico controla el patógeno evitando su diseminación y
produciendo la infección latente en la mayoría de infectados [43, 44]. El riesgo de
activar una infección latente varía dependiendo de factores como la genética del
huésped, la edad, estado nutricional, hábitos como fumar, drogarse o abusar del
alcohol, presencia de otras infecciones y estados de inmunosupresión como el VIH
[40].
14
Introducción
Tuberculosis Primaria Granuloma caseoso

Erradicación de 10%
Infección Primaria
la infección 30%
70%
Infección Latente
90% Reinfección
Reactivación
Recurrencia
Tuberculosis Post-primaria
Granuloma caseoso Respuesta Inmune del Huésped
Virulencia Bacteriana
Figura 1.5. Infección por M. tuberculosis. Adaptado de [42, 45].
La maduración del granuloma (sólido, necrótico y caseoso) ocurre a diferentes

velocidades y puede culminar en la coexistencia de todas las formas de las lesiones
durante la tuberculosis activa [42]. Los granulomas sólidos prevalecen durante la
infección latente y son reacciones tisulares altamente estructuradas que comprometen
fagocitos mononucleares en diferentes estadios de desarrollo, células dendríticas,
linfocitos T y B. En estos granulomas, los linfocitos forman un anillo externo mientras
que en la parte central se encuentran los fagocitos, fibroblastos y las células
dendríticas principalmente [42]. La carga del bacilo dentro de estos granulomas es
baja y su actividad metabólica es reducida con una persistencia no replicativa. Al igual
que los granulomas sólidos, los necróticos son bien estructurados pero con una mayor
necrosis en el centro, compuesto por detritos celulares mayoritariamente, y con bacilos
que pueden empezar a replicarse y ser metabólicamente activos. Se ha postulado que
la necrosis sirve para eliminar los macrófagos infectados y brindar un ambiente
anóxico en el cual el bacilo tenga más dificultades para dividirse, por lo que el daño
tisular generado puede servir como mecanismo protector [42]. Los granulomas
caseificantes presentan un centro que ha sufrido un proceso de licuefacción que da
paso a la formación de una cavidad, disminuyendo su estructura y aumentando el
contenido de oxígeno. Las lesiones cavitarias pueden proporcionarle al bacilo
nutrientes que le permitan crecer ampliamente. Finalmente, el bacilo puede tener
15
Introducción
acceso a los capilares sanguíneos y al espacio alveolar pudiéndose diseminar a otros

órganos y transmitirse a otros individuos [42, 43].
La tuberculosis que ocurre en cualquier sitio del cuerpo puede provocar

síntomas que no siempre están relacionados específicamente con el órgano o tejido
implicado [46]. Las manifestaciones sistémicas de la enfermedad incluyen fiebre,
escalofrío, sudoración, malestar general y pérdida de peso. La tos puede desarrollarse
en muchos pacientes, inicialmente ésta puede ser no productiva pero luego avanzará
a serlo en donde el esputo estará acompañado de sangre [41, 46]. En la tuberculosis
extrapulmonar, una de las localizaciones más graves es en el sistema nervioso central
ya que puede provocar meningitis con la sintomatología que ésta conlleva, así como la
diseminación sanguínea o tuberculosis miliar ya que el bacilo puede diseminarse por
todo el organismo [41, 46].
1.4. Interacciones huésped-patógeno
El resultado de la infección con M. tuberculosis es determinado por la

interacción dinámica y compleja entre el sistema inmune del huésped y las
propiedades del patógeno [47]. M. tuberculosis ha desarrollado diversas estrategias
para asegurar su crecimiento y supervivencia en el huésped atenuando varios
procesos celulares que incluyen la fusión de los fagosomas con los lisosomas, la
presentación de antígeno, la apoptosis y la respuesta bactericida iniciada por los
macrófagos [48, 49]. Esta atenuación es el resultado de un proceso en el que
moléculas bacterianas interfieren con la maquinaria de señalización celular del
huésped reorientando su respuesta. Aunque no se conocen completamente estos
mecanismos, se han identificado muchos mediadores de virulencia bacterianos cuyas
estrategias están siendo estudiadas [47, 48].
1.4.1. Factores de virulencia
M. tuberculosis no posee factores de virulencia clásicos como las toxinas

presentes en otros patógenos bacterianos; su virulencia parece ser un fenómeno
multifactorial que puede estar relacionado con su estructura y complejidad [50]. La
variedad de lípidos únicos que posee como el LAM, TDM y PDIM parecen jugar un
papel importante pero ninguno es un factor de virulencia esencial. El LAM, uno de los
principales constituyentes de la pared celular, induce la producción de factor de
necrosis tumoral (TNF-α, Tumor Necrosis Factor-α) por parte de los macrófagos, tiene
un efecto sobre los radicales libres de oxígeno, inhibe la proteína C quinasa y bloquea
la activación de la transcripción del IFN-γ de los macrófagos contribuyendo de esta
16
Introducción
forma a la persistencia de la micobacteria [51, 52]. El TDM tiene un efecto tóxico en

células de mamífero y es un inhibidor de la migración de células polimorfonucleares.
Los PDIMs parecen estar implicados en la entrada de M. leprae a las células nerviosas
periféricas por unión a la laminina. Los SL están relacionados con la inhibición de la
estimulación de los macrófagos. Las DAT inhiben la linfoproliferación y los PGL
inhiben la respuesta proinflamatoria [51, 52].
Entre los factores de virulencia proteicos más importantes se encuentra la

proteína Hspx que es considerada como un elemento controlador de la latencia de M.
tuberculosis, las proteínas de filtrado celular ESAT6/CFP-10 que son
inmunodominantes en pacientes infectados aunque su papel biológico es debatido [51,
53]. El antígeno 85 que está compuesto por un grupo de proteínas secretadas, que se
unen a la fibronectina y fomentan la formación del granuloma; por su parte, la
lipoproteína de 19 kDa que es reconocida por linfocitos T de pacientes infectados con
tuberculosis y parece inhibir ciertas respuestas del macrófago al IFN-γ, especialmente
las relacionadas al Complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC-II, Major
Histocompatibility Complex class II). Por otro lado, la proteína OmpA que hace parte
de la familia de las porinas, está relacionada con la respuesta bacteriana en
condiciones de estrés por pH ácido [51, 53].
En cuanto a los factores de virulencia relacionados con el estrés oxidativo, M.

tuberculosis codifica enzimas como SodA, SodC, KatG y AhpC que combaten los
radicales de oxígeno liberados durante la respiración anaeróbica y los generados
dentro del macrófago. También posee factores de virulencia relacionados con la
captura de iones metal que pueden exacerbar la progresión de la enfermedad y
sistemas de regulación transcripcional (PhoP, factores sigma alternativos) que
controlan la expresión de genes de virulencia, entre otros [53].
1.4.2. Respuesta inmune
Durante la infección M. tuberculosis interacciona con macrófagos, células

epiteliales y células dendríticas. Esta interacción involucra componentes de la pared
bacteriana (ácidos micólicos, peptidoglicano, arabinogalactano, PIM, LAM, LM y
glicoproteínas) y múltiples receptores de las células fagocíticas como el receptor de la
fracción cristalizable (FcR, Fc Receptor), receptores del complemento (CRs,
Complement Receptors), receptores de manosa (MR, Mannose Receptors), receptores
scavenger tipo A, la lectina tipo C DC-SIGN y los receptores Toll-like (TLR, Toll-like
Receptor) [42, 51, 54]. Esta interacción produce la activación de diversos mediadores
17
Introducción
de la inmunidad innata implicados en la fagocitosis y las vías de señalización. No es

completamente claro cómo M. tuberculosis usa la selección de receptores como una
estrategia patogénica; posiblemente las rutas de entrada produzcan diferentes
respuestas en cuanto a la secreción de citoquinas o diferentes señales de activación
de los macrófagos lo cual podría ser usado por la bacteria para su supervivencia [42,
51, 54].
Algunos receptores permiten la entrada silente del bacilo, como es el caso del
receptor CR que no induce una respuesta tóxica por parte de la célula huésped y
suprime selectivamente la producción de IL-12 que es un importante mediador de la
respuesta inmune celular frente a M. tuberculosis. Por otro lado, la interacción con los
TLR juega un papel importante en la inmunidad innata contra M. tuberculosis;
modulando la fagocitosis, la formación del fagolisosoma y la producción de citoquinas
proinflamatorias y el TNF-α. Los TLR reconocen el LAM, LM y los PIMs de M.
tuberculosis entre otros [42, 54].
Una vez los macrófagos alveolares fagocitan a M. tuberculosis, en el fagosoma

se generan intermediarios reactivos del nitrógeno (RNI, Reactive Nitrogen
Intermediates), intermediarios reactivos del oxígeno (ROI, Reactive Oxygen
Intermediates), enzimas hidrolíticas, péptidos antimicrobianos y se acidifica el medio,
lo que produce la degradación de lípidos y proteínas bacterianas [42, 55].
Posteriormente el fagosoma se fusiona con el lisosoma formando el fagolisosoma cuyo
contenido puede ser procesado hacia la presentación de antígenos por el MHC a los
linfocitos T para la activación de la respuesta inmune adaptativa. La eficacia de estos
mecanismos depende de la capacidad intrínseca microbicida de los macrófagos
alveolares, las características de la cepa de M. tuberculosis y el microambiente
inflamatorio en el sitio de infección [42, 55].
Los bacilos que sobreviven al ataque, proliferan logarítmicamente dentro de los

macrófagos alveolares y las células dendríticas, lo que induce la producción de TNF-α,
IL-6, IL-12p80, IL-1α y IL-1β que activan los macrófagos e inducen la muerte
bacteriana. El IFN-γ es una citoquina proinflamatoria producida por los linfocitos CD4+
y CD8+ también como por las células NK (Natural killer) activadas, en repuesta a la IL-
12 y la IL-18 producida por los macrófagos alveolares y las células dendríticas [54, 55].
Esta citoquina es esencial en la activación de los fagocitos y en la presentación de
antígenos. Por otro lado, promueve la proliferación celular, la adhesión celular y la
apoptosis así como la producción de RNIs y ROIs. Por su parte el TNF-α media la
18
Introducción
respuesta inflamatoria primaria estimulando la producción de IL-1 e IL-6 y también

contribuye a la inducción de RNIs y ROIs [54, 55].
Los linfocitos T (CD4+, CD8+ y γδ) son críticos en el control de la tuberculosis y

su falla puede promover la reactivación de la tuberculosis latente. El desarrollo de la
respuesta T dependiente requiere de la diseminación de la bacteria viva o de
antígenos presentados por células dendríticas que migran a los nódulos linfáticos en
donde proliferarán linfocitos T específicos para luego migrar al área de infección [55].
Los CD4+ producen mediadores inmunes (IFN-γ, IL-2 y linfotoxina α), mientras que los
CD8+ y γδ liberan enzimas y perforinas que ejercen un efecto directo sobre la
micobacteria y las células infectadas. Por otro lado, las células NK pueden reconocer y
lisar macrófagos infectados y producir cantidades significativas de IFN-γ, IL-22 y otras
citoquinas [55].
La respuesta inmune humoral frente a la tuberculosis está relacionada con la

opsonización, la neutralización de toxinas y la lisis mediada por el complemento. Se
han propuesto varios mecanismos por los que la inmunidad humoral podría tener
efectos protectivos. Estos mecanismos incluyen la interferencia en la adhesión a
células mediada por anticuerpos específicos a antígenos estructurales de M.
tuberculosis, limitando así el establecimiento de la infección o la diseminación a otras
células o tejidos. Otros ejemplos incluyen la potenciación de la formación del
fagolisosoma y la lisis mediada por células o complemento [55].
1.4.2.1. Mecanismos de evasión de la respuesta inmune
M. tuberculosis es un patógeno intracelular capaz de sobrevivir y crecer dentro

del fagosoma de los macrófagos. Para muchas bacterias el fagosoma es un ambiente
hostil como resultado de una variedad de estrés tóxico; sin embargo M. tuberculosis se
adapta a ese ambiente evitando la maduración del fagosoma y multiplicándose [56]. La
micobacteria que sobrevive en los fagosomas lo hace a un pH de ~6.4, sin embargo
en los fagolisosomas de macrófagos activados con IFN-γ la bacteria tolera un pH
menor (4.5-5.4), por lo que su capacidad para censar el pH fagosomal es un
mecanismo por el que la micobacteria definiría su localización intracelular y modula su
fisiología [42, 56]. La adaptación a ambientes de bajo pH está mediada por una
variedad de mecanismos que incluyen la extrusión protónica, la secreción de ureasa,
la descarboxilación de aminoácidos, la modificación de la envuelta celular y la
protección de macromoléculas. Estudios recientes mostraron que el locus aprABC está
19
Introducción
implicado en la adaptación de la bacteria al ambiente ácido al igual que la proteína de

membrana OmpATb [42, 48, 56].
Parte del efecto antimicrobiano que ejercen los macrófagos está dado por la
generación de ROI y RNI, los cuales tienen un efecto en las funciones
inmunoreguladoras y en la viabilidad bacteriana por daños en los lípidos y el DNA. M.
tuberculosis ha desarrollado estrategias para contrarrestar dichos efectos
detoxificando, limitando la producción de ROI y RNI y reparando el daño causado por
estos [48, 50]. Los mecanismos de resistencia están relacionados con la presencia de
enzimas como la catalasa-peroxidasa codificada por KatG, que descompone el H2O2 y
ayuda a neutralizar a RNI; la superóxido dismutasa codificadas por SodA y SodC, que
cataliza la conversión de aniones superóxido a H2O2 protegiéndola del daño mediado
por los ROI, la peroxidasa dependiente de NADH y la peroxinitrato reductasa que
confieren resistencia a RNI. Por otro lado, M. tuberculosis posee micotioles que sirven
como antioxidantes y ayudan a preservar el ambiente reductor en el citoplasma [48,
50]. En cuanto a los mecanismos de reparación, posee dos factores accesorios (PafA
y Mpa) que evitan la proteólisis, una metionina sulfóxido reductasa (Msr) que evita la
generación de sulfóxido de metionina que interfiere en la función proteica, una proteína
de unión similar a histonas (Lsr2) que se une al DNA con el fin de protegerlo de los
ROI, una enzima (UvrB) que repara el DNA, la polimerasa DnaE2 que también repara
el DNA. Igualmente, el antígeno 85, la reductasa NADPH-quinona, CysH (implicada en
la asimilación de sulfuro) y componentes de la pared celular como el LAM participan
en la defensa contra el estrés oxidativo [48, 50].
M. tuberculosis también posee otras proteínas que indirectamente inhiben la

producción de ROI y RNI y evitan la activación de los macrófagos; entre estas
proteínas están la ESAT-6 que interacciona con TLR-2 evitando la activación del factor
nuclear κB implicado en la transcripción de genes de la respuesta innata y adaptativa.
Así mismo, las proteínas PPE18 y Hsp60 inhiben la producción de IL-12 y otros
componentes como la pared celular y la lipoproteína de 19-kDa inhiben las vías de
señalización dependiente del IFN-γ [50].
Otro de los mecanismos implicados en la supervivencia de M. tuberculosis en

el macrófago es la inhibición de la maduración del fagosoma y su fusión con el
lisosoma. La expresión aberrante de la GTPasa Rab5 limita la adquisición del
marcador endosomal tardío Rab7 lo que detiene la maduración del fagosoma [51, 55].
Por otro lado, la retención de la proteína TACO en la superficie de los fagosomas que
contienen la micobacteria evita la fusión con el lisosoma. Además, M. tuberculosis de
20
Introducción
interferir sobre el proceso de la autofagia, un mecanismo homeostático que implica la

autodigestión y remplazo de organelos y macromoléculas citoplasmáticas, mediante el
producto del gen eis [51, 55].
La inducción de la muerte celular programada o apoptosis es un mecanismo

importante en la respuesta inmune innata en donde las células infectadas son
eliminadas. En el caso de la infección por M. tuberculosis, se ha observado que la
inducción de apoptosis es menor y se han identificado genes implicados como e nouG,
secA2 y pknE. Además, M. tuberculosis es capaz de inducir la expresión de genes anti
apoptóticos por parte del huésped, como el gen mcl-1 y el A1 así como disminuir la
expresión de receptores como el Fas [50].
Otra estrategia de supervivencia consiste en evitar el reconocimiento de los

macrófagos infectados por parte de los linfocitos T CD4+, inhibiendo el procesamiento
y presentación antigénica por el MHC-II, en donde se ha descrito que la lipoproteína
de 19kDa induce la disminución de la expresión de esta molécula posiblemente por la
excesiva estimulación de los TLR, teniendo en cuenta que éste receptor también se
encuentra a nivel intrafagosomal [55].
1.5. Diagnóstico
La tuberculosis es una enfermedad de diagnóstico y tratamiento complejos

debido a su cronicidad, la naturaleza de la relación huésped-patógeno y la diversidad
de manifestaciones clínicas. El diagnóstico oportuno es esencial para el control de la
enfermedad, en donde la correlación clínica es necesaria para determinar la
importancia de los resultados del laboratorio [7, 57, 58]. El método diagnóstico más
comúnmente utilizado es la observación microscópica del esputo teñido con Ziehl-
Neelsen. Esta técnica es útil en el diagnóstico de la tuberculosis pulmonar pero
ineficaz en la detección de la tuberculosis extra pulmonar así como en pacientes
coinfectados con VIH y niños debido a su reducida carga bacilar. La una sensibilidad
de este método es del 50% mientras que su especificidad se ve afectada por la
prevalencia local de micobacterias no tuberculosas pudiendo variar entre el 20% y el
70% [57]. En países más desarrollados, el diagnóstico de la tuberculosis por
microscopía, es confirmado mediante cultivo seguido de la identificación de la cepa y
la susceptibilidad a fármacos. Estos métodos requieren tiempos de incubación largos,
equipamiento especializado, personal altamente entrenado y son más costosos,
condiciones que en muchos casos pueden no estar disponibles en lugares con
escasez de recursos humanos y financieros [7, 57, 58].
21
Introducción
La identificación de la micobacteria tradicionalmente se hace mediante cultivo

en medio sólido ya que éste es más sensible que la microscopía (80%-85%) y tiene
una especificidad del 98% [59]. El principal inconveniente es el tiempo de incubación
que puede variar entre 4-6 semanas en micobacterias de crecimiento lento y una
semana en las de crecimiento rápido. Por ello se prefiere hacer cultivos en medio
líquido en donde el tiempo de incubación disminuye y sólo requieren de 10 a 100
bacterias/mL lo que lo hace de gran utilidad en los casos de carga bacilar baja. Sin
embargo algunas cepas crecen mejor en medio sólido por lo que se recomienda
sembrar en los dos tipos de medio [58, 59].
En la infección latente, las muestras de esputo son negativas y las radiografías

de tórax son típicamente normales [41]. La prueba de la tuberculina es el método más
comúnmente usado para este tipo de infección. Esta prueba es cutánea y se hace
inyectando intradérmicamente 0.1 mL de PPD; después de 48-72 horas se examina el
sitio de la inyección con el fin de detectar la induración producida como una reacción
de hipersensibilidad retardada, que debe ser ≥10mm de diámetro para ser considerada
como positiva [60]. Aunque la utilidad de este test es amplia, presenta fallos
fundamentales como el elevado número de falsos positivos obtenidos por su
inhabilidad de distinguir entre una infección de M. tuberculosis y la exposición a otras
micobacterias no tuberculosas o la vacunación con BCG. Por otro lado, los falsos
negativos son también un inconveniente particularmente en niños y personas
inmunocomprometidas [41]. Por ello se ha impulsado la identificación de nuevos
antígenos que puedan mejorar la sensibilidad y la especificidad de la prueba cutánea
[41, 60].
La tuberculina era la única prueba existente para la detección de la infección

latente hasta que se desarrolló un ensayo basado en la detección del IFN-γ, en el cual
se determina la inmunidad mediada por células [41]. Los resultados con el uso de este
test pueden obtenerse en menos de 24 horas e igualmente puede ser usado para
detectar la tuberculosis activa aunque es poco efectivo en la diferenciación con el
estado de latencia [41].
En países industrializados, las radiografías y otras técnicas de imagen

avanzadas así como métodos de cultivo más rápidos y la implementación de métodos
moleculares como sistemas de amplificación de genes específicos y sistemas de
amplificación con sondas son utilizados para suplementar los métodos microscópicos
[57]. Por ejemplo se usan sistemas de cultivo líquido como el BACTEC que permite la
detección radiométrica del crecimiento o el sistema MGIT que permite la detección
22
Introducción
fluorométrica; igualmente se han desarrollado métodos de hibridación de ácidos

nucleicos que permite tener resultados en dos horas a partir de cultivos o ensayos
basados en la detección por inmunocromatografía de la proteína MPT64 del complejo
M. tuberculosis. También se está explorando el uso de los microscopios LED (light-
emitting diode) que remplazarían los microscopios de luz convencionales [58].
La sensibilidad en el diagnóstico se pude potenciar combinando estas pruebas

junto con técnicas invasivas tales como la broncoscopia o biopsias tisulares y la
inducción de esputo. Infortunadamente, estas técnicas están fuera del alcance de
muchos países donde la tuberculosis es prevalente y estas limitaciones tienen
consecuencias para el control de la enfermedad. [57, 59].
Las pruebas serológicas basadas en la detección de anticuerpos tienen una

sensibilidad que va del 1% al 60% y una especificidad del 53% al 98.7%. El principal
problema de este tipo de pruebas es la heterogeneidad de las respuestas
inmunológicas frente a los antígenos micobacterianos por lo que ninguna de las
pruebas ensayadas han sido lo suficientemente efectivas para remplazar la
microscopía [58].
Se ha estimado que cerca de 400.000 vidas podrían salvarse cada año con la
introducción de un sistema diagnóstico más exacto, rápido, económico y ampliamente
disponible que tuviera idealmente una sensibilidad mayor al 85% y una especificidad
del 97% [58]. En general, la implementación de nuevas herramientas diagnósticas
requiere de una evaluación cuidadosa que tenga en cuenta estudios de campo en
cada país también como la generación de políticas de estado que fomenten su
desarrollo [57, 58].
1.6. Prevención
1.6.1. BCG
La vacuna BCG usada para prevenir la tuberculosis tiene casi 100 años de
antigüedad y ha sido usada por miles de millones de personas en el mundo,
incluyendo niños, adultos y varios grupos étnicos [9, 28, 61]. La BCG tiene una
actividad protectiva contra las formas severas de la tuberculosis (meningitis y TB
miliar) en niños, pero su eficacia en la prevención de TB pulmonar en adultos es
variable (0-80%) [9, 28]. Esta vacuna es reconocida como segura y sigue siendo una
herramienta importante en la prevención de la enfermedad por lo que la OMS
recomienda que los niños deben ser inmunizados al nacer en países con alto riesgo de
23
Introducción
infección [28]. Sin embargo, el uso de esta vacuna no es recomendada en niños y

adultos infectados con VIH debido al riesgo de aparición de enfermedad BCG
generalizada [9, 28].
La BCG deriva de una cepa virulenta de M. bovis que se atenuó tras realizar
231 pases en medio de cultivo [62]. Los primeros estudios clínicos se hicieron en
Francia y Bélgica con resultados que mostraron un efecto protectivo en niños. Una vez
aprobado su uso, la cepa original fue distribuida por el Instituto Pasteur a diferentes
países en donde se utilizaron condiciones diferentes de cultivo no estandarizadas, lo
que dio lugar al establecimiento de cepas locales con diferencias en la composición
genética y antigénica; lo que para muchos ha contribuido a la variabilidad en su
eficacia [62]. Esto ha sido corroborado por estudios de genómica y proteómica
comparativa que han mostrado que las cepas vacunales usadas difieren de la cepa
original afectando proteínas antigénicas, aunque no hay suficiente evidencia directa de
que estas variaciones puedan tener un efecto en la eficacia protectiva de la BCG en
humanos. Otras hipótesis que se manejan en cuanto a la variación en la efectividad
están relacionadas con una manipulación inadecuada de la vacuna como la incorrecta
reconstitución de los liofilizados, la exposición a calor o a la luz solar, la exposición a
micobacterias ambientales y la presencia de genes de resistencia o de susceptibilidad
en las personas vacunadas [63, 64].
1.6.2. Nuevas vacunas
El desarrollo de nuevas vacunas empezó en los años noventa gracias a la

implementación de técnicas de manipulación genética en micobacterias y a la
secuenciación del genoma de M. tuberculosis. Existen dos enfoques principales para
su desarrollo: (1) desarrollar vacunas que puedan ser mejores que la BCG y
remplazarla ya sea haciendo una versión mejorada o una nueva usando por ejemplo
M. tuberculosis atenuado; (2) desarrollar una estrategia “inducción-refuerzo” en la cual
la BCG se administraría en neonatos (como se hace ahora) y luego administrar una
vacuna nueva como refuerzo [9]. Alternativamente, la nueva vacuna podría ser
administrada junto con otras vacunas a los 3-9 meses de edad y como un refuerzo
separado en adultos jóvenes. Los candidatos a vacuna en desarrollo podrían ser
usados para prevenir la infección o para prevenir la progresión primaria a enfermedad
y la reactivación de la tuberculosis latente. Además, se están llevando a cabo estudios
con el fin de desarrollar vacunas que puedan ser usadas como agentes
inmunoterapéuticos [9].
24
Introducción
Las propiedades que debería tener una nueva vacuna son: estar compuesta
del microorganismo muerto o subunidades de éste, tener varios antígenos del
microorganismo incluyendo proteínas esenciales, su vía de administración
(preferiblemente oral o nasal) debe inducir una respuesta inmune celular (Th1) y
humoral y debe ser eficiente no sólo como vacuna primaria si no también como
refuerzo en caso de haber recibido la BCG [9, 40]. Actualmente hay 12 candidatos en
ensayos clínicos, 11 son para la prevención de la tuberculosis y uno es una vacuna
inmunoterapéutica (Fig. 1.6). Estos candidatos incluyen mutantes atenuados de M.
tuberculosis, cepas de BCG recombinante, subunidades antigénicas administradas
con o sin adyuvantes, vacunas de DNA y antígenos expresados en vectores
bacterianos o víricos [9, 40].
Las vacunas atenuadas tienen la ventaja de contener un amplio espectro de

antígenos y por tanto estimulan diferentes poblaciones de linfocitos T; su principal
desventaja está relacionada con la seguridad en personas no imunocompetentes [65].
Por su parte, las vacunas compuestas de subunidades de antígenos micobacterianos
deben inducir una respuesta inmune protectiva sólo con uno o pocos antígenos. En
cuanto a las vacunas recombinantes, las cepas suelen tener antígenos
sobreexpresados como el caso de la rBCG30 que sobreexpresa el antígeno 85 para
incrementar su antigenicidad [65].
El candidato más avanzado en pruebas cínicas es el MVA85A, que usa un

vector viral para expresar un antígeno micobacteriano y ha sido diseñado para ser
utilizado como refuerzo en niños, adolescentes y adultos; los primeros ensayos de la
fase IIb se hicieron en Sudáfrica pero resultados recientes mostraron una efectividad
de sólo el 17% en niños [9, 40]. Actualmente se está adelantando un ensayo de fase
IIb en adultos VIH positivos en Senegal y Sudáfrica con 1400 voluntarios. En cuanto al
candidato AERAS-402/Crucell Ad35, está basado igualmente en un vector viral y
también fue diseñado como refuerzo en niños, adolescentes y adultos; éste se
encuentra en fase IIb siendo ensayado en niños de Kenia, Mozambique y Sudáfrica [9,
40].
25
Introducción
Fase I Fase II Fase IIb Fase III
Inducción
Refuerzo
Post-Infección
Inmunoterapia
Tipos de vacunas Vectores virales: MVA85A, AERAS-402, AdAg85A

Proteínas/Adyuvantes: M72, Híbrido-1, Hyvac 4, H56, ID93
rBCG: VPM 1002
Muerto ó Extracto: Mw, RUTI
Figura 1.6. Nuevas vacunas en desarrollo. Modificado de [9, 66].
Los candidatos M72 y el Híbrido-1 son dos vacunas que contienen

subunidades proteicas diseñadas para que sirvan como adyuvantes que potencian la
respuesta inmune en combinación con los antígenos inmuno-dominantes de M.
tuberculosis: Rv1196 y Rv0125 en M72, Ag85B y TB10.4 en Híbrido-1; el candidato
M72 se encuentra en la fase IIb mientras que el Híbrido-1 en fase IIa. El candidato
VPM 1002 es una vacuna recombinante viva derivada de la cepa vacunal BCG y
deficiente en ureasa, en la que se ha clonado el gen de la listerolisina de Listeria
monocytogenes con el fin de potenciar la respuesta inmune [9, 40]. Los datos
preclínicos han mostrado que este candidato tiene un efecto protectivo más eficaz que
la BCG tradicional y actualmente se encuentra en fase IIa en Sudáfrica [9, 40]. Por otro
lado, el candidato RUTI, basado en fragmentos detoxificados de M. tuberculosis
incorporados en liposomas, ha sido diseñado con el fin de complementar la
quimioterapia y acortar el tratamiento; este candidato ha mostrado ser efectivo en la
tuberculosis latente y se encuentra actualmente en fase IIa [9, 67]. Otro candidato es
MTBVAC Δ phoP Δfad26, basado en una cepa atenuada de M. tuberculosis; éste
candidato que se encuentra en fase I ha mostrado buenos resultados en modelo
murino y en primates con una protección superior a BCG [68].
El desarrollo de una vacuna más efectiva que la actualmente utilizada, es un

punto crucial en la prevención y el control de la enfermedad; en los últimos años el
enfoque estaba dirigido al descubrimiento de nuevos candidatos vacunales y al inicio
de ensayos clínicos, pero se ha proyectado que en los siguientes años se consolide su
progreso [9].
26
Introducción
1.7. Tratamiento
1.7.1. Esquema general
Un tratamiento eficaz reduce el riesgo de transmisión de la tuberculosis y la

generación de cepas resistentes, sin embargo el éxito del tratamiento se ve dificultado
por problemas como la sensibilidad de los bacilos a los fármacos bactericidas sólo
cuando están activos metabólicamente y en replicación, la presencia de
subpoblaciones que sólo se activan de modo transitorio durante lapsos de tiempo muy
cortos o la presencia de bacilos resistentes incluso en poblaciones que nunca han
estado previamente expuestos a los fármacos [69]. Por ello, la quimioterapia se basa
en el uso simultáneo de varios fármacos con un elevado poder bactericida contra
bacilos metabólicamente activos y una actividad esterilizante contra bacilos en estado
semilatente. La duración del tratamiento debe ser el suficiente para evitar la aparición
de cepas resistentes así como las recaídas de la enfermedad [69].
Los fármacos utilizados en el tratamiento se clasifican en: fármacos de primera,

segunda y tercera línea (Tabla 1.2). Los fármacos clasificados como de primera línea
son más eficaces y tolerables; los de segunda línea son menos efectivos que los de
primera línea y algunos pueden tener algún efecto secundario; mientras que la
mayoría de los fármacos de tercera línea no tienen bien establecida su efectividad [69,
70]. El programa estándar DOTS en el que se suministra los fármacos al paciente y se
observa como los toma, garantizando el cumplimiento de la terapia, contempla un
tratamiento por 6 meses de duración que incluye los dos primeros meses de fase
intensiva con el uso de isoniacida, rifampicina, pirazinamida y etambutol seguidos de
una fase de continuación con el uso de isoniacida y rifampicina durante cuatro meses
[69, 70].
Para casos individuales donde haya una baja conversión hacia negatividad del
esputo, se recomienda administrar pirazinamida con o sin etambutol por más de dos
meses, aunque esta prolongación no está aprobada por la OMS [71, 72]. Por otro lado,
se ha observado que el uso de rifampicina, isoniacida y etambutol en vez de
rifampicina e isoniacida solamente, en la fase de continuación puede llegar a ser
ventajosa en poblaciones con altos niveles de resistencia a la isoniacida [71, 72].
La obtención de un cultivo positivo después de dos meses de tratamiento

puede estar asociada a un fallo en el tratamiento o recaída lo que justifica la
prolongación de la fase de continuación hasta un total de 9 meses [71, 72]. La tasa de
recaída durante los 6-30 meses después de la finalización del tratamiento es <5%. El
27
Introducción
78% de las recaídas ocurren dentro de los 6 meses siguientes a la finalización del
tratamiento y el 91% dentro de los 12 meses posteriores [71, 72].
Tabla 1.2. Clasificación y mecanismo de acción de los fármacos utilizados en el tratamiento de

la tuberculosis [69-71, 73-75].
Actividad/Mecanismo de acción Comentarios
Fármacos de primera línea
Isoniacida Bactericida. Inhibición síntesis de Bacteriostático en bacilos no
ácidos micólicos replicativos
Rifampicina Bactericida. Inhibición de la RNA
polimerasa
Etambutol Bacteriostático. Inhibición de la Bactericida a dosis muy altas
síntesis de la pared
Pirazinamida Bactericida. Posible inhibición
síntesis de ácidos micólicos
Estreptomicina (Iny.) Bactericida. Inhibe la síntesis de
proteínas.
Fármacos de segunda línea
1. Aminoglucósidos
-Amikacina (Iny.). Bactericida. Inhibe la síntesis de
proteínas
-Kanamicina (Iny.) Bactericida. Inhibe síntesis de
proteínas
2. Polipéptidos
-Capreomicina (Iny.) Bactericida. Inhibe síntesis de
proteínas
-Viomicina Bactericida. Inhibe síntesis de
proteinas
-Enviomicina Bactericida. Inhibe síntesis de
proteinas
3. Fluoroquinolonas
-Ciprofloxacina Bactericida. Inhibe la DNA girasa
-Moxifloxacina Bactericida. Inhibe la DNA girasa
-Levofloxacina Bactericida. Inhibe la DNA girasa
4. Tionamidas
-Protionamida Bactericida. Inhibe la síntesis de la
pared celular
-Etionamida Bacteriostático débil. Bloquea la Bactericida en altas dosis
síntesis de ácidos micólicos
5. Cicloserina Bacteriostático. Inhibe la síntesis
de la pared celular
6. Acido p-aminosalicílico Bacteriostático. Inhibe la síntesis
de folatos
Fármacos de tercera línea
Linezoide Bactericida in vitro. Inhibe la
síntesis de proteínas
Rifabutina Bactericida. Inhibe RNA polimerasa
Macrólidos
-Claritromicina Inhibe la síntesis de proteínas
Vitamina D
Tioacetazona Bacteriostático. Inhibe la síntesis
de ácidos micólicos
Tioridazina Bactericida. Inhibe bombas de Tratamiento de cepas
eflujo específicas resistentes
Arginina
Iny: Inyectable.
28
Introducción
Se ha estimado que entre un 20-50% de los pacientes toman de forma

incorrecta o no completan el régimen prescrito, en donde el riesgo de incumplimiento
es mayor después de la fase inicial, transcurridas las primeras 6-8 semanas [69]. El
incumplimiento del tratamiento está relacionado con la duración, los efectos
secundarios y las interacciones con otros fármacos, especialmente en los
administrados a pacientes VHI positivos [71, 72]. Existe un perfil de pacientes
característico asociados a la no adherencia al tratamiento: personas sin techo,
alcohólicos y drogo dependientes, personas con problemas de comportamiento,
retardo mental y la falta de apoyo social y familiar. Las razones de estas conductas
son múltiples y complejas y a ellas hay que sumarles el entorno social y económico en
el que se encuentran; por ello es importante que los pacientes cuenten con el apoyo
familiar y de los profesionales de la salud para garantizar el éxito del programa de
tratamiento [71, 72].
El tratamiento de la tuberculosis latente consistía en administrar únicamente

isoniacida durante 6-12 meses o durante 9-12 meses en el caso de los pacientes VIH
positivos, pero estudios posteriores en estos pacientes han mostrado la posibilidad de
acompañar este esquema de tratamiento con rifampicina más pirazinamida por dos
meses [69].
1.7.2. Tratamiento de cepas resistentes y multirresistentes
Los casos de resistencia son más difíciles y costosos de tratar que los casos de
tuberculosis sensible y en la mayoría no son tratados adecuadamente aumentando la
tasa de transmisión y muerte [74, 76]. El régimen de tratamiento para cepas
resistentes debe ser diseñado e iniciado basándose en los resultados de los test de
susceptibilidad para cada paciente, teniendo en cuenta la medicación administrada
previamente y la presencia de enfermedades subyacentes; es importante que se haga
un seguimiento de la respuesta del paciente al tratamiento y que se cuente con un
experto en el manejo de resistencias [74, 76].
Los pacientes con MDR-TB son aquellos que presentan resistencia a por lo
menos isoniacida y rifampicina [74]. El tratamiento se hace utilizando como mínimo 4 o
más fármacos para los que sea susceptible, empezando con fármacos de primera
línea, adicionando una fluoroquinolona y un inyectable. Se debe adicionar un fármaco
oral de segunda línea para sumar un total de 4 a 6 fármacos. Este esquema debe ser
consultado con un experto en el uso de fármacos para el tratamiento de MDR-TB [74].
29
Introducción
La tuberculosis extremadamente resistente (XDR-TB, Extensively Drug-

Resistant Tuberculosis) se define como la resistencia a por lo menos isoniacida,
rifampicina, una fluoroquinolona y uno de los tres inyectables (amikacina, kanamicina o
capreomicina) [74]. El tratamiento en estos casos es todo un reto dada la falta de
fármacos potentes, sin embargo el enfoque es el mismo que el utilizado en los casos
de MDR-TB. Se deben administrar un total de 4 a 6 fármacos escogiendo primero
aquellos de primera línea que hayan mostrado actividad in vitro, seguido de fármacos
de segunda y tercera línea [74].
1.7.3. Tratamiento de pacientes VIH positivo
Los pacientes infectados con tuberculosis y coinfectados con VIH tienen una
probabilidad mayor (21-34 veces) de desarrollar la enfermedad tuberculosa que
quienes son VIH negativo. La coinfección con VIH debe ser controlada por expertos
tanto en tuberculosis como en VIH [9, 77]. Los principales inconvenientes del
tratamiento están relacionados con la mayor prevalencia de MDR-TB, la gravedad y el
momento clínico de ambas infecciones y la interacción farmacológica entre los
fármacos utilizados para tratar la tuberculosis y el VIH (inhibidores de la transcriptasa
reversa no nucleosídicos e inhibidores de proteasas) [77]. La rifampicina puede reducir
de manera significativa la concentración sanguínea de los inhibidores de proteasas ya
que éste fármaco es un inductor de las enzimas que los metabolizan (citocromos P450
A3), mientras que la rifabutina tiene el mismo efecto pero en menor grado. Se
recomienda tratar la primero la tuberculosis para evitar lo que se conoce como
síndrome de reconstitución inmunológica [69, 77]. En pacientes que no hayan iniciado
el tratamiento antirretroviral se recomienda un esquema de 9 meses (dos con
isoniacida, rifampicina y pirazinamida y siete con isoniacida y rifampicina) y pasados
los dos meses del inicio del tratamiento, se puede sustituir la rifampicina por rifabutina
y utilizar como inhibidor de proteasas el nelfinavir o indinavir. Opcionalmente, se puede
mantener la isoniacida y la rifampicina hasta el noveno mes y seleccionar ritonavir
como inhibidor de proteasa o efavirenz como inhibidor no nucleosídico [69, 77]. Se
debe monitorizar la carga viral y los CD4. Por otro lado, los pacientes que ya reciben
tratamiento antirretroviral no deben interrumpirlo y el tratamiento debe ser ajustado con
el fin de adecuarlo al esquema anteriormente mencionado. En caso de resistencia a
rifampicina, se recomienda el uso de rifabutina con un prolongamiento de la fase de
continuación con isoniacida y etambutol hasta 18 meses [69, 77].
30
Introducción
1.7.4. Nuevos fármacos
El tratamiento de la tuberculosis es un área en continuo desarrollo en donde

nuevos fármacos están siendo estudiados con el fin de mejorar los regímenes para
que sean más cortos, simples, económicos, efectivos y menos tóxicos tanto para el
tratamiento de cepas resistentes como para las que no lo son. Otro de los objetivos es
disminuir la interacción con los fármacos usados para el tratamiento del VIH [7, 76].
Actualmente hay cerca de 13 fármacos en diversos estadios de evaluación clínica para
el tratamiento de la tuberculosis (Tabla 1.3); éstos pueden dividirse en varias
categorías: (1) nuevos fármacos desarrollados para el tratamiento de la tuberculosis
(TMC207, SQ109, LL3858), (2) reevaluación de fármacos de primera línea con el fin
de optimizar su eficacia (rifampicina, rifapentina) y (3) fármacos utilizados actualmente
para otras indicaciones y compuestos de siguiente generación re-propuestos para el
tratamiento de la tuberculosis (gotifloxacina y moxifloxacina; linezolids, PNU100480 y
AZD5847; metronidazol, OPC-67683 y PA-824) [7, 76].
Tabla 1.3. Fármacos en evaluación clínica para TB. Tomado de [76].

Fármaco Categoría Diana Fase Clínica
TMC207 para MDR-
TB Nuevo ATP sintasa II-III
TMC207 para DS-TB Nuevo ATP sintasa II
Sudoterb (LL3858) Nuevo Desconocido II
SQ109 Nuevo Desconocido I
Rifapentina Fármaco corriente RNA polimerasa I-II
Rifampicina Fármaco corriente RNA polimerasa I
Garifloxacina Repropuesto DNA girasa III
Moxifloxacina Repropuesto DNA girasa III
Complejo de iniciación de
Linezolid Repropuesto la síntesis de proteínas II
Siguiente
generación Complejo de iniciación de
PNU100480 repropuesta la síntesis de proteínas I
Siguiente
generación Complejo de iniciación de
AZD5847 repropuesta la síntesis de proteínas I
Metronidazol Repropuesto No determinado para TB II
Siguiente Múltiple, incluyendo la
generación biosíntesis de lípidos y
OPC-67683 repropuesta Proteínas II-III
ATP: Adenosin trifosfato, DS-TB: Tuberculosis sensible, MDR-TB: Tuberculosis
Multirresistente
Así mismo, se está explorando el uso de inhibidores de bombas de eflujo que

administrados junto con antibióticos, potencien su actividad [78].
31
Introducción
1.8. Resistencia
Desde la producción de la penicilina en los años cuarenta, se han desarrollado

numerosos fármacos que ha permitido disminuir la mortalidad asociada a infecciones
bacterianas. Sin embargo el uso intensivo e inadecuado de antibióticos ha provocado
la selección e incremento de bacterias resistentes en poblaciones de patógenos
humanos [79, 80]. Los mecanismos de resistencia probablemente existieron antes del
descubrimiento y uso de la quimioterapia antimicrobiana y prueba de ello es el
aislamiento de una bacteria resistente con 2000 años de antigüedad proveniente de un
glaciar canadiense. Así mismo se identificaron genes de resistencia a β-lactámicos en
una librería metagenómica de sedimentos marinos a los que se les estimó 10000 años
de antigüedad, mientras que otros estudios han identificado microorganismos
resistentes en cepas de Citrobacter freundii y E. coli aisladas antes de 1920 y 1950
respectivamente [79]. También, se ha estimado que la las vías biosintéticas de la
eritromicina, la estreptomicina y la vancomicina tienen una antigüedad de 880, 610 y
240 millones de años respectivamente y la producción de β-lactamasas una
antigüedad de 2 mil millones de años, lo que precede la divergencia de gram negativos
y gram positivos [81]. Por otro lado, también se cree que la resistencia surgió en los
microorganismos productores de antibióticos como mecanismo de autoprotección
contra la acción de sus propios antibióticos lo que está respaldado por el hecho de que
exista una alta homología entre las enzimas que modifican antibióticos de
microorganismos productores y las de microorganismos resistentes. Igualmente los
vecinos microbianos (en nichos específicos) de los microorganismos productores de
antibióticos deben co-evolucionar para desarrollar estrategias de resistencia que les
permitan sobrevivir [81].
La exposición a los antibióticos ha sido el factor más importante que ha

influenciado la aparición y difusión de la resistencia, de hecho muchos estudios han
mostrado una relación directa entre la frecuencia de la resistencia y el uso de
antimicrobianos, por lo que se cree que éstos actúan ejerciendo una presión selectiva
que dirige la evolución de la resistencia [82, 83]. Dicha presión probablemente es
ejercida sobre un grupo de genes existentes conocidos como genes de pre-resistencia
con funciones bioquímicas alternativas que podrían tener una resistencia baja o
fortuita u otro tipo de afinidad por el antibiótico y que bajo presión se convertirán en
genes de resistencia y pasarían a formar parte del resistoma bacteriano [81-83].
Desde el punto de vista clínico, la resistencia se define como el estado en el

cual un paciente infectado con un patógeno determinado es tratado con una dosis
32
Introducción
específica de un antimicrobiano y una vez finalizado el tratamiento no alcanza una

cura clínica [83]. Desde el punto de vista microbiológico, la resistencia se define
usando la CMI (Concentración Mínima Inhibitoria) en la que se establece la
concentración mínima a la que un antimicrobiano inhibe el crecimiento in vitro de un
microorganismo clasificando los aislados en susceptibles (con una alta probabilidad de
éxito terapéutico) y resistentes (asociados a una alta probabilidad de fallo terapéutico)
[83].
1.8.1. Mecanismos de Resistencia
La resistencia antimicrobiana puede ser intrínseca, adquirida o adaptativa. La

resistencia intrínseca se puede describir como un fenómeno natural que muestran
todos los miembros de una especie y está relacionada con la función de componentes
fisiológicos o bioquímicos de dichos microorganismos, como por ejemplo la barrera
ofrecida por la pared celular de algunas bacterias y la expresión constitutiva o
inducible de sistemas activos de eflujo [79, 84]. La resistencia adquirida es el resultado
de una presión evolutiva específica que permite contrarrestar el efecto de un
antibiótico o una clase de antibióticos y se presenta en ciertos linajes derivados de un
ancestro susceptible [85]. Entre los mecanismos de resistencia adquirida están las
mutaciones puntuales en genes cuyo producto es la diana de los antibióticos, las
mutaciones en reguladores transcripcionales, la adquisición de genes de resistencia
exógenos (por transformación, conjugación o transducción) y la producción de
enzimas que modifican y destruyen la actividad del antibiótico (Fig. 1.7) [79, 85, 86].
A B
C D
Figura 1.7. Mecanismos de resistencia en bacterias. A) Inactivación del compuesto. B)

Alteración de la diana. C) Inhibición de la entrada del compuesto a la célula. D) Eflujo activo del
compuesto. Modificado de [86].
33
Introducción
Los mecanismos de resistencia adquirida requieren una nueva programación

genética en respuesta a la presencia del antibiótico [85]. De hecho en varios casos, los
antibióticos o su acción pueden regular la expresión de genes de resistencia haciendo
que la bacteria invierta una considerable cantidad de energía y espacio genético para
resistir activamente a los antibióticos [85].
La resistencia adaptativa es un área relativamente inexplorada, que implica un

incremento temporal en la habilidad de la bacteria a sobrevivir a la presión ejercida por
un antibiótico y que se da gracias a la alteración en la expresión de genes y/o
proteínas como resultado de la exposición a determinadas condiciones ambientales
como el estrés, disponibilidad de nutrientes, fase de crecimiento o niveles sub
inhibitorios de compuestos [87]. A diferencia de la resistencia intrínseca o adquirida
que son estables y pueden transmitirse, la resistencia adaptativa es transitoria y puede
ser revertida por la remoción de la condición inductora [87].
1.8.1.1. Sistemas de eflujo
Uno de los mecanismos de resistencia antimicrobiana más ampliamente

distribuidos entre los microorganismos son los sistemas de eflujo. Estos están
presentes tanto en gram positivos como en gram negativos y le permiten a las
bacterias limitar el acceso de agentes antimicrobianos a sus dianas [88]. Los genes
que los codifican pueden estar presentes a nivel cromosómico o en elementos móviles
como los plásmidos [89]. Estos sistemas pueden actuar en sinergia con otros
mecanismos de resistencia produciendo un nivel elevado de resistencia de importancia
clínica [90].
Las primeras evidencias de que los sistemas de eflujo estaban implicados en la

resistencia a antimicrobianos fueron obtenidas a finales de los años setenta y desde
entonces estos mecanismos han sido reconocidos como los principales causantes de
la aparición de fenotipos MDR. Algunas bombas de eflujo muestran una marcada
especificidad de sustrato pero otras son inespecíficas y pueden expulsar múltiples
compuestos no relacionados estructuralmente [84, 90].
La resistencia puede ser conferida por niveles basales de eflujo o puede surgir
como resultado del incremento constitutivo en la expresión del transportador en
bacterias que usualmente son susceptibles [89]. Este incremento puede ocurrir por la
mutación en el represor local del gen, la mutación de un regulador global, la mutación
en la región promotora o una mutación en elementos de inserción localizados corriente
arriba del gen codificante para la bomba de eflujo [89].
34
Introducción
También, ciertas condiciones ambientales, incluyendo la exposición a diversos

compuestos entre ellos los antimicrobianos, tienen un impacto en la expresión de los
sistemas de eflujo y es así como la expresión diferencial de genes que los codifican se
deben a cambios a nivel extracelular lo que refleja la importancia de estos sistemas en
la adaptación de los microorganismos a su entorno [39, 87]. Los antimicrobianos
juegan un papel muy importante en la inducción de resistencia adaptativa por
sobreexpresión de los sistemas de eflujo. Así cuando la bacteria es expuesta a
concentraciones sub-inhibitorias de un antimicrobiano en un tratamiento que es
abandonado, las bacterias no serán eliminadas si no que llegarán a ser más
resistentes y se cree que la exposición a estas concentraciones induce la expresión
del 5 al 20% de todos los genes cromosómicos [39, 87].
Los sistemas de eflujo son transportadores que no solamente están implicados

en la resistencia, si no que también se encargan de la captación de nutrientes
esenciales y iones, de la excreción de productos finales del metabolismo y sustancias
nocivas, de la comunicación entre las células y el ambiente e incluso algunos exportan
colorantes y detergentes [89]. También, algunos exportan determinantes de virulencia
como adhesinas, toxinas y otras proteínas implicadas en la colonización e infección de
células humanas y animales. Es así como varios estudios han mostrado que la falta de
expresión de algunas bombas de eflujo en gram negativos tiene un efecto deletéreo en
la capacidad patogénica de la bacteria lo que sugiere un posible papel fisiológico que
le permite sobrevivir en el huésped y causar la patología [89].
Los transportadores se clasifican en cinco familias: la superfamilia de

transportadores ABC, la superfamilia de facilitadores principales, la familia de extrusión
de múltiples compuestos tóxicos y fármacos (MATE, Multidrug and toxic compound
extrusión), la familia menor de resistencia a múltiples fármacos (SMR, Small Multidrug
Resistance) y la superfamilia de resistencia-nodulación-división (RND, Resistance-
Nodulation-Division) (Fig. 1.8). También, se pueden clasificar en función de la fuente
de energía que utilizan en: transportadores primarios si utilizan la energía libre
proveniente de la hidrólisis del ATP y transportadores secundarios si utilizan el
gradiente electroquímico transmembranal [86, 90]. Finalmente el transporte puede ser
de tipo simporte, antiporte o uniporte. El proceso de simporte corresponde al
transporte de dos o más tipos de sustratos en la misma dirección simultáneamente, en
el anitporte se transporta dos o más tipos de sustratos en direcciones contrarias
simultáneamente y el uniporte es el transporte de un solo tipo de sustrato a través de
la membrana en una dirección [91].
35
Introducción
Compuesto
Compuesto
Compuesto
Compuesto
Membrana
Interna
Compuesto
Periplasma
Membrana externa
Figura 1.8. Tipos de bombas de eflujo. Tomado de [92].
1.8.1.1.1. Transportadores ABC
Los transportadores ABC son permeasas multiméricas que se encuentran tanto

en procariotas como en eucariotas. Estos transportadores acoplan la energía liberada
de la hidrólisis del ATP a la translocación de una amplia variedad de sustancias
(aminoácidos, iones, péptidos, fármacos, lípidos, polisacáridos, proteínas, etc) y son
importantes factores de virulencia en bacterias ya que están implicados en la
captación de nutrientes y en la secreción de toxinas y antimicrobianos [93, 94].
El primer transportador ABC descrito fue la glicoproteína P humana, la cual

está implicada en la multirresistencia a fármacos en células tumorales. También se
han descrito en actinomicetos productores de antibióticos en los que están implicados
en la autorresistencia al antibiótico sintetizado [89, 94, 95].
Los transportadores ABC están compuestos de cuatro dominios: dos dominios

transmembranales (MSD, Membrane-Spanning Domains) y dos dominios de unión a
nucleótido (NBD, Nucleotide-Binding domain), sin embargo algunas bacterias pueden
tener uno de cada o sólo un NBD. En muchas bacterias estos cuatro dominios se
36
Introducción
expresan como polipéptidos independientes codificados por genes organizados en un

operón o agrupados en una región de DNA, mientras que en eucariotas estos
transportadores son codificados por un solo gen [93]. Por otro lado, estos
transportadores se clasifican en importadores y exportadores de acuerdo con el
sentido de la translocación del sustrato. Los importadores se encuentran
exclusivamente en procariotas y usualmente están asociados a una proteína de unión
a sustrato extra citoplasmática (SBP, Substrate Binding Protein) localizada en el
periplasma de gram negativos o asociada a la membrana de gram positivos mediante
un anclaje lipo-aminoácido contiguo. Por su parte los exportadores se encuentran
tanto en eucariotas como en procariotas y en estos últimos algunos necesitan
proteínas adicionales presentes en la membrana externa [93].
Los NBDs son los encargados de acoplar la hidrólisis del ATP en el proceso de
transporte. Estos dominios son los más conservados entre este tipo de
transportadores con un 30-40% de homología independientemente de su especificidad
de sustrato u origen. Poseen secuencias altamente conservadas: los motivos WalkerA
y WalkerB que forman un bolsillo de unión de ATP típico de los transportadores ABC,
las secuencias de la marca de la familia de transportadores ABC que son un patrón
característico localizado entre los motivos WalkerA y WalkerB y por último un motivo de
seis aminoácidos corriente abajo del motivo WalkerB [93]. Por su parte los MSDs
contienen de 4 a 8 α-hélices transmembrana (usualmente 6) que forman el canal que
permite la translocación del sustrato a través de la membrana. Estos dominios son
menos conservados que los NBDs pero algunos tienen patrones característicos como
el bucle EAA que se encuentra entre la última y penúltima α-hélice y que
probablemente constituye el sitio de interacción con los NBDs [93]. Otro patrón es la
marca de las proteínas integrales de membrana del sistema de transporte tipo ABC-2
que es un motivo que se encuentra en el extremo C-terminal de algunos MSDs. Los
SBP presentan una baja similitud en su secuencia de aminoácidos y en gram positivos
tienen un sitio de unión a lipoproteínas próxima a una secuencia señal hidrofóbica [93].
1.8.1.1.2. Transportadores MFS
Los transportadores MFS son proteínas de membrana que se encuentran en

procariotas y eucariotas. Estos transportadores están implicados en el transporte de
varios sustratos como azúcares, intermediarios del ciclo de krebs, ésteres fosfato,
oligosacáridos, inositoles, antibióticos y una amplia variedad de aniones y cationes
inorgánicos. El transporte de estos sustratos se puede llevar a cabo por simporte,
antiporte o uniporte [86]. Se cree que los transportadores MFS funcionan como
37
Introducción
monómeros, sin embargo en gram negativos pueden formar parte de sistemas

tripartita junto con proteínas del periplasma y canales de la membrana externa [90]. El
análisis de hidropatía y el alineamiento de motivos conservados ha revelado que
algunas proteínas MSF pueden agruparse en dos familias con 12 o 14 segmentos
transmembranales. Además, estos transportadores tienen secuencias conservadas
llamadas motivos A a H. Los motivos A y B se encuentran ampliamente distribuidos
entre los miembros de esta superfamilia, mientras que el motivo C a G sólo está
presente en las familias de 12 y 14 segmentos transmembranales [86]. Por otro lado,
muchos de los transportadores que pertenecen a esta superfamilia han mostrado
similitud en las regiones N y C-terminal de sus secuencias y dado el amplio rango de
sustratos reconocidos se ha sugerido que las regiones C-terminal de estos
transportadores son los que determinan la especificidad de sustrato y la región N-
terminal estaría implicada en la translocación de protones [86]. Se han descrito varias
bombas de eflujo pertenecientes a esta superfamilia implicadas en la resistencia a
antibióticos tanto en gram negativos como en gram positivos, siendo uno de los
mejores caracterizados TetB de E. coli el cual confiere resistencia a tetraciclina [91,
92].
1.8.1.1.3. Transportadores MATE
Los transportadores MATE están implicados en la resistencia a múltiples

agentes tóxicos incluyendo colorantes catiónicos, aminoglucósidos y fluoroquinolonas
aunque su perfil de sustrato es menor comparado con los de otros transportadores.
Estos transportadores están compuestos por una sola proteína de membrana con 12
dominios transmembrana y utilizan el gradiente electroquímico, con frecuencia el
gradiente de Na+ o H+ para el transporte [90, 91]. Aunque hay pocos transportadores
de este tipo caracterizados, muchos genomas bacterianos contienen proteínas MATE
hipotéticas, incluso se han identificado dos genes en el cromosoma 17 humano [90,
91]. El primer transportador caracterizado de este tipo fue NorM de Vibrio
parahaemolyticus y posteriormente se identificaron otros tanto en gram negativos
como en gram positivos [96].
1.8.1.1.4. Transportadores SMR
Los SMR son una familia de transportadores relativamente pequeña restringida

a procariotas [97]. Ellos además son los transportadores multifármaco más pequeños
ya que contienen solo cerca de 110 aminoácidos y cuatro segmentos
transmembranales y posiblemente dado su tamaño, funcionan como complejos
38
Introducción
oligoméricos con tres motivos conservados (A, B y C) [96, 98]. Utilizan la fuerza
protónica motriz para translocar sus sustratos usando el mecanismo antiporte. Aunque
son bombas multifármaco, sus sustratos incluyen antisépticos y desinfectantes. Los
miembros de esta familia mejor caracterizados son Smr de Staphylococcus aureus y
EmrE de E. coli [98].
1.8.1.1.5. Transportadores RND
Estos transportadores se encuentran tanto en eucariotas como en procariotas,

generalmente en gram negativos donde son altamente conservados. Funcionan como
un sistema tripartita formado por una proteína transportadora ubicada en la membrana
interna, una proteína accesoria periplásmica o proteína de fusión de membrana y una
proteína de membrana externa o porina [91, 99]. Estos transportadores son antiporte
con 12 dominios transmembrana y pueden dividirse en dos subfamilias: la del eflujo de
compuestos hidrófobos y anfipáticos y la subfamilia del eflujo de metales pesados [86].
Estos transportadores poseen un amplio rango de sustratos siendo capaces de
contribuir a la resistencia de una gran cantidad de antimicrobianos no relacionados
estructuralmente por lo que se conocen como sistemas multifármacos inespecíficos
[91]. También juegan un papel a nivel fisiológico, protegiendo a bacterias como E. coli
de sales biliares y detergentes y a Pseudomonas aeruginosa de compuestos tóxicos
producidos por otros microorganismos en suelos. Estos transportadores pueden
capturar compuestos que se encuentran en el espacio periplásmico y expulsarlos al
exterior [100]. Los sistemas más estudiados son el AcrAB-TolC de E. coli y MexAB-
OprM de P. aeruginosa [99, 100].
1.8.1.2. Resistencia por modificación o degradación enzimática del antibiótico
Este es un mecanismo específico utilizado por las bacterias con el fin de

inactivar el antibiótico mediante la ruptura de enlaces o la modificación química por
adición o sustitución de radicales. Se cree que reacciones como la hidrólisis, la
transferencia de grupo y las enzimas redox implicadas en el metabolismo primario e
intermediario de los microorganismos posiblemente fueron el origen de este tipo de
resistencia (Tabla 1.4) [85, 100].
39
Introducción
Tabla 1.4. Estrategias enzimáticas de inactivación de antibióticos. Tomado de [85].
Antibióticos
Estrategia Tipo afectados
Hidrólisis β-lactámicos
Macrólidos
Transferencia
de grupo Acil Aminoglucósidos
Cloranfenicol
Estreptogramina A
Fosforil Aminoglucósidos
Macrólidos
Rifamicinas
Péptidos
Tiol Fosfomicina
Nucleotidil Aminoglucósidos
Lincosamina
ADP-ribosil Rifamicina
Glicosil Macrólidos
Rifamicina
Otros Redox Tetraciclina
Rifamicina
Estreptogramina A
Liasa Estreptogramina B
1.8.1.2.1. Hidrólisis
Muchos antibióticos tienen enlaces químicos hidrolíticamente susceptibles,

cuya integridad es importante para su actividad biológica. Existen varios ejemplos de
enzimas que han evolucionado para romper estos enlaces y así destruir la actividad
del antibiótico [85]. El ejemplo mejor conocido son las β-lactamasas, amidasas que
clivan el anillo β-lactámico de las penicilinas y la cefalosporinas. Otros ejemplos
incluyen las esterasas que se han relacionado con la resistencia a macrólidos y
fosfomicina. Estas enzimas requieren agua como co-sustrato por lo que las bacterias
las excretan e interceptan el antibiótico antes de que esté en contacto con la célula
[85].
Las β-lactamasas fueron uno de los primeros mecanismos de resistencia

reportados en la literatura. Han sido detectadas en gram positivos y gram negativos
tanto en plásmidos como a nivel cromosómico Estas enzimas pueden ser metalo-β-
lactamasas o Ser-β-lactamasas según la estrategia empleada para clivar el anillo β-

lactámico [85]. Por su parte las esterasas, actúan catalizando la hidrólisis del anillo
lactona de los macrólidos, estas enzimas también han sido detectadas tanto en gram
40
Introducción
positivos como en gram negativos. Se describieron por primera vez en 1984 en un

aislado resistente de E. coli; esta resistencia se ha relacionado con la presencia de los
genes ereA y ereB. Las epoxidasas actúan sobre el anillo epóxido de la fosfomicina
[85]. Este proceso es catalizado por la enzima FosX de Mesorhizobium loti que
además tiene ortólogos en otras bacterias y cuya estructura es similar a la de la
enzima FosA implicada en resistencia en gram negativos [85].
1.8.1.2.2. Resistencia por transferencia de grupo
Este tipo de resistencia abarca un grupo muy diverso y amplio de enzimas cuya
función es modificar covalentemente los antibióticos, lo que produce una alteración
estructural que impide la unión a su diana. Las estrategias químicas incluyen la O-
acilación y N-acilación, la O-fosforilación, la O-nucleotidilaicón, la O-ribosilación, la O-
glicosilación y la transferencia de tiol. Las enzimas de este grupo son activas solo en el
citosol ya que requieren un co-sustrato como el ATP, el acetil-CoA, NAD+, UDP
glucosa o el glutatión [85].
Dentro de este grupo se encuentran las aciltransferasas que son bastante

comunes en bacterias. La modificación covalente de los grupos hidroxil o amino
produce una pérdida en la capacidad del antibiótico para unirse a su diana y por lo
tanto se vuelven inactivos. El éster (por O-acetilación) o la amida (por N-acetilación)
resultante es biológicamente estable e irreversible sin la acción de una esterasa o una
amidasa. Dentro de las aciltransferasas se encuentran las aminoglucósido
acetiltransferasas, las cloranfenicol acetiltransferasas y las estreptogramina
acetiltransferasas [85]. Las aminoglucósido acetiltransferasas actúan sobre los grupos
amino e hidroxilo de los aminoglucósidos impidiendo su interacción con el rRNA, los
genes que los codifican se encuentran distribuidos en bacterias de importancia clínica
y en bacterias ambientales. Las cloranfenicol acetiltransferasas son enzimas triméricas
que acetilan los dos grupos hidroxilo del cloranfenicol evitando su unión a la subunidad
50S del ribosoma. Las estreptogramina acetiltransferasas, identificadas en varios gram
positivos, acetilan el grupo hidroxilo libre de la estreptogramina A [85].
Las fosfotransferasas son enzimas que catalizan la transferencia de fosfatos a

diversos sustratos. La O-fosfotransferasas están implicadas en la resistencia a
antibióticos y muchas comparten similitudes estructurales con otras quinasas como las
proteinquinasas [85]. Dentro de este grupo se encuentran las aminoglucósido
quinasas, ampliamente distribuidas entre patógenos bacterianos y que impiden la
unión del antibiótico al ribosoma, los genes que las codifican se han encontrado en
plásmidos, transposones e integrones. También existen otras quinasas como las
41
Introducción
macrólido quinasas y las viomicina quinasas que confieren resistencia a la eritromicina

y a la viomicina respectivamente y que han sido detectadas en gram positivos y gram
negativos [85].
Las tioltransferasas están implicadas en la resistencia a la fosfomicina por

acción sobre su anillo epóxido. En gram negativos se ha detectado la enzima de
resistencia a la fosmidomicina FosA (en plásmidos y en el cromosoma) y un gen
equivalente (fosB) en gram positivos. Las nucleotidiltransferasas modifican los
aminoglucósidos y las lincosinamidas transfiriendo nucleósidos a un grupo hidroxilo de
estos antibióticos [85]. Estas enzimas han sido detectadas en gram negativos y gram
positivos. Por su parte las ADP-ribosiltransferasas transfieren ADP-ribosa proveniente
del NAD+ a un hidroxilo del antibiótico. El caso mejor documentado es el de la
resistencia a las rifamicinas en micobacterias aunque se han detectado enzimas
similares en gram negativos. Las glicosiltransferasas catalizan la glicosilación de la
eritromicina y otros macrólidos en la posición 2’ del azúcar desosamina, estas enzimas
están presentes en bacterias productoras de antibióticos como Streptomyces que las
utilizan como mecanismo de protección [85].
1.8.1.2.3. Otros mecanismos de resistencia enzimática
La mayor parte de los mecanismos enzimáticos de resistencia a antibióticos se

dan por transferencia de grupo e hidrólisis, pero las bacterias han desarrollado otros
mecanismos de detoxificación como son las enzimas redox y las liasas.
1.8.1.2.3.1. Enzimas redox
La oxidación es uno de los principales mecanismos utilizados por mamíferos

para detoxificar xenobióticos, pero no es demasiado frecuente en bacterias patógenas.
Uno de los mecanismos más conocidos es la oxidación de la tetraciclina por la enzima
TetX de Bacteroides fragilis que cataliza la monohidroxilación del antibiótico en la
posición 11a afectando el sitio de unión a Mg2+, necesario para su actividad
antimicrobiana. También, se ha visto que una posible monooxigenasa de
Rhodococcus equi confiere resistencia a la rifampicina aunque no se conoce el
mecanismo exacto [85].
1.8.1.2.3.2. Liasas
Las liasas son enzimas que rompen los puentes carbono-carbono, carbono-
oxígeno, carbono-nitrógeno, carbono-sulfuro por rutas no hidrolíticas o no oxidativas.
42
Introducción
Una de las liasas mejor caracterizadas es la Vgb de estafilococos, la cual es

responsable de la resistencia a estreptogramina B [85].
1.8.1.3. Resistencia por alteración de la diana
Las bacterias pueden desarrollar resistencia a través de alteraciones que

hacen que la proteína diana sea menos susceptible al fármaco. Por ejemplo la
resistencia a fluoroquinolonas se debe principalmente a mutaciones en la enzima
diana DNA topoisomerasa [100]. Otro ejemplo es la metilación de la adenina en la
posición 2058 del la subunidad 50S de rRNA conferida por el producto del gen erm,
usualmente codificado en un plásmido provocando la resistencia a macrólidos,
lincosamida y estreptomicina [100].
1.8.2. Papel de los biocidas en resistencia
Los biocidas (antisépticos, desinfectantes y preservantes) han sido usados

empíricamente de varias formas durante siglos con el fin de preservar alimentos,
especias e incluso bálsamos usados en los procesos de momificación. Cuando se
descubrieron las bacterias, se desarrollaron métodos de preservación química y
desinfección en donde se emplearon sustancias como el iodo, el cloro, el fenol y el
cloruro de mercurio [101]. Posteriormente otros compuestos fueron desarrollados y
utilizados satisfactoriamente para prevenir dolencias infecciosas, particularmente en
hospitales. Los desinfectantes contienen uno o más compuestos químicos a una
concentración suficiente para afectar múltiples dianas celulares (proteínas, DNA, RNA,
componentes de la pared celular) y pueden ser bactericidas, esporicidas, fungicidas,
viricidas o una combinación de ellos [101]. La respuesta bacteriana a los biocidas es
determinada por la naturaleza del agente químico y el tipo de microorganismo
implicado. Factores como la temperatura, el pH ambiental y la presencia de materia
orgánica pueden tener un efecto considerable sobre la actividad de un agente
antibacteriano [101].
Los biocidas juegan un papel importante en el control de las fuentes de

infección. Su uso ha aumentado cerca de seis veces en los últimos años lo que ha
producido una reducción significativa en la transmisión de agentes infecciosos. Sin
embargo actualmente existe una creciente preocupación acerca del uso de biocidas y
su relación con el desarrollo de resistencias que puedan afectar a fármacos
clínicamente relevantes [80, 87]. Se ha observado que las bacterias pueden
desarrollar respuestas comunes para contrarrestar los efectos de los biocidas y los
antibióticos, un fenómeno que se conoce como resistencia o tolerancia cruzada
43
Introducción
biocida-antibiótico, posiblemente generada por una presión que favorece la selección

de cepas resistentes [80, 101]. La resistencia cruzada puede ocurrir en
microorganismos con un número elevado mecanismos inespecíficos de resistencia
tales como sistemas de eflujo y cambios en la permeabilidad de la membrana. Por otro
lado, se ha sugerido que la tolerancia a los biocidas puede surgir al igual que en el
caso de los antibióticos, por el uso incorrecto del compuesto [80, 101].
La actividad de los biocidas varía enormemente en diferentes tipos de

microorganismos y sus cepas, algunos de los cuales pueden ser intrínsecamente
resistentes. Al igual que en la resistencia a fármacos, la resistencia intrínseca a los
biocidas está relacionada con determinantes genéticos y características fisiológicas y
estructurales de la bacteria [101]. Las micobacterias son probablemente las bacterias
más resistentes a la desinfección, seguidas de las gram negativas y las gram
positivas. En cuanto a la resistencia adquirida, está dada por mutaciones o por la
adquisición de determinantes genéticos presentes en elementos extra cromosómicos
como los plásmidos y los transposones [101].
La resistencia bacteriana a los biocidas fue descrita por primera vez en los
años cincuenta y sesenta [101]. A la fecha se han descrito varios sistemas de eflujo,
pertenecientes a las principales familias de transportadores implicados en la
detoxificación de biocidas y antibióticos tanto en gram positivos como en gram
negativos. Éstos incluyen transportadores codificados en plásmidos y determinantes
cromosómicos implicados en la resistencia a compuestos del amonio cuaternario, el
triclosán (TRC) y la plata, entre otros [102]. Dichos mecanismos muestran una amplia
especificidad de sustrato, siendo capaces de expulsar una variedad de compuestos no
relacionados estructuralmente incluidos los antibióticos [103]. Estos sistemas de eflujo
incluyen NorA, NorB, MepA y MdeA de S. aureus, el sistema Mex de P. aeruginosa,
AcrAB-TolC de E. coli, SdeXY de Serratia marcescens y SmeDEF de
Stenotrophomonas maltophilia, entre otros [101-103].
1.8.2.1. Triclosán
El triclosán (5-cloro-2-(2,4-dicloro-fenoxi)-fenol), también conocido como

Irgasán es un bisfenol que tiene una alta actividad antibacteriana. Desde los años
setenta se ha usado en un extenso rango de productos del cuidado personal, en la
industria textil, en suministros de limpieza, en la fabricación de juguetes, contenedores
para el almacenaje de alimentos y bolsas de basura, entre otros [104]. Su extenso uso
se debe a que tiene un amplio espectro de acción y es un compuesto seguro. El TRC
es activo contra bacterias gram positivas, algunas gram negativas, hongos y virus; su
44
Introducción
uso ha sido implementado en hospitales para la prevención de infecciones

nosocomiales [104].
Como en el caso de otros biocidas, el TRC tiene múltiples mecanismos de

acción y numerosas dianas celulares a concentraciones superiores a la CMI [105].
Aunque varios estudios han mostrado que a concentraciones sub letales inhibe dianas
bacterianas específicas como la vía biosintética de los ácidos grasos, en concreto la
enoil-ACP reductasa [104] conocida como FabI en E. coli [106], P. aeruginosa [107] y
S. aureus [108] o su homóloga InhA en M. smegmatis y M. tuberculosis que también
es la diana de la isoniacida y la etionamida [109, 110]. Sin embargo Streptococcus
pneumoniae no contiene un homólogo de FabI, en su lugar posee FabK, una enoil
reductasa que es resistente al TRC por lo que se sugiere que en esta bacteria el TRC
podría tener otros blancos responsables de la sensibilidad a este compuesto [111]. Los
efectos observados del TRC sobre la estructura y función de la membrana bacteriana
son una consecuencia de la inhibición de la síntesis de ácidos grasos que a su vez
afecta la síntesis de lípidos como fosfolípidos, lipopolisacáridos, lipoproteínas y ácidos
micólicos [101].
Por otro lado, los efectos del TRC pueden variar dependiendo de la
concentración utilizada, su biodisponibilidad, el tiempo de exposición, la fisiología de la
diana y el microorganismo sobre el cual actúa. Se ha observado que su actividad es
menor cuando la bacteria se encuentra en fase estacionaria posiblemente debido a un
metabolismo reducido y a la presencia de restos celulares y células muertas que
pueden reducir su biodisponibilidad [105]. Las concentraciones a las que normalmente
se usa el TRC son más altas que las requeridas para inhibir la mayoría de bacterias,
por lo que bajo condiciones normales de uso es poco probable que se produzca
resistencia. Sin embargo los productos que contienen TRC dejan residuos en cocinas,
baños y superficies donde son inevitablemente diluidos a concentraciones subletales
que posiblemente permitan la selección de bacterias con resistencia intrínseca o
adquirida al TRC o a otros compuestos no relacionados. Estas bacterias constituyen
una fuente de determinantes de resistencia que pueden ser transmitidos a patógenos
humanos con la posible generación de resistencias cruzadas, cuya aparición ha sido
también atribuida al hecho de que este compuesto inhibe una diana bacteriana
específica como ocurre con otros antibióticos de importancia clínica [104].
En general, los mecanismos por los cuales las bacterias son resistentes al TRC
incluyen mutaciones, modificación enzimática y bombas de eflujo que se expresan en
respuesta al estrés ejercido por el biocida. Varios estudios han mostrado que las
45
Introducción
mutaciones en el gen fabI están relacionadas con la resistencia a TRC en E. coli [106,
112] y subsecuentes estudios genéticos revelaron que la mutación de su homólogo
inhA en M. smegmatis produce igualmente resistencia al TRC y a la isoniacida [109].
Sin embargo las cepas de M. tuberculosis resistentes a la isoniacida son susceptibles
al TRC por lo que el diseño de inhibidores dirigidos al sitio de unión del TRC podría ser
útil en el tratamiento de las cepas resistentes [110].
Se han descrito mecanismos de eflujo implicados en la resistencia al TRC, en

muchas bacterias, incluyendo E. coli (AcrAB-TolC) [113], S. maltophilia (SmeDEF)
[114], Salmonella enterica (AcrAB-TolC) [115, 116], Campylobacter jejuni (CmeABC)
[117], B. fragilis (BmeABC) [118], P. aeruginosa (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-
OprN, MexEF-OmpH y TriABC-OpmH) [119, 120] Serratia marcescens (SdeXY) [121],
entre otros. Muchas de estas bombas han mostrado resistencia cruzada con
antibióticos [104], como es el caso de las quinolonas en E. coli y P. aeruginosa [113,
122, 123] y los β-lactámicos, el cloranfenicol, las fluoroquinolonas y tetraciclinas en S.
enterica [101], entre otros.
La degradación enzimática del TRC ha sido demostrada en dos bacterias del

suelo, Pseudomonas putida y Alcaligenes xylosoxidans que tienen niveles de
resistencia al TRC altos y pueden utilizarlo como fuente de carbono [124]. La
degradación del TRC ha sido también reportada en Sphingomonas sp donde la
pérdida de la habilidad para mineralizar este compuesto provoca susceptibilidad al
TRC y en la bacteria nitrificante Nitrosomonas europaea en la que una monooxigenasa
cataliza la degradación de este compuesto [124]. También, se ha descrito la O-
glicosilación y O-xilosilación del TRC en dos hongos, Trametes versicolor y
Pycnoporus cinnabarinus [125].
El efecto del TRC en micobacterias ha sido ampliamente estudiado y se ha

observado que es un inhibidor sub-micromolar de InhA, representando una inhibición
10000 veces menos eficiente comparada con su equivalente FabI de E. coli, esto
posiblemente debido a que InhA tiene una hendidura de unión más profunda que FabI
[110, 126, 127], lo que se refleja en la mayor resistencia de M. tuberculosis al TRC
comparada con E.coli. El hecho de que InhA también sea la diana de la isoniacida y la
etionamida, la convierte en un excelente objetivo para el desarrollo de nuevos
fármacos anti-tuberculosos. La isoniacida y la etionamida son pre-fármacos cuya
actividad depende de la activación en M. tuberculosis por parte de la enzima KatG
(catalasa-peroxidasa) y EthA (flavin monooxigenasa) respectivamente. Como pre-
fármacos la isoniacida y la etionamida son altamente específicos y efectivos, sin
46
Introducción
embargo mutaciones en sus enzimas activadoras se han relacionado con resistencia

clínica. El TRC que no requiere activación ya que inhibe InhA directamente en cepas
resistentes, representa un candidato prometedor en el diseño de nuevos fármacos y
de hecho se han obtenido derivados con una potencia optimizada de hasta 50 veces
su capacidad inhibitoria frente a InhA y 10 veces su actividad bactericida. Además
estos derivados mostraron eficacia frente a cepas de laboratorio resistentes a
isoniacida y asilados clínicos de M. tuberculosis [128-130]. También se han obtenido
derivados que han sido ensayados en E. coli, S. aureus, Enterobacter cloacae [131]
así como en parásitos como Toxoplasma gondii [132].
1.8.3. Mecanismos de resistencia en M. tuberculosis
Los primeros casos de resistencia en M. tuberculosis se identificaron en la

década de los cuarenta cuando la estreptomicina empezó a usarse en el tratamiento
de la tuberculosis. A medida que la era de la quimioterapia contra la tuberculosis
avanzaba los casos de resistencia continuaron ocurriendo, principalmente como
consecuencia de una terapia inadecuada o la no adherencia a ella. Los investigadores
inicialmente pensaron que las cepas monorresistentes podían tener un fitness
reducido y por tanto ser menos virulentas, sin embargo esta hipótesis fue refutada en
los noventa, época en la que aumentó el número de casos con cepas MDR y la
coinfección con el VIH [133, 134]. Posteriormente en el año 2000 el Stop TB
Partnership’s Green Light Committee creado para proporcionar el acceso a
medicamentos con precios preferenciales, encontró varios casos de resistencia que
eran consistentes con el fenotipo XDR y para determinar su tasa el Centro para el
control y prevención de enfermedades (CDC) de los Estados Unidos y la OMS
realizaron un seguimiento durante los años 2000 a 2004 en el que encontraron que el
20% de los aislados eran MDR y el 2% XDR. El término tuberculosis XDR fue
introducido en el año 2005 en la conferencia mundial sobre la salud del pulmón en
París y en el año 2006 el CDC publicó su definición que fue revisada el mismo año por
la OMS [133, 134].
Pese a los esfuerzos dirigidos al control y la prevención de la resistencia, los

niveles de casos MDR continúan siendo altos en algunas regiones en las que los
sistemas de salud pública no detectan ni tratan la tuberculosis de manera adecuada.
Actualmente, se estima que el 5% de los casos de tuberculosis reportados
corresponden a cepas MDR [76, 135, 136]. En el año 2011 la OMS estimó 310.000
casos de cepas MDR en pacientes con tuberculosis pulmonar. Una de las regiones
más afectadas corresponde a países de Europa oriental y Asia central donde del 9 al
47
Introducción
32% de los casos nuevos de tuberculosis son MDR y más del 50% de casos
previamente tratados tienen este fenotipo. Por su parte el fenotipo XDR se ha
detectado en 84 países con una proporción de casos XDR del 9% y se estima que
cerca de 40.000 casos de este fenotipo pueden producirse cada año [9].
La resistencia en M. tuberculosis es el resultado de múltiples mecanismos que

operan simultáneamente, entre ellos están la resistencia intrínseca dada por la
impermeabilidad de la envuelta celular y el eflujo de antibióticos mediado por bombas.
La resistencia adquirida no ocurre por transferencia horizontal como en otras
bacterias, si no que está dada por la acumulación de mutaciones en genes diana y
reguladores o promotores así como la modificación y degradación de antibióticos por
enzimas [137, 138].
1.8.3.1. Resistencia intrínseca
M. tuberculosis es intrínsecamente resistente a una variedad de

antimicrobianos en gran parte debido a la estructura y composición de su envuelta
celular altamente rica en lípidos [39]. La reducida permeabilidad de la envuelta permite
que haya una disminución del influjo de antimicrobianos y por tanto una reducción en
la acumulación intracelular de éstos [96, 139]. Sin embargo antimicrobianos como las
fluoroquinolonas y las rifamicinas pueden pasar más fácilmente a través de la pared
celular a diferencia de otros fármacos que tienen un paso limitado. Evidencia genética
y bioquímica ha demostrado el papel de la envuelta como barrera y su implicación en
la resistencia [39, 96, 139].
Otro factor importante en la resistencia intrínseca es que aparentemente M.

tuberculosis no posee muchas porinas, esto ha sido evidenciado en ensayos en los
que la expresión de la porina MspA de M. smegmatis en M. bovis BCG y en M.
tuberculosis produce una mayor susceptibilidad a antibióticos β-lactámicos, isoniacida,
etambutol y estreptomicina [32].
La envuelta celular por sí sola no explica la amplia resistencia intrínseca de las

micobacterias a los antimicrobianos, si no que cuenta con otros mecanismos como son
los sistemas de eflujo y las enzimas de modificación de antibióticos o de sus dianas.
1.8.3.1.1 Sistemas de eflujo
El genoma de M. tuberculosis contiene un alto número de bombas de eflujo

pertenecientes a las principales familias de transportadores, muchas de las cuales
están por caracterizar [16]. Los sistemas hasta ahora caracterizados han mostrado
48
Introducción
que M. tuberculosis tiene bombas sustrato-específicas y otras que expulsan

compuestos no relacionados a nivel estructural y funcional y por tanto son bombas de
eflujo MDR. Este fenómeno es considerado como un efecto secundario, accidental y
oportunista del transporte de sustratos fisiológicamente no definidos. Los mecanismos
de inducción y regulación de este tipo de bombas no se entienden completamente,
aunque se sabe que su expresión está muy regulada lo que asegura que los genes
que las codifican estarán disponibles cuando sea necesario para cumplir su función
fisiológica [39, 138].
Aunque los sistemas de eflujo han sido estudiados en varias especies de

micobacterias, en muchos casos se ha usado M. smegmatis como modelo para la
expresión heteróloga y caracterización de estas bombas de eflujo. La primera bomba
caracterizada en micobacterias fue LfrA de M. smegmatis que expresada en plásmidos
multicopia confiere un bajo nivel de resistencia a fluoroquinolonas, bromuro de etidio,
acridina y algunos compuestos del amonio cuaternario [140]. Posteriormente se
caracterizó TetV también en M. smegmatis, que confiere resistencia a tetraciclina [141]
y Tap (Rv1258c) presente en Mycobacterium fortuitum y M. tuberculosis, cuya
expresión en M. smegmatis resulta en una baja resistencia a aminoglucósidos y
tetraciclina [88, 142]. Las proteínas Tap y LfrA hacen parte de la familia de
transportadores MSF. En M. smegmatis el transportador PstB, responsable de la
captación de fosfato, está implicado también en la resistencia a fluoroquinolonas [84].
Estos estudios fueron los precursores de diferentes estudios del eflujo de compuestos
en M. tuberculosis [138, 140-142].
Los genes codificantes de transportadores tipo ABC ocupan aproximadamente

el 2.5% del genoma de M tuberculosis. El análisis de similitud con transportadores
conocidos y la detección de operones han permitido identificar 26 transportadores
completos y 11 incompletos, de los cuales 16 son importadores y 21 presumiblemente
exportadores [93]. La clasificación de los transportadores según análisis filogenético
de sus NBD y el análisis de homología con transportadores de sustrato conocido
predice que al menos 10 de los exportadores están implicados en la translocación de
fármacos [93].
Experimentalmente se han caracterizado 4 transportadores ABC de M.

tuberculosis asociados a la resistencia a antimicrobianos. El primero es el codificado
por los genes drrABC cuya sobreexpresión en M. smegmatis confiere resistencia a un
amplio rango de antibióticos incluyendo tetraciclina, eritromicina, etambutol,
norfloxacina, cloranfenicol, estreptomicina y antraciclinas [143]. Estudios de
49
Introducción
mutagénesis han mostrado que el papel fisiológico de estas proteínas en M.

tuberculosis sería el transporte de los lípidos PDIM a la pared celular. También se ha
mostrado que el operón de M. tuberculosis Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c confiere
resistencia a fluoroquinolonas cuando se sobreexpresa en M. smegmatis [144]. Otro
de los transportadores identificados es el Rv0194 que está implicado en la resistencia
a β-lactámicos, también cuando se sobreexpresa en M. smegmatis y M. bovis BCG
[145]. Por último, se ha demostrado que el transportador Rv1218c media el eflujo de
una amplia variedad de sustratos como novobiocina, pirazolonas, biarilpiperacinas,
bis-anilino pirimidinas, pirroles y piridonas en M. tuberculosis [146] (Tabla 1.5).
El genoma de M. tuberculosis contiene 15 genes que codifican transportadores

de tipo RND, 13 de los cuales han sido designados como MmpL (Mycobacterial
membrane proteins, Large) [84, 147]. La inactivación de 11 de estos genes no altera la
susceptibilidad a fármacos. Los genes mmpL4, mmpL7, mmpL8 y mmpL11 están
implicados en virulencia en ratón y cuando la proteína MmpL7, que forma parte del
complejo de exportación de los PDIMs, se sobreexpresa en M. smegmatis produce
una alta resistencia a la isoniacida [148-150]. Por su parte la proteína MmpL8 exporta
el precursor del sulfolípido sulfátido 2,3-diacil-α,α’- trealosa-2’ sulfato [151].
Finalmente, otros estudios han mostrado que el incremento en la transcripción de los
genes mmpS5-mmpL5 está relacionado con el eflujo de econazol en M. tuberculosis y
M. bovis [152] (Tabla 1.5).
Por otro lado, se han predicho cerca de 16 proteínas MSF en el genoma de M.

tuberculosis [88]. Entre ellas está la proteína P55 (Rv1410c), implicada en la
resistencia a aminoglucósidos y tetraciclina en M. tuberculosis y M. bovis [153]. La
proteína Tap (Rv1258c), sobreexpresada en un aislado clínico MDR de M. tuberculosis
[154]; la proteína Stp (Rv2333c) que confiere resistencia a espectinomicina y
tetraciclina [155]; la proteína Rv1634 que media la resistencia fluoroquinolonas cuando
es sobreexpresada en M. smegmatis [88], la proteína JefA (Rv2459) implicada en la
resistencia a isoniacida y etambutol en M. tuberculosis [156] y finalmente la proteína
Rv0849 implicada en el transporte de pirroles [137].
En la familia SMR se ha descrito la bomba MDR Mmr o TBsmr (Rv3065) de M.

tuberculosis que se induce en presencia de isoniacida y que media el eflujo de la
acriflavina, la eritromicina y el bromuro de etidio cuando se expresa en M. smegmatis
[157]. Sin embargo su deleción y sobreexpresión en M. tuberculosis no tiene ningún
efecto sobre la susceptibilidad a la isoniacida, aunque su deleción si mostró
susceptibilidad al bromuro de etidio, tetra-fenilfosfonio, safranina O y CTAB [158].
50
Introducción
En cuanto a la familia MATE, un estudio reciente mostró que la bomba Mmp en

M. smegmatis contribuye a la resistencia frente a fleomicina, bleomicina, capreomicina,
amikacina, kanamicina y cloruro de cetilpiridinio [159]. Esta bomba hace parte de un
operón junto con otros genes que codifican proteínas con funciones aparentemente no
relacionadas, incluyendo la EfpA cuya expresión se induce en presencia de isoniacida
y etionamida [159].
Por otro lado, M. tuberculosis tiene otras proteínas de membrana que no se

clasifican dentro de las familias de transportadores anteriormente descritas, pero que
están implicadas en resistencia. Una de estas proteínas es IniA implicada en la
resistencia a isoniacida, etambutol y bromuro de etidio cuando se sobreexpresa en M.
bovis BCG y cuya deleción en M. tuberculosis genera una alta susceptibilidad a
isoniacida [160]. Se cree que esta proteína puede ser un transportador tipo MDR
(Tabla 1.5).
Los reguladores transcripcionales juegan un papel importante en muchos de

los mecanismos de resistencia de las micobacterias ya que se inducen en presencia
de algunos antibióticos y otros compuestos. El gen whiB7 es un regulador cuya
expresión aumenta en presencia de eritromicina, tetraciclina y estreptomicina. La
deleción de este gen produce hipersensibilidad a claritromicina, eritromicina,
lincomicina, espectinomicina y estreptomicina. Su inducción se ha correlacionado con
la expresión de los genes Rv1258c (tap), Rv1473 que codifica un posible transportador
ABC de macrólidos y Rv1988 (erm) homólogo a una metil transferasa ribosomal [90].
MarA es un regulador transcripcional que inducido por el salicilato a bajas
concentraciones, produce un fenotipo MDR en E. coli y que cuando se sobreexpresa
en M. smegmatis produce un incremento en la resistencia a isoniacida, rifampicina,
etambutol, tetraciclina y cloranfenicol [161]. En M. tuberculosis también a bajas
concentraciones de salicilato inducen resistencia a rifampicina, isoniacida, etambutol y
estreptomicina, aunque se desconoce el mecanismo por el que se produce este
fenotipo [162].
Otro ejemplo lo constituye LfrR, un represor de M. smegmatis que controla la

expresión de la bomba LfrA, cuya expresión se induce en presencia de acriflavina,
bromuro de etidio o la rodamina 123. La deleción de este regulador produce un
aumento en la expresión de LfrA y por tanto un incremento en la resistencia a estos
compuestos y a las fluoroquinolonas [138].
51
Introducción
Tabla 1.5. Bombas de eflujo de M. tuberculosis asociadas a resistencia a antimicrobianos.

Modificado de [139, 163].
Tipo de Producto Fármaco
transportador Gen proteico Función expulsado Referencias
Rv2686c Proteína integral Transporte activo FQ [144]
de membrana de fármacos
Rv2687c Proteína integral Transporte activo FQ [144]
de membrana de fármacos
Rv2688c Proteína de unión Transporte activo FQ [144]
de ATP de fármacos
drrA Proteína de unión Transporte de TC, SM,ETB, [143, 150]
(Rv2936) a ATP fármacos y PDIMs ERM,
NOR,CM, ANT
ABC drrB Proteína integral Transporte de TC, SM,ETB, [143, 150]
(Rv2937) de membrana fármacos y PDIMs ERM,
NOR,CM, ANT
drrC Proteína integral Transporte de TC, SM,ETB, [143, 150]
(Rv2938) de membrana fármacos y PDIMs ERM,
NOR,CM, ANT
Rv0194 Proteína tipo ABC Transporte de β-lactámicos, [145]
fármacos CM, SM, NOV
Rv1218c Proteína tipo ABC Transporte de NOV, PIR, [146]
fármacos PIRZ
Tap Proteína de Transporte de TC, RIF, AMG [88, 142, 164]
(Rv1258c) membrana fármacos. Posible
factor de virulencia
Rv1634 Proteína de Transporte de FQ [88]
membrana fármacos
stp Proteína integral Transporte de TET, ESP [155]
(Rv2333c) de membrana fármacos
jefA Proteína integral Transporte de INH, ETB [156]

(Rv2459) de membrana fármacos
MFS
Rv0849 Proteína integral Transporte de PIR [137]
de membrana fármacos
P55 Proteína integral Transporte de TET, AMG [153, 165]
(Rv1410c) de membrana fármacos.
Necesaria para
mantener las
características de
crecimiento normal
en medio sólido y
líquido
mmpL7 Proteína Transporte de INH [148-150]
transmembranal fármacos y PDIMs.
Posible factor de
RND
virulencia
mmpL5 Proteína Transporte de ECZ [152]
transmembranal fármacos
mmr Proteína integral Transporte de ACF, ERM [157]
SMR (Rv3065) de membrana de fármacos
eflujo
Proteína de iniA Proteína IniA INH- Transporte de INH, EMB [160]
membrana inducible fármacos
AMG: Aminoglucósidos, ANT: Antraciclinas, BrEt: Bromuro de Etidio, CIP: Ciprofloxacina, CM:
Cloranfenicol, CLZ: Clofazimina, ECZ: Econazol, ESP: Espectinomicina, ERM: Eritromicina,
ETB: Etambutol, FQ: Fluoroqinolonas, INH: Isoniacida, NOR: Norfloxacina, NOV: Novobiocina,
OFX: Ofloxacina, PIR: Pirroles, PIRZ: Pirazolonas, PIZ: Pirazinamida, RIF: Rifampicina, SM:
Estreptomicina, TC: Tetraciclina, THZ: Tioridazina.
52
Introducción
1.8.3.1.2. Sistemas de modificación
La producción de enzimas que inactivan los antibióticos y otros compuestos es

uno de los mecanismos usados por las micobacterias con el fin de resistir sus efectos
tóxicos. El genoma de M. tuberculosis contiene unas 200 oxidorreductasas,
deshidrogenasas y oxidasas, incluyendo 20 citocromo P450 monooxigenasas [16]
muchas de las cuales podrían evolucionar y convertirse en mecanismos de
detoxificación, aunque actualmente el número de enzimas caracterizadas que están
implicadas en ello son pocas.
M. tuberculosis y otras micobacterias son resistentes naturales a los

antibióticos β-lactámicos gracias a la producción de β-lactamasas codificadas por el
gen blaC en M. tuberculosis y por los genes blaS y blaE en M. smegmatis [39, 166,
167]. Así mismo la cepa de M. smegmatis DSM43756 es resistente natural a la
rifampicina gracias a una ADP-ribosiltransferasa que inactiva la rifampicina por
ribosilación [168]. También se han descrito aminoglucósido N-acetiltransferasas y
fosfotransferasas en varias micobacterias incluyendo M. tuberculosis [169-171]. Se
cree que la función fisiológica de la aminoglucósido acetiltransferasa (2’)-Ic de M.
tuberculosis podría ser la acetilación de un intermediario de la vía biosintética del
micotiol, el principal agente reductor de las micobacterias, participando así en la
regulación del potencial redox celular. Así mismo, se ha caracterizado una arilamina N-
acetiltransferasa en M. smegmatis y M. tuberculosis cuya sobreproducción resulta en
resistencia a la isoniacida [172].
Los macrólidos son comúnmente utilizados en el tratamiento de infecciones

causadas por el complejo M. avium y otras micobacterias no tuberculosas. Sin
embargo estos antibióticos tienen muy poco o ningún efecto frente las bacterias del
complejo M. tuberculosis [39]. El mecanismo de acción de estos antibióticos es la
inhibición de la traducción mediante la unión específica a la subunidad 23S del rRNA.
La resistencia a los macrólidos en micobacterias está mediada por el gen erm37 que
codifica una enzima que metila la subunidad 23S inhibiendo la unión del antibiótico.
Este gen está presente en todos los miembros del complejo M. tuberculosis (excepto
M. bovis BCG). Adicionalmente, M. smegmatis y M. fortuitum, también resistentes
naturales a los macrólidos, codifican metiltransferasas (Erm38 y Erm39,
respectivamente) cuya expresión es inducida por macrólidos [39].
Otro sistema de detoxificación es el mediado por el agente reductor micotiol

que interacciona con varios antibióticos como la eritromicina, vancomicina o la
rifampicina contribuyendo así a la resistencia intrínseca en micobacterias. La
53
Introducción
modulación en la síntesis del micotiol puede afectar indirectamente la resistencia a

antibióticos. Así, la transcripción de mshB (Rv1170), una acetilasa que cataliza la
biosíntesis de micotioles se induce en presencia de isoniacida [173].
Las enzimas que participan en la inactivación de antibióticos comparten

muchas similitudes con enzimas bien caracterizadas del metabolismo primario e
intermediario, de las que probablemente derivan y que constituyen una fuente
potencial de nuevos mecanismos de resistencia [174]. Un ejemplo sería la asparagina
sintasa AsnB implicada en la biosíntesis del aspartato y que se ha relacionado con la
resistencia a múltiples fármacos en M. smegmatis. La inactivación de este gen confiere
hípersensibilidad a rifampicina, eritromicina, novobiocina y ácido fusídico [174].
1.8.3.2. Resistencia adquirida
A diferencia de otros microorganismos, la resistencia adquirida de M.

tuberculosis no viene dada por elementos genéticos transmisibles como los plásmidos
y transposones, si no que está relacionada con la acumulación de mutaciones que
inducen variaciones a nivel fenotípico, las cuales dirigen la evolución del bacilo con el
fin de adaptarse a las presiones ambientales [39, 87].
M. tuberculosis tiene una baja tasa de mutación (10-6 a 10-8), sin embargo las
mutaciones pueden ser seleccionadas, por ejemplo tras un tratamiento mal
administrado con el antibiótico para el cual dichas mutaciones confieren resistencia, de
manera que los mutantes resistentes gradualmente superarán en número a las cepas
susceptibles y emergerán como cepas dominantes que podrán ser transmitidas a la
comunidad [133, 135, 139].
La resistencia por mutaciones se puede clasificar en:
-Resistencia natural: es el resultado de una mutación natural independientemente de

la exposición previa al antibiótico.
-Resistencia primaria: son los casos de resistencia en pacientes que no han estado
expuestos a antibióticos.
-Resistencia adquirida: son los casos de resistencia en los que los pacientes
estuvieron bajo un régimen de tratamiento, generalmente inadecuado [136].
Las bases moleculares de este tipo de resistencia, incluyen una variedad de

mutaciones como inserciones, deleciones y mutaciones puntuales en diversos genes.
Por ejemplo, mutaciones en el gen katG que codifica la enzima catalasa-peroxidasa
54
Introducción
que activa a la isoniacida. Esta mutación es la responsable de cerca del 60% de los
casos de resistencia a isoniacida; sin embargo, se han identificado otras mutaciones
en otros genes que están igualmente relacionadas con resistencia a este fármaco,
como por ejemplo mutaciones en el gen inhA que codifica una enoil reductasa y
mutaciones en el gen kasA que codifica una cetoacil sintasa, ambas implicadas en la
síntesis de los ácidos micólicos [136, 175, 176]. Otros ejemplos incluyen mutaciones
en el promotor del gen ahpC que codifica una alquil hidroperoxidasa, así como las
mutaciones en el gen ndh que codifica una NADH deshidrogenasa que produce un
incremento en el ratio NADH/NAD inhibiendo competitivamente la unión isoniacida-
InhA y las mutaciones en los genes ceoA (UDP galactopiranosa reductasa), mabA (3-
cetoacil reductasa), oxyR, acpM y en el gen furA. Por otro lado, las mutaciones en el
gen rpoB están relacionadas con resistencia a rifampicina. Este gen codifica la
subunidad β de la RNA polimerasa que es la diana de esté antibiótico. El 90-98% de
las cepas resistentes a rifampicina presentan mutaciones en este gen [136, 175, 176]
(Tabla 1.6).
La resistencia a pirazinamida se ha atribuido a mutaciones en el gen pncA que

codifica la enzima pirazinaminidasa, que se encarga de activar el antibiótico
convirtiéndolo en ácido pirazinoico. Cerca del 70% de los aislados clínicos resistentes
a este antibiótico presentan mutaciones en este gen. Además este gen puede
inactivarse por la inserción de la secuencia IS6110, que es específica y repetida de
forma variable entre las cepas del bacilo. Las mutaciones relacionadas con resistencia
a fluoroquinolonas se dan principalmente en los genes gyrA y gyrB que codifican la
DNA girasa y la DNA topoisomerasa II respectivamente, siendo estas las dianas de
este grupo de antibióticos. En cuanto a los aminoglucósidos, se ha observado que
mutaciones en los genes rrs y rpsL que codifican la subunidad 16s del rRNA y la
proteína S12 respectivamente, confieren resistencia a la estreptomicina en
aproximadamente el 65 al 67% de aislados clínicos resistentes. Adicionalmente, se ha
encontrado que mutaciones en el gen gidB (que codifica una rRNA metiltransferasa)
también contribuyen a la resistencia a la estreptomicina pero a un nivel más bajo,
representando cerca del 33% de los casos [139, 177]. Al igual que en el caso de la
estreptomicina, las mutaciones en el gen rrs están implicadas en la resistencia a
kanamicina, amikacina, viomicina y capreomicina. La resistencia a capreomicina
también puede ser debida a mutaciones en el gen tlyA, una metiltransferasa que
también está relacionada con la resistencia al ácido p- aminosalicílico [178-181] (Tabla
1.6).
55
Introducción
Tabla 1.6. Genes asociados con resistencia adquirida por mutación en M. tuberculosis.
Modificado de [139].
Frecuencia de mutación (%)
Fármaco Gen Producto génico asociada con resistencia
katG Catalasa- peroxidasa 30-60
inhA Enoil reductasa A 70-80
Isoniacida ahpC Alquil hidroperoxidasa Desconocida

reductasa
kasA β-cetoacil ACP sintasa Desconocida
ndh NADH deshidrogenasa 9.5
rpoB Subunidad β de la RNA 95
Rifampicina polimerasa
rpsL Proteína ribosomal S12 65-67
rrs rRNA 16S
Estreptomicina
gidB 7- metilguanosina 33
metiltransferasa
Etambutol embCAB Arabinosil transferasa 70-90
pncA Pirazinamidasa >70
Pirazinamida
gyrA DNA girasa 42-85
Fluoroquinolonas
gyrB
Kanamicina y rrs rRNA 16S >60
Amikacina
Capreomicina y rrs rRNA 16S 40-100
Viomicina tlyA rRNA metil transferasa 80%
inhA Enoil reductasa A >60%
Etionamida ethA Flavin mono oxigenasa >60%
ethR Represor transcripcional Desconocida
Ácido p-amino tlyA rRNA metil transferasa Desconocida
salicílico
Las mutaciones en el operón embCAB están relacionadas con la resistencia al

etambutol. Estos genes codifican arabinosiltransferasas implicadas en la biosíntesis
del arabinogalactano de la pared celular. Aproximadamente el 65% de los aislados
clínicos resistentes a etambutol presentan mutaciones en estos genes [182]. Al igual
que la isoniacida, la etionamida es un pro-fármaco, que en este caso es activado por la
monoxigenasa EthA cuya mutación está relacionada con la resistencia a este fármaco.
Adicionalmente, esta resistencia también se ha asociado con mutaciones en el gen
inhA [183] (Tabla 1.6).
También se han descrito resistencias por mutaciones a los fármacos de nueva

generación como PA-824 y OPC-67683, unos pro-fármacos cuya resistencia está
relacionada con mutaciones en el gen Rv3547 implicado en el proceso de activación
56
Introducción
de estos compuestos. También se han aislado cepas resistentes al fármaco TMC207,

que presentaban mutaciones en su gen diana atpE, que codifica para una ATP sintasa
[184] (Tabla 1.6).
1.8.3.3. Inducción de sistemas de detoxificación en M. tuberculosis
Los microorganismos pueden alterar su transcriptoma y su proteoma

rápidamente en respuesta a cambios del ambiente con el fin de adaptarse. Algunas de
estas alteraciones afectan a sistemas de detoxificación lo que les permite resistir
condiciones adversas. En M. tuberculosis muchos sistemas de detoxificación se
inducen en presencia de diferentes compuestos, incluidos fármacos utilizados en el
tratamiento. Por ello se han impulsado varios estudios a nivel transcriptómico y
proteómico que pretenden definir el mecanismo de acción y de resistencia a fármacos
conocidos así como identificar nuevas dianas terapéuticas con el fin de validar y
optimizar nuevos compuestos más eficaces.
Uno de los primeros estudios a nivel transcriptómico fue realizado por Wilson y
colaboradores, quienes mostraron con microarreglos de DNA que la isoniacida y la
etionamida inducen la expresión de efpA, una bomba putativa de la familia MSF [185].
Igualmente en otro estudio con microarreglos se mostró la inducción de 10 bombas de
eflujo (Mmr, DrrC, Rv1819c, Rv2209, Rv2459, Rv2477c, Rv2688, Rv2846, Rv2994 y
Rv3728) tras la exposición a rifampicina, isoniacida, etambutol, estreptomicina y
ofloxacina [186] dos de ellas (Mmr, DrrC) ya caracterizadas experimentalmente como
bombas de eflujo; además el gen iniA es fuertemente inducido por el tratamiento con
isoniacida y etambutol [160]. La expresión del gen pstB también es inducida en
presencia de isoniacida [187], por su parte el gen Rv1258c (tap) es inducido tras el
tratamiento con rifampicina e isoniacida [154] y se obtuvieron resultados similares en
un aislado clínico MDR en el que la expresión de Rv1258c y Rv1410c estaba
incrementada en presencia de los mismos antibióticos [188].
1.8.3.3.1. Posibles sistemas de detoxificación de M. tuberculosis Rv1685c-

Rv1686c-Rv1687c y Rv3160c-Rv3161c
En un estudio realizado por Betts y colaboradores se evaluó la respuesta a

nivel transcripcional de M. tuberculosis a tres compuestos que inhiben la síntesis de
los ácidos micólicos: la isoniacida, la tiolactomicina y el TRC [189]. Se identificaron
alrededor de 100 genes cuya expresión variaba en respuesta a cada uno de los
tratamientos ensayados y un número mucho mayor cuando se usó el TRC a una
concentración más alta (5 veces la CMI). Entre los genes inducidos por el TRC el
57
Introducción
operón Rv1685c-Rv1686c-Rv1687c y el operón Rv3160c-Rv3161c mostraron una

fuerte inducción [189]. Los genes Rv1686c-Rv1687c codifican un posible transportador
ABC que podría estar implicado en la translocación de fármacos mientras que el gen
Rv1685c codifica una proteína hipotética conservada que contiene un dominio TetR,
por lo que podría intervenir en la regulación del transportador en respuesta a
antibióticos. Por su parte el gen Rv3161c codifica una posible dioxigenasa, una enzima
capaz de hidrolizar compuestos aromáticos por hidroxilación, mientras que el gen
Rv3160c codifica un posible regulador transcripcional de la familia TetR por lo que
igualmente podría intervenir en la regulación de la dioxigenasa. Por lo tanto, los
autores sugirieron que la baja eficacia del TRC frente a M. tuberculosis podría estar
relacionada con el transportador ABC Rv1686c-Rv1687c y la dioxigenasa Rv3161c
que actuarían como mecanismos de detoxificación limitando el efecto del TRC.
Posteriormente, otro estudio evaluó la respuesta transcripcional de M.

tuberculosis frente a 6 fármacos incluyendo tres de desarrollo reciente: isoniacida,
isoxil (anteriormente usada en el tratamiento, inhibe la síntesis de los ácidos
micólicos), tetrahidrolipstatina (inhibidor de lipasa también usado en el tratamiento de
la obesidad), SRI#221, SRI#967 y SRI#9190 [190]. Este estudio mostró que todos los
fármacos inducían una respuesta común de genes relacionados con el estrés también
como una respuesta específica para cada fármaco ensayado. Los genes Rv3160c-
Rv3161c se indujeron fuertemente en respuesta a dos de los nuevos compuestos,
SRI#967 y SRI#9190. Puesto que tanto estos compuestos como el TRC son bencenos
halogenados, los autores sugirieron que la dioxigenasa Rv3161c se induciría en
respuesta a este tipo de compuestos contribuyendo a la resistencia natural de M.
tuberculosis a este tipo de agentes antimicrobianos [190].
Boshoff y colaboradores analizaron la respuesta de M. tuberculosis frente a 75

fármacos y condiciones inhibidoras del crecimiento, con el fin de establecer los
mecanismos de adaptación del bacilo a la interrupción de diferentes funciones
metabólicas identificando grupos de genes co-rregulados. Los resultados obtenidos
mostraron la inducción de los operones Rv1685c-Rv1686c-Rv1687c y Rv3160c-
Rv3161c en respuesta a los protonóforos carbonilcianuro-m-clorofenilhidrazona
(CCCP) y 2.4 Dinitrofenol (DNP) también como un compuesto antituberculoso llamado
ARP4. Así mismo, la dioxigenasa fue clasificada dentro de un grupo que incluye
posibles mecanismos de detoxificación inducidos en respuesta a diferentes
compuestos aromáticos incluyendo el TRC y la clofazimina [191]. La inducción de
estos sistemas por parte del TRC fue obtenida en otro trabajo realizado por Sullivan y
colaboradores en donde también evaluaron el efecto de nuevos fármacos derivados
58
Introducción
del TRC, de los cuales dos de ellos (6PP y 8PP) mostraron una alta inhibición de InhA
pero no indujeron la expresión ni del transportador y ni de la dioxigenasa validándolos
como dos nuevos compuestos líderes en el desarrollo de nuevos fármacos [129]. Otro
compuesto aromático que induce también la expresión del operón Rv3160c- Rv3161c
es la tioridazina, una fenotiazina que está siendo evaluada en el tratamiento de la
tuberculosis MDR y XDR [192].
En conjunto, estas observaciones apuntan a que los genes Rv1686c-Rv1687c

y Rv3161c podrían ser sistemas de detoxificación de M. tuberculosis que contribuirían
a la resistencia al TRC y otros fármacos. Así mismo, la localización de estos genes
junto a reguladores transcripcionales y el hecho de que en todos los trabajos
anteriormente citados se induzcan conjuntamente, apoya también la hipótesis de que
estos reguladores responden a la presencia de ciertos compuestos tóxicos regulando
la expresión del operón.
También, otros estudios han mostrado que el transportador ABC se induce en

respuesta al H2O2 y a la privación de nutrientes, condiciones que simulan la situación
que encuentra la bacteria en el fagosoma. Así mismo, este transportador se induce
cuando M. tuberculosis infecta macrófagos activados con IFN-γ pero no en macrófagos
no activados o provenientes de ratones deficientes de la óxido nítrico sintetasa,
sugiriendo que el transportador ABC podría tener un papel en la virulencia de la
bacteria [193, 194].
El transportador ABC codificado por los genes Rv1686c-Rv1687c, está incluido

en los posibles transportadores de fármacos identificados por Braibant y colaboradores
de acuerdo con la filogenia de sus NBD y el análisis de homología con transportadores
de sustrato conocido [93]. Como se mencionó anteriormente, el gen Rv1685c codifica
una proteína que podría intervenir en la regulación del posible transportador ABC.
Además, este gen es similar a otros reguladores hipotéticos de M. tuberculosis
(Rv1556, Rv0258c) y a un regulador transcripcional putativo de Streptomyces
coelicolor. Por su parte el gen Rv1686c codifica una probable proteína integral de
membrana tipo ABC que sería la responsable de la translocación del sustrato a través
de la membrana y que contiene 6 hélices transmembranales y el bucle EAA
conservado. Rv1686c es similar a una posible proteína integral de membrana de
Streptomyces coelicolor y una proteína de membrana implicada en la resistencia a
mitramicina en Streptomyces argillaceus. Finalmente, el gen Rv1687c codificaría el
NBD del transportador y contiene todos los patrones conservados de estos dominios.
Además es similar a la proteína NodI de Rhizobuim sp que está implicada en el
59
Introducción
exporte de oligosacáridos, esenciales en la nodulación y a otros transportadores de

tipo ABC de M. tuberculosis como DrrA (Rv2936) [15].
Por su parte el gen Rv3161c codifica una posible dioxigenasa que sería capaz
de hidrolizar compuestos aromáticos por hidroxilación y es similar a subunidades de
varias dioxigenasas y proteínas relacionadas de Rhizobium loti, Caulobacter
crescentus, P. aeruginosa, Arthrobacter keyseri y E.coli [15]. Esta proteína ha sido
detectada en la fracción de membrana de H37Rv por espectrometría de masas a partir
de geles monodimensionales [195] también como en los extractos obtenidos con tritón
X-114 en H37Rv [196]. En cuanto a Rv3160c, como se mencionó anteriormente
codifica un posible regulador de la familia TetR que podría co-transcribirse con
Rv3161c ya que la distancia intergénica es de tan sólo 11 pb. Adicionalmente, muestra
similitud con otros reguladores de S. coelicolor y R. loti [15] y ha sido detectada entre
las proteínas secretadas de M. tuberculosis K pero no en H37Rv ni CDC1551 [197].
60
Objetivos
Objetivos
2. Objetivos
El marco conceptual y experimental de este trabajo se basa en el estudio de los

mecanismos de resistencia de Mycobacterium tuberculosis a antibióticos y otros
compuestos; en concreto el objetivo planteado fue evaluar el papel en la resistencia de
dos posibles sistemas de detoxificación: el transportador ABC Rv1686c- Rv1687c y la
dioxigenasa Rv3161c, los cuales se inducen en presencia del triclosán y otros
compuestos.
Los objetivos específicos de este trabajo fueron:
• Obtención de mutantes de M. tuberculosis deficientes en los genes Rv1686c-

Rv1687c y Rv3161c.
• Sobreproducción de las proteínas codificadas por Rv1686c-Rv1687c y

Rv3161c en M. tuberculosis.
• Caracterización fenotípica de las cepas que sobreproducen las proteínas y las

cepas mutantes.
• Análisis de la virulencia en macrófagos de las cepas de M. tuberculosis

mutantes y que sobreproducen las proteínas codificadas por Rv1686c-Rv1687c
y Rv3161c.
• Evaluación del efecto del triclosán en el proteoma de M. tuberculosis.
61
Materiales y Métodos
3. Materiales y métodos
3.1. Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos
Las cepas y plásmidos utilizados se muestran en las tablas 3.1 y 3.2

respectivamente. Los oligonucleótidos se listan en la tabla 3.3.
Tabla 3.1. Principales cepas utilizadas en este trabajo.

Nombre Genotipo/Característica Fuente/Referencia
E. coli
recA1 endA1 hsdR17 gyrA96 supE44 thi-1 relA1
DH5α Δ(lacZYA-argF)U169 deoR Φ80lacZΔM15 Clontech
F-supE44 Δ(mcrC-mrr) recA13 ara-14 proA2
R
HB101 leuB6 lacY1 galk2 rpsl20(Str ) xyl-5 mtl-1 thi-1 Stock laboratorio
M. smegmatis
2
mc 155 [198]
M. tuberculosis
H37Rv Δpks15/1 ATCC 27294
(pMV261) H37Rv (pMV261) Este trabajo
(8687) H37Rv (pMV261+8687) Este trabajo
(3161) H37Rv (pMV261+3161) Este trabajo
Δ8687 H37RvΔRv1686c-Rv1687c::HygR Este trabajo
Δ3161 H37RvΔRv3161c::HygR Este trabajo
Tabla 3.2. Principales plásmidos utilizados en este trabajo.

Nombre Característica Fuente/Referencia
pGEM®-T easy Vector de clonación A/T Promega
Vector de expresión replicativo para Mycobacterium
R
pMV261 Km , OriE, OriM, Phsp60 [199]
Vector de clonación para la obtención de mutantes

en Mycobacterium
R
pYUB854 Hyg , OriE, λ-cos, MCS::γδres-hyg-γδres::MCS [200]
Vector con resolvasa para eliminar cassette de
higromicina de mutantes construidos con pYUB854
R
pYUB870 Km , Ori-E, OriM, γδ-tnpR, sacB, Phsp60 [200]
Fásmido para Mycobacterium sensible a
R
phAE159 temperatura, derivado de TM4, Km , PacI [201]
pMV261+8687 pMV261 que contiene los ORF Rv1686c-Rv1687c Este trabajo
pMV261+3161 pMV261 que contiene el ORF Rv3161c Este trabajo
63
Nombre Característica Fuente/Referencia

pYUB854 con un fragmento de 815 pb que
incluyen el ORF de Rv1685c y las últimas 73 pb
pYUB854Mut1 del gen Rv1686c Este trabajo
pYUB854Mut1 con un fragmento de 746 pb que

incluye el ORF de mpg y las primeras 38 pb del
pYUB854Δ8687 gen Rv1687c Este trabajo
pYUB854 con un fragmento de 767 pb que

incluye el ORF de Rv3162c y las primeras 59 pb
pYUB854Mut61-2 del gen Rv3161c Este trabajo
pYUB854Mut61-2 con un fragmento de 788 pb
que incluye el ORF Rv3160c y las últimas 99 pb
pYUB854Δ3161 del gen Rv3161c Este trabajo
phAE159Δ8687 phAE159 con pYUB854Δ8687 Este trabajo
phAE159Δ3161 phAE159 con pYUB854Δ3161 Este trabajo
OriE: replicón de E. coli. OriM: replicón de Mycobacterium.
Tabla 3.3. Principales oligonucleótidos utilizados en este trabajo.

Nombre Secuencia* 5'-3' Aplicación
86Up TGGCCATGATCTTGCTGGTACCC Oligo. directo utilizado en la

amplificación de Rv1686c
86Lw CAAAGCCAAGGAACCAGAAC Oligo. reverso utilizado en la
Oligo. directo utilizado en la
86MidUp TCTGGTTCCTTGGCTTTGAC comprobación de clonaciones de
Rv1686c
87Lw GAATTCTGCAGCGTTAGCC
clonación de Rv1687c
8687Up TGGCCATGATGATTTCATCAAGTG Oligo. directo utilizado en la
clonación de Rv1686c -Rv1687c
8687Lw GAATTCTATGACGTCCGTCGCCG Oligo. reverso utilizado en la
clonación de Rv1686c -Rv1687c
MutUp1Bgl AGATCTGCGACATCCAGGTGCTCTAT construcción del Δ8687 (extremo
5’)
Oligo. reverso utilizado en la
MutLw1Hin AAGCTTCGTCGTCGTGCTGAGTTTC construcción del mutante 8687
(extremo 5’)
MutUp2Xba TCTAGACCGTCGCGAAGTAATTCAT construcción del Δ8687 (extremo
3’)
MutLw2Stu AGGCCTGGAGCTCATCGAGGATCATGC construcción del Δ8687 (extremo
3’)
3160Up GAACGGGGTCACCTTAGCTC Oligo. directo utilizado en la
3160Lw GAAAATTCTGGTTCCCGTCA Oligo. reverso utilizado en la

64
Nombre Secuencia* 5'-3' Aplicación
3161UpBam GGATCCGATGTTATCAACTGATAAC Oligo directo utilizado en la

3161LwHin AAGCTTCTAGCTGGCACCTGGGTG Oligo. reverso utilizado en la
Mut61Up1Bgl AGATCTGAACGGGGTCACCTTAGCTC construcción del Δ3161 (extremo
5’)
Mut61Lw1Hin AAGCTTGAAAATTCTGGTTCCCGTCA construcción del Δ3161
(extremo 5’)
Mut61Up2Stu AGGCCTGTTGCTGTCGACGTTCTTGA construcción del Δ3161 (extremo
3’)
Mut61Lw2Xba TCTAGATAATCCCCGATGTCGGTAAG construcción del Δ3161
(extremo 3’)
Oligo. directo utlilizado en la
pMV261Rev AAAGGCCCAGTCTTTCG comprobación de las clonaciones
en pMV261
Phsp60 GGCATAGGCGAGTGCTAAGA comprobación de las clonaciones
en pMV261
Oligo. utilizado en la
HygOut1 GCATGCAAGCTCAGGATGTC comprobacion de las clonaciones
pYUB854 y pYUB870
Oligo. utilizado en la
HygOut2 TTCGAGGTGTTCGAGGAGAC comprobacion de las clonaciones
pYUB854 y pYUB870
SigADir TTCGCGCCTACCTCAAACAG comprobación de las
extracciones RNA
SigARev GCTAGCTCGACCTCTTCCTCG comprobación de las
extracciones RNA
*Las dianas de restricción se muestran subrayadas.
3.2. Métodos microbiológicos
3.2.1. Medios de cultivo, antibióticos y otras soluciones
3.2.1.1. Medios de Cultivo
Medio LB (Luria Bertani) [202]
Triptona 10 g
Extracto de levadura 5g
NaCl 10 g
Agar (Sólo medios sólidos) 17 g
Añadir 1 L de agua destilada y esterilizar en el autoclave durante 15 min a 121ºC.

Dispensar en placas de petri, esperar a que se solidifique y guardar a 4ºC. En el caso
65
de medio LB líquido (sin agar), disolver completamente el medio y dispensarlo antes

de esterilizarlo; guardar a temperatura ambiente.
Medio TB (Terrific Broth)[203]
Triptona 12 g
Extracto de levadura 24 g
Glicerol 4 mL
Añadir 900 mL de agua destilada y esterilizar en el autoclave (15 min a 121ºC). Dejar
enfriar hasta 50ºC-60ºC y añadir 100 mL de la siguiente solución salina previamente
autoclavada:
KH2PO4 0.17 M
K2HPO4 0.72 M
Dispensar en botellas (de 100 mL) en condiciones de esterilidad. Incubar 24 h a 37ºC

para comprobar que no se ha contaminado el medio. Desechar aquellas botellas en
las que se observe crecimiento y guardar el resto a temperatura ambiente.
Medio Middlebrook 7H9+Tween
Middlebrook 7H9 broth (Difco) 4.7 g

Tween 80 0.5 mL
Medio Middlebrook 7H9+Glicerol
Middlebrook 7H9 broth (Difco) 4.7 g

Glicerol 2 mL
Añadir 900 mL de agua destilada y disolver con agitación y temperatura. Esterilizar en

el autoclave a 121ºC durante 10 min. Dejar enfriar hasta 50ºC-60ºC y añadir 100 mL
de suplemento ADC estéril. Para cultivos de menor volumen, preparar alícuotas de 90
mL de medio en botellas de 100 mL y autoclavar por separado, para evitar
contaminaciones.
Suplemento ADC (Albumina-Dextrosa-Catalasa):
BSA (Albúmina sérica bovina) fracción V 5g

Glucosa 2g
Catalasa 3 mg
66
Disolver completamente en 70 mL de agua destilada. Ajustar el volumen a 100 mL con

agua destilada y esterilizar mediante filtración con filtros de 0.22 µm de diámetro de
poro. Para cultivos de menor volumen recoger el filtrado en alícuotas de 10 mL.
Incubar 24 h a 37ºC para descartar contaminaciones. Guardar a 4ºC.
Medio Middlebrook 7H10
Middlebrook 7H10 agar (Difco) 19 g

Glicerol 5 mL
Añadir 895 mL de agua destilada y disolver con agitación y temperatura. Esterilizar en

el autoclave a 121ºC durante 10 min. Dejar enfriar hasta 50ºC-60ºC y añadir 100 mL
del suplemento OADC estéril. Dispensar en placas de Petri y guardar a 4ºC.
Suplemento OADC (Oleico-Albumina-Dextrosa-Catalasa):
BSA fracción V 5g
Glucosa 2g
Catalasa 4 mg
Ácido oleico 0.056 mL
NaCl 0.85 g
Disolver completamente en 70 mL de agua destilada. Ajustar el volumen a 100 mL con

agua destilada y esterilizar mediante filtración con filtros de 0.22 µm de diámetro de
poro. Incubar 24 h a 37ºC para detectar posibles contaminaciones. Guardar a 4ºC.
3.2.1.2. Antibióticos
La tabla 3.4 muestra la concentración de los antibióticos y los disolventes

utilizados para los cultivos de E. coli, M. smegmatis y M. tuberculosis. Se prepararon
soluciones stocks 1000 veces concentradas que fueron esterilizadas con filtros de 0.22
µm y almacenadas a -20°C, excepto la higromicina que se compraba en solución
estéril (Roche). Los stocks 1000X se utilizaron en la preparación de medios de cultivos
sólidos y para preparar las soluciones de trabajo 10 veces diluidas (100X) que se
conservaron a 4°C y se utilizaron para los medios líquidos.
67
Tabla 3.4. Concentraciones de los antibióticos para los cultivos de E. coli, M. smegmatis y M.
tuberculosis.
Concentración final (µg/mL)
Concentración
Antibiótico Disolvente Stock mg/mL E. coli Mycobacterium
Ampicilina Agua 50 50
Kanamicina Agua 50 50 25
Higromicina B PBS 1X 50 100 100
3.2.1.3. Otras soluciones
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-gal)
Este producto se utilizó para suplementar placas de LB a partir de una solución

de trabajo de 40 µg/mL preparada de un stock a 40 mg/mL en N,N dimetil formamida.
3.2.2. Condiciones de crecimiento y conservación de cepas
E. coli: Los cultivos de las diferentes cepas de E. coli utilizadas en este trabajo
se hicieron en medio LB suplementados con antibióticos listados en la tabla 3.4, si era
requerido e incubados a 37°C con agitación en el caso de los medios líquidos. Así
mismo, se utilizó medio TB para extracciones de plasmídico.
Las cepas de E. coli se conservaban en placas de LB suplementadas según se

requirió y almacenadas a 4°C, resembradas mensualmente. También se congelaron a
-20°C con glicerol al 50% (glicerol a una concentración final de 20% v/v).
Mycobacterium: Los cultivos líquidos de las cepas de M. smegmatis y M.

tuberculosis se hicieron en Middlebrook 7H9+Tween suplementados según se requirió
e incubados 37°C. Los cultivos de M. smegmatis se incubaron durante tres días con
agitación; en el caso de M. tuberculosis, los cultivos se hicieron en frascos de 25 cm2
(TPP) que se incubaron durante 1-2 semanas y que se usaron como inóculo para otros
cultivos haciendo una dilución 1/100 e incubándolos durante 1 semana y 24-48h en el
caso de M. smegmatis.
Los cultivos en placa se hicieron con Middlebrook 7H10 suplementado según el

caso. Las placas de M. smegmatis se incubaron a 37°C durante 3 días y las de M.
tuberculosis durante 3-4 semanas, selladas con Parafilm® y en bolsas para evitar
desecación.
Las cepas de M. smegmatis se conservaron en placas de 7H10 suplementadas

según se requirió y almacenadas a 4°C, haciendo pases mensuales. También se
68
congelaron a -20°C con glicerol al 50% (glicerol a una concentración final de 20% v/v).
En cuanto a M. tuberculosis, las placas se conservaron a 37°C y se hicieron pases
cada 4-6 semanas. Igualmente, se congelaron a -20°C con leche descremada al 20%
(p/v).
Todos los procedimientos realizados con M. tuberculosis, se hicieron en el

laboratorio de Nivel de Seguridad Biológica 3 (NSB-3) ubicado en el Institut de
Biotecnologia i de Biomedicina (IBB) de la UAB (IBF/014.2), el cual dispone de las
todas las condiciones requeridas para garantizar la seguridad al trabajar con
microorganismos de nivel 3 como lo es M. tuberculosis, siguiendo las especificaciones
del “Manual de seguridad y procedimientos normalizados de trabajo” del laboratorio,
con el fin de garantizar seguridad del personal investigador, de la comunidad y del
ambiente. El manual del laboratorio contempla la legislación vigente en España y
Europa, así como la normativa de la OMS, el CDC y el “National Institutes of Health”
(NIH) de los EEUU.
3.3. Métodos genéticos
3.3.1. Transformación
La transformación es un procedimiento por el cual se introduce material

genético exógeno a una bacteria. Este proceso depende del estado de competencia
bacteriano, el cual se refiere a su capacidad de incorporar material genético. La
transformación se puede llevar a cabo de dos formas: química y física.
La transformación química implica la exposición del cultivo bacteriano en fase

exponencial a una solución de CaCl2 100 mM a 0°C el cual le proporciona a la bacteria
cationes divalentes que forman un complejo DNA-calcio que se adhiere a la pared
celular y que es DNasa resistente. Este complejo puede deshacerse poniendo las
células a 42°C en un baño durante 90 segundos (choque térmico) en donde se
formarán poros en la membrana por donde se introducirá el DNA. Después de poco
tiempo de crecimiento en medio rico, las células se recuperan y los genes
transformantes se expresan, de manera que se pueden aislar las colonias
transformantes en medio selectivo.
La transformación física también conocida como electroporación implica el uso

de cargas eléctricas que desestabilizan la membrana bacteriana e inducen la
formación de poros a través de los cuales las moléculas de DNA pueden pasar. El
cierre de los poros formados parece ser un proceso estocástico que puede ser
69
retardado manteniendo las células a baja temperatura. Este método es más fácil,
eficiente y reproducible. Para la electroporación se utilizó un electroporador
GenePulser XCell de BioRad y cubetas 0.2 cm.
3.3.1.1. Transformación de E. coli
Preparación de células competentes
Procedimiento:
Día 1
• Preparar un cultivo de la cepa de E. coli DH5α en medio LB e incubar 16 horas

a 37°C con agitación.
Día 2
• A partir del cultivo de noche hacer una resiembra 1/100 en 100 mL de medio
LB e incubar a 37°C hasta alcanzar una OD550 de 0.5-0.6.
• Poner el cultivo 10 min en hielo.
• Centrifugar el cultivo 10 min a 3000 g a 4°C en tubos estériles.
• Eliminar el sobrenadante y resuspenderlo en CaCl2 0.1 M frio (20 mL por cada
100 mL de cultivo) en condiciones de esterilidad.
• Poner el cultivo en hielo durante 30 min.
• Centrifugar durante 10 min a 3000 g a 4°C.
• Desechar el sobrenadante y resuspender en CaCl2 (4 mL por cada 100 mL de
cultivo) con mucho cuidado, ya que en este punto las células son
extremadamente frágiles.
• Mezclar con glicerol a una concentración final de 15% (1.5 mL de glicerol 50%
por cada 100 mL de cultivo).
• Alicuotar en tubos eppendorf (100, 200 y 500 µL por tubo) y congelar con hielo
seco, guardar a -80C.
Transformación
Procedimiento:
• Mezclar 100µL de células competentes y 10-100 ng de DNA plasmídico e

incubar durante 30 min en hielo.
• Poner la mezcla a 42°C durante un minuto y medio.
• Añadir 800µL de medio LB.
70
• Incubar la mezcla a 37°C durante una hora.

• Sembrar en placas y suplementos requeridos durante 12-18 h a 37°C.
Soluciones
CaCl2 100 mM
CaCl2 1.47 g
Disolver en 80 mL de agua destilada y ajustar el volumen a 100 mL; esterilizar en

autoclave a 121°C durante 15 min. Almacenar a temperatura ambiente.
3.3.1.2. Electroporación de Mycobacterium
Preparación de células electrocompetentes de M. smegmatis
La preparación de células electrocompetentes se realizó en condiciones de

esterilidad y en hielo.
Procedimiento:
• Inocular una colonia de M. smegmatis en 10 mL de medio Middlebrook

7H9+Tween e incubar durante 2 o 3 días a 37°C en agitación.
• Hacer una resiembra 1/100 en 100 mL de medio Middlebrook 7H9 e incubar a
37°C en agitación hasta una OD600 de 0.8-1.0 (16-20h aprox).
• Poner en hielo durante 1 hora y media.
• Centrifugar en tubos estériles durante 10 min a 3000g a 4°C.
• Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 mL de glicerol al 10%
(v/v) frio.
• Centrifugar durante 10 min a 3000 g a 4°C.
(v/v) frio.
• Alicuotar en tubos eppendorf (80 µL por tubo) y congelar con hielo seco,
guardar a -80C.
Electroporación de M. smegmatis
Procedimiento:
• Descongelar las células electrocompetentes en hielo.
71
• Añadir 80µL de glicerol al 10% (v/v) y el DNA (<5 µL, no añadir cantidades
superiores por que puede afectar la conductividad de la muestra).
• Poner la mezcla en hielo durante 10 min con el fin de que el DNA sea pre
absorbido.
• Mantener las cubetas de electroporación en hielo durante 15 min y
posteriormente secarlas muy bien.
• Homogenizar las células y transferirlas a la cubeta de electroporación.
• Someterlas a un pulso de 2.5 kV, 1000 Ω, 25 µF y constantes de tiempo de 15
ms a 25 ms.
• Añadir inmediatamente 1 mL de medio Middlebrook 7H9, resuspender con
mucho cuidado y transferirlas a un tubo estéril.
• Incubar a 37°C en agitación a 200 rpm durante 3-4 horas.
• Resuspender y sembrar en placas de medio Middlebrook 7H10 suplementados
con los antibióticos adecuados si se requiere.
• Incubar durante 3-4 días a 37°C.
Preparación de células electrocompetentes de M. tuberculosis
El procedimiento es similar al usado para M. smegmatis con la diferencia de que toda

la preparación se hace a temperatura ambiente:
• Inocular una colonia de M. tuberculosis o 100 µL de un cultivo crecido en 10 mL

de medio Middlebrook 7H9 e incubar durante 2 o 3 semanas a 37°C.
• Hacer una resiembra 1/100 en 100 mL de medio Middlebrook 7H9 e incubar a
37°C durante una semana. Asegurarse que se encuentra en fase exponencial
midiendo la OD600.
• Centrifugar en tubos estériles durante 10 min a 3000 g a 15°C-20°C.
(v/v).
• Centrifugar durante 10 min a 3000 g a 15°C-20°C.
(v/v).
(v/v).
72

(v/v).
• Alicuotar en tubos eppendorf (400 µL por tubo) y electroporar inmediatamente.
Electroporación de M. tuberculosis
• Mezclar las células electrocompetentes con el DNA (<5 µL) y mezclar.

• Incubar la mezcla durante 10 min a temperatura ambiente.
• Homogenizar las células y transferirlas a la cubeta de electroporación.
• Someterlas a un pulso de 2.5 kV, 1000 Ω, 25 µF y constantes de tiempo de 15
ms a 25 ms (electroporador GenePulser XCell™, BioRad).
• Resuspender las células en 1 mL de medio Middlebrook 7H9 y transferirlas a
un tubo estéril que contenga 2 mL de medio Middlebrook 7H9.
• Incubar durante 12h-24 horas a 37°C.
• Resuspender y sembrar en placas de medio Middlebrook 7H10 suplementados
con el antibiótico adecuado si se requiere. La siembra se puede hacer con asas
de Digralsky desechables estériles o con bolas de vidrio de 0.5 cm de diámetro
(Sigma) estériles extendiendo el líquido por rotación de la placa. Las bolas se
desinfectan con lejía y autoclave y posteriormente se lavan de nuevo y se
esterilizan para su reutilización.
• Incubar durante 3-4 semanas a 37°C.
3.4. Métodos de manipulación de DNA
Gran parte de la metodología utilizada en este apartado se basa en Molecular

Cloning: a laboratory manual [204] con algunas modificaciones.
3.4.1. Miniextracción de DNA plasmídico de E. coli
Esta técnica está basada en el protocolo de lisis alcalina descrito por Birnboim
[205].
Procedimiento:
• Preparar un cultivo de noche en 10 mL de medio TB suplementado con el

antibiótico requerido e incubar a 37°C en agitación.
• Centrifugar 1.5 mL de cultivo a 13000 rpm durante cinco min.
• Eliminar el sobrenadante.
• Resuspender el pellet en 100 µL de solución I fría (Tampón de lisis), añadir 1
µL de RNasa e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
73
• Añadir 200 µL de solución II (solución desnaturalizante), mezclar por inversión

y mantener durante 5 min en hielo o hasta que se obtenga una solución
viscosa.
• Añadir 150 µL de solución III (Tampón neutralizante), mezclar por inversión e
incubar durante 5 min en hielo o hasta que se observe un precipitado blanco.
• Centrifugar durante 5 min a 13000 rpm.
• Transferir la fase acuosa a un tubo eppendorf y añadir 1 mL de tierra de
diatomeas (resina que secuestra el DNA).
• Incubar durante 10 min a temperatura ambiente, mezclando por inversión
regularmente para evitar que la tierra se precipite.
• Transferir la muestra a una jeringa colocada sobre una columna Wizard®
Minicolumn (Promega) y pasar la muestra a través del filtro con ayuda del
émbolo.
• Quitar la jeringa de la columna, sacar el émbolo y colocar la jeringa en la
columna nuevamente. Añadir 2 mL de etanol al 70% y filtrar.
• Quitar la jeringa de la columna y colocar la columna en un tubo eppendorf.
Centrifugar durante 20 s a 13000 rpm para eliminar los restos de etanol.
Transferir la columna a un tubo eppendorf nuevo y dejar secar la columna
durante 10 min a temperatura ambiente.
• Añadir al filtro de la columna, 20 µL-50 µL de agua desionizada estéril
precalentada a 42°C e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
• Centrifugar 1 min a 13000 rpm.
Soluciones
• TrisHCl 1M pH 7.5: disolver 60.55 g de Tris Base en 300 mL de agua destilada.

Ajustar el pH con ácido clorhídrico a 7.5. Llevar a volumen de 500 mL con agua
destilada.
• Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0.5 M pH 8: añadir 46.35 g de EDTA y
5 g de NaOH a 200 mL de agua destilada. Ajustar el pH con NaOH a 8 y llevar
a volumen con agua destilada a 250 mL. Agitar hasta alcanzar una disolución
completa. Esterilizar con autoclave por 15 min a 121°C.
Solución I
Tris HCL 1 M pH 7.5 0.625 mL

EDTA 0.5 M pH 8 0.5 mL
74
Glucosa 20% (p/v) estéril 1.135 mL

Agua desionizada 22.74 mL
Mezclar y almacenar a 4°C.
RNasa A
Concentraciones finales:
RNasa A (Roche) 10 mg/mL
Tris HCl 10 mM
NaCl 15 mM
Mezclar 10 µL de Tris HCl 1 M pH 7.5 con 3 µL de NaCl 5 M y 987 µL de agua

desionizada estéril. Añadir 10 mg de RNasa A y homogenizar. Incubar durante 15 min
a 100°C. Dejar enfriar a temperatura ambiente, hacer alícuotas de 50 µL y congelarlas
a -20°C.
Solución II
SDS 10% (p/v) 2.5 mL

NaOH 10 N (40 g/100 mL) 0.5 mL
Agua desionizada 22 mL
Mezclar y guardar a temperatura ambiente, utilizar la solución recién preparada.
Solución III
Acetato potásico 5 M (49.075 g/100 mL) 15 mL

Ácido acético glacial 2.875 mL
Agua desionizada 7.125 mL
Mezclar y guardar a temperatura ambiente.
Tierra de Diatomeas
Tierra de diatomeas (Sigma) 3.5 g

Hidrocloruro de guanidina 100 g
Tris HCl 1 M pH 7.5 8.75 mL
EDTA 0.5 M pH 8 14 mL
75
• Disolver la tierra de diatomeas en 50 mL de agua desionizada estéril en un

vaso de precipitados igualmente estéril, dejar precipitar un mínimo de 3h.
Proteger de la luz.
• Disolver el hidrocloruro de guanidina (tóxico) en 50 mL de agua desionizada
estéril y añadir el TrisHCl y el EDTA; llevar a volumen (175 mL) con agua
desionizada.
• Eliminar la fase acuosa de la tierra de diatomeas con la bomba de vacío y
añadir la solución de guanidina.
• Homogenizar la solución y dispensarla en botellas de 100 mL estériles
protegidas de la luz.
• Almacenar a temperatura ambiente y mezclar antes de usar.
3.4.2. Extracción de DNA plasmídico de Mycobacterium
La extracción de DNA plasmídico micobacteriano no es tan sencilla como en E.

coli, ya por lo general los plásmidos se encuentran en bajo número de copias y es
difícil aislarlos en cantidades suficientes. Para solventar este problema, se han
diseñado estrategias que han permitido manipular el DNA aislado de Mycobacterium
en E. coli que permite la propagación y extracción en altas cantidades [206]. Nuestro
laboratorio ha implementado el uso de dos técnicas para el aislamiento de pDNA de
Mycobacterium: por disrupción mecánica y por calor.
Extracción por disrupción mecánica:
Procedimiento (Modificado de [207]):
• Tomar con el asa de Kölle bastante cantidad de colonias a partir de una placa
bien crecida y añadirlas a un tubo que contenga 200 µL de TE y 100 µL de
bolitas de zirconia de 0.1 mm de diámetro (Biospect).
• Lisar con el Mini BeadBeater (Biospect) durante 2 min a máxima velocidad.
• Centrifugar y separar el sobrenadante.
• Tomar 20 µL de lisado y transformar en 100 µL de competentes de E. coli.
Extracción por calor
Procedimiento:
• Tomar con el asa de Kölle bastante cantidad de colonias a partir de una placa
bien crecida y resuspender en 200 uL de TE.
76
• Incubar a 90°C durante 60 min, en el caso de M. tuberculosis, sellar muy bien

los tubos eppendorf con Parafilm®.
• Para M. tuberculosis, congelar durante 16 horas y descongelar a temperatura
ambiente.
• Tomar 20 µL del sobrenadante de los lisados y transformar en 100 µL de
competentes de E. coli.
Soluciones
TE
Tris HCL 10 mM
EDTA 1 mM
3.4.3. Electroforesis de DNA en geles de agarosa
La electroforesis es una técnica usada con el fin de separar, identificar y

purificar fragmentos de DNA bajo la influencia de un campo eléctrico. Los materiales
más comunes para separar DNA son polímeros como la poliacrilamida o la agarosa,
las cuales actúan como un filtro separando las moléculas de acuerdo a su tamaño y
carga neta. Estos geles se sumergen en tampones de pH ~8.0 en donde el DNA se
desplaza al polo positivo (ánodo) por la carga negativa que le brinda el grupo fosfato
en condiciones de pH neutro. La resolución y velocidad de separación está ligada a la
concentración de agarosa y el voltaje aplicado, en donde los fragmentos de menor
tamaño migran más rápidamente que los de mayor tamaño, por lo que al aumentar la
concentración de agarosa se dificulta el desplazamiento del DNA a lo largo del gel
resolviendo mejor los fragmentos de menor tamaño; por lo que la concentración de
agarosa a utilizar dependerá del tamaño del fragmento de DNA que se quiera observar
y el voltaje aplicado será directamente proporcional. Las moléculas de DNA separadas
pueden visualizarse mediante el uso de sustancias como el Bromuro de etidio, el cual
se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz
ultravioleta [204, 208].
Las concentraciones de agarosa utilizadas en este trabajo fueron: 0.7% para

fragmentos entre 3-14 kb y plásmidos, 1% para fragmentos de 1 a 4 kb, 2% para
fragmentos de 0.1 a 1.5 kb. Se utilizaron dos tipos de agarosa: (LM-sieve, Pronadisa)
para geles al 2% y agarosa para biología molecular (Roche) para otros geles. Los
marcadores de peso utilizados fueron: MWM XIV (Roche) con fragmentos entre 0.1 y
77
2.6 kb, MWM X (Roche) con fragmentos entre 0.07 y 12.2 kb, λ BstEII con fragmentos
entre 0.7 y 14.1 kb, GeneRuler 1 Kb Plus DNA ladder (Fermentas) con fragmentos
entre 0.075 y 20 kb. Los geles fueron teñidos con Bromuro de etidio para su
visualización.
Procedimiento
• Pesar una cantidad de agarosa de acuerdo a la concentración deseada y

mezclar con 50 mL de TAE 1X preparado a partir de uno 10X (Roche).
• Calentar hasta fundir la agarosa completamente.
• Atemperar la solución a unos 50°C y añadir bromuro de etidio a una
concentración final de 0.5 µg/mL a partir de un stock a 625 µg/mL (Amresco).
• Poner la mezcla en un soporte con los extremos sellados previamente con cinta
adhesiva y colocar los peines correspondientes de acuerdo al número de
pocillos que se deseen, dejar solidificar.
• Retirar los peines y la cinta adhesiva y poner el soporte del gel en una cubeta
de electroforesis con TAE 1X.
• Cargar las muestras de DNA en los pocillos del gel, previamente preparadas
con tampón de carga 1X para muestras de hasta 4 µL de DNA (5 µL de tampón
por cada µL de DNA). Para volúmenes mayores, utilizar el tampón de carga 6X
en una relación 1:5.
• Correr el gel con un voltaje constante entre 40 y 70 V por un tiempo que
dependerá del tamaño y el fragmento de DNA a separar.
• Visualizar el DNA con un trans iluminador UV (302 nm de longitud de onda). Si
se desea, hacer foto con el digitalizador de imágenes GelDoc 2000, BIO-RAD).
Soluciones
TAE 1X
Mezclar 250 mL de TAE 10X (Roche) con 1.25 L de agua destilada.
Tampón de carga 6X
Ficoll 400 1.2 g

EDTA 0,5 M pH 8 (46,35 g /250 mL) 1.2 mL
SDS 10% (p/v) 0.6 mL
Azul de bromofenol 15 mg
Xilencianol 15 mg
78
Disolver el Ficoll 400 en 5 mL de agua destilada con temperatura, añadir el SDS y el

EDTA; llevar a volumen de 10 mL y añadir los colorantes. Dispensar en alícuotas de 1
mL y guardar a temperatura ambiente.
3.4.4. Purificación de fragmentos de DNA de geles de agarosa
Este procedimiento se utilizó para la recuperación de bandas procedentes de

PCR o digestión enzimática a partir de geles de agarosa de bajo punto de fusión (LM-
sieve, Pronadisa), la cual ha sido modificada por hidroxietilación permitiendo que se
funda a temperaturas más bajas (~65°C) de tal manera que el DNA puede ser más
fácilmente purificado o tratado enzimáticamente (digestión/ligación). Para fundir la
agarosa se utilizó ioduro sódico 6 M y posteriormente tierra de diatomeas para la
purificación del DNA.
Procedimiento
• Cortar el fragmento de DNA del gel de agarosa con un cúter previamente

flameado para evitar contaminantes.
• Añadir NaI 6 M en una proporción de dos o tres veces el peso de la banda (no
exceder la cantidad dado que el NaI puede desnaturalizar el DNA).
• Incubar a 55°C hasta que la agarosa se disuelva completamente.
• Añadir 1 mL de tierra de diatomeas e incubar 10 min a temperatura ambiente,
mezclar por inversión con regularidad.
• Transferir a una jeringa sobre una columna Wizard® Minicolumn (Promega) y
filtrar.
• Separar la columna de la jeringa, extraer el embolo y poner la jeringa en la
columna, añadir 2 mL de etanol al 70% y filtrar.
• Poner la columna en un tubo eppendorf y centrifugar 20 s a 13000 rpm.
Transferir la columna a un tubo eppendorf nuevo y dejarla a temperatura
ambiente durante 10 min.
• Añadir 15-25 µL de agua desionizada estéril a 42°C al filtro de la columna e
incubar 10 min a temperatura ambiente.
• Centrifugar durante un minuto a 13000 rpm para recuperar el DNA eluido.
Soluciones
NaI 6 M
NaI 18 g
79
Disolver con agitación en 12 mL de agua desionizada. Ajustar a 20 mL con agua

desionizada. Proteger de la luz durante todo el proceso ya que es fotosensible. La
solución debe ser transparente. Guardar a 4°C.
Alternativamente, se usó el kit E.Z.N.A Gel Extraction (OMEGA, bio-tek),

siguiendo las recomendaciones de los fabricantes.
3.4.5. Digestión con enzimas de restricción
Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas de DNA de un

tamaño entre 4 a 6 pb, las cuales cortan el DNA en cada punto en el que encuentran
su secuencias diana generando diversos fragmentos de DNA que pueden separarse
en base a su tamaño en geles de agarosa o poliacrilamdia. De esta forma, las
distancias entre los sitios de corte pueden calcularse en base a los tamaños
generados. Existen diferentes enzimas de restricción que tienen diferentes secuencias
diana; estas enzimas se han aislado de diferentes especies de bacterias [209]. En este
trabajo, se utilizaron enzimas y sus tampones de Roche y New England BioLabs,
siguiendo las instrucciones de los fabricantes.
3.4.6. Clonación en vectores plasmídicos
Para la clonación de DNA externo en plásmidos, hay que tener en cuenta que
los extremos sean compatibles. Hay casos en los que la combinación de enzimas de
restricción empleadas no permiten que los extremos sean compatibles por lo que es
necesario obtener extremos romos que serán compatibles entre sí. También hay que
tener en cuenta que un vector digerido con una única enzima de restricción genera
unos extremos que pueden volverse a unir sin haber incorporado el fragmento de
DNA. Por lo tanto, se utiliza la fosfatasa alcalina para desfosforilar los extremos del
vector y evitar la re-circularización. Los productos de la ligación fueron usados para
transformar en competentes de E. coli, seleccionándose los transformantes en medio
selectivo. La comprobación de las construcciones se realizó por PCR, digestión o
secuenciación a partir de DNA plasmídico extraído.
3.4.6.1 Obtención de extremos romos
Cuando los extremos tanto del vector como del inserto eran incompatibles, se
utilizó la enzima T4 DNA polimerasa para obtener extremos romos gracias a su
actividad polimerasa 5’-3’ en presencia de dNTPs y exonucleasa 3’-5’.
Procedimiento:
80
• Mezclar en un tubo eppendorf:

2 µg-3 µg de DNA, 5 µL de tampón T4 DNA polimerasa 10X (Roche), 5 µL de
T4 DNA polimerasa (1 U/µL) (Roche), 10 µL de dNTPs 0.5 mM (Roche), agua
desionizada hasta un volumen de 50 µL.
• Incubar 15 min a 37°C.
• Inactivar a 70°C durante 10 min.
• Añadir 200 µL de agua desionizada y 500 µL de tierra de diatomeas.
• Recuperar el DNA de la misma manera que para la miniextracción de DNA
plasmídico con la columna Wizard® Minicolumn (Promega), limpiando el DNA
con etanol al 70% y eluyéndolo con agua desionizada a 42°C.
3.4.6.2. Desfosforilación
La desfosforilación se usó para eliminar los grupos fosfato de los extremos 5’

del vector con fosfatasa alcalina, para así evitar la re-circularización de los plásmidos.
Procedimiento:

20 µL de DNA plasmídico digerido, 25 µL de agua desionizada, 5 µL de tampón
de fosfatasa alcalina 10X (Roche), 0.5 µL de fosfatasa alcalina (1 U/ µL)
(Roche).
• Incubar durante 1 hora a 37°C.
• Inactivar la fosfatasa alcalina adicionando EDTA pH 8 a una concentración final
de 5 mM e incubarlo a 70°C por 10 min.
• Añadir 200 µL de agua desionizada y 500 µL de tierra de diatomeas.
• Recuperar el DNA de la misma manera que para la miniextracción de DNA
plasmídico con la columna Wizard® Minicolumn (Promega), limpiando el DNA
con etanol al 70% y eluyéndolo con agua desionizada a 42°C.
3.4.6.3 Ligación
La ligación del inserto y el vector se realizó con la T4 DNA ligasa (New England
BioLabs), la cual cataliza la formación de enlaces fosfodiester entre los nucleótidos
adyacentes de los extremos 3’ y 5’ del DNA, tanto si es de extremos romos como de
extremos cohesivos. Para obtener el máximo número de productos de ligación
correctos, es necesario que tanto el vector como el inserto se encuentren en un
proporción adecuada (relación molar) que debe ser 1:1 vector:inserto para extremos
81
romos y 2:1 para extremos cohesivos. Para calcular dicha proporción se aplica la
siguiente fórmula:
ng inserto = [(ng inserto x kb inserto)/Kb vector] x relación molar inserto / vector
Procedimiento:
• Mezclar en un tubo eppendorf 1 µL de tampón 10 X de la T4 DNA ligasa (New

England BioLabs), 1 µL de T4 DNA ligasa (1 U/ µL) (New England BioLabs),
cantidades calculadas de inserto y vector, agua desionizada ajustando el
volumen a 10 µL.
• Incubar durante 16 horas a temperatura ambiente para ligar extremos romos y
a 4°C para extremos cohesivos.
• Transformar 100 µL de células competentes de E. coli y sembrar en medio
selectivo adecuado.
Los productos de PCR se ligaron directamente en el plásmido linearizado

pGEM®-T Easy vector (Promega), el cual contiene una timina en el extremo 3’
compatible con la adenina adicionada por la polimerasa en la PCR. Este vector
contiene los promotores RNA polimerasa T7 y SP6 flanqueando la región de múltiple
clonaje que se encuentra en la región codificante para el péptido α de la β-
galactosidasa. La inactivación insercional de de éste péptido por parte del producto de
PCR clonado permite identificar los clones recombinantes ya que las colonias serán
blancas en placas con X-Gal, mientras que las bacterias con plásmido sin inserto
formarán colonias azules en presencia del sustrato cromógeno X-gal por acción de la
β-galactosidasa. La región MCS posee varias dianas de restricción que permiten
recuperar los insertos clonados generando extremos compatibles con otros vectores y
flanqueando esta región, oligonucleótidos que permiten secuenciar los productos
clonados.
3.4.7. Amplificación y secuenciación de DNA
3.4.7.1. PCR
La PCR es una de las técnicas más utilizadas en biología molecular dada su

aplicación en campos como la clonación, mutagénesis, secuenciación, etc. En esta
reacción se amplifica un fragmento específico de DNA in vitro con el fin de obtener un
gran número de copias de éste. En una reacción común se incluye una polimerasa de
DNA termoestable, dos primers o oligonucleótidos (directo y reverso), dNTPs, tampón
de reacción y magnesio que brindan condiciones especiales para el funcionamiento
82
adecuado de la enzima. Posteriormente en el termociclador se somete la muestra a

diferentes ciclos con diferentes temperaturas. Cada ciclo tiene un periodo de
desnaturalización del DNA (separación de cadenas), hibridación de los
oligonucleótidos (unión de oligonucleótidos al DNA molde por complementariedad a
temperatura específica dada por las bases que componen la secuencia) y extensión
de los mismos (elongación de la cadena a partir de la secuencia molde por la
polimerasa). La amplificación se da exponencialmente, de modo que las secuencias
sintetizadas en cada ciclo sirven como molde para el siguiente ciclo.
En este trabajo se utilizó la AmpliTaq Gold® DNA polimerasa (Applied

Biosystems) para amplificar DNA de M. tuberculosis altamente rico en GC. Esta
polimerasa se encuentra en estado inactivo por lo que debe someterse a calor para
activarla bien sea en la desnaturalización inicial o a medida que avanza la PCR. Se
adicionó DMSO para favorecer la desnaturalización del DNA. Los oligos utilizados se
diseñaron con el programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu) [210].
Procedimiento:
• Irradiar el material a utilizar (Puntas, pipetas, tubos eppendorf, etc).

• Mantener todas las soluciones en hielo así como la mezcla a realizar.
- 2.5 µL de GeneAmp 10X PCR Buffer II (Applied Biosystems)
- 2.5 µL de DMSO (Sigma)
- 2.5 µL de dNTPs 20 mM (Roche)
- 1.5 µL de MgCl2 25 mM (Applied Biosystems)
- 0.5 µL de cada oligonucleótido 25 pmol/µL (Roche)
- 0.1 µL de AmpliTaq Gold 5 U/µL (Applied Biosystems)
- 0.5 µL de DNA molde (400 µg/uL) o 5 µL de lisado, o agua desionizada en
el tubo control negativo
- Agua desionizada estéril hasta 25 µL
• Introducir las muestras en el termocilador MJ Mini™ Gradient Thermal Cycler
(BIO-RAD) en las siguientes condiciones:
- Desnaturalización inicial durante 9 min a 95°C (activación de la DNA
polimerasa)
- Amplificación 30 ciclos de:
o Desnaturalización: 1 min a 95°C
83
o Hibridación: 30s a temperatura indicada de acuerdo a los

oligonucleótidos, la cual será unos grados superior a la temperatura
del oligonucleótido con temperatura de fusión más baja.
o Extensión: 1 min por Kb amplificada a 72°C
- Extensión final: 7 min a 72°C
3.4.7.2. Secuenciación
La secuenciación del DNA es una técnica que permite la determinación del

orden de las bases nucleotídicas en un DNA de interés. El método utilizado fue el
método automatizado con electroforesis capilar derivado del método de Sanger o
Dideóxido [211]. El kit de secuenciación utilizado fue BigDye® Terminator v. 3.1 Cycle
Sequencing (Applied-Biosystems) el cual implica el uso de una enzima AmpliTaq®
DNA polimerasa FS que permite una menor discriminación de los dideoxinucleótidos
(ddNTPs) gracias a que contiene una mutación puntual en su sitio activo, así como la
generación de picos de una mayor intensidad en fluorescencia; además, implica el uso
de ddNTPs, dNTPs y demás componentes de una PCR tradicional.
Los ddNTPs carecen del grupo OH en el carbono 3’ de la desoxirribosa,

impidiendo la formación de los enlaces fosfodiéster en el momento de la síntesis del
DNA por la enzima AmpliTaq® DNA polimerasa FS. De esta manera se termina la
elongación de la cadena generando fragmentos que difieren en longitud por una base.
Los ddNTPs están marcados con fluorocromos específicos para cada base que
generan su propia longitud de onda (también llamados dye terminadores) que es
detectada por el secuenciador cuando la muestra es separada electroforéticamente en
un polímero desnaturalizante de alta resolución a los que posteriormente se les asigna
su orden en la secuencia. En este trabajo la secuenciación la realizó el Servei
Genòmica Bioinformàtica (SGB) de la UAB en el equipo ABI 3730x (Applied
Biosystems).
Procedimiento:
• Irradiar el material a utilizar (puntas, pipetas, tubos eppendorf, etc).

• Mantener todas las soluciones en hielo así como la mezcla a realizar.
- 0.5 µL de pre-mix BigDye™ (Applied Biosystems)
- 1.75 µL de tampon 5X (Applied Biosystems)
- 0.5 µL de DMSO (Sigma) (Opción)
- 1.0 µL a 2.5 µL de DNA molde (DNA plasmídico)
84
- 0.65 µL de oligonucleótido 5 pmol/µL (Roche)

- Agua desionizada hasta 10 µL
• Introducir las muestras en el termocilador MJ Mini™ Gradient Thermal Cycler
(BIO-RAD) en las siguientes condiciones:
- Desnaturalización inicial durante 3 min a 94°C
- Amplificación 25 ciclos de:
o Desnaturalización: 30 s a 96°C
o Hibridación: 15 s a temperatura óptima del oligonucleótido
o Extensión: 4 min a 60°C
• Posterior a la reacción de secuenciación, se realizó la precipitación y
purificación de los productos con el fin de remover los dye terminadores no
incorporados y demás componentes no utilizados en la amplificación como
sigue:
- Añadir 1 µL de EDTA 125 mM, 1 µL de acetato de sodio 3 M y 25 µL de
etanol al 100%
- Mezclar e incubar por 15 min a temperatura ambiente
- Centrifugar 15 min a velocidad máxima
- Aspirar el sobrenadante y añadir 35 µL de etanol 70%
- Centrifugar 5 min a velocidad máxima
- Aspirar el sobrenadante y secar los pellets
• Resuspender las muestras en 10 µL de formamida y analizar con el ABI 3730x.
3.4.8. Mutagénesis
Para la obtención de mutantes se usó el sistema de transducción especializada

que permite generar mutantes por deleción con alta eficiencia aunque implica más
pasos en comparación con otros métodos [200, 212]. Este sistema comprende cinco
pasos que se muestran en la figura 3.1.
85
Paso 1: Construcción de AES
Paso 2: Incorporación de AES en el fásmido
Empaquetar en λ
Transducir en E.coli;
Purificar DNA del
cósmido
Paso 3: Conversión del cósmido en Micobacteriófago
Paso 4: Transducción especializada
Paso 5: Eliminación del cassette de Higromicina
Figura 3.1. Obtención de mutantes por deleción usando transducción especializada.

Modificado de [200].
Construcción del sustrato de intercambio alélico (AES, Alellic Exchange

substrate)
Para delecionar el gen de interés, es necesario generar un AES amplificando

por PCR las regiones flanqueantes 5’ (corriente arriba) y 3’ (corriente abajo) de dicho
gen, usando dos sets de oligonucleótidos. Posteriormente, se clonan ambos
fragmentos en el cósmido pYUB854 flanqueando un cassette de higromicina de
manera que el gen de interés además de delecionado queda interrumpido por e
marcador de resistencia. A su vez el cassette de higromicina está flanqueado por
secuencias de unión a DNA res específicas para la resolvasa γδ-TnpR codificada por
el plásmido ayudador pYUB870 lo que permite eliminar el marcador de resistencia de
la cepa mutante (Fig. 3.1).
Procedimiento:
86
• Amplificar por PCR las regiones flanqueantes 5’ (fragmento 1) y 3’ (fragmento

2) del gen que se desee delecionar; se recomienda que los amplicones sean
de ~0.5 a 1 kb.
• Clonar cada fragmento en pGEM-T® (opcional).
• Liberar el fragmento 1 clonado en pGEM-T® con las enzimas de restricción
adecuadas y clonarlo en el vector pYUB854 previamente digerido con las
mismas enzimas de restricción lo que producirá el plásmido pYUB854+F1.
• Liberar el fragmento 2 clonado en pGEM-T® con las enzimas de restricción
adecuadas y clonarlo en el plásmido pYUB854+F1 previamente digerido con
las mismas enzimas de restricción lo que producirá el plásmido
pYUB854+F1F2.
• Comprobar por PCR y secuenciación la presencia de la deleción.
Incorporación del AES a un fásmido
El segundo paso implica el clonaje del cósmido recombinante que contiene el

AES en el fásmido lanzadera phAE159, el cual permite que las manipulaciones de
DNA sean hechas en E. coli (Fig. 3.1).
Procedimiento:
• Digerir con la enzima PacI el plásmido pYUB854+F1F2 y el fásmido phAE159.

La enzima PacI no presenta ninguna diana en el cromosoma de M.
tuberculosis.
• Posteriormente ligar ambos plásmidos, mezclando:
- 2 a 4 µL de phAE159
- 4 a 6 µL del plásmido pYUB854+F1F2
- 1 µL de Buffer 10X de la T4 ligasa
- 0.5 µL de T4 DNA ligasa (400 U/µL)
- Completar con agua hasta un volumen final de 10 µL.
• Añadir 5 µL de la ligación a 50 µL del extracto de empaquetamiento MaxPlax

(Epicentre); mezclar golpeando ligeramente con los dedos.
• Incubar durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
• Añadir 400 µL de buffer MP para detener la reacción.
• Añadir 1 mL de células E. coli HB101 en la mezcla e incubar 1h 15 min a 37°C.
Esta cepa de E. coli no tiene actividad γδ resolvasa.
• Centrifugar 1 min a 13000 rpm a 4°C.
87
• Remover el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio LB.

• Hacer diluciones de la mezcla y sembrar diferentes volúmenes (100 µL-300 µL)
por duplicado en placas de LB+Higromicina e incubar toda la noche a 37°C.
• Picar como mínimo 6 colonias y crecerlas en 5 mL de LB+Higromicina, incubar
toda la noche en agitación a 37°C.
• Hacer una miniprep del los cultivos.
• Digerir los fásmidos con PacI para comprobar los insertos, como sigue:
-5 µL de DNA
-2 µL de buffer de restricción10X
-0.2 µL de de BSA 100X
-1 µL de PacI
-2 µL de de agua.
Incubar 3-4 horas a 37°C; posteriormente comprobar el patrón de digestión con

una electroforesis.
Empaquetamiento del fásmido
Esta etapa implica el empaquetamiento de los cósmidos lanzadera

R
recombinantes extraídos de E. coli Hyg en micobacteriófagos, transfectando M.
smegmatis con los cósmidos purificados e incubando a temperatura permisiva de
30°C. Posteriormente, se preparan lisados de título elevado (Fig. 3.1).
Procedimiento:
• Electroporar 4 a 10 µL de DNA fasmídico en 400 µL de células

electrocompetentes M. smegmatis.
• Añadir 1 mL de medio Middlebrook 7H9 sin Tween 80, e incubar 1 h a 37°C.
• Hacer dos mezclas:
A. 400 µL de M. smegmatis electroporada y 400 µL de un cultivo fresco de M.

smegmatis.
B. 110 µL de M. smegmatis electroporada y 1 mL de un cultivo fresco de M.
smegmatis.
• Añadir 300 µL y 500 µL de la dilución A y 300 µL y 400 µL de la dilución B a 3

mL de Middlebrook top agar fundido, mezclar con vórtex y plaquear en placas
de Middlebrook 7H10 atemperadas. Sembrar por duplicado.
• Incubar a 30°C durante 3 días.
88
• Picar calvas obtenidas (~6) con ayuda de una punta de pipeta estéril y mezclar
con 200 µL de buffer MP, incubar 1 h 30 min a temperatura ambiente.
Almacenar a 4°C.
Preparación de fago de título elevado:
• Hacer dos diluciones:
A. Añadir 5 µL de fago recuperado en el paso anterior, a 300 µL de cultivo de

M. smegmatis. Hacer por duplicado.
B. Hacer una dilución 1:5 del fago recuperado en el paso anterior con buffer
MP. Añadir 5 µL de fago diluido a 300 µL de cultivo de M. smegmatis.
• Mezclar cada dilución (A y B) con 3 mL de Middlebrook top agar fundido y

plaquear en placas de Middlebrook 7H10 atemperadas. Sembrar por duplicado.
• Incubar a 30°C durante 2 días.
• Seleccionar las placas con el mayor número de calvas y añadir 5 mL de buffer
MP, incubar 3 horas a 4°C en agitación y luego 1 h 30 min a 37°C. El top agar
se contraerá a 4°C para luego expandirse a 37°C lo que permitirá que más fago
sea liberado en el lisado.
• Separar el buffer MP y centrifugarlo a 3000 rpm durante 5 min a 4°C.
• Filtrar el sobrenadante con filtros de 0.45 µm.
• Hacer diluciones seriadas del lisado del fago en buffer MP por duplicado,
mezclar 300 µL de las diluciones con 300 µL de cultivo de M. smegmatis e
incubar 30 min a 30°C.
• Añadir a cada dilución del fago 3 mL de Middlebrook top agar fundido y
plaquear en placas de Middlebrook 7H10 atemperadas. Sembrar por duplicado.
• Para cada dilución incubar una placa a 30°C y una placa a 37°C con el fin de
confirmar el fenotipo temperatura-sensible y determinar el título del fago en
pfu/mL (plate forming units).
Transducción especializada
En este paso el fago de alto título se transduce en M. tuberculosis a

temperatura no permisiva (37°C) en la cual se restringe la replicación del fago. El
intercambio alélico ocurre como resultado de la doble recombinación entre el DNA
homólogo que se encuentra en los fragmentos flanqueantes a la región génica
delecionada. Cuando se siembra en medio selectivo, se obtienen aproximadamente un
95% de transductantes HygR que muestran el fenotipo mutante deseado (Fig. 3.1).
89
Procedimiento:
• A partir de un cultivo de M. tuberculosis con una OD600 de 1.0 crecido en 7H9

Tween 80, transferir 10 mL a un falcon y centrifugar 10 min a 3000 rpm a 4°C.
Se necesitarán 10 mL de cultivo por cada transducción.
• Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 10 mL de solución de lavado de
micobacteriófago.
• Centrifugar 10 min a 3000 rpm a 4°C, descartar el sobrenadante y resuspender
el pellet en 1 mL de buffer MP.
• Precalentar el fago a 37°C y preparar tres falcon; mezclar en el primero 1 mL
de células con 1 mL de fago de título elevado, en el segundo 1 mL de fago de
título elevado con 1 mL de buffer MP y en el tercer tubo 1 mL de células con 1
mL de buffer MP. Mezclar cuidadosamente cada mezcla con pipeta e incubar
toda la noche a 37°C.
• Centrifugar 10 min a 3000 rpm a 4°C, descartar el sobrenadante y resuspender
el pellet en 1 mL de 7H9.
• Sembrar en placas de Middlebrook 7H10 suplementadas con higromicina. Se
recomienda sembrar 5 placas por transducción.
• Incubar durante 3-4 semanas a 37°C.
Eliminación del cassette de higromicina
Para eliminar el cassette de higromicina de los mutantes, se usa el plásmido

pYUB870, el cual expresa una resolvasa codificada por el gen tnpR bajo el control del
promotor hsp60. Por otro lado, el gen sacB incluido en este plásmido, da una selección
negativa para la pérdida espontánea del plásmido pYUB870 cuando se plaquea en
medio que contiene sucrosa (Fig. 3.1).
Soluciones
Buffer MP
Tris HCl, pH 7.6 50 mM

NaCl 150 mM
MgCl2 10 mM
CaCl2 2 mM
90
Mezclar 2.5 mL de Tris HCl 1 M pH 7.6 con 1.5 NaCl 5 M, 1 mL CaCl2 0.1 M, 5 mL
MgCl2 100 mM; llevar a volumen de 50 mL de agua Milli-Q. Filtrar con filtros de 0.22
µm, almacenar a temperatura ambiente máximo durante 1 año.
Maltosa 20%
Pesar 2 g de maltosa y diluirlos en 10 mL de agua Milli-Q, filtrar con filtros de 0.22 µm,
almacenar a temperatura ambiente máximo durante 1 año.
MgSO4
Pesar 2.45 g de MgSO4 y diluirlos en 10 mL de de agua Milli-Q, filtrar con filtros de

0.22 µm, almacenar a temperatura ambiente.
Dextrosa 20%
Pesar 20 g de dextrosa y disolver en agua hasta 100 mL, filtrar con filtros de 0.22 µm,
almacenar a temperatura ambiente.
Solución de lavado de micobacteriófago
Mezclar 2.5 mL de glicerol 99% con 5 mL de ADC; llevar a volumen de 50 mL con

agua Milli-Q. Filtrar con filtros de 0.22 µm, almacenar a 4°C máximo durante 6 meses.
Preparación de células HB101
• Inocular HB101 en medio LB suplementado con 10 mM de MgSO4 y 0.2% de

maltosa, incubar en agitación toda la noche a 37°C.
• Inocular 0.5 mL del cultivo o/n en 25 mL de medio LB suplementado con 10 mM

de MgSO4 y 0.2% de maltosa.
• Incubar en agitación a 37°C hasta que el cultivo alcance una OD600 de 0.8-1.0.
• Transferir las células a un falcon de 50 mL y centrifugar a 3000 rpm durante 10
min a 4°C.
• Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 12.5 mL de MgSO4 10
mM.
• Almacenar a 4°C hasta durante dos días.
Middlebrook top agar
91
Pesar 0.47 g de medio Middlebrook 7H9, 0.75 g de agar y disolver en 100 mL de agua
destilada; autoclavar 10 min a 121°C, dejar enfriar un poco y añadir 1 mL de dextrosa
al 20% estéril. Alicuotar y almacenar a 4°C.
3.5. Métodos de manipulación de RNA
La manipulación del RNA implica tomar una serie de precauciones que

permitan evitar contaminaciones con RNasas, las cuales son extremadamente
comunes en el ambiente, por lo que es importante trabajar en un ambiente libre de
ellas; para ello todo el material a utilizar debe tratarse para su eliminación, así como
implementar el uso de material de plástico libre de RNasas, puntas de micropipeta con
filtro, agua desionizada estéril en la preparación de soluciones y agua libre de RNasas
para resuspender el RNA una vez aislado. Por otro lado, es importante mantener el
área de trabajo desinfectada con etanol y cambiarse los guantes frecuentemente.
3.5.1. Extracción de RNA total
La clave para tener RNA de buena calidad radica en la rapidez con la que se
aísle, por lo que se recomienda usar un método que sea sencillo así como preparar el
material y las soluciones con antelación. En este trabajo se utilizó el método
recomendado por el Bacterial Microarray Group del St. George’s Hospital Medical
School (Londres) con ligeras modificaciones.
Procedimiento:
• Inocular M. tuberculosis en 10 mL de medio Middlebrook 7H9 e incubar a 37°C

durante 2 o 3 semanas.
• Medir la OD600 de los cultivos y hacer una resiembra en medio Middlebrook
7H9, de manera que la OD600 del cultivo sea de 0.01. El medio de cultivo se
prepara en un mismo lote y se hacen alícuotas en un número de frascos de
cultivo de 75 cm2 acorde con los cultivos se vayan a hacer para la extracción
del RNA; esto con el fin de evitar variaciones en la expresión génica debidas a
diferencias en los cultivos. Incubar a 37ºC durante 1 semana.
• Unir los cultivos directamente en un frasco de cultivo de 150 cm2 que contenga
4 volúmenes de la solución de tiocianato de guanidina (GTC) 5 M.
• Mezclar moviendo el frasco cuidadosamente para no generar aerosoles.
• Centrifugar alícuotas de 40 mL, a 3000 g durante 10 min, en tubos falcon bien
cerrados. Se aconseja no exceder esta cantidad para garantizar la integridad
de los tubos.
92
• Desechar el sobrenadante teniendo la precaución de nunca mezclar la solución

de GTC con lejía y usar los restos que quedan de la solución de GTC para
resuspender las células (aproximadamente 1 mL de GTC por 40 mL de cultivo
original, aunque se debería usar un radio mayor para cultivos en fase
estacionaria, o cultivos con bacterias agregadas). Se aconseja usar la solución
para lavar bien todo el fondo cónico del tubo donde quedan muchas células
adheridas. Transferir alícuotas de 1 mL a tubos eppendorf de 1.5 mL.
• Centrifugar durante 1 min a 13 000 rpm y desechar el exceso de GTC del pellet
bacteriano.
• Ruspender el pellet en 200 µL de Trizol (Invitrogen) con el fin de resuspender
bien las células y añadir 800 µL más de Trizol. Transferir a un tubo con 0.5 mL
de bolitas de zirconia de 0.1 mm de diámetro (glass beads acid-washed
Biospec).
• Lisar las células con el Mini BeadBeater (Biospec) sometiéndolas a dos pulsos
de 30 s a velocidad máxima. Poner en hielo durante 1 minuto para enfriar la
muestra. Repetir dos veces más.
• Mantener los tubos a temperatura ambiente durante 10 min para permitir la
disolución de los complejos RNA-proteína y dar un pulso de centrífuga para
separa las bolitas.
• Transferir el sobrenadante a 2-mL Heavy Phase Lock Gel I (5 PRIME) que
contenga 300 µL de cloroformo/alcohol isoamílico 24:1
• Mezclar por inversión rápidamente durante 15 s y poner en hielo. Una vez
todas las muestras haya sido transferidas, continuar invirtiendo periódicamente
durante 2 min.
• Centrifugar durante 5 min a 16.000 g, recuperar la fase acuosa (≈540 µL) y
ponerla en un tubo de 1.5 mL que contenga 270 µL de isopropanol y 270 µL de

solución de alto contenido salino.
• Precipitar a 4°C durante toda la noche.
• Centrifugar 16000 rpm 10 min a 4°C y descartar la fase de isopropanol.
• Añadir 1 mL de etanol 75%, inviertir varias veces, centrifugar durante 5 min a
16000 g.
• Eliminar el etanol y secar el pellet dejando el tubo eppendorf abierto en la
cabina de flujo laminar previamente irradiada durante 5-10 min, posteriormente
resuspender en 100µL de agua RNase-free (Qiagen, Crawley, UK). Los tubos
de RNA de la misma muestra de cultivo deben ser unidos resuspendiendo
93
todos los pellets en 100µL de agua (en una proporción de 100 µL de agua por
100 mL de cultivo bacteriano original) para mantener una alta concentración de
RNA.
Purificación con el RNeasy® Mini Kit (Qiagen)
El uso de este kit combina las propiedades de unión selectiva a una membrana
de sílica gel con la tecnología microspin en presencia de un buffer de alto contenido
salino y etanol que proporciona las condiciones adecuadas para la unión del RNA a la
membrana. Con este sistema se pueden purificar hasta 100 µg de RNA que
posteriormente es lavado para eliminar contaminantes y eluido en agua libre de
RNasas. El protocolo se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Tratamiento con el kit TURBO DNA-freeTM (Ambion)
Este kit se utilizó para eliminar restos de DNA presentes en la muestra de RNA
extraída. La DNasa incluida es una versión modificada de la DNasa I con 350% más
eficiencia catalítica y mayor afinidad por el DNA lo que la hace más efectiva a la hora
de eliminar DNA en la muestra a tratar. El tratamiento utilizado fue el “riguroso”:
Procedimiento:
• Diluir la muestra hasta una concentración de ácidos nucleicos de 200 ng/µL con
agua RNase-free (Qiagen) y dispensar la muestra en alícuotas, de volumen
igual o inferior a 87 µL, en tubo eppendorf de 0.5 mL para facilitar la
recuperación del sobrenadante tras el tratamiento con el inhibidor de la
DNasa.
• Añadir a cada tubo eppendorf 10 µL de tampón TURBO DNasa 10X, 3 µL de
TURBO DNasa y agua RNase-free (Qiagen) hasta un volumen final de 100 µL.
• Incubar durante 30 min a 37ºC.
• Añadir 3 µL más de TURBO DNasa e incubar otros 30 min a 37ºC.
• Resuspender bien el reactivo inhibidor de la DNasa con el vórtex y añadir 20 µL

a la muestra (0.2 volúmenes).
• Incubar durante 2 min-3 min a temperatura ambiente mezclando bien la
muestra 2 o 3 veces durante el tiempo de incubación.
• Centrifugar a velocidad máxima durante 1.5 min. Transferir el RNA a otro tubo.
Dado que el inhibidor de la DNasa quela cationes divalentes como el
magnesio o el calcio se debe ir con cuidado para no contaminar el RNA con
94
inhibidor, ya que podría impedir reacciones posteriores como la

retrotranscripción.
• Unir todas las muestras procedentes de un mismo cultivo y comprobar por PCR
que no quedan restos de DNA; en el caso de que amplificara la PCR, se haría
un segundo protocolo de tratamiento con TURBO DNasa de acuerdo con las
especificaciones de los fabricantes (TURBO DNA-free™ Second Digest
Protocol).
• En caso necesario, reconcentrar las muestras con el protocolo RNA clean-up
del RNeasy® Mini kit (Qiagen) según se ha descrito anteriormente.
Soluciones
Solución GTC 5 M
Tiocianato de guanidina 5M
N-Lauroilsarcosina sódica 0.5% (p/v)
β-mercaptoetanol 0.1 M
Tween 80 0.5% (v/v)
Pesar 590.8 g de GTC y disolverlos con agitación y calor, añadiéndolos lentamente a

400 mL de agua destilada. La disolución de GTC en agua es una reacción
endotérmica por lo que debe disolverse calentándolo manteniéndolo a una
temperatura de 20°C-25°C. Una vez disuelta, se añaden 5 g de N-Lauroylsarcosina
sódica, 7.5 mL de β-mercaptoetanol y 5 mL de Tween 80. Se disuelve con agitación y
se ajusta el volumen a 1 L con agua destilada. Guardar protegiendo de la luz.
Solución de alto contenido salino
Citrato de Sodio 0.8 M
Cloruro de Sodio 1.2 M
Pesar 10.32 g de citrato de sodio y 5.8 g de Cloruro de sodio disolver en agua

desionizada y ajustar a 50 mL.
3.5.2. Análisis cuantitativo y cualitativo del RNA
El análisis a nivel cuantitativo y cualitativo del RNA extraído permite determinar

su integridad y concentración. Se puede usar uno de los métodos descritos a
continuación:
95
3.5.2.1. Cuantificación por espectrofotometría
Para analizar el RNA se hacen lecturas a 230, 260 nm y 280 nm. El cociente
A260/280 da una estimación de la pureza de la muestra que debe tener valores ≥ 2; si por
el contrario ésta proporción disminuye, la muestra estaría contaminada con proteínas.
Por otro lado, el cociente A260/230 da una estimación de la contaminación por
carbohidratos, péptidos, fenol o compuestos aromáticos en donde la proporción debe
ser también ≥ 2. Se recomienda diluir la muestra usando Tris-EDTA pH 7-7.5 (1 µL de
RNA en 74 µL de TE) también como para la calibración del espectrofotómetro. Una
unidad de A260 corresponde a 44 µg de RNA por mL.
Por otro lado, se puede comprobar la integridad del RNA por mediante en gel
de agarosa al 2%, cargando 1 µg de RNA de acuerdo a las concentraciones estimadas
en el espectrofotómetro; en donde el RNA debe aparecer como dos bandas
ribosomales bien definidas.
3.5.2.2. Cuantificación por Nanodrop
El Nanodrop utiliza un diseño basado en el pipeteo de micro volúmenes

directamente sobre la superficie de un pedestal plano (extremo de la fibra óptica
receptora) que forma un puente de líquido junto con el pedestal superior produciendo
una tensión superficial que mantiene la muestra en su sitio, generando un estrecho
paso óptico cuya longitud varía automáticamente con la concentración de la muestra,
permitiendo hacer mediciones con gran exactitud y reproducibilidad en un rango muy
amplio de concentraciones sin hacer diluciones. La cuantificación con Nanodrop se
realizó en el Servei Genòmica Bioinformàtica (SGB) de la UAB con el equipo
NanoDrop®ND-1000 de acuerdo a las especificaciones de los fabricantes.
3.6. Métodos de manipulación de proteínas
3.6.1. Obtención de extractos proteicos
Los extractos proteicos se obtuvieron con el fin de comprobar la

sobreproducción de la dioxigenasa Rv3161c y del transportador Rv1686c-Rv1687c
clonados en el vector pMV261 [199] en geles mono dimensionales SDS-PAGE. El
procedimiento usado se adaptó al descrito por Parish y Wheeler [213].
Procedimiento:
96
• Inocular una colonia de M. tuberculosis en 10 mL de medio Middlebrook 7H9 e

incubar durante 2 o 3 semanas a 37°C.
• Hacer una resiembra 1/100 en medio Middlebrook 7H9 e incubar a 37°C hasta
que el cultivo alcance una OD600 de aproximadamente 1.
• Centrifugar el cultivo durante 10 min a 3000g y 4°C en tubos estériles.
• Desechar el sobrenadante y hacer dos lavados con PBS 1X para la eliminación
del BSA presente en el medio 7H9.
• Resuspender el pellet en solución de lisis proporcionalmente.
• Añadir 200 µL de pellet resuspendido a un tubo de Mini BeadBeater estéril que
contenga 100 µL de bolitas acid-washed de 0.1 mm de diámetro (Sigma).
• Someter las células a 3 pulsos de 1 min a velocidad máxima en el Mini
BeadBeater (Biospec), con 1 min de reposo en hielo entre cada pulso.
• Centrifugar a 3000g durante 5 min para separar las bolitas y células no lisadas.
• Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf y filtrar los extractos proteicos
con las unidades de filtrado por centrifugación Ultrafree-MC con membrana de
PVDF de 0.22 µm de diámetro de poro (Millipore) para poder realizar el resto
del proceso fuera del laboratorio de bioseguridad.
• Cuantificar y utilizar inmediatamente o congelar a -80°C
Solución de lisis
Urea (Sigma) 7M
Tiourea (GE-Health care) 2M
CHAPS (Sigma) 4% (v/v)
ASB-14 (Sigma) 4% (v/v)
Pesar 21.02 g de urea, 7.61 g de Tiourea, 2 g de CHAPS y 2 g de ASB-14; disolver en

agitación en agua Chromasolv® grado HPLC (Sigma) en un vaso de precipitados de
plástico para evitar la precipitación de la urea en vasos de cristal y ajustar a 50 mL;
alicuotar y congelar a -20°C.
3.6.2. Determinación de la concentración de proteínas
Para determinar la concentración de proteínas se utilizó el Coomassie® Protein

Assay Reagent Kit (Pierce), el cual se basa en el método colorimétrico descrito por
Bradford [214]. Cuando el colorante Coomassie® se une a las proteínas en un medio
ácido sufre un cambio de color de marrón a azul desplazándose su máximo de
absorbancia de 465 nm a 595 nm. La concentración de proteína de la muestra se
97
calcula comparando las absorbancias obtenidas con una recta patrón hecha con
estándares de concentración conocida de BSA que se procesan junto con la muestra.
Procedimiento
• Separar protegiendo de la luz la cantidad necesaria del reactivo Coomassie®

(Bradford) previamente agitado y atemperar a temperatura ambiente.
• Prepara la recta patrón por duplicado en placas de 96 pozos, como sigue:
[BSA] µ g/mL 0 3 6 8 10 12 14 17 20
µ L BSA diluída* 0 15 30 40 50 60 70 85 100
µ L H 2O 100 85 70 60 50 40 30 15 0
*La dilución a realizar es 1/100 a partir del stock a 2 mg/mL
• Hacer diluciones de la muestra hasta encontrarse dentro del rango de 0 a 20

µg/mL.
• Poner 100 µL de la muestra diluida y 100 µL del reactivo de Coomassie®
(Bradford).
• Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente.
• Medir la absorbancia a 620 nm en un lector de placas. Todas las muestras se
cuantificaron como mínimo por duplicado.
• Calcular la recta de regresión con los valores de la recta patrón y determinar la
concentración de proteínas de la muestra extrapolando a la recta patrón
obtenida.
3.6.3. Electroforesis de proteínas
Los extractos proteicos se separaron mediante geles de poliacrilamida con

SDS (SDS-PAGE). Esta técnica, basada en la separación proteica en función de su
peso molecular, fue descrita por Laemmli en 1970 [215], en donde las proteínas son
desnaturalizadas por temperatura (100°C) en presencia de un detergente (SDS) y
agente reductor (β-mercaptoetanol) que rompe los puentes disulfuro. El detergente
aniónico SDS permite que las proteínas adquieran una carga superficial negativa que
hace que migren hacia el ánodo en presencia de un campo eléctrico; de esta manera,
las proteínas migran en función de su peso molecular.
El gel de electroforesis tiene dos partes, la parte superior del gel o stacking
contiene una porción de acrilamida más baja y se prepara con un tampón de baja
98
fuerza iónica y de pH diferente que el gel inferior o de separación. La función del gel
superior es favorecer la migración rápida de las proteínas que se concentran en la
intersección con el gel de separación para que entren a la vez. La visualización de los
geles se realizó mediante la tinción con el colorante azul de Commassie.
En este trabajo se hicieron geles con un grosor de 1.5 mm. El equipo de electroforesis
utilizado fue el Mini-PROTEAN® Tetra System (BIO-RAD) y una fuente de
alimentación POWER-PAC 300 (BIO-RAD).
Procedimiento
• Limpiar los cristales, soportes y separadores con etanol al 70%, secarlos y

montarlos según las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
• Preparar el gel inferior de acuerdo a la tabla 3.5.
• Mezclar e introducir la disolución entre los vidrios hasta llenar ¾ partes.
• Añadir con mucha precaución una pequeña capa de Isopropanol para evitar la
inhibición de la polimerización de la acrilamida por parte del oxigeno y dejar
polimerizar.
• Eliminar el Isopropanol por decantación y lavar con agua destilada y escurrir
• Preparar el gel superior de acuerdo a la tabla 3.5.
• Mezclar e introducir la disolución entre los cristales, colocar el peine de 1.5 mm
de grosor y dejar polimerizar.
• Mezclar las muestras con el tampón de carga 5X y calentarlas a 100°C durante
5 min.
• Centrifugar brevemente y poner las muestras en hielo.
• Sacar el peine del gel superior y colocar el soporte con el gel en la cubeta de
electroforesis. Añadir tampón de electroforesis 1X, llenando previamente el
depósito interior.
• Sembrar un máximo de 20 µL de muestra y 5 µL de marcador de peso
molecular BenchMark™ (Invitrogen).
• Conectar la cubeta a la fuente de alimentación ajustando el amperaje a ~10
mA/gel hasta que las proteínas bajen completamente el gel superior,
posteriormente subir el amperaje a ~20 mA/gel hasta que el frente de azul de
bromofenol del tampón de carga sale por la parte inferior del gel.
• Una vez finalizada la electroforesis se saca el soporte y con cuidado el gel.
• Colocar el gel en una cubeta con la solución de Coomassie y mantenerlo en
agitación lenta durante 20 min.
99
• Descartar el colorante y desteñir el gel con solución decolorante en agitación

lenta durante 1 hora o hasta que se visualicen correctamente las bandas de
proteínas.
• Detener la decoloración lavando el gel con agua destilada.
Tabla 3.5. Concentraciones de geles SDS-PAGE.*30% Acrilamida/Bisacrilamida Solución

37.5:1 (BioRad).
10% 12% 12,5% 15,0%
Concentración Gel Inf Sup Inf Sup Inf Sup Inf Sup
Agua 3.96 mL 1.944 mL 3.56 mL 1.944 mL 3.46 mL 1.944 mL 2.96 mL 1.944 mL
Buffer inferior 2 mL ------- 2 mL ------- 2 mL ------- 2 mL -------
Buffer superior ------- 750µL ------- 750µL ------- 750µL ------- 750µL
Acril/Bis * 2 mL 300µL 2.4 mL 300µL 2.5 mL 300µL 3 mL 300µL
PSA 10% 40µL 40µL 40µL 40µL 40µL 40µL 40µL 40µL
TEMED 4µL 4µL 4µL 4µL 4µL 4µL 4µL 4µL
Soluciones
Buffer gel inferior (4X)
Tris Base 91 g
SDS 2g
Disolver en 300 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 8.8 con HCl. Añadir agua
destilada hasta un volumen final de 500 mL. Filtrar la solución con filtros de 0.45 µm
de diámetro de poro y guardar a 4ºC.
Buffer gel Superior (4X)
Tris-HCl 6.05 g
SDS 0.4 g
Disolver en 40 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 6.8 con HCl. Añadir agua

destilada hasta un volumen final de 100 mL. Filtrar la solución con filtros de 0.45 µm
de diámetro de poro y guardar a 4ºC.
Persulfato de amonio al 10%
Disolver 1 g de persulfato amónico en 10 mL de agua. Hacer alícuotas de 100 µL y

congelar a −20ºC. Cuando se vaya a usar descongelar lentamente en hielo y mantener
siempre en hielo.
100
Tampón de carga 5X
Añadir a 3.8 mL de agua desionizada estéril
TrisHCl 0.5 M pH 6.8 1 mL

Glicerol 0.8 mL
SDS 10% (p/v) 1.6 mL
Azul de bromofenol 0.4 mL
β-mercaptoetanol 0.4 mL
Hacer alícuotas de 500 µL y congelar a −20ºC.
Tampón de electroforesis 10X

Tris Base 30.29 g
Glicina 144.1 g
SDS 10 g
Disolver en agua destilada ajustando el volumen final a 1 L. Diluir 10 veces en agua

destilada para obtener la solución de trabajo. Conservar a 4ºC.
Solución de Coomassie
Coomassie Brilliant Blue R-250 2.5 g

Metanol 500 mL
Ácido acético glacial 100 mL
Agua Hasta 1 L
Guardar a temperatura ambiente protegido de la luz.
Solución decolorante
Mezclar con 100 mL de ácido acético glacial con 900 mL de agua. Guardar a
temperatura ambiente.
3.6.4. Geles bidimensionales (2DE)
La electroforesis bidimensional en combinación con la espectrometría de

masas es el método clásico usado para monitorear la dinámica de la abundancia de
una proteína en sistemas biológicos bajo unas condiciones definidas [20]. Este sistema
combina dos métodos diferentes de separación que son el isoelectroenfoque (IEF) en
la primera dimensión, en el cual las proteínas son separadas de acuerdo a su punto
isoeléctrico (pI) y el SDS-PAGE en la segunda dimensión en la que se separan las
101
proteínas de acuerdo a su peso molecular [216]. En este trabajo se realizaron geles

bidimensionales con el fin de comprobar la sobreproducción de la dioxigenasa
Rv3161c y del transportador Rv1686c-Rv1687c clonados en el vector pMV261 [199]
así como la detección del perfil proteico en cultivos de M. tuberculosis tratados y no
tratados con TRC como ha sido previamente descrito a nivel transcripcional [129, 189].
Con el fin de evitar contaminaciones se requiere tomar ciertas medidas, entre ellas:
• Trabajar siempre con guantes y evitar la contaminación por queratinas

presentes en piel, cabello o ropa.
• Usar guantes sin polvo, preferentemente de nitrilo o vinilo.
• Usar reactivos de la máxima pureza posible.
• Usar agua bidestilada (Milli-Q) o de pureza superior (grado HPLC).
• Evitar calentar la muestra por encima de los 30°C con el fin de prevenir la
degradación de la úrea a isocianato que modificaría las cadenas laterales de
los aminoácidos modificando por lo tanto el punto isoeléctrico de las proteínas.
• Trabajar con muestras libres de contaminantes.
3.6.4.1. Obtención de extractos proteicos para 2DE
La obtención de extractos proteicos para 2DE es un punto crítico en la

obtención de geles de buena calidad. Muchos componentes celulares como lípidos,
DNA y RNA así como la presencia de sales y azucares en la muestra pueden afectar
los resultados obtenidos. El método utilizado ha sido adaptado a partir del
recomendado por GE Healthcare.
Procedimiento:
• Inocular una colonia de M. tuberculosis en 10 mL de medio Middlebrook

7H9+Tween e incubar durante 2 o 3 semanas a 37°C.
• Hacer una resiembra 1/100 en los mL deseados de medio Middlebrook
7H9+Tween e incubar a 37°C hasta que el cultivo alcance una fase
exponencial o estacionaria según se requiera.
• Centrifugar el cultivo durante 10 min a 3000 g y 4°C en tubos estériles.
• Desechar el sobrenadante y hacer dos lavados con PBS 1X estéril.
• Resuspender el pellet en solución de lisis* proporcionalmente.
• Sonicar en hielo con un homogenizador ultrasónico LABSONIC U (B. Braun)
con una sonda de aguja de titanio durante 5 min con una amplitud de 40% en
ciclos de 30 s ON/ 60 s OFF. Alternativamente se puede lisar con Mini
102
BeadBeater (Biospec), pero en nuestro caso este sistema no fue muy efectivo
dado que la concentración proteica obtenida fue muy baja.
• Centrifugar a 3000g durante 5 min para separar las células no lisadas
• Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf y filtrar los extractos proteicos
con las unidades de filtrado por centrifugación Ultrafree-MC con membrana de
PVDF de 0.22 µm de diámetro de poro (Millipore) para poder realizar el resto
del proceso fuera del laboratorio de bioseguridad.
• Cuantificar y utilizar inmediatamente o congelar a -80°C
*La solución de lisis utilizada fue previamente descrita en el apartado 3.6.1.
3.6.4.2. Determinación de la concentración de proteínas para 2DE
Para la cuantificación de las muestras se utilizó el kit 2-D Quant de GE

Healthcare; un sistema que está basado en la unión específica de iones de cobre a las
proteínas. Las proteínas precipitadas son resuspendidas en una solución que contiene
cobre y el cobre no unido es medido con un agente colorimétrico. La densidad de color
es inversamente proporcional a la concentración de proteína.
Procedimiento:
• Preparar un volumen requerido de solución de trabajo “color reagent”,

mezclando 100 partes de reactivo A con 1 parte de reactivo B.
• Preparar la curva estándar por duplicado como sigue:
Número de tubos 1 2 3 4 5 6
Volumen de solución estándar 0 µL 5 µL 10 µL 15 µL 20 µL 25 µL

BSA 2mg/mL
Concentración de Proteína 0 µg 5 µg 10 µg 15 µg 20 µg 25 µg
• Poner en tubos eppendorf 1 µL, 2 µL, 5 µL y 10 µL de muestra por duplicado.

• Añadir 500 µL de solución precipitante a cada tubo eppendorf (incluyendo los
tubos eppendorf de la curva estándar). Mezclar con vórtex e incubar 2-3 min a
temperatura ambiente.
• Añadir 500 µL de solución co-precipitante a cada tubo eppendorf y mezclar con
vórtex.
• Centrifugar por lo menos a 10000 g durante 5 min para sedimentar las
proteínas.
• Remover rápidamente los tubos eppendorf de la centrífuga y decantar los
sobrenadantes con cuidado de no perder los pellets.
103
• Volver a poner las muestras en la centrífuga y dar un pulso de centrífuga,

remover con micropipeta los sobrenadantes restantes. Es importante eliminar
completamente el sobrenadante para evitar posteriores interferencias.
• Añadir 1 mL de la solución de trabajo “color reagent” y mezclar asegurándose
de que la solución se mezcle instantáneamente.
• Incubar a temperatura ambiente durante 15-20 min.
• Leer la absorbancia a 480 nm usando agua como blanco. La absorbancia se
debe leer dentro de los 40 min después de la adición de la solución de trabajo.
• Calcular la recta de regresión con los valores de la recta patrón y determinar la
concentración de proteínas de la muestra extrapolando a la recta patrón
obtenida.
3.6.4.3. Limpieza de la muestra para el IEF
Para la limpieza de las muestras se usó el kit 2-D Clean-Up de GE Healthcare,

donde las proteínas son precipitadas dejando en suspensión sustancias como
detergentes, sales, lípidos, ácidos nucleicos o compuestos fenólicos; las proteínas son
entonces resuspendidas en solución de lisis.
Procedimiento:
• Transferir 1 µL-100 µL de muestra equivalente a una cantidad de proteína de

de 100 µg a un tubo eppendorf.
• Añadir 300 µL de solución precipitante y mezclar bien con vórtex o mediante
inversión e incubar en hielo durante 15 min.
• Añadir 300 µL de solución co-precipitante y mezclar bien con vórtex.
• Centrifugar por lo menos a 12000 g durante 5 minutos.
• Remover rápidamente los tubos eppendorf de la centrífuga y decantar los
sobrenadantes.
• Volver a poner las muestras en la centrífuga cuidadosamente y dar un pulso,
remover con micropipeta los sobrenadantes.
• Añadir 40 µL de solución co-precipitante e incubar en hielo durante 5 minutos.
• Reposicionar en la centrifuga y centrifugar durante 5 min, remover el
sobrenadante.
• Añadir 25 µL de agua destilada o desionizada y mezclar con vórtex durante 5-
10 s asegurándose de la completa dispersión del pellet.
104
• Añadir 1 mL de wash Buffer previamente enfriado por lo menos 1 hora a -20°C

y 5 µL de wash additive, mezclar por vórtex hasta que el pellet se disperse
completamente.
• Incubar los tubos eppendorfs a -20°C mezclando mediante vórtex durante 20-
30 s cada 10 min durante 30 min como mínimo. En este punto, las muestras se
pueden guardar a -20°C como máximo una semana.
• Centrifugar durante lo menos a 12000 g durante 5 minutos.
• Descartar el sobrenadante y dejar secar el pellet durante 5 min sin exceder
este tiempo ya que un exceso de sequedad comportaría una difícil disolución.
• Resuspender el pellet en 100 µL de solución de lisis que contenga 20 mM del
agente reductor Ditiotreitol (DTT) (Sigma) que rompe puentes disulfuro
presentes y mantiene las proteínas en su estado reducido, IPG buffer al 0.5%
(GE Healthcare) que potencia la solubilidad y minimiza la agregación de las
proteínas y una punta de espátula de azul de bromofenol (GE Healthcare);
éstos deben ser añadidos justo antes de usar.
• Mezclar mediante vórtex e incubar durante 1 h y 30 min a temperatura
ambiente.
• Centrifugar como mínimo a 12000 g durante 5 minutos para eliminar cualquier
material insoluble.
• Cargar el sobrenadante en la primera dimensión o congelar a -80°C.
3.6.4.4. Primera dimensión (IEF)
Rehidratación de las tiras de IEF
En este trabajo se usaron tiras de gradiente de pH inmovilizado (IPG) de GE

Healthcare de 24 cm que permiten la separación proteica de acuerdo a su punto
isoeléctrico. Estas tiras se suministran deshidratadas por lo cual deben ser
rehidratadas.
Procedimiento:
• Añadir al “IPGstrip Holder” (GE Healthcare) 450 µL de solución de lisis que

contenga 12 µL de Destreak Reagent (GE Healthcare) que ayuda a evitar la re-
formación de los puentes disulfuro, IPG buffer al 0.5% (GE Healthcare) y una
punta de espátula de azul de bromofenol (GE Healthcare); éstos deben ser
añadidos justo antes de usar.
105
• Retirar el plástico de protección de la tira de IEF, manipulándolas con guantes

y pinzas.
• Colocar la tira en el “IPGstrip Holder” con la parte que lleva la acrilamida
deshidratada cara abajo sobre la solución de lisis sin que queden burbujas (Fig.
3.2).
• Cubrir la tira con 2 mL de aceite mineral (GE Healthcare) para evitar
evaporación del agua durante el proceso de rehidratación.
Figura 3.2. Posicionamiento de la tira IPG en el IPGstrip Holder.
• Dejar a temperatura ambiente como mínimo durante 12 horas a una

temperatura no superior a los 30°C sobre una superficie completamente plana.
Idealmente se debe rehidratar a media tarde y dejarlo toda la noche.
Isoelectroenfoque (Primera dimensión)
El IEF se realizó con el sistema “Ettan™ IPGphor™ Cup loading Manifold” de

GE Healthcare con la unidad electroforética Ettan IPGphor 3. En este sistema el IEF
se hace con el gel cara arriba y la muestra es aplicada en una copa lo que proporciona
mejores resultados y una mayor resolución en cantidades de proteína superiores a 1
mg.
Procedimiento:
• Colocar el manifold (placa de cerámica con óxido de aluminio que permite la

transferencia de calor eficientemente) en la unidad electroforética Ettan
IPGphor como muestra la figura 3.3.
Figura 3.3. Posición del Manifold en el IPGphor. Tomado de [217].
106
• Colocar las tiras previamente rehidratadas en los carriles del manifold cara
arriba, alineándolas con ayuda de unas pequeñas guías que tiene el manifold
como muestra la figura 3.4A.
• Colocar las copas como muestra la figura 3.4B, preferiblemente en el cátodo
donde se realizará la carga de la muestra y nunca sobre las guías del manifold;
las copas no deben perder líquido por lo que antes de cargar la muestra es
recomendable llenarlas con aceite mineral y esperar un rato para asegurarse
de que hayan quedado bien colocadas.
• Colocar dos tiras de papel (Paper wick, GE Healthcare) por tira de IPG
impregnadas con 150 µL de agua Milli-Q tanto en el ánodo como en el cátodo
(Fig. 3.4B) de manera que quede una pequeña zona de contacto papel-
acrilamida como muestra la figura 3.4C. Se recomienda cambiar los papeles
varias veces durante el IEF, ya que estos se van impregnando de
contaminantes a medida que el isoelectroenfoque tiene lugar.
A B
Figura 3.4. A) Placa y posición de las tiras. B). Posición de las copas y las tiras de papel en la
placa. C) Posición de las tiras de papel y el electrodo. Tomado de [217].
107
• Cubrir con aceite mineral con el fin de evitar evaporación del agua durante el
proceso.
• Colocar los electrodos sobre las tiras de papel como se muestra en la figura
3.4C y la figura 3.5 y cerrarlos.
Figura 3.5. Posición del electrodo sobre las tiras de papel. Tomado de [217].
• Cargar la muestra y verificar que no hayan pérdidas por mala posición de las
copas.
• El IEF se realizó a 20°C y 25-75 µA / tira bajo unas condiciones que variaron en
función del rango de pH de la tira utilizada, como sigue:
Geles pH 3-10:
-100V: 3 horas en gradiente

-500V: 1 hora
-1000V: 1 hora
-8000V: 6 horas
Geles pH 4-7

-500V: 1 hora
-1000V: 1 hora
-8000V: 6 horas
108
Geles pH 6-9

-500V: 1 hora
-10000V: 1 hora en gradiente
-10000V: 3 horas
Geles pH 7-11

-500V: 1 hora
-10000V: 1 hora en gradiente
-10000V: 8 horas
Equilibrado de tiras
El equilibrado de las tiras se realizó con el fin de reducir y alquilar los puentes
disulfuros que pudieron quedar oxidados, así como también sustituir los detergentes
no-iónicos por SDS para levar a cabo la segunda dimensión.
Procedimiento:
• Añadir a un tubo que contenga 10 mL de solución de equilibrado 100 mg de

DTT (Sigma) y mezclar hasta disolver.
• Añadir a un tubo que contenga 10 mL de solución de equilibrado 250 mg de
Iodoacetamida (Sigma) y mezclar hasta disolver.
• Romper con un objeto contundente una pipeta de plástico de 25mL para cultivo
celular en el extremo que tiene el trozo de algodón, con el fin de tener los dos
extremos abiertos. Preferiblemente hacerlo sin sacar la pipeta de su envoltura.
• Cerrar el extremo más angosto con Parafilm®.
• Introducir la tira de isoelectroenfoque en la pipeta de modo que el lado que
tiene la acrilamida quede cara arriba.
• Añadir a la pipeta la solución de equilibrado con DTT, cerrar el extremo abierto
con Parafilm® e incubar durante 15 min en agitación suave.
• Descartar la solución de equilibrado con DTT y reemplazarla con la que
contiene Iodoacetamida, cerrar el extremo abierto con Parafilm® e incubar
durante 15 min en agitación suave.
109
• Retirar la tira y proceder inmediatamente con la segunda dimensión para evitar

la difusión de las proteínas o alternativamente congelar a -80°C.
Soluciones
Solución de Equilibrado
Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 50 mM

Urea 6M
Glicerol 99% 30% (v/v)
SDS 2% (p/v)
Azul de Bromofenol granos
Pesar 144.14 g de urea y 8 g de SDS, disolverlos en un vaso de precipitados de

plástico con 13.4 mL de Tris-HCL, 120 mL de glicerol y ajustar el volumen a 400 mL
con agua Milli-Q. Añadir pocos granos de azul de bromofenol, mezclar. Hacer
alícuotas de 10 mL y congelar a -20°C.
3.6.4.5. Segunda dimensión
La segunda dimensión se hizo en el sistema Ettan DALTsix con geles de

acrilamida al 12.5% con unas medidas de 25.5 X 20.5 cm, compatibles con las tiras de
isoelectroenfoque de 24cm.
Preparación de geles de acrilamida 2DE
Procedimiento:
• Limpiar con etanol los cristales y separadores, secarlos y montarlos como

muestra la figura 3.6.
Hojas de relleno
Canal de relleno
Hojas de separación
Cassette del gel Placa frontal
Bisagra del cassette
Pinzas con resorte(6)
Tornillo de fijación
Figura 3.6. Esquema equipamiento para geles 2DE. Tomado de [218].
110
• Preparar las soluciones de acrilamida/bisacrilamida, SDS, TEMED, Persulfato y

TRIS-HCl, mezclar e introducir en el montaje.
• Añadir 2 mL de isopropanol o n-butanol en la parte superior de cada gel para
asegurar un frente recto y dejar polimerizar.
• Eliminar el isopropanol o n-butanol, desmontar y lavar con agua destilada.
• Usar inmediatamente o envolver los geles en papel film con tampón de
electroforesis 1X y almacenar a 4°C.
Soluciones
Solución de Acrilamida al 12.5% para 6 geles
Concentraciones finales
Solución Acrilamida/Bisacrilamida (Sigma) 30.8% (p/v)

Tris HCl 1.5 M, pH 8.8 0.37 M
SDS (Sigma) 10%
Persulfato de amonio (Sigma) 10%
TEMED 10%
Pesar 56.4 g de Acrilamida y 1.5 g de Bisacrilamida, disolver en agitación con agua

Milli-Q y ajustar a 188 mL. Esta solución debe prepararse en cabina de extracción
dado la toxicidad de la acrilamida. Mezclar la solución de acrilamida/bisacrilamida con
4.5 mL de SDS (0.45 g en 4.5 mL de agua), 113 mL de Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 (recién
preparado), 4.5 mL de Persulfato de amonio (0.45 g en 4.5 mL de agua Milli-Q) y 0.62
mL de TEMED (62 µL temed+558 µL de agua Milli-Q).
Montaje de la tira de Isoelectroenfoque en el gel
• Retirar el exceso de la segunda solución de equilibrado, aclarando con tampón

de electroforesis 1X.
• Introducir la tira de isoelectroenfoque entre los cristales del gel como se
muestra en la figura 3.7.
111
Figura 3.7. Esquema posicionamiento de la tira en el gel. Tomado de [218].
• Después de colocar la tira entre los cristales, con la ayuda de una regla como
muestra la figura 3.8A, empujar suavemente la tira de modo que ésta quede en
contacto “intimo” con el gel, teniendo la precaución de no dejar burbujas entre
la tira de isoelectroenfoque y el gel, así como evitar algún tipo de rotura o
rasgadura de la tira.
A B
Figura 3.8. A) Esquema posicionamiento de la tira en el gel. B) Sellado de las tiras con
solución de agarosa. Tomado de [217].
• Recortar una tira pequeña de papel Whatman e impregnar un extremo con 5 µL

de marcador BenchMark™ (Invitrogen), dejar secar y poner 15 µL de solución
de sellado, secar y colocar esta tira en el extremo de derecho de la tira
(cátodo).
• Colocar el gel en posición vertical sobre un soporte y añadir la solución de
sellado previamente fundida (evitando que esté muy caliente) como muestra la
figura 3.8B.
• Llenar el tanque de la cámara de electroforesis con 5 L de tampón de
electroforesis 1X e introducir los geles que previamente se han colocado en el
ánodo.
• Colocar el cátodo y llenarlo con 1200 mL de tampón de electroforesis 3X.
112
• Con ayuda de un embudo preferiblemente, equilibrar los tampones como indica

la figura 3.9 con el fin de establecer un balance hidrostático.
MAX línea llenado

MIN línea llenado
Figura 3.9. Esquema del llenado del tanque. Tomado de [218].
• Cerrar el equipo y aplicar corriente eléctrica tal y como indica la siguiente tabla:
Paso Intensidad (mA/Gel) Voltaje (V) Potencia (W/Gel) Tiempo (h)

1 10 80 1 1
2 40 500 13 4-6
El primer paso se hace a poca potencia con el fin de permitir una buena
transferencia entre la primera y la segunda dimensión, aproximadamente durante 1
hora; posteriormente se continúa con el segundo paso. Los geles se detuvieron 40 min
después de que el frente azul salió por el extremo inferior de los geles e
inmediatamente se procedió a desmontarlos para fijarlos siendo éste el primer paso de
la tinción con plata.
Soluciones
Solución de sellado
Agarosa 0.125 g
Tampón electroforesis 1X 25 mL
Azul de bromofenol granos
Fundir la agarosa en el tampón de electroforesis y añadir el azul de bromofenol,

mezclar y alicuotar. Guardar a temperatura ambiente.
3.6.4.6. Tinción con plata
La tinción con plata es uno de los métodos de tinción más sensibles y

económicos de los que se dispone actualmente. Esta tinción implica varios pasos en
los que se usan una serie de reactivos que deben ser de alta calidad. Cuando un gel
113
de poliacrilamida es bañado en una solución que contiene iones de plata (Ag+) y es

revelado por el tratamiento con un reductor, éste promueve la reducción de los iones
de plata a plata metálica (Ag0) la cual es insoluble y visible. Uno de los inconvenientes
de esta tinción es la modificación química de las proteínas lo que imposibilita la
implementación de técnicas como la espectrometría de masas para su identificación;
por lo anterior el protocolo de tinción debe ser modificado para que éste sea
compatible con espectrometría de masas [217, 219, 220].
Procedimiento:
PASO SOLUCIONES VOLUMEN TIEMPO

FIJACIÓN* Etanol Absoluto 400 mL 30 min
Acido acético 100 mL
glacial Hasta 1 L
Agua destilada
SENSIBILIZACIÓN Etanol Absoluto 300 mL 30 min
Tiosulfato de 2g
sodio 68 g
Acetato de sodio Hasta 1 L
Agua destilada
LAVADO Agua destilada 1L 3X5
min
REACCIÓN CON Nitrato de Plata 2.5 g 20 min
PLATA Agua destilada Hasta 1 L
min
REVELADO Carbonato de 50 g 4min
sodio 800 µL
Fromaldehido Hasta 2 L
37%**
Agua destilada
PARADA EDTA-Na2 14.6 g 10 min
Agua destilada Hasta 1L
min
PRESERVACIÓN Glicerol (87%) 100 mL 30 min
Agua destilada Hasta 1 L
*El paso de fijación se puede prolongar hasta tres días.

**Debe añadirse justo antes de utilizar la solución y el tiempo de revelado podrá variar
y se parará en el momento en el que se alcance el contraste deseado.
• Posterior a la tinción con plata, los geles fueron escaneados para posterior
análisis.
3.6.4.7. Análisis de Imágenes
El análisis de imágenes se realizó en colaboración con el grupo de Biologia

Computacional i Proteòmica de la UAB, con el programa Samespot de Nonlinear
114
Dynamics; una vez hecho, se seleccionaron los spots diferenciales para ser analizados
mediante espectrometría de masas.
3.6.4.8. Extracción de spots
Una vez seleccionados los spots, éstos deben extraerse del gel y para ello se
usan puntas de una pipeta recortadas a un diámetro similar al de los spots. En este
paso es sumamente importante el uso de guantes y bata para, así como trabajar en
cabina de flujo laminar con el fin de evitar contaminación con queratinas.
Posteriormente se procede a desteñir los spots.
3.6.4.9. Desteñido de spots
Procedimiento:
• Añadir 200 µL de solución de desteñido a cada tubo eppendorf que contiene el

spot.
• Proteger de la luz ya que la solución de desteñido es fotosensible e incubar
durante 20 min a temperatura ambiente.
• Descartar la solución de desteñido y añadir 200 µL de agua Chromasolv®
grado HPLC (Sigma) e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
• Repetir el paso anterior hasta que el spot quede completamente transparente.
Soluciones
Solución de desteñido
A. Ferricianuro de potasio 30 mM
B. Tiosulfato de sodio 100 mM
Pesar 0.0998 g de ferricianuro de potasio y disolverlos en 10 mL de agua

Chromasolv® grado HPLC (Sigma), mezclar y proteger de la luz. Pesar 0.2482 g de
tiosulfato de sodio y disolverlos en 10 mL de agua Chromasolv® grado HPLC (Sigma).
Mezclar la solución de ferricianuro de potasio (A) con la de tiosulfato de sodio (B) en
una proporción de 1:1. Esta solución debe preparase antes de usar.
3.6.4.10. Digestión enzimática
La digestión enzimática es un paso esencial para la identificación de proteínas

mediante la técnica conocida como huella peptídica; para ello se utilizan enzimas que
generan péptidos que posteriormente son identificados en el MALDI. En este trabajo la
digestión se realizó con tripsina. Esta enzima proteolítica, corta en las posiciones del
115
carboxilo de residuos Arginina (Arg, R) o Lisina (Lys, K) en la cadena siempre y

cuando no haya una Prolina (Pro, P) en el extremo N-terminal de la proteína. La
tripsina genera el mismo patrón de péptidos de una proteína, este patrón se conoce
como huella peptídica o PMF (Peptide mass fingerprint). Para la digestión enzimática
se usó el equipo DigestPro MSi (Intavis) siguiendo las especificaciones del fabricante.
3.6.4.11. Purificación de la muestra
Una vez finalizada la digestión, se debe purificar la muestra con el fin de

eliminar contaminantes que se pueden incorporar en el proceso de digestión; para ello
se usaron los ZipTip® Pipette Tips (Millipore) que son puntas de pipeta con una resina
de fase reversa C18 en donde los péptidos quedan capturados y después de unos
lavados son eluidos en un volumen deseado.
Procedimiento:
• Pipetear 4 veces con 15 µL ACN al 100%

• Pipetear 4-6 veces con 15 µL TFA al 0.2%
• Pipetear 4-6 veces con 15 µL de muestra
• Pipetear 4-6 veces con 15 µL TFA al 0.2%
• Pipetear 5 µL de ACN 50%+TFA 0.1%
• Tomar 1 µL de matriz HCCA y 1 µL de muestra, mezclar y poner en la placa
GroundSteel (Bruker Daltonics) del MALDI-TOF.
Soluciones
Matríz
Preparar una disolución saturada de HCCA (ácido α-ciano-4-hidroxicinámico)

pesando 5 mg de HCCA (Bruker Daltonics) y disolverlos en 333.3 µL de ACN 100%
grado HPLC (Sigma)+566.6 µL de agua Chromasolv® grado HPLC (Sigma)+100 µL
TFA 1% (Sigma). Mezclar con vórtex e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
Es recomendable preparar la matriz con frecuencia y utilizar el mismo tubo eppendorf.
3.6.5. Espectrometría de masas
Para la identificación de las proteínas por huella peptídica se empleó la

espectrometría masas tiempo de vuelo, ionización/ desorción mediante láser asistida
por matriz (MALDI-TOF), la cual permite conocer con exactitud las masas moleculares
de los péptidos generados mediante la digestión con una enzima proteolítica, que
116
posteriormente son comparadas con una base de datos. La proteína puede ser
identificada correctamente si hay un número suficiente de coincidencias con la base de
datos produciendo un alto score, de esta forma se evita falsos positivos [221]. Esta
parte del trabajo fue realizada en colaboración con el grupo de Biologia Comptacional i
Proteòmica de la UAB, utilizando un equipo Ultraflex eXtreme™ (Bruker Daltonics).
Descripción del sistema
La espectrometría de masas láser de desorción/ionización asistida por matriz

(MALDI-TOF) permite conocer exactamente la distribución de las masas moleculares
de una muestra. Con esta tecnología se detectan y caracterizan biomoléculas como
proteínas péptidos y oligosacáridos de masas entre 400 y 350.000 Da. Es un método
muy sensible que permite detectar pequeñas cantidades de muestra (10-15 a 10-18
mols) con una precisión de 0.1-0.01%. La identificación de proteínas mediante esta
técnica tiene la ventaja que utiliza tiempos de análisis muy cortos (pocos minutos) y un
consumo mínimo de muestra (menos de 1pmol), además de proporcionar información
de microheterogenidades (ej. Glicosilaciones) y la presencia de productos
secundarios. La precisión en la determinación de la masa molecular mediante este
espectrómetro de masas es suficiente como para caracterizar proteínas después de su
digestión tríptica siempre y cuando el genoma del cual proviene la muestra esté
completamente secuenciado y depositado en las bases de datos.
Para poder analizar la muestra en el MALDI-TOF, ésta debe mezclarse con un

compuesto que sea capaz de absorber la luz UV, a este compuesto se le conoce como
matriz; la matriz adecuada para el análisis de péptidos es la HCCA (ácido α-ciano-4-
hidroxicinámico). Una vez están la muestra y la matriz mezcladas, se deposita la
mezcla sobre una placa GroundSteel (Fig. 3.10) y se deja secar quedando la matriz y
la muestra en forma de cristales. Estas placas se caracterizan por que en cada
posición de la placa hay una superficie hidrofílica rodeada de una zona hidrofóbica, lo
que permite que la muestra se concentre en una superficie muy pequeña que puede
variar de 200 a 800 µm.
Figura 3.10. Imagen de la Placa del MALDI-TOF. Tomado de [222].
117
La placa es introducida en la cámara de ionización del MALDI que dispone de

una bomba de vacio para poder extraer todo el aire de la cámara. Una vez dentro de la
cámara, al hacer incidir en la muestra un haz de luz láser (330-360 nm) con
pulsaciones de nanosegundos, la matriz absorbe la energía a la que la exponemos y
esta energía es transferida al analito. De esta manera, la matriz ioniza la muestra y los
péptidos ionizados quedan dispersos en el vacio de la cámara (desorción/ionización)
tal y como se muestra en la figura 3.11.
Figura 3.11. Esquema de la ionización de las partículas en el MALDI. Tomado de [223].
La cámara donde se coloca la placa con las muestras se encuentra entre dos
electrodos, un cátodo y un ánodo. Al estar la muestra ionizada con cationes, la
muestra migrará hacia el ánodo. El detector se encuentra por detrás del ánodo. La
resolución de estos equipos depende en gran medida de la longitud del tubo de vuelo.
Una forma elegante de alargar el recorrido de los iones sin incrementar la longitud del
tubo es colocar un detector, conocido como detector reflector, a mitad de recorrido del
tubo de vuelo. Utilizando este detector los iones rebotan en el detector lineal y son
detectados por el detector reflector (Fig. 3.12).
Cátodo Zona de vuelo Ánodo
Detector lineal
Placa de Detector Reflector

muestras reflector
Figura 3.12. Esquema del espectrómetro de masas MALDI-TOF. Tomado de [224].
118
En la mayoría de los casos sólo hay una carga positiva en cada péptido, por lo
que si se aplica la misma fuerza eléctrica sobre cada molécula cuando está presente
en un campo eléctrico de dos electrodos y siguiendo la ley de Newton:
Fuerza (F) = masa (m) x aceleración (a); a = F/m
Para una fuerza concreta, cuanto más grande es la masa, más pequeña es la
aceleración. Es decir, los péptidos de mayor tamaño colisionaran más tarde en el
detector que aquellos péptidos cuyas masas sean menores. Todas los péptidos que
colisionan en el detector a la vez (misma masa) generan un pico y su magnitud es
proporcional al número de péptidos que colisionan a la vez.
Para la identificación de proteínas mediante la técnica de la huella peptídica es

necesario que la calibración del espectrómetro sea lo más precisa posible. Con tal
objetivo, las muestras se prepararon alternando una muestra con un marcador de
masa molecular (Bruker Daltonics) compuesto de:
Péptido Masa molecular (Da)

Angiotensina II 1046.5418
Angiotensina I 1296.6848
Sustancia P 1347.7354
Bombesina 1619.8223
ACTH_clip(18-39) 2465.1983
Somatostatina(28) 3147.4710
Para el análisis de los péptidos se utilizaron los siguientes programas de Bruker

Daltonics:
• FlexControl: permite controlar el MALDI-TOF. Los espectros fueron obtenidos en el

modo de iones positivos en el espectrómetro de masas.
• FlexAnalysis: permite el procesado de los espectros obtenidos por el FlexControl. El

método utilizado para la detección de los picos fue PMF.FAMS.
• Biotools: permite la búsqueda en bases de datos. Utiliza como motor de búsqueda el
Mascot (MatrixScience). Los parámetros de búsqueda en la base de datos fueron:
- Tolerancia: 50 ppm de error.

- Tolerancia de la digestión de la tripsina: 1 fallo.
- Modificaciones: oxidación de las metioninas.
119
- Mínimo de 4 coincidencias en las masas de los péptidos.

- Ninguna restricción en el taxón.
Según estos parámetros de búsqueda, la puntuación de la proteína es -10·log

(P), donde P es la probabilidad que un acierto observado sea un evento aleatorio.
En la espectrometría de masas, se recomienda utilizar sólo fungibles de

material que no se disuelva en presencia de disolventes orgánicos de lo contrario, sólo
se observan polímeros de plástico en el espectro del MALDI como se muestra en la
figura 3.13. En este trabajo se utilizó un fungible especial, tanto tubos como puntas de
pipeta, comercializado por Eppendorf.
Figura 3.13. Imagen de un espectro con presencia de polímeros.
3.6.6. Electroforesis en Gel Diferencial 2-D (2D-DIGE)
El 2-D DIGE es un método que permite el análisis preciso de las diferencias en

abundancia de las proteínas entre dos muestras. Este método se basa en el marcaje
con tres fluoróforos (CyDye): Cy2, Cy3 y Cy5, que reaccionan con el grupo ɛ-amina de
la lisina. Los fluoróforos llevan una carga positiva que remplaza la carga positiva del
grupo amino por lo que el punto isoeléctrico de Ia proteína se conserva,
adicionalmente tienen el mismo peso molecular por lo que las proteínas marcadas con
cada fluoróforo migrarán en la misma posición en el gel 2DE; por otro lado, los
fluoróforos son compatibles con la tinción con plata u otros métodos de tinción.
La posibilidad de separar más de una muestra en un único gel permite la inclusión de

dos muestras y un control interno el cual es preparado mezclando cantidades iguales
de cada muestra a evaluar y cargarlo en el gel junto con la muestra problema,
120
eliminando de esta forma diferencias en la movilidad electroforética debido a pequeñas

variaciones entre geles. Ver figura 3.14.
Extracto proteico 1 Extracto proteico 2 Control interno

Marcado con Cy5 Marcado con Cy3 Marcado con Cy2
Mezcla de extractos marcados
Separación por 2D
y análisis de imagenes
Cy5 Cy3 Cy2
Análisis de imágenes
Figura 3.14. Esquema del proceso de 2D-DIGE. Modificado de [217].
3.6.6.1. Preparación de la Muestra para 2D-DIGE
Procedimiento:
• Obtener el extracto proteico como ha sido descrito en el apartado 3.6.4.1,

realizando los tratamientos deseados a los cultivos.
• Cuantificar las muestras como ha sido descrito en el apartado 3.6.4.2.
• Para un gel se limpia aproximadamente 90 µg de cada muestra como ha sido
descrito en el apartado 3.6.4.3 en alícuotas de 30 µg, dejando preferiblemente
todo un fin de semana en wash buffer y cambiándola el primer día de la
semana, mezclar con vórtex durante todo el día y continuar con el protocolo.
Por cada gel, se necesitarán 50 µg de proteína de cada muestra (tratada y no
tratada) y 50 µg de proteína para el control interno mezclando 25 µg de cada
muestra (tratada y no tratada).
• Una vez resuspendidas las muestras en la solución de lisis descrita en el
apartado 3.6.1, se ajusta el pH a 8.5.
3.6.6.2. Reconstitución de los fluoróforos
Los fluoróforos utilizados fueron CyDye™ minimal labelling DIGE de GE Healthcare.
121
Procedimiento:
• Atemperar los viales de los fluoróforos (Cy3, Cy5 y Cy2) durante 5 min
protegiéndolos de la luz.
• Añadir 5 µL de dimetilformamida (DMF) anhidra al 99.8% (Sigma) a cada
fluoróforo; la DMF preferiblemente nueva ya que ésta se degrada rápidamente.
• Mezclar con vórtex por 30 s.
• Centrifugar durante 30 s a 12000 g.
• Preparar la solución de trabajo a 400 pmol/µL diluyendo 1 volumen de la
solución stock en 1.5 volúmenes de DMF (5 µL fluoróforo+7.5 µL DMF).
3.6.6.3. Marcaje de las muestras
Procedimiento:
• En un tubo eppendorf, añadir un volumen equivalente a 50 µg de proteína y 1

µL de fluoróforo a 400 pmol/µL; mezclar y dar un pulso de microcentrífuga e
incubar en hielo durante 30 minutos protegiendo de la luz.
• Añadir 1 µL de lisina a 10 mmol/L para parar la reacción, mezclar y dar un
pulso de microcentrífuga e incubar durante 10 min en hielo protegiendo de la
luz.
3.6.6.4. Preparación de las muestras para la primera dimensión (IEF)
Procedimiento:
• Combinar las muestras marcadas y el control interno de acuerdo a la figura

3.15.
• Añadir buffer de lisis hasta un volumen final de 100 µL con los IPGs adecuados
al rango de pH que se va a utilizar en la primera dimensión.
A partir de este punto, se corrió la primera y segunda dimensión como se ha

descrito en los apartados 3.6.4.4 y 3.6.4.5, protegiendo en todo momento de la luz.
Posteriormente, las imágenes fluorescentes de los geles fueron obtenidas en un
scanner Typhoon 9400 de GE Healthcare, en el servicio de Proteómica del Hospital
Vall d’Hebron. Las imágenes del Cy2, Cy3 y Cy5 fueron escaneadas a unas longitudes
de onda de excitación/emisión de 488/520 nm, 532/580 nm y 633/670 nm
respectivamente. El análisis de las imágenes, así como el análisis estadístico de las
mismas, se llevo a cabo como se describió en el apartado 3.6.4.7 y la identificación de
122
los spots como se describió en los apartados 3.6.4.8, 3.6.4.9, 3.6.4.10, 3.6.4.11, 3.6.5.
Se recomienda hacer los geles con una réplica de cada.
Control interno – Cy2 Muestra tratada – Cy3 Muestra No tratada – Cy5

25 µg Muestra tratada+ 50 µg 50 µg
25 µg Muestra no tratada
Mezclar GEL 1
Control interno – Cy2 Muestra No tratada – Cy3 Muestra tratada – Cy5

25 µg Muestra tratada+ 50 µg 50 µg
25 µg Muestra no tratada
Mezclar GEL 2
Figura 3.15. Esquema del diseño experimental de 2D-DIGE.
3.7. Análisis de la expresión génica
3.7.1. RT-PCR
La PCR con transcripción inversa (RT-PCR, Reverse Transcription-PCR) se ha

convertido en una de las técnicas más ampliamente usadas en investigación. La
facilidad con la cual esta técnica permite que el RNA sea detectado y cuantificado ha
sido su mayor ventaja. Este método permite identificar mutaciones y polimorfismos en
secuencias transcritas, también como medir los niveles de expresión génica. El primer
paso implica la conversión de RNA a DNA complementario (cDNA) mediante el uso de
cebadores que pueden ser específicos e hibridar en un gen determinado o pueden no
serlo y unirse a todos los mRNAs. La elección del tipo de cebador a utilizar dependerá
del tipo de diseño experimental. En este trabajo esta técnica se usó como control de
calidad del RNA que posteriormente se usó en la PCR en tiempo real.
Para la síntesis del cDNA se utilizó la AMV Reverse Transcriptase (AMV-RT)

de Promega. El producto de esta reacción se utilizó posteriormente como DNA molde
123
para la amplificación por PCR con la AmpliTaq Gold® DNA polimerasa (Applied
Biosystems) como se ha descrito en el apartado 3.4.7.1.
Procedimiento:
Para una reacción de un volumen final 20 µL
• Irradiar previamente con luz ultravioleta el material a utilizar (micropipetas,

puntas, tubos eppendorf, etc.) en el lugar donde se realiza la mezcla de
reacción.
• Mantener todas las soluciones en hielo junto con las mezclas.
• Mezclar en un tubo eppendorf: 1 µg de RNA, 4 µL de tampón de reacción 5X
de la AMV-RT (Promega), 2 µL de dNTPs 20 mM (Roche), 1 µL del
oligonucleótido reverso, y agua RNase-free (Qiagen) hasta completar un
volumen de 19 µL.
• Incubar las muestras en el termociclador a 65ºC durante 10 min para
desnaturalizar el RNA.
• Incubar a temperatura ambiente durante 5 min para permitir la hibridación del
cebador.
• Añadir a todos los tubos (excepto al control negativo de la RT): 0.1 µL de
inhibidor de RNasa 40 U/µL (Roche) y 1.0 µL de AMV-RT 10 U/µL (Promega).
• Mantener en el termociclador durante 1 h a 42ºC para que se produzca la
síntesis de cDNA, y 5 min a 95ºC para inactivar la AMV-RT.
• Usar 2 µL de la reacción anterior como DNA molde para una PCR usando el
mismo oligonucleótido reverso que en la RT y un oligonucleótido directo. En el
control negativo de la RT no debe haber amplificación, puesto que al no
añadirle AMV-RT no se sintetiza cDNA; si se detecta amplificación significa que
el RNA está contaminado con DNA. Debe hacerse un control negativo de RT
por cada muestra de RNA.
3.7.2. PCR en Tiempo Real (Real time-PCR)
En la PCR tradicional, secuencias específicas de DNA o cDNA pueden ser

copiadas o amplificadas miles a millones de veces y su detección se realiza a punto
final después del último ciclo de PCR por electroforesis en gel. En la PCR en tiempo
real, la cantidad de producto de PCR se mide en cada ciclo. La posibilidad de
monitorear la reacción durante su fase exponencial hace posible que se pueda
cuantificar la cantidad inicial del transcrito con gran precisión comparándolo con un
124
control conocido. Esta técnica implementa el uso de marcadores fluorescentes que

emiten fluorescencia a medida que avanza la PCR. El incremento en la señal de
fluorescencia es directamente proporcional al número de amplicones generados en la
fase exponencial de la reacción.
Los sistemas para detección de fluorescencia incluyen agentes de unión a DNA

de doble cadena como el SYBR Green en donde la intensidad de la fluorescencia
aumenta en la medida en la que el fluoróforo se une al DNA, oligonucleótidos
fluorescentes como Amplifluor que inicialmente tienen una configuración de horquilla
en donde la fluorescencia está inhibida y que es permitida cuando se incorporan en la
PCR y sondas como TaqMan que contienen un fluorocromo y un quencher que
inactiva el fluorocromo e hibrida en la zona intermedia del DNA molde, entre el oligo
directo y el reverso, de modo que durante la PCR la sonda es degradada por la Taq
polimerasa liberando el reportero fluorescente generando una señal que incrementa en
cada ciclo.
En este trabajo se utilizaron sondas TaqMan marcadas con FAM que fueron
diseñadas por Applied Biosystems para los genes Rv1687c (oligo directo: 5’-
GCAAGCCGCCGATGAG-3, oligo reverso: 5’-CCGGACAGGTTGGCACAA-3 y sonda:
5’-CCACCGCTTCGATCAC-3)’ y Rv3161c (oligo directo:
5’CGAATTCGCCGGCTATCG-3’, oligo reverso: 5’-TCCAATTAGCTCGCCACTCATG-
3’, y sonda: 5’-CTCGACCTGCACCATC-3’). Las muestras de RNA fueron enviadas al
Microbiology Group del Department of Medicine en el Imperial College London en
Londres. El cDNA se sintetizó usando el kit High Capacity cDNA Reverse Transcription
de Applied Biosyistems, junto con las sondas específicas para los genes Rv1687c,
Rv3161c y sigA para generar las curvas estándar y realizar la PCR en tiempo real. La
expresión del sigA se utilizó como control endógeno de las muestras para normalizar
la expresión.
En primer lugar se realizó un experimento de validación para comprobar que la

eficiencia de las sondas/oligos. de los genes de estudio y del control eran
equivalentes. Para ello se hizo una PCR en tiempo real con las diferentes sondas
usando diluciones seriadas de concentración conocida del RNA y se calculó la curva
estándar a partir de los datos de ciclo umbral (CT) y la concentración de la muestra. A
continuación se realizó la PCR en tiempo real con las diferentes muestras de RNA y se
calculó la expresión de los genes de interés utilizando el método del CT comparativo o
2-ΔΔCT. Se utilizaron tres extracciones de RNA independientes para cada
cepa/condición y cada muestra de RNA se amplificó en cuadriplicado.
125
3.8. Métodos de caracterización fenotípica
3.8.1. CMI
El estudio de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos es de suma

importancia ya que permite dirigir la terapéutica una vez la bacteria es identificada así
como vigilar la aparición de nuevos mecanismos de resistencia. Los métodos
implementados pueden clasificarse en métodos cuantitativos y cualitativos. Los
métodos cuantitativos son aquellos que permiten determinar la CMI y la concentración
mínima bactericida (CMB). La CMI es la concentración mínima a la que un
antimicrobiano en un periodo de tiempo determinado es capaz de inhibir el crecimiento
in vitro de una bacteria. La determinación de la CMI puede hacerse por micro o macro
dilución en cultivo líquido, dilución en agar o E-test. En el primer método se hacen
diluciones seriadas del antimicrobiano que son incorporadas en el medio de cultivo;
posteriormente se inocula con una cantidad fija del microorganismo y después de
incubar se hace la lectura determinándose la CMI [75].
3.8.1.1. Ensayo en microplaca de la resazurina (REMA)
Este método implementa el uso de un indicador redox (resazurina) que cambia

de color azul (estado oxidado) a rosa cuando está en un ambiente reductor como el
generado durante el metabolismo celular. Esta propiedad ha sido utilizada para medir
la viabilidad de M. tuberculosis tras la exposición a fármacos antituberculosos. Es un
método simple, rápido y de bajo costo que no requiere de un equipamiento especial
para su utilización ya que el cambio de color puede detectarse visualmente [225, 226].
En este trabajo se usó este método con el fin de establecer las CMIs de M.
tuberculosis y M. smegmatis frente a los compuestos que se listan en la tabla 3.6:
Procedimiento:
Preparación del Inóculo
• Inocular una colonia de M. tuberculosis o M. smegmatis en 10 mL de medio

Middlebrook 7H9+Tween+ADC e incubar a 37°C durante 2 o 3 semanas para
M. tuberculosis y 3 días en el caso de M. smegmatis.
• Hacer una resiembra 1/100 en medio Middlebrook 7H9+Tween+ADC e incubar
a 37°C hasta que el cultivo alcance una OD600 de aproximadamente 1.
126
• Medir la OD600 de los cultivos y diluir en 10 mL de 7H9+glicerol+ADC (ya que el

Tween afecta la CMI) de modo que la OD600 final sea de 0.01 para M.
tuberculosis y 0.001 para M. smegmatis.
Tabla 3.6. Concentraciones de los antibióticos para los ensayos de CMIs.

Concentración Rangos ensayados
Compuesto Disolvente stock mg/ml (µg/mL)
Triclosán* DMSO 34.74 (100X) 2.71-86.85
Isoniacida* Agua 4 (1000X) 0.03125-1
Etambutol* Agua 3.2 (100X) 0.25-8
Estreptomicina** Agua 0.4 (100X) 0.03125-1
Rifampicina* Metanol 0.128 (1000X) 0.016-0.512
Clofazimina* DMSO 1.92 (1000X) 0.015-0.48
Ethionamida* DMSO 1.92 (250X) 0.06-1.92
Acido p-aminosalicílico* Etanol 3.2 (100X) 0.025-0.8
D-cicloserina* Agua 25.6 (100X) 2.0-64
Kanamicina** Agua 3.2 (100X) 0.25-1
Tetraciclina* Etanol 50% 1.6 (50X) 0.25-8
Eritromicina* Etanol 40 (50X) 6.25-200
Cloranfenicol*** Etanol 8 (100X) 0.625-20
Gentamicina* Agua 4.8 (100X) 0.375-12
Ofloxacina* NaOH 0.1 N 0.8 (100X) 0.0625-2
Levofloxacina* NaOH 0.1 N 0.8 (100X) 0.0625-2
Acriflavina* Agua 1.6 (100X) 0.125-4
Reserpina* DMSO 38.4 (100X) 3.0-96
o-vanadato* Agua 28.8 (100X) 2.25-75
m-clorocarbonilcianuro
fenilhidrazona* DMSO 4 (100X) 0.31-10
Verapamil* DMSO 128 (100X) 10-320
Tioridazine hidroclorado* Agua 16 (100X) 1.25-40
Amikacina** Agua 1.6 (100X) 0.125-4
†
Bromuro de Etidio Agua 0.625 (39X) 0.125-4
††
Safranina Agua 1.6 (100X) 0.125-4
Bromuro de
cetiltrimetilamonio* Agua 20 (100X) 1.56-50
† ††
*Sigma, **Apollo Scientific, ***Roche, Amresco, Panreac.
Preparación del compuesto
• A partir de una solución stock del compuesto, diluir en 5 mL de 7H9-

glicerol+ADC hasta una concentración 1X (equivalente a 4 veces respecto a la
concentración máxima que se desee ensayar).
Montaje de la placa de 96 pocillos
127
• Añadir 200 µL de agua Milli-Q estéril en los pocillos de las filas A y H y de las
columnas 1 y 12 con el fin de mantener la humedad durante la incubación (Fig.
3.16).
• Añadir 100 µL de 7H9+glicerol+ADC a el resto de pocillos (aproximadamente 6
mL/placa de medio en total).
• Añadir 100 µL de la solución 1X del compuesto a ensayar en los pocillos B2 al
B5 y B7 a B10. Hacer diluciones seriadas tomando un volumen de 100 µL
hasta la fila G descartando los últimos 100 µL.
• Añadir 100 µL del inóculo a los todos los pocillos excepto los B6 y B11 que
servirán como controles de esterilidad. Los pocillos C6 al G6 y C11 al G11
serán los controles de crecimiento.
• Añadir 100 µL de medio a los pocillos del control de esterilidad B6 y B11 de
modo que todos los pocillos tendrán un volumen final de 200 µL.
• Cerrar las placas y en el caso de M. tuberculosis sellarlas con Parafilm®,
colocar las placas dentro de una bolsa de plástico y cerrarla.
• Incubar a 37ºC durante 1 día en el caso de M. smegmatis y 7 días en el caso
de M. tuberculosis.
Revelado
• Añadir 30 µL de resazurina (Sigma) al 0.01% (recién preparada a partir de un

stock al 0.1%) a los pocillos control de crecimiento C6 y C11. Incubar durante
3-4 horas para M. smegmatis y 24 h para M. tuberculosis. Si el indicador vira a
rosa, revelar toda la placa e incubar durante 3 o 24 h más; en caso de que no
vire revelar los pocillos control de crecimiento D6 y D11 incubar nuevamente y
proceder como se mencionó anteriormente. Es importante realizar la lectura al
cabo de 3 o 24 h ya que si se incuba por más tiempo se pueden tener resultado
erróneos. Se considera positivo si el indicador vira a un rosa similar al del
pocillo control de crecimiento. Un color lila se considera negativo. La CMI es la
menor concentración del compuesto más baja a la que no hay crecimiento
(permanece azul o lila).
128
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
B CE CE
C CC1 CC1
D CC2 CC2
E CC3 CC3
F CC4 CC4
G CC5 CC5
Pocillos con agua CC: Control de crecimiento

CE: Control de esterilidad
Figura 3.16. Diseño de la placa para el ensayo REMA.
Soluciones
Resazurina 0.1%
Pesar 0.01 g y disolverlos en 10 mL de agua Milli-Q, mezclar y esterilizar mediante

filtración con filtros de 0.22 µm de diámetro de poro. Hacer alícuotas y congelar a -
20°C. La solución de trabajo 0.01% es estable durante una semana a 4°C.
3.8.2. Ensayo de permeabilidad
La estructura de la envuelta de las micobacterias hace que tenga una fluidez

muy baja y que por tanto la penetración de fármacos sea difícil. Sin embargo la
permeabilidad puede potenciarse usando inhibidores específicos que interfieran en la
biosíntesis de los componentes de la pared celular. El etambutol es un compuesto
sintético que se usa en el tratamiento de primera línea contra la tuberculosis; éste
afecta la síntesis de arabinogalactano generando una desorganización de la pared
celular así como la pérdida de su integridad y cambios en la composición de lípidos
libres lo que conlleva a incrementar la permeabilidad de la pared [227]. El etambutol se
ha usado a concentraciones sub-inhibitorias con el fin de permeabilizar la pared de
micobacterias y revertir la resistencia natural a diversos compuestos [228-231]. En
este trabajo se usó con el fin de permeabilizar la pared de M. tuberculosis y estudiar el
efecto del TRC.
Procedimiento:
129
• Inocular una colonia de M. tuberculosis en 10 mL de medio Middlebrook 7H9-

Tween+ADC e incubar a 37°C durante 2 o 3 semanas.
• Medir la OD600 de los cultivos y diluir en 10 mL de 7H9+glicerol+ADC de modo
que la OD600 final sea de 0.01.
• Añadir etambutol a una concentración final de 0.3 µg/mL y TRC a diferentes
concentraciones. Así mismo, hacer el seguimiento de la OD600 a cultivos sólo
con etambutol, sólo con TRC y sin etambutol y TRC.
• Incubar a 37ºC y medir la OD600 cada 24 horas durante 12 días.
3.9. Métodos de manipulación de cultivos celulares
3.9.1. Mantenimiento y manipulación de líneas celulares
El mantenimiento y la manipulación de las líneas celulares que se han utilizado

en este trabajo se realizó en el Servei de Cultius Cel·lulars, Producció d’Anticossos i
Citometria (SCAC) del Institut de Biotecnologia i de Biomedicina de la Universitat
Autònoma de Barcelona.
La línea celular utilizada en este trabajo fue la J774 A.1, que son macrófagos
murinos derivados de médula ósea. Esta línea fue donada por Jesús García-Gil del
laboratorio de Microbiologia Molecular de la Universitat de Girona.
Los macrófagos fueron cultivados en medio D-MEM (4.5 g/L glucosa, 580 mg/L
L-glutamina, 110 mg/L piruvato, 15 mg/L rojo fenol) (GIBCO) suplementado con 10%
de suero fetal bovino (FBS) de GIBCO, en una atmósfera controlada a 37°C con un
5% de CO2.
3.9.1.1. Congelación de las células
Procedimiento:
• Descongelar el FBS a 37°C.

• Mezclar 9 mL con 1 mL de DMSO estéril (DMSO al 10%) y ponerlo a 4°C (en
un tubo de 15 mL en hielo).
• Hacer un recuento de células tomando una alícuota de la suspensión celular
(10 µL) y mezclandola con la solución de azul de tripán (10 µL), posteriormente
sembrar 10 µL de la mezcla en la cámara de Neubauer y contar las células
viables (que serán brillantes, refringentes y no coloreadas) de los 4 cuadrantes
130
externos de la cámara. Hacer el promedio de células contadas y aplicar la

fórmula:
células/mL=promedio de células contadas x 104 x factor de dilución.
• Resuspender las células a una concentración de 6-10 x 106 células/mL.
• Poner 500 µL de las células en un criotubo y añadir 500 µL de medio de
congelación. La concentración final de DMSO será del 5%.
• Congelar el criotubo 1 h a -20°C, 24 h a -80°C y finalmente en nitrógeno
líquido.
3.9.1.2. Descongelación de las células
Procedimiento:
• Atemperar el medio de cultivo a 37°C.

• Poner el criotubo en un baño de agua a 37°C durante 1 min.
• Resuspender en 5 mL de medio a 37°C y mezclarlo con 5 mL de medio en un
tubo.
• Centrifugar durante 5 min a 1400 rpm y descartar el sobrenadante.
• Resuspender en un volumen de medio a 37°C según la cantidad de células.
• Poner las células en un frasco de cultivo e Incubar.
El DMSO es tóxico a 37°C por lo tanto se debe trabajar lo más rápido posible.
3.10. Análisis de la virulencia de M. tuberculosis en macrófagos
3.10.1. Preparación de stocks de cultivos de para la infección
Procedimiento:
• Descongelar las cepas originales que se quieran ensayar y crecerlas en 10 mL

de medio Middlebrook 7H9+Tween+ADC e incubar a 37°C durante 2 o 3
semanas para M. tuberculosis.
• En un criotubo mezclar 500 µL de cultivo y 500 µL de glicerol al 20% y congelar
a -20°C.
3.10.2. Ensayo de infección
Cultivos de M. tuberculosis:
131
• Descongelar un stock del cultivo y crecerlo en 10 mL de medio Middlebrook

7H9+Tween+ADC e incubar a 37°C durante 2 o 3 semanas.
a 37°C hasta que el cultivo alcance una OD600 de aproximadamente 0.6-0.8.
Procedimiento:
Día 1
Infección
• Sembrar los macrófagos a última hora del día en una placa de 96 pocillos a una
concentración de 5 x 104 células/mL en 100 µL de DMEM suplementado con
FBS al 10% (GIBCO).
• Incubar toda la noche a 37°C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
Día 2
Preparación del inóculo
• Centrifugar el cultivo de M. tuberculosis OD600 0.6-0.8 durante 10 min a 3000 g.

• Hacer dos lavados con DPBS (GIBCO)+Tween 0.05%.
• Resuspender en DPBS (GIBCO), dejar el cultivo a temperatura ambiente
durante 5 min con el fin de sedimentar agregados.
• Separar el “sobrenadante”, ponerlo en otro falcon y medir la OD600.
• Diluir el cultivo en medio DMEM suplementado con FBS al 10% (GIBCO) de
modo que se tenga la concentración adecuada para infectar las células a una
MOI (multiplicidad de infección) deseada. Hacer recuento de viables de éste
inóculo.
Infección
• Inspeccionar las monocapas bajo el microscopio.

• Aspirar el medio presente en los pocillos.
• Añadir un volumen (20-100 µL) de la suspensión bacteriana a las monocapas;
dejar un pocillo como control adicionando medio sin bacteria.
• Incubar a 37°C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 durante 4 horas.
• Hacer un lavado con 200 µL de DPBS (GIBCO).
132
• Añadir 200 µL de DMEM con 200 µg/mL de amikacina para eliminar las
bacterias extracelulares en cada pocillo, Incubar durante 1 hora a 37°C con 5%
de CO2.
• Hacer dos lavados con 200 µL de DPBS (GIBCO) para quitar la amikacina.
• En este punto o bien se lisan las monocapas de células para hacer el recuento
de viables de bacterias intracelulares o bien se adicionan 200 µL de DMEM
para continuar con la incubación durante los tiempos post infección que se
desee determinar.
• Calcular el número de viables a diferentes tiempos post infección: día 1, día 2,
día 3, día 4 y día 7 para. Se tratan las monocapas de células con 100 µL de
agua Milli-Q estéril y se incuba durante 30 min a 37°C con 5% de CO2.
• Pipetear el lisado y sembrar viables mediante la técnica de la gota haciendo un
banco de diluciones con DPBS (GIBCO)+Tween 0.05% en placas de 7H10 e
incubar durante 3-4 semanas.
3.10.3. Ensayo de resistencia al peróxido de hidrógeno
Procedimiento:
• Preparar medio Middlebrook 7H9 como se ha descrito en el apartado 3.2.1.1

pero sin catalasa en el suplemento ADC (7H9-AD).
• Preparar medio 7H9+AD+H2O2 100mM.
• Añadir 1000 µL 7H9-AD en las columnas 2 a 6 de una placa de 24 pocillos
estéril (Fig. 3.17).
• Añadir 640 µL de 7H9+AD+H2O2 100mM en la columna 1 y mezclarlo con 1360
µL de 7H9-AD, lo que dará un volumen final 2 mL y una concentración final de
H2O2 de 32mM.
• Hacer diluciones seriadas, tomando un volumen de 1000 µL de la columna 1
hasta la columna 4 descartando los últimos 1000 µL. Las concentraciones de
las columnas 1 a 4 serán: 32mM, 16 mM, 8 mM, 4 mM. La columna 5 será el
control de crecimiento y la 6 el control de esterilidad.
• Añadir 10 µL de un cultivo de M. tuberculosis en fase logarítmica crecida en
medio libre de catalasa, cerrar la placa, sellar con Parafilm®, colocar las placas
dentro de una bolsa de plástico e incubar durante 90 min a 37ºC.
• Sembrar viables en placas de 7H10 e incubar a 37ºC durante 3-4 semanas.
133
1 2 3 4 5 6
A 32 mM CC CE
B 16 mM CC CE
C 8 mM CC CE
D 4 mM CC CE
Figura 3.17. Diseño de la placa para el ensayo de resistencia a H2O2. CC: control de
crecimiento, CE: control de esterilidad.
Soluciones
Medio Middlebrook 7H9+AD (sin catalasa) con H2O2
Añadir 0.56 mL de H2O2 al 30% (Panreac) a 49.4 mL de 7H9+AD; esto dará una
concentración de 100mM.
Algunos de los métodos que se describieron en este apartado se basaron en trabajos

previos desarrollados en el Institut de Biotecnologia y de Biomedicina (IBB) de la
Universitat Autònoma de Barcelona [232-234].
134
Resultados
Resultados
4. Resultados
4.1. Estudio del efecto del triclosán sobre la expresión de los genes Rv1687c y
Rv3161c
En primer lugar se procedió a comprobar los resultados reportados en la

literatura respecto al efecto del TRC sobre la expresión del transportador ABC
Rv1686c-Rv1687c y de la dioxigenasa Rv3161c. Para ello se evaluó el nivel de
expresión de los genes Rv1687c y Rv3161c a partir de RNA total extraído de cultivos
en fase logarítmica de H37Rv en presencia y ausencia de TRC a una concentración de
108.5 µg/mL (375 µM) equivalente a 5 veces su CMI (21.7 µg/mL, 75 µM). Al cultivo no
tratado con TRC se le adicionó DMSO (99%) ya que éste fue usado para solubilizar el
TRC. Los cultivos tratados y no tratados se incubaron durante 2 horas a 37°C y
posteriormente se realizó la extracción del RNA. Este experimento se hizo por
triplicado. La expresión génica se cuantificó mediante Real-Time PCR usando las
sondas descritas en el apartado 3.7.2.
Los resultados mostraron que en presencia de TRC la expresión del gen

Rv1687c del transportador ABC aumenta aproximadamente 1000 veces y la del gen
Rv3161c más de 1300 veces en la cepa H37Rv (Tabla 4.1).
Tabla 4.1. Expresión de los genes Rv1687c y Rv3161c en respuesta al tratamiento con TRC en
la cepa H37Rv respecto a la misma cepa no tratada.
H37Rv
Gen
EN ± DS
Rv1687c 1002.67 0.82
Rv3161c 1366.83 0.46
E.N: Expresión Normalizada respecto al gen sigA, SD: Desviación Estándar. Los valores son el
resultado de la media de tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas.
De esta forma, estos resultados confirmaron la inducción de estos genes en

presencia del TRC, tal y como había sido reportado previamente por otros autores
[129, 189].
4.2. Construcción de los mutantes Rv1686c-Rv1687c y Rv3161c en M.

tuberculosis
Para la obtención de los mutantes se siguió el sistema de transducción

especializada descrito en materiales y métodos (apartado 3.4.8).
135
Resultados
4.2.1. Mutante del transportador ABC (Rv1686c-Rv1687c)
Para la construcción del AES se amplificó por PCR la región flanqueante 3’

(corriente abajo) del gen Rv1686c con los oligonucleótidos MutUp1Bgl y MutLw1Hin,
generando el fragmento 1 (Mut1) de 815 pb que incluye sólo 73 pb de dicho gen. El
fragmento 2 (Mut2) fue generado por amplificación de la región flanqueante 5’
(corriente arriba) del gen Rv1687c con los oligonucleótidos MutUp2Xba y MutLw2Stu
produciendo un amplicón de 746 pb que incluye sólo 38 pb del gen Rv1687c; de esta
forma se omitieron 608 pb del gen Rv1686c de un total de 681 pb y 730 pb del gen
Rv1687c de un total de 768 pb (Fig. 4.1).
Mut 1 Mut 2
MutLw1Hin MutUp2Xba
MutUp1Bgl MutLw2Stu
815pb 746pb
Rv1685c Rv1686c Rv1687c mpg
86Lw 86Up
8687Lw 8687Up
Figura 4.1. Construcción de las deleciones de los genes Rv1686c-Rv1687c.
El fragmento 1 (Mut1) se clonó en el vector pGEM-T®, fue secuenciado y no se

observaron cambios en la secuencia. Posteriormente fue liberado digiriendo con las
enzimas BglII y HindIII para luego clonarlo en el vector pYUB854 digerido con las
mismas enzimas, obteniéndose el vector pYUB854Mut1. El segundo fragmento (Mut2)
también fue clonado en el vector pGEM-T®; igualmente fue secuenciado y no se
observaron cambios en la secuencia. Este fragmento posteriormente fue liberado por
digestión con XbaI y StuI; se hicieron extremos romos y se clonó en pYUB854Mut1
digerido con StuI y tratado con la T4 DNA polimerasa generando el plásmido
pYUB854Δ8687. Los fragmentos Mut1 y Mut2 se clonaron en pYUB854 corriente
arriba y corriente abajo del gen de resistencia de higromicina respectivamente (Fig.
4.2) La orientación y presencia de la deleción se comprobó por PCR con los
oligonucleótidos Hyg out1-8687Up, Hyg out2-8687Lw y por digestión con las enzimas
SacI y NotI (Fig. 4.2).
El plásmido pYUB854Δ8687 se clonó en el fásmido phAE159 digiriendo ambos

plásmidos con PacI, generando el fásmido phAE159Δ8687. Posteriormente se
empaquetó en el fago lambda y se transdujo en E. coli HB101. Los transductantes
resultantes se comprobaron por PCR con los oligonucleótidos Hyg out1-8687Up, Hyg
out2-8687Lw, 8687Up-8687Lw y por digestión con PacI.
136
Resultados
PacI
StuI PacI
SacI NotI NotI cos
SacI
Mut2 SacI
NotI
NotI
8687Up
XbaI OriE
res
Hyg out1 pYUB854Δ 8687
BglII
SacI
res Mut1
Higromicina
HindIII
8687Lw
Hyg out2
Figura 4.2. Clonación y comprobación de los fragmentos Mut1 y Mut2 en pYUB854.
El fásmido phAE159Δ8687 se electroporó en M. smegmatis y luego se preparó

un lisado de título elevado que fue transducido en M. tuberculosis. Se hicieron un total
de tres transducciones en donde se obtuvieron 38 transductantes de los cuales 12
fueron analizados por PCR con los oligonucleótidos 8687Up-8687Lw que amplifican un
fragmento de 1.5 kb en la cepa salvaje y 2.1 Kb en la cepa mutante (Fig. 4.3 carriles 1
y 2), Hyg out1-8687Up que no amplifican en la salvaje y amplifican un fragmento de
285 pb en el mutante (Fig. 4.3 carriles 3 y 4), Hyg out2-8687Lw que no amplifican en la
salvaje y amplifican un fragmento de 385 pb en el mutante (Fig. 4.3 carriles 5 y 6).
Adicionalmente, se amplificó con los oligonucleótidos 86Up-86Lw para diferenciar los
recombinantes simples que conservan una copia salvaje del operón y en los que por lo
tanto sí hay amplificación, de los recombinantes dobles o mutantes en los que no hubo
amplificación. En todas las PCRs se usaron el fásmido phAE159Δ8687 y la cepa
H37Rv como controles. Finalmente se confirmaron 5 mutantes (Δ8687 5.31, 5.15,
5.16, 1.14, 1.15).
MWM 1 2 3 4 5 6
20 kb
1.5 kb
0.5 kb
Figura 4.3. Comprobación de la cepa Δ8687 mediante PCR. Electroforesis en agarosa al 1%

de la amplificación por PCR de: H37Rv (carril 1) y Δ8687 (carril 2) con los oligonucleótidos
8687Up-8687Lw, H37Rv (carril 3) y Δ8687 (carril 4) con los oligonucleótidos HygOut1-8687Up,
137
Resultados
H37Rv (carril 5) y Δ8687 (carril 6) con los oligonucleótidos HygOut2-8687Lw. El marcador

utilizado fue el GeneRuler 1 Kb Plus DNA ladder (Fermentas). Se muestran los resultados para
el clon 5.31 como ejemplo de los resultados obtenidos con los otros 4 clones.
4.2.2. Mutante de la dioxigenasa (Rv3161c)
Para la construcción del AES se amplificó por PCR la región flanqueante 3’

(corriente abajo) del gen Rv3161c con los oligonucleótidos Mut61Up1Bgl y
Mut61Lw1Hin, generando el fragmento 1 (Mut61-1) de 788 pb que incluye sólo 99 pb
de dicho gen. El fragmento 2 (Mut61-2) fue generado por amplificación de la región
flanqueante 5’ (corriente arriba) con los oligonucleótidos Mut61Lw2Xba y
Mut61Up2Stu produciendo un amplicón de 767 pb que incluye sólo 59 pb del gen; de
esta forma se omitieron 991 pb del gen Rv3161c de un total de 1149 pb (Fig. 4.4).
Mut61-1 Mut61-2
Mut61Lw2Xba
Mut61Lw1Hin Mut61Up1Bgl Mut61Up2Stu
788pb 767pb
PPE53’ Rv3160c Rv3161c Rv3162c
3161LwHin 3161UpBam
Figura 4.4. Construcción de las deleciones del gen Rv3161c.
El fragmento 2 (Mut61-2) se clonó en el vector pGEM-T®, fue secuenciado y no

se observaron cambios en la secuencia; posteriormente fue liberado y digerido con las
enzimas StuI y XbaI para luego clonarlo en el vector pYUB854 digerido con las
mismas enzimas, obteniéndose el vector pYUB854Mut61-2. El primer fragmento
(Mut61-1) fue clonado en el vector pGEM-T®, también fue secuenciado y no se
observaron cambios en la secuencia; posteriormente fue liberado por digestión con
BglII y HindIII; se hicieron extremos romos y se clonó en pYUB854Mut61-2 digerido
con HindIII y tratado con la T4 DNA polimerasa generando el plásmido
pYUB854Δ3161. Los fragmentos Mut61-1 y Mut61-2 se clonaron en pYUB854
corriente abajo y corriente arriba del gen de resistencia a higromicina respectivamente
(Fig. 4.5). La orientación y presencia de la deleción se comprobó por PCR con los
oligonucleótidos Mut61Lw1Hind-Mut61Up1Bgl, Hygout2-Mut61LwHind y por digestión
con BamHI y SacI (Fig. 4.5).
El plásmido pYUB854Δ3161 fue clonado en el fásmido phAE159 digiriendo

ambos plásmidos con PacI, generando el fásmido phAE159Δ3161. Posteriormente se
empaquetó en el fago lambda y se transdujo en E. coli HB101. Los transductantes
resultantes se comprobaron por PCR con los oligonucleótidos Hyg out1-3161UpBam y
Hyg out2-3161LwHin y por digestión con PacI.
138
Resultados
StuI
Mut61Up2Stu
BamHI
BamHI
PacI
cos
PacI
NruI
Mut61-2
SacI
3161UpBam
Mut61Lw2Xba OriE
XbaI
res
Hyg out1 pYUB854Δ 3161
BglII
BamHI
Mut61Lw1Hin
SacI
res Mut61-1
SacI
Higromicina
3161LwHin
Hyg out2
Mut61Up1Bgl
HindIII
Figura 4.5. Clonación y comprobación de los fragmentos Mut61-1 y Mut61-2 en pYUB854.
El fásmido phAE159Δ3161 se electroporó en M. smegmatis y luego se preparó un

lisado de título elevado que fue transducido en M. tuberculosis. Se hicieron un total de
dos transducciones en donde se obtuvieron 16 transductantes que fueron analizados
por PCR con los oligonucleótidos 3161UpBam-3161LwHin que amplifican un
fragmento de 1.1 kb en la cepa salvaje y 2 Kb en la cepa mutante (Fig. 4.6 carriles 1 y
2), Hyg out1-3161UpBam que no amplifican en la salvaje y amplifican un fragmento de
310 pb en el mutante (Fig. 4.6 carriles 3 y 4) y Hyg out2-3161LwHin que no amplifican
en la salvaje y amplifican un fragmento de 354 pb en el mutante (Fig. 4.6 carriles 5 y
6). En todas las PCRs se usaron el fásmido phAE159Δ3161 y la cepa H37Rv como
controles. Se confirmaron 11 mutantes (Δ3161 2.14, 2.15, 2.16, 2.17, 2.18, 2.21, 2.24,
2.25, 2.26, 2.27, 2.28).
MWM 1 2 3 4 5 6
20 kb
1.5 kb
0.5 kb
Figura 4.6. Comprobación de la cepa Δ3161 mediante PCR. Electroforesis en agarosa al 1%

de la amplificación por PCR de: H37Rv (carril 1) y Δ3161 (carril 2) con los oligonucleótidos
3161UpBam-3161LwHin, H37Rv (carril 3) y Δ3161 (carril 4) con los oligonucleótidos HygOut1-
139
Resultados
3161UpBam, H37Rv (carril 5) y Δ3161 (carril 6) con los oligonucleótidos HygOut2-3161LwHin.

El marcador utilizado fue el GeneRuler 1 Kb Plus DNA ladder (Fermentas). Se muestran los
resultados para el clon 2.24 como ejemplo de los resultados obtenidos para el resto de
mutantes aislados.
El cassette de higromicina tanto de los mutantes del transportador como los de

la dioxigenasa no pudo ser eliminado con el plásmido pYUB870 pese a los muchos
intentos, lo que dificultó la construcción de cepas dobles mutantes para los dos
sistemas.
4.3. Construcción de cepas sobreproductoras de Rv1686c-Rv1687c y Rv3161c
Los genes Rv1686c-Rv1687c fueron amplificados por PCR con los

oligonucleótidos 8687Up y 8687Lw (Fig. 4.1), para luego ser clonados y secuenciados
en pGEM-T®. Posteriormente el fragmento fue liberado y clonado en el vector pMV261
(que posee el promotor hsp60 de expresión constitutiva fuerte) tratando ambos
plásmidos con BalI y EcoRI. Se analizó la zona de unión vector-inserto por
secuenciación comprobándose que las proteínas entraban en fase. Este plásmido se
electroporó en M. tuberculosis y los transformantes obtenidos se comprobaron
transformando E. coli con los lisados obtenidos por calor y digiriendo los vectores
purificados de E. coli con SalI y SmaI. Se comprobaron 5 clones designados como
8687-1, 8687-2, 8687-4, 8687-5 y 8687-6.
En el caso del gen Rv3161c, se amplificó por PCR con los oligonucleótidos
3161UpBam y 3161LwHin (Fig. 4.4), para luego clonarlo y secuenciarlo en pGEM-T®;
posteriormente el fragmento fue liberado y clonado en el vector pMV261 tratando
ambos plásmidos con BamHI y HindIII. Se analizó la zona de unión vector-inserto por
secuenciación comprobándose que las proteínas entraban en fase. El plásmido
resultante se electroporó en M. tuberculosis y los transformantes se comprobaron
transformando E. coli con los lisados obtenidos por calor y digiriendo los plásmidos
purificados de E. coli con NcoI y NruI. Se comprobaron 5 clones designados como
3161-4.1, 3161-4.2, 3161-12.1, 3161-12.2 y 3161-12.3.
4.3.1. Comprobación de las cepas sobreproductoras
En primer lugar se evaluó la expresión de los genes Rv1687c y Rv3161c a nivel

transcripcional usando RNA total extraído de cultivos en fase exponencial de las cepas
H37Rv, H37Rv (pMV261), 8687-1, 8687-2, 3161-4.1 y 3161-12.1. La expresión génica
se cuantificó mediante Real-Time PCR. Los resultados mostraron que en el caso del
transportador ABC el gen Rv1687c se expresa 9 y 6 veces más en los clones 8687-1 y
8687-2 respectivamente, que en la cepa salvaje H37Rv, y 6 y 4 veces más que en la
140
Resultados
cepa H37Rv (pMV261). Por su parte los clones 3161-4.1 y 3161-12.1 expresan el gen
Rv3161c casi 128 y 160 veces más que la cepa salvaje H37Rv y 133 y 167 veces más
que la cepa H37Rv (pMV261) (Tabla 4.2). Estos resultados confirmaron que los genes
Rv1687c y Rv3161c se sobreexpresan en las cepas estudiadas.
Tabla 4.2. Expresión del gen Rv1687c en los clones 8687-1 y 8687-2 sobreproductores del
transportador ABC y del gen Rv3161c en los clones 3161-4.1 y 3161-12.1 sobreproductores de
la dioxigenasa, respecto a las cepas H37Rv y H37Rv electroporada con pMV261.
H37Rv H37Rv (pMV261)
Gen/Clon
E.N. ± SD E.N. ± SD
Rv1687c
Clon 8687-1 9.39 1.42 6.05 1.42
Clon 8687-2 6.71 3.81 4.32 3.28
Rv3161c
Clon 3161-4.1 127.96 1.47 133.6 1.47
Clon 3161-12.1 160.67 0.6 167.7 0.60
E.N: Expresión Normalizada respecto al gen sigA, SD: Desviación Estándar. Los valores son el
resultado de la media de tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas.
A continuación se verificó la sobreexpresión de los genes a nivel proteico. Para

ello se hicieron geles bidimensionales a partir de extractos proteicos obtenidos de
cultivos en fase estacionaria, de las cepas H37Rv (pMV261), la cepa 8687-1
(sobreproductora del transportador ABC) y la cepa 3161-4.1 (sobreproductora de la
dioxigenasa). Se usaron cultivos en fase estacionaria para poder obtener una mayor
biomasa y por tanto una mayor cantidad de proteína total. Inicialmente se utilizaron
geles con un gradiente de pH de 3 a 10, pero para resolver mejor las zonas donde
posiblemente se encontraban tanto el transportador ABC como la dioxigenasa se
usaron tiras de isoelectroenfoque con gradientes de pH de 6 a 9 y de 4 a 7
respectivamente. Una vez realizada la electroforesis bidimensional se llevó a cabo la
identificación por huella peptídica mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.
El análisis comparativo de las imágenes mediante el programa Samespot

(Nonlinear Dynamics) mostró un único spot diferencial cuya intensidad era mayor en la
cepa sobreproductora que en la cepa control H37Rv (pMV261). Este spot estaba
localizado en una zona que concordaba con la masa y el punto isoeléctrico predichos
para la proteína codificada por el gen Rv1687c (MW: 27.55 kDa, pI: 6.95). Dicho spot
no se detectó en el gel de la cepa control H37Rv (pMV261), indicando que o bien no
se expresa o bien que la abundancia de esta proteína está por debajo del límite de
sensibilidad de la tinción con plata (Fig. 4.7).
Mediante el análisis por huella peptídica, el spot fue identificado como la

posible proteína de unión a ATP Rv1687c del transportador ABC Rv1686c-Rv1687c de
141
Resultados
M. tuberculosis (Fig. 4.8). La proteína codificada por Rv1686c no fue identificada en

estos geles ya que ésta proteína tiene un punto isoeléctrico de 8.49 que está al límite
de detección del gel. Aún así se infiere la expresión del la proteína completa dado que
el gen Rv1686c precede al gen Rv1687c en el vector recombinante (Fig. 4.1).
MW
A
+
-
6 9
pI
MW
B
+
-
6 9
pI
Figura 4.7. Geles 2DE de pH 6-9 teñidos con nitrato de plata. A) H37Rv electroporada con
pMV261. B) Clon 8687-1 que sobreproduce el transportador ABC Rv1686c-Rv1687c. Las
flechas indican el spot diferencial. Los geles fueron cargados con 100µg de proteína total. El
marcador de masa molecular utilizado es el BenchMark™ (Invitrogen).
142
Resultados
B
* 20 * 40 *
Rv1687c : MMISSSDELLRDGADPAVIIDQLRVIRGKRLALQDVSVRVACGTITGLLG : 50
MALDI_TOF : MMISSSDELLRDGADPAVIIDQLRVIRGKRLALQDVSVRVACGTITGLLG : 50
MMISSSDELLRDGADPAVIIDQLRVIRGKRLALQDVSVRVACGTITGLLG
60 * 80 * 100
Rv1687c : PSGSGKTTLIRCIVGSQIIASGSVSVLGQPAGSAELRHRVGYMPQDPTIY : 100
MALDI_TOF : PSGSGKTTLIRCIVGSQIIASGSVSVLGQPAGSAELRHRVGYMPQDPTIY : 100
PSGSGKTTLIRCIVGSQIIASGSVSVLGQPAGSAELRHRVGYMPQDPTIY
* 120 * 140 *
Rv1687c : NDLRVIDNIRYFAELCGVDRQAADEVIEAVDLRDHRTARCANLSGGQRAR : 150
MALDI_TOF : NDLRVIDNIRYFAELCGVDRQAADEVIEAVDLRDHRTARCANLSGGQRAR : 150
NDLRVIDNIRYFAELCGVDRQAADEVIEAVDLRDHRTARCANLSGGQRAR
160 * 180 * 200

Rv1687c : VSLACALVGRPDLLVLDEPTIGLDPVLRVELWDRFTALARRGTTLLVSSH : 200
MALDI_TOF : VSLACALVGRPDLLVLDEPTIGLDPVLRVELWDRFTALARRGTTLLVSSH : 200
VSLACALVGRPDLLVLDEPTIGLDPVLRVELWDRFTALARRGTTLLVSSH
* 220 * 240 *
Rv1687c : VMDEADRCGDLLLLRQGQLLAHTTPHRLRKETGCTSLEEAFLSIVRRTTT : 250
MALDI_TOF : VMDEADRCGDLLLLRQGQLLAHTTPHRLRKETGCTSLEEAFLSIVRRTTT : 250
VMDEADRCGDLLLLRQGQLLAHTTPHRLRKETGCTSLEEAFLSIVRRTTT
Rv1687c : VPAAG : 255

MALDI_TOF : VPAAG : 255
VPAAG
Figura 4.8. A) Espectro de masas obtenido para el spot diferencial identificado en el gel de la
cepa que sobreproduce el transportador (Fig. 4.7, B), cada pico corresponde a un péptido
derivado de la digestión tríptica de la proteína. B) Alineamiento de la secuencia identificada
mediante huella peptídica vs. Rv1687c reportada en la base de datos Tuberculist.
Para el análisis de la sobreproducción de la dioxigenasa codificada por

Rv3161c se usaron geles con un gradiente de pH de 4 a 7 teniendo en cuenta que el
punto isoeléctrico de esta proteína es de 5.16 y su masa molecular de 42.5 kDa.
Después del análisis de las imágenes obtenidas se identificó un spot en el gel de la
cepa sobreproductora cuya abundancia era mayor que en la cepa control H37Rv
(pMV261). El spot seleccionado estaba en la zona en la que posiblemente se
encontraría la proteína codificada por el gen Rv3161c (Fig. 4.9). La identificación por
huella peptídica mostró que dicho spot era en efecto la proteína codificada por
Rv3161c, cuyo espectro y alineamiento se muestran en la figura 4.10.
143
Resultados
MW
A
+
-
4 7
pI
MW
B +
-
4 7
pI
Figura 4.9. Geles 2DE de pH 4-7 teñidos con nitrato de plata. A) H37Rv electroporada con
pMV261. B) Clon 3161-4.1 que sobreproduce la dioxigenasa Rv3161c. Las flechas indican el
spots diferencial. Los geles fueron cargados con 100µg de proteína total. El marcador de masa
molecular utilizado fue el BenchMark™ de Invitrogen.
144
Resultados
B
* 20 * 40 *
Rv3161c : MLSTDNRAELGDILTDIGDYLDDNPPALSLPPAAYTSSELWQLERERIFN : 50
MALDI_TOF : MLSTDNRAELGDILTDIGDYLDDNPPALSLPPAAYTSSELWQLERERIFN : 50
MLSTDNRAELGDILTDIGDYLDDNPPALSLPPAAYTSSELWQLERERIFN
60 * 80 * 100
Rv3161c : RSWMLVAHVDQVAKTGDYVTVSVAGEPVMVVRDVDGQLHALSPICRHRLM : 100
MALDI_TOF : RSWMLVAHVDQVAKTGDYVTVSVAGEPVMVVRDVDGQLHALSPICRHRLM : 100
RSWMLVAHVDQVAKTGDYVTVSVAGEPVMVVRDVDGQLHALSPICRHRLM
* 120 * 140 *
Rv3161c : LMVEPGAGRIDTLTCQYHLWRYGLDGRLRGAPHMAANLDFNRRECRLPQF : 150
MALDI_TOF : LMVEPGAGRIDTLTCQYHLWRYGLDGRLRGAPHMAANLDFNRRECRLPQF : 150
LMVEPGAGRIDTLTCQYHLWRYGLDGRLRGAPHMAANLDFNRRECRLPQF
160 * 180 * 200

Rv3161c : AVATWNGLVWINLDADAEPIAAHLDLTDDEFAGYRLGEMVQVESWSHEWR : 200
MALDI_TOF : AVATWNGLVWINLDADAEPIAAHLDLTDDEFAGYRLGEMVQVESWSHEWR : 200
AVATWNGLVWINLDADAEPIAAHLDLTDDEFAGYRLGEMVQVESWSHEWR
* 220 * 240 *
Rv3161c : ANWKVAAENGHENYHVLGLHRQTLEPFVPGGGDLDVRQYSRWALRLRVPF : 250
MALDI_TOF : ANWKVAAENGHENYHVLGLHRQTLEPFVPGGGDLDVRQYSRWALRLRVPF : 250
ANWKVAAENGHENYHVLGLHRQTLEPFVPGGGDLDVRQYSRWALRLRVPF
260 * 280 * 300

Rv3161c : TVPVEAKSLQLNEVQKSNLVVLWTFPNSALAIAGERVVWFGFIPQSIDRV : 300
MALDI_TOF : TVPVEAKSLQLNEVQKSNLVVLWTFPNSALAIAGERVVWFGFIPQSIDRV : 300
TVPVEAKSLQLNEVQKSNLVVLWTFPNSALAIAGERVVWFGFIPQSIDRV
* 320 * 340 *
Rv3161c : QVLGGVLTTPELAADAAATAQTSQFVMAMINDEDRLGLEAVQVGAGSRFA : 350
MALDI_TOF : QVLGGVLTTPELAADAAATAQTSQFVMAMINDEDRLGLEAVQVGAGSRFA : 350
QVLGGVLTTPELAADAAATAQTSQFVMAMINDEDRLGLEAVQVGAGSRFA
360 * 380
Rv3161c : ERGHLSSKEWPGMLAFYRNLAMALVGDHPGAS : 382
MALDI_TOF : ERGHLSSKEWPGMLAFYRNLAMALVGDHPGAS : 382
ERGHLSSKEWPGMLAFYRNLAMALVGDHPGAS
Figura 4.10. A) Espectro de masas obtenido para el spot diferencial en el gel correspondiente
al clon 3161-4.1, sobreproductora de la dioxigenasa (Fig. 4.9, B), cada pico corresponde a un
péptido derivado de la digestión tríptica de la proteína. B) Alineamiento de la secuencia
identificada por huella peptídica vs. Rv3161c reportada en la base de datos Tuberculist.
De esta forma se confirmó que tanto la proteína Rv1687c del transportador

ABC codificado por Rv1686c-Rv1687c como la dioxigenasa codificada por Rv3161c se
sobreproducen en las cepas 8687-1 y 3161-4.1 respectivamente.
145
Resultados
4.4. Caracterización fenotípica de las cepas mutantes y sobreproductoras
Se analizó el fenotipo de dos clones escogidos al azar de las cepas

sobreproductoras del transportador ABC (8687-1, 8687-2) y de la dioxigenasa
Rv3161c (3161-4.1 y 3161-12.1), así como de 3 clones del mutante Δ8687 (5.31, 5.15,
5.16) y 3 del mutante Δ3161 (2.21, 2.24 y 2.14).
4.4.1. Crecimiento y morfología colonial
El crecimiento en medio líquido mediante el seguimiento de la OD600, no mostró

diferencias entre la cepa parental H37Rv y las cepas sobreproductoras o los mutantes
(Fig. 4.11).
10
1
OD600600
LogOD
H37Rv
H37Rv
0.1
0,1 8687-1
8687-1
Δ8687
Δ5.31 5.31
3161-4.1
4.1
Δ3161-2.14
Δ2.14
0.01
0,01
1 2 3 4 5 8 9 10 11 12
Tiempo (días)
Figura 4.11. Crecimiento en medio líquido de H37Rv, las cepas sobreproductoras 8687-1,
3161-4.1 y los mutantes Δ8687 5.31 y Δ3161-2.14. Se muestran los resultados para un clon
representativo de cada cepa. Los datos representan el promedio de tres ensayos
independientes. Las barras de error representan la desviación estándar de la media.
Tanto las cepas que sobreexpresan el transportador y la dioxigenasa, como

sus mutantes mostraron un crecimiento abundante en medio sólido formando colonias
rugosas.
4.4.2. Análisis de susceptibilidad a compuestos
Se determinó la CMI de las cepas sobreproductoras del transportador ABC y de

la dioxigenasa así como la de las cepas mutantes, frente a los compuestos que se
listan en el apartado 3.8.1.1 usando como controles la cepa parental H37Rv y la
H37Rv (pMV261). Se hicieron como mínimo dos ensayos independientes con dos
réplicas técnicas en cada ensayo. En general, los resultados obtenidos no mostraron
diferencias significativas (prueba t Mann-Whitney) respecto a las cepas controles ni
para el transportador ni para la dioxigenasa (tabla 4.3).
146
Resultados
Tabla 4.3. CMIs en µg/mL determinadas mediante el ensayo REMA. Los resultados son la mediana y el rango (mínimo-máximo) de al menos dos
experimentos independientes.
Sobreproducción Sobreproducción
H37Rv transportador Mutantes transportador (Δ8687) dioxigenasa Mutantes dioxigenasa (Δ3161)
Compuesto H37Rv (pMV261) 8687_1 8687_2 5.31 5.15 5.16 3161-4.1 3161-12.1 2.14 2.21 2.24
21.7
Triclosán 21.7 (21.7) (10.8-21.7) 21.7 (21.7) 21.7 (21.7) 21.7 (21.7) 21.7 (21.7) 21.7 (21.7) 21.7 (21.7) 21.7 (21.7) 21.7 (21.7) 21.7 (21.7) 21.7 (21.7)
0.062 0.093 0.125 0.062 0.062 0.062 0.062 0.062 0.062 0.090 0.093 0.093
Isoniacida (0.062- 0.125) (0.062-0.125) (0.062-0.125) (0.062-0.125) (0.062- 0.125) (0.062- 0.125) (0.062- 0.125) (0.062) (0.062) (0.062-0.125) (0.062-0.125) (0.062-0.125)
Etambutol 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1)
0.125 0.125
Estreptomicina 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) (0.125) (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125)
0.064 0.064 0.064 0.064 0.064 0.064 0.064 0.064 0.064 0.064 0.064 0.064
Rifampicina (0.032-0.064) (0.032-0.064) (0.032-0.064) (0.032-0.064) (0.032-0.064) (0.032-0.064) (0.032-0.064) (0.064) (0.064) (0.032-0.064) (0.032-0.064) (0.032-0.064)
0.12 0.12 0.12 0.12 0.18 0.12 0.12 0.12
Clofazimina (0.12-0.24) (0.12-0.24) 0.12 (0.12) 0.12 (0.12) 0.12 (0.12) 0.12 (0.12) (0.12-0.24) (0.12-0.24) (0.12-0.24) (0.12-0.24) (0.12-0.24) (0.12-0.24)
0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48
Etionamida (0.24-0.48) (0.24-0.48) 0.48 (0.48) 0.48 (0.48) 0.48 (0.48) 0.48 (0.48) 0.48 (0.48) (0.24-0.48) (0.24-0.48) (0.24-0.48) (0.24-0.48) (0.24-0.48)
0.1 0.1
Acido p-aminosalicílico 0.1 (0.1-0.2) 0.1 (0.1-0.2) 0.1 (0.1-0.2) 0.1 (0.1-0.2) 0.1 (0.1) 0.1 (0.1) 0.1 (0.1) (0.1-0.2) (0.1-0.2) 0.1 (0.1-0.2) 0.1 (0.1-0.2) 0.1 (0.1-0.2)
D-cicloserina 8 (8) 8 (8) 8 (8) 8 (8) 8 (8) 8 (8) 8 (8) 8 (8) 8 (8) 8 (8) 8 (8) 8 (8)
Kanamicina 2 (2) NA NA NA 2 (2) 2 (2) 2 (2) NA NA 2 (2) 2 (2) 2 (2)
Tetraciclina 4 (4-8) 4 (4-8) 8 (4-8) 4 (4-8) 4 (4-8) 4 (4) 4 (4) 4 (4-8) 8 (4-8) 4 (4) 4 (4) 4 (4)
Eritromicina 100 (50-100) 100 (50-100) 75 (50-100) 100 (50-100) 75 (50-100) 100 (50-100) 100 (50-100) 100 (100) 100 (100) 100 (50-100) 100 (50-100) 100 (50-100)
Cloranfenicol 2.5 (2.5) 2.5 (2.5) 2.5 (2.5) 2.5 (2.5) 2.5 (2.5) 2.5 (2.5) 2.5 (2.5) 2.5 (2.5) 2.5 (2.5) 2.5 (2.5) 2.5 (2.5) 2.5 (2.5)
Gentamicina 3 (3) 3 (3) 3 (3) 3 (3) 3 (3) 3 (3) 3 (3) 3 (3) 3 (3) 3 (3) 3 (3) 3 (3)
Ofloxacina 0.25 (0.25) 0.25 (0.25) 0.25 (0.25) 0.25 (0.25) 0.25 (0.25) 0.25 (0.25) 0.25 (0.25) 0.25 (0.25) 0.25 (0.25) 0.25 (0.25) 0.25 (0.25) 0.25 (0.25)
0.125 0.125
Levofloxacina 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) (0.125) (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125) 0.125 (0.125)
Acriflavina 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2)
Tioridazina
hidroclorada 10 (5-10) 10 (5-10) 10 (10) 10 (10) 10 (10) 10 (10) 10 (10) 10 (10) 10 (5-10) 10 (10) 10 (10) 10 (10)
Amikacina 0.5 (0.5-1) 1 (1) 0.5 (0.5) 0.5 (0.5) 0.5 (0.5) 0.5 (0.5) 0.5 (0.5) 0.75 (0.5-1) 0.75 (0.5-1) 0.5 (0.5) 0.5 (0.5) 0.5 (0.5)
Bromuro de Etidio 2 (2) 1 (1-2) 2 (2) 1 (1-2) 1.5 (1-2) 1.5 (1-2) 1.5 (1-2) 2 (2) 2 (2) 1.25 (1-2) 1.5 (1-2) 1.5 (1-2)
Safranina 1 (1) 1 (1) 1 (1) 0.5 (0.5-1) 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1) 1 (1)
Bromuro de
cetiltrimetilamonio 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25)
NA: No aplica, plásmido con resistencia a kanamicina.
147
Resultados
4.4.3. Estudio de la virulencia
Estudios previos habían mostrado que la expresión del transportador ABC

Rv1686c-Rv1687c se induce en macrófagos activados [193], por lo que se había
sugerido que este transportador podría tener algún papel en la virulencia de M.
tuberculosis. Por lo anterior se planteó evaluar el efecto de la mutación por deleción y
la sobreproducción del transportador en la virulencia. Para ello se comparó el
crecimiento de las cepas H37Rv, 8687-1 y Δ8687 5.31 en la línea celular de
macrófagos J774 A.1 haciendo un seguimiento de las CFUs durante 7 días.
Como muestra la figura 4.12 ni la mutación, ni la sobreproducción del

transportador tuvieron un efecto significativo en la supervivencia de M. tuberculosis
dentro de los macrófagos.
1,0E+05
1,0E+04
Log CFUs
1,0E+03 H37Rv
8687-1
Δ8687 5.31
1,0E+02
1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (días)
Figura 4.12. CFUs de las cepas H37Rv, 8687-1 que sobreproduce el transportador y el
mutante Δ8687 5.31 infectando la línea celular de macrófagos J774 A.1. Los datos representan
el promedio de como mínimo tres ensayos independientes con tres réplicas técnicas por cepa.
Las barras de error representan la desviación estándar de la media.
También, se evaluó el efecto de la deleción y la sobreproducción de la

dioxigenasa en la virulencia de M. tuberculosis, infectando igualmente la línea celular
de macrófagos J774 A.1. En este caso tampoco se obtuvieron diferencias entre el
mutante, la cepa que sobreproduce la dioxigenasa y la salvaje (Fig. 4.13).
148
Resultados
1,0E+05
Log CFUs
1,0E+04
H37Rv
3161-4.1
Δ3161 2.24
1,0E+03
1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (días)
Figura 4.13. CFUs de las cepas H37Rv, la cepa 3161-4.1 que sobreproduce la dioxigenasa y el
mutante Δ3161 2.24 infectando la línea celular de macrófagos J774 A.1. Los datos representan
el promedio de cómo mínimo tres ensayos independientes y tres réplicas técnicas por cepa.
Las barras de error representan la desviación estándar de la media.
Estos resultados muestran que ni la deleción ni la sobreproducción del

transportador ABC Rv1686c-Rv1687c y la dioxigenasa Rv3161c tienen un efecto en la
virulencia de M. tuberculosis en macrófagos.
4.4.4. Estudio de la resistencia al H2O2
De acuerdo con Schnappinger y colaboradores [193], los genes del posible

transportador ABC se inducen en presencia de H2O2. Este es un estrés encontrado por
la bacteria en el macrófago, por lo que los genes que responden a este estímulo
podrían ser importantes para la supervivencia del patógeno en el huésped. Así pues,
se estudió el papel del transportador en la resistencia de M. tuberculosis al H2O2. Para
ello se evaluó la viabilidad de las cepas H37Rv, 8687-1, 8687-2 y los mutantes Δ8687
5.31, 5.15, 5.16 tras el tratamiento con diferentes concentraciones de H2O2 (8-32 mM)
durante 90 min a 37°C. Los resultados no mostraron diferencias significativas (prueba t
Mann-Whitney) entre las cepas sobreproductoras y los mutantes respecto a la salvaje
H37Rv (Tabla 4.4).
149
Resultados
Tabla 4.4. Recuento de viables (CFU/mL) de la cepa parental H37Rv, las cepas
sobreproductoras 8687-1 y 8687-2 y los mutantes Δ8687 5.31, 5.15, 5.16 tras la exposición a
diferentes concentraciones de H2O2. Se muestra la media y la desviación estándar de tres
experimentos independientes.
[H2O2] H37Rv 8687-1 8687-2 Δ8687 5.31 Δ8687 5.15 Δ8687 5.16
32mM 9.71E+04 1.19E+05 9.33E+04 9.75E+04 9.90E+04 1.00E+05
± 5.40E+04 ± 4.59E+04 ± 1.15E+04 ± 3.54E+03 ± 1.41E+03 ± 7.00E+04
16mM 1.07E+05 1.33E+05 1.32E+05 9.90E+04 1.10E+05 1.02E+05

± 7.33E+04 ± 8.31E+04 ± 3.40E+04 ± 1.41E+03 ± 1.41E+04 ± 9.39E+04
8mM 1.56E+05 1.13E+05 1.78E+05 1.08E+05 1.59E+05 1.07E+05

± 5.39E+04 ± 1.04E+05 ± 5.28E+04 ± 6.33E+04 ± 1.02E+05 ± 1.07E+04
4mM 2.13E+05 1.83E+05 2.12E+05 2.21E+05 1.81E+05 2.17E+05

± 1.56E+05 ± 1.28E+05 ± 1.06E+05 ± 1.36E+05 ± 4.31E+04 ± 6.25E+04
4.5. Estudio de la resistencia a triclosán en M. tuberculosis
Los resultados obtenidos parecían indicar que ni el transportador Rv1686c-

Rv1687c ni la dioxigenasa Rv3161c estaban implicados en la resistencia al TRC. Por
ello se planteó estudiar el papel de las bombas de eflujo y de la impermeabilidad de la
envuelta celular en la resistencia de M. tuberculosis al TRC, así como analizar a nivel
proteómico el efecto del tratamiento con TRC, con el fin de identificar otras posibles
proteínas que pudieran estar implicadas en la respuesta a este desinfectante.
4.5.1. Implicación de bombas de eflujo
Para estudiar si la resistencia al TRC en M. tuberculosis es debida a la

detoxificación por bombas de eflujo, se evaluó el efecto de los inhibidores de bombas
reserpina, CCCP, verapamil y o-vanadato. Para ello, se determinó la CMI de estos
inhibidores en la cepa salvaje H37Rv, cuyos resultados fueron: 48 µg/mL para la
reserpina, 5 µg/mL para el CCCP, 80 µg/mL para el verapamil y >96 µg/mL para el o-
vanadato. Posteriormente se determinó la CMI del TRC en presencia de los
inhibidores de bombas a unas concentraciones sub-inhibitorias de 12 µg/mL para la
reserpina, 1.25 µg/mL para el CCCP, 40 µg/mL para el verapamil y 9 µg/mL para el o-
vanadato, en la cepa H37Rv. Las concentraciones de los inhibidores se eligieron en
base a la literatura ya que no afectan el crecimiento de M. tuberculosis tal y como se
comprobó mediante la determinación de la CMI de estos inhibidores en la cepa salvaje
H37Rv.
Los resultados no mostraron cambios en la CMI del TRC (21.7 µg/mL, 75 µM)
en presencia de reserpina, CCCP u o-vanadato, pero sí se observó una disminución
150
Resultados
en presencia de verapamil (10.85 µg/mL, 37.5 µM). Para estudiar mejor esta
disminución, se hicieron curvas de crecimiento con la cepa H37Rv y el verapamil, en
donde se observó que la concentración utilizada en las CMIs (40 µg/mL) sí afectaba el
crecimiento y que por lo tanto la disminución observada podría estar relacionada con
un efecto tóxico de este inhibidor (Fig.4.14). Cuando se usó una concentración de
verapamil de 20 µg/mL no se observaron cambios en la CMI del TRC.
10
1
OD600600
LogOD
0,1
0.1
H37Rv
H37Rv + Ver 40µg/mL

0,01
0.01
1 2 3 4 5 8 9 10 11 12
Tiempo (días)
Figura 4.14. Crecimiento en medio líquido de M tuberculosis H37Rv en presencia y ausencia

de verapamil a una concentración de 40 µg/mL. Los datos representan el promedio de tres
ensayos independientes. Las barras de error representan la desviación estándar de la media.
Estos resultados sugieren que la resistencia TRC en M. tuberculosis no se

debe a la función de otras bombas de eflujo.
4.5.2. Implicación de la envuelta celular
Para estudiar si la resistencia de M. tuberculosis al TRC está relacionada con la

resistencia natural dada por la envuelta celular del bacilo, se utilizó el etambutol que a
concentraciones sub-inhibitorias afecta en la permeabilidad de la pared sin afectar la
viabilidad del bacilo. En primer lugar se estudió la CMI del TRC en presencia de
etambutol a una concentración 4 veces por debajo de la CMI (0.25 µg/mL) en la cepa
salvaje H37Rv. La CMI obtenida fue la misma que la obtenida en ausencia de
etambutol (75 µM, 21.7 µg/mL). Al no observar cambios en la CMI se realizó el
seguimiento de la OD600 de cultivos de H37Rv en presencia de etambutol, TRC y
ambos a unas concentraciones sub-inhibitorias de 0.3 µg/mL y 18.7 µM,
respectivamente.
151
Resultados
Las curvas de crecimiento mostraron que ni el etambutol ni el TRC solos

afectan el crecimiento de la H37Rv a las concentraciones utilizadas, pero cuando se
combinan se reduce la viabilidad de esta cepa (Fig. 4.15).
1,2
1
*
0,8
OD600
0,6
H37Rv
H37Rv
0,4
Etb
Etb 0.3µg/mL
0,3µg/mL
TRC
TRC 18.7µM
18,7µM
0,2
Etb
Etb 0.3µg/mL
0,3µg/mL + TRC
+ TRC 18.7µM
18,7µM
0
1 2 3 4 5 8 9 10 11 12
Tiempo (días)
Figura 4.15. Crecimiento en medio líquido de la cepa H37Rv con TRC (18.7 µM), etambutol
(0.3 µg/mL) y ambos. Los datos representan el promedio de dos ensayos independientes con
dos réplicas cada uno, las barras de error representan la desviación estándar de la media.
p<0.05 (*) con la prueba t Mann-Whitney.
Este resultado sugiere que parte de la resistencia de M. tuberculosis al TRC

puede ser revertida por concentraciones sub-inhibitorias de inhibidores de la pared
celular como el etambutol y que por tanto parte de la resistencia estaría relacionada
también con la permeabilidad de la envuelta celular.
4.5.3. Análisis proteómico
Con el fin de identificar proteínas que respondan al tratamiento con TRC en M.

tuberculosis, se prepararon extractos proteicos para 2DE y 2D-DIGE que fueron
obtenidos a partir de dos cultivos de H37Rv en fase logarítmica, tratados
independientemente con TRC (5 veces su CMI: 108.5 µg/mL, 375 µM) o con DMSO
(99%) durante 2 h a 37°C. En primer lugar, se llevó a cabo la comparación del perfil
proteico entre los cultivos tratados con TRC y los no tratados (+DMSO) mediante la
técnica de 2D-DIGE. Para ello se utilizaron geles con un gradiente de pH de 4 a 7 ya
que en esta zona se agrupan la mayoría de proteínas. Los extractos proteicos fueron
marcados como se describió en los apartados 3.6.6.3 y 3.6.6.4. Se hicieron dos geles
por cada condición experimental (Fig. 3.15) resultando en un total de cuatro geles.
152
Resultados
Una vez los extractos fueron separados por 2DE, los geles fueron escaneados
y se realizó el análisis de imágenes, donde se observó una mayor abundancia de una
proteína (spot 1, Fig. 4.16) y la disminución en la abundancia de tres proteínas (spots
3, 4 y 7), figura 4.17.
A DMSO TRC
B DMSO TRC
Volumen Normalizado
Figura 4.16. Spot 1 en la muestra no tratada (+DMSO) vs. muestra tratada con TRC. A)
Representación en 3D del perfil del spot 1. B) Representación del volumen normalizado para el
spot 1, cada punto indica el volumen obtenido para cada una de las cuatro réplicas.
153
Resultados
MW
43 7 +
4 7
pI
Figura 4.17. Gel 2D-DIGE de la cepa H37Rv tratada con TRC vs H37Rv no tratada (+DMSO), marcados con Cy3 (Rojo) y Cy5 (verde) respectivamente. Los
spots señalados tuvieron un p<0.05 de acuerdo con el análisis de ANOVA de dos vías y un fold change > 1.5.
154
Resultados
Posteriormente, los geles fueron teñidos con nitrato de plata y los spots fueron
extraídos para ser identificados mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, en
donde el spot 1 fue identificado como la dioxigenasa Rv3161c, cuyo espectro se
muestra la figura 4.18.
B 1 MLSTDNRAEL GDILTDIGDY LDDNPPALSL PPAAYTSSEL WQLERERIFN

51 RSWMLVAHVD QVAKTGDYVT VSVAGEPVMV VRDVDGQLHA LSPICRHRLM
101 LMVEPGAGRI DTLTCQYHLW RYGLDGRLRG APHMAANLDF NRRECRLPQF
151 AVATWNGLVW INLDADAEPI AAHLDLTDDE FAGYRLGEMV QVESWSHEWR
201 ANWKVAAENG HENYHVLGLH RQTLEPFVPG GGDLDVRQYS RWALRLRVPF
251 TVPVEAKSLQ LNEVQKSNLV VLWTFPNSAL AIAGERVVWF GFIPQSIDRV
301 QVLGGVLTTP ELAADAAATA QTSQFVMAMI NDEDRLGLEA VQVGAGSRFA
351 ERGHLSSKEW PGMLAFYRNL AMALVGDHPG AS
Figura 4.18. A) Espectro de masas obtenido para el spot 1, cada pico corresponde a un
péptido derivado de la digestión tríptica de la proteína. B) Secuencia de la proteína codificada
por Rv3161c, en la que se muestran en rojo los péptidos identificados por espectrometría de
masas MALDI-TOF.
El spot 3 fue identificado como la proteína ThiC (Rv0423c), probablemente

implicada en la biosíntesis de tiamina y el spot 4 como una probable peptidasa
citoplasmática llamada PepQ (Rv2535c); sus espectros se muestran en las figuras
4.19 y 4.20 respectivamente. En cuanto al spot 7, su identificación no fue posible ya
sea debido a la baja cantidad de proteína presente en el spot, modificaciones post-
traduccionales que modifican la masa molecular de los péptidos o bien a la falta de
representación de este producto proteico en la base de datos utilizada.
155
Resultados
B 1 MTITVEPSVT TGPIAGSAKA YREIEAPGSG ATLQVPFRRV HLSTGDHFDL

51 YDTSGPYTDT DTVIDLTAGL PHRPGVVRDR GTQLQRARAG EITAEMAFIA
101 AREDMSAELV RDEVARGRAV IPANHHHPES EPMIIGKAFA VKVNANIGNS
151 AVTSSIAEEV DKMVWATRWG ADTIMDLSTG KNIHETREWI LRNSPVPVGT
201 VPIYQALEKV KGDPTELTWE IYRDTVIEQC EQGVDYMTVH AGVLLRYVPL
251 TAKRVTGIVS RGGSIMAAWC LAHHRESFLY TNFEELCDIF ARYDVTFSLG
301 DGLRPGSIAD ANDAAQFAEL RTLGELTKIA KAHGAQVMIE GPGHIPMHKI
351 VENVRLEEEL CEEAPFYTLG PLATDIAPAY DHITSAIGAA IIAQAGTAML
401 CYVTPKEHLG LPDRKDVKDG VIAYKIAAHA ADLAKGHPRA QERDDALSTA
451 RFEFRWNDQF ALSLDPDTAR EFHDETLPAE PAKTAHFCSM CGPKFCSMRI
501 TQDVREYAAE HGLETEADIE AVLAAGMAEK SREFAEHGNR VYLPITQ
péptido derivado de la digestión tríptica de la proteína. B) Secuencia de la proteína ThiC, en la
que se muestran en rojo los péptidos identificados por espectrometría de masas MALDI-TOF.
156
Resultados
B 1 MTHSQRRDKL KAQIAASGLD AMLISDLINV RYLSGFSGSN GALLVFADER

51 DAVLATDGRY RTQAASQAPD LEVAIERAVG RYLAGRAGEA GVGKLGFESH
101 VVTVDGLDAL AGALEGKNTE LVRASGTVES LREVKDAGEL ALLRLACEAA
151 DAALTDLVAR GGLRPGRTER QVSRELEALM LDHGADAVSF ETIVAAGANS
201 AIPHHRPTDA VLQVGDFVKI DFGALVAGYH SDMTRTFVLG KAADWQLEIY
251 QLVAEAQQAG RQALLPGAEL RGVDAAARQL IADAGYGEHF GHGLGHGVGL
301 QIHEAPGIGV TSAGTLLAGS VVTVEPGVYL PGRGGVRIED TLVVAGGTPK
351 MPETAGQTPE LLTRFPKELA IL
péptido derivado de la digestión tríptica de la proteína. B) Secuencia de la proteína pepQ, en la
que se muestran en rojo los péptidos identificados por espectrometría de masas MALDI-TOF.
También se utilizaron geles con un gradiente de pH de 7 a 11 NL (No lineal)

que fueron teñidos con nitrato de plata y que se muestran en la figura 4.21.
157
Resultados
MW
A
+
-
7 11
pH- PI
MW
B +
-
7 11
pH- PI
Figura 4.21. Geles 2DE de pH 7-11 NL teñidos con nitrato de plata. A) H37Rv no tratada
(+DMSO) B) H37Rv tratada con TRC. Los geles fueron cargados con 100µg de proteína total.
El marcador de masa molecular utilizado fue el BenchMark™ de Invitrogen.
El análisis comparativo de imágenes no mostró diferencias significativas en los

perfiles proteicos comparados en este gradiente de pH.
158
Discusión
Discusión
5. Discusión
La alta mortalidad y morbilidad asociada a la tuberculosis, la convierte en uno

de los principales problemas de salud pública mundial. La quimioterapia es una de las
principales herramientas de control de esta enfermedad a falta de una vacuna más
efectiva, sin embargo el incremento en la prevalencia de la tuberculosis está
estrechamente relacionado con la aparición de cepas resistentes, por lo que es
necesaria una mejor comprensión de los mecanismos de resistencia, con el fin de
desarrollar fármacos más eficaces [138].
La implementación de tecnologías de biología molecular y la secuenciación del

genoma de M. tuberculosis y otras micobacterias han permitido incrementar el
conocimiento de los mecanismos de resistencia a los principales fármacos usados en
el tratamiento, aunque aún queda mucho por dilucidar [184].
La resistencia en M. tuberculosis está dada principalmente por la

impermeabilidad de la pared celular, la generación de mutaciones en genes diana, la
presencia de enzimas que inactivan el fármaco y las bombas de eflujo. Muchos de
estos mecanismos se inducen en respuesta al tratamiento, permitiéndole a la bacteria
adaptarse y sobrevivir [137]. En este contexto, en este trabajo se estudió la implicación
del posible transportador ABC Rv1686c-Rv1687c y la posible dioxigenasa Rv3161c de
M. tuberculosis en la resistencia a fármacos. Estudios previos habían mostrado que
dichos sistemas se inducen en respuesta al TRC y a otros compuestos, sugiriendo que
podrían formar parte de los mecanismos de detoxificación de M. tuberculosis [129,
189-192].
El transportador ABC Rv1686c-Rv1687c, la dioxigenasa Rv3161c y la resistencia

en M. tuberculosis
En primer lugar se estudió la respuesta a nivel transcripcional de los genes

Rv1687c y Rv3161c al tratamiento con TRC. Los resultados obtenidos confirmaron
que estos sistemas se inducen en la cepa H37Rv en presencia de TRC tal y como
había sido reportado anteriormente por Betts y colaboradores [189] y Sullivan y
colaboradores [129].
Para estudiar el papel de estos genes en la resistencia se construyeron

mutantes deficientes en estos sistemas usando como referencia la cepa H37Rv
(apartado 4.2) así como cepas sobreproductoras usando el vector de expresión
pMV261 (apartado 4.3). Se determinó entonces la CMI del TRC y de otros compuestos
159
Discusión
(apartado 4.4.2), en donde no se observaron diferencias significativas entre la cepa

salvaje H37Rv, la cepa control H37Rv (pMV261), los mutantes y las cepas
sobreproductoras tanto del transportador como de la dioxigenasa. Este resultado fue
inesperado teniendo en cuenta la posible función de estas proteínas y el hecho de que
su expresión se induce en presencia de TRC. Así mismo, en el caso de las cepas
sobreproductoras, se descartó un fallo en la sobreproducción de las proteínas ya que
su expresión se confirmó a nivel transcripcional y proteico (apartado 4.3.1).
Por lo tanto aunque estos sistemas se inducen en presencia de TRC, su

inducción parece no estar relacionada con la resistencia de M. tuberculosis al TRC ni a
otros compuestos ensayados en este trabajo. Entonces, por qué se inducen estos
genes en presencia del TRC? Una hipótesis podría ser que estos sistemas podrían
detoxificar otros metabolitos generados en respuesta al daño inducido por el TRC. En
el caso del transportador, éste podría transportar componentes de la pared celular
para compensar el daño causado por la interferencia en la síntesis de los ácidos
micólicos, como ha sido sugerido para el transportador Mmr de M. tuberculosis [158]
que aunque no está implicado en el eflujo de isoniacida, es inducido por la isoniacida,
la cual comparte la misma diana del TRC, la InhA. En bacterias como E. coli y
Salmonella enterica, se ha descrito la sobreexpresión de genes implicados en la
síntesis de la pared celular tras el tratamiento con TRC como mecanismo de
protección [116, 235]. Así mismo, en M. tuberculosis se ha observado la inducción de
genes relacionados con la síntesis de la pared en respuesta al tratamiento con
etionamida, entre otros [191]. Por lo tanto, algunas proteínas de membrana pueden
contribuir a eventos de remodelación de la pared en respuesta al estrés ambiental y es
posible que el TRC en M. tuberculosis induzca una respuesta similar que resulte en la
expresión de mecanismos que contrarresten el efecto deletéreo del biocida [105, 236].
El TRC en M. tuberculosis bloquea la síntesis de ácidos micólicos por inhibición

de la enoil reductasa InhA [110]. Esta inhibición es 10000 veces menos eficiente en
comparación con su homóloga en E. coli FabI [237]. Este hecho explicaría la mayor
resistencia de M. tuberculosis que tiene altos valores de CMI (~5-12 µg/mL) [110, 129,
189] comparados con los bajos valores obtenidos en E. coli (<1 µg/mL) [106, 111, 113,
235]. Sin embargo, es posible que M. tuberculosis tenga otros mecanismos que
contribuyan a esta resistencia. Así pues, luego de descartar la implicación del
transportador y la dioxigenasa, se planteó evaluar otros factores que podrían estar
relacionados con la resistencia de M. tuberculosis al TRC. Uno de ellos fue el papel de
otras posibles bombas que pudieran detoxificar el TRC. Para ello se determinó la CMI
del TRC en presencia de los inhibidores de bombas CCCP, verapamil, o-vanadato y
160
Discusión
reserpina en la cepa H37Rv (apartado 4.5.1). Compuestos como el CCCP y el

verapamil afectan el gradiente electroquímico de la membrana por disipación de la
fuerza protónica motriz y por el bloqueo de los canales de calcio, respectivamente [78,
238]. Por su parte, el o-vanadato inhibe la acción de bombas de eflujo que utilizan la
hidrólisis del ATP como fuente de energía [239] y la reserpina es un alcaloide vegetal
con una amplia especificidad de sustrato que interacciona con ciertas bombas de
eflujo como NorA de S. aureus, Bmr de Bacillus subtilis y la glicoproteína P en
mamíferos [239, 240]. Estos compuestos han mostrado ser unos inhibidores efectivos
de sistemas de eflujo intrínsecos en micobacterias [78, 238]. Los resultados obtenidos
en este trabajo no mostraron ningún efecto de los inhibidores ensayados, que pudiera
reflejarse en cambios en la CMI del TRC descartando así la implicación de bombas en
la resistencia al biocida.
Otro de los factores que juega un papel importante en la resistencia intrínseca

de M. tuberculosis es su envuelta celular, ya que ésta es una barrera muy eficiente
que impide el paso de muchos fármacos. Para evaluar si parte de la resistencia
intrínseca al TRC estaba dada por la pared se utilizó etambutol el cual a
concentraciones sub-inhibitorias aumenta la permeabilidad de la envuelta de M.
tuberculosis, como ha sido evidenciado en otros trabajos en los que lo han utilizado
para aumentar la eficacia de fármacos como la claritromicina [228], isoniacida,
rifampicina, estreptomicina [229] y cefepime [230]. En otras bacterias como P.
aeruginosa, se ha observado que la pared celular está implicada en la resistencia al
TRC, de manera que el uso de agentes permeabilizantes como la polimixina B, el
compuesto 48/80 y el EDTA, hace que esta bacteria sea más susceptible al biocida
[241]. Los resultados obtenidos en M. tuberculosis mostraron que aunque no se
observaron variaciones en la CMI del TRC en presencia de etambutol, sí se observó
una ligera disminución en el crecimiento de M. tuberculosis H37Rv cuando se hizo el
seguimiento de la OD600 en presencia de etambutol y TRC (apartado 4.5.2), por lo que
es posible que la pared tenga un papel en la resistencia de M. tuberculosis al biocida.
La no variación de la CMI puede estar relacionada con el bajo efecto del etambutol y la
concentración utilizada (0.25 µg/mL) que fue ligeramente menor que la utilizada en las
curvas de crecimiento (0.3 µg/mL).
Por último, se estudió la respuesta de M. tuberculosis al tratamiento con TRC,

pero a nivel proteico. Para ello se comparó el proteoma de cultivos de H37Rv tratados
y no tratados con TRC (apartado 4.5.3). Los resultados mostraron que el tratamiento
de M. tuberculosis con TRC produce una mayor abundancia de dioxigenasa Rv3161c,
sin embargo no se detectó la inducción ni del transportador ni de otras proteínas.
161
Discusión
La proteína codificada por Rv3161c fue detectada en un gradiente de pH de 4 a

7 y cabe resaltar que la detección del transportador u otras proteínas pudo verse
afectada por las limitaciones de la técnica de 2DE, en la que la obtención de geles del
gradiente de pH básico (en donde se esperaba encontrar el transportador) es
significativamente más compleja dada la dificultad de enfocar proteínas básicas. Así
mismo con esta técnica es difícil detectar proteínas que se encuentran en baja
abundancia o proteínas de membrana las cuales son difíciles de resolver e identificar
[236].
También se observó que el efecto del tratamiento con TRC en M. tuberculosis

resulta en una disminución en la abundancia de tres proteínas, de las cuales dos
pudieron ser identificadas: la proteína hipotética ThiC (Rv0423c) y la peptidasa
hipotética PepQ (Rv2535c). La proteína ThiC está implicada en la síntesis de la
tiamina o vitamina B1, la cual es un importante cofactor de varias enzimas de vías
metabólicas como la glicólisis, la vía de la pentosa fosfato, el ciclo de los ácidos
tricarboxílicos y la síntesis de aminoácidos [242, 243]. En M. tuberculosis, el gen
codificante para esta proteína es esencial para el crecimiento in vitro [244, 245]. Por su
parte la peptidasa PepQ podría estar implicada en la digestión molecular y reducción
de proteínas a aminoácidos que serán utilizados en diferentes procesos celulares
como fuentes de energía o como subunidades para la biosíntesis. En M. tuberculosis,
la mutación del gen codificante para esta peptidasa reduce el crecimiento in vitro de
H37Rv [244]. El análisis de expresión génica realizado por Betts y colaboradores [189]
no reporta la identificación de estas proteínas en particular, pero no se descarta que
formen parte de los 23 genes des-regulados que pertenecen a la misma clase
funcional (metabolismo intermediario y respiración) que ThiC y PepQ de acuerdo al
Tuberculist, ya que ese trabajo no lista la totalidad de genes obtenidos. La disminución
en la abundancia de estas proteínas puede también estar relacionada con algún
cambio en la traducción o con la vida media de estas proteínas.
Por otro lado, en el mismo estudio se detectaron 207 genes inducidos y 168
genes des-regulados en respuesta al tratamiento con TRC (5 veces la CMI) [189], por
lo que los resultados a nivel transcripcional no reflejan los obtenidos en este trabajo a
nivel proteómico, en el que se detectó sólo una proteína en mayor abundancia y tres
en menor. Esta diferencia podría estar relacionada con modificaciones post
traduccionales así como las limitaciones inherentes a las técnicas utilizadas [246]. Este
hecho pone de manifiesto que los patrones de expresión génica son necesarios pero
insuficientes por si solos en el estudio de un sistema biológico [246].
162
Discusión
La respuesta de M. tuberculosis al TRC a nivel proteico difiere de la de otros

microorganismos como E. coli en el que hay un aumento de proteínas como FabI,
bombas de eflujo como TolC, proteínas de membrana relacionadas con virulencia
como OmpA, Ompx y NmpC y otras proteínas involucradas en el metabolismo general
[247]. Así mismo, en S. enterica también se detectó un aumento en la abundancia de
FabI, TolC y de una serie de proteínas relacionadas con la producción de energía
celular consistente con un incremento en su demanda para ser utilizada en los
mecanismos de defensa celular y reparación [116, 248]. Por lo que la respuesta al
TRC es caso-dependiente y obedece al tipo de bacteria, la concentración del biocida y
otras variables del entorno [249, 250].
Los genes Rv1686c-Rv1687c y Rv3161c y la virulencia de M. tuberculosis
Una de las características más importantes de M. tuberculosis es su capacidad

para sobrevivir y proliferar en el interior de los macrófagos, siendo capaz de adaptarse
a ambientes muy diferentes como los encontrados en los fagosomas y los granulomas
[251]. En gram negativos las bombas de eflujo se han relacionado con múltiples
funciones relacionadas con la virulencia, incluyendo la colonización del intestino, la
adherencia y la invasión de las células [89]. Algunas bombas de M. tuberculosis
participan en actividades similares posiblemente para asegurar la supervivencia
intracelular contribuyendo así a la virulencia del bacilo [252]. Por ejemplo el
transportador BacA codificado por Rv1819c juega un rol en el mantenimiento de la
infección crónica en ratones y aunque no está implicado en el transporte de
antimicrobianos se ha sugerido que éste puede participar en el transporte de ciertos
péptidos antimicrobianos y lípidos que son importantes en la progresión de la infección
en el huésped [253, 254]. Por su parte, el operón formado por lpfG (Rv1411) y P55
(Rv1410) es requerido para mantener la composición normal de la superficie celular en
M. smegmatis y mutantes de Rv1411 en M. tuberculosis que no producen LprG o P55
generan cepas atenuadas en ratón; además, P55 está implicado en la respuesta al
estrés oxidativo y el crecimiento normal in vitro [165, 255, 256].
Otros estudios han mostrado que cuando M. tuberculosis infecta macrófagos,

es más resistente a la isoniacida y a la rifampicina; este hecho fue explicado por la
presencia de la bomba de eflujo Rv1258c que media la tolerancia a la rifampicina y
que además promueve el crecimiento bacteriano intracelular en ausencia de
antimicrobianos y que por tanto es considerada como un factor de virulencia. Además,
esta bomba junto con otras anotadas en el genoma, se inducen a nivel transcripcional
163
Discusión
una vez infectan los macrófagos como respuesta a los diferentes mecanismos de
defensa del huésped [252].
Dentro de las bombas que son inducidas en macrófagos se encuentra el

transportador ABC Rv1686c-Rv1687c, que también es inducido en respuesta al H2O2 y
a la privación de nutrientes [193, 194]. Por lo anterior, se evaluó el papel de este
transportador en la virulencia de M. tuberculosis, infectando la línea de macrófagos
J774 A.1 con el mutante Δ8687 5.31, la cepa sobreproductora 8687-1 y la H37Rv
como control (apartado 4.4.3). Los resultados obtenidos no mostraron diferencias entre
la cepa control, el mutante y la cepa sobreproductora. Así mismo, aunque no habían
reportes en la bibliografía que relacionaran la dioxigenasa con la virulencia, se evaluó
el efecto de la mutación y la sobre producción de este sistema en la virulencia de M.
tuberculosis en macrófagos pero no se encontraron diferencias entre las cepas
ensayadas y el control.
También, se realizaron ensayos con H2O2 para estudiar la resistencia de M.

tuberculosis a este compuesto. Para ello se evaluó la viabilidad de las cepas H37Rv,
las cepas sobreproductoras del transportador y los mutantes, pero los resultados
tampoco mostraron diferencias entre las cepas sobreproductoras, los mutantes
respecto a la H37Rv.
En conjunto, estos resultados apuntan a que ni el transportador ABC ni la

dioxigenasa están relacionados con la virulencia de M. tuberculosis, ni tampoco son
genes esenciales en la proliferación del bacilo al interior de los macrófagos,
confirmando lo descrito por Rengarajan y colaboradores quienes en un análisis de
mutagénesis por transposones, no observaron que estos sistemas estuvieran
relacionados con la proliferación del bacilo [257]. Sin embargo en el caso del
transportador, su inducción podría estar relacionada con algún mecanismo
compensatorio como respuesta a la presión ejercida por el sistema inmune del
huésped.
Hay que tener en cuenta que los resultados obtenidos en los ensayos de
infección pudieron verse influenciados por el hecho de trabajar con macrófagos no
activados con IFN-γ. Igualmente este tipo de ensayos son in vitro y estas condiciones
no son las mismas que las encontradas in vivo, por lo que sería interesante estudiar el
efecto de la mutación y la sobreproducción del transportador en un modelo animal que
permita evaluar una respuesta que sea más acorde con la realidad.
164
Conclusiones
Conclusiones
6. Conclusiones
1. La expresión de los genes Rv1687c y Rv3161c se inducen unas 1000 veces a

nivel transcripcional en respuesta al tratamiento con triclosán.
2. El tratamiento de M. tuberculosis con triclosán induce una mayor abundancia

de la proteína codificada por Rv3161c y una disminución en la abundancia de
las proteínas ThiC y PepQ.
3. Ni el transportador ABC Rv1686c-Rv1687c ni la dioxigenasa Rv3161c están

directamente implicados en la resistencia de M. tuberculosis al triclosán u otros
antibióticos ensayados en este trabajo.
4. Los genes Rv1686c-Rv1687c y Rv3161c no son necesarios para la virulencia

de M. tuberculosis en macrófagos in vitro.
5. La resistencia natural al triclosán en M. tuberculosis no parece ser debida a la

actividad de bombas de eflujo.
6. La impermeabilidad de la pared celular sería en parte responsable de la

resistencia intrínseca de M. tuberculosis al triclosán.
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Mycobacterium tuberculosis adaptation and survival in macrophages. Proc Natl
Acad Sci U S A, 2005. 102(23): p. 8327-32.
187
Agradecimientos
Durante estos años son muchas las personas a las que he tenido la suerte de
conocer y que han hecho parte de esta “aventura”. Sé que serán pocas las palabras
para expresarles mis agradecimientos; espero no olvidar a nadie…
En primer lugar a Isidre por haber depositado su confianza en mí, por haber
permitido que me incorporase a su grupo en el que me he sentido como en casa y por
su apoyo incondicional en todo momento, sobre todo en los más difíciles, para él un
simple gracias no es suficiente….
También quiero agradecer a Núria por enseñarme a trabajar con micobacterias

en “tiempo record” y por todos sus aportes al desarrollo de este trabajo.
A mis compañeros de laboratorio: Mario por introducirme en el “mágico mundo

del 2D”, por su disposición y paciencia para enseñar y ayudar a resolver mis líos
proteómicos (que no fueron pocos). Raquel por sus consejos y por siempre estar
dispuesta a responder a mis preguntas. Gracias a los dos por sus palabras de ánimo,
ustedes son simplemente geniales! A Paula por escucharme y por tener siempre una
sonrisa para todos y contagiarnos con su optimismo. A Pol por su buena energía, es
un compañero de labo estupendo! A Daniel por la revisión de esta tesis y por llevarnos
merienda de vez en cuando J. A Elías por darle vidilla al labo con sus “hits” de la radio
y por supuesto los tererés!! A Ignasi, Anaïs y Gerard por siempre estar dispuestos a
echarme una mano…. Todos han contribuido de alguna manera a que el día a día
fuera más ameno.
Quisiera también agradecer al servicio de cultivo celular, especialmente a Fran

por su ayuda con mis células y por los buenos momentos que nos hace pasar a los
“inquilinos” de cultivo.
A los demás labos del IBB que muchas veces me “salvaron la vida” dejándome
algún reactivo. También a Alicia por estar siempre dispuesta a echarnos una mano con
toda la burocracia de la ciencia.
Al departamento de Genètica i Microbiologia y a las chicas de los integrados

del C5 por su ayuda con las prácticas.
A Jose A. Aínsa y Liliana Rodrigues por abrirme las puertas de su laboratorio

en Zaragoza, por su amabilidad y hospitalidad así como a Jose Dominguez y Cristina
Prat por su amable ayuda en Can Ruti.
189
También a mis amigos, que han estado ahí en las buenas y sobre todo en las
malas y que aunque a muchos nos separan miles de kilómetros los llevo en el
corazón. Es lindo saber que cuento con personas así. Caro López… gracias por estar
a mi lado siempre. A mis “mexicans” Eve y Abraham y también a Paula con los que
pasé momentos geniales! A Dolors por compartir su casa conmigo. A los FIDIC:
Carlos, Pili, Paula, Cami, Yago, Adri, Oscar, Jair, Alvaro, Angie, las Caros, Juanca,
Diana, Sandra, Cathe, Fer y Manuel… allí empezó todo…
A mis padres Miryam y Jaime y a Leo, qué les puedo decir…son el motor de mi
vida, gracias por su constante apoyo, sus consejos y por soportar mis estados
“bipolares”… soy muy afortunada de tener la familia que tengo!!!!. También al resto de
mi familia al “otro lado del charco”: Julia, Alexa, mis abues, Consuelo y a Janis.
Y por último y no menos importante a Gus, por su infinito amor, comprensión y

apoyo en todo momento… no tengo palabras para expresar mi agradecimiento, es un
privilegio tenerlo en mi vida! Esta tesis también es suya.
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ESTUDIO DE LA IMPLICACIÓN DE LOS

GENES Rv1686c-Rv1687c y Rv3161c DE

ANDROMEDA CELESTE GÓMEZ CAMACHO

Departament de Genètica i de Microbiologia

Estudio de la implicación de los genes

Tesis Doctoral presentada por

Visto bueno de los Directores de la Tesis,

Dr. Isidre Gibert González Dra. Núria Andreu Martín

Resumen ........................................................................................ vii

1.1. La Tuberculosis en el mundo ........................................................................... 1

1.2. Mycobacterium tuberculosis ............................................................................ 4

1.2.1. Características generales del género Mycobacterium .................................. 4

1.2.2. Genoma de M. tuberculosis .......................................................................... 6

1.2.3. Proteoma de M. tuberculosis......................................................................... 8

1.2.4. Envuelta de M. tuberculosis ........................................................................ 10

1.2.4.1. Membrana celular ................................................................................. 12

1.2.4.2. Pared celular......................................................................................... 12

1.2.4.3. Cápsula ................................................................................................. 13

1.2.4.4. Proteínas similares a porinas ............................................................... 13

1.3. Patogénesis ...................................................................................................... 14

1.4. Interacciones huésped-patógeno ................................................................... 16

1.4.1. Factores de virulencia ................................................................................. 16

1.4.2. Respuesta inmune ...................................................................................... 17

1.4.2.1. Mecanismos de evasión de la respuesta inmune ................................. 19

1.5. Diagnóstico ...................................................................................................... 21

1.6. Prevención ........................................................................................................ 23

1.6.1. BCG ............................................................................................................. 23

1.6.2. Nuevas vacunas .......................................................................................... 24

1.7. Tratamiento ...................................................................................................... 27

1.7.1. Esquema general ........................................................................................ 27

1.7.2. Tratamiento de cepas resistentes y multirresistentes ................................. 29

1.7.3. Tratamiento de pacientes VIH positivo........................................................ 30

1.7.4. Nuevos fármacos ........................................................................................ 31

1.8. Resistencia ....................................................................................................... 32

1.8.1. Mecanismos de Resistencia ........................................................................ 33

1.8.1.1. Sistemas de eflujo ................................................................................ 34

1.8.1.1.1. Transportadores ABC .................................................................... 36

1.8.1.1.2. Transportadores MFS .................................................................... 37

1.8.1.1.3. Transportadores MATE .................................................................. 38

1.8.1.1.4. Transportadores SMR .................................................................... 38

1.8.1.1.5. Transportadores RND .................................................................... 39

1.8.1.2. Resistencia por modificación o degradación enzimática del antibiótico 39

1.8.1.2.1. Hidrólisis ......................................................................................... 40

1.8.1.2.2. Resistencia por transferencia de grupo ......................................... 41

1.8.1.2.3. Otros mecanismos de resistencia enzimática ................................ 42

1.8.1.2.3.1. Enzimas redox ......................................................................... 42

1.8.1.2.3.2. Liasas ...................................................................................... 42

1.8.1.3. Resistencia por alteración de la diana .................................................. 43

1.8.2. Papel de los biocidas en resistencia ........................................................... 43

1.8.2.1. Triclosán ............................................................................................... 44

1.8.3. Mecanismos de resistencia en M. tuberculosis ........................................... 47

1.8.3.1. Resistencia intrínseca ........................................................................... 48

1.8.3.1.1 Sistemas de eflujo ........................................................................... 48

1.8.3.1.2. Sistemas de modificación .............................................................. 53

1.8.3.2. Resistencia adquirida ........................................................................... 54

1.8.3.3. Inducción de sistemas de detoxificación en M. tuberculosis ................ 57

1.8.3.3.1. Posibles sistemas de detoxificación de M. tuberculosis Rv1685c-