Manual Tecnicas Serologicas-2019-V4 Brucelosis

BRUCELOSIS
(B. abortus, B. melitensis, B. suis)
2019
Laboratorio de Referencia OIE/FAO para Brucelosis

Coordinación de Bacteriología
Dirección de Laboratorio Animal
Dirección General de Laboratorios y Control Técnico
Brucelosis
MANUAL DE DIAGNÓSTICO
SEROLÓGICO
Versión 4.0/2019
Elaborado por: Departamento Brucelosis (Laboratorio de Referencia para OIE/FAO)

Ana M. Nicola, M.V., MSc.
Sebastián Elena, M.V., MSc.
Cristina Franco, Vet., MSc.
Aprobado por:
Bernardo Alonso, M.V. Coordinación Bacteriología
Eduardo Maradei, M.V. Dirección Laboratorio Animal
Carlos Zenobi, M.V., MSc. Dirección General de Laboratorios y Control Técnico
OBJETIVO
El presente Manual tiene como objetivos:
▪ Colaborar con el mejor desempeño y competencia de los Laboratorios que

realizan el diagnóstico serológico de la Brucelosis en diferentes especies animales inscriptos en la Red
de Laboratorios de SENASA.
▪ Proporcionar a la Red de Laboratorios de SENASA un instrumento que facilite el

desarrollo adecuado, sistematizado y estandarizado de los procedimientos técnicos que se realizan en
los laboratorios.
▪ Contribuir a la aplicación de las medidas de bioseguridad y controles de calidad

que deben cumplirse, cuando se desarrolle un procedimiento técnico.
▪ Contar con un instrumento que sirva de guía para la evaluación y monitoreo de

las actividades del laboratorio.
Las técnicas diagnósticas descriptas en el presente Manual son las internacionalmente reconocidas y
recomendadas por la ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL (OIE) y EL SENASA.
Página 2 de 65
SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis)
INDICE
Definiciones y Abreviaturas 4
Medidas Generales de Bioseguridad y Seguridad en el Laboratorio 5
Introducción Brucelosis 9
Procedimientos de Trabajo (ingreso/rechazo de muestras) 14
Prueba de screening con antígenos tamponados en placa (BPAT y RBT) 17
Prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT y 2-ME) 20
Prueba de anillo en leche 26
ELISA Indirecto 29
ELISA por competición / bloqueo 32
Ensayo de Polarización Fluorescente 35
Fijación de complemento 38
Normativa vigente 57
Informe de la Subcomisión Técnica de la Comisión Nacional de Brucelosis 58
Anexo I Lavado y desinfección de manos 60

Anexo II Modelo de Planilla de emisión de resultados 62
Bibliografía 64
Página 3 de 65
DEFINICIONES / ABREVIATURAS
Ag: Antígeno
Biovariedad: bv
BPAT (Buffered plate antigen test): Aglutinación con antígeno bufferado en placa
CELISA: Enzimoinmunoensayo competitivo
C’: Complemento de cobayo
DILAB: Dirección General de Laboratorios y Control Técnico
DLA: Dirección de Laboratorio Animal
DNSA: Dirección Nacional de Sanidad Animal
DT: Dilución de Trabajo
ELISA: Enzimoinmunoensayo
FCT: Fijación de Complemento test
FPA: Ensayo de Polarización Fluorescente
GR: Glóbulos Rojos
IELISA: Enzimoinmunoensayo Indirecto
IgG: Inmunoglobulina G
IgM: Inmunoglobulina M
LPS: Lipopolisacárido
2-ME: 2- Mercaptoethanol
M: Molar
mP: milipolarización
MRT (PAL): Prueba de anillo en leche
OIE: Organización Mundial de Sanidad Animal
PAC: Poder anticomplementario
RBT: Rosa de Bengala Test
RENSPA: Registro Nacional Productor Agropecuario
SAT: Seroaglutinación lenta en tubo
SENASA: Servicio de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
SH: Sistema Hemolítico
UI/ml: Unidades Internacionales por mililitro
UIFCT/ml: Unidad Internacional fijadora del complemento Test por mililitro
UA: Unidad de Antigeno
UC: Unidad de Complemento
UH: Unidad de Hemolisina
Página 4 de 65
MEDIDAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD Y SEGURIDAD EN EL
LABORATORIO
Se entiende por Bioseguridad: "La disciplina que trata el manejo seguro y la contención de
microorganismos infecciosos y materiales biológicos peligrosos". La práctica del manejo seguro de
microorganismos patógenos y sus toxinas en el laboratorio biológico se realiza a través de la aplicación
de los principios de contención y la evaluación de riesgos.
Principios de Bioseguridad: El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para
manejar materiales infecciosos en el medio ambiente del laboratorio, donde son manipulados o
conservados. El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en
laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos.
La contención primaria, la protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de
la exposición a agentes infecciosos, es provista tanto mediante buenas técnicas microbiológicas como a
través del uso de Equipos de Protección Personal (EPP) de seguridad adecuados. La aplicación de
vacunas al personal cuando corresponda, puede brindar un mayor nivel de protección del personal.
La contención secundaria, la protección del medio ambiente externo al laboratorio de la exposición a
materiales infecciosos, se logra a través de una combinación del diseño de la instalación y prácticas
operativas.
Por lo tanto, los tres elementos de contención incluyen prácticas y técnicas de laboratorio,
equipos de seguridad y el diseño de la instalación. La evaluación del riesgo del trabajo a realizar
con un agente específico determinará la combinación apropiada de estos elementos.
Prácticas y Técnicas de Laboratorio. El elemento más importante de la contención es el cumplimiento

estricto de las prácticas y técnicas microbiológicas estándares. Las personas que trabajan con agentes
infecciosos o materiales potencialmente infectados deben conocer los riesgos potenciales, y también
deben estar capacitados y ser expertos en las prácticas y técnicas requeridas para manipular dichos
materiales en forma segura.
El director o la persona a cargo del laboratorio es responsable de brindar u organizar la capacitación
adecuada del personal.
Cada laboratorio está obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de bioseguridad que
identifique los riesgos que se encontrarán o puedan producirse, y que especifique las prácticas y
procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a estos riesgos. Se debe alertar al
personal acerca de los riesgos especiales y se le debe exigir que lea y cumpla las prácticas y
procedimientos requeridos. El personal capacitado y bien informado acerca de las técnicas de
laboratorio adecuadas, procedimientos de seguridad y riesgos asociados a la manipulación de agentes
infecciosos debe ser el responsable de la conducción de los trabajos con cualquier agente o material
infeccioso. Esta persona tiene la obligación de consultar a profesionales especializados en bioseguridad
u otros profesionales de la salud y seguridad respecto de la evaluación del riesgo. Cuando las prácticas
de laboratorio estándares no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o a un
procedimiento de laboratorio particular, quizás sea necesario aplicar medidas adicionales. El director del
laboratorio es responsable de seleccionar prácticas de seguridad adicionales, que deben guardar
relación con los riesgos relacionados con el agente o procedimiento.
Prácticas operativas seguras y hábitos personales
▪ El acceso al laboratorio debe ser limitado o restringido.

▪ El laboratorio debe ser diseñado para que su limpieza sea sencilla. Las superficies de las mesas de
trabajo deben ser impermeables al agua y ser resistentes al calor moderado y a solventes orgánicos,
ácidos, álcalis y productos químicos utilizados para descontaminar la superficie de trabajo y los equipos.
▪ Los muebles de laboratorio deben tener la capacidad de soportar cargas y usos previstos. Los espacios
entre las mesas de trabajo, gabinetes y equipos deben ser accesibles para su limpieza.
▪ Cada laboratorio debe contener una pileta para el lavado de manos.
▪ La iluminación debe ser adecuada para todas las actividades, evitando los reflejos y el brillo que puedan
molestar la visión.
▪ Si el laboratorio tiene ventanas que se abren hacia el exterior, deben estar provistas de mosquiteros.
▪ Se debe usar ambos, delantales, batas o uniformes de laboratorio de protección adecuados durante la
permanencia en el mismo.
▪ Se debe retirar y dejar esta ropa de protección en el laboratorio antes de dirigirse a otras áreas (por
ejemplo, cafetería, biblioteca, oficinas administrativas), se debe usar además, calzado cerrado y cabello
recogido.
Página 5 de 65
▪ Se debe usar guantes cuando es probable que las manos entren en contacto con materiales
infecciosos, superficies o equipos contaminados. Puede ser apropiado el uso de dos pares de guantes.
Se deben descartar los guantes cuando están contaminados, y se retiran cuando se completa el trabajo
con los materiales infecciosos o, cuando está comprometida la integridad del guante. Los guantes
descartables no se lavan, no se vuelven a usar, ni se utilizan para tocar superficies “limpias” (teclados,
teléfonos, picaportes, entre otros), y no se deben usar fuera del laboratorio.
▪ No está permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse o almacenar
alimentos para uso humano en áreas de trabajo.
▪ Se debe utilizar protección ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras
de microorganismos u otros materiales peligrosos. Las personas que usan lentes de contacto en
laboratorios deben también utilizar antiparras o un protector facial.
▪ Las personas deben lavarse las manos luego de manipular materiales viables, luego de quitarse
los guantes y antes de retirarse del laboratorio. (Ver Anexo I).
▪ Los alimentos se almacenan fuera del área de trabajo en gabinetes o refrigeradores designados y
utilizados con este único fin.
▪ Está prohibido pipetear con la boca; se debe utilizar dispositivos de pipeteo mecánicos. Se debe aplicar
políticas para el manejo seguro de objetos cortantes o punzantes.
▪ Todos los procedimientos se llevan a cabo con precaución a fin de minimizar la creación de
salpicaduras o aerosoles.
▪ Las superficies de trabajo se descontaminan como mínimo una vez por día, luego de finalizar las tareas
y ante todo derrame de material viable.
▪ Todos los cultivos, stocks y otros desechos reglamentados se descontaminan antes de ser desechados
mediante un método de descontaminación aprobado, como por ejemplo, mediante autoclave. Los
materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato son colocados en un recipiente
duradero, estanco y cerrado para su transporte desde el laboratorio. Los materiales que se deben
descontaminar fuera del laboratorio inmediato se embalan de conformidad con las normas locales,
estatales y federales aplicables antes de retirarlos del establecimiento de acuerdo a las indicaciones de
la Ley 24.051 de Residuos Peligrosos.
▪ Hojas de seguridad: (en inglés, Material Safety Data Sheet o MSDS) es un documento que indica las
particularidades y propiedades de una determinada sustancia para su uso más adecuado. El principal
objetivo de esta hoja es proteger la integridad física del operador durante la manipulación de la
sustancia. Esta hoja o ficha contiene las instrucciones detalladas para su manejo y persigue reducir los
riesgos laborales y medioambientales.
▪ El laboratorio debe tener las hojas de cada sustancia química que utiliza en el Laboratorio
impresas y capacitar al personal sobre las mismas.
Limpieza y desinfección del Laboratorio
Todo Laboratorio debe tener un programa con métodos de limpieza y desinfección bien definidos a fin
de disminuir los riesgos de contaminación con materiales peligrosos acorde a las características del
laboratorio y volumen de trabajo.
La limpieza de los laboratorios incluye a los equipos, mesas de trabajo, heladeras, freezer, aberturas,
etc. Dentro de la limpieza de los laboratorios se debe incluir control de insectos y roedores.
Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos)
El Laboratorio debe elaborar un procedimiento de la manipulación, clasificación y descarte de los

residuos peligrosos.
Los residuos peligrosos pueden causar daño, directa o indirectamente, a seres vivos o contaminar el
suelo, el agua, la atmósfera o el ambiente en general.
Se consideran residuos patológicos al material biológico de diversos orígenes que puede no tener
características infecciosas pero sí de toxicidad. Un residuo se considera tóxico cuando es capaz de, a
determinadas dosis, provocar una acción química o químico-física que cause daño en la salud, luego de
estar en contacto con la piel o las mucosas o de haber penetrado en el organismo por cualquier vía.
Los residuos serán acumulados en recipientes colocados convenientemente y en cantidad suficiente en

el lugar de generación de los mismos.
Los mismos se podrán tratar mediante los siguientes métodos: Incineración, enterramiento por relleno
de seguridad, esterilización por autoclave, ya sea por el mismo laboratorio o por empresas dedicadas a
ese fin. Se ajustará a la normativa establecida por la jurisdicción donde se encuentra el laboratorio.
Página 6 de 65
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO
Se debe cumplimentar la reglamentación vigente de acuerdo a las BPL (Buenas Prácticas de

Laboratorio), requisitos particulares de SENASA y la Norma ISO/IEC 17025 (última versión vigente)
según la categoría del Laboratorio.
Para que los resultados del diagnóstico sean uniformes, confiables y trazables, deben efectuarse
siguiendo técnicas estandarizadas, con operadores capacitados en la realización e interpretación de
los resultados, utilizando equipos y reactivos controlados.
Los procedimientos de laboratorio están sujetos a múltiples causas de error que deben ser
detectados para poder aplicar acciones correctivas y /o preventivas.
Los procedimientos se pueden monitorear mediante controles internos, con la utilización diaria de
sueros controles internos con títulos conocidos y, el control externo que se refiere al realizado por un
laboratorio de referencia. Este último se puede hacer mediante auditorías que revisen los métodos
analíticos, la organización del trabajo del laboratorio y los procedimientos de control de calidad
internos implementados y la realización de inter laboratorios.
El control permanente de la calidad de los resultados junto a las buenas prácticas de laboratorio que
incluye la utilización de técnicas evaluadas, personal capacitado y operaciones estandarizadas,
garantizan el resultado confiable del diagnóstico.
Control de calidad de insumos
Todos los insumos y reactivos que se utilizan en el laboratorio deben estar establecidos con fórmulas
y procedimientos detallados en manuales disponibles en el área de trabajo.
La composición, tipo de envase, identificación y lugar de almacenamiento debe ser la indicada en los
manuales. No introducir cambios que no estén registrados y autorizados por el responsable del
laboratorio.
Todos los insumos y materiales de referencia deben cumplir con las especificaciones registradas.
Los reactivos biológicos que se emplean en las técnicas de ensayo, deben utilizarse de acuerdo a
las especificaciones del Manual de Procedimientos Operativos, respetando las indicaciones para la
conservación, almacenamiento y titulación.
Los reactivos para el diagnóstico de Brucelosis que se comercializan en la República Argentina,

deben cumplir la normativa vigente de SENASA y aprobar el control de calidad de cada lote o serie
indicado en la estampilla correspondiente. Se debe llevar un registro de cada lote de
antígeno/kit que se utiliza con la fecha de uso.
En los laboratorios se requiere usar agua con mínimo de impurezas. Los requisitos de calidad o
pureza se encuentran establecidos en base a diferentes normas o criterios, dependiendo de las
instituciones u organismos internacionales que establecen las referencias. Entre éstas se encuentran
la American Society for Testing and Materials (ASTM), British Standards Institution (BSI) y la
International Organization for Standardization (ISO). Actualmente están definidos los diferentes
niveles de pureza del agua en función de los parámetros físicos químicos, tales como conductividad
eléctrica, resistividad, contenido de carbono, oxígeno o sílice.
Clasificación del agua de acuerdo a su característica fisicoquímica.
Especificaciones según ISO 3696
Página 7 de 65
CLASIFICACION DE LOS TIPOS DE AGUA SEGÚN NC- ISO 3696: 2004
Grado 1- Exenta básicamente de contaminantes constituidos por iones disueltos o coloidales y

materias orgánicas. Es apropiada para los requisitos de análisis más exigentes, incluyendo la
cromatografía líquida de alta definición. Se puede preparar por un tratamiento adicional del agua de
grado 2 (por ejemplo osmosis inversa o desionización seguida de filtrado a través de una membrana
con tamaño de poro de 0,2 µm para separar las partículas, o por redestilación en un aparato de sílice
fundido).
Grado 2- Con muy pocos contaminantes inorgánicos, orgánicos o coloidales. Es apropiada para
análisis delicados, incluyendo la espectrometría de absorción atómica (EAA) y la determinación de
componentes en cantidades mínimas. Se puede preparar por destilación múltiple o por desionización
u osmosis inversa seguida de destilación.
Grado 3- Apropiada para la mayoría de los trabajos de química en laboratorios por vía húmeda y la
preparación de soluciones de reactivos. Se puede preparar mediante una sola destilación, por
desionización o por osmosis inversa. Salvo indicación en contrario, se puede utilizar para el trabajo
normal de análisis.
Equipos
El laboratorio debe tener inventario del equipamiento y un programa de control y mantenimiento

de los equipos que emplea en el laboratorio.
Página 8 de 65
INTRODUCCIÓN: BRUCELOSIS (Capítulo 3.1.4.- Manual Organización Mundial de Sanidad
Animal -OIE)- versión 2016. http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahm/3.01.04_BRUCELL.pdf
Brucelosis es el nombre genérico que se aplica a las infecciones, humanas o animales, causadas por
distintas especies del género Brucella, principalmente Brucella abortus, B. melitensis y B. suis.
La infección del ganado ovino por B. ovis se describe por separado en el Capítulo 3.7.7 Epididimitis
ovina (Brucella ovis) del Manual de la OIE.
Agente: Brucella (B. abortus, B. melitensis, B. suis)
El género Brucella forma parte de la familia Brucellaceae, que a su vez forma parte del orden
Rhizobiales, en la clase Alphaproteobacteria. Presenta una estrecha relación genética con ciertos
agentes patógenos de las plantas y simbiontes de los géneros Agrobacterium y Rhizobium, así como
con agentes patógenos de animales (Bartonella) y bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum).
La evidencia genética e inmunológica indica que todos los miembros del género Brucella están
estrechamente relacionados. Sin embargo, teniendo en cuenta que existen diferencias relevantes
entre las principales variantes en cuanto al tipo de hospedador y a la epidemiología, así como
evidencias moleculares de variaciones genómicas, el Comité Internacional de Sistemática de
Procariotas, Subcomité de Taxonomía de Brucella, adoptó en 2005 una decisión firme sobre el
retorno a las posiciones anteriores a 1986 en lo relativo a la taxonomía de Brucella; la consecuencia
de ese posicionamiento es la re aprobación de las seis especies de Brucella con sus biovariedades
reconocidas. Los nombres clásicos relacionadas con las seis especies de Brucella están publicados
en las Listas Autorizadas de Nombres de Bacterias de 1980, y las cepas típicas designadas
aparecen asociadas a esos nombres publicados y validados: Brucella abortus, B. melitensis, B. suis,
B. neotomae, B. ovis y B. canis. Las tres primeras se subdividen en biovariedades por sus
características de cultivo y serológicas. En la última década se han aislado cepas de Brucella de
mamíferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de las especies ya reconocidas. Hay
estudios en curso destinados a establecer su posición en la taxonomía de este género y se ha
propuesto que podrían clasificarse en dos nuevas especies, B. ceti y B. pinnipedialis. Recientemente
se ha aislado una nueva cepa, denominada Brucella microti, en el topillo campesino (Microtus arvalis)
y en zorros y suelo de Europa Central (Scholz et al., 2008). También se han descrito por primera vez
ciertas cepas aisladas de infecciones humanas de implantes mamarios y de pulmón, aunque todavía
no está claro cuál es el reservorio natural de las mismas. Aunque solo se han descrito dos cepas de
cada nuevo tipo, formalmente se han publicado como décima y onceava especies de Brucella, B.
inopinata y B. papionis, respectivamente (Scholz et al., 2010; Whatmore et al., 2014). Por último, las
cepas aisladas de roedores, zorros y ranas se han caracterizado como cepas atípicas de Brucella
claramente diferenciables de las especies descritas actualmente, pero todavía no se han aprobado
como nuevas especies de Brucella.
Descripción de la enfermedad
Infección por Brucella en ganado bovino
La infección por Brucella en el ganado bovino suele estar causada por biovariedades (bv.) de
Brucella abortus. En algunos países, sobre todo del sur de Europa, África y Asia occidental, en los
que el ganado bovino se cría en estrecha relación con ganado ovino o caprino, la infección también
puede deberse a B. melitensis (Verger, 1985). En ocasiones, B. suis puede causar una infección
crónica de la glándula mamaria del ganado bovino, pero no se ha observado que cause aborto ni que
se transmita a otros animales. La infección por Brucella en ganado bovino se transmite a nivel
mundial, pero varios países del norte y centro de Europa, así como Canadá, Japón, Australia y
Nueva Zelanda se consideran libres tanto de B. abortus como de B. melitensis. Esta enfermedad
suele ser asintomática en animales de corta edad y en hembras no gestantes. Tras la infección por
B. abortus o B. melitensis, las hembras adultas gestantes presentan placentitis, que suele dar lugar a
aborto entre el quinto y el noveno mes de gestación. Incluso en ausencia de aborto, en la placenta,
los líquidos fetales y las secreciones vaginales producen una profusa excreción del microorganismo.
La glándula mamaria y los ganglios linfáticos relacionados también pueden resultar infectados, y es
posible que se excreten microorganismos con la leche. Las siguientes gestaciones suelen llegar a
término, pero la infección uterina y mamaria reaparece, con cantidades bajas de microorganismos
Página 9 de 65
tanto en los productos del parto como en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo se
encuentra presente en la mayoría de ganglios linfáticos principales del organismo. Los bovinos
machos adultos pueden presentar orquitis / epididimitis y la brucelosis puede ser una causa de
infertilidad en ambos sexos. Los higromas, que suelen afectar a las articulaciones de las
extremidades, son un signo frecuente en caso de brucelosis en algunos países tropicales y pueden
ser el único indicador manifiesto de infección; el líquido de los higromas suele estar infectado por
Brucella.
Infección por Brucella en ovejas y cabras
La infección por Brucella en ovejas y cabras (excepto la infección por B. ovis) está causada
principalmente por las biovariedades de B. melitensis. En ovejas y cabras se han observado
infecciones esporádicas causadas por B. abortus o B. suis, pero estos casos son extremadamente
infrecuentes. La infección por Brucella en ovejas y cabras es endémica en la región del Mediterráneo,
pero se dan casos en todo el mundo. América del Norte (excepto México) se considera libre del
agente, del mismo modo que el norte y el centro de Europa, el sudeste asiático, Australia y Nueva
Zelanda.
Patológica y epidemiológicamente, la infección por B. melitensis en ovejas y cabras es muy similar a
la infección por B. abortus en ganado bovino. En la mayoría de los casos, las vías principales de
transmisión de Brucella son la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales expulsadas
por las ovejas y cabras infectadas, ya sea al abortar o al parir a término. La expulsión de Brucella
también es frecuente en las secreciones de la ubre y en el semen, y puede aislarse Brucella de
distintos tejidos, como los ganglios linfáticos de la cabeza, el bazo y los órganos asociados a la
reproducción (útero, epidídimo y testículos), así como de lesiones artríticas (Alton et al., 1988).
Infección por Brucella en cerdos
La infección por Brucella en cerdos está causada principalmente por las biovariedades 1, 2 o 3 de B.
suis. En cerdos también se han observado infecciones esporádicas por B. abortus o B. melitensis,
pero estos casos son muy infrecuentes. La enfermedad tiene lugar en muchos países en los que se
crían cerdos. En general, la prevalencia es baja, pero en algunas regiones, como América del Sur o
el sudeste asiático, la prevalencia puede ser mucho más alta. En algunos países, la brucelosis
porcina puede ser un problema grave, aunque actualmente no reconocido. Se ha observado
infección por la bv 1 de Brucella suis en jabalíes de algunos estados del sur de EE.UU., así como de
Queensland (Australia) y de otros países de Oceanía. En estos países, se han documentado varias
infecciones humanas en personas que practicaban la caza y manipulaban material obtenido de
jabalíes. En general, la enfermedad se transmite por la ingesta de alimento contaminado por
productos del parto o de un aborto, o bien por secreciones uterinas. Los cerdos se comen de
inmediato los fetos abortados y las membranas fetales. La transmisión durante la copula también es
frecuente, y la excreción de B suis en el semen tiene implicaciones para el personal que lleva a cabo
la inseminación artificial. En los cerdos, como en los rumiantes, tras la bacteriemia inicial, B. suis
coloniza las células del tracto reproductor de ambos sexos. En las hembras, resultan invadidas la
placenta y los fetos, mientras que en los machos la invasión tiene lugar en uno o más de los
siguientes tejidos: testículos, próstata, epidídimo, vesículas seminales o glándulas bulbouretrales. En
los machos, las lesiones, que suelen ser unilaterales, empiezan con una hiperplasia que puede
avanzar a absceso; la fase final se caracteriza por esclerosis y atrofia. Pueden aparecer artritis en
varias articulaciones, y a veces tiene lugar una espondilitis. En las cerdas, el signo más frecuente de
brucelosis es el aborto en cualquier momento de la gestación, aunque es más habitual entre los días
50 y 110. La secreción vaginal no suele ser evidente y, en los rebaños infectados de forma crónica, el
signo clínico más relevante es la infertilidad, no el aborto. En los machos, la brucelosis tiene más
probabilidades de ser persistente, y ocasiona lesiones en el tracto genital que a menudo dan lugar a
una interferencia con la actividad sexual, que puede ser temporal o irreversible. El verraco puede
excretar Brucella con el semen sin ninguna anomalía aparente en los órganos sexuales ni
interferencia con la actividad sexual. En ambos sexos puede aparecer una tumefacción articular y de
las vainas de los tendones, cojera y, en ocasiones, parálisis posterior. Un porcentaje considerable
tanto de cerdos como de cerdas se recupera de la infección, a menudo en un plazo máximo de 6
meses, pero muchos quedan infectados de por vida (Olsen et al., 2012). La infección causada por la
bv 2 de B. suis difiere de la causada por la bv 1 y la bv 3 en cuanto a la gama de hospedadores, la
distribución y la patogenicidad. Históricamente, la distribución geográfica de la bv 2 de B. suis ha sido
un amplio territorio situado entre Escandinavia y los Balcanes. La prevalencia en jabalíes parece ser
Página 10 de 65
alta en toda Europa continental (EFSA, 2009). En los brotes de Europa, los jabalíes intervienen como
fuente de transmisión de la bv 2 a cerdos criados en el exterior, y se consideran el principal
reservorio salvaje de esta infección (EFSA, 2009). La bv 2 de Brucella suis causa lesiones miliares,
sobre todo en tejidos reproductivos, que a menudo se vuelven purulentas. Hasta la fecha, la bv 2 se
ha documentado en muy pocos casos como causa de brucelosis humana. No obstante, sí se han
observado infecciones por la bv2 en cazadores con inmunocompromiso que hayan estado
excesivamente expuestos debido a prácticas como el destripado y despellejado de jabalíes o liebres.
Asimismo, en ganado bovino y ovino de Europa expuesto a jabalíes infectados, se han observado
casos, aunque muy infrecuentes, de infección por la bv 2 de B. suis sin signos clínicos.
Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio, o

salvajes en libertad.
Se ha observado infección por B. abortus y B. melitensis en el dromedario (Camelus dromedarius) y

en el camello (C. bactrianus), así como en camélidos de América del Sur: la llama (Lama glama), la
alpaca (Lama pacos), el guanaco (Lama guanicoe) y la vicuña (Vicugne vicugne), y se ha relacionado
con el contacto con rumiantes grandes y pequeños infectados por B. abortus y B. melitensis.
Asimismo, se ha observado brucelosis en el búfalo doméstico (Bubalus bubalis), el bisonte
americano y el europeo (Bison bison y B. bonasus, respectivamente), el yak (Bos grunniens), el
elk/wapiti (Cervus elaphus), el búfalo africano (Syncerus caffer) y varias especies de antílopes de
África.
Los signos clínicos de brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en el
ganado bovino, ovino y caprino.
La infección por Brucella melitensis en rumiantes salvajes puede tener lugar cuando estas especies
se encuentran en estrecho contacto con ovejas y cabras de zonas enzoóticas. Los signos de la
brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en bovinos, ovinos y caprinos, pero
en varias especies de rumiantes salvajes (como el rebeco [Rupicapra rupicapra], el íbex alpino
[Capra ibex] y la cabra ibérica [Capra pyrenaica] salvaje), se ha observado artritis purulenta o
calcificada y orquitis, así como uveítis y problemas neurológicos. Estas especies se consideran
portadores terminales, que no pueden transmitir la enfermedad, la cual suele desaparecer de forma
natural en cuanto la infección por Brucella se ha erradicado del ganado doméstico, a no ser que
tengan lugar efectos antropogénicos.
Existen dos tipos distintos de situación epidemiológica respecto a la infección por B. suis en otras
especies no porcinas. En el primer caso, la infección por B. suis tiene lugar en animales que no son
el hospedador natural de la infección concreta mediante la ingesta de materiales contaminados o por
co-habitación con hospedadores naturales infectados. Por ejemplo, zorros y lobos del ártico pueden
contraer la bv 4 de B. suis del reno; los perros y los roedores, como ratas o ratones, pueden contraer
otras biovariedades de B. suis por cohabitación con hospedadores infectados; y el ganado bovino y
los caballos pueden resultar infectados por cohabitación o interacción con porcinos infectados. Las
bacterias infectantes pertenecen siempre a las biovariedades definidas de especies hospedadoras
naturales. En el segundo caso, los hospedadores naturales de B. suis o microrganismos similares a
B. suis son especies salvajes. Un ejemplo es la denominada brucelosis murina de la Comunidad de
Estados Independientes (CIS) y los países bálticos, donde pequeños roedores resultan infectados
por la bv 5 de B. suis. Una situación similar se ha observado en Australia, donde, a partir de
roedores, se han aislado cepas parecidas a B. suis pero con características distintas; finalmente se
ha considerado que son distintas de B. suis en base al perfil genético.
Además del jabalí, la liebre común europea (Lepus europaeus) también se considera reservorio de la
bv 2 de B. suis y se ha observado que interviene como posible fuente de transmisión al ganado
doméstico. En la liebre común europea, la enfermedad se caracteriza por la formación de nódulos, de
tamaños variables comprendidos entre el de una semilla de mijo y el de una cereza o incluso mayor;
a menudo se vuelven purulentos. Estos nódulos pueden tener lugar en casi cualquier lugar, a veces
en el tejido subcutáneo o intramuscular, en el bazo, el hígado o los pulmones y en los órganos
reproductivos de ambos sexos. La condición corporal de la liebre puede quedar sorprendentemente
intacta. Otras especies también pueden resultar infectadas por cohabitación con cerdos, jabalíes o
liebres infectados por la bv 2 de B. suis. El destripado o despellejado de jabalíes en explotaciones
bovinas podría ser una vía de transmisión al ganado bovino. La bv 4 de Brucella suis causa una
zoonosis grave en renos salvajes o domesticados (Rangifer tarandus y sus distintas subespecies) en
toda la región del Ártico, incluidos Siberia, Canadá y Alaska. Rangifer tarandus es muy susceptible a
la infección por B. suis, que causa fiebre, abatimiento y distintos signos locales, como aborto,
Página 11 de 65
retención de placenta, metritis, a veces con secreciones sanguinolentas, mastitis, bursitis y orquitis.
La transmisión al ser humano puede tener lugar por contacto directo o por el consumo de leche cruda
u otros productos cocidos de manera insuficiente procedentes del reno, especialmente la médula
ósea.
Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad
La infección por Brucella es fácilmente transmisible al ser humano, en el que causa un proceso febril
(fiebre ondulante) que puede avanzar a una forma más crónica y también producir complicaciones
graves que afecten a los sistemas músculo esquelético, cardiovascular y al sistema nervioso central.
Deben aplicarse medidas de precaución para prevenir la infección humana. La infección se contrae
básicamente por vía oral, respiratoria o conjuntival, pero la ingesta de productos lácteos crudos
constituye el principal riesgo para el público general en los lugares en los que la enfermedad es
endémica. Existe un riesgo ocupacional en veterinarios, trabajadores de mataderos y ganaderos que
manipulen animales/canales infectados y fetos abortados o placentas. La brucelosis también es una
de las infecciones de laboratorio más fáciles de contraer, y todas las manipulaciones de laboratorio
relacionadas con cultivos vivos o material que pueda estar infectado o contaminado deben realizarse
a un nivel de bioseguridad y contención adecuado, que se determinará a partir de un análisis del
riesgo biológico Se han realizado recomendaciones específicas relativas a las precauciones en
materia de bioseguridad que deben aplicarse con los materiales infectados por Brucella (se ofrece
más información en Alton et al., 1988; Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Brucelosis, 1986;
OMS, 1953; OMS, 2004).
Todos los abortos en el ganado deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis y
deberían investigarse. El cuadro clínico no es patognomónico, aunque la historia del rebaño puede
servir de ayuda. El diagnóstico inequívoco de infecciones por Brucella solo puede hacerse por
aislamiento e identificación de Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el análisis
bacteriológico, el diagnóstico puede basarse en métodos serológicos.
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
Pruebas serológicas
No existe una prueba única que permita la identificación de Brucella. Normalmente se necesita
una combinación de los métodos serológicos y bacteriológicos.
Ninguna prueba serológica aislada es adecuada en todas y cada una de las situaciones
epidemiológicas, presentando limitaciones en el análisis de animales individuales. Se deben
considerar todos los factores que influyen en la relevancia del método de prueba y de sus resultados
para una aplicación o interpretación diagnóstica específica. Los métodos serológicos que se
describen en esté manual son métodos estandarizados y validados, con características de realización
adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas en el comercio internacional. Esto
no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilización de reactivos diferentes. Sin
embargo, los métodos y reactivos descritos en esté manual suponen un estándar de comparación
respecto a la realización esperada del diagnóstico.
Debe resaltarse que la prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a
efectos del comercio internacional. La prueba de fijación de complemento (FCT) es más específica
que la SAT para el diagnóstico y además posee un sistema estandarizado de unidades.
Para el control de la brucelosis a nivel nacional o local, son adecuadas para el análisis las pruebas
con antígeno tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de
aglutinación tamponada en placa (BPAT), así como el Enzimoinmunoensayo (ELISA) y el Ensayo de
Polarización Fluorescente (FPA). Las reacciones positivas deben volverse a analizar utilizando una
estrategia confirmatoria adecuada.
En otras especies, como por ejemplo en búfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo
(Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), camellos (Camelus
dromedarius, C.bactrianus) y camélidos sudamericanos, la infección por Brucella sigue un curso
similar al del ganado bovino. Para estos animales pueden utilizarse los mismos procedimientos
serológicos, pero cada uno debe ser validado en el animal estudiado.
Página 12 de 65
Tabla 1. Métodos analíticos disponibles para el diagnóstico de infección por Brucella abortus,
melitensis o suis. (Manual OIE 2016)
Propósito
Determinar el
Determinar la estado
Demostrar
Demostrar prevalencia de inmunitario en
Método ausencia de Contribuir a las Confirmar
ausencia de la infección – animales
infección en políticas de casos clínicos
infección en la vigilancia en el individuales o
animales erradicaciónb sospechososc
población rebaño / en poblaciones
individualesa
manada tras la
vacunación
Identificación del agente
Métodos de
- - - + - n/a
tinción
Cultivo - - - +++ - n/a
d
PCR - - - +/++ - n/a
Detección de la respuesta inmune
BBAT
+++ ++ +++ + +++ n/a
(RBT o BPAT)
FPA ++ ++ + ++ ++ n/a
CFT ++ ++ +++ ++ +++ n/a

I-ELISA +++ ++ +++ ++ +++ n/a
C-ELISA ++ + + + ++ n/a
BST ++ - + +++ ++ n/a
SAT ++ + + - + n/a
Pruebas
basadas en el
- - + ++ - n/a
NH y proteínas
del citosole
Prueba en leche
de tanquef I-
ELISA en leche +++ - +++ + +++ n/a
o prueba de
anillo en leche
Clave: +++ = método recomendado; ++ = método adecuado; + = puede utilizarse en ciertas situaciones, pero el costo, la fiabilidad
u otros factores limitan su aplicación; - = no adecuado para esta finalidad; n/a = no aplicable.
PCR = reacción en cadena de la polimerasa; BBAT = pruebas con antígeno tamponado de Brucella (es decir, RBT [rosa de
bengala] y BPAT [prueba de aglutinación en placa tamponada]); CFT = fijación de complemento; I- o C-ELISA
=enzimoinmunoanálisis indirecto de competición; FPA = prueba de polarización de la fluorescencia; BST = prueba de la brucelina;
SAT = prueba de aglutinación en suero; NH = hapteno nativo
a
Solo aplicable a rebaños / manadas, países o zonas libres de la infección por Brucella.
bp
Para aumentar la eficiencia de las políticas de erradicación en rebaños/manadas, se recomienda combinar pruebas para
aumentar la sensibilidad en cuanto al diagnóstico, es decir, al menos dos pruebas serológicas, como BBAT o FPA y CFT o I-
ELISA. La sensibilidad aumenta aún más si se aplica simultáneamente serológica y BST.
c
En zonas de prevalencia baja o casi libres, el valor predictivo de los resultados positivos en las pruebas serológicas puede
ser muy bajo. En tales situaciones, para confirmar casos clínicos suele ser necesario identificar el agente causal.
En rebaños/manadas infectados, un resultado positivo en cualquier prueba serológica puede considerarse una confirmación de
un caso clínico. Todo animal que dé positivo en cualquier prueba debe considerarse infectado, incluso en ausencia de signos
clínicos.
En zonas de prevalencia baja o casi libres, los resultados positivos aislados pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) o
BST.
En países o zonas libres, los animales sospechosos son los que dan positivo tanto en una prueba serológica de cribado como
en una confirmativa (pruebas en serie) y pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) y/o BST.
d
Es posible que se obtenga falsos positivos.
e
En las zonas en las que se practica la vacunación subcutánea con S19 o Rev. 1, esta prueba puede ayudar a diferenciar
entre los anticuerpos generados a partir de la vacunación y los generadores a partir de la infección.
f
Solo ganado lechero.
Página 13 de 65
PROCEDIMIENTOS DE TRABAJO PARA EL DIAGNÓSTICO DE BRUCELOSIS EN
EL LABORATORIO DE RED
REGISTRO DE ENTRADA DE MUESTRAS
Todo laboratorio debe contar con un instructivo o procedimiento de recepción, manejo y

rechazo de muestras.
Es responsabilidad del veterinario acreditado que envía las muestras asegurarse la correcta
identificación, embalaje y documentación que acompaña a las mismas.
Los laboratorios deben contar con un registro de entrada de muestras (en papel o software con back-
up), en el que figure como mínimo la siguiente información:
▪ Fecha de recepción de muestras.
▪ Cantidad de muestras.
▪ Especie.
▪ Fecha de extracción de muestras.
▪ Procedencia: establecimiento, número de RENSPA.
▪ Localidad: Departamento, Partido, Provincia.
▪ Remitente: veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por
la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), SENASA.
▪ Motivo del envío:
• DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario),
• MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica Para
Mantenimiento del Estatus),
• SAN (Saneamiento de Rodeo Bajo Plan), CSM (Certificado
de Seronegatividad para el Movimiento),
• Control Interno (Según Requerimiento de Veterinario
Acreditado),
• Re-muestreo, otros.
CARACTERISTICAS Y CONDICIONES DE LAS MUESTRAS

Condiciones de "recepción" de las muestras:
▪ Sangre entera o suero refrigerados.

▪ Suero congelado.
▪ Leche para PAL refrigerada (No congelada)
▪ Leche para IELISA refrigerada/congelada
▪ Tubos con identificación clara, de preferencia sobre cinta de papel o similar adherida al
tubo; otra opción es la marcación firme e indeleble en el cuerpo del tubo.
▪ Planillas/protocolo completas de toma de muestras (Anexo II, Resolución SENASA 67/2019).
Condiciones de "rechazo" o demora del procesamiento de las muestras:
▪ Falta de planillas/protocolo o planillas incompletas de toma de muestras (Anexo II,

Resolución SENASA 67/2019).
▪ Falta de la firma del veterinario acreditado en la planilla de extracción, responsable de la
toma de muestra.
▪ Sangre entera congelada.
▪ Leche para PAL congelada, contaminada.
▪ Sangre entera o suero, contaminados.
▪ Sueros hemolizados.
▪ Tubos no identificados.
▪ Volumen insuficiente.
Página 14 de 65
Los Laboratorios reconocidos y autorizados deben ser exigentes con la calidad de las
muestras a procesar, como así también con la planilla de toma de muestra firmada
por el veterinario acreditado actuante que debe acompañar a las muestras.
Informes de resultados
Los informes que elabore el Laboratorio deben ser precisos para poder desarrollar adecuadamente
las acciones de saneamiento (Ver modelo Anexo II del presente Manual).
En el informe de resultados debe constar:
▪ Logo del Laboratorio/Dirección/Tel/email/ Nº de L

▪ N° de Protocolo interno.
▪ Fecha de extracción de muestras.
▪ Fecha de recepción de muestras.
▪ Fecha de informe o emisión de resultados.
▪ Cantidad de muestras.
▪ Especie.
▪ Procedencia: establecimiento, número de RENSPA.
▪ Localidad: departamento, partido, provincia.
▪ Remitente: Veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la
Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), SENASA.
▪ Motivo del envío: DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario), MuVe (Muestreo de
Vigilancia Epidemiológica Para Mantenimiento del Estatus), SAN (Saneamiento de Rodeo Bajo
Plan), CSM (Certificado de Seronegatividad para el Movimiento), Control Interno (Según
Requerimiento de Veterinario Acreditado), Remuestreo.
▪ Columnas con la información del tubo/caravanas/edad/fecha de vacunación/pruebas
utilizadas/Resultados con los valores obtenidos (SAT-2ME, ELISA, FCT, FPA), valor de corte e
interpretación cuando corresponda.
▪ Información de los antígenos/kits utilizados.
▪ Firma del Director Técnico del Laboratorio.
▪ Observaciones.
▪ Paginación x de y.
▪ Que conste en todas las páginas N° del protocolo y N° de RENSPA.
Página 15 de 65
Figura 1: Diagrama de diagnóstico serológico de Brucelosis en la República Argentina
Animales a examinar:
Hembras vacunadas mayores de 18 meses
Animales no vacunados mayores de 6 meses
* Solo en bovinos
Página 16 de 65
PRUEBAS SCREENING CON ANTÍGENO TAMPONADO EN PLACA (BPAT y
RBT) PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA Brucella spp
Son pruebas tamiz de aglutinación en placa. Se fundamentan en la inhibición de las aglutininas

inespecíficas a bajo pH. Detectan anticuerpos IgG y algunos IgM específicos.
DESARROLLO
Materiales
▪ Micropipetas de10-100 µl.

▪ Gradillas.
▪ Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45cm de largo x 35 cm de ancho x
15 cm de profundidad) con tapa, provista de una placa de vidrio marcada con cuadrados de
aproximadamente 4 cm de lado, que se apoya cerca de la parte superior de la caja de manera
que pueda quitarse y ponerse fácilmente.
La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas
parcialmente), de la mezcla de suero y antígeno. El interior de la caja debe pintarse de negro
opaco.
Debe colocarse dentro del aglutinoscopio una pequeña cámara húmeda para evitar la
evaporación de las muestras.
▪ Mezcladores de acero o plástico.
Equipos
▪ Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC).

▪ Freezer con temperatura controlada (-20ºC ± 5°C).
▪ Vórtex.
▪ Centrífuga.
▪ Timer.
Reactivos
▪ Antígeno BPAT con volumen celular aprox. de 11%.

▪ Antígeno Rosa de Bengala, volumen celular aprox. de 8%.
Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ±3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya

que se modifica la sensibilidad.
▪ Suero control interno positivo.

▪ Suero control interno negativo.
▪ Cada Laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo y
negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos.
EJECUCIÓN DEL ENSAYO DE BPAT
▪ Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex.

▪ Llevar las muestras de suero y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC) como mínimo unos
45-60 minutos previos a la realización del ensayo.
▪ Garantizar la homogeinización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no
menos 10 minutos (No usar vórtex).
▪ Colocar sobre el aglutinoscopio (con cámara húmeda), la placa de vidrio (limpia y seca), se
recomienda pasar papel absorbente embebido en alcohol 70º de ambos lados de la misma.
▪ Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 80 µl de suero,
previo mezclado con vortex. Utilizar un tip o punta de pipeta para cada suero.
▪ Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota del suero, con la precaución de
no tocar el suero para no contaminar con el tip el frasco de antígeno.
Página 17 de 65
▪ Mezclar bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno abarcando una
superficie circular aproximada de 3 cm de diámetro.
Se retira la placa de vidrio y se imprimen 3 movimientos en forma rotativa hasta homogeinizar la
mezcla.
Se coloca la placa sobre el aglutinoscopio con cámara húmeda y se tapa, permaneciendo la luz
apagada.
Se efectúa una nueva rotación, pasados 4 minutos.
▪ A los 8 minutos, rotando de nuevo la placa y con la luz encendida, se procede a la lectura.
Figura 2: Aglutinoscopio
EJECUCIÓN DEL ENSAYO DE ROSA DE BENGALA
▪ Colocar la placa de vidrio sobre el aglutinoscopio, como se indicó en la prueba de BPAT.

Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 30 µl de suero.
Utilizar un tip para cada suero.
▪ Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota de suero.
▪ Se mezcla bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno, abarcando una
superficie circular de aproximadamente 2 cm. de diámetro.
▪ Se retira la placa de vidrio y se imprimen movimientos en forma rotativa durante 4 minutos a
razón de 10 a 12 movimientos por minuto. Esto se puede hacer en forma manual o con
rotadores diseñados especialmente.
▪ Finalizados los 4 minutos y rotando la placa sobre la caja de lectura o aglutinoscopio con la luz
encendida, se procede a la lectura sobre fondo blanco.
En el caso de muestras de sueros caprinos y ovinos, la OIE recomienda utilizar la prueba de Rosa
de Bengala modificado (RBTm), el cual consiste en mezclar 75 µl de suero y 25 µl de antígeno.
Lectura a los 4 minutos, como se detalle en la explicación anterior.
Página 18 de 65
Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de screening con antígeno
tamponado en placa
Las reacciones se clasifican en:
POSITIVAS: Cuando se forman grumos, aún siendo finos (no confundir con aglutinaciones
inespecíficas producidos por impurezas, hemólisis, etc.). Estas muestras deben someterse a las
pruebas confirmatorias de SAT/2-ME, FPA, CELISA o FCT.
NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antígeno es de turbidez homogénea y sin grumos.

Estas muestras se informan como negativas y no se realizan las pruebas complementarias.
Figura 3: Lectura BPAT/RBT

BPAT RBT
Informe de resultados
Se aceptan las siguientes expresiones de resultados en las planillas
Positivo Negativo
+ -
POS NEG
P N
Criterios de aceptación del resultado
En paralelo a las muestras problemas se dispensan los sueros controles internos negativo y
positivo. Para aceptar los resultados, ambos controles deben arrojar la lectura correspondiente. Si
los controles no arrojan la lectura esperada, se debe revisar las posibles causas, calidad de los
sueros controles, antígeno, calibración de pipetas, etc.
Página 19 de 65
PRUEBAS DE SERO-AGLUTINACIÓN LENTA EN TUBO (SAT/ 2-ME)
Las pruebas de seroaglutinación detectan la presencia de los anticuerpos IgM e IgG. Los anticuerpos
IgM aglutinan más intensamente que los IgG ya que, al ser las moléculas pentavalentes, poseen un
mayor número de sitios de unión.
El título de un suero se determina por la inversa de la dilución más alta que causa un determinado
grado de aglutinación y se expresa en unidades que corresponden al recíproco de esa dilución.
La prueba de 2-Mercaptoethanol es una prueba selectiva que detecta solamente la presencia de IgG,
se basa en que los anticuerpos IgM, con configuración de pentámero, se degradan en cinco
subunidades semejantes por la reducción de enlaces disulfuro, debido a la acción de ciertos
compuestos que contienen el radical tiol, tales como el 2- mercaptoethanol. Estas subunidades
conservan sus características de antigenicidad, pero pierden la actividad de anticuerpo plurivalente y
se comportan como univalentes. Aún cuando las subunidades están integradas por dos cadenas
pesadas y dos livianas, al combinarse con el antígeno no originan complejos suficientemente grandes
como para aglutinar, probablemente como consecuencia de algún impedimento estérico. Las
moléculas de IgG, en cambio, no sufren un efecto obvio que altere su actividad para dar reacciones
objetivas como la aglutinación.
La prueba se usa, por lo tanto, como evidencia presuntiva de la presencia de anticuerpos de la clase
IgG.
DESARROLLO
Materiales
▪ Micropipetas de10-100 µl.

▪ Gradillas.
▪ Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45cm de largo x 35 cm de ancho x 15
cm de profundidad) con tapa. La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida
oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente). El interior de la caja debe pintarse de negro
opaco.
▪ Tubos de serología: tipo Wasserman de 13 por 100 mm o tubos de Khan de vidrio.
▪ Probetas (100ml y 1000ml).
▪ Pipetas 1, 2, 5 y 10ml.
▪ Recipientes de vidrio de volúmenes variados.
▪ Propipetas.
▪ Dispensador automático o pipetas graduadas de 1-10ml.
Reactivos
1. Antígeno SAT, volumen celular aprox.4.5%.

Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ±3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se
modifica la sensibilidad
2. Suero control interno positivo.
3. Suero control interno negativo.
Cada Laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo (determinar el
título) y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos.
Página 20 de 65
Equipos:
▪ Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC).

▪ Freezer con temperatura controlada (-20ºC ± 5°C).
▪ Estufa con temperatura controlada (37ºC ± 2).
▪ Balanza.
▪ Vórtex.
▪ Centrífuga.
▪ Timer.
▪ Termómetro calibrado.
Drogas y Soluciones: (Tener copia impresa de la hoja de seguridad de cada droga)
▪ Cloruro de Sodio p.a.

▪ Fenol p.a.
▪ 2- Mercaptoethanol p.a.
▪ Solución salina al 0.85%.
▪ Solución salina fenolada al 0,5%.
Ejecución del ensayo

a) Consideraciones generales:
▪ Las muestras que resulten positivas a BPAT o RBT deben confirmarse por las técnicas de SAT
y 2-Mercaptoethanol, CELISA, FPA o FCT.
▪ La existencia de hemólisis excluye el empleo del método de tubo y placa. La presencia de
hemólisis en las muestras de suero interfiere en la prueba de aglutinación en tubo, no sólo
porque la coloración puede enmascarar la reacción de aglutinación, sino porque se forma un
precipitado como resultado de la acción del fenol que contiene la solución de antígeno sobre la
hemoglobina libre. Es muy difícil distinguir esta falsa reacción, de la aglutinación específica de la
unión antígeno-anticuerpo.
b) Desarrollo:
Ambas pruebas (SAT y 2-ME) se realizan simultáneamente procediendo de la siguiente manera:
▪ Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex.
▪ Llevar las muestras de suero y de antígeno a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC al menos una

hora antes de la ejecución del ensayo.
▪ Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no

menos de 10 minutos (No usar vórtex).
▪ Por cada muestra de suero problema positivo a BPAT, colocar en una gradilla 1 hilera de 8
tubos de 13 x 100 mm o tubos de Khan. Identificar la gradilla con el número de protocolo.
▪ Identificar el primer tubo de cada hilera con el número correspondiente al suero problema. En
los primeros 4 tubos se realiza la prueba de SAT; se deja un espacio libre y en los 4 tubos
siguientes de la misma hilera, se realiza la prueba de 2-ME.
▪ Por cada muestra de suero debidamente identificada, se utilizan tubos en los cuales se
dispensa con micropipeta 80 µl de suero en el fondo del primer tubo, 40 µl se distribuyen en el
segundo tubo, 20 µl en el tercero y 10 µl en el cuarto.
▪ Repetir el procedimiento descripto para depositar las mismas cantidades de suero en los tubos
de 2-ME.
▪ Incluir un suero control interno positivo (título conocido) y negativo y, un control de

soluciones y antígeno sin suero.
Página 21 de 65
▪ Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución de 2-
mercaptoethanol (0,1 M) en cada tubo del grupo de 2-ME y mezclar muy bien agitando la
gradilla.
▪ Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución salina

fenolada al 0,5 % a cada uno de los tubos del grupo de SAT.
▪ Dejar las gradillas con las mezclas durante 45 a 60 minutos a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC y
posteriormente, dispensar a cada tubo 1 ml de antígeno de SAT diluido al 2 % (0,09 %) en
solución salina 0,85%.
▪ Mezclar bien agitando la gradilla y llevar a estufa.
Incubación
La incubación se realiza a 37 ± 2 ºC durante 40-48 hs. y tiene por objeto obtener en el tiempo más
corto posible el máximo de aglutinación.
Se recomienda tomar y registrar las temperaturas máximas y mínimas de la estufa durante el

transcurso de las 40-48 hs. de la incubación, para verificar la estabilidad de la estufa.
c) Lectura e interpretación de resultados
Una vez finalizada la incubación de las muestras, se realiza la lectura de las pruebas contra el
fondo negro opaco de la caja de lectura o aglutinoscopio, iluminada desde atrás con una fuerte luz
que atraviese los tubos.
La aglutinación del complejo antígeno-anticuerpo bajo la forma de grumos y su depósito en el
fondo del tubo por gravedad, determina la clarificación de la columna de líquido en el tubo,
manteniéndose los grumos firmes después de una leve agitación del tubo.
La aglutinación es el resultado directo de la unión específica de los anticuerpos presentes en el
suero, con las Brucellas inactivadas contenidas en el antígeno. Las determinaciones se deben
basar tanto en la claridad/turbidez de las mezclas como en el grado de aglutinación y la firmeza de
los grumos al agitar suavemente el tubo.
El título se determina por la inversa de la dilución más alta donde se observa aglutinación en el
tubo, en el que se presenta una disminución evidente de la turbidez, manteniéndose los grumos
firmes a pesar de una agitación leve. Si esto ocurre, por ejemplo, en los 3 primeros tubos
solamente, el título del suero (recíproco de la dilución) es de 100 UI/ml de aglutinación en SAT o
en 2-ME.
El grado de aglutinación en cada una de las distintas diluciones puede clasificarse como completo
(+), incompleto (I) o negativo (-).
Aglutinación completa es aquélla en que el líquido de la mezcla suero- antígeno aparece

límpido, translúcido y la agitación suave no rompe los grumos.
Aglutinación incompleta es la que muestra la mezcla suero-antígeno parcialmente turbia y una

suave agitación no rompe los grumos.
Negativa es aquélla en que la mezcla suero-antígeno no evidencia aglutinación, la columna líquida

aparece turbia y una suave agitación no revela grumos.
Fenómeno de zona
En ciertas ocasiones, puede ocurrir que se encuentre aglutinación en las diluciones más altas, pero no
en las diluciones más bajas. Esta inhibición de la aglutinación en las diluciones bajas es llamada
“fenómeno de zona” y está asociado a un exceso en la concentración de anticuerpos en el suero en las
diluciones más bajas, provocando una aglutinación no visible por estar fuera de la zona de equivalencia
de la unión antígeno-anticuerpo.
Página 22 de 65
Figura 4: Esquema Prueba simultánea de SAT y 2-ME
Página 23 de 65
Informe de Resultados
Ejemplo
Negativo
-
Neg
I 25
25
1/25
I: Incompleto
Tabla 2: Interpretación de los resultados para Hembras Bovinas mayores de 18

meses de edad vacunadas con vacuna Brucella abortus cepa 19 entre los 3 a 8
meses de edad
BPAT SAT 2-ME INTERPRETACION
- NH * NH NEGATIVO
+ ≤ 50 - NEGATIVO
+ I 100 - SOSPECHOSO
+ 100 - SOSPECHOSO
+ 200 - POSITIVO
+ 25 a 50 I 25 NEGATIVO
+ ≤ 25 ≤ 25 NEGATIVO
+ ≥ I 50 ≥ I 50 POSITIVO
* NH: No se hace
Tabla 3: Interpretación de los resultados para animales no vacunados (Bovinos y

otras especies) mayores de 6 meses de edad
BPA SAT 2-ME INTERPRETACION
- NH NH NEGATIVO
+ 25 - NEGATIVO
+ I 50 - SOSPECHOSO
+ 50 - SOSPECHOSO
+ 100 - POSITIVO
+ 200 - POSITIVO
+ ≥ 25 ≥ 25 POSITIVO
Página 24 de 65
Preparación de Soluciones para las pruebas de SAT/2-ME
SOLUCIÓN SALINA 0,14 M
• Cloruro de Sodio 8,5 g

• Agua destilada 1000 ml
SOLUCIÓN SALINA FENOLADA
Solución salina 0,14 M con la adición de 0,5 % de fenol. Conservar a temperatura ambiente por un
plazo de 30 días. Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal.
SOLUCIÓN 2-MERCAPTOETHANOL 0,1 M
• 2-Mercaptoethanol 7,8ml
• Solución salina 0,14M. 992,2ml
(No utilizar solución salina fenolada)
El 2-Mercaptoethanol es sensible a la luz y al calor y se deteriora rápidamente por exposición al aire.

Se debe conservar en frasco color ámbar herméticamente cerrado a temperatura ambiente
(22ºC ± 4 ºC).
Leer detenidamente la hoja de seguridad. Evitar la inhalación, manipularlo en lo posible con máscara de
gases o en cabina de extracción. NUNCA pipetear con la boca.
La solución de 2-Mercaptoethanol ya preparada se puede conservar por una semana a temperatura

ambiente (22ºC ± 4 ºC). Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o
semanal.
SOLUCIÓN DE ANTÍGENO SAT (WRIGHT) al 2%
• Solución salina 0,14M (no utilizar solución salina fenolada) 98ml

• Antígeno SAT (Wright) (4,5%) 2ml
• La solución de antígeno al 2% se puede conservar por una semana en heladera (5ºC ±
3ºC).
• Descartar toda aquella solución que presenten turbidez o signos de contaminación.
Página 25 de 65
PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE (PAL o MRT) solo para Bovinos
La prueba se diseño para detectar la presencia de anticuerpos en leche de bovinos. Estos
anticuerpos reaccionan con el antígeno coloreado con hematoxilina formando un complejo antígeno
anticuerpo que queda adherido a la superficie de los glóbulos grasos y asciende con ellos a la
superficie, formando una capa o anillo de crema de color púrpura azulada, de intensidad variable
según el grado de la reacción. Paralelamente, desaparece parcial o totalmente la tinción de la
columna de leche. Si la muestra no contiene anticuerpos específicos, el antígeno no se fijará a los
glóbulos grasos y permanecerá uniformemente distribuido, coloreando la columna de leche, mientras
que la capa de crema forma un anillo de color blanco natural.
El porcentaje de grasa de la muestra influye en la prueba, ya que la formación del anillo de crema en
la superficie dependerá del tenor graso.
La prueba de anillo en leche se usa especialmente como diagnóstico presuntivo para detectar
rebaños infectados. También se emplea en la vigilancia epidemiológica en áreas de control de la
brucelosis.
Los animales de rebaños positivos a la prueba de anillo en leche deben ser examinados por las
pruebas serológicas para identificar los infectados.
Materiales
▪ Tubos de serología: tipo Wassermann de 13 mm por 100 mm, o tubos de khan de vidrio claro y
completamente limpio.
▪ Pipetas 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml.
▪ Micropipetas de 10 a 100 µl y 1 ml.
▪ Gradillas.
▪ Timer.
Reactivos
1. Antígeno PAL con volumen celular aprox.4%.

Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ± 3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que
se modifica la sensibilidad
2. Muestras de leche refrigerada (No congelada)

3. Solución de formalina 1%.
4. Muestras de leche controles positivo y negativo.
Equipos:
▪ Heladera con temperatura controlada (5ºC ± 3 ºC).

▪ Estufa con temperatura controlada (37 ºC ± 2ºC).
▪ Termómetro calibrado.
Toma de la muestra
La prueba se lleva a cabo con la muestra de leche de tanque. Si es necesario, las muestras se
pueden pre tratar con un conservante (formalina al 0,1%) durante 2–3 días a 5°C ± 3°C antes de
su utilización.
En el campo, tan pronto se ha llenado el tarro y antes de que la crema suba, revolver bien el
contenido y tomar unos 50 ml de leche. Si es necesario, agregar 1 ml de solución de formalina al
1% por cada 10 ml de leche. Las muestras, bien identificadas, se transportan refrigeradas hasta el
laboratorio.
Página 26 de 65
Ejecución del ensayo
Las muestras de leche se deben mantener en refrigeración a una temperatura de 5ºC ± 3 ºC hasta que
hayan transcurrido no menos de 24 horas desde su recolección (preferiblemente, 48 a 72 horas).
Las muestras de leche no deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas a agitación violenta ni
conservadas durante más de 72 horas.
Llevar las muestras de leche y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC) como mínimo unos 45-60
minutos previos a la realización del ensayo. Mezclar cada muestra invirtiendo varias veces el recipiente
(tubo o frasco).
Garantizar la homogeinización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10
minutos (No usar vórtex).
Colocar 1 ml de la muestra en un tubo de vidrio 13 x 100mm o tubo de khan. La altura de la columna

de leche en el tubo debe ser como mínimo de 25 mm.
Agregar 30 µl de antígeno a cada tubo. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces, sin que se
llegue a formar espuma. No debe quedar antígeno sobre las paredes.
Incubar en estufa a 37ºC ±2 ºC, durante una hora.
Lectura
- Anillo de crema, blanco; columna de leche, azul.
+ Anillo de crema y columna de crema, del mismo color, o casi igual.

++ Anillo de crema de color más pronunciado que la columna de leche.
+++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche tiene aún un poco de color.
++++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche es blanca.
Cualquier grado de + debe interpretarse como Positivo
Observaciones
El exceso o la escasez de crema dificultan la interpretación de la prueba.
La agitación vigorosa dificulta la realización de la prueba.
El calentamiento de la leche interfiere con los resultados; por lo tanto, la prueba no se puede efectuar
con leches pasteurizadas.
Cuando la prueba se efectúa el mismo día en que se ha recolectando la leche, se pueden obtener
algunos resultados falsos positivos o dudosos.
La leche de calostro puede dar resultados falsos positivos.
La leche de vacas con mastitis también puede dar falsos positivos o impedir la interpretación de la
prueba debido al descoloramiento del antígeno.
La leche de vacas próximas a secarse puede dar resultados dudosos o falsos positivos.
Hay vacas infectadas con Brucella que no eliminan anticuerpos por la leche. Estas vacas son
positivas en las pruebas de sangre y negativas en la prueba del anillo.
Página 27 de 65
Modificación de la prueba para tanques muy grandes
Para hacer más sensible la prueba, aumentar la cantidad de leche, manteniendo constante la
cantidad del antígeno (30 µl).
Cuando se ajusta la PAL para aplicarla a rebaños de gran tamaño (utilizándose 2 o 3 ml de leche), se
añaden 0,1 ml de una mezcla de crema negativa no pasteurizada al tubo de ensayo y a continuación,
30 µl del antígeno de la prueba del anillo. Después de mezclar, la prueba se incuba y se lee de la
misma forma que para la PAL no ajustada. La mezcla de crema negativa se recoge mediante la
separación de la leche compuesta por varias muestras y sin pasteurizar correspondiente a un rebaño
de 25 o más vacas que sean negativas a brucelosis.
< 150 vacas 1 ml de leche

150 – 450 vacas 2 ml de leche
451- 700 vacas 3 ml de leche
Figura 5: Prueba de vigilancia epidemiológica para muestras de pool de leche
Página 28 de 65
ENZIMOINMUNOENSAYO INDIRECTO (I ELISA) (Para suero o leche)
Se realiza siguiendo el protocolo de los kits comerciales validados y aprobados para el diagnóstico
oficial de la brucelosis en la República Argentina con el valor de corte establecido por SENASA.
El enzimoinmunoensayo (ELISA) es un método empleado habitualmente para la detección y/o

cuantificación de sustancias, generalmente proteínas, que se encuentran en concentraciones muy
bajas. El método combina la especificidad de unión de los anticuerpos con la amplificación de "señal"
que brindan las reacciones catalizadas por enzimas. En la práctica clínica es la técnica inmunológica
más empleada. Se utiliza para cuantificar, entre otras cosas, hormonas, marcadores tumorales, para
determinar la presencia de antígenos microbianos y para la determinación cualitativa o cuantitativa de
anticuerpos totales o frente a algún antígeno en particular.
ELISA Indirecto. Consta de las siguientes etapas:
1. Fijación insoluble del antígeno al soporte/placa, específico para los anticuerpos objeto de
estudio (generalmente en los kits comerciales la placa ya está preparada con el antígeno
pegado a la misma).
2. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados, solo si se indica en las
instrucciones.
3. Adición de los sueros/leches controles y sueros/leche problemas, en la dilución indicada en el

protocolo, de tal forma que si hay presencia de anticuerpos, estos reaccionarán
específicamente con los antígenos fijados al soporte.
4. Incubación.
5. Lavado para eliminar los anticuerpos que no se hayan pegado al antígeno o uniones
inespecíficas. Es importante que la placa no se seque, lo que podría incrementar la actividad
inespecífica del ensayo.
6. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima (generalmente anti IgG de especie), los
cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se
encuentran fijados a los antígenos.
7. Incubación.
8. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados (conjugado) que no hayan reaccionado.
9. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
10. Frenado.
11. Lectura colorimétrica de la placa.
Página 29 de 65
Figura 6: Esquema ELISA Indirecto
Materiales y Equipamiento
▪ Lector de placas automático con filtros (405 nm, 414 nm, 450nm).
▪ Computadora.
▪ Agitador orbital de placas.
▪ Lavador manual o automático de placas.
▪ Heladera (5 ± 3 ºC) y freezer (-20 ± 5ºC).
▪ Estufa de incubación (37 ± 2 ºC).
▪ Vórtex.
▪ Sistema purificador de agua (mínima calidad de agua requerida: destilada o desionizada).
▪ Micropipetas monocanal de volumen variable (0,5 –10µl, 5 - 50 µl, 50 -200 µl, 200 - 1000 µl).
▪ Micropipetas multicanal de volumen variable (5 - 50 µl, 30 -300 µl).
▪ Propipetas.
▪ Dispensadores automáticos.
▪ Timer.
▪ Selladores de placas de acetato o parafilm.
▪ Cubetas plásticas para pipetas multicanales.
▪ Microtubos (para realizar las diluciones previas de los sueros), tubos o placas fondo en U.
▪ Crío tubos de polipropileno para el almacenamiento de los sueros.
▪ Gradillas.
▪ Material de vidrio (probetas, pipetas, erlenmeyers, etc. de distintos volúmenes).
▪ Toallas o papel absorbente.
Página 30 de 65
Reactivos
Están incluidos en los kits comerciales autorizados por el SENASA, incluyen:
• Buffer de lavado
• Buffer de dilución
• Conjugado
• Sustrato cromógeno
• Solución de frenado
• Sueros controles
• Placas o tiras de 8 pocillos con el Ag pegado
A continuación se citan algunas precauciones a tener en cuenta para ejecutar la técnica de Elisa:
Seguir expresamente las instrucciones del kit para la preparación de todos los reactivos
Ambientar los reactivos del kit a temperatura ambiente por lo menos una hora antes de su
utilización.
No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes lotes o kits.
Evitar cualquier contaminación de los reactivos.
No utilizar los kits una vez superada la fecha de caducidad.
Utilizar una punta de pipeta nueva por cada muestra y reactivo.
Utilizar agua desionizada o destilada para la preparación/dilución de los reactivos que se empleen
en el ensayo.
Corroborar que el lector de placas posee el filtro con el cual se debe leer la placa y seguir las
instrucciones de uso del equipo.
Se recomienda trabajar las muestras por duplicado, para verificar la repetibilidad del operador.
Incluir sistemáticamente un control positivo y un control negativo siempre que se utilice
el kit.
El sustrato es extremadamente sensible a la luz y a las contaminaciones, por lo que, se
recomienda retirar del frasco únicamente el volumen que se vaya a utilizar y nunca
devolver el sustrato sobrante al frasco original.
La solución de frenado es un ácido fuerte. En caso de contacto con la piel lavar
inmediatamente con abundante agua.
Figura 7: Placa de Elisa
Página 31 de 65
ELISA POR COMPETICIÓN / BLOQUEO
La técnica consiste en la adsorción del antígeno lipopolisacárido liso (LPS-l) de Brucella sobre una
matriz sólida (Microplaca de 96 pocillos). A continuación se añade la dilución de los sueros y el
anticuerpo monoclonal, específico para un epitope de la cadena O del LPS-l. Se mezclan los dos
junto con el antígeno adherido y se dejan incubar. Después de la incubación, se lava la microplaca y
a continuación se añade el conjugado de anticuerpo anti-monocolonal conjugado con enzima. Es
importante mencionar que el anticuerpo del conjugado ha sido previamente adsorbido con suero
normal (no infectado) de bovino, equino y humano para reducir las reacciones inespecíficas entre
especies. La etapa final de la prueba es la adición de la solución substrato / cromógeno. Después de
un periodo de tiempo fijo, se frena la reacción y se mide fotométricamente. Entre cada uno de los
pasos del ensayo la placa debe ser lavada debidamente.
En la ausencia de anticuerpos anti Brucella en los sueros problemas (sueros negativos), el
anticuerpo monoclonal se liga con el epítope de la cadena O del LPS-l, lo cual es indicado en la
prueba por el desarrollo de color. En el caso que el suero problema contenga anticuerpos anti-
Brucella (suero positivo) estos compiten con el anticuerpo monoclonal por sitios del epítope e inhiben
el enlace del anticuerpo monoclonal con la porción de cadena O del LPS-l, manifestándose por la
ausencia de color en el ensayo. Los sueros con anticuerpos post vacunales por B. abortus cepa 19,
compiten en menor grado con el anticuerpo monoclonal porque su afinidad, especificidad y
concentración es baja, resultando usualmente en una reacción negativa (excepto los animales
vacunados en los tres meses anteriores al sangrado).
Diversos CELISA / bloqueo comerciales se encuentran disponibles en el mercado. En el caso del
Elisa de bloqueo, sobre las placas con el LPS de Brucella abortus pegado, se depositan las muestras
de suero, las cuales en el caso de contener anticuerpos específicos se unirán al antígeno. Tras
eliminar el material no unido mediante lavados, se añade el anticuerpo monoclonal específico del
LPS (epítope C) conjugado con una enzima. En el caso de que las muestras contengan anticuerpos
frente a LPS, estos no permitirán la unión del conjugado, mientras que, si las muestras no contienen
este tipo de anticuerpos, el conjugado se unirá libremente al antígeno de la placa.
Tras sucesivos lavados para eliminar el material no unido, podremos revelar las reacciones
acontecidas en la placa mediante la adición del sustrato adecuado el cual, desarrollará una reacción
colorimétrica en presencia de la enzima (es decir en presencia del monoclonal conjugado con
enzima). De este modo la aparición de una reacción coloreada, indicará que la muestra evaluada no
contiene anticuerpos específicos del LPS de Brucella spp. y, la ausencia de color indicará que la
muestra es positiva y contiene dichos anticuerpos.
Materiales y equipamiento, reactivos, cuidados y precauciones, manejo y conservación

de las muestras: Idem Elisa Indirecto.
Figura 8: CELISA
Página 32 de 65
Tabla 4: Guía de problemas y soluciones en la técnica de ELISA
Señal Posible causa Solución
1.Error de pipeteo Práctica

Color irregular 2.Falta de mezcla de reactivos Mejorar técnica
3.Falta de lavados Precaución
1. Se omitió el substrato Revisar

2. Errónea concent. Substrato Revisar
No hay color 3. Substrato con pH erróneo Controlar pH
4. Conjugado muy diluido Revisar
5. Se omitió el conjugado Revisar
1. Conjugado muy concentrado Controlar

Color parejo en toda la placa 2. Falla en el lavado Mejorar técnica
3 Substrato contaminado Revisar
1. Reacción inespecífica Cambiar solución de lavado

Elevado color de fondo 2. Material de vidrio sucio Mejorar lavado
“background” 3. Agua de mala calidad Controlar calidad
4. Poco detergente (Tween 20) Revisar
5. Tampones contaminados Preparar soluciones nuevas
1. Substrato muy concentrado Revisar

Desarrollo de color muy rápido 2. Conjugado muy concentrado Controlar dilución
3. Solución substrato con pH erróneo Controlar
4. Concent. Cromógeno errónea Revisar
1. Substrato muy diluido Revisar

2. Conjugado muy diluido Revisar dilución
Desarrollo de color muy lento 3.Solución substrato con pH erróneo Revisar
4.Concentración Cromógeno errónea Revisar
5.Concent de Tween errónea Revisar
1. Incubación despareja Utilizar estufa

Efecto borde 2. Resecación por aire Mantener la placa cubierta
3. Tampón de lavado residual Eliminarlo
Página 33 de 65
Figura 9: Modelo de protocolo de Trabajo ELISA
Protocolo ELISA Brucelosis

DIRECCIÓN DE LABORATORIOS
Y CONTROL TÉCNICO
Fecha:
Temperatura ambiente:
Analista:
Marca del Kit:
Tipo de Elisa: Competencia Indirecto Bloqueo Otros
Matriz: Suero Leche Otros
Número de Lote:
Vencimiento: Fecha apertura kit:
Nº Placa:
Muestras: Protocolo N°……
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
Firma operador
Página 34 de 65
ENSAYO DE POLARIZACION FLUORESCENTE PARA LA DETECCIÓN DE
ANTICUERPOS CONTRA Brucella EN SUERO
El ensayo de Polarización Fluorescente (FPA) para la detección de anticuerpos contra Brucella tiene
la capacidad de ser una prueba multi-especies, permitiendo el diagnóstico presuntivo en bovinos,
porcinos, caprinos, ovinos, ciervos y bisontes.
Este ensayo, validado para bovinos, tiene la capacidad de distinguir animales infectados con Brucella
de los animales vacunados con B. abortus cepa 19 a partir de los 3 meses post vacunación
aproximadamente, y de los animales con reacción cruzada con bacterias gram negativas en más del
90% de los casos.
A diferencia de los enzimoinimunoensayos, el FPA es un ensayo homogéneo que no requiere la

necesidad de varias etapas de lavado. Los reactivos son agregados secuencialmente en solución y el
tiempo total de la prueba no excede los 5 minutos para cada muestra. En resumen, la prueba
involucra la adición de una determinada cantidad de suero a una solución tampón de dilución en un
tubo de vidrio. A continuación la muestra es equilibrada por aproximadamente cinco minutos,
posteriormente se realiza una primera lectura en el analizador fluorescente para obtener una lectura
blanco de referencia (auto fluorescente).
A continuación el antígeno conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) es agregado a la

solución y luego, la muestra es equilibrada nuevamente por un mínimo de dos minutos para permitir
que el antígeno y el anticuerpo interactúen, a continuación la muestra es leída nuevamente en el
polarizador. Si anticuerpos específicos contra Brucella están presente (suero positivo), el resultado
será un valor alto de unidades de mili polarización (mP). En ausencia de anticuerpos anti Brucella
(suero negativo), el resultado es un valor bajo en mP.
El valor de corte para distintas especies animales para la República Argentina se ha determinado en:
Bovinos:
▪ Animales negativos < 94 mP.
▪ Animales sospechosos: Los valores entre 94mP y 104 mP.
▪ Animales positivos: valores igual o mayor a 105 mP.
Caprinos y Porcinos:
Ovinos (para el diagnóstico de B. melitensis, no para B. ovis):

Materiales y equipamiento:
▪ Analizador de Polarización Fluorescente.

▪ Vórtex.
▪ Micropipetas monocanal de volumen variable (0,1– 10µl, 20 –200µl, 200–1000µl).
▪ Heladera (5 ± 3 ºC) y freezer (-20 ± 5 ºC).
▪ Tubos de vidrio: Tubos de borisilicato de 10 x 75 mm.
▪ Material de vidrio.
▪ Termómetro de temperatura ambiental.
▪ Computadora e impresora.
Reactivos
Están incluidos en los kits comerciales AUTORIZADOS por el SENASA, incluyen:
• Buffer de dilución
• Sueros controles positivo y negativo
• Antígeno marcado con isotiocionato de fluoresceina
Página 35 de 65
PREPARACION DE LA PRUEBA DE FPA
Preparación de los Reactivos
Se deben seguir las instrucciones del prospecto que acompaña al kit comercial.
Preparación del equipamiento/instrumentos
El usuario debe leer el manual de instrucciones y familiarizarse con los controles de los instrumentos,
calibración y la solución de los problemas de todos los equipos previos a la ejecución del ensayo.
Ejecución de la prueba
En el día de la prueba preparar y analizar los sueros controles, siguiendo con lo especificado
en los puntos indicados a continuación. Si el valor de mP de los sueros controles no se ajusta
dentro de los límites especificados, el ensayo debe ser rechazado.
Dejar a temperatura ambiente los reactivos, sueros controles y problemas por lo menos dos (2) hs.
antes de su uso. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente
al momento del ensayo
Encender el equipo y seguir las instrucciones de uso.
▪ Para bovinos dispensar 990 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos
de vidrio de borosilicato (10x 75mm).
▪ Dispensar 10 µl de suero bovino (Dilución 1/100) a analizar dentro de los tubos y mezclar
bien con vórtex evitando la formación de espuma.
▪ Para porcinos y caprinos dispensar 960 µl de la solución tampón de dilución de sueros

en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm).
▪ Dispensar 40 µl de suero porcino o caprino (dilución 1/25) a analizar dentro de los tubos
y mezclar bien con vórtex.
▪ Para ovinos (B. melitensis) dispensar 975 µl de la solución tampón de dilución de sueros.
▪ Dispensar 25 µl de suero ovino (dilución 1/40).
▪ Esperar como mínimo cinco minutos a que la solución suero-Buffer se estabilice.

▪ Continuado el período de equilibración, realizar la lectura blanco de las muestras.
▪ Dispensar 10 µl de antígeno conjugado con FITC determinado en cada tubo y mezclar
▪ bien con vórtex.
Es importante evitar la formación de espuma en la muestra
En caso de que el suero se vea contaminado con partículas en suspensión, dejar el

suero equilibrarse por lo menos 10 minutos para asegurarse que estas partículas hayan
sedimentado o centrifugar el mismo. Las partículas inespecíficas puedan interferir con
la lectura de la muestra dado que, la misma se basa en el Peso Molecular de las
partículas en suspensión
▪ Dejar que la muestra y el antígeno se equilibren por lo menos por dos minutos.
▪ Leer las muestras exactamente en el mismo orden que fueron blanqueadas.
Página 36 de 65
Figura 10: Esquema Ensayo de Polarización Fluorescente
10 µl de Suero Bovino
+
990 µl ANTIGENO
de Buffer
10 µl
Esperar 5 min.
Lectura Incubación Lectura

Blanco en 2-5 min Final en
Polarizador Polarizador
Interpretación de los resultados
Control del ensayo
Los sueros controles del ensayo deben estar dentro de los límites especificados por el fabricante del
kit utilizado según el control de calidad desarrollados durante la estandarización, optimización e
implementación del ensayo.
Los resultados de los sueros controles y problemas son expresados en unidades de mili polarización
(mP) de la actividad del suero contra el antígeno.
Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo.
Aceptación de los controles
Si los valores de mP de los sueros controles están fuera de los límites especificados, la prueba será
rechazada y los controles y las muestras deben ser repetidas.
Página 37 de 65
FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
La fijación del complemento (FCT) es la prueba de referencia internacional para el diagnóstico
serológico de la brucelosis bovina, ovina y caprina.
La prueba permite la detección y cuantificación relativa de los anticuerpos específicos antibrucélicos
¨capaces de fijar¨ el complemento (IgG1 y algunas IgM específica), cuya presencia en determinados
niveles posee una gran correlación con el estado de ¨Animal infectado¨.
La FCT es una prueba confirmatoria ampliamente usada y aceptada pese a la complejidad de su
realización y a la necesidad de buenas instalaciones y personal entrenado para titular y mantener los
reactivos adecuadamente.
La técnica se desarrolla en dos etapas: en la primera el antígeno y el suero problema (cuyo

complemento se destruyó previamente por calentamiento a baño maría) se incuba en presencia de
complemento de cobayo. Después de dejar reaccionar la mezcla de reactivos, se mide en la segunda
etapa la cantidad de complemento libre (que indica la ausencia o presencia de anticuerpos
antibrucelares en suero y su cantidad) mediante la incorporación de un ¨sistema indicador¨ o ¨sistema
hemolítico¨ formado por eritrocitos de carneros recubiertos de anticuerpos de conejo (hemolisina) como
complejo antígeno-anticuerpo alternativo.
La presencia de anticuerpos en el suero problema induce la formación de inmuno complejos en la

primera etapa de la reacción que determina la activación del sistema complemento y el agotamiento de
sus factores. En la segunda etapa de la reacción no existe complemento libre que pueda activarse ante
la presencia del ¨sistema hemolítico¨. El resultado es la ausencia de hemólisis (resultado positivo).
Alternativamente, la lisis de los eritrocitos (hemólisis) es indicadora de la existencia de complemento
libre en la segunda etapa de la reacción, que no se agotó en la primera por no haberse formado inmuno
complejos ante la ausencia de anticuerpos antibrucelares (resultado negativo).
Se han propuesto varios métodos para FCT que utilizan diferentes concentraciones de eritrocitos de
oveja (GR) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensión al 2%, 2,5% o al 3%).
Los GR están sensibilizados con un volumen igual de suero anti-GR de conejo diluido (hemolisina)
hasta contener varias veces (en general de dos a cinco veces) la concentración mínima necesaria para
producir un 100% de lisis de los GR en presencia de soluciones titulada de complemento de cobayo.
Variantes para la prueba de FCT:
▪ La macrotécnica, se realiza en tubos de Khan a un volumen final de 1 ml.

▪ La microtécnica, se realiza en placas de polipropileno de 96 pocillos, con un volumen final de 100 µl.
Equipos
- Pipetas monocanales con rangos de 2 µl a 20 µl, 20 µl a 200 µl y 500 µl a 5000 µl.

- Pipetas multicanales de rango 20 µl a 200 µl.
- Centrifuga.
- Centrífuga de placas.
- Estufa con temperatura controlada (37ºC ± 2ºC).
- Heladera con temperatura controlada (5 ± 3°C).
- Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5°C).
- Agitador de microplacas.
- Vórtex.
-Baño térmico.
- Espectrofotómetro.
Materiales:
-Tubos de ensayo.
- Material de vidrio de volúmenes varios.
- Gradillas.
- Film para cubrir placas.
- Puntas de pipetas (Tips).
Página 38 de 65
- Placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en U.
- Cubetas o reservorios de plástico para reactivos.
Reactivos
Solución buffer: Ver Anexo FCT I

Solución GR 2%: ver Anexo FCT II
Titulación Hemolisina: Ver Anexo FCT III
Sistema hemolítico Anexo FCT IV
Titulación Complemento: Ver Anexo FCT V
Titulación Antígeno: Ver Anexo FCT VI
Sueros controles
Suero control positivo bovino (SENASA suero patrón Nacional BR 01/05).
Suero control negativo bovino (SENASA suero patrón Nacional BR 03/05).
Manejo y conservación de las muestras

- Conservar los sueros en heladera (5 ± 3ºC) no más de dos días, para períodos mayores,
conservarlos a –20 ± 5ºC.
- Evitar repetidos ciclos de congelamiento/ descongelamiento.
- No usar sueros contaminados, que presenten precipitados o intensa hemólisis.
- Homogeneizar con el uso de vórtex los sueros antes de usarlos.
Inactivación de los sueros
Sueros patrones
- Suero BR 01/05: Reconstituir el suero control positivo bovino liofilizado con 1 ml de agua
destilada estéril. Realizar una dilución 1/12,5 con SB e inactivar durante 30 minutos en baño
termostático a 58 ± 2ºC, luego alicuotar y conservar a -20 ± 5ºC.
- Suero BR 03/05: Reconstituir el suero control negativo bovino liofilizado con 1 ml de agua
destilada estéril. Inactivar durante 30 minutos en baño termostático a 58 ± 2ºC, luego alicuotar y
conservar a –20 ± 5º C.
Muestras de suero
Las muestras de suero se inactivan 30 minutos en baño termostático a 58 ± 2ºC para eliminar el
complemento natural contenido en las mismas. La temperatura del baño termostático se controla
mediante la introducción de un termómetro certificado en el agua durante todo el tiempo de exposición
de las muestras.
- Los sueros ovinos se inactivan por 30 minutos en baño termostático entre 60ºC – 63°C (en caso
de que los sueros sean anticomplementarios, se recomienda realizar otro ciclo de inactivación
de 30 minutos).
- Las muestras podrán ser sumergidas en el baño termostático en tubos de ensayo tapados
herméticamente, contenidos en gradillas, debidamente identificados. Volumen de suero
sugerido a inactivar: 200 µl.
- La inactivación de las muestras podrá realizarse un día antes del análisis. En este caso, una vez
retiradas del baño termostático se dejan a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos
para luego conservar en heladera. Si el análisis se realiza después de las 24 hs, las muestras ya
inactivadas se conservan a (-20 ± 5ºC).
Página 39 de 65
Condiciones del ensayo
El procedimiento se desarrolla en caliente (incubación en estufa a 37 ± 2ºC) y se utilizan los siguientes
reactivos en volúmenes de 25 µl:
a.
Diluciones en base 2, a partir de 1/2 de los sueros problemas en SB.
b.
Solución de complemento de cobayo en SB que contenga 2 UC (100%).
c.
Solución de antígeno en SB a la dilución de trabajo.
d.
Sistema hemolítico obtenido por la mezcla de volúmenes iguales, de una solución de suero
hemolítico en SB que contenga 2UH (100%) y de una suspensión de glóbulo rojos de carnero
en SB al 2%.
Ejecución
Dependiendo del número de muestras a realizar, se podrá incluir los controles en la misma
placa o utilizar una placa para los sueros y otra para los controles.
a) Dilución de las muestras de suero

- El procedimiento de dilución se realiza de forma general en placa fondo en U, mediante la
utilización de volúmenes de 25 µl.
- La secuencia de operaciones se detalla en la tabla 1. La homogeneización de los dos
componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta.
Tabla 1
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256

25 µl de la 25 µl de la 25 µl de la 25 µl de la 25 µl de la 25 µl de la 25 µl de la
Suero 25 µl dilución dilución dilución dilución dilución dilución dilución
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128
SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl
b) Sueros controles
- Control positivo: El procedimiento de dilución se realiza mediante la utilización de volúmenes
de 25 µl, siguiendo la secuencia de operaciones que se detalla en la tabla 2. La homogeinización
de los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la
micropipeta.
Tabla 2
1/12,5 1/25 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600

Suero 25 µl de la 25 µl de la 25 µl de la 25 µl de la 25 µl de la 25 µl de la
positivo 25 µl 25 µl dilución dilución dilución dilución dilución dilución
01/05 1/25 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800
SB - 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl
- Control negativo: El suero control negativo se diluye siguiendo el mismo protocolo de los
sueros problema (1/2, 1/4, 1/8 etc.).
c) Controles del ensayo
• Control de la ausencia de poder anticomplementario del antígeno: Se dispensa por duplicado

en la placa 25 µl/pocillo de SB, 25 µl/pocillo de C y 25 µl/pocillo de antígeno
• Control sistema hemolítico con complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 50
µl/pocillo de SB y 25 µl/pocillo de C.
Página 40 de 65
• Control sistema hemolítico sin complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 75
µl/pocillo de SB.
d ) Disposición de los sueros en la placa

Los controles y muestras diluidas deben quedar dispuestas en la placa fondo en U (25 µl/pocillo) según
indica la tabla 3.
Tabla 3
1 2
3
Control Control 4 5 6 7 8 9 10 11 12
muestra
positivo negativo
A 1/12,5 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2
B 1/25 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4
C 1/50 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8
D 1/100 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16
E 1/200 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32
F 1/400 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64
G 1/800 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128
H 1/1600 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256
c) Preparación y dispensado de las soluciones de antígeno y complemento

- Preparar la solución de C según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar 25
µl/pocillo de dicha solución en todas las muestras.
- Preparar la solución de antígeno según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar
25 µl/pocillo de dicha solución en todos los pocillos salvo en la dilución 1/2 (muestras y control
negativo) y 1/12,5 (control positivo) Fila A, las cuales actuarán como controles de poder
anticomplementario (PAC) de cada suero.
d) Primera incubación en caliente

- Tapar y agitar la placa en agitador de placas durante 2-4 minutos.
- Incubar a 37 ± 2ºC durante 30 minutos.
e) Dispensado del sistema hemolítico

- Quince (15) minutos antes de finalizar la primera incubación, preparar e incubar a 37 ± 2ºC
durante 15 minutos el sistema hemolítico según el Anexo FCT IV.
- Finalizada la primera incubación, dispensar 25 µl/ pocillo del sistema hemolítico en todos los
pocillos de las placas incluida la placa de los controles.
f) Segunda incubación en caliente

- Tapar y agitar las placas en agitador de placas durante 2-4 minutos.
- Incubar a 37 ± 2ºC durante 30 minutos.
g) Centrifugación de la placa
- Finalizada la incubación, centrifugar la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos o
bien dejarla en reposo en heladera durante una hora antes de su lectura.
Página 41 de 65
Expresión de resultados
El grado de fijación del complemento se manifiesta por la presencia (negativos) o ausencia (positivos)
de hemólisis del sistema hemolítico. La reacción positiva se cuantificará mediante la determinacion del
título y su grado de hemólisis.
Reacción positiva
- Sedimento en grado variable de los glóbulos rojos en el fondo del pocillo.
- El sobrenadante estará afectado por un cierto tinte rojizo en función de la hemólisis que se haya
producido. Este grado de hemólisis debe cuantificarse y cosignarse mediante un sistema de
cruces.
Figura 11: Placa fijación de complemento
++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemólisis

Sobrenadante rojizo en un 25% de intensidad, en el fondo un deposito claro de
+++ GR 25% de hemólisis
Sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad, en el fondo un deposito tenue de
++ GR 50% de hemólisis
Sobrenadante rojizo en un 75% de intensidad, en el fondo un deposito muy
+ tenue de GR 75% de hemólisis
100% de
Negativo sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR hemólisis
Página 42 de 65
Determinación del título del suero
Será la inversa de la dilución mas alta que siga dando algún grado de sedimentación de los GR. Este
grado de fijación será informado mediante el sistema de cruces descripto y convertido a UIFCT.
- En el caso de los bovinos vacunados con Brucella abortus S19, para el diagnóstico de las
Brucellas lisas (B. abortus), se considera un resultado positivo cualquier valor ≥40 UIFCT (1/8
++).
- Para animales no vacunados (bovinos, caprinos, ovinos y porcinos) se considera positivo

cualquier valor ≥20 UIFCT (1/4 ++).
Expresión de los resultados en unidades internacionales de fijación del complemento
- El sistema de expresión de los resultados en UIFCT, ajustados al suero patrón internacional

OIEISS (en el caso de las Brucellas lisas), usado a continuación, se basa en el Procedimiento
IZS TE B2. 1.6 SOP 004 del Centro Internacional de Referencia OIE para Brucelosis Istituto
Zooprofilattico Sperimentale dell”Abruzzo e del Molise G. Caporale. Teramo. Italia y el Manual
de Procedimiento del Laboratorio Agroalimentario. Gobierno de Aragón. España. Tabla 4.
Tabla 4. Interpretación en UIFCT
% de
1000 UIFCT
Dilución Fijación del
(1/200)
Complemento
+ 16,6
++ 20
1:4
+++ 23,2
++++ 26,6
+ 33,2
++ 40
1:8
+++ 46,4
++++ 53,2
+ 66,4
++ 80
1:16
+++ 92,8
++++ 106,4
+ 132, 8
++ 160
1:32
+++ 185,6
++++ 212,8
+ 265,6
++ 320
1:64
+++ 371,2
++++ 425,6
+ 531,2
++ 640
1:128
+++ 742,4
++++ 851,2
+ 1062,4
++ 1280
1:256
+++ 1484,8
++++ 1702,4
Página 43 de 65
Controles del ensayo
La aprobación del ensayo debe realizarse si los controles han dado los resultados esperados:
Controles Resultado Esperado
50 % de fijación (++)
Suero control positivo - en la dilución 1:200 que corresponde
a 1000 UIFCT (Brucellas lisas)
100% de hemólisis
Suero control negativo en todos las diluciones, ausencia de fijación de
complemento
100% de hemólisis
Control de poder anticomplementario de los ausencia de fijación del complemento en la
sueros dilución 1:2 (sin antígeno)
Control de ausencia de poder
anticomplementario del antígeno 100 % hemólisis
Control del sistema hemolítico sin C 0% de hemólisis
Control del sistema hemolítico con C 100% de hemólisis
Criterio de aceptación del análisis:
El ensayo se debe considerar APROBADO / NO APROBADO
a) APROBADO:
• Los controles de antígeno, sistema hemolítico con y sin complemento dan los
resultados pre-establecidos.
• El control de suero positivo da el resultado pre-establecidos (1:200) con una
variación máxima de (± 2 ++).
• El control negativo da un resultado Negativo.
b) NO APROBADO: si uno de los controles no da el resultado esperado, se repite el ensayo.
La presencia de, al menos, un 25% de sedimento de eritrocitos (+) de la fila A (dilución ½) indica poder
anticomplementario en la muestra.
En este caso, se informa el resultado de PAC, lo que implica la solicitud de una nueva extracción de la
toma de muestra.
Página 44 de 65
Para facilitar la lectura e interpretación de los resultados se puede preparar una escala visual del
siguiente modo:
En un tubo se coloca 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2% + 900 µl de SB 1X.
En otro tubo colocar 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2% + 700 µl de agua destilada, agitar
para provocar la completa hemólisis de los GR (solución de hemoglobina), y agregarle 200 µl de SB 5X
para mantener la presión osmótica.
Estos dos tubos mantienen la misma relación de GR. intactos en el primer caso y de glóbulos lisados en
el segundo, que el que el 0% de hemólisis y el 100% de hemólisis en la prueba.
De esta manera mezclándolas en distintas proporciones podremos obtener la imagen que corresponde
a los distintos grados de hemólisis, luego de centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm.
PORCENTAJE DE HEMÓLISIS
REACTIVOS 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
EN µl
Solución 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
hemolisada
Suspensión de 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
glóbulos rojos
Página 45 de 65
Anexo FCT I: Solución Buffer (SB)
- Realizar una solución de stock de calcio/magnesio como indica la tabla 1, luego conservar en
refrigeración durante 6 meses o eliminar si hay turbidez producto de contaminación.
Solución de stock calcio 0,3M y magnesio 1 M
Ca Cl2. 3,7g
Mg Cl2. 9,5 g
Agua destilada 100 ml
- Añadir 1ml de solución stock a 1 litro de solución salina 0,85% (NaCl2 8,5 g/ agua destilada
1 litro).
- La solución de trabajo debe tener un pH de 7,3 – 7,4.
- Luego de su uso conservar en refrigeración por 7 días.
Página 46 de 65
Anexo FCT II: Preparación de la suspensión de GR 2 %
a) Lavado de los GR
- Homogeinizar cuidadosamente el frasco que contiene los eritrocitos.

- En un tubo cónico re-suspender los eritrocitos en una proporción de 1 volumen de GR + 5
volúmenes de SB, luego homogeinizar cuidadosamente.
- Centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 5 minutos y luego eliminar el sobrenadante
con una pipeta.
- Repetir la re-suspensión de los GR en SB, centrifugar de la misma manera anteriormente
descripta y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta.
- Realizar la última re-suspensión de los GR en SB y centrifugar aproximadamente a 1500 rpm
durante 10 minutos.
- Luego de la última centrifugación descartar el sobrenadante el cual debe estar libre de
hemólisis.
b) El método para la estandarización de la suspensión de glóbulos rojos 2% se podrá realizar por

medio de dos técnicas.
• Método espectrofotométrico.
• Método en cámara de Neubauer.
Método espectrofotométrico:
- Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlo en 9,8 ml de SB (2%).

- Realizar un blanco de lectura en el espectrofotómetro dispensando 2,5 ml agua destilada en la
celda o tubo del espectrofotómetro.
- Determinar la lisis 100% de los GR realizando una dilución 1/15 con agua destilada, agregando
en un tubo que contiene 2,8 ml de agua destilada 0,2 ml de glóbulos rojos al 2%.
- Una vez lisados los eritrocitos, leer la densidad óptica (DO) a 545 nm.
- La DO esperada debe ser de 0.330 ± 0.05. El laboratorio debe determinar según el modelo de
espectrofotómetro cual es la DO optima que indique la concentración de GR al 2 %.
Método en cámara de Neubauer:
- Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlo en 9,8 ml de SB (2%).

- Realizar una dilución 1/200 y hacer el recuento de glóbulos rojos en la cámara.
- La suspensión deberá tener 5,4(± 0,2) X 108 GR/ml.
Página 47 de 65
Anexo FCT III: Titulación Hemolisina
Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina
Se prepararán 15 diluciones de hemolisina (tabla 1). En cada tubo se dispensa los siguientes
volúmenes de SB y de hemolisina. La solución se homogeniza mediante agitación en vórtex.
Tabla 1: Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina

N° de tubo Dilución SB (ml) Hemolisina
1 1/50 4,9 100 µl
2 1/100 2 2 ml T1
3 1/150 7,45 50 µl
4 1/200 1 1 ml T2
5 1/250 12,5 50 µl
6 1/500 1 1 ml T5
7 1/1000 6 2 ml T5
8 1/2000 1 1 ml T7
9 1/3000 2 1 ml T7
10 1/4000 3 1 ml T7
11 1/5000 4 1 ml T7
12 1/6000 5 1 ml T7
13 1/7000 3 0,5 ml T7
14 1/8000 3,5 0,5 ml T7
15 1/9000 4 0.5 ml T7
Preparación de las soluciones “hijas” de hemolisina

- En la filas B, C, D, G y H de una placa fondo en U dispensar 25 µl/pocillo de SB excepto de las
columnas 10, 11 y 12 de las filas A, B, C y D (tabla 2).
- En la filas A (excepto las columnas 10, 11 y 12) y F de la placa dispensar 50 µl/pocillo de las
diluciones “madres’’ de hemolisina preparadas en la batería de tubos de ensayo, según
protocolo de la tabla 1.
- Con una pipeta multicanal recoger 25 µl por pocillo de la fila A y pasar a la fila B. La
homogenización de los dos componentes de cada dilución se realiza mezclando mediante 5
golpes de aspirado y dispensado de la pipeta. Recoger 25 µl/pocillo de la fila B y pasar a la fila
C. Volver a homogenizar. Recoger 25 µl/pocillo de la fila C y pasar a la D. Homogeinizar y
recoger 25 µl/pocillo y descartar.
- De la misma forma, haga diluciones de la fila F sobre las filas G y H.
- Las diluciones finales obtenidas se detallan en la tabla 3.
-
Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones ‘’madres’’ de hemolisina y SB
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl
A de T1 de T1 de T1 de T2 de T2 de T3 de T3 de T4 de T4
B de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB
C de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB
D de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB
E
50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl
F de T5 de T5 de T6 de T7 de T8 de T9 de T10 de T11 de T12 de T13 de T14 de T15
G de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB
H de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB
Página 48 de 65
Tabla 3. Diluciones finales de hemolisina
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1/50 1/50 1/50 1/100 1/100 1/150 1/150 1/200 1/200
B 1/100 1/100 1/100 1/200 1/200 1/300 1/300 1/400 1/400
C 1/200 1/200 1/200 1/400 1/400 1/600 1/600 1/800 1/800
D 1/400 1/400 1/400 1/800 1/800 1/1200 1/1200 1/1600 1/1600
F 1/250 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/3000 1/4000 1/5000 1/6000 1/7000 1/8000 1/9000
G 1/500 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/6000 1/8000 1/10000 1/12000 1/14000 1/16000 1/18000
H 1/1000 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/12000 1/16000 1/20000 1/24000 1/28000 1/32000 1/36000
Preparación y dispensado de la suspensión de glóbulos rojos
- Se prepara una suspensión de GR al 2% según lo indicado anteriormente. En este ensayo se

prepara una suspension de 5 ml.
- Dispensar la suspensión (25 µl/pocillo) en los pocillos de la microplaca.
- Cubrir y agitar la microplaca en un agitador de placas durante 30 minutos a bajas revoluciones.
Esto proporciona la sensibilización de los GR (unión con los anticuerpos presentes en las
diluciones de hemolisina).
- Dispense 25 µl/pocillo de SB en las filas A, B, C, D, F, G y H. En los pocillos de la columna 1 se
dispensar adicionalmente otros 25 µl (esta columna actúa como control del poder hemolítico de
la hemolisina).
Preparación y dispensado de una solución de complemento
- El objeto es preparar una solución de complemento a una concentración tal que siempre haya
reactivo disponible para detectar una posible unión de Ag (GR) – Ac (hemolisina diluida).
- Para complementos (comerciales) que den un titulo (unidad de complemento) superior a 1/90,
debe prepararse una solución de 1/30. Para complementos que den títulos inferiores, la
solución a preparar será de 1/10 – 1/20 (tabla 4).
Tabla 4: Dilución del complemento

TV Complemento
Solución de complemento 1/20 5,7 ml 0,3 ml
Solución de complemento 1/30 5,8 ml 0,2 ml
- Dispensar 25 µl/pocillo de la solución de complemento en las filas A, B, C, D, F, G y H, excepto

en los pocillos de la columna 1.
- Cubrir y agitar la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas.
Incubación
- Incubar a 37 ± 2° C, durante 30 minutos.
Página 49 de 65
Cálculos y expresión de resultados
El resultado de la relación de cada pocillo se evalúa por el grado de hemólisis presente en el mismo y
se consigna mediante un sistema de cruces. Tabla 5.
Tabla 5: Expresión de resultados

0 % de
++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR hemólisis
Sobrenadante rojizo en un 25% de intensidad, en el fondo un deposito claro de 25% de
+++ GR hemólisis
Sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad, en el fondo un deposito tenue de 50% de
++ GR hemólisis
Sobrenadante rojizo en un 75% de intensidad, en el fondo un deposito muy 75% de
+ tenue de GR hemólisis
100% de
Negativo sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR hemólisis
Los resultados de la lectura se emiten en la hoja de laboratorio correspondiente.
Cálculos de los resultados

- Se define la unidad de hemolisis (UH) como la dilución más alta que permita la lisis del 100% de
los eritrocitos en el pocillo.
- Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los
pocillos que contengan la misma dilución de hemolisis presentan un grado de hemolisis similar.
- Se elige la UH de la dilución en la que se obtenga 100% de hemolisis. Si existen dudas entre
dos diluciones se elegirá la dilución más baja (mayor concentración de hemolisina).
- La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UH, es decir 2 UH 100%.
- Ejemplo: Si la UH se ha establecido en 1/1000
DT= 2 x 1/1000= 1/500
- Los cálculos y las proporciones finales de reactivos se registran en hojas de trabajo.
- Se podrá realizar una dilución 1/50 o 1/100 de la hemolisina en SB conservando a -20 ± 5ºC
para luego diluirla al título de trabajo. Se registra el lote, fecha y cantidad de hemolisina diluida.
Página 50 de 65
Anexo FCT IV: Sistema hemolítico
- Para la preparación del sistema hemolítico, el volumen total del sistema depende del número de
placas a utilizar (1 placa= 96 pocillos fondo en U).
Ejemplo para dos placas:
2 placas x 2,4 ml = 4.8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en previsión de
perdidas)
- Dispensar en un frasco 2,5 ml de GR 2% y luego 2,5 ml de hemolisina al título de uso agitando
suavemente para homogenizar las dos suspensiones e incubar a 37° C ± 2° C, durante 15
minutos.
Página 51 de 65
Anexo FCT V: Titulación Complemento
Se llama complemento al suero de cobayo completo, que contiene el sistema enzimático denominado
‘’sistema complemento’’, cuya función en la técnica de fijación del complemento es la de detectar
uniones especificas antígeno-anticuerpo. En el caso que en dichas uniones una de las partes sean
glóbulos rojos, es capaz de lisarla, como en el caso del sistema hemolítico que se utiliza en la reacción
de fijación del complemento, donde los hematíes de carnero hacen el papel de antígeno y el suero de
conejo (hemolisina) de anticuerpos.
El complemento que sea objeto de titulación debe descongelarse dejándolo llevar a temperatura de
laboratorio. Una vez reconstituido o descongelado se mantendrá en refrigeración y solo se sacara de la
heladera en el momento de su utilización. Si se provee que se va a utilizar más de un vial se juntaran
todos en uno y se titulará el conjunto.
Preparación de las soluciones “madres” del complemento

- Realizar 6 diluciones ‘’madres’’ del complemento, empleando para ello tubos de ensayo. Tabla 1
de este anexo.
- En cada tubo se dispensan los siguientes volúmenes de SB y de complemento. La solución se
homogeiniza perfectamente mediante un agitador.
Tabla 1. Diluciones “madre” del complemento

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6
SB µl 725 850 975 1100 1225 1350
C µl 25 25 25 25 25 25
Preparación de las soluciones “hijas” en placas de ensayo y dispensado del SB

- En la filas B, C y D de una placa fondo en U dispense 25 µl/pocillo de SB (tabla 2).
- En la filas A de la placa dispense 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de complemento por
duplicado según protocolo descripto en tabla 1.
- Con una pipeta multicanal recoja 25 µl/pocillo de la fila A y trasváselos a la fila B. La
homogenización de los dos componentes de cada dilución se propiciara mezclando mediante 5
golpes de aspirado y dispensación de la pipeta. Recoja 25 µl/pocillo de la fila B y páselo a la fila
C. Vuela a homogenizar. Recoja 25 µl/pocillo de la fila C y páselo al D. Homogeinice y recoja 25
µl/pocillo y descártelos.
- Las diluciones que han quedado preparadas en la placa se detallan en la tabla 3.
- Dispense a continuación 50 µl/pocillo de SB en todas las filas de la placa.
- Agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas.
Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones “madres’’ de complemento y SB

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
de T1 de T2 de T4 de T2 de T5 de T6 de T1 de T2 de T4 de T2 de T5 de T6
B
de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB
C
D
E
F
G
H
Página 52 de 65
Tabla 3. Diluciones finales del complemento
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55
B 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110
C 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220
D 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440
E
F
G
H
- Cubra la placa para evitar evaporación excesiva e incube en estufa a 37 ±2 °C durante 15

minutos
Dispensado del sistema hemolítico
- El sistema hemolítico habrá sido preparado según procedimiento descripto anteriormente.
- Finalizada la incubación de la placa, dispense 25 µl/pocillo del SH en todos los pocillos de la
placa.
- Cubra y agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas.
- Incube en estufa a 37 ±2 °C durante 30 minutos
Centrifugación de la placa
- Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos.
El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemolisis presente en el mismo y
se consignará mediante un sistema de cruces:
Tabla 4
++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemolisis

+++ GR 25% de hemolisis
Sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad, en el fondo un deposito tenue
++ de GR 50% de hemolisis
+ tenue de GR 75% de hemolisis
Negativo sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100% de hemolisis
- Se define la unidad de complemento (UC) o Unidad Hemolítica como la dilución más alta que
permita la lisis del 100% de los eritrocitos en el pocillo.
- Sobre la hoja del laboratorio se comprobará la respetabilidad del análisis, constatando que los
pocillos que contengan la misma dilución de complemento presentan un grado de hemolisis
similar.
- Se elige la UC la dilución más alta que de 100% de hemolisis.
- La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UC.
Ejemplo: supongamos que se necesite preparar una solución de complemento para utilizar en el
análisis de 2 placas según el procedimiento descripto Ello supone un volumen total de solución
de complemento de 2 placas x 2,4ml/placa = 4,8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en
Página 53 de 65
previsión de perdidas)
a. Supongamos que UC = 1/100
DT= 2 x UC= 2 x 1/100 = 1/50
Si en 50 ml de SB se dispensa 1 ml de C puro:
En 5 ml de SB se dispensan x. x= 5/50= 0,1 ml
b. Por tanto las proporciones será: 0,1 ml de complemento y 4,9 ml de SB.
Control de 2 Unidades de complemento (2 UC)
- Una vez obtenida la dilución de trabajo, se realizará diluciones del complemento que contengan
2 unidades, 1,5 unidades, 1 unidad. 0,75 unidades y 0,5 unidades.
- Para ello trabajaremos según la siguiente secuencia. Tabla 5.
Tabla 5: Diluciones del complemento

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
(2 unidades) (1,5 unidades) (1 unidades) (0,75unidades) (0,5unidades)
C: 2 unidades (µl) 400 300 200 150 100
SB (µl) 0 100 200 250 300
- Se dispensaran por duplicado 25 µl/pocillo de cada una de las diluciones en los

correspondientes pocillos de una placa y luego se completan con 50 µl de SB. Tabla 6
Tabla 6. Unidades del complemento en la placa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 2U 1, 5U 1U 0,75 U 0,5 U
B 2U 1, 5U 1U 0,75 U 0,5 U
C
D
E
F
G
H
- Cubra la placa para evitar evaporación excesiva, agite 2 – 4 minutos e incube en estufa a 37°C
± 2° C durante 15 minutos
- Luego repita lo descripto agregando el SH
Lectura del análisis:
- Pocillo con 2 Unidades: 100% de hemolisis
- Pocillo con 1,5 Unidades: 100% de hemolisis
- Pocillo con 1 Unidades: 100% de hemolisis o traza de GR en suspensión
- Pocillo con 0,75 Unidades: 0% a 75% de hemolisis
- Pocillo con 0,5 Unidades: 0% a 50% de hemolisis
CONTROL DE CALIDAD
- El ensayo debe ser repetible: pocillos con diluciones iguales deben tener un grado de reacción
similar. En caso contrario se repetira el análisis.
- Debe observarse cada gama de reacciones posibles desde diluciones con el 100% (N) de
hemólisis (las mas bajas), hasta diluciones con el 0 % (++++) de hemólisis (las mas alta). En
caso contrario se repetira el análisis.
- En el control de 2 Unidades de complemento deben dar los resultados preeestablecidos.
El análisis debe informarse como APROBADO/NO APROBADO en el apartado de observaciones de la
planilla de titulación del complemento. En caso de no aprobado, se repite el proceso.
Página 54 de 65
Anexo FCT VI: Titulación Antígeno
Se utiliza el antígeno de seroaglutinación en tubo (SAT) volumen celular aproximado de 4,5 %
Se trata de determinar lo que se denomina UA (Unidad Antigénica) que corresponde para cada lote de
antígeno y será la dilución óptima de uso para garantizar la unión con los anticuerpos presentes en los
sueros problema, en la cantidad suficiente para fijar el complemento.
El antígeno formará el complejo antígeno-anticuerpo con los anticuerpos presentes de los sueros
problema y que serán capaces de fijar el complemento.
Esta reacción requiere un título mínimo para que se lleve a cabo, es decir, se debe garantizar una
concentración mínima de antígeno que reaccione con los anticuerpos y sea capaz de fijar el
complemento.
Preparación de diluciones “madre” de antígeno

Se preparan tres diluciones previas en tubos, donde se dispensaran en un tubo 500 µl de SB y 10 µl de
antígeno, en el segundo tubo 750 µl de SB y 10 µl de antígeno y en tercero 1250 µl de SB y 10 µl de
antígeno lo que da una dilución de 1/50, 1/75 y 1/125 respectivamente.
Preparación de las diluciones “hijas” de antígeno

En una placa de fondo en U se dispensa 25 µl de SB en todos los pocillos salvo en la columna 1 y los
pocillos A10, A11, A12. La fila C y F no se utilizaran hasta la columna 9 (Tabla 1). En la columna 1 se
pondrá 50 µl de las soluciones madres del antígeno por duplicado y en los pocillos A10, A11, A12 de
forma simple (tabla 1). Se diluye pasando 25 µl sucesivamente de estos pocillos a los siguientes
consiguiendo diluciones al duplo del antígeno. Las diluciones se realizan de la columna 1 a la columna 9
y de los pocillos A10, A11, A12 hasta los pocillos H10, H11 y H12. Es decir se pasan 25 µl de la
columna 1 a la 2, se homogeiniza y se pasa otros 25 µl a la columna 3 y así sucesivamente y se elimina
los 25 µl que sobran en la columna 9 y lo mismo en vertical en las columna 10, 11 y 12.
Tabla 1 Diluciones ‘’hijas’’ del antígeno

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/50 1/75 1/125
B 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/100 1/150 1/250
C 1/200 1/300 1/500
D 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/400 1/600 1/1000
E 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/800 1/1200 1/2000
F 1/1600 1/2400 1/4000
G 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/3200 1/4800 1/8000
H 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/6400 1/9600 1/16000
Dispensado de sueros controles positivo y negativo

Seguidamente se dispensa 25 µl de suero control positivo en los pocillos de la fila A, B D E, G y H salvo
en las columnas 10, 11, 12 donde se dispensan 25 µl de suero control negativo y servirá como control
de hemolisis.
El suero control positivo debe ir a una dilución igual al título conocido (1/200) en la reacción de fijación
del complemento.
Dispensado de una solución de complemento

Posteriormente se dispensa 25 µl de complemento a todos los pocillos según el título obtenido
previamente, Se agita la placa 2 - 4 minutos y se incuba durante 30 minutos a 37° C ± 2° C.
Página 55 de 65
Dispensado del sistema hemolítico
Tras la incubación de la placa se procede a dispensar 25 µl de sistema hemolítico a todos los pocillos.
Luego se agita la placa 2 - 4 minutos e incubará durante otros 30 minutos a 37 ° C ± 2° C.
Centrifugación de la placa
Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos.
El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemolisis presente en el mismo y
se consignara mediante un sistema de cruces.
Tabla 2
++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemolisis

+++ GR 25% de hemolisis
Sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad, en el fondo un deposito tenue de
++ GR 50% de hemolisis
+ tenue de GR 75% de hemolisis
Negativo sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100% de hemolisis
Los resultados de la lectura se registran en la hoja de laboratorio correspondiente

- Se define la unidad de antígeno (UA) como la dilución más alta que permita una fijación
completa (0% de hemolisis)
- Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los
pocillos que contengan la misma dilución de antígeno presentan un grado de hemolisis similar.
- Se elige la UA a dilución en la que se obtenga el 0 % de hemolisis. Si existen dudas entre dos
diluciones se elegirá la dilución más baja (de mayor concentración de antígeno).
- La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UA.
Ejemplo: supongamos que la UA se ha establecido 1/800:
DT= 2 x UA= 2 x 1/800 = 1/400
Página 56 de 65
NORMATIVA VIGENTE
Consultar en
• http://www.senasa.gob.ar/normativas
• https://www.boletinoficial.gob.ar/
• http://www.infoleg.gob.ar/
LEY 24.696: Declárase de interés nacional el control y erradicación de la enfermedad reconocida

como Brucelosis (Brucella abortus) en las especies bovina, suina, caprina y otras en todo el Territorio
Nacional.
RESOLUCIÓN SENASA 67/2019: Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis

Bovina en la REPÚBLICA ARGENTINA. Se aprueba el Plan Nacional de Control y Erradicación de
Brucelosis Bovina en la REPÚBLICA ARGENTINA, de aplicación obligatoria en todo el Territorio
Nacional, excepto en la Provincia de TIERRA DEL FUEGO, ANTÁRTIDA E ISLAS DEL ATLÁNTICO
SUR.
RESOLUCIÓN SENASA 857-E/2017: Zona Libre de Brucelosis Ovina y Caprina a Brucella

melitensis.
RESOLUCIÓN SENASA 372-E/2017: Aprobación del Plan Nacional de Control de Brucelosis

Caprina.
RESOLUCIÓN SENASA 98/2016: Comercialización de antígenos/kits para diagnóstico de

brucelosis. Los laboratorios elaboradores y/o importadores y/o sus distribuidores autorizados por el
servicio nacional de sanidad y calidad agroalimentaria (Senasa), solo pueden efectuar ventas de
antígenos/kits para diagnóstico de brucelosis a los laboratorios inscriptos en la red nacional de
laboratorios del Senasa, que se encuentren debidamente habilitados para el rubro diagnóstico de
brucelosis.
RESOLUCIÓN SENASA 63/2013: Se aprueban los requisitos y procedimientos que deben

cumplir los productores agropecuarios para que sus establecimientos obtengan la certificación oficial
como libre de brucelosis porcina y para incorporar sus rodeos al Registro Nacional de
Establecimientos Oficialmente Libres de Brucelosis Porcina.
RESOLUCIÓN SENASA 246/2007: Requisitos de bioseguridad para los laboratorios que se

dediquen a la elaboración de productos destinados al diagnóstico y a la prevención de la Brucelosis
Animal y la Tuberculosis Animal.
RESOLUCIÓN SENASA 438/2006: Adóptese el Sistema de Diagnóstico Serológico para el

Programa de Control y Erradicación de la Brucelosis. Técnicas que lo conforman.
RESOLUCIÓN 736/2006: Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos SANIDAD

ANIMAL Y VEGETAL. Créase la Red Nacional de Laboratorios de Ensayo y Diagnóstico. Marco
normativo para la inscripción en el Registro de la mencionada Red. Excepciones.
RESOLUCIÓN SENASA 79/2003: Adoptar la Técnica de I-ELISA en Leche para el

diagnóstico de Brucelosis Bovina en establecimientos lecheros
RESOLUCIÓN SENASA 1484/1993: Normas para la Elaboración, fraccionamiento, distribución,

expendedor para los reactivos destinados en el diagnóstico y prevención de la Brucelosis Animal.
Página 57 de 65
INFORME DE LA SUBCOMISIÓN TÉCNICA DE LA COMISIÓN NACIONAL DE
BRUCELOSIS para el cambio del título de corte de la prueba de 2-ME (2006)
Integrantes: Dr. Eduardo Bagnat, SENASA; Dr. Eduardo Moras, Fac. Vet UBA; Dra. Marcela
Martínez Vibot, Fac. Vet UBA; Dr. Luis Samartino, INTA; Dra. Susana T. de Echaide, INTA; Dra.
Irene Walsh, AAVLD; Dr. Guillermo López, DIPRODESA; Dra. Cecilia Di Lorenzo, Coleg. Med. Vet,
Bs. As; Dra. Ana M. Nicola, SENASA.
CAMBIO DEL PUNTO DE CORTE DE LA PRUEBA 2- MERCAPTOETANOL
Se decidió cambiar la interpretación oficial del resultado de la Prueba de aglutinación, del 2-

Mercaptoetanol para los bovinos.
Será considerado Reactor Serológico Positivo a todo animal que en la Prueba de aglutinación del 2-
Mercaptoetanol, presente reacción de aglutinación en la dilución 1/50 (sea esta reacción completa o
incompleta) o mayor siendo esta realizada conforme al Manual de Brucelosis de la DILACOT-
SENASA.
Todo animal cuya reacción de aglutinación en la Prueba del 2-Mercaptoetanol se presente únicamente
en la dilución 1/25, sea esta completa o incompleta, será considerado seroreactor Negativo.
Datos analizados
INTA Castelar
Proporcionó a la subcomisión Técnica de Brucelosis el resultado del diagnóstico serológico sobre un
total de 1672 sueros de diversos establecimientos que fueran remitidos a esa unidad de diagnóstico y a
los cuales se le realizara las Pruebas de Fijación de Complemento, SAT y 2-ME. Siendo que se
observaba, por parte de especialistas y profesionales de campo, reacciones que no superaban la
dilución 1/25 en la Prueba del 2-Mercaptoetanol y muchas de las cuales no reaccionaban en la
dilución 1/50 en la Prueba del SAT y que además ocurrían en animales de establecimientos cuya
epidemiología no manifestaba indicios de presencia de la enfermedad, se consideró la necesidad de
analizar el error de diagnóstico que se producía en este estrato reactor serológico tomando como
referencia la Prueba de Fijación de Complemento (estándar deoro).
Del total de 1672 sueros, 170 sueros (10%) reaccionaron sólo en la dilución 1/25 al 2-ME y fueron
a su vez Negativos a la FC` y no superaron la dilución 1/50 al SAT. Por otra parte hubo 6 sueros
(0,3%) con ese nivel de reacción al 2-ME y al SAT, que resultaron Positivos a la Fijación
deComplemento.
170 sueros resultaron falsos positivos (FP), esto es reactores 1/25 al 2-ME y Negativos a la FC` y,
6 sueros resultaron Verdaderos Positivos (VP) (+ 1/25 al 2-ME y Positivos a la FC`).
La relación FP/ VP fue de 35/1
EE INTA RAFAELA
Sobre un total de 801 sueros 51 (6,3%) se encontraban en ese estrato reactor (FC` Negativo, SAT 1/50
o menos y 2-ME 1/25). Hubo 2 sueros (0,2%) FC` Positivo, SAT 1/50 o menos y 2- ME 1/25
51 sueros resultaron FP y 2 sueros resultaron VP La relación FP/VP fue 51/2= 25/1
Página 58 de 65
Conclusión:
La cantidad de Falsos Positivos que cuesta detectar (1) uno verdadero positivo, en el estrato de reactor
estudiado, fue de 35 y 25 en cada estudio. Ello significa un costo muy elevado.
Al cambiar el nivel de corte del 2-ME de la dilución 1/25 al de la dilución 1/50 (sea esta reacción
completa o incompleta), el Verdadero Positivo pasará a ser un Falso Negativo.
Por otro lado se observa que en el nuevo punto de corte, reactor en la dilución 1/50 (sea esta reacción
completa o incompleta), hay predominio de los verdaderos positivos (FC` Positivos) respecto de los
Falsos Positivos (FC` Negativos). Esta relación costo /beneficio justifica la modificación.
Debe considerarse que esta modificación se refiere a la interpretación estándar oficial de la serología
que se incorpora al Manual de Procedimientos de la Brucelosis de la DILACOT-SENASA. Ello debe
distinguirse de la práctica particular de saneamiento donde el profesional sanitarista puede y debe
interpretar los resultados serológicos con un CRITERIO EPIDEMIOLÓGICO adecuado al caso particular
de aplicación.
Asimismo debe tenerse presente para los procedimientos de certificación, que en aquellos casos en que
el profesional encuentre discordancia de los resultados con la condición epidemiológica, podrá solicitar
que sean consideradas sus discrepancias con la interpretación oficial para su caso, Res. SENASA
438/06.
Ver tabla a continuación
A partir de Diciembre 2006

TABLA DE DECISIÓN
(Hembras vacunadas mayores de 18 meses)
BPA WRIGHT 2-ME INTERPRETACIÓN
- NSH NSH NEGATIVO
+ 50 UI - NEGATIVO
+ I 100UI - SOSPECHOSO
+ 100 UI - SOSPECHOSO
+ I 200 UI - SOSPECHOSO
+ 200UI - POSITIVO
+ I 50UI I 50 UI POSITIVO
Referencias
I=Incompleto
NSH = No sehace
UI = Unidades Internacionales
+ =Positivo
- =Negativo
Página 59 de 65
ANEXO I Lavado y desinfección de manos
Una vez terminada la tarea, retirarse los guantes y siempre lavarse las manos después de cada
actividad en el Laboratorio
Página 60 de 65
Página 61 de 65
ANEXO II Modelo de Planilla de emisión de
resultados
Página 62 de 65
Página 63 de 65
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
1) ALTON G.G., JONES L.M., ANGUS R.D. & VERGER J.M. (1988). Techniques for the Brucellosis
Laboratory. Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, France.
2) ANGUS R.D. & BARTON C.E. (1984). The production and evaluation of a buffered plate antigen
for use in a presumptive test for brucellosis. Dev. Biol. Stand., 56,349–356.
3) Centro Panamericano de Zoonosis – Nota Técnica Nº2.
4) CIOCCHINI A.E., REY SERANTES D. A., MELLI L.J., IWASHKIW J.A., ELENA S., FRANCO C.,
NICOLA A.M., FELDMAN M.F., COMERCI D.J., UGALDE J.E. A bacterial engineered
glycoprotein as a novel antigenic target for diagnosis of bovine brucellosis. Vet Microbiol. 2014
Aug, 27; 172 (3-4):455-65.
5) CORTINA M.E., BALZANO R.E., REY SERANTES D.A., CAILLAVA A.J., ELENA S., FERREIRA
A.C., NICOLA A.M., UGALDE J.E., COMERCI D.J., CIOCCHINI A.E (2016). A bacterial
glycoengineered antigen for improved serodiagnosis of porcine brucellosis. Journal of Clinical
Microbiology, 54(6), 1448-1455.
6) GALL D., NIELSEN K., FORBES L., COOK W., LECLAIR D., BALSEVICIUS S., KELLY L.,
SMITH P. & MALLORY M. (2001). Evaluation of the fluorescence polarization assay and
comparison to other serological assays for detection of brucellosis in cervids. J. Wildl. Dis.,
37,110–118.
7) GALL D.,NIELSEN K.,FORBES L.,DAVIS D.,ELZER P.,OLSEN S.,BALSEVICIUS S.,KELLY L.,

SMITH P., TAN S. & JOLY D. (2000). Validation of the fluorescence polarization assay and
comparison to other serological tests for detection of serum antibody to Brucella abortus in bison. J.
Wildl. Dis., 36, 469–476.
8) MACMILLAN A.P., GREISER-WILKE I., MOENNIG V. & MATHIAS L.A. (1990). A competition
enzyme immunoassay for brucellosis diagnosis. DtschTierarztl. Wochenschr., 97, 83–85.
9) Manual de procedimiento IZS TE B2.1.6 SOP012 – Instituto Zooprofilactico experimental del

Abruzzo y del Molise “G. Caporale” Teramo, Italia.
10) Manual de Procedimientos Técnicas para el Diagnóstico de Brucelosis Humana 2008. Servicio
de Brucelosis Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”,
Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para América del Sur.
11) NIELSENK. (2002). Diagnosis of brucellosis by serology. Vet. Microbiol., 90,447–459.
12) NIELSEN K., GALL D., JOLLEY M., LEISHMAN G., BALSEVICIUS S., SMITH P., NICOLETTI P.
& THOMAS F. (1996). A homogenous fluorescence polarization assay for detection of antibody
to Brucella abortus. J. Immunol. Methods, 195,161–168.
13) NIELSEN K., KELLY L., GALL D., BALSEVICIUS S., BOSSE J., NICOLETTI P. & KELLY W.
(1996). Comparison of enzymeimmunoassays for the diagnosis of bovine brucellosis. Prev. Vet.
Med., 26, 17–32.
14) NIELSEN K., KELLY L., GALL D., NICOLETTI P. & KELLY W. (1995). Improved competitive
enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis.Vet.Immunol.Immunopathol.,
46,285–291.
15) Norma ISO/IEC 17025/2017.
16) Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). “Manual of standards for diagnostic test &
vaccines”, Capítulo 3.1.4 : Infección por Brucella abortus, B. melitensis y B. suis.) Edición 2016.
Página 64 de 65
17) Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). Código Terrestre. Capítulo 8.4: Infección por
Brucella abortus, B. melitensis y B. suis.
18) SENASA. Manual de diagnóstico serológico de la Brucelosis Bovina. 2009.
19) SENASA. Manual de procedimientos de técnicas diagnósticas en Brucelosis.1998.
20) Silva Paulo, P.; Vigliocco, A.M., Ramondino, R., Marticorena, D., Bici, E., Briones, G., Gorchs,
C., Gall, D., Nielsen, K. 2000. Evaluation of primary binding assays for presumptive
serodiagnosis of swine brucellosis in Argentina. Clin. Diag. Lab. Immunol. 7:828-831.
21) Szyfres, B. 1983. El Diagnóstico de la Brucelosis Bovina en el Contexto de un Programa de

lucha. Boletín Técnico Nº2. IICA/SENASA.
22) Vanzini, V., Aguirre, N., Lugaresi, C.I., de Echaide, S., de Canavesio, V.G., Guglielmone, A.,
Marchesino, M., Nielsen, K. 1998. Evaluation of an Indirect ELISA for the diagnosis of bovine
brucellosis in milk and serum samples in dairy cattle in Argentina. Preventive Vet. Med.36:211-
217.
23) Vanzini, V., Echaide, S., 1998. Brucelosis Enzimoinmunoensayo Indirecto para detectar
anticuerpos anti-Brucella abortus en bovinos. Versión traducida y actualizada con datos
obtenidos en la EEA Rafaela.
24) STACK J.A., PERRETT L.L., BREW S.D., MACMILLAN A.P. (1999). C-ELISA for bovine
brucellosis suitable for testing poor quality samples. Vet. Record, 145, 735–736.
25) WORLD HEALTH ORGANIZATION (2009). WHO Manual técnico de referencia para la higiene
de las manos.
26) WORLD HEALTH ORGANIZATION (2005). WHO Laboratory Biosafety Manual, Second Edition.
WHO, Geneva, Switzerland.
27) WORLD HEALTH ORGANIZATION (1986). JOINT FOOD AND AGRICULTURE

ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS/WORLD HEALTH ORGANIZATION EXPERT
COMMITTEE ON BRUCELLOSIS Technical Report Series 740, Sixth Report. WHO, Geneva,
Switzerland
28) WRIGHT P.F., NILSSON E., VAN ROOIJ E.M.A., LELENTA M. & JEGGO M.H. (1993).
Standardisation and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the
detection of antibody in infectious disease diagnosis. Rev.sci.tech.Off.int.Epiz., 12, 435–450.
29) WRIGHT P.F., TOUNKARA K., LELENTA M. & JEGGO M.H. (1997). International reference
Standards: antibody standards for the indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Rev. Sci.
Tech., 3, 824– 832.
Página 65 de 65
BRUCELOSIS
Manual de Diagnóstico Serológico
2009

Manual Tecnicas Serologicas-2019-V4 Brucelosis

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Manual Tecnicas Serologicas-2019-V4 Brucelosis

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Manual Tecnicas Serologicas-2019-V4 Brucelosis

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

BRUCELOSIS

(B. abortus, B. melitensis, B. suis)

Laboratorio de Referencia OIE/FAO para Brucelosis

(B. abortus, B. melitensis, B. suis)

Elaborado por: Departamento Brucelosis (Laboratorio de Referencia para OIE/FAO)

El presente Manual tiene como objetivos:

▪ Colaborar con el mejor desempeño y competencia de los Laboratorios que

▪ Proporcionar a la Red de Laboratorios de SENASA un instrumento que facilite el

▪ Contribuir a la aplicación de las medidas de bioseguridad y controles de calidad

▪ Contar con un instrumento que sirva de guía para la evaluación y monitoreo de

Medidas Generales de Bioseguridad y Seguridad en el Laboratorio 5

Prueba de screening con antígenos tamponados en placa (BPAT y RBT) 17

Prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT y 2-ME) 20

Prueba de anillo en leche 26

ELISA por competición / bloqueo 32

Ensayo de Polarización Fluorescente 35

Informe de la Subcomisión Técnica de la Comisión Nacional de Brucelosis 58

Anexo I Lavado y desinfección de manos 60

Prácticas y Técnicas de Laboratorio. El elemento más importante de la contención es el cumplimiento

Prácticas operativas seguras y hábitos personales

▪ El acceso al laboratorio debe ser limitado o restringido.

Limpieza y desinfección del Laboratorio

Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos)

El Laboratorio debe elaborar un procedimiento de la manipulación, clasificación y descarte de los

Los residuos serán acumulados en recipientes colocados convenientemente y en cantidad suficiente en

Se debe cumplimentar la reglamentación vigente de acuerdo a las BPL (Buenas Prácticas de

Control de calidad de insumos

Los reactivos para el diagnóstico de Brucelosis que se comercializan en la República Argentina,

Grado 1- Exenta básicamente de contaminantes constituidos por iones disueltos o coloidales y

El laboratorio debe tener inventario del equipamiento y un programa de control y mantenimiento

Agente: Brucella (B. abortus, B. melitensis, B. suis)

Infección por Brucella en ganado bovino

Infección por Brucella en ovejas y cabras

Infección por Brucella en cerdos

Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio, o

Se ha observado infección por B. abortus y B. melitensis en el dromedario (Camelus dromedarius) y

Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad

CFT ++ ++ +++ ++ +++ n/a

BST ++ - + +++ ++ n/a

REGISTRO DE ENTRADA DE MUESTRAS

Todo laboratorio debe contar con un instructivo o procedimiento de recepción, manejo y

CARACTERISTICAS Y CONDICIONES DE LAS MUESTRAS

▪ Sangre entera o suero refrigerados.

Condiciones de "rechazo" o demora del procesamiento de las muestras:

▪ Falta de planillas/protocolo o planillas incompletas de toma de muestras (Anexo II,

▪ Logo del Laboratorio/Dirección/Tel/email/ Nº de L

Son pruebas tamiz de aglutinación en placa. Se fundamentan en la inhibición de las aglutininas

▪ Micropipetas de10-100 µl.

▪ Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC).

▪ Antígeno BPAT con volumen celular aprox. de 11%.

Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ±3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya

▪ Suero control interno positivo.

EJECUCIÓN DEL ENSAYO DE BPAT

▪ Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex.

EJECUCIÓN DEL ENSAYO DE ROSA DE BENGALA

▪ Colocar la placa de vidrio sobre el aglutinoscopio, como se indicó en la prueba de BPAT.

Las reacciones se clasifican en:

NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antígeno es de turbidez homogénea y sin grumos.