01 de marzo del 2023 

 
 
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GENERAL  
PRÁCTICA # 8 
FOTOCOLORIMETRÍA

Integrantes del equipo: 

● Abril Payan Gastelum – 216354 
● Itzel Janeth Lucero Ramírez 224283 
● Jennifer Denisse Cardenas Mendez 224105 

 
 

ÍNDICE
Introducción……………………………………………………………………….1
Objetivo……………………………………………………………………………1
Métodos y Materiales……………………………………………………………2
Resultados………………………………………………………………………..2
Discusión………………………………………………………………………….7
Conclusión………………………………………………………………………..8
Bibliografía………………………………………………………………………..9

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS

Tabla I. Tabla que muestra los materiales y reactivos usados en la práctica……2

Tabla II. Absorbancias registradas de las soluciones de acuerdo con las distintas
longitudes de onda……………………………………………………………………...3
Tabla III. Concentración y absorbancias registradas a las longitudes de onda para
cada dilución seriada……………………………………………………………………4

Tabla IV. Tabla de los valores de la concentración de las soluciones…………….7

Gráfica 1. Espectro de absorción de los reactivos…………………………………..4

Gráfica 2. Curva de calibración de la safranina………………………………………5

Gráfica 3. Curva de calibración del verde brillante…………………………………..6

Gráfica 4. Curva de calibración del azul de metileno………………………………..6

Figura 1. Colores de luz visible………………………………………………………...7

INTRODUCCIÓN
La fotocolorimetría se fundamente en la mayor o menor absorción de luz de
acuerdo con el mayor número de moléculas en una solución, donde la tonalidad
dependerá de la capacidad de absorber un rayo de luz de determinada longitud de
onda. La fotocolorimetría manipula las variables de este fenómeno controlando la
luz incidente proveniente de un foco luminoso y su pureza, de modo tal que sólo
incida aquella luz que es específicamente adsorbida por la partícula que
deseamos analizar (analito).
Conociendo la longitud de onda óptima a la que absorben los analitos, o especies
directamente relacionadas con ellos, se pueden realizar las pruebas analíticas en
los laboratorios clínicos aplicando las leyes de espectrofotometría.
La relación de la longitud de onda con la frecuencia y con la energía de radiación
es inversa, por lo que las radiaciones más energéticas, más penetrantes, son a su
vez las de mayor frecuencia y menor longitud de onda. La región visible del
espectro luminoso es la zona de longitudes de onda con energía radiante capaz
de ser detectado por el ojo humano y va desde el violeta hasta el rojo.
Las técnicas espectroscópicas se basan en la medida de los efectos de la
interacción de las radiaciones electromagnéticas con la materia. Al incidir sobre el
material biológico con una intensidad inicial (I 0), las moléculas y/o átomos de este
absorben parte de esa radiación (Ia), otra parte la dispersan (Id) y otra atraviesa la
muestra (It). La cantidad de radiación absorbida se ajusta a leyes físicas concretas
dependientes de las características tanto de la radiación como de la materia sobre
la que se irradia (Del Valle Mendoza & Cornejo Tapia, 2014).

OBJETIVO

a) Determinar los espectros de absorción de 2 sustancias coloridas.

b) Determinar la longitud de onda óptima para la cuantificación de cada sustancia
(máxima absorbancia).
c) Desarrollar curvas de calibración para cada una de las sustancias.
d) Comprobar si se sigue la Ley de Lambert-Beer para cada una de las sustancias
y cuáles serán los límites.

MATERIALES Y MÉTODOS

1
 MATERIAL POR EQUIPO MATERIAL POR MESA REACTIVOS

12 tubos de ensaye 1 pipeta de 5 ml Solución de safranina

(7.12 x 10-5 M)
1 gradilla 2 pipetas de 2 ml Solución de verde brillante
(4.14 x 10-5 M)
Espectrofotómetro 1 propipeta azul Solución de azul de
Genesys 20 metileno (6.25 x 10-5 M)
1 propipeta
verde
Celdillas para
Fotocolorímetro.
1 piseta
1 vaso de precipitado
250 ml
Tabla I. Tabla que muestra los materiales y reactivos usados en la práctica.

1. Para iniciar con esta práctica prendimos el espectrofotómetro antes para

que se pudiera hacer las lecturas fotométricas correctas y medir sus
absorbancias.
2. Se puso un 1 ml de agua destilada, safranina, verde brillante y azul de
metileno, en los tubos de ensayé para después poder depositarlos en las
cubetas celulares.
3. Para poder calibrar el espectrofotómetro se tuvo que estar midiendo con el
blanco ( agua destilada) de 540 a 700 no al igual que con los otros
reactivos, esto fue el barrido.
4. Preparamos 4 disoluciones de 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 utilizando como diluyente
el agua para cada uno de los reactivos los cuales son safranina, verde
brillante y azul de metileno.
5. Llevamos los reactivos diluidos al espectrofotómetro para medir la
absorbancia de cada uno de ellos.

RESULTADOS

Experimento No.1 Manejo del espectrofotómetro.

En este experimento lo único que se realizo fue el manejo del espectrofotómetro
que usamos en el laboratorio que es un Thermo Spectronic Genesys – 20. Por lo
tanto, no hubo algún resultado como tal, solo se llevaron a cabo los pasos que
indicaba el manual de la práctica de laboratorio.
Experimento No. 2 Determinación de los espectros de absorción.
Con respecto a este experimento realizado, en el que se determinó el espectro de
absorción para las soluciones de safranina, verde brillante y azul de metileno, se
2
obtuvieron las siguientes absorbancias mostradas en la Tabla II. a partir de
distintas longitudes de onda, desde 480 nm hasta 700 nm (en intervalos de 20
nm).

Absorbancia
λ(nm) Safranina Verde Brillante Azul de metileno
480 0.813 0.058 0.244
500 1.102 0.05 0.279
520 1.219 0.093 0.003
540 0.93 0.196 0.265
560 0.387 0.431 0.293
580 0.185 0.806 0.38
600 0.149 0.911 0.296
620 0.16 1.136 0.316
640 0.141 1.022 0.348
660 0.107 0.519 0.409
680 0.087 0.168 0.346
700 0.071 0.051 0.248
Tabla II. Absorbancias registradas de las soluciones de acuerdo con las distintas longitudes de
onda.

Posteriormente, con los datos registrados en la tabla anterior, fue realizada la

Grafica 1. en la que se puede observar la absorbancia con respecto a la longitud
de onda, facilitando así la comprensión del comportamiento para cada colorante.
Refiriéndose a la solución estándar con safranina, la longitud de onda en la que se
observó el máximo de absorbancia fue 520 nm, mientras que, en la solución que
contenía el colorante de verde brillante, la máxima absorbancia se percibió en 620
nm y finalmente el azul de metileno, la máxima absorbancia fue a los 660 nm.
 Espectro de absorción
1.4

1.2
Absorbancia 1

0.8

0.6

0.4

0.2

0
480 530 580 630 680
Longitud de onda (nm)

Gráfica 1. Espectro de absorción de los reactivos.

Experimento No. 3 Preparación de curva de calibración para una solución

tipo.
En lo que refiere al experimento 3, se tomó en cuenta que la solución inicial de la
safranina originalmente tenía una concentración de 7.12 *10-5 M, mientras que la
concentración inicial de la solución de verde brillante era de 4.14 * 10-5 M y con la
solución inicial del azul de metileno era de 6.25 * 10-5 M. Con estas se realizaron
diluciones seriadas, y para obtener la concentración en M de cada dilución se
dividió el valor inicial de las soluciones con las que se comenzó entre el número de
serie de la dilución. Tras conocer la concentración de cada dilución y realizar las
medidas para ellas en el espectrofotómetro, tanto a la longitud de onda de máxima
absorbancia de la safranina (λ1) como la de verde brillante (λ2) y la de azul de
metileno (λ3), se obtuvieron los siguientes datos mostrados en la Tabla III. para las
curvas de calibración.

Safranina 520 nm Verde Brillante 620 nm Azul de metileno 660 nm

Dilución C (M) A (λ1) C (M) A (λ2) C (M) A (λ3)
1:1 7.12E-05 1.219 1.80E-04 1.136 6.25E-05 0.409
1:2 3.56E-05 0.382 9.00E-05 1.007 3.13E-05 0.106
1:4 1.78E-05 0.169 4.50E-05 0.389 1.56E-05 0.039
1:8 8.90E-06 0.154 2.25E-05 0.186 7.81E-06 0.015
1:16 4.45E-06 0.082 1.13E-05 0.045 3.91E-06 0.014
Tabla III. Concentración y absorbancias registradas a las longitudes de onda para cada dilución
seriada.

Al momento de graficar los datos registrados en las diluciones con safranina se

obtuvo la siguiente Gráfica 2. en donde se puede observar la ecuación de la recta,
4
la cual es similar a la de la ley de Lambert-Beer donde A = Ɛ ∙ L ∙ C, siendo la “y”
en la ecuación de la pendiente equivalente a la absorbancia (A), el valor de la
pendiente el coeficiente de extinción molar (Ɛ) y la “x” la concentración (C). La “L”
en la ley de Lambert-Beer corresponde a la longitud de la celda (1 cm).

Curva de calibración de la safranina

1.4

1.2
f(x) = 16897.426603842 x − 0.0650000000000002
1 R² = 0.949492950506827
Asorbancia

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0.00E+00 1.00E-05 2.00E-05 3.00E-05 4.00E-05 5.00E-05 6.00E-05 7.00E-05 8.00E-05

Concentración (M)

Gráfica 2. Curva de calibración de la safranina.

Asimismo, a partir de la Tabla III. Se graficaron los datos correspondientes al

verde brillante como se muestra en la Gráfica 3.
 Curva de calibración del verde brillante
1.2
f(x) = 6615.53166069295 x + 0.0911666666666667
R² = 0.853525098876856
1

0.8
Absorbancia

0.6

0.4

0.2

0
0.00E+00 5.00E-05 1.00E-04 1.50E-04 2.00E-04
Concentración (M)

Gráfica 3. Curva de calibración del verde brillante.

De igual manera se realizo la grafica de curva de calibración para el azul de

metileno como las gráficas anteriores en la Grafica 4.

Curva de calibración del azul de metileno

0.45
0.4
0.35 f(x) = 6842.83870967742 x − 0.049125
R² = 0.945182488130203
0.3
Absorbancia

0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0.00E+00 1.00E-05 2.00E-05 3.00E-05 4.00E-05 5.00E-05 6.00E-05 7.00E-05
Concentración (M)

Gráfica 4. Curva de calibración del azul de metileno.

Experimento No. 4 Determinación de las concentraciones molares de las

soluciones problema.
Para concluir con la practica en la Tabla IV. se calcularon los valores
desconocidos de las concentraciones de las soluciones con ayuda de una fórmula

6
de Excel, basándonos en un video que sirvió de apoyo para la práctica (Villa
Gomez, 2014).

Solución Absorbancia Concentración

Safranina 1.219 7.35435E-05
Verde
Brillante 1.136 0.000145019
Azul de
metilo 0.409 6.46072E-05
Tabla IV. Tabla de los valores de la concentración de las soluciones.

DISCUSIÓN

En el experimento 2 se observó que la safranina tuvo su mayor absorbancia de

longitud de onda a los 520 nm; de acuerdo con la literatura revisada en un rango
de 470 y 520 nm las moléculas absorben el color verde, reflejando el color rojo y
púrpura. Por tanto, se logró captar a la safranina de un color rosado (color
complementario). En el caso del colorante verde brillante se obtuvo una mayor
absorbancia entre los 580-660 nm de longitud de onda, siendo mayor a los 620
nm. Como se muestra en la Figura 1., en este rango de longitud de onda las
moléculas del verde brillante absorben el color rojo y naranja, reflejando el azul y
el verde azulado, que son los colores distintivos de este tipo de colorante.

Figura 1. Colores de luz visible.

Para conocer la absorbancia de disoluciones diluidas de una sustancia se necesita

atravesar un haz de luz monocromática, es decir, luz que está compuesta de un
7
sólo color. Por ello, es necesario primero realizar el espectro de absorción de la
sustancia pura y conocerla longitud de onda donde se presenta su mayor
absorbancia. De acuerdo, a Harris (Harris, 2003) “normalmente se escoge la
longitud de onda de máxima absorbancia por dos razones: la primera es que la
curva es relativamente aplanada en las proximidades del máximo, de manera que
apenas varía la absorbancia si se desajusta un poco el monocromador o si varía
algo la anchura de banda escogida. La ley de Beer se cumple mejor cuando la
absorbancia es casi constante a lo largo de la banda de longitudes de onda
escogida. La segunda es que la sensibilidad del análisis es máxima en el máximo
de absorbancia (es decir, se consigue la máxima respuesta para una
concentración dada de analito).” La teoría nos dice que cuanto mayor es la
absortividad molar, mayor es la absorbancia. Y lo podemos comprobar al observar
mayor absorbancia de la safranina que del verde brillante a 520 nm de longitud de
onda, donde sus absortividades molares son de 0.0235 y0.0043 1µM cm,
respectivamente. Si analizamos la relación de la absorbancia con respecto a la
concentración de la sustancia, podemos observar en ambas curvas de calibración
que hay un aumento en la absorbancia entre menos diluida se encuentre, y esto
se debe a que a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas
y mayor absorbancia (Nieves , y otros, 2015).

La ley de Lambert-Beer puede ser utilizada de diferentes maneras. En el

experimento 3 se determinó la concentración de las tres muestras problema, a
partir de la curva de calibración de las disoluciones seriadas. Ya que la ecuación
de la recta nos arroja la absortividad molar de los colorantes a 520 y 660 nm de
longitud de onda y de esta forma sólo es necesario despejar la concentración
(Skoog & West, 2015).

CONCLUSIÓN

Se puede decir que el fotocolorímetro es algo importante porque gracias a él

podemos medir lo que es la absorción de la radiación electromagnética de una
muestra. El fotocolorímetro se puede emplear en lo que es el área de bioquímicas,
puede utilizarse para los análisis de sangre, materiales metalúrgicos, pinturas,
entre otros.
8
También es importante siempre calibrar el fotocolorímetro antes de usarla, se
calibra con agua destilada que es básicamente el “Blanco”, ya que si no se calibra
bien nos dará los resultados mal.
Podemos concluir que las celdillas del fotocolorímetro se deben de colocar con la
flecha indicada, aunque también, si al tomarlas por la cara lisa estas se ensucian
con los dedos, provocaría que en el pasaje de la luz y los valores de las
absorbancias que del Fotocolorímetro no serían correctos, es por eso por lo que
se deben de colocar bien.

BIBLIOGRAFÍA

Del Valle Mendoza, J., & Cornejo Tapia, Á. (2014). Preparacion de una Curva de
Calibración. En J. Del Valle Mendoza, & Á. Cornejo Tapia, Bioquímica,
Biología Cecular y Molecular II (págs. 12-17). Lima: Universidad Peruana de
Ciencias Aplicadas (UPC).
Harris, D. (2003). Análisis químico cuantitativo. Barcelona: España:Reverté.
Nieves , A., Bárcena, J., Fernández, E., Galván, A., Jorrín, J., Peinado, J., . . .
Túnez, I. (2015). spectrofotometría:Espectros de absorción y cuantificación
colorimétrica de biomoléculas. . Obtenido de Campus Universitario de
Rabanales.:
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOM
ETRIA.pdf
Skoog, D., & West, M. (2015). Fundamentos de química analítica. (9ª ed.). México,
D.F: Cengage Learning.
Villa Gomez, G. (2014). YouTube. Obtenido de Cuantificación de Proteínas:
https://www.youtube.com/watch?v=ZA1lzPMyCMU