UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN

ANTONIO ABAD DEL CUSCO

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

“DETERMINACIÓN SEXUAL DE Aglaeactis castelnaudii y

Aglaeactis cupripennis (TROCHILIDAE) MEDIANTE LOS GENES
CHD1 EN BOSQUES DE Polylepis EN LA CORDILLERA DEL
VILCANOTA, CUSCO”

TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO

Presentado por:
Bach. DAVID GUEVARA APAZA
Asesorado por:
Dra. JULIA GRISELDA MUÑIZ
DURAN
Co-Asesora:
Mgt. MERCEDES MARITZA
QUISPE FLOREZ

FINANCIADA POR EL PROGRAMA “YACHAYNINCHIS WIÑARINANPAQ”

CUSCO - PERÚ
2022
Para mi papá Marco.
 AGRADECIMIENTOS

A mis padres por su apoyo durante el desarrollo de mi carrera universitaria.

Al vicerrectorado de investigación de la UNSAAC por el financiamiento brindado

para el desarrollo de esta tesis de pregrado, al Comité de Bioética Institucional y
Sub Comité de Bioética Institucional de estudio con animales, vegetales y/o mate­
rial genético no humano de la UNSAAC, por brindar la autorización pertinente y al
Servicio Nacional Forestal y de Fauna Silvestre ­ SERFOR por el permiso de inves­
tigación para la colecta temporal de aves y la toma de muestras de tejido sanguíneo
y plumas.

A mis asesoras, Mgt. Blga. Griselda Muñiz Durand y Mgt. Blga. Maritza Quispe
Flórez del laboratorio de Biología Molecular por su guía y constante apoyo en el
desarrollo de todas las etapas de este proyecto de investigación, así tambien al
MSc. Romulo Segovia por su apoyo en la técnico en la preparación de este trabajo
de tesis.

Al Dr. Fabricio Rodrigo dos Santos y al MSc. Jean Carlos Pedroso de Oliveira del
laboratorio de Biodiversidade y Biología Molecular de la Universidade Federal de
Minas Gerais, por su predisposición y apoyo en la fase de laboratorio de este tra­
bajo de investigación.

A mis compañeros y amigos de la universidad y los asistentes de campo que brin­

daron su apoyo y compañía en la toma de datos para este proyecto de tesis.
 ÍNDICE

RESUMEN I

INTRODUCCIÓN II

PLANTEAMIENTO DE PROBLEMA III

JUSTIFICACIÓN IV

OBJETIVOS V

HIPÓTESIS VI

CAPÍTULO I: GENERALIDADES 1
1.1 ANTECEDENTES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 MARCO TEÓRICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.1 Los picaflores altoandinos en Perú . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.2 Morfometría en picaflores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.3 Estimación de edad en picaflores . . . . . . . . . . . . . . 10
1.2.4 Monomorfismo y dimorfismo sexual en aves . . . . . . . 11
1.2.5 Monocromatismo en aves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.2.6 Sistema cromosómico sexual en aves . . . . . . . . . . . 12
1.2.7 Identificación sexual de las aves . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.2.8 Genes CHD­1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.2.9 Cebadores para la detección del gen CHD­1 en aves . . . 16
1.2.10 Limitantes del uso de cebadores para la detección del
gen CHD­1 en aves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS 20

2.1 ÁREA DE ESTUDIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.1.1 Ubicación política y geográfica . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.1.2 Accesibilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.1.3 Descripción del área . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.1.4 Características ecológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2 MATERIALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.2.1 Material biológico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.2.2 Materiales de campo ­ monitoreo ecológico . . . . . . . . 26
2.2.3 Materiales para colecta de muestras genéticas . . . . . . 26
 2.2.4 Material de laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.2.5 Reactivos e insumos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.3 METODOLOGÍA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.3.1 Captura temporal de aves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.3.2 Preparación previa a la extracción de ADN . . . . . . . . . 31
2.3.3 Extracción de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.3.4 Visualización de Amplicones . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.3.5 Secuenciamiento de CHD­Z . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.3.6 Análisis bioinformático . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.3.7 Análisis prueba de hipótesis entre el sexado molecular y
datos morfométricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

CAPÍTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN 37

3.1 Morfometría de picaflores del género Aglaeactis . . . . . . . . . 37
3.2 Extracción de ADN (Calidad / concentración) . . . . . . . . . . . 45
3.3 Amplificación de fragmentos del gen CHD1 . . . . . . . . . . . . 49
3.4 Alineamiento de la secuencia de CHD­1Z . . . . . . . . . . . . . . 57
3.5 Correlación entre datos morfométricos y sexado molecular . . . 58
3.6 DISCUSIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

CONCLUSIONES 67

RECOMENDACIONES 69

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 70
ÍNDICE DE ANEXOS 75
Anexo A: Aspectos de bioseguridad durante la colecta de muestra . 75
Anexo B: Protocolo de Extracción de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Anexo C: Geles de Electroforesis ­ Amplificacion del gen CHD­1 . . . 78
Anexo E: Secuenciamiento de fragmentos del gen CHD­1Z . . . . . . 79
Anexo D: Datos usados para el análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
Anexo E: Imágenes del procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
Anexo F: Permisos de Investigación y Comité de Ética . . . . . . . . 86
 LISTA DE TABLAS

Tabla N° 1 Métodos moleculares para identificación sexual en aves. . 15

Tabla N° 2 Ubicación de redes de neblina en la estacion YANA (Y) . . 23
Tabla N° 3 Ubicación de redes de neblina en la estacion POLY (P) . . 24
Tabla N° 4 Ubicación de redes de neblina en la estacion QUELLO (Q) 25
Tabla N° 5 Concentración de stock y final de la PCR con PlatinumTM
Taq DNA Polymerise (InvitrogenTM) . . . . . . . . . . . . . 33
Tabla N° 6 Cebadores usados en PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Tabla N° 7 Protocolo PCR Touchdown modificado . . . . . . . . . . . 35
Tabla N° 8 Datos cualitativos de carácter reproductivo . . . . . . . . . 38
Tabla N° 9 Datos cualitativos de muda . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Tabla N° 10 Datos de porcentaje de estrías . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Tabla N° 11 Comparación morfométrica por sexo en A. castelnaudii . . 41
Tabla N° 12 Comparación morfométrica para especies A. castelnaudii
con sexo no determinado (ND). . . . . . . . . . . . . . . . 41
Tabla N° 13 Comparación morfométrica en A. cupripennis . . . . . . . 43
Tabla N° 14 Comparación morfométrica para especiesA. cupripennis con
sexo no determinado (ND). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
Tabla N° 15 Datos por espectrofotometría en tejido sanguíneo . . . . . 46
Tabla N° 16 Datos por espectrofotometría en tejido de plumas . . . . . 47
Tabla N° 17 Datos promedio de cantidad y calidad del ADN extraído . . 48
Tabla N° 18 Ensayos de PCR y variación de temperatura de anillamien­
to por cada cebador en estudio . . . . . . . . . . . . . . . 49
Tabla N° 19 Ensayos de PCR en el cebador CHD­R/CHD­F . . . . . . 50
Tabla N° 20 Datos de amplificación por PCR del gen CHD­1 en A. cas­
telnaudii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Tabla N° 21 Datos de amplificación por PCR del gen CHD­1 en A. cu­
pripennis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
Tabla N° 22 Cantidad de amplificaciones efectivas en plumas y tejido
sanguíneo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
Tabla N° 23 Resultados de la prueba Mann–Whitney U en A. castelnau­
dii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Tabla N° 24 Resultados de la prueba Mann–Whitney U en A. cupripen­
nis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
Tabla N° 25 Datos usados en el análisis de datos morfométricos numé­
ricos para A. castelnaudii . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
Tabla N° 26 Datos usados en el análisis de datos morfométricos numé­
ricos para A. castelnaudii (parte 2) . . . . . . . . . . . . . . 81
Tabla N° 27 Datos usados en el análisis de datos morfométricos numé­
ricos para A. cupripennis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
 LISTA DE FIGURAS

Figura N° 1 Individuos de las especies A. castelnaudii y A. cupripennis

Aglaectis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Figura N° 2 Distribución de linajes de picaflores en América . . . . . . 5
Figura N° 3 Mapa de distribución de las especies A. cupripennis y A.
castelnaudii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Figura N° 4 Toma de datos de la medida de cordura alar en picaflores 8
Figura N° 5 Toma de datos de la medida de la cola en picaflores . . . 9
Figura N° 6 Toma de datos de la medida de pico ­ narina en picaflores 9
Figura N° 7 Visualización de estrías del pico de picaflores . . . . . . . 10
Figura N° 8 Estrategia de muda simple compleja com muda preforma­
tiva parcial en picaflores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Figura N° 9 Esquema de amplificación del gen CHD­1 en los cromo­
somas sexuales W y Z . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Figura N° 10 Cromo­dominio de CHD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Figura N° 11 Diagrama esquemático del cebador P2/P8 . . . . . . . . . 17
Figura N° 12 Representación esquemática de regiones del cebador . . 18
Figura N° 13 Eficiencia de los cebadores P2/P8 . . . . . . . . . . . . . 18
Figura N° 14 Mapa de ubicación de zona de estudio . . . . . . . . . . . 22
Figura N° 15 Mapa de ubicación de trampas en la estación YANA . . . 23
Figura N° 16 Mapa de ubicación de trampas en la estación Polylepis . 24
Figura N° 17 Mapa de ubicación de trampas en la estación Quellococha 25
Figura N° 18 Morfología de una pluma de vuelo típica . . . . . . . . . . 32
Figura N° 19 Diagrama de PCR Touchdown usado . . . . . . . . . . . . 34
Figura N° 20 Resultados del sexado molecular y datos de sexo no de­
terminado colectados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Figura N° 21 Ciclo de muda y edad estimada para individuos de ACG­
CU: A. cupripennis y AGCA: A. castelnaudii . . . . . . . . 40
Figura N° 22 Fotografías de A. castelnaudii . . . . . . . . . . . . . . . 42
Figura N° 23 Fotografías de A. cupripennis . . . . . . . . . . . . . . . . 44
Figura N° 24 Espectrofotometría en tejido de sanguíneo . . . . . . . . . 45
Figura N° 25 Espectrofotometría en tejido de plumas . . . . . . . . . . 47
Figura N° 26 Control de macho y hembra para A. castelnaudii . . . . . 51
Figura N° 27 Productos de TD­PCR de genes CHD­1 amplificado por 3
cebadores en agarosa 2 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
Figura N° 28 Análisis de productos amplificados con el cebador CHD­
F/CHR­r por TD­PCR, en agarosa 2 % (1) . . . . . . . . . 54
Figura N° 29 Análisis de productos amplificados con el cebador CHD­
F/CHR­r por TD­PCR, en agarosa 2 % (2). . . . . . . . . . 55
Figura N° 30 Diferenciación de hembras usando los genes CHD­1 . . . 55
Figura N° 31 Diagramas de caja de medias numéricas: Ala y cola en A.
castelnaudii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Figura N° 32 Diagramas de caja de medias numéricas: Pico Narinas y
culmen expuesto en A. castelnaudii . . . . . . . . . . . . 59
Figura N° 33 Diagramas de caja de medias numéricas: Tarso y peso en
A. castelnaudii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Figura N° 34 Diagramas de caja de medias numéricas: Ala y cola en A.
cupripennis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Figura N° 35 Diagramas de caja de medias numéricas: Ala y cola en A.
cupripennis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Figura N° 36 Diagramas de caja de medias numéricas: Ala y cola en A.
cupripennis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
Figura N° 37 Análisis de productos amplificados con el cebador CHD­
F/CHR­r por TD­PCR, en agarosa 2 % (3) . . . . . . . . . 78
Figura N° 38 Análisis de productos amplificados con el cebador CHD­
F/CHR­r por TD­PCR, en agarosa 2 % (4). . . . . . . . . . 78
Figura N° 39 Secuenciamiento del gen CHD­1Z . . . . . . . . . . . . . 79
Figura N° 40 Monitoreo en campo y toma de muestras. . . . . . . . . . 83
Figura N° 41 Extracción de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
Figura N° 42 PCR y visualización de Geles de Agarosa . . . . . . . . . 85
Figura N° 43 Equipo de trabajo de campo en Agosto 2019. . . . . . . . 86
Figura N° 44 Equipo de trabajo de laboratorio en Febrero del 2020. . . 86
 LISTA DE ABREVIATURAS

ABREVIATURAS

ADN : Ácido Desoxirribonucleico

ARN : Ácido Ribonucleico
CHD­1 : Gen Chromodomain Helicase Binding 1
CHD­
: Gen Chromodomain Helicase Binding 1 del cromosoma W (solo en
1W
hembras)
CHD­1Z : Gen Chromodomain Helicase Binding 1 del cromosoma Z
PCR : Polimerase Chain Reaction (Reacción en cadena de Polimerasa).
pb : Pares de bases
RFLP : Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción
RAPD : Polimorfismo de DNA amplificado al azar
BP : Brood Patch (Parche de incubación)
CP : Cloacal Protuberance (Protuberancia cloacal, generalmente dilatada
en machos en epoca de apareamiento)
 RESUMEN

El presente trabajo reporta el uso de herramientas moleculares para la identifica­

ción del sexo de dos especies de picaflores altoandinos monocromáticos Aglaeactis
castelnaudii (Endémica de Perú) y A. cupripennis) de Bosques de Polylepis sp. en
la Cordillera del Vilcanota, Cusco durante los meses de agosto a diciembre de los
años 2016­2019 mediante el gen de Cromo Helicasa de Unión al ADN (CHD­1). En
el caso de especies sin dimorfismo sexual (monomorfismo) la identificación del sexo
depende de los cromosomas sexuales. El gen CHD­1, se encuentra en ambos cro­
mosomas sexuales y su tamaño nos permite identificar el sexo en aves, obteniendo
2 bandas en el caso de las hembras y solo 1 banda en los machos observadas por
electroforesis. El objetivo del presente trabajo fue identificar el sexo de las especies
mencionadas mediante amplificación por PCR del gen CHD­1 a partir de muestras
de ADN extraídas de plumas rectrices y 0.2 ml de tejido sanguíneo por individuo.
De 81 aves capturadas temporalmente se obtuvieron 20 muestras de tejidos: 15
pares de muestras para Aglaeactis castelnaudii y 5 para Aglaeactis cupripennis.
Se utilizó los cebadores específicos P2 / P8 (Griffiths et al., 1998), 2550F / 2718R
(Fridolfsson & Ellegren, 1999) y CHD­F / CHD­R (Lee et al., 2010). Los fragmentos
obtenidos del gen CHD­1Z (machos) fueron secuenciados haciendo uso de la téc­
nica de Sanger. Además, se evaluó la influencia de los datos cualitativos (indices
de edades y reproducción) sobre el sexado molecular y se realizo un análisis de
hipótesis con la prueba no paramétrica de Mann–Whitney U para analizar os da­
tos morfométricos. La extracción de ADN de muestra de tejido sanguíneo fue mas
eficiente tanto en índices de calidad (260/280, entre 1.9 ­ 2.1) y cantidad de ADN
disponible de 141­4070 ng/µl frente a plumas (1.51 ­ 2.03 y 4­174 ng/µl respecti­
vamente). En PCR, el cebador CHD1F / CHD1R, fue mas productivo respecto a la
claridad y la diferencia de de tamaño de las bandas generadas por electroforesis
(aprox. 300 pb), siendo aproximadamente 650 pb en CHD­1Z (machos) y 350 pb
en CHD­1W (hembras) observadas en gel de agarosa al 2 %. Se diferenció 12 ma­
chos y 3 hembras de la especie A. castelnaudii junto a 4 machos y 1 hembra de
la especie A. cupripennis. El secuenciamiento de los fragmentos del gen CHD­1Z
(machos) dieron como resultado secuencias de 695 y 697 pares de bases para A.
castelnaudii y A. cupripennis respectivamente. En la evaluación morfométrica no se
encontró influencia en los datos cualitativas, en las pruebas de hipótesis los valores
obtenidos no fueron estadísticamente significativos, por lo que no se encontró dife­
rencia en los valores morfométricos numéricos y el sexo de las aves. El gen CHD­1
permitió la identificación del sexo de los picaflores de ambas especies estudiadas
a través de la amplificación por PCR en muestras de tejido sanguíneo.
Palabras clave: Andes, Aglaeactis, CHD­1, CHD­F / CHD­R, sexado molecular.

i
 INTRODUCCIÓN

Perú posee 122 especies de las 338 picaflores existentes (Plenge, 2022). Estos
tuvieron una diversificación masiva luego de su llegada a Sudamérica hace 22 mi­
llones de años gracias a la formación de los Andes que impulsó el proceso de
especiación, concluyendo con aproximadamente 140 especies adaptadas exclusi­
vamente a la vida Altoandina (McGuire et al., 2014). Este grupo en particular formó
dos clados importantes en la vertiente de los Andes: Coquetas y Brillantes (McGui­
re, Witt, Remsen, Dudley, & Altshuler, 2009), ambos están presentes en la región
de Cusco.
El dimorfismo sexual en animales es definido como la diferencia en formas, colo­
ración (dicromatismo) o tamaño entre machos y hembras de una misma especie,
ya que la expresión de estos caracteres son un conjunto de aspectos que juegan
un papel fundamental para garantizar el éxito en los procesos de apareamiento
(Matta Camacho, Ramírez Martín, Zúñiga Díaz, & Vera, 2009). Varias de estas es­
pecies de picaflores presentan un dicromatismo y dimorfismo sexual marcado, con
machos llamativos y hembras pálidas, pero aun así, al igual que casi la mitad de
especies de aves existentes, son monocromáticas (Fogden, Williamson, & Taylor,
2014). Debido a esta limitante en la diferenciación dificultan el reconocimiento del
sexo de algunas especies de aves en monitoreos ecológicos personalizados como
el anillamiento (Russell & Russell, 2019).
El sistema cromosómico de las aves es inverso al de los mamíferos, donde las
hembras son heterogaméticas (cromosomas sexuales W y Z) y los machos son
homogaméticos (2 copias del cromosoma Z). El gen CHD1 (“cromo­helicasa­región
de unión al DNA” ) se encuentra ligado a ambos cromosomas sexuales en las aves y
debido a la variación de la longitud del intrón, donde el fragmento del cromosoma Z
(CHD1­Z) suele ser de mayor tamaño que el fragmento del cromosoma W (CHD1­
W), es posible identificar el sexo de las aves a través del uso de protocolos de
biología molecular.
Esta investigación tuvo como objetivo el uso de técnicas de amplificación del gen
CHD1 mediante PCR para identificar el sexo de picaflores monocromáticos de las
especies A. castelnaudii y A. cupripennis a través del la amplificación del gen CHD1
en muestras de tejido sanguíneo y plumas de individuos colectados temporalmente
en el periodo comprendido entre agosto a diciembre de los años 2016­2019.

ii
 PLANTEAMIENTO DE PROBLEMA

El desconocimiento del sexo en algunas especies de aves, puede tener conse­

cuencias importantes para estudios ecológicos o poblacionales como: estudios en
comportamiento, genética, evolución (Ellegren, 1996a), nicho ecológico, estructura
poblacional como la diferencias en su tasa de desarrollo y susceptibilidad a enfer­
medades (Ellegren & Sheldon, 1997), así como su tasas de reproducción en hábi­
tat fragmentados afectados por el cambio climático (Montalti, Kopij, & Maragliano,
2004).
Durante las tres ultimas décadas, la técnica de PCR es la más usada para el sexado
molecular en aves silvestres, generalmente durante colecta de muestras durante
monitoreos ecológicos con marcaje, es decir de cuando se involucra un estudio per­
sonalizado del individuo (Harvey, Bonter, Stenzler, & Lovette, 2006). Permitiendo
priorizar características únicas de cada especie, estadios de vida (especialmente
periodos de reproducción) y detectar las diferencias sexuales (en mucho casos di­
morfismo sexual o como en este estudio el monomorfismo de color). La bibliografía
en el uso de esta técnica es escasa tanto en el contexto académico nacional, solo
un estudio en aves en cautiverio (Liza, Maturrano, & Rosadio, 2008), como en la
familia Trochilidae (Hagadorn, Tell, Drazenovich, & Ernest, 2016; Shibuya, 2016;
Shibuya, Presti, Lopes, Mota, & Roper, 2018).
La problemática que abordamos en este estudio se centra en aplicar las herramien­
tas de biología molecular para aislar y amplificar el genes CHD­1 complementado
con protocolos de monitoreo en campo para que apoyados a la tecnología disponi­
ble aportemos al conocimiento científico sobre el sexado de las especies de pica­
flores monomórficos en estudio que dependen de hábitat en constante degradación
como los bosques de Polylepis sp.
Por lo expuesto se plantearon las siguientes preguntas:

1. ¿Es posible identificar el sexo de los picaflores altoandinos usando técnicas

moleculares que aíslen y ampliquen el gen CHD­1?

2. ¿Existirá correlación entre el sexado molecular y las características morfomé­

tricas (obtenidas en campo)?

iii
 JUSTIFICACIÓN

El Perú es el octavo país mas biodiversidad del mundo, se calcula que posee al­
rededor de 25,000 especies de animales, de los cuales el 22 % son endémicas
(CONCYTEC, 2016). En cuanto al grupo de las aves, el país posee 1,884 espe­
cies, incluyendo a 122 especies de las 338 especies de picaflores (Trochilidae)
existentes en América y en el mundo (Plenge, 2022).
En estudios de ecología no disponer de la información del sexo de los individuos
puede conllevar a tener información inexacta de la estructural poblacional de las
especies monitoreadas (Matta Camacho et al., 2009), es por eso que el uso de
técnicas modernas como la PCR para poder aislar genes específicos como el gen
CHD­1 para identificar el sexo de aves monocromáticas es esencial para aportar
mayor información de los individuos en estudio. Además que contribuye a la línea de
investigación de Prospección de Biodiversidad, aportando al inventario de recursos
genéticos para el conocimiento científico en la Región del Cusco y Perú.
Esta contribución puede generar nuevas propuestas de investigación y enriquecer
las políticas de conservación en hábitats en los que se encuentren distribuidos al­
gunas de estas especies endémicas y aquellas que se encuentren en peligro de
extinción.

iv
 OBJETIVOS

Objetivo General

Identificar el sexo de picaflores neotropicales altoandinos monocromáticos de las

especies A. castelnaudii y A. cupripennis de Bosques de Polylepis en la Cordillera
del Vilcanota en Cusco, mediante los genes CHD­1.

Objetivos Específicos

1. Extraer y purificar ADN genómico a partir de tejido sanguíneo y plumas.

2. Amplificar los genes CHD­1 en las hembras y machos por PCR.

3. Secuenciar los fragmentos de genes CHD­1Z de machos.

4. Evaluar por medio de una prueba de hipótesis entre los datos obtenidos por
el sexado molecular y los datos morfométricos de las especies A. castelnaudii
y A. cupripennis.

v
 HIPÓTESIS

Los genes CHD­1 permiten la identificación sexual en picaflores monocromáticos

neotropicales altoandinos de las especies A. castelnaudii y A. cupripennis.

vi
 CAPÍTULO I: GENERALIDADES

1.1 ANTECEDENTES

Ellegren (1996a) en Suecia, describieron el gen homólogo descrito en gallinas con

el gen CHD de ratones, el cual codifica una proteína envuelta en la regulación glo­
bal de la activación transcripcional en el nivel cromático. Además determinaron la
existencia de dos copias genómicas, una de ellas (denominada CHD­W) ubicada
en el cromosoma W en todas las especies no­ratites (aves voladoras, excluyendo
a avestruces, emúes, casuarios, ñandúes, kiwis y tinamúes). Además se desarrolló
un sistema de flanqueo de intrones en el Papamoscas acollarado (Ficedula albico­
llis), pero aún no se disponía de un conjunto de cebadores conservados aplicables
a linajes divergentes.
Kahn, St. John, & Quinn (1998) en Estados Unidos, reportaron los posibles intro­
nes que intervienen entre CHD Helicasa y las regiones de unión del ADN (ADN­
binding). Demostraron la eficacia de la amplificación por PCR en varias taxas de
aves, usando electroforesis al 2 % para reportar las bandas obtenidas. Además re­
comienda el uso de estas técnicas por su rapidez y estandarización en laboratorios
para identificar el sexo de las aves de interés.
Harvey et al. (2006) en Estados Unidos, realizaron una comparación en la determi­
nación del sexo en muestras de plumas y tejido sanguíneo de Carboneros de Capa
Negra (Poecilia atricapilla), comprobó la eficacia de la amplificación de los fragmen­
tos de CHD­1 haciendo uso de los cebadores P2­P8 tanto para tejido sanguíneo
como para plumas. Además describe la necesidad de implementar una corrección
a los protocolos de laboratorio cuando se usan plumas como fuente de tejido de
ADN y discuten los posibles errores que puede generar usar tejido queratinizado,
demostrando que puede ser una fuente confiable de ADN para estudios genéticos
en la especie estudiada.
Wang et al. (2007) en Taiwán, comprobaron la utilidad del protocolo de sexaje mo­
lecular y comparando con practicas de necropsia y endoscopia en 73 especies de
aves (abarcando 19 familias) presentes en el Zoológico de Taipei. Reporto una falla
en algunas especies haciendo uso del cebador 1237L/1272H debido a la posible
existencia de diversidad genética y un éxito del 73 % de especies usando el ceba­
dor 2550F/2718R. Además discute que la repetida riqueza en secuencias de G/C
en el cromosoma W (CHD­1W) en especies como el Kiwi, puede provocar el uso
de otros medios como geles de poliacrilamida para poder detectar las bandas y
recomienda que debido a la diversidad genética asumida es necesario investigar
nuevos marcadores genéticos para otras especies candidatas.

1
Lee et al. (2010) en Taiwan, utilizaron la técnica molecular de PCR para amplificar
el gen CHD en 144 muestras de 53 especies de varias familias de aves. Además
de utilizar el cebador P2/P8, diseñaron los cebadores CHD­1R/CHD­1F. Este nuevo
par de cebadores produce una diferencia entre las bandas W y Z de mayor tamaño
siendo mas sensible a ser detectados por electroforesis en geles de agarosa. Todas
las especies que fueron evaluadas fueron sexadas exitosamente y el protocolo fue
recomendado como un método universal para el sexado otras aves.
Liu, Li, Yang, & Cai (2011) en China, utilizaron la técnica molecular de PCR para
ampliar fragmentos específicos del gen CHD­1 utilizando varios cebadores diseña­
dos a partir de Ellegren (1991) como el P2/P3 y P4/P5 en varias especies de Grúas
hembras (Balearica pavonina, Grus grus, Grus japonensis, Grus vipio, Grus leuco­
geranus, Anthropoides virgo y Grus nigricollis), siendo productiva para la identifica­
ción sexual de este grupo de aves. Además reportaron un árbol filogenético de los
genes CHD en las Grúas y secuenció los fragmentos de CHD­1W (exclusivamente
en hembras).
Vucicevic et al. (2013) en Serbia, amplificaron el gen CHD en 248 muestras de va­
rios grupos de aves, haciendo uso de los cebadores 2550F/2718R y P2/P8. Com­
probaron la efectividad de estos cebadores en 50 de las 58 especies estudiadas.
Propusieron hasta 5 protocolos de laboratorio para aislar el gen CHD­1 y reco­
mendaron usar el gen CHD, por su alto grado de conservación, como identificador
universal del sexo en aves (con excepción de la ratites), contribuyendo al conoci­
miento científico de muchas especies.
Hagadorn et al. (2016) en Estados Unidos, realizaron técnicas de PCR utilizando
11 cebadores diferentes y además evaluaron el uso de fuentes de ADN invasivas
(tejido sanguíneo y tejido) y no invasivas (plumas) para determinar sexo de los
picaflores más comunes en Norte América: Calypte anna, Archilochus alexandri,
Selasphorus sasin, Selasphorus rufus y Calypte costae. Comprobaron que el ce­
bador P2/P8 fue el mas exitoso en todas las especies en comparación con otros
pares de cebadores evaluados y propone el uso de plumas como fuente de ADN.
Este es el primer estudio que se realiza en individuos de la familia Trochilidae.
Çakmak, Akın Pekşen, & Bilgin (2017) en Turquía, experimentaron con tres de
cebadores (CHD1F/CHD1R, 2550F/2718R y P2/P8) para identificar el sexo de 230
muestras de tejido de 77 especies (pertenecientes a 14 ordenes) de aves. Demos­
traron el éxito en todas las muestras haciendo uso de los cebadores CHD1F/CHD1R
y propone un protocolo de Touchdown PCR para la amplificación de los fragmentos
del gen CHD1. Recomendaron seguir usando los 3 pares de cebadores descritos
como método universal para el sexado de aves pero escoger el mas eficiente de­
pendiendo de la especie en la que se vaya a realizar el estudio.

2
Shibuya et al. (2018) en Piraquara, Brasil utilizaron tecnicas moleculares de PCR
para el sexado molecular de 110 individuos de 5 especies de picaflores monocromá­
ticos: Amazilia versicolor, Leucochloris albicollis, Colibri serrirostris, Florisuga fusca
y Eupetomena macroura, usando plumas y tejido saguíneo de individuos vivos co­
mo fuente de ADN y amplificandolo con los cebadores P2 y P8 (con fluorescencia)
y secuenciando los fragmentos generados. Encontraron fragmentos de genes de
2 tamaños: 374 pb en ambos sexos (cromosoma Z) y ambos de 379 ­ 383 pb en
hembras (cromosoma W). Recomienda el uso de estas técnicas moleculares para
monitoreos continuos que involucren el estudio individual en campo.
Liza et al. (2008) en Lima – Perú, utilizaron técnicas moleculares de PCR utilizando
los cebadores específicos P2/P8 y tejido sanguíneo como fuente de ADN para el
sexado molecular en cinco especies de guacamayos en cautiverio (Ara ararauna,
Ara chloroptera, Ara macao, Ara militaris y Propyrrhura couloni). Reportaron el éxito
en todas las muestras utilizadas, detectando dos fragmentos de 300­400 pares de
bases en hembras y solo uno en machos en gel de poliacrilamida.

1.2 MARCO TEÓRICO

1.2.1 Los picaflores altoandinos en Perú

Los picaflores (familia Trochilidae), son aves pequeñas con un particular mecanis­
mo de vuelo y metabolismo alto, destacados por sus colores llamativos e iridis­
centes (Calder, 2001), debido a la forma en que algunos pigmentos estructurales
(capas de queratina) en las plumas reflejan la luz del sol (Scott, 2010).
Perú posee 122 especies de los 338 picaflores existentes (Plenge, 2022), estos
tuvieron una diversificación masiva luego de su llegada a Sudamérica hace 22 mi­
llones de años, siendo la formación de los Andes lo que impulsó el proceso de
especiación, concluyendo con aproximadamente 140 especies adaptadas exclusi­
vamente al hábitat Andino (McGuire et al., 2014). La mayor parte de la diversidad
de colibríes andinos (>2000 metros de altitud) se divide en los clados Coquetas y
Brillantes (Bleiweiss, 1998; McGuire et al., 2009).

1.2.1.1 Picaflores altoandinos del género Aglaeactis

El genero Aglaeactis pertenece al clado de los Brillantes. Este grupo esta conforma­
do por 29 especies por linaje principal representado en la hibridación filogenética
del DNA, así como 49 especies taxonómicas.
El genero Aglaeactis solo posee 4 especies descritas: Aglaeactis cupripennis, A.
castelnaudii (ambas citadas en este estudio), A. aliciae y A. pamela (figura 1).

3
Figura N° 1: Individuos de las especies A. castelnaudii (izquierda) y A. cupripennis (derecha),
tomado de Schuchmann (1985).

• Fenotipo: como se describe en Schuchmann (1985), poseen un pico recto

y relativamente corto (20­24 mm), con un plumaje varía de leonado (oscuro)
en A. cupripennis, el representante con mayor distribución, a marrón­negro
en A. castelnaudii y A. aliciae en Perú a negro aterciopelado en A. pamela,
en Bolivia. Sin embargo, los colores de pigmento oscuro son menos típicos
de este complejo de especies que el brillo de las plumas de la espalda y
la rabadilla, incluidas las cobertoras superiores de la cola en casi todos los
colores del arco iris. Además, las alas son relativamente largas (80­90 mm),
lo que les permite ahorrar energía en el vuelo hacia adelante a pesar de su
alto peso corporal de 7 ­ 8.5 g, lo que los hace poseedores de la carga alar
más baja de todos los troquílidos 0,023 g/cm2. La diferencia en estadios de
vida pueden verse ligados a la iridiscencia de las plumas, siendo mas opacas
cuando son juveniles (hasta 1 año de vida) y mas llamativas y lustrosas en
adultos.

• Filogenia: los individuos del genero Aglaeactis, pertenecen al grupo de los

Brillantes. Este grupo evolucionó a partir de los ermitaños basales (subfamilia
Phaethornithinae) de tierras bajas a través del proceso de colonización en
Sudamérica, como se observa en la figura 2 y como se cita en Bleiweiss
(1998).

4
Figura N° 2: Distribución de linajes de picaflores en América, tomado de Bleiweiss (1998).

• Distribución: casi todos los individuos del genero Aglaeactis poseen un ran­
go restringido debido a barreras geográficas de los lugares que habitan, des­
de cuerpos de agua hasta montañas (Bleiweiss, 1998), en el caso de las
especies del genero Aglaeactis, están confinadas en gran medida a las la­

5
 deras orientales de los Andes (Schuchmann, 1985), esta restricción se ve
reflejada en el endemismo tanto para Peru por la especies Aglaeactis castel­
naudii (principal en este estudio) y Aglaeactis aliciae, como para Bolivia por
la especie Aglaeactis pamela. Estas tres especies tienen como predecesor a
Aglaeactis cupripennis (principal en este estudio) que se encuentra distribuido
por un amplio rango, desde Colombia, Ecuador y Perú.

Figura N° 3: Mapa de distribución de las especies A. cupripennis y A. castelnaudii. En la zona de

estudio se puede además se puede apreciar a la subespecie A. castelnaudii castelnaudii.
Elaborado con datos de Birdlife International, consultado en 2020

6
 • Ubicación taxonómica:, los picaflores en estudio se encuentra bajo la si­
guiente clasificación:
Reino : Animalia
Phylum : Chordata
Clase : Aves
Orden : Apodiformes
Familia : Trochilidae
Genero : Aglaeactis
Especie : A. cupripennis (Bourcier, 1843)
A. castelnaudii (Bourcier & Mulsant, 1848)

1.2.2 Morfometría en picaflores

Acorde al manual de anilladores de picaflores de Norte América (Russell & Russell,

2019), se utilizaron técnicas de medición estandarizadas para poder comparar los
datos posteriormente. Estas mediciones se realizan con instrumentos como bolsas
de tela. Entre las medidas tomadas, se describen a continuación:

• Medidas categóricas, que comprenden medias subjetivas durante la exami­

nación del ave y la experiencia del investigador.

1. Grasa: Es el porcentaje apreciable en las fosas pectorales del ave. Es

muy complicado apreciarlo debido al tamaño del ave. Se usa una escala
de 0: No presentaba grasa corporal, 1: vestigios en la zona pectoral, 2:
grasa en zona pectoral, cuello y partes de la espalda, 3: grasa en todo
el cuerpo.
2. Protuberancia cloacal (CP): en muchos picaflores, la región del orificio
cloacal se hincha durante la temporada de reproducción en los machos
y se extiende hacia afuera de manera notoria. Tanto los colibríes machos
como hembras tienen pequeñas protuberancias durante todo el año; da­
do que normalmente no hay una diferencia notoria entre los sexos, no
es necesario anotarlos ni medirlos. En el momento de la puesta de hue­
vos, las hembras a menudo muestran una hinchazón notable en el área
desnuda anterior a la cloaca y el huevo en sí puede ser bastante visible
inmediatamente antes de la puesta. Para medir el CP, se usa una es­
cala de 0: No presentaba CP, 1: CP aparente (protuberancia hinchada ­
convexa), 2: CP notorio, 3: CP hinchado ­ probablemente por deposición
de heces o por reproducción.
3. Parche de incubación (BP): es una modificación que sufren las aves
durante la época de incubación de huevos desarrollando un área sin

7
 plumas, engrosada y vascularizada en la superficie ventral. En picaflores
es aparente por una inflamación sutil o distinta del área abdominal que
puede estar asociada con el desarrollo del huevo. Para medir el BP se
usa una escala de 0: No presentaba BP, 1: BP aparente (hinchado), 2:
BP notorio (hinchado y rojo), 3: BP maduro, de apariencia a una bolsa
perdiendo liquido, 4: BP muy arrugado, apariencia de bolsa que perdió
todo el liquido.
4. Muda corporal: esta medida se colecta dependiendo de la presencia
activa de muda corporal en el cuerpo del ave (presencia de nuevas plu­
mas o capullos de nueva plumas). Para medirlo se usa una escala de 0
(sin muda aparente) a 5 (muda en todo el cuerpo).
5. Desgaste de plumas rémiges: este patrón sirve mucho para identificar
aves inmaduras. En este estudio solo tomamos en cuenta las plumas
rémiges de las plumas primaria (P10 a P8) usando una escala de 0 (plu­
mas gastadas, con cortes en forma de «v» en la punta) a 5 (Plumas
lustrosas y nuevas).

• Medidas numéricas: Comprenden medidas tomadas haciendo uso de ins­

trumentos como reglas, vernier calibrado al 0.1 cm y balanza gramera, se
describen a continuación:

1. Largo del ala: Esta medida también es conocida como «cordura alar» y
se toma desde la curvatura del ala plegada hasta la punta de la primaria
más larga (Figura 4). Con esta técnica se permite conocer el tamaño de
la pluma de vuelo primaria mas larga (P10).

Figura N° 4: Toma de datos de la medida de cordura alar en picaflores.

Manual de anillador de picaflores de Norte América (Russell & Russell, 2019)

2. Cola: Se obtiene a través del uso de la regla especial, deslizando entre

las dos rectrices centrales cerca de sus bases y lo más paralela posible
al plano de la pluma, luego se presiona ligeramente hacia el cuerpo hasta

8
 que se detiene como se observa en la figura 5 (a). No se mide la cola si
las rémiges más largas están muy gastadas, rotas, faltan o crecen.

Figura N° 5: Toma de datos de la medida de la cola en picaflores.

Manual de anillador de picaflores de Norte América (Russell & Russell, 2019)

3. Pico ­ narinas: La medida se toma haciendo uso de un vernier calibrado

al 0.1 cm. La medida se toma desde el borde frontal de las plumas en el
lado superior (dorsal) del pico superior (maxilar) hasta la punta del pico
(Figura 6). En el caso de aves con pico curvado, esta medida se realiza
tomando en cuenta la curvatura del pico.

Figura N° 6: Toma de datos de la medida de pico ­ narina en picaflores.

Manual de anillador de picaflores de Norte América (Russell & Russell, 2019)

4. Ancho del pico: similar a pico­narina, la medida se toma haciendo uso

de un vernier calibrado al 0.1 cm. Se toma como indicativo la parte mas
ancha de la base del pico para complementar la información colectada
por el largo del pico.
5. Tarso: la medida se toma haciendo uso de un vernier calibrado al 0.1
cm. Se toma como indicativo el largo del tarso (medida entre la rotula de
la pierna y la base de la pata).

9
 6. Masa corporal (peso): la medida se toma haciendo uso de una balanza
gramera de sensibilidad al 0.01 g y es de gran utilidad como indicador de
la condición fisiológica del picaflor cuando se usa en combinación con la
cuerda del ala.

1.2.3 Estimación de edad en picaflores

La estimación de la edad de picaflores es un tema que aun se viene estudiando

para utilizar un sistema global estandarizado. Se demostró que el uso del sistema
anual (Russell & Russell, 2019) en Estados Unidos y Canadá (hemisferio norte) no
puede compararse directamente con el Neotrópico (hemisferio sur), por lo que se
implemento el sistema WRP (Johnson & Wolfe, 2017; Wolfe, Ryder, & Pyle, 2010).
En este estudio usamos el sistema WRP basado en ciclos de muda y la presencia
de estrías para determinar la edad de las aves.

• Estrías: conocido también como «corrugaciones del pico», característica ex­

clusiva de los picaflores. Basado en la suposición de que los individuos ju­
veniles tienen finas ondulaciones que se extienden en diagonal a lo largo del
pico, como se cita en Russell & Russell (2019) y como se aprecia en la figura
7. Para medirlo se usa una escala porcentual, donde el individuo mas adulto
presenta un porcentaje cercano a 0 y opuestamente, en individuos juveniles
presenta cerca de un 100 %

Figura N° 7: Visualización de estrías del pico de picaflores.

(A) Estrías en individuos juveniles, (B) Estrías en individuos adultos.
Manual de anillador de picaflores de Norte América (Russell & Russell, 2019)

10
 • Sistema WRP, el ciclo de muda de un ave depende de su estrategia de muda,
la extensión de la muda y el plumaje de cada etapa de muda. Según Johnson
& Wolfe (2017), los picaflores probablemente pueden desarrollar un sistema
de muda con estrategia básica compleja con muda preformativa parcial (figura
8).

Figura N° 8: Estrategia de muda simple compleja con muda preformativa parcial en picaflores
Johnson & Wolfe (2017)

Las códigos de los ciclos de edad que este grupo de aves puede tomar son
los siguientes:

• FPJ ­ Polluelo, Muda prejuvenil (del termino en ingles: Prejuvenile molt).

• FCJ ­ Juvenil, Primera muda juvenil (First cycle prejuvenile).
• FPF ­ Juvenil, Primer ciclo de muda preformativo (First cycle preformati­
ve molt)
• FCF ­ Juvenil (casi adulto), Primer ciclo formativo (First cycle formative)
• SPB ­ Adulto, Segundo ciclo pre ­ básico (Second prebasic molt)
• DCB ­ Adulto, Ciclo básico definitivo (Definitive cycle basic)
• DPB ­ Adulto, Ciclo prebásico definitivo (Definitive prebasic molt)

La diferencia en años de adultos es complicada, por lo que la diferencia entre

SPB y DCB no es apreciable en campo sin métodos de marcaje, por lo que
se estandarizó el uso de DCB para individuos adultos en este estudio.

1.2.4 Monomorfismo y dimorfismo sexual en aves

Se define dimorfismo sexual a cualquier diferencia en tamaño, color, presencia y/o

ausencia de alguna estructura que provoque una diferencia apreciable entre los
sexos en las especies. El dimorfismo y monomorfismo sexual (término antagónico)
han evolucionado repetidamente el uno del otro, sugiriendo que las limitaciones
genéticas no son fuertes para desencadenar los procesos evolutivos (Price & Birch,
1996). En cuanto a las diferencias por color, la validez de este enfoque evolucionario
ha sido cuestionada en las últimas décadas, con la demostración de que muchas
especies de aves pueden ver longitudes de onda UV debido a la presencia de un

11
cuarto tipo de célula cónica en la retina que es receptiva a la luz UV (como se cita
en Eaton (2005).
En las aves, el monomorfismo y dimorfismo sexual son también expresado como
monocromatismo y dicromatismo sexual correspondientemente, cuando la diferen­
cia se basa en color o patrones de color del plumaje de los individuos, probablemen­
te debido a una consecuencia de la selección sexual. Primeramente, por mutacio­
nes en el cromosoma sexual y que al parecer la compensación de dosis parece no
ocurrir en aves. Y en segundo lugar, por que algunos genes autosómicos pueden
estar sujetos a una expresión limitada por sexo (la expresión de algunos colores en
el macho depende de la presencia de testosterona o de la ausencia de estrógeno).
Esta evolución en el dimorfismo sexual requiere no solo las presiones de selección
adecuadas sino también de variación genética suficiente, pudiendo concluir en la
presencia de rasgos rudimentarios de machos en hembras o viceversa (Price &
Birch, 1996).

1.2.5 Monocromatismo en aves

El monocromatismo, es un proceso marcado generalmente cuando el ave se en­

cuentra en los primeros estadios de su vida (recién eclosionado o como polluelo)
luego de algunas semanas es posible apreciar algunas características que los dife­
rencian como el tamaño (Dubiec & Zagalska­Neubauer, 2006). En muchos casos,
un eventual dicromatismo es apreciable entre el paso del estadio juvenil – adulto,
pero no es un factor determinando por lo que incluso hasta hoy en día un 60 % de
todos los Passeriformes (el orden más grande y diverso de las aves) son monocro­
máticas (Price & Birch, 1996). Además que la ausencia de diferencias apreciables
entre machos y hembras, provoca que su identificación en campo sea complicada
para los investigadores (Dubiec & Zagalska­Neubauer, 2006).

1.2.6 Sistema cromosómico sexual en aves

Es conocido que el sistema cromosómico de diferenciación sexual en aves se basa

en cromosomas autosómicos heterogaméticos, donde las hembras poseen un cro­
mosoma sexual Z y un segundo cromosoma sexual W y los machos poseen dos
copias del cromosoma sexual Z (figura 9. Gran parte del cromosoma W (al igual
que el cromosoma Y en mamíferos) presenta señales típicas de un cromosoma
sexual degenerado, debido a su bajo contenido de material genético codificante
(menos de veinte genes), rico en secuencias satélites similares a las encontradas
en la heterocromatina del centrómero, lo cual lo hace susceptible de cambios y mu­
taciones pues no está sujeta a una presión selectiva (Fridolfsson & Ellegren, 1999).
La presencia de gran cantidad de DNA no codificante es explicada por la acumu­
lación de mutaciones deletéreas o presencia de elementos transponibles. Por su

12
parte, el cromosoma Z (al igual que el cromosoma X en los mamíferos) es uno de
los cromosomas más conservados pues aún mantiene el mismo grupo de genes
codificantes, cerca de 350 genes (como se cita en Matta Camacho et al. (2009)).

Figura N° 9: Esquema de amplificación del gen CHD­1 en los cromosomas sexuales W y Z de aves
macho y hembra Purwaningrum et al. (2019)

1.2.7 Identificación sexual de las aves

La identificación del sexo, tiene una importancia grande en estudios de biología

evolutiva, ecología, identificación forense, genética de poblaciones, conservación,
así como en la planificación de la reproducción de especies amenazadas o para ha­
cer cumplir la legislación para proteger las especies de aves en peligro de extinción
(Lee et al., 2010; Matta Camacho et al., 2009).
Durante las últimas 3 décadas, se vienen implementando proyectos que prioricen
la identificación sexual en aves, de modo que se pueda estandarizar protocolos
aplicables a muchas especies de aves a nivel global.

13
1.2.7.1 Identificación sexual por herramientas no moleculares

a) Por hormonas y herramientas ecológicas. La mayoría son usados como

indicadores. Estos métodos pueden ser ecológicos como la observación del
comportamiento de búsqueda de alimento o la presión de la depredación, la
dispersión o patrones de migración, diferencias en morfométrica, la presencia
del parche de incubación (en inglés Brood patch, cuando las gónadas retro­
ceden) solo en temporadas de reproducción, o a través de intervenciones qui­
rúrgicas como el examen de las gónadas por laparotomía o laparoscopia, o
por exámenes de laboratorio como pruebas para detectar esteroides fecales
(proporciones más altas de estrógenos en aquellas muestras provenientes
de las hembras) siendo todos los resultados afectados por la edad del ani­
mal y la época de captura (Begović et al., 2017; Çakmak et al., 2017; Dubiec
& Zagalska­Neubauer, 2006; Khaerunnisa, Sari, Ulfah, Jakaria, & Sumantri,
2013; Matta Camacho et al., 2009)

a) Por Citogenética. Mediante el análisis de los cromosomas provenientes de

tejido sanguíneo (cultivo celular, 6­8 gotas de tejido sanguíneo equivalentes
a 0,4­0,5 µl). Esta metodología requiere tiempo para su estandarización, es
muy susceptible a contaminación y necesitan personal muy capacitado por la
complejidad del cariotipo de las aves, que tienen 40­126 cromosomas (Mat­
ta Camacho et al., 2009), además por el desconocimiento del tamaño de los
cromosomas sexuales en varios tipos de aves (Ellegren & Sheldon, 1997).

1.2.7.2 Identificación sexual por herramientas moleculares

Los protocolos moleculares propuestos fueron evolucionando en función a la dispo­

nibilidad de tecnología y costo de insumos permitiendo la detección y el diseño de
los cebadores novedosos, muchos de estos aún se siguen usando en la actualidad.
Las propuestas usadas se presentan en la tabla 1 de manera cronológica.

14
 Tabla N° 1: Métodos moleculares usados para identificar el sexo de aves.

TÉCNICA BASE LIMITACIONES REF

Haciendo uso de Técnicas Convencionales.

Polimorfismo
Compara los perfiles de Difícil automatización y
de longitud de
bandas, después de la la manipulación de
fragmentos de (1)
digestión por enzimas de material radiactivo para
restricción
restricción. su visualización
(RFLP).
Desarrollo de sondas de
Hiper variabilidad de
Análisis de ADN que son capaces de
los sitios de (1)
Minisatélites descubrir números grandes
hibridación.
de minisatélites.
Muestra a machos como
Análisis de heterocigotos y a las Tiempo y difícil
(1)
Microsatélites. hembras como homocigotas automatización.
según el número de bandas.

Haciendo uso de Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).

Baja reproducibilidad
Emplean cebadores cortos
por las condiciones de
(10 nucleótidos) de
Polimorfismo reacción y/o (1)
secuencia arbitraria para
de DNA competencia entre el (2)
generar huellas genéticas.
amplificado al ADN de diferentes (3)
Solo funciona en la especie (4)
azar (RAPD). fragmentos y aparición
de estudio (es una técnica
de bandas
muy específica).
inespecíficas (débiles).
Combinación de las técnicas
RFLP y PCR, siendo mas
reproducible, permite la
Polimorfismo
identificación de individuos,
de longitud de Requiere de personal
estimación de análisis de
fragmentos capacitado y mayor (1)
parentesco y en la
amplificados costo.
determinación del sexo en
(AFLP).
algunas aves. Esta técnica
contribuyó a la detección del
Gen CHD­1.
A través de la amplificación
Posibles alteraciones o
de intrones del gen CHD­W
Usando los polimorfismos debido (1)
en aves no ratites de
genes CHD­1. al tamaño de CHD­Z (5)
cualquier sexo y CHD­Z en
en hembras.
machos.

Referencias: (1) Matta Camacho et al. (2009); (2) Griffiths & Tiwari (1995); (3) Ellegren (1996b);
(4) Ellegren & Sheldon (1997); (5) Griffiths et al. (1998).

15
1.2.8 Genes CHD­1

Los genes CHD tienen un papel importante en la codificación de la regulación (con­

trol de la elongación) transcripcional a nivel de la cromatina (Ellegren, 1996b; Liu et
al., 2011) y en la remodelación de la cromatina (Griffiths & Korn, 1997; Simic et al.,
2003). Esta familia de genes se encuentran desde hongos (levaduras) hasta seres
humanos (Matta Camacho et al., 2009).
Existen 3 dominios en la proteína CHD1 (Chromo­Helicase/ATPase­DNA binding
protein, gráficamente en la figura 10): En primer dominio, Chromo, tiene una se­
cuencia similar que está representado en 2 familias de proteínas HPI y Polycomb
(expresión de genes y condensación de la cromatina), variando en cada familia de
aves. El segundo dominio, Helicasa/ATPase, es parte de una familia de proteínas
de múltiples funciones, siendo similar la SNF2 de los humanos, la cual activa la
transcripción por condensación de la cromatina. El último el dominio, DNA binding
que provee de una unión (>12pb) selectiva a dinucleótidos AT de doble cadena de
ADN vía interacción (como se cita en Griffiths & Korn (1997)).

Figura N° 10: Cromo­dominios presentes en la estructura de la proteína CHD Matta Camacho et al.
(2009)

El gen CHD1 contiene al menos dos intrones que difieren en longitud en los cro­
mosomas Z y W. Esto permite la discriminación entre los productos de los genes
CHD­Z y CHD­W en un gel, resultando en una detección exitosa cuando se tiene la
presencia de ambos genes en hembras (W, Z) y un par de genes Z en machos (Du­
biec & Zagalska­Neubauer, 2006). La amplificación y electroforesis del gen CHD
en ambos cromosomas sexuales es el método más usado para identificar el sexo
en casi todos los grupos de aves (Lee et al., 2010).

1.2.9 Cebadores para la detección del gen CHD­1 en aves

El primer gen CHD­W descrito fue encontrado en el cromosoma W y un segun­

do gen CHD1 (que llamaron CHD­Z) por su posible localización en el cromoso­
ma Z (Ellegren, 1996a). CHD­W estaba representando una secuencia conservada
inusualmente y estando presente en todas las aves de linajes mayores, sin incluir
las aves ratites.

16
Los primeros cebadores descritos para este propósito fueron los desarrollados por
Ellegren (1996b):

• P2 (5’­TCTGCATCGCTAAATCCTTT­3’)

• P3 (5’­AGATATTCCGGATCTGATAGTGA­3’)

Años más tarde usando secuenciamiento de clones ADNc se estimó el homólogo

de CHD de roedores en gallinas, se confirmó la presencia de ambos genes CHD­
W y CHD­Z en un solo organismo (hembras). El grado de homología entre el gen
CHD­W en gallinas y el ratón CHD (figura 11) fue de 83 % a nivel de nucleótidos y
96 % a nivel de aminoácidos, este extraordinario nivel de similaridad es debido a
que los linajes de aves y mamíferos divergieron hace más de 200 millones de años
(Ellegren & Sheldon, 1997), comprobando una vez más la diferenciación evolutiva
de los cromosomas sexuales en aves y mamíferos.
Además aportaron con el diseño de los siguientes cebadores:

• 2917F (5’­GTAGAAGAAGATATTCTTGA­3’)

• 3088R (5’­CCTCAGCACCAAACTTCAAA­3’)

Figura N° 11: Diagrama esquemático de la organización del gen CHD (en roedores) incluyendo la
posiciones de los cebadores usados para amplificar el gen CHD­W en gallinas (Ellegren, 1996b). La
línea representaba la parte del CHD­W de gallina secuenciado.

Kahn et al. (1998) uso los cebadores descritos previamente para el sexado de Fi­
cedula albicollis, proponiendo de igual manera otro par de cebadores:

• 1237L (5’­GAGAAACTGTGCAAAACAG­3’)

• 1272H (5’­TCCAGAATATCTTCTGCTCC­3’)

Para poder detectar la presencia del gen CHD1, necesitando de enzimas de res­
tricción para producir las amplificaciones. En su desarrollo se asumió que no existe
ningún producto de cromosoma Z (es decir, no tomaron en cuenta la existencia
de CHD­Z). La existencia de 2 genes CHD1 en aves fue problemático y ventajoso

17
desde el punto de vista de identificación sexual molecular (Fridolfsson & Ellegren,
1999). Por lo que Griffiths et al. (1998), mejoro su técnica garantizando la reprodu­
cibilidad a bajo costo bajo la amplificación de PCR sin necesidad de enzimas de
restricción para cortar selectivamente algunos fragmentos (figura 12) , probando
sus primer previamente descrito (P2­P3) en combinación con una serie de can­
didatos (P14, P9 y P8) considerando finalmente el par P2­P8 por su éxito en el
sexaje de 27 especies de varios ordenes de aves (figura 13), garantizando su uso
universal en aves no ratites.

• P2 (F) (5’­TCTGCATCGCTAAATCCTTT­3’)

• P8 (R) (5’­CTCCCAAGGATGAGRAAYTG­3’)

Figura N° 12: Representación esquemática de las regiones del gen CHD usando los cebadores
producidos por Kahn et al. (1998) tomando como referencia los cebadores P3­P2 Griffiths et al.
(1996).

Figura N° 13: Éxito de los cebadores P2­P8 a través de varias clases y especies de ave (Griffiths et
al., 1998)

El uso de estos cebadores daba como producto 2 bandas en el caso de los machos
con una diferencia muy corta de 10 a 80 pb (Jensen, Pernasetti, & Durrant, 2003),
que podían ser observados con dificultad en geles de agarosa, por lo que se reco­
mienda el uso de geles de poliacrilamida para la visualización de los fragmentos.

18
Un informe anterior indicó que la falta de sexo con precisión de algunas especies
utilizando el par de cebadores P2 ­ P8 se debió probablemente a polimorfismos en
el cromosoma Z (Dubiec & Zagalska­Neubauer, 2006).
Fridolfsson & Ellegren (1999) también proponen el uso de los cebadores 2550F­
2718R para la identificación sexual de aves.

• 2550F (5’­GTTACTGATTCGTCTACGAGA­3’)

• 3718R (5’­ATTGAAATGATCCAGTGCTTG­3’)

El uso de estos cebadores daban como producto fragmentos de ADN de 400­450

pb en el en el gen CHD1­W y 600­650 pb en el gen CHD1­Z. La comparación de
los individuos generalmente se daba por una diferencia de 150­250 pb (sólo en
hembras y cuando las bandas estaban separadas, Fridolfsson & Ellegren (1999).
El uso de estos cebadores garantizaban la visualización de las bandas de manera
estándar en geles de agarosa, a comparación con los primeros usados por Griffiths
et al. (1998), estos podían apreciarse sin necesidad de geles de poliacrilamida.
Por último, Lee et al. (2010) diseñó los cebadores CHD1F­CHD1R a partir de ali­
neamientos de secuencia de productos 2550F­2718R.

• CHD1F (5’­TATCGTCAGTTTCCTTTTCAGGT­3’)

• CHD1R (5’­CCTTTTATTGATCCATCAAGCCT­3’)

En el mayor de los casos, el tamaño del fragmento Z es mayor que el fragmento

W en las amplificaciones usando el conjunto de cebadores CHD1F ­ CHD1R, pero
se observa lo contrario en el caso de la amplificación P2 ­ P8 (Lee et al., 2010).
El uso de estos cebadores también garantizaban el éxito del sexaje, con bandas
separadas por cada gen CHD y su visualización en geles de agarosa haciendo uso
de métodos convencionales y económicos de laboratorio.

1.2.10 Limitantes del uso de cebadores para la detección del gen CHD­1 en
aves

El uso de las técnicas de detección del gen CHD­1 también tiene algunas limi­
taciones como la existencia de posibles errores en la interpretación de los datos
de tipificación sexual, como el polimorfismo en el cromosoma Z y la formación de
moléculas de ADN heteroduplex, pudiendo ser necesario realizar análisis de frag­
mentos adicionales (electroforesis capilar) aumentando así los costos asociados
con el procedimiento (Çakmak et al., 2017; Shibuya et al., 2018).

19
 CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 ÁREA DE ESTUDIO

El estudio se llevo a cabo en los Bosques de Yanacocha y Quellococha (figura 14).

El monitoreo se llevo a cabo a través de Estaciones de monitoreo: YANA (Mapa en
figura 15 y tabla 2) y POLY (Mapa en figura 16 y tabla 3) en el Bosque de Polylepis
de Yanacocha y QELLO (Mapa en figura 17 y tabla 4) en el Bosques de Polylepis
de Quellococha de la Localidad de Yanacocha.

2.1.1 Ubicación política y geográfica

Localidad de Yanacocha, Centro Poblado de Huayoccari (­13.285592, ­72.049514),

Distrito de Huayllabamba, Provincia de Urubamba, Región Cusco.

2.1.2 Accesibilidad

El acceso fue por la carretera asfaltada Cusco – Urubamba, con un desvío al pueblo
de Huayocari seguido de una caminata de aproximadamente cinco horas (aproxi­
madamente 10 km) hasta llegar a la laguna y bosque de Yanacocha.

2.1.3 Descripción del área

Los Bosques de Yanacocha y Quellococha son parte de los 10 bosques de Polyle­

pis sp. de la provincia de Urubamba y de la cordillera del río Vilcanota. Yanacocha
sobresale de todos ellos por ser el de mayor punto de biodiversidad (Servat, Men­
doza, & Ochoa, 2002), siendo el más rico en variedades de aves frente similares
como Pumahuanca, Mantanay y Huilloc (Lloyd & Marsden, 2008).

2.1.4 Características ecológicas

• Altitud: Los bosques se encuentran en na gradiente del Valle sagrado o valle

del Vilcanota y comprenden entre 3950 a 4100 metros de altitud.

• Recursos Hidricos: Posee lagunas (cochas) que tiene origen glacial, estas
están rodeadas de los bosques de Polylepis (en general P. subsericans) de
distribución simpatrica a través de a gradiente altitudinal (Galiano, 1990).

• Exposición Solar: Posee condiciones naturales de exposición solar alta y

ventosidad abundante, debido a las pequeñas quebradas secundaria a lo lar­
go del territorio (Galiano, 1990).

20
• Ecosistema: Basado en el Mapa de Ecosistemas (MINAM, 2019), la zona
de estudio se encuentra dentro de la categorización de «Bosque relicto al­
toandino (Queñoal y otros)». Este ecosistema forestal está constituido por
bosque relicto altoandino dominado por asociaciones de «queñua» (Polyle­
pis),que se extienden por más de 0,5 hectáreas, con árboles de una altura
superior a 2 metros y una cubierta del suelo superior al 10 %; comúnmente
restringidos a laderas rocosas o quebradas; distribución actual en parches o
islas de vegetación.

21
Figura N° 14: Mapa de ubicación de la zona de estudio [Mapa computarizado]. Escala variable.
Cartas nacionales SIGMED ­ MINEDU, Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco.
Diseñado en QGIS [Software SIG]. Versión 3.24 ­ Tisler.

22
Ubicación de la estación YANA:

Figura N° 15: Mapa de ubicación de redes de neblina de la estación Yanacocha [Mapa

computarizado]. 1:2000. Cartas nacionales SIGMED ­ MINEDU, Universidad Nacional de San
Antonio Abad del Cusco. Diseñado en QGIS [Software SIG]. Versión 3.24 ­ Tisler

Tabla N° 2: Ubicación de redes de neblina en la estacion YANA (Y)

CÓDIGO LONGITUD LATITUD ALTITUD (m)

ST02 ­13.286955021 ­72.050131978 3937.9
Y01 ­13.287333967 ­72.050126027 3943
Y02 ­13.286841027 ­72.050114963 3940.9
Y03 ­13.28677699 ­72.050012033 3941.8
Y04 ­13.286903976 ­72.049974985 3940.6
Y05 ­13.286652016 ­72.050004993 3942.9
Y06 ­13.286515977 ­72.050004993 3944.8
Y07 ­13.287435975 ­72.049880018 3939.2
Y08 ­13.287481992 ­72.049949002 3937.9
Y09 ­13.287652982 ­72.04988597 3937.7
Y10 ­13.287723977 ­72.049961993 3937.6
Y11 ­13.287737975 ­72.050056038 3936.8
Y12 ­13.28783202 ­72.049950007 3932.9
Y13 ­13.287940985 ­72.05024899 3922.6
Y14 ­13.288049027 ­72.050229963 3917.7
Y15 ­13.288200991 ­72.050108006 3914.2

23
Ubicación de la estación POLY:

Figura N° 16: Mapa de ubicación de redes de neblina de la estación POLY [Mapa computarizado].
1:2000. Cartas nacionales SIGMED ­ MINEDU, Universidad Nacional de San Antonio Abad del
Cusco. Diseñado en QGIS [Software SIG]. Versión 3.24 ­ Tisler

Tabla N° 3: Ubicación de redes de neblina en la estacion POLY (P)

CÓDIGO LONGITUD LATITUD ALTITUD (m)

ST01 ­13.287675203 ­72.050518428 3854.5
P01 ­13.289664974 ­72.051519016 3855.5
P02 ­13.289578976 ­72.051463025 3856.6
P03 ­13.289494989 ­72.051388007 3858.2
P04 ­13.289460037 ­72.051210981 3854.8
P05 ­13.289317964 ­72.050989028 3858.3
P06 ­13.289301032 ­72.051110985 3859.2
P07 ­13.289150996 ­72.050977964 3860.8
P08 ­13.28849704 ­72.051064968 3880.1
P09 ­13.288430991 ­72.050987016 3881.6
P10 ­13.288386986 ­72.050873023 3884.1
P11 ­13.288157992 ­72.050623996 3889.7
P12 ­13.288100995 ­72.050596001 3891.5
P13 ­13.288257988 ­72.05047396 3888.5
P14 ­13.288474996 ­72.050419981 3881
P15 ­13.28857298 ­72.050453005 3878.6

24
Ubicación de la estación QUELLO:

Figura N° 17: Mapa de ubicación de redes de neblina de la estación QUELLO [Mapa

computarizado]. 1:2000. Cartas nacionales SIGMED ­ MINEDU, Universidad Nacional de San
Antonio Abad del Cusco. Diseñado en QGIS [Software SIG]. Versión 3.24 ­ Tisler

Tabla N° 4: Ubicación de redes de neblina en la estacion QUELLO (Q)

CÓDIGO LONGITUD LATITUD ALTITUD (m)

STA03 ­13.280374886 ­72.051445956 4085.2
Q01 ­13.280704971 ­72.051613983 4086.2
Q02 ­13.280694997 ­72.051547011 4086.7
Q03 ­13.280589972 ­72.051517004 4089.3
Q04 ­13.280138019 ­72.050705971 4111.3
Q05 ­13.280057972 ­72.050685016 4110.6
Q06 ­13.280049004 ­72.050522994 4112.9
Q07 ­13.279768964 ­72.050832035 4112.3
Q08 ­13.279737029 ­72.050712006 4113.6
Q09 ­13.279162031 ­72.05118902 4122
Q10 ­13.279092964 ­72.051152978 4124.5
Q11 ­13.279013 ­72.051112996 4126.5

25
2.2 MATERIALES

2.2.1 Material biológico

• Picaflores del género Aglaeactis (captura temporal, sin sacrificio)

• Tejido sanguineo (0.2 ­0.3 mL, aproximadamente 2 gotas) por individuo.

• 2 Plumas rectrices por individuo.

2.2.2 Materiales de campo ­ monitoreo ecológico

• 10 Redes de Neblina (12 × 2.5 × 0.038 m).

• 40 Tubos de Aluminio (para la instalación de Redes de Neblina).

• 2 kg de Driza.

• 15 Bolsas de Tela.

• Equipo de Anillamiento (1 Vernier, 1 Balanza de Bolsillo, 1 Regla especial

para medir alas, ficha de anillamiento).

• 1 par de binoculares 10x42.

• Guía de identificación “Aves del Perú”.

• GPS Garmin 64s.

• Cámara fotográfica.

2.2.3 Materiales para colecta de muestras genéticas

• Algodón esteril

• Etanol 70° (Portugal®)

• Capilares estériles, sin heparina (VITREX®)

• Aguja Hipodérmica número 20 (ALMEDP®)

• 12 Carta de colección de muestras de sangre (Macherey Nagel®)

• 100 unidades de sobres de papel bond (12x19cm)

• Sílica Gel (Genérica)

• Polvo comercial coagulante para gallinas (Quick Stop®)

• Bolsas hermeticas (Ziploc®)

26
2.2.4 Material de laboratorio

• Espectrofotómetro NanoDropTM 2000 (ThermoScientific®)

• Vortex (ThermoScientific®)

• Termociclador ­ Applied Biosystems Pro­Flex PCR System (Thermo Fisher

Scientific®)

• Cubeta de electroforesis 80 V ­ PowerPacTM 300 (Bio Rad®)

2.2.5 Reactivos e insumos

• Proteinasa K (ThermoScientific®)

• dNTP (ThermoScientific®)

• Proteinasa K (ThermoScientific®)

• dNTP (ThermoScientific®)

• Kit PlatinumTM Taq DNA Polymerase (InvitrogenTM®)

• 1Kb Plus DNA Ladder (InvitrogenTM®)

• GelRedTM (Biotium®)

• Gel de Agarosa (Avati®)

• Tris NH4Cl

• RNAasa 10 mg/ml (ThermoScientific®)

• Solución Salina al 0.85 %

• Solución de Lísis Celular de Madisen

• Fenol : Cloroformo : Alcohol Isoamílico (25:24:1)

• Cloroformo : Alcohol Isoamiílico (24:1)

• Acetato de Amonio 7.5 M

• High TE (10 ml Tris HCl pH 8.0 1 M y 8 ml EDTA 0.5 M)

• Low TE (0.5 ml Tris HCl pH 8.0 1 M y 0.4 ml EDTA 0.5 M)

27
2.3 METODOLOGÍA

2.3.1 Captura temporal de aves

El monitoreo ecológico fue llevado a cabo según el manual de Anillamiento de Pi­

caflores de Norte América (Russell & Russell, 2019). En el periodo de estudio se
realizó entre los meses de Agosto a Diciembre de los años 2016 ­2019, bajo los
permisos de investigación otorgados por SERFOR (adjunto en ANEXOS).
El protocolo se llevó a cabo de la siguiente manera:

1. Definición de estaciones de estudio: Haciendo uso de trampas de redes de

neblina, se ubicaron en 3 estaciones de estudio: POLY, YANA y QUELLO. La
ubicación estuvo de acuerdo a la composición floral adyacente, la incidencia
solar y por observación previa con una distancia de 100 metros cercanos
a los parches de Polylepis, dividiendo cada estación en 10 a 15 puntos de
monitoreo, con esfuerzo de captura: 10 horas (red/mes) con un total de 50
horas (red/mes) durante todo el proyecto de investigación.

2. Revisión de trampas y colecta de individuos: Una vez abiertas las tram­

pas, se revisaron cada 20 – 30 minutos, con mayor esfuerzo durante las 10:00
– 13:00 horas por el aumento de radiación solar. En cada revisión se recogie­
ron las aves que cayeron en las redes usando el método de agarre de cuerpo
completo (del termino en ingles: body grasp technique como se cita en Rus­
sell & Russell (2019) y Johnson & Wolfe (2017), se almacenaron en bolsas
de tela oscuras y se trasladaron a la estación para su revisión.

3. Identificación de aves capturadas: Las aves capturadas fueron revisadas

en orden de llegada, priorizando a picaflores por su alto metabolismo. Las
aves fueron identificadas con el libro de Aves del Perú (Schulenberg, Stotz,
Lane, O’Neill, & Parker III, 2010) y posteriormente clasificadas de acuerdo
con el sistema taxonómico actual (Plenge, 2022).
Según Schulenberg et al. (2010) y Schuchmann (1985) se identificó a la aves
haciendo uso de las diferencias taxonómicas fenotípicas relacionadas al color
y la distribución de las plumas de los individuos. En el caso de A. castelnaudii
siempre presenta mechones de plumas plumas blancas en la zona pectoral ,
con abdomen y cola rojiza oscuro. En cambio, A. cupripennis tiene un plumaje
mas sencillo con mechones pectorales de un matiz rojizo claro, así como la
iridiscencia notable de una gama de colores parecidos a un arco iris en la
espalda.

4. Obtención de datos morfométricos: Se registraron las siguientes datos,

según los protocolos estandarizados de la guía de anillamiento de picaflores

28
 de Norte América (Russell & Russell, 2019):

a) Fecha y Hora de captura (formato dd/mm/aaaa y 24h)

b) Nombre de la especie
c) Grasa corporal
d) Estrías o corrugaciones del pico (conocidas también como estrías), solo
en picaflores
e) Sexo (en general: macho, hembra. Para picaflores en objetivo: desco­
nocido)
f ) valores categóricos (reproductivos)
• Parches de cría (ausencia, pérdida de plumas, o si se encuentra
vascularizada, arrugada, en muda, no visible o desconocida)
• Protuberancia cloacal (ninguna, pequeña, mediana, grande, no visi­
ble o desconocida)
g) Valores numéricos
• Culmen expuesto
• Longitud del pico
• Ancho del pico
• Peso del ave
• Longitud del ala (también conocida como cordura alar)
• Longitud de la cola (plumas rectrices)
• Longitud del tarso

Una vez terminada la revisión, si el ave no presentaba síntomas de estrés o

agotamiento se procedía con la toma de muestras para el análisis molecular,
caso contrario se liberaba el ave. Algunos de estos datos morfométricos fue­
ron usados como indicadores de dimorfismo sexual en estudios previos, de
estos resaltan el peso, la longitud de la cola y el tamaño del pico (como se
cita en Jensen et al. (2003)).

5. Revisión de patrones de muda y estimación de edad en aves: A la par de

la toma de datos morfométricos, se estimó la edad de las aves estudiadas a
través del uso del Sistema W­R­P (Wolfe et al., 2010), haciendo uso de las
estrías del pico y patrones de coloración o envejecimiento en el plumaje de los
picaflores. Fue importante la toma de esos datos para ayudar a comprender
algunos factores ecológicos en el grupo de los picaflores (Trochilidae) donde
requieren del 40 % de su metabolismo basal para poder concluir un ciclo de
muda (Shibuya et al., 2018). Es necesario remarcar algunas características
de la familia Trochilidae (picaflores) tal como se indica en Johnson & Wolfe
(2017).

29
 • La presencia de un patrón de muda con sustitución de las plumas en
sentido proximal a distal.
• La presencia de solo 5 pares de plumas rectrices (cola). Denotadas de
adentro hacia afuera y por el lado en el que se encuentra en base a la
orientación del cuerpo ave.

6. Colecta de muestras para estudios genéticos: Descrito ampliamente en la

siguiente sección 2.3.1.1. (Colecta de muestras para extracción de ADN en
tejido sanguíneo y plumas).

7. Liberación del individuo: Si el individuo no presento ningún síntoma de es­

trés, se liberó y se continuo con el siguiente individuo.

2.3.1.1 Colecta de muestras para extracción de ADN en tejido sanguíneo y

plumas

La colecta se realizó durante la colecta temporal de aves, siguiendo protocolos

de bioseguridad (ANEXO A) para evitar la contaminación cruzada y proteger al
investigador.

1. En plumas:
Este tipo de colecta es considerado como no invasivo y no es letal para los
individuos (Çakmak et al., 2017; Dubiec & Zagalska­Neubauer, 2006; Harvey
et al., 2006) y es usado muchas veces cuando se hacen estudios de especies
amenazadas o elusivas, pero teniendo de contra parte que pueden contener
muy poca calidad y cantidad de ADN para analizar (Horváth, Martínez­Cruz,
Negro, Kalmár, & Godoy, 2005).
Se colectó las plumas rectrices externas (R5R y R5L) por arranque, fueron
almacenadas en sobres de papel bond y guardadas en un lugar oscuro y seco
hasta su uso. Se utilizó silica en gel para garantizar la humedad nula en el
sobre de papel, lo que podría provocar que hongos y bacterias proliferen.

2. En tejido sanguíneo:
Este tipo de colecta puede ser letal o amenazar con la integridad de las aves,
por alguna lesión o estrés, siendo uno de los métodos más usado para es­
tudios genéticos en aves según Çakmak et al. (2017), debido a que la tejido
sanguíneo de las aves poseen eritrocitos nucleados que es utilizado como
principal fuente de ADN (Dubiec & Zagalska­Neubauer, 2006).
La colecta se realizó por una punción con una aguja hipodérmica número 20
en la vena tarsal (pata), debido al tamaño pequeño de los picaflores (Dubiec &

30
 Zagalska­Neubauer, 2006), considerando las medidas de bioseguridad des­
critas en el ANEXO A.
Se colectó el tejido sanguíneo haciendo uso de un tubo capilar estéril y sin
heparina, colectando menos de la mitad del capilar (aproximadamente 1 gota
(menos de 50 μl) y se impregnó en una carta de colecta de muestras sanguí­
neas Macherey Nagel®, estas son fabricadas con un tratamiento previo con
una solución conservadora, tampon de EDTA y que frecuentemente es usado
para análisis forenses humanos (Hagadorn et al., 2016; Shibuya et al., 2018).
Después de cada toma de muestra, se alimento al picaflor agua azucarada,
como se indica en la Guía de Anillamiento de Picaflores (Russell & Russell,
2019). Luego de este proceso, el individuo quedó en observación hasta que
se compruebe que puede reincorporarse a su entorno y posteriormente fue
liberado.
A pesar de que la colecta de muestras descritas previamente eran prioridad
de este trabajo de investigación, se supervisó constantemente la presencia
de signos de estrés, en el caso el animal se vea afectado por el proceso, este
fue liberado sin tomar estas muestras. Ningún animal fue sacrificado ni murió
durante este proyecto de investigación.

3. Almacenamiento de muestras:
Las muestras fueron almacenadas en el Laboratorio de Biología Molecular
y Genética de la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco
durante los meses de trabajo de campo, siendo almacenados a temperatu­
ra ambiente, en bolsas herméticas Ziploc® con sobres de silica en gel para
garantizar que la humedad sea mínima durante el tiempo.

4. Procesamiento de muestras:
Las muestras fueron procesadas en el Laboratório de Biodiversidade e
Evolução Molecular ­ Universidade Federal de Minas Gerais, Brasil, a
través de una pasantía de investigación coordinada durante el proceso de
este trabajo de investigación.

2.3.2 Preparación previa a la extracción de ADN

Este procedimiento se realiza de manera mecánica, recuperando el ADN depen­

diendo de su origen, se describe a continuación:

1. Para muestras de plumas:

Se realizaron cortes usando unas tijeras estériles independientes, priorizando
el posible coagulo de tejido sanguíneo del ombligo superior del cálamo (3 a

31
 5mm de largo del contorno final de la pluma mudada, como se cita en Horváth
et al. (2005), en la figura 18. También se usaron los agregados de la punta
basal para poder aprovechar el material genético que podría encontrarse ahí
(Begović et al., 2017; Dubiec & Zagalska­Neubauer, 2006).
Finalizado este proceso mecánico, se utilizaron tampones leves para limpiar y
posteriormente tratar la muestra para recuperar el ADN disponible y proceder
con su extracción.

Figura N° 18: (A) Detalles de la vista posterior de la base de la pluma, y (B) Sección longitudinal a
través del cálamo de la pluma. Dos áreas de muestreo diferentes son mostradas: (1) Punta basal
del cálamo y (2) coágulo del tejido sanguíneo del ombligo superior Horváth et al. (2005)

2. Para muestras de tejido sanguíneo:

Se realizaron cortes pequeños con tijeras estériles independientes al círcu­
lo marcado dentro de la carta de colección de muestras de tejido sanguíneo
(Macherey Nagel®), donde se colectaron las muestras sanguíneas. Finaliza­
do este proceso se procedió a la extracción del ADN.

2.3.3 Extracción de ADN

La extracción de ADN se realizó en el laboratorio de Biodiversidade e Evolução

Molecular (LBEM) ­ Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Brasil, con
medidas que garantizan la esterilidad de los materiales usados (irradiados perma­
nentemente por luz ultravioleta) así como la seguridad pertinente para realizar ex­
perimentos con biología molecular.
Se utilizó el método de Fenol – Cloroformo (Sambrook & Russell, 2001) con modi­
ficaciones, generando diluciones finales de 50 μl para la tejido sanguíneo y 20 μl
para plumas, a través de las siguientes etapas:

32
 1. Etapa de Limpieza y desintegración por lisis: haciendo uso de solución de
lisis de Madisen, tampones de soluciones salinas y Proteinasa K.

2. Etapa de re­suspención de ADN y precipitación: haciendo uso de Fenol:

Cloroformo:Alcohol isoamil (25:24:1) y Acetato de Amonio 7.5 M.

3. Etapa de recuperación y dilución del DNA: haciendo uso de etanol a 4°C

y TE.

El protocolo ampliado puede apreciarse en el ANEXO B. La calidad del ADN aisla­

do se midió independientemente por espectrofotometría (NanoDropTM 2000 spec­
trophotometers – ThermoScientific).

2.3.3.1 Amplificación por PCR y Electroforésis

La amplifiación se realizó en el LBEM ­ UFMG, Brasil. Este se llevo a cabo utilizando

el kit PlatinumTM Taq DNA Polymerase (InvitrogenTM), con las especificaciones
descritas en la tabla 5.

Tabla N° 5: Concentración de stock y final de la PCR con PlatinumTM Taq DNA Poly­
merise (InvitrogenTM)

Reactivo Concentración Stock Concentración usada

ddH2 O ­ ­
Tampón de reacción 10 X 1X
MgCl2 50 mM 1,5 mM
dNTPs 2,5 mM 200 µM
Primer Forward 25 µM 0,5 µM
Primer Reverse 25 µM 0,5 µM
Taq Polimerasa 5 U/µL 0,5 U/microtubo
DNA 40 ng/ µL ­

Para comparar la eficiencia de los cebadores descritos en la bibliografia, se utilizó

3 pares de cebadores específicos, descritos en la tabla 6.

33
 Tabla N° 6: Cebadores usados en PCR

CEBADORES SECUENCIAS
CHD1F1 5’­TATCGTCAGTTTCCTTTTCAGGT­3’
1
CHD1R 5’­CCTTTTATTGATCCATCAAGCCT­3’
2
2550F 5’­GTTACTGATTCGTCTACGAGA­3’
2
2718R 5’­ATTGAAATGATCCAGTGCTTG­3’
P2 (F)3 5’­TCTGCATCGCTAAATCCTTT­3’
3
P8 (R) 5’­CTCCCAAGGATGAGRAAYTG­3’

Nota: 1 (Lee et al., 2010), 2 (Fridolfsson & Ellegren, 1999), 3 (Griffiths et al., 1998).

El proceso se llevó a cabo en un termociclador de Applied Biosystems ProFlex

PCR System (Thermo Fisher Scientific), utilizand un esquema de PCR Touchdown
modificado de Hernández­Olicón et al. (2020), como se describe a continuación en
la figura 19 y en la tabla 7.

Figura N° 19: PCR Touchdown, gradiente de reducción de 1°C / ciclo

34
 Tabla N° 7: Protocolo PCR Touchdown modificado

Etapa Temperatura Tiempo

Denaturación inicial 94 °C 4 minutos
Denaturación 94 °C 30 segundos
Anillamiento 57­51 °C 45 segundos
Extensión 72 °C 45 segundos
Repetir por 7 ciclos
Denaturación 94 °C 30 segundos
Anillamiento 50 °C 45 segundos
Extensión 72 °C 45 segundos
Repetir por 30 ciclos
Extensión final 72 °C 5 minutos

2.3.4 Visualización de Amplicones

La prueba de la calidad del ADN se realizó usando gel de agarosa a 2 % (Ava­

ti) a una tensión de 80 Voltios (PowerPacTM 300, Bio­Rad®) con tampón TAE
(tris(hidroximetil)aminometano, ácido acético glacial y EDTA) al 0,5 X, durante 70
minutos. Se usó como comparador un marcador de peso molecular de 1Kb Plus
DNA Ladder (InvitrogenTM), colorados con tampón de muestras 6x (0,25 % de Azul
de bromofenol, 0,26 % de Xilenocianol e glicerol 30 %) con GelRedTM (Biotium), di­
luído 10.000x en agua.
Mediante la intensidad de la luz de las bandas de ADN en el gel observadas en
un transiluminador UV se puedo identificar a las hembras cuando se observaban 2
fragmentos y en el caso de los machos se observó solo 1 (Cerit & Avanus, 2007;
Dawson et al., 2013; Griffiths et al., 1998; Khaerunnisa et al., 2013).

2.3.5 Secuenciamiento de CHD­Z

Las muestras fueron secuenciadas en el LBEM ­ UFMG, Brasil. Para lo cual se

preparó los amplicones de los individuos machos (CHD­1Z) de ambas especies, a
través de las etapas que se describen a continuación:

1. Purificación de amplicones con protocolo de precipitación de PEG (Polietilen­

glicol) al 20 % y etanol congelado, se cargaron los amplicones al cassette de
secuenciamiento.

2. Precipitación con Hi­Di Formamida (ThermoScientific) y secuenciamiento en

el secuenciador ABI 3130 (Applied Biosystems).

35
2.3.6 Análisis bioinformático

Se utilizó el software MEGAX (Kumar, Stecher, Li, Knyaz, & Tamura, 2018) y el
paquete de algoritmos de alineamiento genético T­Coffee (Di Tommaso et al., 2011).

2.3.7 Análisis prueba de hipótesis entre el sexado molecular y datos morfo­

métricos

En el caso de los 20 individuos se realizó un análisis de prueba de hipótesis ha­

ciendo uso de la prueba de Mann–Whitney U.
Esta es una prueba no paramétrica de la hipótesis nula de que es igualmente proba­
ble que un valor seleccionado aleatoriamente de una muestra sea menor o mayor
que un valor seleccionado aleatoriamente de una segunda muestra. Se asume que
las dos muestras son independientes. El tamaño del efecto del lenguaje común es
la proporción de pares donde x es mayor que y (como se cita en (Vallat, 2018)).

𝐶𝐿 = 𝑃 (𝑋𝑍𝑌 ) + 5 ∗ 𝑃 (𝑋 = 𝑌 )

Donde:

• CL es el lenguaje común (CL en ingles).

• X y Y muestras independientes.

Para el análisis estadístico y de organización de utilizó el paquete pingouin ­ ver­

sión 0.5.2 (Vallat, 2018) para organizar la información ecológica colectada y para
el análisis de hipótesis con los datos numéricos. Para la visualización obtenida,
los paquetes seaborn ­ versión 0.11.2 (Waskom, 2021) y matplotlib ­ versión 3.5.1
(Thomas et al., 2021) del lenguaje de programación Python ­ versión 3.9.

36
 CAPÍTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se colectó datos de 81 individuos: 55 individuos de la especie A. castelnaudii y 26

individuos de la especie A. cupripennis. El sexo de los individuos de los que no se
tomaron muestras de tejido sanguíneo o plumas fueron categorizadas como ”No
determinado”.
En el caso de los 20 individuos de los que se colectaron muestras de tejido sanguí­
neo y plumas a través de PCR y la amplificación del gen CHD­1 se se identificó el
sexo de 15 individuos de la especie A. castelnaudii (3 hembras y 12 machos) y 5
individuos de la especie A. cupripennis (1 hembra y 4 machos) como se ilustra en
la figura 20.

(a) AGCA: A. castelnaudii. (b) AGCU: A. cupripennis.

Figura N° 20: Resultados del sexado molecular y datos de sexo no determinado colectados

3.1 Morfometría de picaflores del género Aglaeactis

Se presentan los resultados obtenidos por tipo de datos morfométricos, pudiendo

ser cualitativos (frecuencia) y numéricos:

3.1. Datos cualitativos:

Fueron enfatizados para evaluar si influían en el sexado molecular obtenido.

3.1.1. Datos reproductivo:

Aquí se listan la grasa, el parche de protuberancia (BP) y el parche de incuba­

ción(CP), en la tabla 8 se presenta los resultado de los individuos colectados.

37
 Tabla N° 8: Datos cualitativos de carácter reproductivo

Especies
Índice
A. castelnaudii A. cupripennis
0 ­ Nulo 33 16
1 ­ Bajo 17 10
GRASA 2 ­ Leve 4 0
3 ­ Moderado 1 0
4 ­ Abundante 0 0
0 ­ Nulo 31 19
1 ­ Leve 11 6
BP 2 ­ Hinchado 6 1
3 ­ Enervado 5 0
4 ­ Arrugado 2 0
0 ­ Nulo 4 5
1 ­ Leve 17 9
CP 2 ­ Moderado 23 8
3 ­ Notorio 11 4
4 ­ Hinchado 0 0

Nota: Para ver mas detalles revisar la sección «Morfometria de picaflores» del Marco Conceptual)

Se observa que la mayoría de individuos en estudio presentaban una baja (valores

0 y 1) cantidad de grasa durante el muestreo. En el caso de el parche de protu­
berancia (BP) los resultados fueron variados, siendo resaltante que al menos 13
individuos de A. castelnaudii se encontraban posiblemente con un proceso repro­
ductivo activo (por ejemplo la incubación de huevos). Finalmente en el caso de la
protuberancia cloacal, la mayoría de individuos (44 A. castelnaudii y 12 A. cupri­
pennis) presentaban esta estructura moderada o notoria.

3.1.2. Datos de muda:

Aquí se listan: la muda corporal, muda de alas de vuelo y el desgaste de las plumas
de vuelo; en la tabla 9 se presentan los resultado de los individuos colectados.

38
 Tabla N° 9: Datos cualitativos de muda

Especies
Muda
A. castelnaudii A. cupripennis
0 ­ Nula 28 11
1 ­ Leve 11 7
2 ­ Leva Moderada 12 1
Cuerpo
3 ­ Moderada 4 3
4 ­ Abundante 0 3
5­ Todo el cuerpo 0 1
Ninguna 49 22
Alas de Vuelo Simetrica 5 3
Asimetrica 1 1
0 ­ Muy gastadas 2 0
1 ­ Moderada 6 0
2 ­ Leve Moderada 5 0
Desgaste
3 ­ Leve 6 5
4 ­ Sin puntas 13 10
5 ­ Nuevas 23 8

3.1.3. Datos de estimación de edad:

En el caso de los datos de porcentaje de estrías colectados, los resultados se pre­

sentan la tabla 10.

Tabla N° 10: Datos de porcentaje de estrías

Estadio Adultos Juveniles

Porcentaje de Estrias 0­10 % 10­25 % 25­75 % 75­100 %
A. castelnaudii 26 14 4 9
A. cupripennis 5 2 9 10

Se uso el porcentaje de estrías para poder definir el estadio del ave basado en
estas estructuras observadas. Con esta información se utilizó todos los parámetros
cualitativos expuestos para estimar la edad de las aves haciendo uso del sistema de

39
WRP. Para esto se resaltó el porcentaje de estrías, la muda activa en alas de vuelo y
cuerpo, finalmente el desgaste y algún posible patrón reproductivo. Se presenta los
datos obtenidos en la figura 21, donde se puede observar que la mayoría de aves
se encontraban después del primer ciclo de vida (adultos de aproximadamente un
año) seguido de algunos individuos que se encontraban en un estadio juvenil.

Figura N° 21: Ciclo de muda y edad estimada para individuos de A. cupripennis y A. castelnaudii,
Nota. FAJ: Polluelo, Primera muda juvenil, FPF: Juvenil, Primer ciclo de muda preformativo, FCF:
Juvenil (casi adulto), Primer ciclo formativo , DPB: Adulto, Ciclo prebásico definitivo, DCB: Adulto,
Ciclo básico definitivo, UCU: Adulto, Ciclo prebasico definitivo desconocido acorde al sistema WRP
(Wolfe et al., 2010).

40
3.2. Datos Numéricos:

Los datos numéricos colectados fueron: cordura alar (ala), largo de la cola en la
rectriz más larga, medida del pico a la narina, el ancho del culmen al nivel de las
narinas y el peso del cuerpo, para evaluar si estas podrían ser replicados en campo
para ser usadas en la identificación del sexo de manera mecánica.
3.2.1. Para Aglaeactis castelnaudii:
Los datos morfométricos numéricos utilizados fueron segmentados por el sexo del
individuo identificado mediante ensayos de PCR y el gen CHD­1. Las medidas mor­
fométricas se presentan los valores promedio y márgenes de variación (desviación
estándar) en la tabla 11.

Tabla N° 11: Comparación morfométrica por sexo en A. castelnaudii

ESPECIES MEDIDAS MACHOS HEMBRAS

Ala 73.5 ± 4.3 (11) 73 ± 3.5 (3)
Cola 48.1 ± 1.6 (12) 49 ± 2 (3)
Narinas 19.1 ± 0.7 (12) 19 ± 0.5 (3)
A. castelnaudii
Culmen ancho 2.7 ± 0.3 (12) 2.9 ± 0.3 (3)
Tarso 7.0 ± 0.4 (12) 7.3 ± 0.1 (3)
Peso 6.8 ± 0.5 (11) 7.1 ± 0.4 (3)

Nota. Promedio en mm ± desviación estándar (cantidad de individuos). En individuos que tenían las
ala en muda activa, no se tomó la medida. En el caso del peso, algunos individuos escaparon antes
de la toma de datos o se encontraban aparentemente estresados y fueron liberados.

De igual manera en el caso de individuos con sexo desconocido, se obtuvo los

siguientes promedios junto a su escala de error presentados en la tabla 12.

Tabla N° 12:
Comparación morfométrica para especies A. castelnaudii con sexo no
determinado (ND).

ESPECIE Ala Cola Narinas Culmen Tarso Peso

72.9 ± 4.3 48.3 ± 4.6 18.3 ± 1.7 3.0 ± 0.4 5.9 ± 0.7 6.9 ± 0.3
A
castelnaudii (40) (39) (40) (40) (40) (38)

Nota. Promedio en mm ± desviación estándar, (N) cantidad de individuos

41
En la serie de imágenes (figura 22), se observan a vista frontal y posterior, así como
un individuo adulto de la especie A. castelnaudii.

(a) Vista frontal de A. castelnaudii (b) Coloración en espalda de A. castelnaudii

(c) Espalda y Ala de A. castelnaudii (d) Plumas rectrices de A. castelnaudii

(e) Vista dorsal de A. castelnaudii (f) Vista de juvenil (inferior­izquierda) y adulto.

Figura N° 22: Fotografías de A. castelnaudii

42
3.2.2. Para Aglaeactis cupripennis:
Se realizó el mismo proceso de tratamiento de datos que en la sección anterior,
se consideró la segmentación de los datos morfométricos por el sexo del individuo
identificado mediante ensayos de PCR y el gen CHD­1. Las medidas morfométricas
se presentan en valores promedio y márgenes de variación (desviación estándar)
en la tabla 13 y para los individuos de sexo desconocido en la tabla 14.

Tabla N° 13: Comparación morfométrica en A. cupripennis

ESPECIES MEDIDAS MACHOS HEMBRAS

Ala 82.2 ± 4.3 (4) 76.0 ± 0 (1)
Cola 50.2 ± 2.4 (4) 47.0 ± 0 (1)
Narina 17.4 ± 1.5 (4) 16.2 ± 0 (1)
A. cupripennis
Culmen ancho 2.8 ± 0.5 (4) 2.4 ± 0 (1)
Tarso 6.8 ± 0.7 (4) 6.4 ± 0 (1)
Peso 7.3 ± 0.2 (4) 6.3 ± 0 (1)

Nota: Promedio en mm ± desviación estándar (cantidad de individuos)

Tabla N° 14:
Comparación morfométrica para especiesA. cupripennis con sexo no
determinado (ND).

ESPECIE Ala Cola Narinas Culmen Tarso Peso

78.7 ± 4.4 47.9 ± 4.1 17.0 ± 1 2.8 ± 0.4 5.9 ± 0.8 6.9 ± 0.4
A.
cupripennis (21) (21) (21) (21) (18) (21)

Nota. Promedio en mm ± desviación estándar, (N) cantidad de individuos

43
En la serie de imágenes (figura 23), se observan a vista frontal y posterior, así como
un individuo adulto de la especie A. cupripennis.

(a) Vista frontal de A. cupripennis (b) Coloración en espalda de A. cupripennis

(c) Adulto de A. cupripennis (d) Espalda y Ala de A. cupripennis

(e) Ala de A. cupripennis (f) Adulto de A. cupripennis

Figura N° 23: Fotografías de A. cupripennis

44
3.2 Extracción de ADN (Calidad / concentración)

Dependiendo de la cantidad de muestras disponibles, se realizó la extracción de

material genético en las muestras colectadas. En algunos casos, algunas mues­
tras independientes (por individuo) generaron hasta tres unidades para extracción
acorde al protocolo de extracción usado. Se utilizaron los datos producidos por el
espectrofotómetro NanoDropTM 2000 (ThermoScientific®).

• En muestras de tejido sanguíneo.

Como se observa en la tabla 15 (siguiente pagina) los datos obtenidos de
la extracción de tejido sanguíneo oscilan entre 141.3 ng/μl y 4070.3 ng/μl,
gráficamente se puede observar en la figura 24.
Este es un buen indicativo de la calidad obtenida (dentro de los rangos es­
tándares de la medida de calidad 260/280 (entre 1.8 a 2.0).

(a) Tejido Sanguíneo en PM06 (b) Tejido Sanguíneo en PM03

Figura N° 24: Espectrofotometría en tejido de sanguíneo. (a) A. castelnaudii (PM06) con

concentración de ADN de 2356.7 ng/µl e índice 260/280 de 1.95 y (b) A. cupripennis (PM03) con
concentración de ADN de 4070.3 ng/µ e índice 260/280 de 1.93.

45
 Tabla N° 15: Datos por espectrofotometría en tejido sanguíneo

Especie Número Código ADN Relación

Extracción (ng/µl) 260/280
1 PM02 141.3 1.93
2 PM04 725.3 1.93
3 PM05 1029.8 1.95
4 PM06 2356.7 1.95
5 PM11 104.7 2.17
6 PM12 1324.9 1.94
7 PM14 1387.1 1.92
8 PM13 903.8 1.92
A. castelnaudii
9 PM17 2534.9 1.90
10 PM18 875.7 1.94
11 PM21 1391.9 1.94
12 PM22 1771.3 1.92
13 PM24 543.8 1.94
14 OM02 1047.7 1.95
15 OM01 862.5 1.90
1 PM01 448.7 1.93
2 PM03 4070.3 1.93
3 PM07 258.6 1.91
A. cupripennis
4 PM08 975.8 1.94
5 PM15 1119.1 1.97

• En muestras de tejido de plumas.

Como se observa en la tabla 16 los datos obtenidos de la extracción de tejido
de plumas oscilan entre 7.2 ng/μl y 74.8 ng/μl. A pesar de que las cantidades
de ADN extraídas son bajas, en cuanto a calidad la mayoría se encuentra
dentro del rango de 1.51 ­ 2.03, por lo que consecuentemente algunos se
encuentran dentro de los rangos estándares de la medida 260/280 (entre 1.8
a 2.0).

46
 Tabla N° 16: Datos por espectrofotometría en tejido de plumas

Especie Número Código ADN Relación

Extracción (ng/µl) 260/280
1 UM11 8,4 1,51
2 UM23 33,4 1,51
3 TM17 7,2 1,96
4 TM18 33,1 1,84
A. castelnaudii
5 TM19 42 1,54
6 RM13 13,9 1,71
7 RM14 74,8 1,63
8 RM15 15,9 1,66
1 UM12 10,7 1,71
2 TM20 32,7 1,95
3 TM21 35,5 1,95
4 RM16 7,2 2,03
A. cupripennis
5 RM17 14,4 1,86

Debido a la baja cantidad de ADN extraído en plumas, luego de varias re­

peticiones, se decidió recortar la cantidad de muestras de plumas debido a
que el resultado no brindaban una mejora en cuanto a la cantidad y calidad
del de material genético para ser usarlo en PCR, los resultados obtenidos por
espectofotometría se pueden observar en la figura 25.

(a) Tejido de pluma (TM18) (b) Tejido de pluma (RM16)

Figura N° 25: Espectrofotometría en tejido de plumas. (a) A. castelnaudii (TM18) con concentración
de ADN de 33.1 ng/µl e índice 260/280 de 1.84 y (b) A. cupripennis (RM16) con concentración de
ADN de 7.2 ng/µl e índice 260/280 de 2.03.

47
Se observó una mayor disponibilidad de material genético en muestras de tejido
sanguíneo (impregnado en las cartas de colecta de Macherey Nagel®) que en plu­
mas, consecuentemente se observo el mismo patrón en los indicadores de calidad
se presentan en la tabla 17 por cada especie estudiada.

Tabla N° 17: Datos promedio de cantidad y calidad del ADN extraído

A. castelnaudii A. cupripennis
Muestra ADN (ng/µl) 260/280 ADN (ng/µ) 260/280
Tejido Sanguíneo 1133.4.53.4 (15) 1.95 (15) 1374.5 (5) 1.94 (5)
Plumas 28.6 (8) 1.67 (8) 20.1 (5) 1.9 (5)

Nota: Promedio (cantidad de individuos)

48
 3.3 Amplificación de fragmentos del gen CHD1

En primera instancia, se efectuó ensayos de PCR para evaluar la eficiencia de los

cebadores en estudio (CHDF/CHDR, P2/P8 y 2250F/2718R) para diferenciar el se­
xo a través del tamaño de las bandas amplificadas. En la tabla 18, se presentan los
6 ensayos de PCR realizadas con todos los cebadores en mención, el objetivo de
la comparación fue detectar el cebador que permita la visualización de las bandas
en agarosa al 2 %.

Tabla N° 18:
Ensayos de PCR y variación de temperatura de anillamiento por cada
cebador en estudio

Tipo de Número de
N° P2/P8 2250F/2718R CHDF/CHDR MgCl2
Muestras Muestras
1 Plumas 4 48 48 48 1.5
2 Plumas 5 49 48 48 1.5
3 Tejido Sanguíneo 10 49 48 48 1.5
4 Tejido Sanguíneo 10 50 49 49 3
5 Tejido Sanguíneoy Plumas 5 Touch Down ­ PCR 1

Proporciones fijas: (1) Tampón = 1, (2) dNTPs = 200, (3) Cebador forward = 0.5,
(4) Taq Polimerasa = 0.5, (5) Cebador reverse = 0.5

La eficiencia de los cebadores depende de la taxonomía del ave en estudio, además

de que las condiciones de la PCR pueden generar conflictos en cuanto al tamaño de
los amplicones generados. En los fragmentos generados por P2/P8 y 2250F/2718R
se obtuvo una diferencia poco apreciable debido a que el tamaño de los fragmentos
generados eran de similar tamaño.
En el caso del cebador CHD­R/CHD­F los fragmentos eran notorios debido a la
diferencia de tamaño de los mismos. Por lo que se utilizó para la mejora del PCR
mediante múltiples repeticiones, para el mismo se realizaron pruebas modificando
la temperatura de anillamiento y alternando otros reactivos adicionales como BSA
y DMSO para confirmar su influencia dentro de la amplificación de los fragmentos,
tal como se observa en tabla 19.

49
 Tabla N° 19: Ensayos de PCR en el cebador CHD­R/CHD­F

Numero de Temperatura de Otros

N° Tipo de Muestras MgCl2
Muestras Anillamiento (°C) Reactivos
1 Plumas 5 50 1.5 48
2 Tejido Sanguíneo 5 50 ­ 52 ­ 54 2
3 Tejido Sanguíneo 10 50 ­ 52 2
4 Tejido Sanguíneo 18 50 2
5 Tejido Sanguíneo 12 55 ­ 56 ­ 57 2
6 Tejido Sanguíneo 18 54 ­ 55 ­ 56 2
7 Tejido Sanguíneo 323 57 ­ 59 ­ 61 2
8 Plumas 13 57 ­ 59 ­ 61 2
9 Tejido Sanguíneo 8 59 2 0.72 ug BSA
10 Plumas 19 59 2 0.72 ug BSA
11 Tejido Sanguíneo y plumas 27 59 2 0.72 ug BSA
12 Plumas 17 59 2 0.72 ug BSA
13 Tejido Sanguíneo y plumas 24 59 2 0.72 ug BSA
14 Plumas 22 59 2 0.72 ug BSA
15 Tejido Sanguíneo 28 59 2 0.72 ug BSA
16 Plumas 5 59 2 0.72 ug BSA
17 Plumas 5 59 2 0.72 ug BSA
18 Tejido Sanguíneo 18 TD 1 0.72 ug BSA
19 Tejido Sanguíneo 20 TD 1.5 3 % DMSO
20 Tejido Sanguíneo 18 TD 1
21 Tejido Sanguíneo 20 TD 1.5
22 Tejido Sanguíneo y Plumas 22 TD 2
23 Plumas 7 TD 1
24 Plumas 7 TD 1
25 Plumas 10 TD 1

Proporciones: (1) Tampon = 1, (2) dNTPs = 200, (3) Cebador forward = 0.5,
(4) Taq Polimerasa = 0.5, (5) Cebador reverse = 0.5

50
Como se observa en las tablas 18 y 19. El protocolo de PCR Touch Down fue más
efectivo para poder obtener los fragmentos del gen CHD­1 en ambos sexos de las
especies en estudio.
Se estableció un control, donde se obtuvo un fragmento de aproximadamente 650
pb para machos y 2 fragmentos de aproximadamente 650 pb y 350 pb para las
hembras en las especies de A. castelnaudii como se observa en la figura 26.

Figura N° 26: Control de macho (PM21) y hembra (PM13) para A. castelnaudii obtenidos por el
protocolo Touch Down PCR y visualizado en agarosa 2 %. PM13 y PM21: Tejido Sanguíneo; UM11,
TM19, UM23: Plumas; C­: Control.

Se utilizó estos controles para poder comparar la eficiencia de los genes bajo las
mismas condiciones (Touch Down PCR) como se observa en la figura 27.

51
 Figura N° 27: Productos de TD­PCR, en agarosa 2 % de genes CHD­1 amplificado por 3
cebadores. Nota: De izquierda a derecha: P2/P8, amplificación visible pero no diferenciación de
tamaño debido a la pequeña diferencia de las bandas. 2550F/218R, amplificación eficiente pero
poca diferenciación entre bandas. CHD­F/CHD­R, amplificación y diferenciación de bandas eficiente
para el sexaje molecular: En los carriles PM13 y PM04: 2 bandas, hembras de la especie A.
castelnaudii, en el carril PM12 y PM15: 1 banda, machos de las especies A. castelnaudii y A.
cupripennis respectivamente. C­: Control.

Utilizando como patrón de las muestras amplificadas en la figura 26, se procedió a

hacer repeticiones de las pruebas de PCR tal como ser observa en las tablas 20
(para A. castelnaudii) y la tabla 21 para A. cupripennis.
Es así que se logro diferencias 12 machos y 3 hembras para A. castelnaudii y 4
machos y 1 hembra en A. cupripennis, en ambos caso con un fragmento de apro­
ximadamente 650 pb para machos y 2 fragmentos, uno de aproximadamente 650
pb y 350 pb como se aprecia en las figuras 28 y 29.

52
Tabla N° 20: Datos de amplificación por PCR del gen CHD­1 en A. castelnaudii

Cod Ext Muestra N A F M Sexo Mol

1 PM02 Sangre 3 9 M
PM04 Sangre 2 10 F
2
OM08 Plumas 3 ND
PM05 Sangre 3 7 M
3
OM07 Plumas 3 ND
PM06 Sangre 3 8 M
4
OM08 Plumas 3 ND
PM11 Sangre 6 M
5
OM10 Plumas 3 ND
PM12 Sangre 7 M
6
OM13 Plumas 3 ND
PM13 Sangre 1 16
7 F
OM15 Plumas 1 1
PM14 Sangre 6 M
8
OM14 Plumas 3 ND
PM17 Sangre 1 5 M
9
OM16 Plumas 2 ND
PM18 Sangre 1 6
M
10 PM19 Sangre 1 2
OM18 Plumas 3 ND
PM20 Sangre 1 ND
11 PM21 Sangre 1 8 M
OM19 Plumas 3 ND
PM22 Sangre 6
M
12 PM23 Sangre 3
OM20 Plumas 3 ND
PM24 Sangre 1 5
M
13 OM12 Sangre 1
OM21 Plumas 3 ND
OM01 Sangre 4 M
14
OM22 Plumas 3 ND
OM02 Sangre 4 1
15 OM03 Sangre 1 1 F
OM23 Plumas 2

Nota: N: No amplificó, A: Amplificó pero las bandas no fueron claras,

F: Hembras, M: Machos, ND: No determinado.

53
 Tabla N° 21: Datos de amplificación por PCR del gen CHD­1 en A. cupripennis

Cod Ext Muestra N A F M Sexo Mol

PM01 Sangre 1 3 8 M
1
OM04 Plumas 3 1 ND
PM03 Sangre 2 1 7 M
2
OM05 Plumas 3 ND
PM07 Sangre 4 3 3 M
3
OM09 Plumas 3 ND
PM08 Sangre 1 3 8 F
4 PM09 Sangre 1 2 F
OM11 Plumas 1 1 F
PM15 Sangre 7 M
5 PM16 Sangre 3 M
OM17 Plumas 4 ND

Nota: N: No amplificó, A: Amplificó pero las bandas no fueron claras,

F: Hembras, M: Machos, ND: No determinado.

Figura N° 28: Análisis de productos amplificados con el cebador CHD­F/CHR­R por TD­PCR, en
agarosa 2 % (1). Nota. AGCA: A. castelnaudii, C­: Control.

54
 Figura N° 29: Análisis de productos amplificados con el cebador CHD­F/CHR­r por TD­PCR, en
agarosa 2 % (2). Nota. AGCA: A. castelnaudii, AGCU: A. cupripennis, C­: Control.

En el caso de las hembras, en la figura 30, se observa que en su mayoria la presen­

cia de la banda mas grande no es notoria, debido a problemas con la competencia
del cebador donde solo nos permite observar las bandas mas pequeñas en hem­
bras (aproximadamente de 350 pb) en comparación con las bandas mas grandes
del control (PM21) macho (aproximadamente de 650 pb).

Figura N° 30: Identificación de hembras usando los genes CHD­1 con el cebador CHD­F/CHD­R en
tejido sanguíneo. PM21 (control machos) y PM13 (control hembras), OM01 (A. castelnaudii), PM08
y PM04 (A. cupripennis).

55
Finalmente, en las muestras estudiadas, la eficiencia de amplificaciones en tejido
de plumas fue muchísimo menor a lo obtenido usando tejido sanguíneo como fuente
de ADN, como podemos observar tanto para A. castelnaudii (tabla 20) como para
A. cupripennis (tabla 21).
Finalmente, los resultados en cuanto a la eficiencia de amplificación se presentan
en la tabla 22.

Tabla N° 22: Cantidad de amplificaciones efectivas en plumas y tejido sanguíneo

Especie
Muestra A. castelnaudii A. cupripennis
Tejido Sanguíneo 15 (100 %) 5 (100 %)
Plumas 2 (15 %) 2 (40 %)

En la tabla 22 se presenta la cantidad de muestras que permitieron el sexado de los

picaflores en estudio, resaltando que en muestras de tejido sanguíneo se obtuvo
mejores resultado en comparación con las muestras de tejido de plumas.
En varios casos el resultado obtenido en los geles de agarosa al 2 % de muestras
de plumas producían una o varias bandas confusas (tablas 20 y 21), no permitiendo
la detección del sexo de los individuos.
Este fenómeno puede deberse a la poca calidad del ADN colectado en las plumas
(tal como se describió en el cálculo de la espectrofotometría) afectando el producto
final amplificado por la presencia de otros restos o químicos que puedan interferir
en amplificación por TD­PCR.

56
3.4 Alineamiento de la secuencia de CHD­1Z

Se recuperó el gen CHD­1Z (solo en machos) de los genes de Agarosa al 2 %. Obte­

niéndose por alineamiento de secuencias, 1 fragmento de 695 pb. para Aglaeactis
castelnaudii a través del ensamblado de 10 amplicones secuenciados y 1 frag­
mento de 697 pb para A. cupripennis a través del ensamblado de 3 amplicones
secuenciados.

Comparación de secuencias del Gen CHD­1Z en individuos machos de las

especies A. castelnaudii y A. cupripennis

ag-cup-CHD1Z 1 TGGCTGCAGA-TCCACAT-CCTGTCCCA-CCATGGTCCTTCACAGGCTGKTGGATCCAAC
ag-cas-CHD1Z 1 ..........T.......C.........C....................-........--

ag-cup-CHD1Z 58 MCACCTG--CCCCACCGTGGTCCTTCAGGGACTCCTCCACCAGTCTTCTTCCATGGGTAC
ag-cas-CHD1Z 58 C......CC......................-----........................

ag-cup-CHD1Z 116 AGGGCGGGACATCTTGCTATCTCCACCACCAGGCTGCAGCAAAATC-TCTGCTTGGGT--

ag-cas-CHD1Z 113 ....-.........................................T....T......CY

ag-cup-CHD1Z 173 AGAGATCCTCTCCCTTCTTTCTCACCAA-CCTTGCTATCACCTT-CCCCTCTCCTCTGCT

ag-cas-CHD1Z 172 ............................C...............C...............

ag-cup-CHD1Z 231 CTCAGGTCTTTTTGCAGTTTTWGGTTTTTTTTTTTAATTTCTGAATGTGTTATTCACAGA

ag-cas-CHD1Z 232 .....................-.T....................................

ag-cup-CHD1Z 291 GGTGCATCCAGCTTCCCTAATCTTGGCTTTGGCCAGAATGGAGCTGGGGGAGCTTCCAGC

ag-cas-CHD1Z 291 ............................................................

ag-cup-CHD1Z 351 AGCTTCTTACAGGAGCCTCCCCTCCCTCCCCCCGCAAAACCCCGCCATCAAAACATCTGC

ag-cas-CHD1Z 351 ............................................................

ag-cup-CHD1Z 411 TTCTGCTGTCCTCACCTGAGTAGGGAAWGTCAGACAAGATGACCTCCAGAGGTCTCTTCT

ag-cas-CHD1Z 411 ...........................-...W............................

ag-cup-CHD1Z 471 AACTGTTGCATGAATATATGATCTGTTACTACTTTGCTTAAGAAAACATATATGAAAAAT

ag-cas-CHD1Z 470 ........................-...................................

ag-cup-CHD1Z 531 TGTTCTGTTAAAGACTGACAGTTTGCTYCTATGCTACACCTGTATTTCGAAA-TTAAACT

ag-cas-CHD1Z 529 .......-..........M..-.....-..........-.............T.......

ag-cup-CHD1Z 590 GAATTGAACTGGAAAATCCGCATTAATTTTTTTTTCTTTCATTCMAATAACACTTTTGG-

ag-cas-CHD1Z 585 ..--.......A......................C...CTTCMAC.TA...........G

ag-cup-CHD1Z 649 -CAGTTGGAGTATTGCAAGTTGGCTCC--GGATTTTAATAT-TKGTACAAGAA

ag-cas-CHD1Z 643 CAG..K....GTA.T.C..G....C..TT...A...T....A.T.........

57
Se observa una similitud de ambas secuencias debido a la ancestralidad filoge­
nética de A. cupripennis sobre A. castelnaudii, confirmando a través de esta com­
paración de secuencias que el gen CHD­1Z se encuentra conservada en ambas
especies y el uso de esta técnica de PCR con el par cebadores CHDF/CHDR es
útil en este grupo de aves (picaflores) y en especial en el género Aglaeactis.

3.5 Correlación entre datos morfométricos y sexado molecular

Se evaluó los datos obtenidos por el sexado molecular sobre 15 individuos de la

especie A. castelnaudii y 5 individuos de la especie A. cupripennis.

3.5.1. Para A. castelnaudii­ 15 individuos:

Consideraciones de datos cualitativos:

• Índices reproductivos: Tanto para Grasa, Parche de Incubación (BP) y Pro­

tuberancia cloacal (CP), los resultados se establecieron en rangos muy bajos.
Esto se puede deber también a la temporada de muestreo (Agosto a Diciem­
bre, en este ultimo da el inicio a la temporada de reproducción). No represen­
taron ser significativos para el sexado molecular así como para el sexado en
campo.

• Índices de muda y desgaste de plumas: Se observo que 3 individuos esta­

ban en una muda activa (al menos la mitad de su cuerpo), y que la mayoría de
los individuos presentaron plumas nuevas y lustrosas, estos datos nos per­
mitieron estimar la edad de las aves, mas no representaron una relación con
el sexado molecular o en campo ya que fue común en ambos sexos.

• Ciclo de muda (edad): Debido a la presencia o ausencia de estrías pudimos

medir a través de porcentajes obteniendo que al menos 10 individuos de las
que se colectaron muestras de tejido estaba en etapa adulta, esto se comple­
mentó con el sistema WRP (DCB y 2 DPB) se encontraban en estadio adulto
(o casi adulto) y solo 5 individuos se encontraban en etapa juvenil (4 FCF y
1 FPF). En este trabajo de investigación, la edad de ave no tuvo significancia
en el sexado molecular.

Consideraciones de datos numéricos:

Visualmente, se aprecia a través de diagramas de cajas la estructura de la distribu­
ción de los datos. Teóricamente cuando mas aisladas estén las cajas es probable
que pertenezcan a distribuciones diferentes. Se graficó los datos obtenidos en la
figura 31 para las medidas de ala y cola.

58
 Figura N° 31: Diagramas de caja de medias numéricas: Ala y cola en A. castelnaudii

En la figura 33 se observa los diagramas de cajas para las medidas de pico narinas
y culmen expuesto.

Figura N° 32: Diagramas de caja de medias numéricas: Pico Narinas y culmen expuesto en A.
castelnaudii

59
Las medidas de tarso y el peso colectado de los individuos se graficó en la tabla
33.

Figura N° 33: Diagramas de caja de medias numéricas: Tarso y peso en A. castelnaudii

Prueba de hipótesis: A. castelnaudii

Tabla N° 23: Resultados de la prueba Mann–Whitney U en A. castelnaudii

Métrica U­val p­val RBC CLES

ala 11.0 0.405783 0.333333 0.333333
cola 23.5 0.460297 ­0.305556 0.652778
tarso 27.5 0.185469 ­0.527778 0.763889
pico_narinas 19.0 0.942157 ­0.055556 0.527778
culmen_ancho 21.5 0.653795 ­0.194444 0.597222
peso 24.0 0.275230 ­0.454545 0.727273

Nota: Umbral de confianza del 95 %. U­val: valor U, p­val: valor p, RBC: correlación biserial de
rango, CLES: tamaño del efecto de lenguaje común

Los resultados nos muestran que el valor p de significancia con un intervalo del
95 % de confianza muestran que ningún valor descarta la hipótesis nula (valor p
<0.05), es decir que ningún valor de las métricas numéricas es diferente en machos
y hembras en esta especie.

60
Para A. cupripennis:

Consideraciones de datos cualitativos:

• Índices reproductivos: Similar a A. castelnaudii, los valores de Grasa, Par­

che de Incubación (BP) y Protuberancia cloacal (CP), fueron mínimos y no
nos permiten discriminar el sexo en las aves por el sexado molecular ni en
campo.

• Índices de muda y desgaste de plumas: Se observo que solo 1 individuos

estaban en una muda activa, y mientras que el desgaste de todos los indi­
viduos fue leve, permitiéndonos estimar la edad de las aves, pero no fueron
significativos en el sexado molecular o en campo.

• Ciclo de muda (edad): Con la información obtenida por la presencia de es­

trías, pudimos detectar casi todos los individuos estaban atravesando por un
estadio adulto (o casi adulto). Esto fue luego confirmado con el sistema WRP,
se identificó que 1 individuo (DCB ­ adulto) y 4 individuos que se encontraban
en etapa casi adulto ­ juvenil (FCF). En este caso también, la edad de ave no
tuvo significancia en el sexado molecular.

Consideraciones de datos numéricos:

Debido al momento de captura, solo se dispuso de una muestra de tejido sanguíneo
y pluma lo que considera el único dato para la hembra de A. cupripennis dentro des­
de estudio. Esto es importante ya que el diagrama de la misma siempre mostrara
una sola linea (no caja) dentro de los siguientes gráficos.
En caso de A. cupripennis se enfatizó la comparación entre machos e individuos
de sexo no determinado.

61
Se graficó los datos obtenidos en la figura 34 para las medidas de ala y cola.

Figura N° 34: Diagramas de caja de medias numéricas: Ala y cola en A. cupripennis

Se muestran también los diagramas referentes a las medidas de pico narinas y

culmen expuesto en la figura 35

Figura N° 35: Diagramas de caja de medias numéricas: Ala y cola en A. cupripennis

62
En la figura 36, se observan las medias de tarso y peso de las especies de A.
cupripennis.

Figura N° 36: Diagramas de caja de medias numéricas: Ala y cola en A. cupripennis

Prueba de hipótesis: A. cupripennis

Tabla N° 24: Resultados de la prueba Mann–Whitney U en A. cupripennis

Métrica U­val p­val RBC CLES

ala 0.5 0.456057 0.75 0.125
cola 0.5 0.456057 0.75 0.125
tarso 1.0 0.800000 0.50 0.250
pico_narinas 1.5 1.000000 0.25 0.375
culmen_ancho 1.0 0.800000 0.50 0.250
peso 0.0 0.400000 1.00 0.000

Nota: Umbral de confianza del 95 %. U­val: valor U, p­val: valor p, RBC: correlación biserial de
rango, CLES: tamaño del efecto de lenguaje común

Los resultados nos muestran que el valor p de significancia con un intervalo del
95 % de confianza, al igual que en A. castelnaudii en esta especie se muestran que
ningún valor descarta la hipótesis nula (valor p <0.05), es decir que ningún valor de
las métricas numéricas es diferente en machos y hembras en esta especie.

63
3.6 DISCUSIÓN

Se identificó el sexo de 20 individuos del género Aglaeactis haciendo uso de las

técnicas de PCR y la amplificación del gen CHD­1. De los cuales, en la especie A.
castelnaudii se obtuvo 12 machos y 3 hembras y en A. cupripennis, 4 machos y 1
hembra.
La identificación en campo fue satisfactoria haciendo uso de guías y claves taxonó­
micas (Schuchmann, 1985; Schulenberg et al., 2010), los individuos presentaban
rasgos fenotípicos únicos de su especie. En este estudio reportamos que la mayo­
ría de los datos categóricos colectados en los datos de 55 individuos de la especie
A. castelnaudii y 26 individuos de la especie A. cupripennis (grasa, parche de in­
cubación ­ BP, protuberancia cloacal ­ CP) para ambas especies en la especie no
influyeron en la identificación del sexo de los individuos. Con respecto a edad esti­
mada del ave a través de sus ciclos de muda y al porcentaje de estrías, nos permitió
confirmar que la mayoría de individuos de A. castelnaudii eran adultos (44 adultos
y 9 juveniles), mientras que los individuos de A. cupripennis fueron 10 juveniles y
16 adultos, este factor al ser de importancia fenotípica y de madurez del ave, no
influyó directamente en la identificación del sexo de los individuos.
Con respecto a los datos morfométricos numéricos, se evaluó la estructura de la
distribución de los datos a través de diagramas de cajas para obtener una referen­
cia exploratoria de los datos numéricos morfométricos. Se pudo observar que tanto
para A. castelnaudii y A. cupripennis las medidas morfométricas y el peso apa­
rentemente se encuentran distribuidos dentro de un intervalo, siendo complicado
discernir y utilizar alguna de estas medidas para diferenciar machos de hembras en
estudios ecológicos en campo. En el caso de A. cupripennis los resultados fueron
comparados solo a 1 hembra, ya que no se dispuso de mas ejemplares del mismo
sexo.
La disponibilidad de ADN genómico en la tejido sanguíneo y plumas, se obtuvo
una calidad/cantidad de ADN mucho mayor en tejido sanguíneo (entre 141.3 ng/μl
y 4070.3 ng/μl y 1.8 a 2.0 en la escala de 260/280) que en plumas (4.1 ng/μl y 74.8
ng/μl y 1.51 a 2.03 en la escala de 260/280). Este fenómeno se debe a diversos
factores, como ya fueron descritos en Horváth et al. (2005) y Harvey et al. (2006),
la dificultad de obtener muestras de ADN en plumas se debe a la degradación de
células originarias (en mucho caso debido al previo proceso de muda o maduración
del individuo), principalmente la causa es la zona de colecta de las plumas, en
este estudio solo fueron usadas las plumas rectrices timoneras de la cola. Esta
ubicación anatómica puede disponer de muy poca cantidad de tejido sanguíneo
coagulado antes de ser desprendida y por procesos naturales de esclerotización
de la misma, esto reduce la probabilidad de encontrar material genético disponible

64
para la extracción de ADN.
En la amplificación de ADN, se realizaron diferentes pruebas dependiendo de la
necesidades específicas de cada cebador: P2 / P8 (Çakmak et al., 2017; Griffiths
et al., 1998; Harvey et al., 2006; Lee et al., 2010; Shibuya, 2016; Vucicevic et al.,
2013), el cebador 2550F / 2718R (Çakmak et al., 2017; Fridolfsson & Ellegren,
1999; Vucicevic et al., 2013) y CHD1R / CHD1F (Çakmak et al., 2017; Lee et al.,
2010), se realizaron diferentes experimentos modificando las concentraciones del
(PCR) Master Mix así como la configuración del Termociclador. Trabajos previos
reportaron la baja efectividad de P2/P8 (Fridolfsson & Ellegren, 1999) en geles
de agarosa debido al tamaño diferencial de los fragmentos en ambos sexo que
amplifica ( 20 pb), los mismos autores proponen un par de cebadores (2550F/218R)
que genere fragmentos diferenciales más grandes. Durante las pruebas se pudo
observar que las bandas en algunos caso eran más difusas, debido a competencia
de las bandas por el cebador (Matta Camacho et al., 2009), esto se pudo mejorar
a través de la implementación del protocolo de Touchdown PCR (Çakmak et al.,
2017), garantizando que el procedimiento sea replicable para futuros ensayos.
Hagadorn et al. (2016) y Shibuya et al. (2018) fueron los únicos equipos que tra­
bajaron en especies de la familia Trochilidae, a diferencia de los individuos de este
estudio, ellos usaron individuos de «tierras bajas» en la selva de Brasil y otras re­
giones de Estados Unidos. Debido a que la mayoría de estudios se realizaron en
otras aves de importancia industrial (Ellegren, 1996a), en cautiverio (Wang et al.,
2007) o en peligro de extinción (Liza et al., 2008), no permiten tener una compara­
ción apreciable como histórico para aves del mismo hábitat que las que usamos en
este estudio. En ausencia de datos similares en picaflores altoandinos nos permite
confirmar que el uso del tercer par de cebadores CHD1F/CHD1R fue mas producti­
vo (funcionando en todas las muestras de sangre amplificadas), demostrando que
los protocolos establecidos funcionan correctamente para los picaflores del gene­
ro Aglaeactis, ya que los fragmentos generados para cada sexo daban bandas de
diferencia significativa, mas pequeñas en las hembras (el cromosoma W) y mas
grandes en los machos (en el cromosoma Z) visualizados en el geles de agarosa
al 2 %.
Según McGuire et al. (2014), A. cupripennis sería el ancestro de las otras 3 especies
existentes del género Aglaeactis, ya que se encuentra en un rango de distribución
mucho mas amplio (Ecuador, Perú y Bolivia), esto mismo pudo ser confirmado por el
secuenciamiento de las muestras en machos (CHD­1Z), obteniendo los fragmentos
secuenciados de longitud similar en A. castelnaudii y A. cupripennis con 695 pb y
697 pb respectivamente. Esto comprueba la conservación de este gen CHD­1Z en
ambas especies.

65
Finalmente los resultados obtenidos por análisis de prueba de hipótesis, con la
información obtenida por el sexado molecular y la medidas numéricas colectadas
fueron evaluadas por la prueba no paramétrica de Mann–Whitney U para descartar
la hipótesis nula (no hay diferencia en variables numéricas en cuanto al sexo de
las especies). Los resultados obtenidos para ambas especies nos muestran que el
valor p (significancia) a un nivel de confianza del 95 %, en las métricas evaluadas
no fueron significativas (valor­p >0.05). Con estos enunciados no se descartó la
hipótesis nula, por lo que no podemos afirmar que haya diferencias en las medidas
morfométricas colectadas. Este análisis refleja el estado y momento del muestreo
de los individuos, por lo que un mayor numero de muestras reforzarán los resultados
obtenidos.

66
 CONCLUSIONES

1. Se muestrearon 81 individuos: 55 individuos de la especie Aglaeactis castel­

naudii y 26 individuos de la especie Aglaeactis cupripennis. A través de la
técnica de PCR, se identificó el sexo por la amplificación del gen CHD­1 en
15 individuos de A. castelnaudii (12 machos y 3 hembras) y 5 individuos de
A. cupripennis (4 machos y 1 hembra).

2. Los datos morfométricos categoricos colectados (grasa, protuberancia cloa­

cal ­ CP, parche de reproducción ­ BP) no representaron indicativos para po­
der ser usados como indicadores del sexo de los individuos en campo. Con
respecto a la estimación de la edad por ciclos de muda y porcentaje de estrías
confirmo que los individuos de este estudio fueron en su mayoría adultos para
A. castelnaudii (44) y A. cupripennis (16), la edad estimada de los individuos
no influyó en la identificación sexual por PCR de las especies muestreadas.
Los datos morfométricos numéricos fueron visualizados de manera explora­
toria a través de diagramas de cajas, no se observo una diferencia aparente
entre las distribuciones por sexo (incluyendo a especies de sexo no identifi­
cado) por lo que no fue posible proponer alguna de estas variables como un
diferenciador para ser usado en proyectos ecológicos de campo.

3. Se extrajo el material genético de 2 fuentes: plumas y tejido sanguíneo. Se ob­

tuvo una diferencia significativa cuanto a la cantidad y a los índices calidad de
ADN extraído, siendo mas altas en muestras de tejido sanguíneo impregnada
en carta de sangre de Macherey Nagel (entre 141.3 ­ 4070.3 ng/μl y 1.9 ­ 2.1
respectivamente) que en plumas y mas bajas en plumas rectrices colectadas
por arranque (entre 4.1 ­ 74.8 ng/μl y 1.51 ­ 2.03 respectivamente).

4. Para estandarizar la técnica de PCR, se realizaron 6 ensayos obteniendo

mejores resultados haciendo uso de un protocolo Touchdown PCR y el ce­
bador especifico CHD1F/CHD1R. Se detectó un patrón tanto para machos y
hembras, en el proceso se mejoró la técnica y se realizaron 25 repeticiones
para pruebas de PCR. Se logró amplificar los genes CHD1­W y CHD1­Z en
muestras de tejido sanguíneo de 20 individuos.

5. El secuenciamiento del fragmento del gen CHD1­1Z (machos) de las dos es­
pecies A. castelnaudii y A. cupripennis dio como resultado 2 bandas de 695
pb y 697 pb respectivamente, demostrando la conservación del gen en estas
especies.

67
6. Se analizó la influencia de los datos morfométricos categóricos por cada indi­
viduo sexado exitosamente para ambas especies. Estos valores representa­
ron una importancia para conocer el estado reproductivo y edad del ave pero
no influyeron en el sexado molecular o la diferenciación de los individuos.
En el caso de las medidas morfométricas y el peso, se evaluó a través de
una prueba de hipótesis no paramétrica de Mann–Whitney en un intervalo de
confianza al 95 %. Los resultados obtenidos no demostraron una significancia
estadística (valor ­ p >0.05), rechazando la hipótesis nula. Con estos resulta­
dos, no se puede afirmar que hayan diferencias en los datos morfométricos
numéricos acorde el sexo de los individuos de las especies estudiadas.

68
 RECOMENDACIONES

1. Se recomienda la colecta de plumas por arranque en otra región anatómica

del ave, para mejorar la cantidad y calidad de ADN genómico que se pueda
obtener sin necesidad de la colecta invasiva de tejido sanguíneo.

2. Se sugiere incrementar el número de muestras, para que los datos en com­

paración sean más diversos, esto puede mejorar con la técnica de colecta
usada y usar un método parametrico para su evaluación.

3. Promover el uso de nuevos instrumentos así como técnicas y equipos en los

laboratorios locales para poder replicar este tipo de estudios.

69
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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74
 ANEXOS

Anexo A: Aspectos de bioseguridad durante la colecta de muestras

Toda colecta de muestras que incluya el contacto con de algún fluido y/o tejido
del animal se realizará haciendo uso de equipos de protección personal: guantes
de nitrilo (evitamos el uso de guantes de látex debido al polvo antiadherente que
posee) y barbijo para evitar el contacto por accidente de algún fluido animal con
mucosas bucales del investigador y/o asistente.
Al ser este un estudio que pretende amplificar genes altamente específicos, se
evitará la contaminación de la muestra de cualquier tipo.
En el caso de las muestras de plumas, el tejido se encuentra queratinizado en las
base del tallo de las mismas, en muchos casos el desprendimiento de la pluma
puede provocar un sangrado en el cálamo por lo que es importante la protección
continua del investigador y el ave.

Anexo B: Protocolo de extracción de ADN

Protocolo de Extracción de ADN en tejido sanguíneo y plumas de Fenol Clo­

roformo Isoamyl (Sambrook & Russell (2001), modificado por Anderson V.
Chaves)

Etapa de Limpieza y desintegración por lisis (Día 1)

1. Separar las muestras y anotar en el cuaderno de extracción de ADN

2. Colocar Tris NH4Cl en baño 37°C y el Solución de Lisis de Madisen en baño

a 55°C

3. Trasferir un pequeño pedazo de tejido (o sangre) a tubos de 1,5 ml

4. Triturar el tejido o sangre coagulada con tijeras.

5. Adicionar 1 ml de Tris NH4Cl previamente calentado a 37°C

6. Vortexar e incubar en baño a 37°C por 5 min

7. Centrifugar 6.000 rpm 5 min

8. Descartar el sobrenadante

9. Repetir los pasos 5 a 8

10. Adicionar 1 ml de Solución Salina 0.85 %

75
 11. Vortexar

12. Centrifugar 6.000 rpm 5 min

13. Descartar el sobrenadante

14. Resuspender el pellet en 300 µl de High TE

15. Adicionar 400 µl de solución de Solución de Lisis de Madisen previamente

calentada a 50°C

16. Adicionar 8 µl de Proteinasa K 20 mg/ml (en freezer a ­20°C) – la cantidad

puede variar

17. Vortexar

18. Incubar en Termomixer a 55°C o baño a 55°C total la noche – overnight

Etapa de resuspención de ADN y precipitación (Día 2)

1. Vortexar el tejido lisado

2. Adicionar 10 µl de RNAse 10 mg/ml (en freezer a ­20°C) al material lisado

3. Dejar 3­5 min a temperatura ambiente

4. Adicionar 1 volume de Fenol: Cloroformo:Alcohol isoamil (25:24:1) (refrigera­

dora 2­4°C)

5. Agitar por 10 min

6. Centrifugar 14.000 rpm por 15 min

7. Transferir el sobrenadante para un tubo nuevo

8. Repetir los pasos 21 a 24

9. Adicionar 1 volumen de Cloroformo:Alcohol isoamil (24:1) (refrigeradora 2­

4°C)

10. Agitar por 10 min

11. Centrifugar 14.000 rpm por 15 min

12. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo

13. Adicionar 100 µl de Acetato de Amonio 7.5 M (refrigeradora) y completar con

isopropanol helado (refrigeradora)

14. Invertir hasta la precipitación del ADN

76
 15. Incubar en freezer para precipitar

Etapa de recuperación y dilución del DNA (Día 3)

1. Centrifugar 14.000 rpm 15 min a 4°C

2. Descartar el sobrenadante

3. Adicionar 1000 µl de etanol 70 % helado (refrigeradora o freezer)

4. Centrifugar 14.000 rpm 15 min

5. Descartar sobrenadante cuidadosamente

6. Dejar secar bien en la estufa ( 60°C max 1hr)

7. Adicionar 50 µl de Low TE (refrigeradora) ( el volumen va depender de la

cantidad de ADN obtenida)

8. Incubar en baño a 37°C 30 min (u overnight)

9. Almacenar las muestras en refrigeradora

10. Depositar muestras en freezer ­80°C

77
Anexo C: Geles de Electroforesis ­ Amplificacion del gen CHD­1

Figura N° 37: Análisis de productos amplificados con el cebador CHD­F/CHR­R por TD­PCR, en
agarosa 2 % (3). Nota. AGCA: A. castelnaudii, C­: Control.

Figura N° 38: Análisis de productos amplificados con el cebador CHD­F/CHR­R por TD­PCR, en
agarosa 2 % (4). Nota. AGCA: A. castelnaudii, AGCU: A. cupripennis, C­: Control.

78
Anexo E: Secuenciamiento de fragmentos del gen CHD­1Z

Figura N° 39: Secuenciamiento del gen CHD­1Z

Anexo D: Datos usados para el análisis

79
 Tabla N° 25: Datos usados en el análisis de datos morfométricos numéricos para A. castelnaudii

Fecha Hora Estacion Grasa Bp Cp Sexo Muda Cuerpo Muda Limite Desgaste Estrias Ciclo Muda Ala Cola Tarso Pico Narinas Culmen Ancho Peso Muda
2016­11­21 16:58 YANA01 1 1 2 D 0 D 2 0 DCB 70 46 7.4 19.1 3.1 6.54 N
2016­11­21 16:39 YANA01 0 4 1 D 0 D 2 50 FCF 75 50 4.9 18 2.7 6.67 N
2016­11­21 16:39 YANA01 0 4 1 D 0 D 3 10 DCB 77 49 5.4 16 2.6 6.84 N
2016­11­21 9:33 YANA01 1 2 3 D 1 D 1 0 DCB 68 49 5.6 19.4 3.8 6.93 N
2016­11­21 7:30 YANA01 0 0 3 D 0 D 1 10 DCB 77 48 5.3 19.5 3.8 6.93 N
2016­11­22 11:15 YANA01 1 1 3 D 1 D 2 50 FCF 71 47 5.1 18.8 3 6.68 N
2017­10­20 8:35 YANA02 0 0 1 D 2 D 0 0 DCB 69 46 6.1 19.3 2.8 6.93 N
2017­10­20 12:00 YANA02 0 1 2 D 2 D 1 50 FCF 81 48 5.7 19.2 3.3 7.01 N
2017­10­20 10:43 YANA02 0 0 1 D 2 D 0 0 FAJ 72 49 6 18.8 2.9 7.15 N
2017­11­19 10:30 YANA02 1 1 2 D 0 D 1 95 FCF 75 48 5.9 17 2.5 6.47 N
2017­11­19 10:30 YANA02 1 0 2 D 0 D 4 50 FCF 74 51 6.4 17.1 3.2 6.91 N
2017­12­17 7:50 YANA02 1 0 3 D 0 N 1 10 DCB 82 51 5.3 17.1 2.4 7.19 N
2018­08­18 7:13 YANA02 0 0 1 D 0 N 5 0 DCB 74 47 5.6 18.7 3 6.79 N
2018­08­18 6:32 YANA02 0 0 0 D 2 N 5 70 FCF 74 50 6.1 18.4 3 6.85 N
2018­08­18 13:25 YANA02 1 0 0 D 1 N 4 95 FCF 65 51 5.3 18.6 2.7 7.4 N
2018­08­18 10:59 YANA02 0 0 1 D 0 N 5 95 FCF 71 49 5.2 18.7 3.2 N
2018­08­19 11:18 YANA02 0 0 2 D 1 P 4 60 FCF 71 46 6.6 16.5 3.3 6.2 N
2018­08­19 10:36 YANA02 1 0 1 D 3 N 2 10 DPB 69 44 5 17.2 2.8 6.55 Y
2018­08­19 11:06 YANA02 1 1 2 D 2 N 4 50 FCF 70 49 7.3 16.5 2.9 6.65 N
2018­08­19 10:10 YANA02 0 1 2 D 2 N 4 10 DCB 73 48 5.7 16 2.5 6.72 N
2018­08­19 11:00 YANA02 0 0 2 D 1 N 3 95 FPF 70 50 5.1 19.1 3.2 6.82 N
2018­08­19 10:41 YANA02 0 0 1 D 0 N 1 70 FCF 74 44 7 16.1 3.1 6.88 N
2018­08­19 10:53 YANA02 0 0 1 D 0 N 5 75 FCF 75 50 5.3 18.8 3 7.06 N
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2018­08­28 18:00 YANA02 0 0 3 D 0 D 2 0 DCB 75 45 5.4 18.2 3.2 7.29 N
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2018­09­27 7:20 YANA02 2 0 1 D 0 N 5 0 FAJ 75 48 5.4 18.3 3.1 6.45 N
2018­09­27 8:40 YANA02 1 2 3 D 0 N 5 30 FAJ 74 49 5.9 17.1 2.5 6.99 N
2018­09­30 9:58 YANA03 0 1 1 D 1 N 4 70 FCF 66 46 6.1 21.4 2.8 6.83 N
2018­09­30 7:50 YANA03 0 0 1 D 0 N 4 90 FCF 69 46 5.5 18.9 3.5 6.95 N
80
 Tabla N° 26: Datos usados en el análisis de datos morfométricos numéricos para A. castelnaudii (parte 2)

Fecha Hora Estacion Grasa Bp Cp Sexo Muda Cuerpo Muda Limite Desgaste Estrias Ciclo Muda Ala Cola Tarso Pico Narinas Culmen Ancho Peso Muda
2018­10­24 10:00 YANA02 1 3 1 D 0 N 4 0 FAJ 74 50 7.6 21.7 2.5 6.17 N
2018­10­24 11:00 YANA02 3 4 2 D 3 N 5 0 FCF 74 48 6.5 17.1 3.1 7.13 N
2018­10­24 13:00 YANA02 0 4 2 D 0 N 5 30 DCB 72 40 7.1 20.3 2.9 7.26 N
2018­10­24 12:00 YANA02 2 4 2 D 0 N 5 0 FCF 81 49 6.5 21.2 2.2 7.48 N
2018­10­24 12:00 YANA02 1 2 2 D 2 N 5 50 FPF 65 43 7.1 18 2.4 7.6 N
2018­10­24 7:00 YANA02 1 2 3 D 1 N 5 0 FAJ 73 51 6 23.5 2.9 N
2019­08­10 16:48 YANA04 0 2 1 M 3 N 5 25 FPF 72 47 6.5 18.4 2.6 6.8 Y
2019­08­10 16:16 YANA04 0 0 0 F 0 N 5 75 FCF 75 51 7.4 18.6 3.2 6.86 N
2019­08­10 15:50 YANA04 0 0 2 M 0 N 3 25 FCF 75 50 6.1 18.5 3.1 7.04 N
2019­08­10 16:35 YANA04 0 0 1 M 2 N 5 0 DPB 50 7.1 20.1 3.2 7.21 Y
2019­08­11 11:45 YANA04 0 0 1 M 0 N 4 75 FCF 75 50 6.4 19.4 2.3 7.06 N
2019­09­29 7:40 YANA04 0 1 2 M 2 N 4 0 DCB 78 48 7.4 19.8 2.3 6.88 N
2019­09­29 8:33 YANA04 0 0 2 F 3 N 5 0 DPB 69 49 7.4 19.5 2.7 6.9 Y
2019­09­29 12:55 YANA04 0 0 2 M 1 N 5 0 DCB 75 46 7.2 19.5 2.7 7.1 N
2019­09­29 8:11 YANA04 0 0 2 M 1 N 5 95 FCF 73 48 7.2 19.5 2.7 N
2019­10­26 14:20 QELLO01 0 0 2 M 0 N 5 50 DCB 77 50 7.4 18.5 2.8 6.61 N
2019­10­27 7:00 QELLO01 0 0 2 M 0 N 4 0 DCB 74 48 7.5 18.7 2.8 6.47 N
2019­10­27 9:00 QELLO01 0 0 1 M 0 N 5 25 DCB 80 46 6.8 18.2 2.7 6.74 N
2019­11­25 12:15 POLY01 0 0 2 M 0 N 5 10 DCB 75 48 7.1 19.8 2.7 6.61 N
2019­12­20 16:00 YANA02 0 1 0 M 0 N 5 0 DCB 75 46 7.2 18.3 2.9 6.03 N
2019­12­20 8:00 YANA02 0 0 2 F 2 N 4 0 DCB 75 47 7.2 18.9 2.7 7.58 N
81
 Tabla N° 27: Datos usados en el análisis de datos morfométricos numéricos para A. cupripennis

Fecha Hora Estacion Grasa Bp Cp Sexo Muda Cuerpo Muda Limite Desgaste Estrias Ciclo Muda Ala Cola Tarso Pico Narinas Culmen Ancho Peso Muda
2018­08­18 10:50 YANA02 0 0 0 D 2 N 5 80 FCF 80 52 5.1 17.1 2.1 6.48 N
2018­08­18 7:28 YANA02 0 0 0 D 4 N 4 80 FCF 73 47 4 16.7 2.8 6.74 N
2018­08­19 11:44 YANA02 1 0 1 D 3 N 4 90 FPF 77 46 6.7 17.3 2.8 6.51 Y
2018­08­19 11:23 YANA02 1 0 2 D 5 N 3 95 FPF 84 48 5 17 3 6.63 Y
2018­08­19 10:25 YANA02 0 1 1 D 0 N 3 60 FCF 76 41 6.6 16.1 2.4 6.74 N
2018­08­19 11:10 YANA02 0 0 1 D 1 N 4 90 FCF 81 50 5.8 16.5 2.7 6.89 N
2018­08­19 13:11 YANA02 0 0 1 D 0 N 4 25 DCB 70 50 5.5 18.1 3.2 6.94 N
2018­08­19 10:48 YANA02 1 0 2 D 4 N 2 50 DPB 84 46 5.5 16.5 3 7.05 Y
2018­08­19 13:03 YANA02 1 0 0 D 1 P 5 95 FCF 74 50 5.5 17.5 3.4 7.22 N
2018­08­19 12:00 YANA02 0 0 1 D 1 N 4 95 FCF 79 49 5.7 16.3 2.3 7.33 N
2018­09­27 9:00 YANA02 1 2 3 D 1 N 3 0 UCU 72 48 16.6 3.2 6.72 N
2018­09­27 12:00 YANA02 1 2 3 D 0 N 3 0 DPB 78 51 6.2 16 2.8 6.93 N
2018­09­30 9:55 YANA03 0 0 1 D 0 P 5 90 FCF 77 47 4.9 17.5 3.4 6.27 N
2018­09­30 10:38 YANA03 0 0 0 D 1 P 4 50 FCF 87 45 6.6 18.3 2.3 6.51 N
2018­09­30 10:21 YANA03 0 0 3 D 2 N 4 70 FCF 78 52 6.7 15.5 2.1 6.65 N
2018­09­30 13:23 YANA03 0 0 2 D 0 N 5 60 FCF 76 47 18.1 2.6 6.8 N
2018­09­30 10:24 YANA03 0 0 1 D 1 P 5 95 FCF 81 53 4.9 16.8 2.6 7.26 N
2018­10­23 18:00 YANA02 1 2 2 D 0 P 4 0 FCF 85 39 16.9 2.3 6.84 N
2018­10­24 10:00 YANA02 1 3 1 D 0 N 4 0 FAJ 74 50 7.6 21.7 2.5 6.17 N
2018­10­24 11:00 YANA02 3 4 2 D 3 N 5 0 FCF 74 48 6.5 17.1 3.1 7.13 N
2018­10­24 13:00 YANA02 0 4 2 D 0 N 5 30 DCB 72 40 7.1 20.3 2.9 7.26 N
2018­10­24 12:00 YANA02 2 4 2 D 0 N 5 0 FCF 81 49 6.5 21.2 2.2 7.48 N
2018­10­24 12:00 YANA02 1 2 2 D 2 N 5 50 FPF 65 43 7.1 18 2.4 7.6 N
2018­10­24 7:00 YANA02 1 2 3 D 1 N 5 0 FAJ 73 51 6 23.5 2.9 N
2019­08­10 16:48 YANA04 0 2 1 M 3 N 5 25 FPF 72 47 6.5 18.4 2.6 6.8 Y
2019­08­10 16:16 YANA04 0 0 0 F 0 N 5 75 FCF 75 51 7.4 18.6 3.2 6.86 N
2019­08­10 15:50 YANA04 0 0 2 M 0 N 3 25 FCF 75 50 6.1 18.5 3.1 7.04 N
2019­08­10 16:35 YANA04 0 0 1 M 2 N 5 0 DPB 50 7.1 20.1 3.2 7.21 Y
2019­08­11 11:45 YANA04 0 0 1 M 0 N 4 75 FCF 75 50 6.4 19.4 2.3 7.06 N
2019­09­29 7:40 YANA04 0 1 2 M 2 N 4 0 DCB 78 48 7.4 19.8 2.3 6.88 N
2019­09­29 8:33 YANA04 0 0 2 F 3 N 5 0 DPB 69 49 7.4 19.5 2.7 6.9 Y
2019­09­29 12:55 YANA04 0 0 2 M 1 N 5 0 DCB 75 46 7.2 19.5 2.7 7.1 N
2019­09­29 8:11 YANA04 0 0 2 M 1 N 5 95 FCF 73 48 7.2 19.5 2.7 N
2019­10­26 14:20 QELLO01 0 0 2 M 0 N 5 50 DCB 77 50 7.4 18.5 2.8 6.61 N
2019­10­27 7:00 QELLO01 0 0 2 M 0 N 4 0 DCB 74 48 7.5 18.7 2.8 6.47 N
2019­10­27 9:00 QELLO01 0 0 1 M 0 N 5 25 DCB 80 46 6.8 18.2 2.7 6.74 N
2019­11­25 12:15 POLY01 0 0 2 M 0 N 5 10 DCB 75 48 7.1 19.8 2.7 6.61 N
2019­12­20 16:00 YANA02 0 1 0 M 0 N 5 0 DCB 75 46 7.2 18.3 2.9 6.03 N
2019­12­20 8:00 YANA02 0 0 2 F 2 N 4 0 DCB 75 47 7.2 18.9 2.7 7.58 N
82
Anexo E: Imágenes del procedimiento

(a) Estación de muestreo Polylepis. (b) Vista de la laguna de Yanacocha.

(c) Estación de muestreo Quellococha. (d) Estación de muestreo Yanacocha

(e) Toma de datos morfométricos en campo. (f) Toma de datos en campo.

(g) Revisión: patrones de muda y color. (h) Toma de muestras de sangre.

Figura N° 40: Monitoreo en campo y toma de muestras.

83
 (b) Extracción de ADN de sangre y plumas.
(a) Preparación para extracción de ADN.

(c) Extracción por el protocolo de fenol cloro­ (d) Revisión con el espectrofotómetro.
formo.

(e) Resultados de análisis espectofotometría.

Figura N° 41: Extracción de ADN

84
 (b) Preparación de muestras para PCR.

(a) Preparación de master mix para PCR.

(c) Carril de tubos de PCR. (d) Programación de termociclador.

(f) Revisión de geles con transiluminador UV.

(e) Electroforesis.

Figura N° 42: PCR y visualización de Geles de Agarosa

85
 Figura N° 43: Equipo de trabajo de campo en Agosto 2019.

Figura N° 44: Equipo de trabajo de laboratorio en Febrero del 2020.

Anexo F: Permisos de Investigación y Autorización del Comité de Ética UN­

SAAC

86
 Firmado digitalmente por CERDAN
QUILIANO Miriam Mercedes FAU
20562836927 soft
Cargo: Directora General
Motivo: Soy el autor del documento
Fecha: 14.12.2020 11:16:24 -05:00

Magdalena Del Mar, 14 de Diciembre del 2020

RDG N° D000399-2020-MIDAGRI-SERFOR-DGGSPFFS

VISTOS:

La solicitud de autorización para realizar investigación científica en fauna

silvestre fuera de Áreas Naturales Protegidas - ANP, presentada el día 4 de diciembre
de 2019 por el señor David Guevara Apaza (CUT N° 60861-2019), ciudadano peruano
identificado con DNI N° 70386803; así como, el Informe Técnico N° D000642-2020-
MIDAGRI-SERFOR-DGSPFS, de fecha 14 de diciembre de 2020; y,

CONSIDERANDO:

Que, mediante el artículo 13 de la Ley N° 29763, Ley Forestal y de Fauna

Silvestre, se creó el Servicio Nacional Forestal y de Fauna Silvestre - SERFOR, como
un organismo público técnico especializado con personería jurídica de derecho público
interno, como pliego presupuestal adscrito al Ministerio de Agricultura y Riego; artículo
en el que además se señala que el SERFOR es la autoridad nacional forestal y de fauna
silvestre, ente rector del Sistema Nacional de Gestión Forestal y de Fauna Silvestre -
SINAFOR, constituyendo su autoridad técnico normativa a nivel nacional, encargada de
dictar las normas y establecer los procedimientos relacionados a su ámbito;

Que, a través del Decreto Supremo N° 019-2015-MINAGRI, se aprobó el

Reglamento para la Gestión de Fauna Silvestre, vigente desde el 1 de octubre de 2015,
reglamento que en el numeral 134.1 de su artículo 134, precisa que la investigación
científica del patrimonio se aprueba mediante autorizaciones, salvaguardando los
derechos del país, respecto a su patrimonio genético nativo; asimismo, en el numeral
134.5 del citado artículo, se dispone que el desarrollo de actividades de investigación
básica taxonómica de fauna silvestre, relacionada con estudios moleculares con fines
taxonómicos, sistemáticos, filogeográficos, biogeográficos, evolutivos y de genética de
la conservación, entre otras investigaciones sin fines comerciales, son aprobadas a
través de autorizaciones de investigación científica;

Que, según el numeral 134.2 del artículo 134 del Reglamento para la Gestión de
Fauna Silvestre, es competencia del SERFOR la evaluación de la presente solicitud,
toda vez que el estudio incluye el registro de especies amenazadas por el Decreto
Supremo N° 004-2014-MINAGRI y listadas en los Apéndices de la Convención sobre el
Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres - CITES,
además se hará uso de herramientas moleculares como parte de su metodología;

Que, de acuerdo al literal g) del artículo 53 del Reglamento de Organización y

Funciones - ROF del SERFOR, aprobado por Decreto Supremo N° 007-2013-MINAGRI
y modificado por Decreto Supremo N° 016-2014-MINAGRI; la Dirección General de
Gestión Sostenible del Patrimonio Forestal y de Fauna Silvestre, tiene por función, entre
otras, el otorgar permisos de investigación o de difusión cultural con o sin colecta de
flora y fauna silvestre y sus recursos genéticos;

Esta es una copia auténtica imprimible de un documento electrónico archivado en el Servicio Forestal y de Fauna Silvestre, aplicando lo dispuesto
por el Art. 25 de D.S. 070-2013-PCM y la Tercera Disposición Complementaria Final del D.S. 026-2016-PCM. Su autenticidad e integridad pueden
ser contrastadas a través de la siguiente dirección web: Url: https://sgd.serfor.gob.pe/validadorDocumental/ Clave: BFIX2WV
 Que, mediante Resolución de Dirección Ejecutiva N° 060-2016-SERFOR/DE,
expedida el 1 de abril de 2016, se aprobaron los “Lineamientos para el otorgamiento de
la autorización con fines de investigación científica de flora y/o fauna silvestre”;

Que, en el actual Texto Único de Procedimientos Administrativos - TUPA del

SERFOR, aprobado por Decreto Supremo N° 001-2016-MINAGRI y modificado por
Resolución Ministerial N° 613-2016-MINAGRI, Resolución Ministerial N° 026-2019-
MINAGRI y Resolución de Dirección Ejecutiva N° D000103-2020-MINAGRI-SERFOR-
DE; no se contempla el procedimiento de autorización para realizar investigación
científica fuera de ANP;

Que, en observancia del principio de impulso de oficio, previsto en el numeral 1.3

del artículo IV del Título Preliminar del Texto Único Ordenado - TUO de la Ley N° 27444,
Ley del Procedimiento Administrativo General, aprobado por Decreto Supremo N° 004-
2019-JUS; se desprende que las autoridades deben dirigir e impulsar de oficio el
procedimiento y ordenar la realización o práctica de los actos que resulten convenientes
para el esclarecimiento y resolución de las cuestiones necesarias;

Que, por tanto, cabe señalar que en el numeral 26 del Anexo N° 2 del
Reglamento para la Gestión de Fauna Silvestre, en concordancia al numeral 6.6 de los
lineamientos aprobados por Resolución de Dirección Ejecutiva N° 060-2016-
SERFOR/DE; se establecen los siguientes requisitos para la autorización con fines de
investigación científica fuera de ANP: i) Solicitud con carácter de declaración jurada que
contenga información sobre el investigador, según formato; ii) Hoja de vida del
investigador principal y plan de investigación, según formato; iii) Carta de presentación
de los investigadores participantes, emitida por la institución académica u organización
científica nacional o extranjera de procedencia; iv) Documento que acredite el
consentimiento informado previo, expedido por la respectiva organización comunal
representativa, de corresponder; y v) Documento que acredite el acuerdo entre las
instituciones que respaldan a los investigadores nacionales y extranjeros, en caso la
solicitud sea presentada por un investigador extranjero;

Que, mediante solicitud s/n recibida el 4 de diciembre de 2019, el señor David

Guevara Apaza, (en adelante, el administrado), bachiller de la Facultad de Ciencias de
la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco - UNSAAC, solicitó autorización
para realizar investigación científica en fauna silvestre, con captura temporal de aves y
colecta definitiva de plumas y sangre, como parte del proyecto titulado: “Determinación
Sexual en aves monomórficas a través de herramientas genéticas en la cordillera del
Vilcanota”; investigación a ser efectuada fuera de ANP, en los bosques de Yanacocha
y en el Área de Conservación Privada - ACP Santuario de la Verónica, ambos ubicados
en la provincia de Urubamba y departamento de Cusco, por el periodo de nueve (09)
meses;

Que, mediante Memorándum N° 532-2019-MINAGRI-SERFOR-ATFFS - Cusco

recibido el 19 de diciembre de 2019, la Administración Técnica Forestal y de Fauna
Silvestre de Cusco del SERFOR remite a la Dirección de Gestión Sostenible del
Patrimonio de Fauna Silvestre – DGSPFS, la solicitud de Autorización con fines de
investigación científica presentada por el señor David Guevara Apaza, toda vez que el
proyecto de investigación solicitado incluye el uso de herramientas moleculares;

Esta es una copia auténtica imprimible de un documento electrónico archivado en el Servicio Forestal y de Fauna Silvestre, aplicando lo dispuesto
por el Art. 25 de D.S. 070-2013-PCM y la Tercera Disposición Complementaria Final del D.S. 026-2016-PCM. Su autenticidad e integridad pueden
ser contrastadas a través de la siguiente dirección web: Url: https://sgd.serfor.gob.pe/validadorDocumental/ Clave: BFIX2WV
 Que, a través del Decreto Supremo N° 008-2020-SA, publicado el 11 de marzo
de 2020, se declaró en Emergencia Sanitaria a nivel nacional, por el plazo de noventa
(90) días calendario, debido a la existencia del COVID-19; siendo que mediante Decreto
Supremo N° 020-2020-SA, Decreto Supremo N° 027-2020-SA y Decreto Supremo N°
031-2020-SA, la Emergencia Sanitaria fue ampliada hasta el 6 de marzo de 2021;

Que, mediante Decreto Supremo N° 044-2020-PCM, publicado el 15 de marzo

de 2020, se declaró el Estado de Emergencia Nacional por el plazo de quince (15) días
calendario, ordenándose un aislamiento social obligatorio (cuarentena), a consecuencia
del brote del COVID-19; así como, por Decreto Supremo N° 051-2020-PCM, Decreto
Supremo N° 064-2020-PCM, Decreto Supremo N° 075-2020-PCM, Decreto Supremo N°
083-2020-PCM, Decreto Supremo N° 094-2020-PCM, Decreto Supremo N° 116-2020-
PCM, Decreto Supremo N° 135-2020-PCM, Decreto Supremo N° 146-2020-PCM,
Decreto Supremo N° 156-2020-PCM, Decreto Supremo N° 174-2020-PCM y el Decreto
Supremo N° 184-2020-PCM, se dispuso prorrogar el Estado de Emergencia Nacional,
hasta el 31 de diciembre de 2020;

Que, a través del numeral 2 de la Segunda Disposición Complementaria Final

del Decreto de Urgencia N° 026-2020, publicado el 15 de marzo de 2020, se declaró la
suspensión por treinta (30) días hábiles, del cómputo de los plazos de tramitación de los
procedimientos administrativos sujetos a silencio positivo y negativo que se encontraban
en trámite a la entrada en vigor de la citada norma, con excepción de aquéllos que
contaban con un pronunciamiento de la autoridad pendiente de notificación a los
administrados; suspensión que por Decreto Supremo N° 076-2020-PCM, fue ampliada
por quince (15) días hábiles;

Que, mediante el artículo 28 del Decreto de Urgencia N° 029-2020, publicado el

20 de marzo de 2020, se declaró la suspensión por treinta (30) días hábiles, del cómputo
de los plazos de inicio y de tramitación de los procedimientos administrativos y
procedimientos de cualquier índole, incluso los regulados por leyes y disposiciones
especiales, que se encontraban sujetos a plazo, siendo tramitados en entidades del
sector público, y que no estaban comprendidos en los alcances de la Segunda
Disposición Complementaria Final del Decreto de Urgencia N° 026-2020; suspensión
que también resultó aplicable a los procedimientos en trámite a la entrada en vigor del
Decreto de Urgencia N° 029-2020, la cual fue prorrogada por quince (15) días hábiles,
en mérito al artículo 12 del Decreto de Urgencia N° 053-2020;

Que, mediante Decreto Legislativo N° 1497, publicado el 10 de mayo de 2020, se

dispuso la suspensión hasta el 31 de diciembre de 2020, de la aplicación del numeral
134.3 del artículo 134 del TUO de la Ley N° 27444, Ley del Procedimiento Administrativo
General, respecto a la obligación de la presentación física del escrito o documentación
por parte de los administrados;

Que, a través del Decreto Supremo N° 087-2020-PCM, publicado el 20 de mayo

de 2020, se dispuso ampliar hasta el día 10 de junio de 2020, la suspensión del cómputo
de los plazos de tramitación de los procedimientos administrativos; suspensión que fue
declarada por el numeral 2 de la Segunda Disposición Complementaria Final del Decreto
de Urgencia N° 026-2020, y por el artículo 28 del Decreto de Urgencia N° 029-2020;

Esta es una copia auténtica imprimible de un documento electrónico archivado en el Servicio Forestal y de Fauna Silvestre, aplicando lo dispuesto
por el Art. 25 de D.S. 070-2013-PCM y la Tercera Disposición Complementaria Final del D.S. 026-2016-PCM. Su autenticidad e integridad pueden
ser contrastadas a través de la siguiente dirección web: Url: https://sgd.serfor.gob.pe/validadorDocumental/ Clave: BFIX2WV
 Que, mediante correo electrónico de fecha 08 de abril de 2020, efectuado a la
dirección electrónica autorizada por el administrado ([email protected]);
la Dirección de Gestión Sostenible del Patrimonio de Fauna Silvestre - DGSPFS
comunicó las observaciones identificadas en la solicitud antes mencionada, a fin que
fueran subsanadas, las mismas que consistieron en: i) La Sección 6, Métodos y
Técnicas detallados, subtítulo “Metodología para estudio temporal de aves” se indica
que: “En el caso de las aves pequeñas, serán anilladas para posterior monitoreo y
liberadas …….”; al respecto, debido que no se evidencia de manera explícita la
experiencia del investigador en el uso de la técnica de marcaje por anillamiento, se debe
sustentar esta experiencia incluyéndolo en la hoja de vida, o indicar la experiencia de
alguno de los otros investigadores participantes; ii) Indicar el tipo de anillos a utilizar y
definir el término “aves pequeñas”; iii) Presentar mayores detalles metodológicos en
relación a la manipulación de las aves durante el marcaje, y la extracción de muestras
de sangre y plumas; además, acotar las medidas de bioseguridad que se contemplaran
durante estos procedimientos, asimismo, se debe considerar en todo momento los
criterios de bienestar animal (Ley 30407, 2016); iv) Detallar los datos del/los laboratorio
(s) donde se realizarán los estudios moleculares (extracción, amplificación y
secuenciamiento) a partir de las muestras colectadas, indicando el nombre de la
institución, nombre del responsable del laboratorio, dirección legal de la institución,
teléfono y correo electrónico de contacto, asimismo, se deberá informar cuál será el
destino de las muestras remanentes de sangre y plumas luego de realizado los análisis;
v) En relación a la sección 7, Detalle y Justificación de la colecta definitiva y/o Captura
temporal, no se indica el número de individuos por especie de los que se extraerán
muestras; en ese sentido, se deberá incluir una tabla donde se indique la especie, el
número máximo de individuos de donde se extraerá muestra (para sangre y pluma) por
cada localidad y si se trata de una especie protegida (D.S. Nº 004-2014-MINAGRI),
especie CITES como las especies de la familia Trochilidae), o con endemismo marcado;
y vi) Finalmente en caso de contar con la autorización de ingreso al Área de
Conservación Privada La Verónica, adjuntarlo;

Que, mediante correo electrónico de fecha 8 de mayo de 2020, el administrado

remitió la subsanación de las observaciones comunicadas, conforme se precisa a
continuación: i) Adjuntó su CV, como sustento de su experiencia en manejo de aves,
anillamiento y toma de muestras; ii) Señaló que los tipos de anillos y el uso de "aves
pequeñas" están aclarados en el Anexo II del documento adjunto; iii) Remitió un nuevo
plan de investigación con las precisiones solicitadas e inclusión de un nuevo cronograma
de trabajo extendiendo la investigación por un periodo de doce (12) meses; iv) Remitió
la lista de especies en el Anexo I del documento adjunto; y v) Con respecto al ACP
Santuario de la Verónica, indicó que cuenta con un acuerdo oral y un compromiso escrito
del propietario, el mismo que informó de la redacción de la carta de autorización de este
año, no obstante debido al retraso de la autorización y el contexto actual, no se ha
podido concretar la suscripción de dicha carta; subsanando así las observaciones
comunicadas;

Que, a través de la Resolución Ministerial N° 0177-2020-MINAGRI, expedida el

31 de julio de 2020, se aprobó el “Protocolo para la implementación de medidas de
vigilancia, prevención y control frente al COVID-19 en las actividades de fauna silvestre”;

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por el Art. 25 de D.S. 070-2013-PCM y la Tercera Disposición Complementaria Final del D.S. 026-2016-PCM. Su autenticidad e integridad pueden
ser contrastadas a través de la siguiente dirección web: Url: https://sgd.serfor.gob.pe/validadorDocumental/ Clave: BFIX2WV
 Que, mediante Informe Técnico N° D000642-2020-MIDAGRI-SERFOR-
DGSPFS, emitido el 14 de diciembre de 2020 y cuyo contenido forma parte integrante
de la presente resolución; la DGSPFS precisa que la presente investigación prevé la
captura temporal in situ de especímenes de la Clase Aves, para marcaje, para toma de
datos biométricos y obtención de muestras de sangre, plumas y la colecta de artrópodos
ectoparásitos encontradas en las aves capturadas; para realizar el análisis genético con
fines taxonómicos;

Que, asimismo, tras el análisis de las conclusiones y recomendaciones

expuestas en el referido informe técnico; se desprende, entre otros, lo siguiente: i) De
acuerdo a los objetivos, métodos y técnicas detallados en el plan de investigación, el
estudio no representa un riesgo para las poblaciones silvestres presentes en el área de
estudio; ii) La presente investigación reviste de importancia porque permitirá generar
información referido al sexo de aves alto andinas monocromáticas de los bosques de
Yanacocha y el ACP Santuario de la Verónica, Cusco a través de herramientas
moleculares; iii) El área de estudio de la presente investigación se circunscribe a la
localidad de Yanacocha, ubicada en el distrito de Huayllabamba y al ACP Santuario de
la Verónica, ubicada en el distrito de Ollantaytambo, previa autorización para el ingreso
y desarrollo de la investigación que nos ocupa, emitida por el responsable o
representante de dicha ACP; ambos ubicados en la provincia de Urubamba y
departamento de Cusco; iv) La solicitud materia de evaluación, cumple con todos los
requisitos exigidos en el numeral 26 del Anexo N° 2 del Reglamento para la Gestión de
Fauna Silvestre, y en los lineamientos para el otorgamiento de la autorización con fines
de investigación de flora y/o fauna silvestre; por lo que se recomienda aprobar la
solicitud de autorización presentada por el señor David Guevara Apaza, para realizar la
investigación científica: “Determinación Sexual en aves monomórficas a través de
herramientas genéticas en la cordillera del Vilcanota”, por el periodo de doce (12)
meses, según el cronograma de trabajo presentado; v) Corresponde incorporar en la
Resolución de Dirección General que apruebe la autorización de investigación científica,
como parte de las obligaciones, el implementar las medidas dispuestas en el “Protocolo
para la implementación de medidas de vigilancia, prevención y control frente al COVID-
19 en las actividades de fauna silvestre”, establecidas en los numerales 8, 11, 12 y
12.1.3, en lo que resulte aplicable; protocolo aprobado por Resolución Ministerial N°
0177-2020-MINAGRI; y vi) Corresponde incorporar como parte de los compromisos, la
aplicación de medidas en campo que garanticen la protección y bienestar de los
especímenes a estudiar durante la ejecución del proyecto, además de implementar
protocolos de bioseguridad, necesarios para evitar las zoonosis procedentes de las
poblaciones de fauna silvestre;

Que, de conformidad con lo establecido en la Ley N° 29763, Ley Forestal y de

Fauna Silvestre, el Reglamento para la Gestión de Fauna Silvestre, aprobado mediante
Decreto Supremo N° 019-2015-MINAGRI, el TUO de la Ley N° 27444, Ley del
Procedimiento Administrativo General, aprobado por Decreto Supremo N° 004-2019-
JUS; así como, en ejercicio de las atribuciones conferidas por el literal g) del artículo 53
del Reglamento de Organización y Funciones del SERFOR, aprobado por Decreto
Supremo N° 007-2013-MINAGRI y modificado por Decreto Supremo N° 016-2014-
MINAGRI;

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por el Art. 25 de D.S. 070-2013-PCM y la Tercera Disposición Complementaria Final del D.S. 026-2016-PCM. Su autenticidad e integridad pueden
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 SE RESUELVE:

Artículo 1°.- Otorgar la autorización con fines de investigación científica de fauna

silvestre fuera de Áreas Naturales Protegidas, al señor David Guevara Apaza,
investigador de nacionalidad peruana, identificado con DNI N° 70386803, para la
realización de la investigación científica titulada: “Determinación Sexual en aves
monomórficas a través de herramientas genéticas en la cordillera del Vilcanota”,
en virtud de las consideraciones antes expuestas; correspondiéndole el Código de
Autorización N° AUT-IFS-2020-060.

Artículo 2°.- La autorización de investigación científica otorgada, implica la

captura temporal in situ de especímenes de la Clase Aves, para marcaje, toma de datos
biométricos y colecta de muestras de sangre, plumas y artrópodos ectoparásitos
encontradas en las aves capturadas; para realizar el análisis genético con fines
taxonómicos; a ser realizado en la localidad de Yanacocha, distrito de Huayllabamba,
departamento Cusco y en el ACP Santuario de la Verónica, distrito de Ollantaytambo,
departamento Cusco, de acuerdo a lo descrito en el Anexo 1 adjunto. Sin embargo, el
ingreso al ACP Santuario de la Verónica, corresponde ser autorizado previamente, por
lo que es responsabilidad del señor David Guevara Apaza, gestionar la citada
autorización; es decir, la presente autorización de investigación, no comprende la
autorización que debe ser emitida por el responsable del ACP citada, respecto al ingreso
y desarrollo de la investigación que nos ocupa.

Artículo 3°.- El marcaje únicamente será realizado para aves pequeñas,

especies de diversas familias que no superen 30 cm de la cordura alar y que el tamaño
del anillo metálico sea menor a 5.56 mm, serán anilladas con anillos de aluminio para
posterior monitoreo y liberadas luego de la toma de datos.

Artículo 4°.- En mérito a la autorización que precede, el señor David Guevara

Apaza se encuentra sujeto al cumplimiento del cronograma de trabajo aprobado, el cual
comprende un periodo de doce (12) meses, a ser contabilizados a partir del día hábil
siguiente de la fecha de notificación de la presente resolución.

Artículo 5°.- Autorizar la participación de los investigadores propuestos por el

señor David Guevara Apaza, para integrar el correspondiente equipo de investigación,
conforme se detalla a continuación:

Nombres y Documento
Nacionalidad Cargo Institución
Apellidos de Identidad
Julia Griselda DNI N°
Peruana Colaboradora UNSAAC
Muñiz Durand 23822964
Rubens Brayan DNI N° Co-
Peruana UNSAAC
Ñaca Tuco 70329961 investigador
Erick Waldir DNI N° Co-
Peruana UNSAAC
Huamán Vargas 76476962 investigador
Karen Marcela DNI N°
Peruana Colaboradora UNSAAC
Miranda Pino 75157942

Artículo 6°.- En atención a la autorización otorgada, el titular adquiere las

siguientes obligaciones:

a) No extraer especímenes ni muestras biológicas de fauna silvestre no

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 autorizadas, no ceder los mismos a terceros, ni utilizarlos para fines distintos
a lo autorizado.
b) Cumplir con el plan de investigación aprobado, el cual incluye la metodología,
área de estudio, cronograma de trabajo, entre otros.
c) No contactar ni ingresar a territorios comunales, sin contar con la autorización
del representante legal de la comunidad correspondiente.
d) Solicitar el correspondiente Permiso de Exportación ante la Dirección General
de Gestión Sostenible del Patrimonio Forestal y de Fauna Silvestre del
SERFOR, así como pasar el control respectivo, en caso se requiera enviar al
extranjero parte del material colectado, por razones científicas acotadas. Los
ejemplares únicos de los grupos taxonómicos colectados y holotipos, solo
podrán ser exportados en calidad de préstamo.
e) Entregar a la Dirección General de Gestión Sostenible del Patrimonio Forestal
y de Fauna Silvestre, una (01) copia del informe final (incluyendo versión
digital) como resultado de la autorización otorgada, copias del material
fotográfico, diapositivas y cualquier otro material que pueda ser utilizado para
difusión. Asimismo, entregar una (01) copia de las publicaciones producto de
la investigación realizada en formato impreso y digital. El formato de informe
final que debe ser usado, se encuentra en el Anexo 2 adjunto.
f) El cumplimiento de lo señalado en el literal e), no deberá exceder los seis (06)
meses posteriores al término de vigencia de la presente autorización.
g) Los derechos otorgados a través de la presente autorización, no eximen al
titular de contar con la autorización respectiva para el ingreso a predios
privados ni a áreas comprendidas en títulos habilitantes, por lo que es
responsabilidad del titular gestionar las autorizaciones necesarias.
h) Implementar, en lo que resulte aplicable, las medidas dispuestas en los
numerales 8, 11, 12 y 12.1.3 del “Protocolo para la implementación de
medidas de vigilancia, prevención y control frente al COVID-19 en las
actividades de fauna silvestre”, aprobado por Resolución Ministerial N° 0177-
2020-MINAGRI.

Artículo 7°.- El titular de la autorización se compromete a:

a) Comunicar con anticipación a la Administración Técnica Forestal y de Fauna

Silvestre de Cusco del SERFOR, el ingreso y salida a campo para la
realización de las actividades de investigación.
b) Solicitar anticipadamente ante la Dirección General de Gestión Sostenible del
Patrimonio Forestal y de Fauna Silvestre del SERFOR y dentro del plazo de
vigencia de la autorización, cualquier cambio en las características del estudio
aprobado (V.g. cronograma, inclusión de especialistas, etc.), que demande la
modificación de la presente resolución.
c) Indicar el número de la resolución en las publicaciones generadas a partir de
la autorización concedida.
d) Aplicar medidas de campo que garanticen la protección y bienestar de los
especímenes a estudiar durante la ejecución de la investigación, además de
implementar protocolos de bioseguridad, necesarios para evitar las zoonosis
procedentes de las poblaciones de fauna silvestre.
e) En caso sobrevenga algún hecho o evento que imposibilite la ejecución de la
investigación autorizada o que origine que no se pueda continuar con el
desarrollo de la misma, corresponde al titular solicitar por escrito ante la
Dirección General de Gestión Sostenible del Patrimonio Forestal y de Fauna
Silvestre del SERFOR, la renuncia a la autorización otorgada; renuncia que

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 deberá ser solicitada dentro del plazo de vigencia de la autorización,
precisándose el hecho o evento que origina la imposibilidad de ejecutar o de
continuar ejecutando la investigación aprobada, debiendo además el titular
adjuntar la documentación de sustento que estime necesaria, de ser el caso.

Artículo 8°.- El incumplimiento de las obligaciones y/o compromisos adquiridos

por el titular, podrá constituir una causal para denegar futuros actos administrativos o
títulos habilitantes a nivel institucional, sin perjuicio del ejercicio de las acciones civiles,
administrativas y/o penales que correspondan.

Artículo 9°.- La Dirección General de Gestión Sostenible del Patrimonio Forestal

y de Fauna Silvestre del SERFOR, no se responsabiliza por accidentes o daños sufridos
por el titular ni por los investigadores que participarán en el estudio; asimismo, se
reserva el derecho de demandar al titular los cambios a que hubiese lugar en los casos
en que se formulen ajustes sobre la presente autorización.

Artículo 10°.- Notificar la presente resolución y el Informe Técnico N° D000642-

2020-MIDAGRI-SERFOR-DGSPFS, al señor David Guevara Apaza; para su
conocimiento y fines.

Artículo 11°.- Remitir la presente resolución a la Dirección General de

Información y Ordenamiento Forestal y de Fauna Silvestre, a la Dirección de Control de
la Gestión del Patrimonio Forestal y de Fauna Silvestre, y a la Administracioón Técnica
Forestal y de Fauna Silvestre de Cusco del SERFOR; para su conocimiento,
seguimiento y/o verificación de ejecución.

Artículo 12°.- Disponer la publicación de la presente resolución en el portal web

del SERFOR: www.gob.pe/serfor.

Regístrese, comuníquese y publíquese,

Documento firmado digitalmente

Miriam Mercedes Cerdán Quiliano

Directora General
Dirección General de Gestión Sostenible del
Patrimonio Forestal y de Fauna Silvestre
Servicio Nacional Forestal y de Fauna Silvestre - SERFOR

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 RESOLUCIÓN DE DIRECCIÓN GENERAL

ANEXO 1

Coordenadas referenciales de las localidades propuestas para el

desarrollo del proyecto ubicado en el departamento de Cusco

UTM - WGS 84 Situación

Localidad Distrito Provincia Departamento (Zona 18) frente a
Este Norte una ANP
Fuera de
Yanacocha Huayllabamba Urubamba Cusco 819712 8529388
ANP
ACP
Santuario Fuera de
Ollantaytambo Urubamba Cusco 785856 8540413
de la ANP
Verónica

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WJHERFB
 Comité de Bioética Institucional y Sub Comités de Bioética de la UNSAAC
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Código: CBI-UNSAAC2020-003

INFORME FINAL DE ASPECTOS BIOÉTICOS DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

Datos del Investigador Principal

Nombre: Bach. David Guevara Apaza

Facultad: Facultad de Ciencias.

Departamento: Biología.

Universidad: Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco

Correo electrónico: [email protected]

Teléfono: 932918059

Datos del Proyecto de investigación

Título: “Determinación sexual mediante los genes CHD-1 en picaflores neotropicales

altoandinos monocromáticos de bosques de Polylepis en la cordillera del Vilcanota,
Cusco”.

Fecha de ingreso: 16-11-2020

Fecha de emisión de informe final: 18-02-2021.

Resultado de la evaluación a aspectos bioéticos: APROBADO.

Observaciones: El proyecto de Tesis presentado a consideración del Comité de

Bioética Institucional de la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco (CBI-
UNSAAC), ha sido evaluado por el CBI-UNSAAC y por el Sub Comité de Bioética
Institucional de estudio con animales, vegetales y/o material genético no humano de la
UNSAAC, emitiendo un informe donde se consideró observaciones tanto desde el punto
de vista bioético como desde el punto de vista metodológico. El Sr. Bach. David Guevara
Apaza, autor del proyecto, cumple con el levantamiento de observaciones además de
entregar las autorizaciones respectivas para llevar a cabo el estudio, material que ha
sido revisado. El CBI-UNSAAC emite el resultado final de la evaluación.

Atentamente,

Dr. Ramón Figueroa Mujica.

Presidente del Comité de Bioética Institucional de la UNSAAC
[email protected]

C.C.Archivo
/MAQR