S0213005X10004994

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Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297–307
www.elsevier.es/eimc
Formación médica continuada: Infección por el VIH en el adulto
Diagnóstico de laboratorio de la infección por el VIH, del tropismo viral y de las

resistencias a los antirretrovirales夽
Federico García a,∗ , Marta Álvarez a , Carmen Bernal a,b , Natalia Chueca a y Vicente Guillot a
a
Servicio de Microbiología, Hospital Universitario San Cecilio, Granada, España
b
Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina Granada España
información del artículo r e s u m e n
Historia del artículo: En el diagnóstico de la infección VIH, para considerar un resultado positivo, se recomienda el uso de tres
Recibido el 12 de diciembre de 2010 técnicas con distinto principio o base antigénica, siendo obligado que para la confirmación una de ellas
Aceptado el 14 de diciembre de 2010 sea el Western Blot. Las técnicas serológicas de cuarta generación acortan el período ventana a 13-15 días,
On-line el 23 de febrero de 2011
debido a que incluyen la detección de antígeno-p24. La detección del genoma-VIH (ADN proviral/ARN)
complementa al diagnóstico serológico en situaciones complejas. La viremia plasmática (carga viral) se
Palabras clave: utiliza para el seguimiento de los pacientes infectados por VIH, para contribuir a la decisión del inicio de
VIH
tratamiento y para comprobar el fallo virológico al régimen antirretroviral en uso. Las pruebas de resis-
Diagnóstico de laboratorio
Monitorización
tencia se utilizan para guiar el cambio de tratamiento, y para detectar la transmisión de cepas resistentes
en los nuevos diagnósticos. Antes de utilizar un antagonista de CCR5 hay que determinar el tropismo
viral; para ello, se pueden utilizar métodos genotípicos, accesibles a los laboratorios de diagnóstico, o
fenotípicos, de más difícil acceso.
© 2010 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
Laboratory diagnosis of HIV infection, viral tropism and resistance to

antiretrovirals
a b s t r a c t
Keywords: The accurate diagnosis of HIV infection demands that to consider a positive result, at least three assays
HIV with different antigenic base should be used, one of them, Western-Blot being mandatory for confirma-
Laboratory diagnosis tion. Fourth generation ELISAs shorten the window phase to 13-15 days, as they now include p24 antigen
Monitoring
detection. Proviral DNA or Viral RNA detection by molecular methods have proved useful for addressing
complex situations in which serology was inconclusive. Viral load (HIV-RNA) is routinely used to follow-
up HIV infected patients and is used for treatment initiation decisions. It is also used to monitor viral
failure. When this happens, resistance tests are needed to guide treatment changes. Resistance is also
used to assess the transmission of drug resistance to newly diagnosed patients. Finally, before using an
anti-CCR5 drug, viral tropism needs to be determined. This can be done using genotypic tests, widely
available in many HIV labs, or phenotypic tests, only available at certain sites.
© 2010 Elsevier España, S.L. All rights reserved.
Introducción conocimientos de los mecanismos inmunopatogénicos, de la rela-

ción hospedador-virus, de los mecanismos de replicación vírica, y
A mediados de la década de 1980 se introdujo el diagnóstico de la respuesta inmune que sucede en los individuos infectados en
del VIH para identificar individuos con sospecha de infección por el curso de la infección. Los adelantos en la tecnología, principal-
dicho virus. Durante estos 25 años, las pruebas diagnósticas han mente los avances en técnicas de biología molecular a través de
tenido un gran desarrollo como consecuencia del progreso en los la incorporación de la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa),
sin duda han contribuido a implementar métodos de laborato-
rio de inestimable valor para el manejo del paciente VIH. En este
capítulo se revisarán los principales métodos disponibles para el
夽 Nota: sección acreditada por el SEAFORMEC. Consultar preguntas de cada
diagnóstico de laboratorio de la infección por el VIH, y para la deter-
artículo en: http://www.eslevier.es/eimc/formacion.
∗ Autor para correspondencia. minación de las resistencias a los antirretrovirales y del tropismo
Correo electrónico: [email protected] (F. García). viral.
0213-005X/$ – see front matter © 2010 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
doi:10.1016/j.eimc.2010.12.006
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298 F. García et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297–307
Marcadores inmunológicos y virológicos durante la ARN-VIH/ADN proviral

infección
Ag p24
En el curso de la infección se pueden utilizar varios marcadores
víricos para identificar la infección y monitorizar su tratamiento. La ELISA de 4.a generación: Anticuerpos + Agp24
cinética y el momento de aparición de cada uno de ellos es distinto,
y la elección del marcador a detectar va a depender del objetivo ANTICUERPOS
del diagnóstico1 . El primer marcador que aparece tras la infección ELISA de 3.ª generación
es el ARN-VIH que se puede detectar por técnicas de amplificación
aproximadamente a las dos semanas de la infección, generalmente
ELISA de 2.ª generación
a los 10-12 días. Prácticamente al mismo tiempo que el ARN-VIH,
se puede detectar el ADN de VIH integrado en el genoma celular ELISA de 1.ª generación
(ADN proviral). El antígeno p24 aparece en suero a los 11-13 días, y
se puede detectar, con las técnicas de máxima sensibilidad, aproxi-
madamente durante 1 mes y medio2 . Los anticuerpos se detectan 0 10 20 30 40 50 60 70
en el suero a las tres o cuatro semanas de la infección, con una Días después de la exposición
media de 22 días, y alcanzan su concentración máxima a las 10-12
semanas3 . Cuando aparecen los anticuerpos, disminuyen los nive- Figura 1. Tiempo de aparición de marcadores específicos de infección VIH.
les de viremia y desaparece el antígeno p24 como consecuencia de
la formación de inmunocomplejos1 .
El intervalo de tiempo que existe entre la infección y la aparición quimioluminiscencia, lo que permite la automatización, el pro-
de anticuerpos o seroconversión, se conoce como período ventana, cesamiento de un gran número de muestras, la reducción de
y se caracteriza por presencia de ADN proviral, ARN-VIH, antígeno manipulación y de los costes5 . Recientemente se han introdu-
p24 y ausencia de anticuerpos específicos. cido las técnicas de cuarta generación que permiten la detección
simultánea de anticuerpos y antígeno p24, reduciéndose el período
ventana a 13-15 días, es decir, se aproxima casi a la detección de
Técnicas de detección de infección VIH
ARN-VIH4 (fig. 1). Con estas técnicas la sensibilidad se incrementa
hasta un 99,9% lo que reduce la posibilidad de un resultado falsa-
El diagnóstico de infección se realiza detectando la presencia
mente negativo, esto indica que en principio un resultado negativo
de anticuerpos específicos ya que estos se encuentran en el suero
no requiere confirmación ni seguimiento serológico, excepto en
prácticamente en el 100% de las personas infectadas.
personas con alto riesgo de adquirir la infección6 . Hay que tener en
Con objeto de minimizar el riesgo de obtener un resultado falsa-
cuenta, que se pueden producir falsos negativos en fases iniciales
mente negativo todas las técnicas son extremadamente sensibles, y
de la infección hasta que se produce la seroconversión, en estadios
capaces de detectar anticuerpos de baja avidez por antígeno que se
finales de la misma, en pacientes con tratamiento inmunosupresor,
producen sólo en las fases tempranas de la infección. La sensibili-
trasplantados de médula ósea, personas con alteraciones de linfo-
dad es del 99%, hay que señalar que es imposible conseguir un 100%
citos B, en pacientes con hipogammaglobulinemia, infectados por
porque la seroconversión no ocurre hasta las 3-4 semanas y ade-
tipos de VIH no detectados por la base antigénica, o por un error
más pueden existir infectados seronegativos como consecuencia de
en la identificación de la muestra5 . La especificidad se sitúa entre
defectos inmunitarios.
el 99,5% y 99,9% y se pueden producir falsos positivos como conse-
El incremento de la sensibilidad lleva aparejado un descenso de
cuencia de reconocimientos no específicos de sustancias del suero
la especificidad (se producen falsos positivos), aunque las técni-
por los antígenos víricos de la base antigénica. Los factores que pue-
cas actuales cifran la especificidad en torno al 99%. Por otro lado,
den estar implicados en la falsa reactividad son la base antigénica
a menor prevalencia de la infección VIH en la población estudiada,
utilizada, la inactivación de las muestras por calor, los errores en
disminuye el valor predictivo positivo y es por tanto mayor la pro-
la identificación de las mismas, y la hemólisis, aspecto lipídico y
babilidad de que se produzcan resultados falsos positivos con tasas
contaminación microbiana del suero. Se han descrito falsos positi-
de infección por VIH bajas. Por ello, todo resultado positivo debe
vos en multíparas, hemodializados, multitransfundidos, pacientes
ser confirmado mediante un test confirmatorio1 .
con hepatitis alcohólica, personas con infecciones agudas por otros
virus como herpes y VHB, vacunados frente a VHB e Influenzavi-
Técnicas de screening: ELISA rus, pacientes con enfermedades autoinmunes, lupus eritematoso
diseminado, y personas con anticuerpos frente a diversos antígenos
La calidad diagnóstica del ELISA viene determinada por una cui- HLA1,5,6 . Debido a la posibilidad de estas reactividades no específi-
dada selección del punto de corte o “cut-off” y sobre todo por la cas hay que recurrir a las pruebas confirmatorias para verificar los
base antigénica utilizada que captura los anticuerpos específicos resultados positivos de las técnicas de screening.
presentes en la muestra. Las primeras técnicas se desarrollaron en
1985, usaban como base antigénica un lisado vírico, y se detec-
taban los anticuerpos a los 40 días de la infección1 . En 1987 se Técnicas rápidas
introdujeron las técnicas de segunda generación que incorporaban
como antígenos proteínas recombinantes y péptidos sintéticos, y A veces se pueden plantear situaciones urgentes y por ello se
nuevos antígenos que permitieron detectar anticuerpos frente a han desarrollado técnicas de ejecución rápida, que no necesitan
todos los subtipos M, y los grupos N y O, y frente a VIH-2. Se con- aparataje y se pueden interpretar a simple vista. Se basan en la
siguió incrementar la sensibilidad, detectándose los anticuerpos aglutinación de partículas sensibilizadas de látex, o eritrocitos, téc-
a los 33-35 días tras la infección4 . En 1994 las técnicas de ELISA nicas de Dot-inmunoensayo y de inmunocromatografia capilar7 . La
adquirieron el formato “en sándwich”, se denominaron ELISA de sensibilidad oscila entre el 85-99%8,9 , y la especificidad entre el 93-
tercera generación, detectan anticuerpos de clase IgG e IgM, y por 99%. Se suelen producir falsos negativos en muestras con bajo nivel
ello se acorta el período ventana a 22 días4 . Estas técnicas se han de anticuerpos o estadios recientes de infección10 , y falsos positivos
modificado utilizando sustratos fluorescentes (ELFA) o formatos de en regiones con alta prevalencia de anticuerpos11 .
F. García et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297–307 299
Ensayos confirmatorios En la repetición con el nuevo suero, pueden existir varias posi-
bilidades, la primera es que la técnica de screening se mantenga
Las técnicas confirmatorias que se utilizan más frecuente- positiva y no se detecten cambios en el WB respecto al primero, o
mente son el Western Blot (WB) y el inmunoblot recombinante o incluso se produzca una disminución en el número de bandas y en
imunoensayo en línea (LIA) que tienen como mínimo la misma sen- intensidad, en este caso la posibilidad de una reacción inespecífica
sibilidad que el ELISA y una especificidad superior. Ambas técnicas es alta, y el paciente debe ser tranquilizado. Se debe solicitar una
pueden incorporar antígenos de envoltura de VIH-2 lo que permite nueva muestra en un mes y comprobar que las bandas se mantie-
diagnosticar este tipo vírico. nen o desaparecen para dar una respuesta final. Hay que destacar,
El Western Blot es una metodología en la cual las distintas pro- que en la mayoría de casos estas situaciones se producen en sueros
teínas víricas se separan en función de su peso molecular mediante con valores muy cercanos al punto de corte en las técnicas de scree-
electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfieren a una mem- ning. Si en el suero de repetición la técnica de screening se mantiene
brana de nitrocelulosa sobre la que se añade e incuba el suero del positiva y se observan más bandas y un incremento en la intensidad
paciente, la unión antígeno-anticuerpo se detecta mediante una de las mismas, probablemente sea debido a una seroconversión, en
técnica de ELISA. Si el suero posee anticuerpos frente a una proteína cuyo caso se informará como positivo si reúne los criterios de posi-
se produce una banda coloreada que define la reactividad en WB. tividad, o se solicitará una nueva muestra si sigue interpretándose
Detecta anticuerpos frente a las glicoproteínas de envoltura gp160, como indeterminado6 . El CDC recomienda realizar un seguimiento
gp120 y gp41, las codificadas por el gen gag p55, p24 y p17 y las de 6 meses en los WB indeterminados, y si el patrón de WB se man-
proteínas enzimáticas p66, p51 y p311 . Existen casas comerciales tiene estable, el resultado se debe considerar negativo en individuos
que incluyen al menos una proteína del gen env de VIH-2 lo que sin sintomatología y riesgo bajo de infección.
permite identificar las infecciones producidas por dicho tipo vírico.
En el momento actual esta metodología se ha semiautomati- Detección de antigenemia
zado lo que facilita su realización, pero los resultados pueden ser
subjetivos, ya que lectura se basa en la observación de la presencia La detección de anticuerpos específicos, indican exposición al
de bandas coloreadas que corresponden a las distintas proteínas virus e infección, y la detección directa del antígeno viral p24 intro-
víricas5 . Por ello, en cada laboratorio se debe establecer una disci- duce un concepto dinámico en la serología ya que al ser un índice
plina de lectura de reactividades. de replicación viral, aporta información sobre el estado actual de
La “interpretación” de los resultados es uno de los mayores la infección. Se detecta en estadios iniciales de infección, o en
puntos conflictivos en la serología VIH, se considera negativo la evolución a SIDA, y sirve de apoyo al diagnóstico serológico en
ausencia total de reactividad; para valorar la positividad existen aquellas situaciones en las que la detección de anticuerpos no es
numerosos criterios, según el Center for Disease Control (CDC) se concluyente8 .
considera positivo cuando se detectan al menos 2 bandas de p24, El antígeno p24 se puede determinar en suero y plasma con téc-
gp41, y gp160/gp120, la OMS reconoce una prueba positiva con nicas de ELISA de captura que aumentan la sensibilidad que en el
2 bandas, el ARC (Cruz Roja Americana) indica que deben existir momento actual puede llegar a ser de 8 pg/ml, lo que según algunos
tres bandas una de cada gen estructural, y el Consorcio de Estan- estudios puede equivaler a 5.000-10.000 copias de ARN de VIH.
darización de la Serología de Retrovirus indica que debe existir
al menos una de gp120 o gp160 y una de p24 o p312,12,13 . Cada Ensayos para la detección de infecciones recientes por VIH
laboratorio debe establecer sus propios criterios de acuerdo a las
indicaciones de la técnica que se utilice. Se interpreta como “inde- La identificación de infecciones recientes es importante para
terminado” cualquier reactividad que no reúna el criterio mínimo conocer el patrón de transmisión de VIH en una comunidad o pobla-
de positividad y es en esta categoría donde surgen mas contro- ción. En la primera fase de la infección existen títulos bajos de
versias ya que las causas del WB indeterminado son diversas y anticuerpos y anticuerpos de baja avidez; cuando la infección pro-
pueden corresponder a fases tempranas o estadios avanzados de la gresa la concentración de anticuerpos y la avidez de los mismos se
infección con deterioro inmunológico grave, y presencia de inmu- incrementa. Los métodos que permiten diferenciar una infección
nocomplejos que pueden reducir los anticuerpos circulantes, recién reciente de una crónica basados en la detección de anticuerpos
nacidos de madre VIH positiva, a sueros hemolizados, inactivados se agrupan bajo el término STARHS (algoritmo serológico para la
por calor, con factor reumatoide, o con bilirrubina elevada, a reac- detección de infección reciente por el VIH) que se basa en la apli-
ciones cruzadas con otros retrovirus, sueros de pacientes infectados cación de dos técnicas de ELISA para detectar anticuerpos VIH, una
por subtipo no B o con hipergammaglobulinemia secundaria a la de ellas modificada para que sea menos sensible. Se considera una
hiperestimulación antigénica, multitrasfundidos, o a situaciones infección reciente si la muestra es positiva para ELISA convencional
patológicas como conectivopatía, gammapatía policlonal y lupus y negativa en el ELISA modificado de baja sensibilidad9 . También se
eritematoso diseminado5 . La posibilidad de un WB indeterminado pueden identificar infecciones recientes usando el índice de avidez.
o incluso negativo se incrementa cuando se realiza el screening con Para ello se procesa el suero por duplicado (diluido con PBS y tra-
técnicas de cuarta generación, debido a que las mismas detectan tado con guanidina que interfiere en la unión antígeno-anticuerpo
antígeno y la positividad de de dicha técnica puede deberse casi de baja avidez). Tras el procesamiento de ambos sueros se calcula
exclusivamente a antígeno p24 libre sérico. Por todo ello, un resul- el índice de avidez dividiendo la señal obtenida del suero tratado
tado indeterminado debe ser evaluado minuciosamente valorando con PBS/guanidina. Si el índice es < 0,6 se puede considerar con una
la historia clínica del paciente, las prácticas de riesgo y la posibi- probabilidad elevada que la infección ha ocurrido en los 6 meses
lidad de una infección reciente por VIH. Es importante observar el anteriores15 . Hay que destacar, que estas técnicas se utilizan con
patrón de reactividades ya que si se detecta alguna banda de envol- fines epidemiológicos, para conocer el patrón de transmisión de
tura con o sin bandas del gen gag, puede deberse a infección VIH, VIH y poder diseñar medidas preventivas adecuadas.
en estas situaciones se debe de recurrir a otras pruebas confirmato-
rias (LIA o IFI)14 y en ocasiones es necesario complementarlas con Determinación de ADN proviral
la determinación de ADN proviral o carga viral o antígeno p24 libre
sérico para valorar una posible primoinfección12 . En cualquier caso El ADN proviral se corresponde con el genoma viral integrado
ante un Western Blot indeterminado se debe solicitar siempre una en el genoma de la célula a la que el virus infecta. En la actualidad,
nueva muestra5 . esta determinación está siendo reemplazada por la determinación
de carga viral (ARN-VIH), en gran parte debido a las dificultades viremia entre 20 y 50 copias/ml. En el mercado existen sistemas
de disponer de ensayos comerciales para determinar ADN provi- basados en la amplificación de la señal (branched-DNA) o en la
ral, con suficientes controles de calidad y certificación por agencias amplificación de la secuencia (RT-PCR en tiempo real, NASBA y
reguladoras, además de que para su realización se debe utilizar san- LCx). Las técnicas de transcripción reversa-reacción en cadena de la
gre total. Sin embargo, es la determinación de referencia a la hora polimerasa (RT-PCR) en tiempo real basadas en sondas fluorescen-
de utilizar los métodos moleculares para diagnosticar la infección tes son, en general, más rápidas y permiten rangos dinámicos más
VIH. En este sentido juega un papel importante para complementar amplios (20-107 copias/ml). Todas las técnicas detectan y cuan-
aquellas situaciones diagnósticas en las que la serología no es con- tifican el subtipo B, que es el más prevalente en nuestro medio,
cluyente. Se puede utilizar para valorar la transmisión madre-hijo así como los subtipos circulantes más frecuentes. Sin embargo,
en el diagnóstico de la transmisión vertical de VIH y para el segui- ninguna de las técnicas detecta el VIH-2. Por último, se han des-
miento de la profilaxis post-exposición, aunque, como veremos a arrollado ensayos, no comerciales y utilizados en investigación, que
continuación, la mayoría de los laboratorios utilizan la carga viral permiten detectar una sola copia de ARN-VIH-120
de VIH en estos escenarios. Es necesario destacar, que la elevada sensibilidad de los ensa-
yos de cuantificación de la carga viral del VIH puede originar un
Determinación de la viremia plasmática (carga viral) uso inapropiado del mismo, como ocurre cuando se utilizan para
el diagnóstico precoz de la infección por VIH. Las pruebas de carga
La viremia plasmática o carga viral del VIH se define como el viral no han sido desarrolladas con una especificidad suficiente y
número de copias de ARN del virus que se encuentra presentes pueden causar falsos positivos21 , en estas situaciones es preferible
en plasma. Su determinación, junto con la cifra de linfocitos CD4 utilizar otras pruebas genéticas de tipo cualitativo con sensibilidad
y la situación clínica del paciente, se emplea para establecer las y especificidad ampliamente demostrada, como el ADN proviral.
decisiones terapéuticas y para la monitorización del tratamiento Sin embargo, existen situaciones especiales en que la determi-
antirretroviral16 . Es uno de los factores a valorar para decidir si se nación de la carga viral se pueda usar como diagnóstico de la
debe iniciar el tratamiento, si bien el principal indicador en estos infección por VIH, como es el caso de niños recién nacidos de
casos es el recuento de linfocitos CD417 . madres seropositivas o en la primoinfección, cuando el diagnós-
El objetivo del tratamiento es reducir la carga viral de modo tico serológico está comprometido. Se considerarán válidos sólo
rápido por debajo de los límites de detección (< 50 copias/mL) y aquellos resultados en los que el nivel de viremia sea elevado, si
mantenerla suprimida el mayor tiempo posible, ya que con este no es preferible descartar la infección mediante el uso de otras
nivel de carga viral se ha demostrado que no se seleccionan muta- pruebas.
ciones de resistencia. Una vez instaurado el tratamiento, la carga
viral disminuye rápidamente (1-2 log10 ) en las primeras semanas
Algoritmo diagnóstico
y algo más lentamente a partir del primer mes de tratamiento, si
el régimen no incluye un inhibidor de la integrasa, hasta conseguir
Cuando el objetivo de las pruebas de detección de anticuerpos
un nivel estable por debajo del límite de detección que se correla-
frente al VIH es el diagnóstico de infección y la prevalencia de la
ciona con una mayor duración de la respuesta virológica. En general,
misma es inferior al 10%, se recomienda el uso de tres técnicas con
se recomienda una determinación al comienzo del tratamiento,
distinto principio o base antigénica, siendo obligado que una de
y después a las 4 semanas, y cada 4-8 semanas hasta conseguir
ellas sea el Western Blot. Para diagnosticar a una persona como
la supresión. El seguimiento posterior se debería realizar cada 3-
positiva las tres pruebas deben ser positivas. En la figura 2 se refleja
4 meses durante al menos el primer año18 . La potencia, eficacia,
el algoritmo diagnóstico de la infección VIH.
tolerabilidad y facilidad de dosificación de los nuevos tratamien-
tos, además de la situación económica actual están planteando la
revisión de estas pautas de monitorización. De hecho, una vez que Pruebas para la detección de resistencias a antirretrovirales
la replicación viral es suprimida, los intervalos de monitorización se
pueden extender hasta los 6 meses entre los pacientes que perma- El conocimiento de los mecanismos que llevan a la selección de
necen virológicamente suprimidos y tienen un nivel de recuento resistencias y de sus consecuencias (fracaso terapéutico), así como
de CD4 por encima de los 350 células/␮l. Se requiere una moni- del perfil de resistencia de cada fármaco, junto con la posibilidad de
torización más estrecha en aquellos pacientes que han necesitado detectar su presencia mediante ensayos que se pueden llevar a cabo
cambiar su tratamiento debido al fracaso virológico19 . en laboratorios de diagnóstico clínico, han modificado la forma de
En los pacientes con carga viral controlada se ha observado utilización de la terapia antirretroviral.
ocasionalmente brotes transitorios de viremia de bajo nivel (blips) Entre las técnicas disponibles para la detección de resistencias
que vuelve espontáneamente a ser indetectable sin ningún cambio se encuentran los métodos «fenotípicos», consistentes en enfrentar
en el tratamiento. Se desconoce la patogenia de los blips; aunque al virus a diferentes concentraciones de un determinado fármaco y
diversos estudios sugieren que un pequeño porcentaje de pacientes establecer el grado de inhibición comparando con cepas control, y
pueden desarrollar fracaso virológico con aparición de mutaciones los métodos “genotípicos”, que emplean el análisis de la secuencia
de resistencia, en general, no los relacionan con fracaso virológico. de ácidos nucleicos del virus para detectar la presencia de mutacio-
Se considera que hay un fracaso virológico cuando la carga nes de resistencia22,23 . Las pruebas genotípicas son las que tienen
viral es detectable a las 24 semanas de comenzado el tratamiento mayor difusión entre los laboratorios de diagnóstico, mientras que
antirretroviral, o si tras alcanzar la indetectabilidad ésta vuelve a los ensayos fenotípicos quedan reservados para laboratorios de
ser detectable en dos determinación consecutivas separados en al investigación. A principios de esta década, se realizaron numerosos
menos un mes. En esta segunda situación, primero hemos de tener estudios que avalaron la utilización de las pruebas de resistencias
en cuenta la tolerabilidad del tratamiento, las interacciones entre en la práctica clínica, y que propiciaron que estos ensayos se reco-
fármacos, y la adherencia del paciente. mendaran en todas las guías de práctica clínica sobre tratamiento
En la actualidad existen diversas técnicas para la cuantificación antirretroviral. Las principales características de estos estudios se
de la carga viral que tan solo difieren en sus formatos, tiempos y muestran en la tabla 1. Los ensayos genotípicos exigen que la base
capacidad de procesamiento. Algunas permiten la detección hasta molecular de las resistencias esté suficientemente caracterizada,
un nivel de 20 copias de ARN de VIH por mililitro de plasma, sin de tal forma que la detección de una mutación sea predictiva de la
embargo, todavía se desconocen las implicaciones clínicas de una falta de actividad de un determinado agente. Por esta razón, estas
Técnica de 4.ª generación
Positivo Negativo
Pedir nuevo suero Segundo suero Informar Negativo Sospecha de primoinfección
Agp24/ADN proviral
2 Técnicas: 4.a y 3ageneración (Carga Viral) Y Seguimiento
+/+ +/- -/-
Confirmación con WB
Confirmación con WB
Repetir 1.ª muestra
Pedir nuevo suero para
Positivo Indeterminado Negativo descartar error de muestra
Positivo
(valorar patrón)
Agp24/ADN proviral
Informar Positivo (Carga Viral) Agp24/ADN proviral
(Carga Viral)
Positivo Negativo Positivo Negativo
Informar Positivo Nueva muestra Nueva muestra Nueva muestra

Seguimiento Seguimiento Seguimiento Seguimiento
Posible primoinfección Posible primoinfección
Figura 2. Algoritmo del diagnóstico de infección VIH.
pruebas genotípicas tienen en general más valor para detectar resis- resultados se expresan generalmente en forma de cambios en la
tencia (detección de una determinada mutación), que para predecir IC50 (Fold Change -FC-), comparando con una cepa control. La inter-
sensibilidad (ausencia de todas las posibles causas de resistencia). pretación del valor de FC es diferente dependiendo del fármaco
Para la elaboración de los perfiles de resistencia de cada fármaco implicado. Los métodos de sensibilidad del virus en células mono-
se han utilizado diferentes abordajes, como analizar los virus ais- nucleares de sangre periférica (CMSP) han sido desplazados en la
lados de personas en los que el fenotipo a un fármaco concreto era actualidad por otros ensayos basados en modelos de virus recom-
resistente, caracterizando en estas cepas las mutaciones que apare- binantes. En los primeros se aísla el virus del paciente y se cultiva
cen en su genoma, y más recientemente, los modelos de predicción con CMSP añadiendo diluciones seriadas del fármaco. La suscep-
basados en la respuesta virológica, que relacionan el perfil de muta- tibilidad relativa del virus a un fármaco determinado se establece
ciones con la eficacia de un fármaco en un régimen TARGA. De este en base a la menor concentración del fármaco capaz de suprimir
modo, ante un fracaso a una combinación de fármacos, se puede la replicación viral. Esta técnica presenta serios inconvenientes por
estudiar el genotipo y deducir que fármaco es causante del fracaso. su gran laboriosidad, y porque son métodos caros, lentos y que no
En la tabla 2 se recogen las ventajas e inconvenientes de los méto- están al alcance de cualquier laboratorio de diagnóstico clínico. Para
dos genotípicos y fenotípicos para la determinación de resistencias eliminar alguno de estos inconvenientes se diseñaron los métodos
a los antirretrovirales. basados en el empleo de virus recombinantes que consiguen una
mayor rapidez y reproducibilidad en los resultados, aunque siguen
Ensayos fenotípicos sin estar disponibles en los laboratorios de diagnóstico. Consis-
ten en la obtención de la secuencia de los genes de RT y PR del
Los métodos fenotípicos miden la concentración de fármaco plasma de un paciente por medio de RT-PCR y su introducción
necesario para inhibir la replicación viral en cultivo celular. Los dentro de un sistema ya estandarizado para la producción de un
Tabla 1
Estudios que valoraron la utilidad de los estudios de resistencia.
Estudio Diseño Duración N CV VIH (log10 copias/mL) p %pacientes CV<400 copias/mL p
VIRADAPT GT/STD 6 meses 108 −1,15 vs −0,67 0.05 32 vs 14 0,067

GART GT/STD 3 meses 153 −0,94 vs −0,47 0.003 34 vs 22 0,067
VIRA3001 FT/STD 4 meses 274 −1,23 vs −0,87 0.004 45 vs 34 0,09
KAISER FT/STD 4 meses 115 −0,25 vs −0,4 0.05 - –
NARVAL GT/FT/STD 3 meses 541 - - 41 vs 33 vs 34 0,249
ARGENTA GT/STD 3 y 6 meses 174 - - 27 vs 12/ 21 vs 17 0,02/ ns
CTG575 FT/STD 6 meses 238 - - 48 vs 48 –
HAVANA GT/STD 6 meses 274 −1,1 vs −0,8 ns 57 vs 42 0,01
FT: fenotipo; GT: genotipo; STD: estándar de tratamiento.

Tabla 2
Ventajas e inconvenientes de los ensayos genotípicos y fenotípicos para la determinación de resistencias a los antirretrovirales.
Ventajas Inconvenientes
Genotipo
Rapidez Detección indirecta de la resistencia
Dificultad técnica media, realizable en laboratorios hospitalarios Desconocimiento del efecto de las resistencias cruzadas
Menor coste económico Puede no existir correlación con el análisis fenotípico
La mutación precede a la resistencia fenotípica Carencia de sensibilidad para las variantes menores (< 20%)
Requieren la interpretación por un experto
No son válidos para nuevas drogas hasta que se diseñan los algoritmos de interpretación y se
validan clínicamente
Fenotipo
Medida directa de la sensibilidad a los distintos antirretrovirales No puede realizarse con cargas virales bajas
Proporciona información acerca de las resistencias cruzadas No detecta subpoblaciones virales que constituyan menos del 10-20% de la población total
Reflejan el efecto de todas las mutaciones presentes, incluso aquellas No aporta sensibilidad a combinaciones de fármacos
que aún no han sido descritas
Los resultados son fáciles de interpretar Falta de estandarización en los valores de IC50 de cada fármaco
Disponible únicamente en laboratorios comerciales por su elevada complejidad
Elevado coste y técnica compleja
Posible selección de variantes víricas mejor adaptadas al cultivo celular
VIH recombinante capaz de infectar una línea celular, incluyendo análogos y no análogos de los nucleósidos/ótidos, frente a los inhi-
un procedimiento que facilita la lectura de los resultados. Actual- bidores de la proteasa y frente a los inhibidores de la integrasa,
mente hay tres compañías principales que ofrecen la realización respectivamente, que se conocen como mutaciones de resisten-
de estas pruebas fenotípicas: Antivirogram® (Virco), PhenoSense® cia. También se pueden determinar mutaciones en HR1 y HR2 para
(Virologic) y Phenoscript® (VIRAlliance). Las características de estos estudiar la resistencia frente a los inhibidores de la fusión, aun-
ensayos se muestran en la figura 3. La interpretación de los resul- que estos fármacos (enfuvirtide) se utilizan ya muy poco en terapia
tados de estos ensayos, aunque más intuitiva y sencilla, no está antirretroviral.
exenta de complicaciones, ya que analizan la sensibilidad fármaco La técnica más empleada para la detección de mutaciones de
a fármaco, y en la vida real las combinaciones pueden suponer un resistencia es la secuenciación poblacional del genoma que codifica
comportamiento diferente del meramente aditivo. las enzimas transcriptasa inversa, proteasa o integrasa. Antes de la
secuenciación es necesario extraer el ácido nucleico del plasma del
Ensayos genotípicos paciente, transcribirlo en ADN (retrotranscripción) y hacer al menos
una reacción de amplificación (PCR). Una vez realizada la reac-
En ellos se estudian los cambios en el gen de la transcriptasa ción de secuenciación, el procedimiento de lectura se encuentra
inversa, proteasa, o integrasa, que generan la resistencia frente a automatizado mediante electroforesis acoplada a la detección de
(1) (2) (3)

gag-prot-RT gag-prot-RT gag-prot-RT
RT-PCR RT-PCR RT-PCR

Plésmido
Plésmido Plésmido
Nested linearizado
Producto linearizado Producto PCR Producto PCR linearizado
PCR PCR
Electroporación Plésmido enV Ligación
Plasma Plasma Plasma env-luciferasa
delecionado Plésmido
Plésmido con
proteína VSV-G delecionado Plásmido
Precipitación fosfato delecionado
cel.MT-4
Tratamiento con cálicico Plásmido con MLV
Transfección cel. Productoras 293T
inhibidores de la
Recombinación Precipitacion fosfato cálcico
proteasa homóloga Tratamiento con
Recombinación homologa
inhibidores de la
Virus recombinantes proteasa
Expansión virus
Producción de virus
recombinantes Producción de virus
pseudotipificados recombinantes
Tratamiento con pseudotipificados
inhibidores de Tratamiento con
la transcriptasa Infección inhibidores de la
reversa transcriptasa Infección
reversa
Cuantificación producción de
b-galactosidasa Cuantificación luciferasa
Titulación Test susceptibilidad
Figura 3. Ensayos de virus recombinantes para la determinación fenotípica de la resistencia a los antirretrovirales.
En el método Antivirogram® (Virco) (1) los virus recombinantes se preparan mediante transfección de células MT-4 con el producto amplificado PR-RT y con un plásmido que
contiene el genoma completo del VIH salvo la región gag-pro-RT. La CI50 del virus recombinante se determina en cultivos, midiendo la viabilidad de células MT4 infectadas con
el virus recombinante en presencia de diluciones de cada antirretroviral. El método Phenoscript (Viralliance) (2), combina aspectos de los otros dos métodos: un proceso de
recombinación homóloga, como en el Antivirogram, con un sólo ciclo de replicación viral, como en el Phenosense. Las células diana (P4) contienen el gen de la ␤-galactosidasa
controlado por LTR de HIV de modo que cuando se acumulan suficentes productos del gen TAT en la célula infectada, se expresa el gen de la ␤-galactosidasa y su producto se
puede medir mediante colorimetría o fluorimetría. El método Phenosense (ViroLogic) (3), a diferencia del Antivirogram, es un ensayo de un solo ciclo de replicación viral, lo
que reduce el tiempo para los resultados. Utiliza un proceso de ligación, más que de recombinación homologa, para introducir el fragmento amplificado mediante RT-PCR en
el genoma de una partícula de VIH en la que el gen env ha sido sustituido por un gen productor de luciferasa. En un ciclo de replicación este virus es capaz de producir todas
las proteínas de VIH a excepción de las de envoltura y, en su lugar, se expresa el gen de la luciferasa. La CI50 del virus recombinante se determina cuantificando la expresión
del gen de la luciferasa en cultivos de célula infectadas con el virus recombinante en presencia de antirretrovirales.
Tabla 3
Principales guías de tratamiento antirertroviral.
Guía Acceso
IAS (International AIDS Society) www.iasusa.org/guidelines/index.html

DHHS (U.S. Department of Health Human Services) http://www.aidsinfo.nih.gov/guidelines/
CDC (Centre for Disease Control) http://www.cdc.gov/hiv/
EACS (European AIDS Society) http://www.europeanaidsclinicalsociety.org/guidelines.asp
BHIVA (British HIV Association) http://www.bhiva.org/ClinicalGuidelines.aspx
GESIDA-PNS (Grupo SEIMC de Estudio de SIDA-Plan www.gesida.seimc.org/pcientifica/dcconsensos.asp?apnv0=pcientifica&apnvA=dcconsensosyrc&
Nacional sobre el SIDA) appag=dcconsensos txt.htm
dideoxi-nucleótidos (terminadores de cadena) fluorescentes. Tras en otras ocasiones una determinada combinación de mutaciones
la obtención de la secuencia es necesario un análisis informático es difícil de interpretar debido al efecto aditivo o incluso rever-
para comparar las secuencias obtenidas con una cepa de referen- tiente de algunas mutaciones sobre otras. Además, para hacer una
cia para establecer las mutaciones encontradas relacionadas con correcta interpretación del genotipo de resistencias es imprescindi-
resistencia a antirretrovirales. Algunas de las compañías que han ble una continua actualización por la aparición de nuevos patrones
desarrollado reactivos y equipos de secuenciación automática para de resistencia y por la incorporación de nuevos fármacos. Por todos
esta aplicación son TruGene® HIV-1 Genotyping Test (Siemens) y estos motivos se han diseñado distintos algoritmos de interpreta-
ViroSeq® HIV-1 Genotyping System (Abbott Diagnostics). El pri- ción que facilitan dicha labor. Estos algoritmos están disponibles
mero emplea la secuenciación bidireccional y la electroforesis en en páginas web y, por lo general, son de acceso gratuito. Su manejo
gel, mientras que el segundo emplea el método unidireccional y es sencillo ya que sólo hay que editar la secuencia obtenida, en
la electroforesis capilar. Ambos sistemas ofrecen un software para formato fasta o txt, en dicha página web, que de forma auto-
la edición de las secuencias y un algoritmo propio de interpreta- mática nos devuelve un informe de interpretación de los niveles
ción. de resistencia a todos los antirretrovirales. Entre los principales
Las técnicas de secuenciación, comerciales o “caseras” aseguran algoritmos destacan: la página web de la Universidad de Stanford
un 98-100% de éxito en la amplificación en muestras con una carga (http://hivdb.stanford.edu), la página de la Sociedad Internacio-
viral superior a 500-1.000 copias/ml, sin embargo, con las adecua- nal de SIDA de EE.UU. (www.iasusa.org), la página de la ANRS
das modificaciones es posible amplificar prácticamente cualquier francesa (www.hivfrenchresistance.org), el algoritmo de la Red
muestra con carga viral detectable24 . No debemos olvidar, que la de Investigación en SIDA –RIS– (www.retic-ris.net), el algoritmo
secuencia obtenida por estos métodos de secuenciación poblacio- Geno2pheno (www.geno2pheno.org), o sistemas de interpretación
nal es en realidad la secuencia promedio de todas las variantes como el Fenotipo Virtual (Vircotype). Estas guías recogen, además
presentes en la muestra original, siendo difícil detectar mutacio- de las resistencias clásicas frente a análogos y no análogos de la
nes que supongan menos del 10-20% del total25 . Esto explica por RT e inhibidores de la proteasa, las nuevas mutaciones descritas
qué los métodos que utilizamos predicen el fracaso de un fár- frente a los inhibidores de la integrasa. Es importante alertar, que
maco pero no aseguran el éxito, ya que las mutaciones pueden no todos los sistemas de interpretación aportan la misma calidad de
encontrarse por debajo de estos niveles (variantes minoritarias), interpretación. En general, para la elección del sistema de interpre-
y pueden ser seleccionadas cuando se emplea el fármaco al que tación que vayamos a utilizar debemos valorar, entre otros, la fecha
confiere resistencia. Para asegurar la detección de las variantes que de la última actualización, la metodología que se ha empleado para
representan menos del 20%, hemos de recurrir a técnicas especia- derivar las reglas de interpretación, el número de pacientes que
les: clonación de los productos de amplificación, PCR mediante se incluyen para la elaboración de la/s regla/s de interpretación, si
diluciones límite o PCR-alelo específica a tiempo real, que no se adscribe distinto peso a distintas mutaciones, si la prevalencia
son aplicables hoy por hoy a la rutina del laboratorio de diag- de mutaciones en la población analizada es similar a la prevalen-
nóstico clínico. Recientemente se han introducido técnicas que cia local, si se tienen en cuenta mutaciones con efecto beneficioso,
permiten la secuenciación masiva de genomas únicos. Existen, en si existen datos clínicos que avalen que ese algoritmo es capaz de
este momento, cuatro plataformas comerciales de secuenciación predecir la eficacia virológica, y si se tienen en cuenta reglas de
masiva, aunque la tecnología 454-UDS (Roche Diagnostics), es la interpretación específica para los subtipos no-B. Además, cuando
que por el momento ofrece resultados en el campo de las muta- realizamos la interpretación de un perfil de resistencias también
ciones de resistencia a antirretrovirales. Además de una compleja hemos de tener en cuenta la historia previa de tratamiento antirre-
metodología que aun no está al alcance de los laboratorios de troviral del paciente y, si los hubiese, los estudios previos que se le
diagnóstico, una herramienta imprescindible para poder usar estas hayan practicado, sumando para su interpretación todo su histórico
técnicas son los sistemas informáticos con capacidad para alma- de mutaciones/secuencias (genotipo acumulado). Esta estrategia ha
cenar y manejar enormes masas de datos, y programas diseñados demostrado mejorar la interpretación del genotipo de resistencias,
específicamente para leer y filtrar miles de secuencias, ensam- consiguiendo mayores niveles de eficacia en el régimen elegido
blarlas, anotarlas ó compararlas con bases de datos externas. No si este se basa en el genotipo acumulado en vez de en el último
obstante, si se consiguen superar estas dificultades, estas técnicas genotipo realizado26 .
se presentan como una alternativa, de gran valor, a las técnicas
convencionales. Indicaciones para la realización de los estudios de resistencia
Interpretación de las mutaciones de resistencia Actualmente existen numerosas guías nacionales e internacio-
nales que describen las circunstancias en las que se aconseja un
La interpretación de las mutaciones de resistencia es compleja y estudio de resistencia (tabla 3). En general, dichas guías coin-
constituye uno de los pasos de mayor importancia para emitir una ciden en la recomendación de realizar el estudio de resistencia
información correcta. Aunque existen mutaciones concretas que antes de comenzar el tratamiento antirretroviral, sea una infec-
determinan perfiles de resistencia muy específicos y su significado ción reciente o crónica, tras el fracaso terapéutico, en embarazo
es muy claro, en especial para los fármacos de baja barrera genética, o tras una exposición accidental al caso fuente si no lo posee. No
Tabla 4
Ventajas e inconvenientes de los diferentes métodos disponibles para determinación del tropismo viral.
Metodología Ventajas Inconvenientes
ESTA (Enhanced Sensitivity Trophile Assay) Sensibilidad para variantes DM/X4 (0,3%) Limitaciones logísticas (envío EE.UU)
Dispone de validación clínica en ensayos clínicos Caro, Lento, Exige viremia ≥ 1000 cop/mL
(MOTIVATE, MERIT)
Genotipo V3 plasma (secuenciación poblacional) Rápido, práctico y económico Menor sensibilidad analítica para DM/X4
Ampliamente disponible en laboratorios
Sensibilidad Clínica
Genotipo V3 en ADN proviral (CMSP/sangre total) Posibilidad de amplificar muestras con viremia <50 Falta de estandarización y validación clínica
cop/ml (única alternativa en muchas situaciones Sesgos en la representación de secuencias
clínicas) plasmáticas en células
Práctico
Genotipo V3 (UltraDeepSequencing) Alta sensibilidad en la detección de variantes X4 Muy Costoso y laborioso
Permite la cuantificación de variantes X4 Dificultad en el manejo y la interpretación de los
Validado en estudios clínicos resultados
No accesible actualmente para laboratorios clínicos
Ensayo MT-2 Barato Requiere el cultivo viral

Sensibilidad por determinar
se recomienda tras suspensión del tratamiento por la reversión de versión inicial de TrofileTM para detectar poblaciones minoritarias
la mayoría de las mutaciones que no se detectarían al ser variantes que se correlacionaron con fracaso terapéutico a maraviroc. Para
minoritarias. solventar esta limitación la compañía Monogram ha desarrollado
una versión mejorada del sistema en la que se aumenta el nivel
Determinación del tropismo viral de sensibilidad para detectar variantes minoritarias X4 o R5/X4
en torno al 0,3%31 . En la actualidad, esta versión ESTA-TrofileTM ,
Los antagonistas de los receptores de quimiocinas son una nueva es la comercialmente disponible y ha sido validada retrospectiva-
familia de fármacos que ha pasado a formar parte del arsenal tera- mente en los ensayos MERIT. ESTA-TrofileTM reclasificó como DM
péutico para el tratamiento de la infección por VIH. La actividad un 14,7% de los pacientes identificados originalmente como R5 en
antiviral de los antagonistas de CCR5 está limitada a variantes R5- el momento basal por TrofileTM . Sin embargo, en un análisis deta-
trópicas27 y la detección de variantes X4-trópicas en pacientes que llado de los datos se observa que a pesar de su mayor sensibilidad
inician tratamiento con antagonistas de CCR5 se ha asociado con el para detectar variantes minoritarias X4-trópicas, ESTA-TrofileTM no
fracaso virológico al tratamiento con estos fármacos28 . Por lo tanto, mejora la capacidad del ensayo para discriminar entre pacientes
antes de recomendar el inicio de un tratamiento con antagonistas respondedores y no respondedores a maraviroc, ya que aproxima-
de CCR5, se requiere la realización de un estudio de tropismo del damente un 43% de los pacientes reclasificados como DM habían
VIH por los receptores de quimiocinas CCR5 y CXCR4. El tropismo respondido (ARN-VIH < 50 cop/mL en semana 48) a la terapia con
viral por los receptores de quimiocinas puede ser determinado maraviroc a pesar de la presencia de variantes X4-trópicas32 .
mediante métodos fenotípicos y genotípicos29 . A continuación se En España, se ha desarrollado el ensayo TropiTest (Instituto de
describen en detalle las características metodológicas así como sus Salud Carlos III-Fundación FIPSE). La principal ventaja de este sis-
principales ventajas e inconvenientes para su utilización en la prác- tema es que los virus recombinantes que se generan son virus
tica clínica, que se muestran en la tabla 4. de ciclo múltiple, lo que permite bajar el umbral de sensibilidad
para la detección de poblaciones minoritarias al menos al 1%33 .
Métodos fenotípicos Otra ventaja que es compartida con el método de TrofileTM es que
amplifica el gen completo de la envuelta. Este test ha sido validado
Los ensayos fenotípicos para la determinación de tropismo se con ambas versiones de TrofileTM mostrando una excelente corre-
basan en la generación de virus recombinantes. En este tipo de lación con la versión TrofileTM ES. Otros ensayos fenotípicos son:
ensayo el gen de la envuelta es amplificado mediante PCR (RT-PCR) PhenoX-R (InPheno AG, Basel, Switzerland), Virco® type HIV-1 (Virco
a partir del plasma del paciente y mediante técnicas de clonaje o BVBA, Mechelen, Belgium), HIV-1 Phenoscript EnvTM (VIRalliance,
recombinación genética se generan virus quiméricos o seudotipos Paris; France), y Toulouse Tropism Test (Universidad de Toulouse). Las
que portan la envuelta del paciente. Estos virus son utilizados para principales características de los ensayos fenotípicos para determi-
infectar líneas celulares que expresan el receptor CD4 y uno de nación del tropismo se pueden consultar en la tabla 5.
los dos correceptores principales del VIH, CCR5 o CXCR4. De esta
manera, se define el tropismo viral conferido por la envuelta del Métodos genotípicos
paciente estudiado a partir del comportamiento del virus recom-
binante. TrofileTM (Monogram Biosciences, San Francisco, California, Los métodos genotípicos se presentan como una alternativa más
USA) es el ensayo fenotípico de mayor difusión. Se incluye en el económica, rápida y factible de desarrollar localmente en cualquier
grupo de métodos basados en la generación de virus recombinan- laboratorio especializado de VIH que cuente con tecnología para
tes de ciclo único30 . Hasta el momento, es el único método validado realizar la determinación de resistencias a antirretrovirales. Desde
y aprobado en EE.UU. por la FDA para la determinación del tro- principios de los años noventa, se han descrito y desarrollado
pismo viral en muestras de pacientes candidatos a tratamiento con diferentes reglas y algoritmos de correlación genotipo-tropismo
maraviroc, el único anti-CCR5 aprobado. La característica princi- basados fundamentalmente en las características de la secuencia
pal de este y otros métodos similares es el conseguir amplificar la de aminoácidos de la región V3 de la envuelta viral34 . Inicialmente
envuelta completa del VIH del paciente. Este aspecto es relevante ya se propusieron reglas sencillas como la “regla 11/25 o la regla
que aunque la región V3 contiene los principales determinantes del de la carga neta”, que se caracterizan por presentar una gran
tropismo viral existen otras regiones implicadas (V1, V2, C4). Los especificidad para la clasificación de variantes X4-trópicas, aunque
ensayos clínicos MERIT y MOTIVATE han revelado limitaciones de la baja sensibilidad35,36 . Posteriormente, el estudio de la variabilidad
Tabla 5
Principales métodos fenotípicos basados en generación de virus recombinantes para determinación del tropismo viral.
VIRalliance XtrackC /PhenX-R In Virco NH2-V4 Monogram Biosciences Univ Toulouse Toulouse ISCIII-FISPE
Phenoscript Pheno AG gp120 TrofileES* Tropism Test (TTT) Tropitest
Amplicón V1-V3 gp120 (900 pNL4-3 defectivo pHXB2D-NH2- pCAX-PXMX pNL43env-Luc2 vector pNL4-3-lacZ/env-
pb) env V4-eGFP (expresión
env) + RTV1.F-
lucP.CNDOU3
Generación del vector Recombinación Clonaje Recombinación Clonaje Recombinación homóloga Clonaje
homóloga
Células Diana U373-CD4-CCR5 CXCR4 U87.CD4.CCR5 U87.CD4.CCR5 U87.CD4.CCR5 U87/Ghost/PBMc
U373-CD4-CXCR4 CCR5/CXCR4 U87.CD4.CXCR4 U87.CD4.CXCR4 U87.CD4.CXCR4 CD4.CCR5
Gen marcador ␤-galactosidasa ␤-galactosidasa GFP Luciferasa Luciferasa Luciferasa
Replicación Ciclo múltiple Ciclo único Ciclo múltiple Ciclo único Ciclo múltiple Ciclo múltiple
Sensibilidad 5-10% 1% 5-10% 0,3-1% 0,5% 1%
natural en secuencias de V3 y su asociación con los fenotipos R5- para el receptor CCR5, con el fin de mejorar las predicciones. La
o X4-trópicos, ha permitido la identificación de nuevos residuos principal ventaja de este método es que se muestra en constante
y patrones de aminoácidos en la región V3 relacionados con el evolución y se realizan actualizaciones periódicas en las bases de
tropismo viral. Con los datos obtenidos y a través de la utilización datos.
de diferentes métodos estadísticos (support vector machines-SVM, Al igual que para la determinación de resistencias, las nue-
position specific scoring matrices-PSSM) se han diseñado sofisticados vas plataformas de secuenciación masiva permiten superar las
algoritmos de interpretación que permiten predecir el uso del limitaciones de las técnicas convencionales de secuenciación
correceptor del VIH basándose en la secuencia genética de la región poblacional, mediante la generación simultánea de centenares
V3 de un determinado aislado viral. Algunos de ellos se encuentran de secuencias clonales de virus40,41 . Actualmente, 454 (454 Life
disponibles en páginas web de libre acceso como son WetCat, Sciences/Roche Diagnostics) es la plataforma de secuenciación
geno2phenocoreceptor , y WebPSSM. Diversos estudios han evaluado masiva mejor situada para el estudio del tropismo del VIH por-
también la capacidad de predecir el tropismo viral combinando que genera secuencias de 300-500 pares de bases y ello permite
la información aportada por varios algoritmos, e incluso variables secuenciar la región V3 entera en un solo amplicon. Así, 454 per-
clínicas relacionadas con la infección por VIH. Estos métodos han mite detectar virus X4 presentes en < 1% de la población viral42 .
conseguido mejorar la sensibilidad para detectar cepas X4, sin una Aunque los estudios realizados con 454 han demostrado una
pérdida significativa de especificidad37,38 . superioridad técnica frente a los métodos convencionales, la rea-
El algoritmo de interpretación de más amplia difusión es lidad es que esta tecnología todavía no está disponible para el
Geno2phenocoreceptor . Se ha desarrollado conjuntamente entre la diagnóstico clínico rutinario. Es una tecnología cara, poco auto-
Universidad de Colonia y el Instituto Max-Planck de Alemania39 . matizada, requiere un conocimiento técnico muy especializado,
El método estadístico que utiliza para hacer sus predicciones es y precisa un análisis bioinformático intensivo. Estas limitacio-
SVM (Support Vector Machine). Geno2pheno puede realizar las pre- nes técnicas e industriales se están resolviendo rápidamente
dicciones tanto a partir de la secuencia FASTA de nucleótidos mediante nuevas versiones de la tecnología (secuenciador 454
o de aminoácidos de la región V3. La base de datos en la que Junior) y mediante el desarrollo de herramientas de interpretación
basa geno2pheno sus predicciones consiste en un total de 1100 parcialmente automatizadas como Geno2Pheno-454 (http://g2p-
secuencias de V3 de 332 pacientes: 769 secuencias de V3 que se 454.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php).
corresponden con un fenotipo R5, 210 con un fenotipo X4 y 131 La validación de los ensayos genotípicos para uso clínico
secuencias con fenotipo R5X4, principalmente obtenidas de la base requiere la demostración de su capacidad para identificar pacientes
de datos de Los Álamos. La mayoría de estas secuencias son subtipo respondedores y no respondedores a un tratamiento con anta-
B, aunque también incluye algunas secuencias de otros subtipos gonistas de CCR5 más que demostrar una perfecta correlación
genéticos. El servidor permite seleccionar en cada predicción el con el ensayo fenotípico de TrofileTM . El re-análisis retrospectivo
grado de sensibilidad para detectar variantes X4, seleccionando de los ensayos MOTIVATE43 ha demostrado que las herramien-
el porcentaje de FPR (False Positive Rate) en cada predicción. La tas genotípicas y el ensayo de TrofileTM son comparables en la
última versión de geno2pheno oferta la posibilidad de introdu- predicción de respuesta a maraviroc a pesar de que la sensibili-
cir datos clínicos adicionales como la carga viral, número de CD4 dad de las herramientas genotípicas utilizadas geno2pheno-5% y
y la presencia o ausencia de la deleción de 32 pares de bases PSSM para detectar variantes X4-trópicas fue del 63 y 59%, res-
Tabla 6
Ventajas e inconvenientes de los ensayos genotípicos y fenotípicos para la determinación del tropismo viral.
Limitaciones Fenotipo Genotipo
Técnicas • La transcripción inversa in vitro (síntesis de una doble hebra de ADN • La transcripción inversa in vitro (síntesis de una doble hebra de ADN
a partir de ARN) tiene una eficiencia no superior al 10% a partir de ARN) tiene una eficiencia no superior al 10%
• La eficiencia del proceso de generación del plásmido en el que se • “Limitada” sensibilidad de la secuenciación poblacional para detectar
inserta la envuelta del paciente es variable. Las técnicas de clonaje son variantes por debajo del 10-20%
más eficaces que las de recombinación homóloga, y por tanto más
sensible
• La generación de virus de ciclo múltiple aumenta la sensibilidad • Amplificación limitada a la región V3, sin tener en cuenta los
frente a los sistemas de ciclo único, ya que las secuencias minoritarias determinantes contenidos en V1, V2 y C4
se amplifican “biológicamente” en los ciclos de infección-reinfección y
pueden ser detectadas con mayor eficacia
De interpretación • Determinación del umbral “clínico” que predice el éxito o el fracaso • Los sistemas de interpretación del tropismo viral están basados en
al tratamiento con antagonistas de CCR5 datos pareados genotipo/fenotipo con un número relativamente bajo
de secuencias y con escaso número de secuencias de subtipos no-B
pectivamente, comparado con TrofileTM . De la misma manera el 17. Thompson MA, Aberg JA, Cahn P, Montaner JS, Rizzardini G, Telenti A, et al.,
re-análisis retrospectivo del ensayo MERIT44 logró demostrar la International AIDS Society-USA. Antiretroviral treatment of adult HIV infection:
2010 recommendations of the International AIDS Society-USA panel. JAMA.
capacidad de la herramienta geno2pheno-5,75% para identificar 2010;304:321–33.
pacientes respondedores y no-respondedores a maravicoc de forma 18. Gupta RK, Hill A, Sawyer AW, Cozzi-Lepri A, von Wyl V, Yerly S, et al. Virological
similar a ESTA-TrofileTM a pesar de que de nuevo la sensibilidad monitoring and resistance to first-line highly active antiretroviral therapy in
adults infected with HIV-1 treated under WHO guidelines: a systematic review
de geno2pheno para detectar variantes X4-trópicas fue del 55% and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 2009;9:409–17.
comparado con ESTA-TrofileTM . Recientemente, se han presentado 19. Reekie J, Mocroft A, Ledergerber B, Beniowski M, Clotet B, van Lunzen J, et al.,
estudios prospectivos en diferentes cohortes europeas en los que EuroSIDA Study Group. History of viral suppression on combination antiretro-
viral therapy as a predictor of virological failure after a treatment change. HIV
se ha valorado la respuesta a maraviroc en pacientes en los que su Med. 2010;11:469–78.
uso terapéutico fue basado en la determinación genotípica del tro- 20. Palmer S, Wiegand AP, Maldarelli F, Bazmi H, Mican JM, Polis M, et al. New
pismo viral. En general, los resultados derivados de estos estudios real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity
for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J Clin Microbiol.
señalan tasas de respuesta a maraviroc superiores al 85% cuando los
2003;41:4531–6.
aislados de los pacientes eran clasificados genotípicamente como 21. de Mendoza C, Holguín A, Soriano V. False positives for HIV using comercial
R5-trópicos45,46 . viral load quantification assays. AIDS. 1998;12:2076–7.
22. Hirsch MS, Günthard HF, Schapiro JM, Johnson VA, Kuritzkes DR, Mellors JW,
Las limitaciones de los ensayos fenotípicos y genotípicos para
et al. Antiretroviral drug resistance testing in adult HIV-1 infection: 2008
la determinación del tropismo viral se presentan en la tabla recommendations of an International AIDS Society-USA panel. Clin Infect Dis.
6. Los datos actuales ponen de manifiesto la viabilidad de la 2008;47:266–85.
utilización de determinadas herramientas genotípicas para la 23. Pillay D, Zambon M. Antiviral drug resistance. BMJ. 1998;317:660–2.
24. Parra-Ruiz J, Álvarez M, Chueca N, Peña A, Pasquau J, López-Ruz MA, et al.
determinación del tropismo viral en la práctica clínica47 . Por Resistencias genotipicas en pacientes con VIH-1 y grados de viremia persis-
todo lo expuesto, diversas guías de manejo de la infección tentemente bajos. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2009;27:75–80.
por VIH, como las españolas (http://www.gesida.seimc.org)16 , 25. Paredes R, Lalama CM, Ribaudo HJ, Schackman BR, Shikuma C, Giguel F, et al.,
AIDS Clinical Trials Group (ACTG) A5095 Study Team. Pre-existing minority
europeas (www.europehivresistance.org) y británica (http:// drug-resistant HIV-1 variants, adherence, and risk of antiretroviral treatment
www.bhiva.org/Tropism.aspx)48 , incluyen entre sus recomenda- failure. J Infect Dis. 2010;201:662–71.
ciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH mediante 26. Alvarez M, García A, Guillot V, Johnson M, Chueca N, Hernández-Quero J, et al.
Cumulative Versus Last Genotype: Impact on the Prediction of Antiretroviral
métodos genotípicos para guiar el uso terapéutico de los antago- Drug-Resistance. 7th European HIV Drug Resistance Workshop; 2009, Mar 25-
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27. Dorr P, Westby M, Dobbs S, Griffin P, Irvine B, Macartney M, et al. Maraviroc (UK-
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Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297–307

Formación médica continuada: Infección por el VIH en el adulto

Diagnóstico de laboratorio de la infección por el VIH, del tropismo viral y de las

información del artículo r e s u m e n

Laboratory diagnosis of HIV infection, viral tropism and resistance to

Introducción conocimientos de los mecanismos inmunopatogénicos, de la rela-

298 F. García et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297–307

Marcadores inmunológicos y virológicos durante la ARN-VIH/ADN proviral

F. García et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297–307 299

300 F. García et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297–307

F. García et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297–307 301

Técnica de 4.ª generación

Pedir nuevo suero Segundo suero Informar Negativo Sospecha de primoinfección

+/+ +/- -/-

Positivo Negativo Positivo Negativo

Informar Positivo Nueva muestra Nueva muestra Nueva muestra

Figura 2. Algoritmo del diagnóstico de infección VIH.

VIRADAPT GT/STD 6 meses 108 −1,15 vs −0,67 0.05 32 vs 14 0,067

FT: fenotipo; GT: genotipo; STD: estándar de tratamiento.

302 F. García et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297–307

(1) (2) (3)

RT-PCR RT-PCR RT-PCR

F. García et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297–307 303

IAS (International AIDS Society) www.iasusa.org/guidelines/index.html

304 F. García et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297–307

Metodología Ventajas Inconvenientes

Ensayo MT-2 Barato Requiere el cultivo viral

F. García et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297–307 305

Limitaciones Fenotipo Genotipo

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