Prácticas de laboratorio 03 – Programa de Biología

Biología Celular – Ingrith Angélica Zárate Caballero

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DE CIENCIAS - PROGRAMA DE BIOLOGÍA

PROCARIOTAS

PRACTICA No. 03

Objetivo:

1. Identificar la célula procariota en diferentes muestras.

Introducción:

Las células procariotas son estructuras simples, incluyen a las bacterias. No se sabe con certeza cuándo
aparecieron las células procariotas por primera vez en la Tierra. La evidencia de vida procariota se obtuvo
de rocas con aproximadamente 2.700 millones de edad. Estas rocas no contienen tan solo microbios
fosilizados, sino también moléculas orgánicas complejas que son características de tipos particulares de
organismos procariotas, incluidas las cianobacterias. Es improbable que tales moléculas se sintetizaran de
manera abiótica, esto, es, sin la participación de células vivas. Las cianobacterias aparecieron hace casi
2.400 millones de años, porque es cuando la atmósfera fue enriquecida con oxígeno molecular (O2), que
es un producto secundario de la actividad fotosintética de estas células procariotas.

Las procariotas están divididas en dos grandes grupos taxonómicos o dominios:

Archaea (arqueobacterias) y bacteria (o eubacterias). De acuerdo con la opinión actual, los miembros de
las arqueobacterias se vinculan de forma más estrecha con las eucariotas respecto de otros grupos de
procariotas (bacteria). El dominio arqueobacteria incluye a varios grupos de organismos cuyos lazos
evolutivos entre unos y otros se manifiestan por similitudes de la secuencia nucleótida de sus ácidos
nucleícos.

Las especies más conocidas de arqueobacterias son las que viven en ambientes extremos e inhóspitos, a
menudo se conocen como “extremófilas”. Entre los organismos de arqueobacterias figuran los
metanógenos (procariotas capaces de convertir los gases CO2 y H2 en gas metano CH4; los halófitos
(procariotas que viven en ambientes en extremo salados, como el Mar Muerto o algunas cuencas oceánicas
profundas con salinidad equivalente a la del MgCl2 5M); acidófilos (procariotas que tienen preferencias por
ambientes ácidos, que viven a un pH tan bajo como cero, como los que se encuentran en los líquidos que
drenan de las minas abandonadas) y termófilos (procariotas que viven a muy altas temperaturas). En este
último grupo se incluye a las hipertermófilas, que viven en chimeneas hidrotermales del fondo marino. Al

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poseedor del registro más elevado en este grupo se le denomina “cepa 121”, porque es capaz de vivir y
dividirse en agua súper caliente a una temperatura de 121°C, que es utilizada para esterilizar equipo
quirúrgico en autoclave.

Todos las otras procariotas se clasifican en el dominio de bacteria. Este dominio incluye a las células vivas
más pequeñas, el micoplasma (0,2 μm de diámetro), que también son las únicas procariotas conocidas sin
una pared celular y que contienen un genoma con apenas 500 genes. Las bacterias están presentes en
todos los ambientes conocidos sobre la Tierra, desde los hielos polares antárticos hasta los desiertos más
secos del África y los confines internos de las plantas y animales. Asimismo, hay que mencionar las
bacterias que viven en sustratos rocosos situados a varios kilómetros de profundidad. Se piensa que
algunas de estas comunidades bacterianas se aislaron de la vida en la superficie hace más de 100 millones
de años.

Las procariotas más complejas son las cianobacterias. Estas poseen membranas citoplasmáticas, que
sirven como sitios para la fotosíntesis. Las membranas citoplasmáticas de las cianobacterias son muy
parecidas a las membranas fotosintéticas presentes dentro de los cloroplastos de las células vegetales.
Como en las plantas, organismos eucariotas, la fotosíntesis en cianobacterias se lleva a cabo al romper las
moléculas de agua para liberar oxígeno molecular. Muchas cianobacterias no solo son capaces de realizar
la fotosíntesis, sino también la fijación de nitrógeno, esto es, la conversión de nitrógeno (N2) gaseoso en
formas reducidas de nitrógeno (como amoníaco, NH3) que pueden utilizar las células en la síntesis de
compuestos orgánicos que contienen nitrógeno incluidos aminoácidos y nucleótidos. Estas especies
celulares capaces de efectuar la fotosíntesis y la fijación de nitrógeno pueden sobrevivir con los recursos
esenciales (luz, N2, CO2 y H2O). Por tanto, no es de sorprender que las cianobacterias sean los primeros
organismos que colonizan las rocas sin vida formadas por una erupción volcánica.

Respecto a la tinción de Gram.

Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios donde se manejan pruebas
microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las
bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas. Fue desarrollada
por el científico danés Hans Christian Gram en 1884; hoy en día, sigue siendo una de las tinciones más
utilizadas universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz que resulta. En microbiología clínica
resulta de gran utilidad, ya que a partir de muestras clínicas directas provenientes de sitios estériles se
puede saber de manera rápida las características de la muestra y hacer una diferencia de los potenciales
microorganismos causantes de una infección. Los principios de la tinción de Gram están basados en las
características de la pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada
microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de
peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una
pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; así
pues, la composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram
negativas y Gram positivas explica y determina las características tintoriales. La tinción de Gram se basa
en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared

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bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta
por la formación de un complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared
bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y
cierra los poros de esta, también destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a
que ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla de alcohol-acetona. Las bacterias
Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo,
mientras que las Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano. Por
último, se coloca safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de contra tinción y sirve para
teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo.

Hay bacterias de un mismo género que pueden observarse en la misma muestra como Gram positivas y
como Gram negativas, a este evento se le llama tinción Gram variable secundaria a alteración en nutrientes,
temperatura, pH o concentración de electrolitos. No todas las bacterias se pueden teñir por esta técnica,
ya que carecen de pared celular (micoplasma) o su pared celular tiene una composición química diferente
(micobacterias, que cuentan con una gran cantidad de ácidos micólicos). Las muestras útiles para su uso
son líquidos estériles, biopsias para cultivo, abscesos, hisopados, crecimiento de colonias aisladas en
medios de cultivo. Las bacterias Gram positivas se observan de color azul obscuro a morado, mientras que
las Gram negativas se observan de color rosa a rojo.

MATERIALES DE LA PRACTICA

1. Microscopio
2. Laminas o portaobjetos (Estudiante).
3. Laminillas o cubreobjetos (Estudiante).
4. Yogurt Alpina (estudiantes)
5. Fucsina básica.
6. Azul de metileno.
7. Glicerina.
8. Cristal violeta.
9. Lugol.
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10. Alcohol-cetona.
11. Safranina.
12. Alcohol (estudiantes)
13. Algodón (estudiantes)
14. Papel Absorbente (estudiantes)
15. Toallita (estudiantes)
16. Hisopos de algodón para toma de muestras (estudiantes comprar dos en cualquier droguería)
17. Kit de laboratorio que incluya algodón, toalla para limpiar, papel absorbente.

PROCEDIMIENTO

Ejercicio 1.

Frotis de la garganta: Sentar cómodamente al compañero,

alistar el hisopo y baja lenguas estériles, colocarse los guantes,
indicar al estudiante que abra la boca, introducir el bajalenguas
y con el hisopo frotar las amígdalas (aparentemente parece no
haber tomado muestra de las amígdalas). Coloque la muestra
en el centro de la lámina y proceda a fijarla adicionándole una
gota de fucsina básica dejándola actuar por un minuto, luego
lave la muestra manteniendo inclinada la lámina hasta que el
agua esté clara, indicando que salió el exceso de colorante.
Seque la muestra (flamear al mechero) y proceda a observar al
microscopio con los objetivos de 10x y 40x.

Ejercicio 2.

Frotis de la mucosa nasal: Tomar con mucho cuidado la muestra de

las fosas nasales, con un hisopo, colocarla en el centro de la lámina
portaobjetos, para fijarla añada alcohol etílico y deje secar, adicione
una gota de azul de metileno para colorearla dejándola actuar por un
minuto, lave manteniendo inclinada la lámina hasta que el agua esté
clara indicando que ha salido el exceso del colorante. Seque la
muestra (flamear al mechero), coloque el cubreobjetos y proceda a
observar al microscopio con los objetivos 10x y 40x.

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Ejercicio 3.

Observación de bacterias de yogurt (Estreptococos lácteos y

Lactobacilus búlgaros): Colocar una gota del líquido que queda en la
superficie del yogurt en una lámina portaobjetos, flaméela por un
minuto, adiciónele dos gotas de alcohol y deje actuar un minuto para
que la grasa del yogurt se disuelva, luego lave con agua para escurrir
el exceso de alcohol y secar al aire, añada una gota de azul de
metileno, déjelo actuar por 5 minutos, lávelo y deje secar al aire,
añada una gota de glicerina, coloque el cubreobjetos y observe al
microscopio con los objetivos 4 10 40.
Ejercicio 4.

Tinción de Gram. Tome una muestra de yogurt

o sarro dental, colóquela en el portaobjetos, con
un palillo extiéndala, agréguele una gota de
cristal violeta y déjela por 1 minuto, luego lave
la muestra manteniendo inclinada la lámina
hasta que el agua salga clara, seguidamente
agréguele lugol, déjela nuevamente por 1
minuto y lave, agréguele alcohol cetona
dejándolo igualmente por 1 minuto, lave hasta
que el agua salga sin colorante, por último, agréguele safranina, déjela por 2 minutos, lave posteriormente,
flaméela en el mechero y lleve la muestra al microscopio, por último observe las bacterias que estén
presentes en la muestra.

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Bibliografía

Becker, W., Kleismith, L., Hardin, J. (2007) El mundo de la célula. Sexta edición.

Audesirk, T., Audesirk, G., Byers, B. E. (2008) Biología. La vida en la Tierra. Octava edición.

Azcón-Bieto J, Talón M. (2000). Fundamentos de Fisiología Vegetal. McGraw-Hill Interamericana. Madrid

Barceló Coll J y cols (2000). Fisiología Vegetal. Pirámide. Madrid Guardiola Bárcena JL, García Luis A.
(1990). Fisiología Vegetal I: Nutrición y Transporte. Editorial Síntesis. Madrid Salisbury FB, Ross CW (1992).
Plant Physiology. Wadsworth Publishing. California