APLICACIONES CLÍNICAS DE LAS TÉCNICAS ACTUALES DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Ed. Cont. Lab. Clin 37: 33 - 40

TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA (NGS).

María Santamaría González.

Servicio de Bioquímica Clínica. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza.
José Miguel Lezana Rosales.
Unidad de Bioinformática. Centro de Genética Molecular Genetaq. Málaga.

1. FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA
La secuenciación de nucleótidos que conforman la molécula de ADN representa el análisis
más detallado de su estructura y una herramienta eficaz para identificar variantes en el ma-
terial genético. La secuenciación Sanger supuso en los años 70 una revolución importante
en Genética Humana, sentando precedente en el origen de la era genómica. Sin embargo,
en los últimos años se han desarrollado nuevas plataformas de secuenciación denominadas
de alto rendimiento o nueva generación (Next-Generation Sequencing o NGS) capaces de
generar paralelamente, y de forma masiva, millones de fragmentos de ADN en un único
proceso de secuenciación, elevando significativamente el rendimiento a un menor coste y
ofreciendo ventajas significativas respecto a los sistemas convencionales.

Con la incorporación de las nuevas tecnologías de secuenciación a la práctica clínica, cada

laboratorio gestiona el procedimiento a desarrollar en cada caso. Con la finalidad de me-
jorar el rendimiento del laboratorio se desarrollan paneles NGS que permiten el análisis
en paralelo de múltiples genes o regiones seleccionadas del ADN que se relacionan con fe-
notipos parecidos o solapantes. Estos paneles pueden proporcionar un primer método de
análisis genético. Si no se detecta ninguna alteración importante que explique el fenotipo
reportado, el facultativo determinará si continúa ampliando el estudio con la secuencia-
ción del exoma o del genoma completo.

El procedimiento general de las técnicas de secuenciación masiva incluye en términos ge-

nerales:
1. Fragmentación del ADN: se generan pequeños fragmentos de distinto tamaño y pos-
teriormente se unen a sus extremos unas moléculas llamadas adaptadores. El conjun-
to de todos los fragmentos de ADN unidos a sus adaptadores se conoce como librería.
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2. Enriquecimiento (opcional): consiste en seleccionar exclusivamente las áreas de inte-

rés antes de la secuenciación.
2.1. Métodos de captura por hibridación en fase sólida: se construyen microarrays
con oligonucleótidos unidos covalentemente a una superficie sólida con secuen-
cias complementarias a aquellas que se quieren seleccionar. Las áreas de interés
del ADN fragmentado hibridan con estos oligonucleótidos y permanecen unidas
a la superficie sólida. Roche/NimbleGen ha desarrollado y comercializa estos
microarrays como el desarrollado para la captura del exoma (SeqCap EZ Exome
capture)
2,2. Métodos de amplificación mediante PCR: la amplificación se produce mediante el
anclaje del fragmento de ADN, a través de sus adaptadores, a una superficie só-
lida. Las plataformas que requieren la amplificación clonal de los fragmentos de
ADN se denominan de segunda generación. Existen plataformas, denominadas
de tercera generación, que no requieren la amplificación de los fragmentos de
ADN, reduciendo el tiempo de trabajo y abaratando el proceso de secuenciación.

3. Ligación del material amplificado a una superficie sólida donde se llevará a cabo la
reacción de secuenciación.

4. Secuenciación del material genético: la secuenciación y detección de las bases ocurren

al mismo tiempo en todas las moléculas de ADN (secuenciación masiva y paralela)

5. Creación de archivos con información de la secuenciación y alineamiento de las lec-

turas contra un genoma de referencia: los cientos de miles de lecturas obtenidas son
almacenadas en archivos fastq (dos por paciente en el caso de paired-end). Se requie-
ren el empleo de potentes herramientas informáticas para proceder al alineamiento
de las secuencias, y posteriormente generar una base de datos con las variantes obte-
nidas.

A pesar de estas peculiaridades, cada plataforma de secuenciación masiva se basa en prin-

cipios químicos distintos que generan diferencias cuantitativas y cualitativas. A continua-
ción se detallan las técnicas de secuenciación más utilizadas por las plataformas disponibles
en el mercado:

Secuenciación por síntesis o polimerización: sistemas dependientes de ADN polimerasa

• Secuenciador semiconductor: se basa en el registro de los cambios de pH producidos
durante la incorporación de bases durante la síntesis de ADN. Esta tecnología es in-
corporada por las plataformas de Ion Torrent™ (Ion PGM, Ion PROTON) (https://www.
thermofisher.com/es/es/home/brands/ion-torrent.html)

• Terminación reversible cíclica: se utilizan nucleótidos que incorporan un grupo ter-

minador marcado con moléculas fluorescentes, de manera que la incorporación del
siguiente nucleótido a la cadena no se efectúa hasta que el terminador es retirado

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tras lectura de la señal fluorescente. Las plataformas que utilizan esta técnica son
Illumina (https://www.illumina.com/) y Helicos BioSciences (http://seqll.com/).

La plataforma de Illumina permite realizar secuenciación de tipo paired-end mediante la

cual es posible leer un fragmento de ADN por los dos extremos. Se secuencia el fragmento
amplificado por los dos extremos en vez de por uno solo. Ofrece ventajas a la hora de rea-
lizar el alineamiento contra el genoma de referencia, ya que permite estimar el tamaño del
fragmento original y situarlo con mayor precisión en el genoma mejorando así la cobertu-
ra de las zonas de interés y también resulta útil para la detección de eventos estructurales.

• Secuenciación en tiempo real: estas técnicas son muy rápidas porque no frenan la se-
cuenciación tras la incorporación de cada base para llevar a cabo la lectura ni invier-
ten tiempo en ciclos de lavado. Tampoco requieren amplificación, ni sufren fenóme-
nos de desfase. Esta tecnología desarrollada por Pacific Biosciences (http://www.pacb.
com/products-and-services/) e incorporada en su plataforma SMRT (Single Molecule
Real Time) contiene un dispositivo que permite limitar el campo de observación lo
suficiente como para captar exclusivamente la fluorescencia emitida por la incorpo-
ración de nucleótidos marcados en tiempo real.

Otras técnicas de secuenciación: todavía en fase de desarrollo

• Basadas en nanoporos: Se basan en la identificación de las distintas bases de la ca-
dena de ADN gracias a una señal óptica o por la variación que se produce en una
corriente eléctrica al pasar la cadena a través de un nanoporo anclado a una mem-
brana. Desarrollada por Oxford Nanopore Systems (https://nanoporetech.com/)

• Observación directa con microscopía: desarrollada por compañías como ZS Genetics

(http://alllseq.com/knowledge-bank/emerging-technologies/zs-genetics/) que utiliza la
microscopía electrónica y permite leer la secuencia del ADN directamente
por métodos ópticos sin necesidad de amplificación.

Las técnicas de secuenciación NGS generan principalmente, tres tipos de ficheros: FASTQ,
SAM/BAM (alineamiento) y VCF (anotación).

Fichero FASTQ: texto de entrada estándar que contiene los datos crudos (lecturas o reads)
obtenidos por el secuenciador. Permite almacenar la secuencia biológica junto con las ca-
lidades asociadas a cada nucleótido de la secuencia. Este fichero es reconocido por las he-
rramientas bioinformáticas encargadas del alineamiento.

Fichero SAM (Sequence Alignment/Map format): representación de alineamientos de se-

cuencias contra un genoma o secuencia de referencia.

Fichero BAM (Binary Alignment/Map format): versión comprimida del formato SAM. Per-
mite realizar un indexado para tener acceso directo a las posiciones genómicas.

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Los datos de alineamiento se visualizan empleando herramientas de visualización interac-

tiva como IGV (Integrative Genomics Viewer)

Fichero VCF (Variant Call Format) se obtiene a partir de los ficheros SAM/BAM. Permite
almacenar las variaciones de la secuencia con respecto al genoma contra el que se alinea:
SNPs, inserciones, deleciones y variantes estructurales, junto con ciertas anotaciones opcio-
nales derivadas de diferentes bases de datos

Los pares de reads correctamente alineados se utilizan en la detección de SNP (Single Nu-
cleotide Polymorphism), pequeñas inserciones y deleciones y en la estimación del número
de copias. Los reads de un par no alineados que muestran una distancia o una orientación
inesperada, se analizan como indicadores potenciales de variantes estructurales. Por últi-
mo, el acoplamiento de novo de reads no alineados con la referencia proporciona predic-
ciones de variantes estructurales.

Un aspecto importante en la NGS es el número de veces que cada base del genoma está
presente en los reads de secuenciación producidos; es decir, el número de veces que se lee
cada nucleótido. Este valor se denomina cobertura y es uno de los factores determinantes
para evaluar la fiabilidad del nucleótido asignado a esa posición del genoma. El diseño de
paneles de NGS debe garantizar una adecuada cobertura en todos los genes analizados. La
gran capacidad de estas tecnologías para generar datos genómicos va a incrementar signi-
ficativamente la información genética asociada que disponemos en la actualidad.

2. ÁMBITO DE APLICACIÓN
Debido a su gran rendimiento, este tipo de plataformas es idóneo para un sin fin de es-
tudios a gran escala imposibles de abordar con ningún otro tipo de tecnología existente
hasta la fecha debido al enorme coste que ello supondría. Entre las principales aplicaciones
destacan:
o Diagnóstico molecular de enfermedades hereditarias: se pueden seguir varias estrategias
pero recae en el laboratorio la responsabilidad de realizar una gestión adecuada del mé-
todo a utilizar en cada caso.

Secuenciación dirigida: la más utilizada, consiste en el aislamiento, enriquecimiento y

secuenciación de regiones específicas del genoma (regiones codificantes de interés y
zonas intrónicas flanqueantes). Se desarrollan paneles genéticos de apoyo al diagnós-
tico que permiten la identificación de variantes, polimorfismos, reordenamientos y
variantes somáticas en baja frecuencia, en numerosas muestras de forma simultánea.
Esta técnica es la más utilizada para el estudio de enfermedades con componente
hereditario que ya tienen mutaciones o genes asociados a su etiología. También es de
aplicación en la detección de mutaciones presentes en tumores, lo que permite eva-
luar si un tumor podría responder a una determinada terapia con fármacos dirigidos.

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Secuenciación de exoma: consiste en seleccionar las secuencias codificantes del ge-

noma, y finalmente secuenciarlas. Esta estrategia es empleada en la identificación de
genes causantes de patología cuando se desconoce la causa genética de un fenotipo
clínico concreto o para aquellas enfermedades con alta heterogeneidad fenotípica y
genética. No indicada en aquellos casos en los que se conoce el gen causante de la
patología o si ya se ha identificado la mutación responsable en otros miembros de la
familia.

Secuenciación de Genoma completo: el reto de esta estrategia de análisis es obtener

una interpretación eficiente y fiable antes de utilizarla con fines diagnósticos en ge-
nética humana. Sin embargo, se está aplicando en el campo de la Microbiología para
obtener genomas completos tanto de bacterias como de virus o patógenos fúngicos.
El estudio genómico que permite la identificación y caracterización de diferentes
microogranismos de una comunidad microbiana por extracción directa de ADN, es lo
que se conoce como metagenómica.

o Diagnóstico prenatal de aneuploidías: la secuenciación de ADN fetal presente en el plas-

ma materno es un método no invasivo y eficaz utilizado para detectar las principales aneu-
ploidías.

o Análisis del transcriptoma (ARN-Seq - Transcriptoma completo): con la secuenciación ma-

siva del ADN complementario se genera información global sobre el contenido de ARN de
una muestra, incluyendo mensajero, ribosomal y de transferencia y otros ARNs no codifi-
cantes. Proporciona una forma eficiente de medir niveles de expresión génica, identificar
eventos de splicing alternativo, fusión génica SNPs de manera simultánea.

o Estudio del microtranscriptoma: identificación, cuantificación y caracterización de cien-

tos de pequeñas moléculas de ARN no codificante (SmallRNAs: miRNAs, snoRNAs, piRNAs)
cuya función puede ser clave para el funcionamiento celular.

o Identificación de zonas de interacción proteína-ADN (ChIP-seq): esta aplicación es posible

a través de la técnica ChIP-Seq que combina la inmunoprecipitación de la cromatina con la
secuenciación masiva.

o Identificación de patrones de Metilación (metiloma): utilizada para el estudio de la re-

gulación de procesos clave como la diferenciación celular, el desarrollo o la aparición de
enfermedades.

Durante los próximos años, la lista de aplicaciones crecerá sin duda, al igual que la sofisti-
cación con las que se realizan las aplicaciones existentes.

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3. LIMITACIONES DE LA TÉCNICA
Los factores que influyen en la calidad de los resultados obtenidos son muy variados y van
a influir de forma decisiva en el tipo de errores cometidos y en la fiabilidad de los datos
derivados del análisis, incluyen: conservación de la muestra (tejido fresco o fijado), pureza
de la muestra (en el caso de tumores, porcentaje de células no tumorales presentes en la
muestra), técnica de secuenciación, cobertura y herramientas de análisis e interpretación
de resultados.

Entre las limitaciones más importantes de estas técnicas a tener en cuenta, destacan:

- La secuenciación exómica no es útil para detectar inversiones, traslocaciones, grandes

deleciones heterocigotas o zonas poliméricas con más de 8 bases repetidas.

- En función de la estrategia (panel, exoma) y de la metodología utilizada, en algunas

ocasiones quedan zonas codificantes del genoma sin cubrir.

- El incremento vertiginoso en la cantidad de datos genómicos generados hace necesa-

rio el desarrollo de herramientas de almacenamiento de datos de elevada capacidad
y con sistema de seguridad integrado.

- La obtención de un gran número resultados inesperados o no solicitados por el pa-

ciente, requiere de la aplicación de los métodos generales para interpretación de las
variantes aisladas y el análisis integral del contexto genómico y fisiológico específico
de cada caso. Es habitual realizar un análisis y consulta en bases de datos poblaciona-
les para conocer la evidencia científica sobre las posibles implicaciones.

- La dificultad en la interpretación de los resultados: el análisis de datos no sigue un

modelo único y la combinación de distintas herramientas de software y bases de
datos pueden dar lugar a resultados variables. La bioinformática surge para dar res-
puesta a los problemas computacionales que aparecen con las plataformas de NGS.
Esta disciplina aporta información importante para un análisis e interpretación efi-
ciente de los datos. Incluye: Análisis primario: Análisis de imagen y asignación de
bases Análisis secundario: Alineamiento, detección de variantes y anotación. Análisis
terciario: Búsqueda y análisis de las variantes más probablemente patogénicas. Aná-
lisis conjunto de variantes y fenotipo del paciente.

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COMISIÓN DE GENÉTICA
Presidenta: Pilar Carrasco Salas.
Miembros: Concepción Alonso Cerezo, Ana Cuesta Peredo, Orland Diez Gibert, Begoña Ezquieta
Zubicaray, Hada Macher Manzano, Jesús Molano Mateos, Josep Oriola Ambròs, Raquel RodrÍguez
López, Atocha Romero Alfonso, Ana Mª Sánchez de Abajo, María Santamaría González (coordinadora),
Cristina Torreira Banzas.
ACTIVIDADES FORMATIVAS DEL COMITÉ DE EDUCACIÓN
D. Balsells, B. Battikhi (Residente), R. Deulofeu, M. Gassó, N. Giménez, A. Merino, A. Moreno,
A. Peña, N. Rico, M. Rodríguez (Presidente), MC. Villà.
ISBN 978-84-697-4013-2 – Febrero 2018 (recibido para publicación Junio 2017).

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