Aislamiento de Adn

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Aislamiento de adn

Introducción Casi todas las células contienen adn, pero su concentración varía dependiendo
del tejido. El tejido linfoide, el bazo y el timo resultan buenas fuentes para obtener adn.
Algunos tejidos contienen actividades altas de las enzimas deoxirribonucleasa, lo cual trae
como consecuencia la fragmentación del adn, en consecuencia para la obtención de adn es
aconsejable que el tejido tenga una baja actividad de la enzima y una alta concentración de
adn. La extracción de adn requiere una serie de etapas básicas. En primer debe romperse la
membrana plasmática y el núcleo para dejar libre el adn. Al mismo tiempo es necesario
inactivar las enzimas que puedan degradarlo y finalmente aislarlo por precipitación en alcohol.
Para extraer el adn a menudo se efectúa con disolventes para eliminar los contaminantes de
los ácidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una combinación de fenol y cloroformo con
objeto de eliminar las proteínas. Para concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una
precipitación con isopropanol o etanol. Si la cantidad de ácido nucleico es escasa, puede
añadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucógeno) para favorecer la precipitación.
También puede realizarse una precipitación selectiva con concentraciones salinas elevadas
(precipitación salina) o una precipitación de las proteínas mediante cambios del pH. El adn se
desnaturaliza fácilmente y debe trabajarse con cuidado para obtener un buen producto. Debe
evitarse la tensión mecánica y condiciones físicas y químicas extremas y deben inhibirse las
nucleasas-

Objetivos específicos

•Aislar adn a partir de hígado de pez, basado en las propiedades de la molécula

•Realizar y discutir las diferentes etapas para el aislamiento de ADN-

Materiales y reactivos

•Bazo de cerdo (también puede ser hígado de rata)

•Buffer salino: 0,15 mol L-1 de NaCl y 0,015 mol L-1 de Citrato de Sodio

•Cloruro de Sodio (2 mol L-1).

•Cloroformo/Alcohol amílico (6:1)

•Alcohol absoluto

•Éter

•Licuadora Laboratorio 1.Pique en pedazos muy pequeños 10 g de bazo de cerdo y


homogenice en 40 ml de buffer salino frío durante 1 min, centrifugue la suspensión a 5000 g. 5
min. 2.Descarte el sobrenadante y resuspenda el precipitado en NaCl 2 mol L-1, hasta obtener
un volumen total de 200 ml 3.Descarte el precipitado y el sobrenadante colóquelo en un vaso
de precipitado, agite la solución con una varilla de vidrio, mientras va añadiendo un volumen
igual de agua destilada. 4.Aparecerá un precipitado fibroso, trate de envolverlo con la varilla
de vidrio y déjela secar en un vaso de precipitado por 30 min. 5.Coloque el grumo sobre un
papel de filtro para eliminar totalmente el contenido de agua. 6.Disuelva la
deoxirribonucleoproteína en 20 ml de NaCl 2 mol L-1, agregue un volumen igual de mezcla
cloroformo: alcohol amílico y homogeneice por 30 sec. 7.Centrifugue la emulsión a 5000 g por
15 min. y recoja la capa.

Superior (acuosa). Succione cuidadosamente la capa superior en forma tal que no se agite la
proteína presente en la interfase de los dos líquidos. 8. Repita el paso anterior. 9. Añada el
doble de volumen de alcohol frío para precipitar las fibras de adn y mezclar lentamente con
una varilla de vidrio hasta que las fibras de adn se enrollen en ella. 10. Saque la varilla y
presione cuidadosamente el adn fibroso contra las paredes del vaso precipitado para exprimir
el solvente. 11. Lave finalmente el precipitado metiendo la varilla en una serie de solventes y
exprimiendo el exceso del solvente. Los cuatro solventes a usar serán etanol 70% v/v, etanol
80% v/v, etanol absoluto, Éter. 12. Deje evaporar el éter remanente colocando el adn en un
vidrio de reloj por 10 min. 13. Pese el adn seco y guárdelo en el congelador resuspendido en
2ml de buffer salino 0,015 mol L-1 hasta cuando los necesite

Post-laboratorio Señale la importancia y la función de cada uno de los pasos realizados para la
obtención de adn.

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