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GENE
CLONACIÓN
Y ADN
ANÁLISIS
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GENE
CLONACIÓN
Y ADN
ANÁLISIS
Una introducción
SEÑOR BROWN
Facultad de Ciencias de la Vida
universidad de manchester
Manchester

Sexta Edición

Una publicación de John Wiley & Sons, Ltd.

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Esta edición se publicó por primera vez en 2010, © 2010, 2006 por TA Brown Primera,
segunda y tercera ediciones publicadas por Chapman & Hall 1986, 1990, 1995 Cuarta y quinta ediciones
publicadas por Blackwell Publishing Ltd 2001, 2006

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Datos de catalogación en publicación de la Biblioteca del Congreso

Brown, TA (Terence A.)
Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción / TA Brown.—6th ed.
pag. cm.
ISBN 978-1-4051-8173-0 (pbk. : papel alcalino) - ISBN 978-1-4443-3407-4 (hbk. : papel alcalino)
1. Clonación molecular. 2. Secuencia de nucleótidos. 3. Análisis de ADN. I. Título.
QH442.2.B76 2010
572.8ÿ633—dc22
2009038739

ISBN: 9781405181730 (tapa blanda) y 9781444334074 (tapa dura)

Un registro de catálogo para este libro está disponible en la Biblioteca Británica.

Juego en 10/12pt Classical Garamond de

Graphicraft Limited, Hong Kong
Impreso en Malasia

1 2010
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Contenidos breves
CONTENIDOS BREVES

Prefacio a la sexta edición xvi

Parte I Los principios básicos de la clonación de genes

y el análisis de ADN 1

1 Por qué son importantes la clonación de genes y el análisis de

ADN 3 2 Vectores para la clonación de genes: plásmidos y
bacteriófagos 13 3 Purificación de ADN de células vivas 25 4
Manipulación de ADN purificado 45 5 Introducción de ADN en células
vivas 72 6 Vectores de clonación para E. coli 88 7 Vectores de
clonación para eucariotas 105 8 Cómo obtener un clon de un gen
específico 126 9 La reacción en cadena de la polimerasa 147

Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y

Análisis de ADN en la Investigación 163

10 Secuenciación de genes y genomas 165

11 Estudio de la expresión y función génica 185
12 Estudiando los genomas 207

Parte III Las aplicaciones de la clonación de genes y

el análisis de ADN en biotecnología 223
13 Producción de proteínas a partir de genes clonados 225
14 Clonación de genes y análisis de ADN en medicina 245
15 Clonación de genes y análisis de ADN en agricultura 264
16 Clonación de genes y análisis de ADN en ciencia forense y arqueología 282

Glosario 298
Índice 312

Sitio web complementario disponible en www.wiley.com/go/brown/cloning

en
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Contenido
CONTENIDO

Prefacio a la sexta edición xvi

Parte I Los principios básicos de Gene

Clonación y Análisis de ADN 1

1 Por qué son importantes la clonación de genes y el análisis de ADN

3 1.1 El desarrollo temprano de la genética 3 1.2 El advenimiento

de la clonación de genes y la cadena de polimerasa

reacción 4
1.3 ¿Qué es la clonación de genes?
5 1.4 ¿Qué es PCR? 6 1.5 Por qué
son tan importantes la clonación de genes y la PCR 7
1.5.1 Obtención de una muestra pura de un gen por clonación 7
1.5.2 La PCR también se puede utilizar para purificar un gen 9
1.6 Cómo orientarse en este libro 11

2 Vectores para la clonación de genes: plásmidos y

bacteriófagos 13
2.1 Plásmidos 13
2.1.1 Tamaño y número de copias 15
2.1.2 Conjugación y compatibilidad 16 2.1.3
Clasificación de plásmidos 16 2.1.4 Plásmidos en
organismos distintos de las bacterias 17 2.2 Bacteriófagos 17
2.2.1 El ciclo de infección por fagos 18 2.2.2 Fagos lisogénicos 19
Organización de genes en la molécula de 2 ADN 19 Las formas
lineal y circular de 2 ADN 19 M13: un fago filamentoso 22 2.2.3
Los virus como vectores de clonación para otros
organismos 24

viii
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viii Contenido

3 Purificación de ADN a partir de células vivas 25

3.1 Preparación del ADN celular total 25
3.1.1 Crecimiento y recolección de un cultivo bacteriano 26
3.1.2 Preparación de un extracto celular 28 3.1.3 Purificación
del ADN de un extracto celular 29 Eliminación de contaminantes
mediante extracción orgánica y digestión enzimática 29 Uso de
intercambio iónico cromatografía para purificar el ADN de un
extracto celular 30

3.1.4 Concentración de muestras de ADN 30

3.1.5 Medición de la concentración de ADN 31 3.1.6
Otros métodos para la preparación de ADN celular total 32 3.2
Preparación de ADN plasmídico 33 3.2.1 Separación en función del tamaño
35 3.2.2 Separación en la base de la conformación 36 Desnaturalización
alcalina 36 Centrifugación en gradiente de densidad de bromuro de
etidio-cloruro de cesio 36 3.2.3 Amplificación de plásmido 39
3.3 Preparación de ADN de bacteriófago 39 3.3.1 Crecimiento
de cultivos para obtener un título alto 2 40 3.3.2 Preparación
de ADN no lisogénico 2 fagos 40 3.3.3 Recolección de fagos de un
cultivo infectado 42 3.3.4 Purificación de ADN de 2 partículas de fago 42 3.3.5
La purificación de ADN M13 causa pocos problemas 43

4 Manipulación de ADN purificado 45

4.1 La gama de enzimas manipuladoras de ADN 46
4.1.1 Nucleasas 46
4.1.2 Ligasas 47 4.1.3
Polimerasas 48 4.1.4
Enzimas modificadoras del ADN 49 4.2
Enzimas para cortar el ADN: endonucleasas de restricción 50
4.2.1 El descubrimiento y la función de las endonucleasas de restricción 51 4.2.2
Las endonucleasas de restricción de tipo II cortan el ADN en secuencias de nucleótidos
específicas 52 4.2.3 Extremos romos y extremos cohesivos 53 4.2.4 La frecuencia
de las secuencias de reconocimiento en una molécula de ADN 53 4.2.5 Realización de
una digestión de restricción en el laboratorio 54 4.2.6 Análisis del resultado de la escisión
con endonucleasas de restricción 56

Separación de moléculas por electroforesis en gel 57

Visualización de moléculas de ADN en un gel de agarosa 58
4.2.7 Estimación del tamaño de las moléculas de ADN 58 4.2.8
Mapeo de las posiciones de diferentes sitios de restricción en una molécula de ADN
59 4.2.9 Métodos especiales de electroforesis en gel para separar moléculas
más grandes 60
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Contenido ix

4.3 Ligadura: unión de moléculas de ADN 63 4.3.1 El modo

de acción de la ADN ligasa 63 4.3.2 Los extremos
cohesivos aumentan la eficacia de la ligadura 64 4.3.3 Colocación
de extremos cohesivos en una molécula de extremos romos 64
Conectores 64 Adaptadores 65 Producción de extremos
cohesivos por cola de homopolímero 67 4.3.4 Ligadura de
extremos romos con una topoisomerasa de ADN 69

5 Introducción del ADN en las células vivas 72

5.1 Transformación: la absorción de ADN por células bacterianas 74
5.1.1 No todas las especies de bacterias son igualmente eficientes en la
captación de ADN 74 5.1.2 Preparación de células competentes
de E. coli 75 5.1.3 Selección de células transformadas 75

5.2 Identificación de recombinantes 76 5.2.1

Selección de recombinantes con pBR322: inactivación por inserción de un gen de
resistencia a antibióticos 77 5.2.2 La inactivación por inserción no siempre
involucra antibióticos
resistencia 79
5.3 Introducción de ADN de fago en células bacterianas 81
5.3.1 Transfección 81 5.3.2
Empaquetado in vitro de 2 vectores de clonación 81 5.3.3
La infección por fagos se visualiza como placas en un agar
medio 81
5.4 Identificación de fagos recombinantes 83 5.4.1
Inactivación por inserción de un gen lacZÿ portado por el fago vector 83

5.4.2 Inactivación por inserción del gen 2 cI 83 5.4.3

Selección usando el fenotipo Spi 83 5.4.4 Selección en base
al tamaño del genoma 2 84
5.5 Introducción de ADN en células no bacterianas 85
5.5.1 Transformación de células individuales 85 5.5.2
Transformación de organismos completos 85

6 Vectores de clonación para E. coli 88

6.1 Vectores de clonación basados en plásmidos de E. coli 89
6.1.1 La nomenclatura de los vectores de clonación de plásmidos 89
6.1.2 Las propiedades útiles de pBR322 89 6.1.3 El pedigrí de
pBR322 90 6.1.4 Vectores de clonación de plásmidos de E. coli más
sofisticados 90 pUC8—un plásmido de selección Lac 92 pGEM3Z—in vitro
transcripción de ADN clonado 93 6.2 Vectores de clonación
basados en el bacteriófago M13 94

6.2.1 Cómo construir un vector de clonación de fagos 94 6.2.2

Vectores híbridos plásmido-M13 96
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X Contenido

6.3 Vectores de clonación basados en bacteriófagos 8 97

6.3.1 Los segmentos del genoma 2 pueden eliminarse sin afectar la viabilidad 98

6.3.2 La selección natural se puede usar para aislar 2 modificados que carecen de
ciertos sitios de restricción 98 6.3.3 Vectores de inserción y reemplazo 98
Vectores de inserción 99 Vectores de reemplazo 100 6.3.4 Experimentos de clonación
con inserción o reemplazo 2

vectores 100
6.3.5 Los fragmentos largos de ADN se pueden clonar usando un cósmido 101
6.4 8 y otros vectores de alta capacidad permiten construir bibliotecas genómicas
102 6.5 Vectores para otras bacterias 104

7 Vectores de clonación para eucariotas 105 7.1 Vectores para

levaduras y otros hongos 105 7.1.1 Marcadores
seleccionables para el plásmido 2 3m 106 7.1.2 Vectores basados
en el plásmido 2 3m: plásmidos episomales de levadura 106 7.1.3 Un YEp
puede insertarse en el cromosoma de levadura ADN 107 7.1.4
Otros tipos de vector de clonación de levadura 108 7.1.5 Se pueden usar
cromosomas artificiales para clonar fragmentos largos de ADN en levadura
110 Estructura y uso de un vector YAC 110 Aplicaciones de los vectores YAC 111
7.1.6 Vectores para otras levaduras y hongos 112

7.2 Clonación de vectores para plantas superiores

112 7.2.1 Agrobacterium tumefaciens: la genética más pequeña de la naturaleza
ingeniero 113
Uso del plásmido Ti para introducir nuevos genes en una célula vegetal
113
Producción de plantas transformadas con el plásmido Ti 115
El plásmido Ri 117
Limitaciones de la clonación con plásmidos de Agrobacterium 117
7.2.2 Clonación de genes en plantas por transferencia directa de genes 118
Transferencia directa de genes al núcleo 118
Transferencia de genes al genoma del cloroplasto 119 7.2.3
Intentos de utilizar virus de plantas como vectores de clonación 119
Vectores de caulimovirus 120
Vectores de geminivirus 120 7.3
Vectores de clonación para animales 120
7.3.1 Vectores de clonación para insectos 121
Elementos P como vectores de clonación para Drosophila 121
Vectores de clonación basados en virus de insectos 122 7.3.2
Clonación en mamíferos 122 Virus como vectores de clonación para
mamíferos 123 Clonación de genes sin vector 124
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Contenido xi

8 Cómo obtener un clon de un gen específico 126

8.1 El problema de la selección 126
8.1.1 Existen dos estrategias básicas para obtener el clon que deseas 127

8.2 Selección directa 128

8.2.1 El rescate de marcadores amplía el alcance de la selección directa 129
8.2.2 El alcance y las limitaciones del rescate de marcadores 130
8.3 Identificación de un clon a partir de una biblioteca de genes 131
8.3.1 Bibliotecas de genes 131
8.3.2 No todos los genes se expresan al mismo tiempo 131 8.3.3 El
ARNm se puede clonar como ADN complementario 133
8.4 Métodos para la identificación de clones 133
8.4.1 Las cadenas de ácido nucleico complementarias se hibridan entre sí
otro 133
8.4.2 Sondeo de hibridación de colonias y placas 133 Marcaje
con un marcador radiactivo 136 Marcaje no radiactivo
137
8.4.3 Ejemplos del uso práctico del sondeo de hibridación 137 Sondeo de
abundancia para analizar una biblioteca de ADNc 137 Sondas de
oligonucleótidos para genes cuyos productos de traducción han sido
caracterizados 138 El sondeo heterólogo permite identificar genes
relacionados 141 La hibridación Southern permite un fragmento de
restricción específico que contiene un gen por identificar 142 8.4.4 Métodos
de identificación basados en la detección de la traducción

producto del gen clonado 144

Los anticuerpos son necesarios para los métodos de detección
inmunológica 144
Uso de un anticuerpo purificado para detectar proteína en colonias
recombinantes 145
El problema de la expresión génica 146

9 La reacción en cadena de la polimerasa 147

9.1 Resumen de la reacción en cadena de la polimerasa 147
9.2 PCR en más detalle 149
9.2.1 Diseño de los cebadores de oligonucleótidos para una PCR 149 9.2.2
Determinación de las temperaturas correctas para usar 152 9.3 Después
de la PCR: estudio de los productos de la PCR 153
9.3.1 Electroforesis en gel de productos de PCR 154 9.3.2
Clonación de productos de PCR 154 9.3.3 Problemas con
la tasa de error de la polimerasa Taq 157 9.4 La PCR en tiempo real
permite cuantificar la cantidad de material de partida 158 9.4.1 Realización de
un análisis cuantitativo Experimento de PCR 159 9.4.2 La PCR en tiempo
real también puede cuantificar el ARN 160
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xi Contenido

Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de

Genes y el Análisis de ADN en la Investigación
163

10 Secuenciación de genes y genomas 165

10.1 La metodología para la secuenciación del ADN 165
10.1.1 Secuenciación del ADN de terminación de cadena 166
Resumen de secuenciación de terminación de
cadena 166 No todas las ADN polimerasas se pueden usar para la
secuenciación 168 La secuenciación de terminación de cadena requiere
una plantilla de ADN monocatenario 169 El cebador determina la región
de la plantilla de ADN que se secuenciará 169 10.1.2 Pirosecuenciación
171 La pirosecuenciación implica la detección de pulsos de
quimioluminiscencia 171 Pirosecuenciación paralela masiva 171

10.2 Cómo secuenciar un genoma 173 10.2.1

El enfoque rápido para la secuenciación del genoma 174
El proyecto de secuenciación del genoma de Haemophilus influenzae 174
Problemas con la secuenciación de escopeta 176 10.2.2 El enfoque de clon
contig 177 Ensamblaje de clones contig por caminata cromosómica 177 Métodos
rápidos para el ensamblaje de clones contig 178 Ensamblaje de clones
contig mediante análisis de contenido de sitio etiquetado con secuencia 179
10.2.3 Uso de un mapa para ayudar al ensamblaje de secuencias 180
Mapas genéticos 180 Mapas físicos 181 La importancia de un mapa en el
ensamblaje de secuencias 183

11 Estudio de la expresión y función génica 185

11.1 Estudio del transcrito de ARN de un gen 186
11.1.1 Detección de la presencia de un transcrito y determinación de su
secuencia de nucleótidos 186 11.1.2 Mapeo de transcritos por
hibridación entre gen y ARN 188

11.1.3 Análisis de transcripción por extensión de cebador

190 11.1.4 Análisis de transcripción por PCR 191
11.2 Estudio de la regulación de la expresión génica 192 11.2.1
Identificación de sitios de unión a proteínas en una molécula de ADN 193
Retardo en gel de complejos ADN-proteína 193 Huella con ADNasa I
194 Ensayos de modificación de interferencia 194 11.2.2 Identificación
de secuencias de control mediante análisis de deleción 197

Reportero genes 197

Realización de un análisis de borrado 198
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Contenido XIII

11.3 Identificación y estudio del producto de traducción de un gen clonado 199 11.3.1 HRT
y HART pueden identificar el producto de traducción de un gen clonado 199 11.3.2
Análisis de proteínas por mutagénesis in vitro 200

Diferentes tipos de técnicas de mutagénesis in vitro 202

Uso de un oligonucleótido para crear una mutación puntual en un gen
clonado 203
Otros métodos para crear una mutación puntual en un gen clonado
204
El potencial de la mutagénesis in vitro 205

12 Estudiando los genomas 207

12.1 Anotación del genoma 207
12.1.1 Identificación de los genes en una secuencia genómica 208
Búsqueda de marcos de lectura abiertos 208 Las exploraciones
ORF simples son menos eficaces para localizar genes en genomas
eucariotas 209 La búsqueda de homología ayuda a la localización de
genes 210 Comparación de las secuencias de genomas relacionados
211 12.1.2 Determinación de la función de un gen desconocido 212

La asignación de la función del gen mediante análisis experimental requiere

un enfoque inverso a la genética 212 Los genes específicos pueden
inactivarse mediante recombinación homóloga 213 12.2 Estudios del
transcriptoma y el proteoma 214

12.2.1 Estudio del transcriptoma 215 Estudio de

un transcriptoma mediante análisis de secuencias 215 Estudio de
transcriptomas mediante análisis de micromatrices o chips 215
12.2.2 Estudiar el proteoma 217 Separar las
proteínas en un proteoma 217 Identificar las proteínas
individuales después de la separación 218
12.2.3 Estudio de las interacciones proteína-proteína 220
Presentación en fagos 220 El sistema de dos híbridos
de levadura 220

Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y

Análisis de ADN en Biotecnología 223

13 Producción de proteínas a partir de genes clonados 225

13.1 Vectores especiales para expresión de genes foráneos en E. coli 227
13.1.1 El promotor es el componente crítico de una expresión
vectores 228
El promotor debe elegirse con cuidado 228 Ejemplos de
promotores utilizados en vectores de expresión 231 13.1.2 Cassettes
y fusiones génicas 232
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xiv Contenido

13.2 Problemas generales con la producción de proteína recombinante en

E. coli 234
13.2.1 Problemas derivados de la secuencia del gen extraño 235 13.2.2 Problemas
causados por E. coli 236 13.3 Producción de proteína recombinante por células
eucariotas 237
13.3.1 Proteína recombinante de levaduras y hongos filamentosos 237
Saccharomyces cerevisiae como huésped para la síntesis de proteínas
recombinantes 237 Otras levaduras y hongos 238 13.3.2 Uso de células
animales para la producción de proteínas recombinantes 239 Producción
de proteínas en células de mamíferos 239 Producción de proteínas en células de
insectos 240 13.3 .3 Pharming: proteína recombinante de plantas y animales
vivos 241 Pharming en animales 241 Proteínas recombinantes de plantas
242 Preocupaciones éticas planteadas por pharming 243

14 Clonación de genes y análisis de ADN en medicina 245

14.1 Producción de fármacos recombinantes 245 14.1.1 Insulina
recombinante 246
Síntesis y expresión de genes de insulina artificial 247
14.1.2 Síntesis de hormonas de crecimiento humano en E. coli 247
14.1.3 Factor VIII recombinante 249 14.1.4 Síntesis de otras proteínas
humanas recombinantes 251 14.1.5 Vacunas recombinantes 252

Producción de vacunas como proteínas recombinantes 252

Vacunas recombinantes en plantas transgénicas 253
Vacunas de virus vivos recombinantes 253 14.2
Identificación de genes responsables de enfermedades humanas 255 14.2.1
Cómo identificar un gen para una enfermedad genética 256
Localización de la posición aproximada del gen en el genoma humano
256 Identificación de candidatos para el gen de la enfermedad 258 14.3
Terapia génica 259 14.3.1 Terapia génica para enfermedades hereditarias
259 14.3.2 Terapia génica y cáncer 260 14.3.3 Las cuestiones éticas que plantea el gen
terapia 262

15 Clonación de genes y análisis de ADN en agricultura 264

15.1 El enfoque de adición de genes a la ingeniería genética de plantas 265
15.1.1 Plantas que elaboran sus propios insecticidas 265
Las 1-endotoxinas de Bacillus thuringiensis 265
Clonación de un gen de 1-endotoxina en maíz 266
Clonación de genes de 1-endotoxina en cloroplastos 268
Contrarrestar la resistencia de los insectos a los cultivos de 1-endotoxina 269
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Contenido XV

15.1.2 Cultivos resistentes a herbicidas 270

Cultivos “Roundup Ready” 271 Una
nueva generación de cultivos resistentes al glifosato 272
15.1.3 Otros proyectos de adición de genes 273
15.2 Sustracción de genes 274
15.2.1 ARN antisentido y la ingeniería de la maduración de frutos en
tomate 274
Uso de ARN antisentido para inactivar el gen de la poligalacturonasa
274 Uso de ARN antisentido para inactivar la síntesis de etileno
276 15.2.2 Otros ejemplos del uso de ARN antisentido en ingeniería
genética de plantas 276 15.3 Problemas con plantas modificadas
genéticamente 277

15.3.1 Preocupaciones de seguridad con marcadores

seleccionables 277 15.3.2 La tecnología de terminación 278
15.3.3 La posibilidad de efectos nocivos en el medio ambiente 279

16 Clonación de genes y análisis de ADN en ciencia forense y arqueología 282 16.1

Análisis de ADN en la identificación de sospechosos de delitos 283

16.1.1 Identificación genética por sondeo de hibridación 283 16.1.2

Perfil de ADN por PCR de repeticiones cortas en tándem 283 16.2
Estudio de parentesco por perfil de ADN 286 16.2.1 Los individuos
relacionados tienen perfiles de ADN similares 286 16.2.2 Perfil de
ADN y los restos de los Romanov 286
Análisis STR de los huesos de Romanov 286
Se utilizó ADN mitocondrial para vincular los esqueletos de Romanov con
parientes vivos 287 Los niños desaparecidos 289 16.3 Identificación del
sexo mediante análisis de ADN 289 16.3.1 PCR dirigidas a secuencias
específicas del cromosoma Y 289 16.3.2 PCR de la amelogenina gen 290 16.4
Arqueogenética: uso del ADN para estudiar la prehistoria humana 291 16.4.1
Los orígenes de los humanos modernos 291

El análisis de ADN ha desafiado la hipótesis multirregional 291 El análisis

de ADN muestra que los neandertales no son los ancestros de los
europeos modernos 293 16.4.2 El ADN también se puede usar para
estudiar las migraciones humanas prehistóricas 294 La expansión de la agricultura
en Europa 294 El uso del ADN mitocondrial para estudiar las migraciones
humanas pasadas en europa 294

Glosario 298
Índice 312

Sitio web complementario disponible en www.wiley.com/go/brown/cloning

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Prefacio a la sexta edición

PREFACIO A LA SEXTA EDICIÓN

Durante los cuatro años transcurridos desde la publicación de la quinta edición de Gene
Durante
Cloning and DNA Analysis: An Introduction , ha habido avances importantes en la tecnología de
secuenciación de ADN, en particular, la adopción generalizada de enfoques de alto rendimiento
basados en pirosecuenciación. La inclusión de estas nuevas técnicas en la sexta edición me ha
llevado a reescribir por completo el material sobre la secuenciación del ADN y a colocar toda la
información relevante, tanto sobre la metodología en sí misma como sobre su aplicación a la
secuenciación del genoma, en un solo capítulo. Esto me ha permitido dedicar otro capítulo completo
a los métodos posteriores a la secuenciación utilizados para estudiar genomas. El resultado es,
espero, un tratamiento más equilibrado de los diversos aspectos de la genómica y la posgenómica
que el que había logrado en ediciones anteriores.
Un segundo avance importante de los últimos años ha sido la introducción de la PCR en
tiempo real como medio para cuantificar la cantidad de una secuencia de ADN particular
presente en una preparación. Esta técnica ahora se describe como parte del Capítulo 9. En
otros lugares, hice varias adiciones, como la inclusión de métodos basados en topoisomerasa
para la ligadura de extremos romos en el Capítulo 4, y en general arreglé partes de capítulos
que se habían vuelto un poco difíciles de manejar debido a la efectos acumulativos de las
modificaciones realizadas durante los 25 años desde la primera edición de este libro. La Sexta
Edición es casi el doble de larga que la Primera, pero conserva la filosofía de esa edición
original. No deja de ser un texto introductorio que comienza por el principio y no supone que el
lector tenga ningún conocimiento previo de las técnicas utilizadas para estudiar genes y genomas.
Quisiera agradecer a Nigel Balmforth y Andy Slade de Wiley-Blackwell por ayudarme
a hacer realidad esta nueva edición. Como siempre, también debo agradecer a mi esposa
Keri por el apoyo incansable que me ha brindado en mi decisión de usar tardes y fines de
semana para escribir este y otros libros.

TA Brown
Facultad de Ciencias de la
Vida Universidad de Manchester

xvi
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PARTE I
Los principios básicos
de la clonación de genes y
Análisis de ADN

1 | Por qué son importantes la clonación de genes y el análisis de

ADN 3 2 | Vectores para la clonación de genes: plásmidos y

bacteriófagos 13 3 | Purificación de ADN a partir de células vivas 25 4

| Manipulación de ADN purificado 45 5 | Introducción del ADN en las

células vivas 72 6 | Vectores de clonación para E. coli 88 7 | Vectores

de clonación para eucariotas 105 8 | Cómo obtener un clon de un gen

específico 126 9 | La reacción en cadena de la polimerasa 147

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Capítulo 1
Por qué la clonación
de genes y el análisis de ADN son
Importante

Contenido del capítulo

CONTENIDO DEL CAPÍTULO

1.1 El desarrollo temprano de la genética 1.2 El

advenimiento de la clonación de genes y la reacción en cadena de la polimerasa
1.3 ¿Qué es la clonación de genes?
1.4 ¿Qué es PCR?
1.5 Por qué son tan importantes la clonación de genes y la
PCR 1.6 Cómo orientarse en este libro

A mediados del siglo XIX, Gregor Mendel formuló un conjunto de reglas para explicar la herencia de las
características biológicas. La suposición básica de estas reglas es que cada propiedad hereditaria de un
organismo está controlada por un factor, llamado gen, que es una partícula física presente en algún lugar de
la célula. El redescubrimiento de las leyes de Mendel en 1900 marca el nacimiento de la genética, la ciencia
destinada a comprender qué son estos genes y cómo funcionan exactamente.

1.1 El desarrollo temprano de la genética

Durante los primeros 30 años de su vida, esta nueva ciencia creció a un ritmo asombroso. La idea de que los
genes residen en los cromosomas fue propuesta por W. Sutton en 1903 y recibió el respaldo experimental
de TH Morgan en 1910. Morgan y sus colegas desarrollaron las técnicas para el mapeo de genes y en 1922
habían producido un análisis exhaustivo de la relación relativa. posiciones de más de 2000 genes en los 4
cromosomas de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster.

A pesar de la brillantez de estos estudios genéticos clásicos, no hubo una comprensión real de la
naturaleza molecular del gen hasta la década de 1940. De hecho, no fue hasta

Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010 3
por Blackwell Publishing.
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4 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

los experimentos de Avery, MacLeod y McCarty en 1944, y de Hershey y Chase en 1952, que nadie creía
que el ácido desoxirribonucleico (ADN) es el material genético: hasta entonces se pensaba ampliamente
que los genes estaban hechos de proteínas. El descubrimiento del papel del ADN fue un tremendo estímulo
para la investigación genética, y muchos biólogos famosos (Delbrück, Chargaff, Crick y Monod estuvieron
entre los más influyentes) contribuyeron a la segunda gran era de la genética. En los 14 años entre 1952 y
1966, se elucidó la estructura del ADN, se descifró el código genético y se describieron los procesos de
transcripción y traducción.

1.2 El advenimiento de la clonación de genes y la reacción en

cadena de la polimerasa

Estos años de actividad y descubrimiento fueron seguidos por una pausa, un período de anticlímax en el
que a algunos biólogos moleculares (como se autodenominó la nueva generación de genetistas) les pareció
que había pocas cosas de importancia fundamental que no se entendieran.
En verdad, existía la frustración de que las técnicas experimentales de finales de la década de 1960 no
fueran lo suficientemente sofisticadas como para permitir que se estudiara el gen con mayor detalle.
Luego, en los años 1971-1973, la investigación genética volvió a ponerse en marcha por lo que en ese
momento se describió como una revolución en la biología experimental. Se desarrolló una metodología
completamente nueva que permitió planificar y llevar a cabo experimentos que antes eran imposibles, si no
con facilidad, al menos con éxito. Estos métodos, denominados tecnología de ADN recombinante o
ingeniería genética, y cuyo centro es el proceso de clonación de genes, desencadenaron otra gran era
de la genética. Condujeron a técnicas de secuenciación de ADN rápidas y eficientes que permitieron
determinar las estructuras de genes individuales, alcanzando su punto culminante a principios de siglo con
los proyectos masivos de secuenciación de genomas, incluido el proyecto humano que se completó en
2000.
Condujeron a procedimientos para estudiar la regulación de genes individuales, lo que ha permitido a los
biólogos moleculares comprender cómo las aberraciones en la actividad de los genes pueden dar lugar a
enfermedades humanas como el cáncer. Las técnicas generaron la biotecnología moderna, que pone a
los genes a trabajar en la producción de proteínas y otros compuestos necesarios en la medicina y los
procesos industriales.
Durante la década de 1980, cuando la emoción engendrada por la revolución de la clonación de genes
estaba en su apogeo, apenas parecía posible que otro proceso igualmente novedoso e igualmente
revolucionario estuviera a la vuelta de la esquina. Según el folclore del ADN, Kary Mullis inventó la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) durante un viaje por la costa de California una noche de 1985. Su
onda cerebral era una técnica exquisitamente simple que actúa como un complemento perfecto para la
clonación de genes. La PCR ha facilitado muchas de las técnicas que eran posibles pero difíciles de llevar
a cabo cuando se usaba la clonación de genes por sí sola. Ha ampliado la gama de análisis de ADN y ha
permitido que la biología molecular encuentre nuevas aplicaciones en áreas de actividad fuera de su gama
tradicional de medicina, agricultura y biotecnología. La arqueogenética, la ecología molecular y el análisis
forense del ADN son solo tres de las nuevas disciplinas que se han hecho posibles como consecuencia
directa de la invención de la PCR, lo que permite a los biólogos moleculares formular preguntas sobre la
evolución humana y el impacto del cambio ambiental en la biosfera, y utilizar sus poderosas herramientas
en la lucha contra el crimen. Han pasado cuarenta años desde el amanecer de la era de la clonación de
genes, pero todavía estamos montados en la montaña rusa y la emoción no tiene fin a la vista.
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Capítulo 1 Por qué son importantes la clonación de genes y el análisis de ADN 5

Construcción de una molécula de ADN recombinante Figura 1.1 Los

pasos básicos en la clonación de genes.

recombinante
+ molécula de adn

Fragmento vectorial de
ADN +

Bacteria

Bacteria
Transporte a la célula portador
huésped recombinante
molécula de adn

Multiplicación de la
molécula de ADN
recombinante

División de la
célula huésped

Numeroso
divisiones celulares

que dan como

resultado un clon
Colonias bacterianas
que crecen en medio sólido

1.3 ¿Qué es la clonación de genes?

¿Qué es exactamente la clonación de genes? La forma más fácil de responder a esta pregunta es
seguir los pasos de un experimento de clonación de genes (Figura 1.1):

1 Un fragmento de ADN, que contiene el gen que se va a clonar, se inserta en una molécula de
ADN circular llamada vector, para producir una molécula de ADN recombinante.
2 El vector transporta el gen a una célula huésped, que suele ser una bacteria,
aunque se pueden usar otros tipos de células vivas.
3 Dentro de la célula huésped, el vector se multiplica, produciendo numerosas copias idénticas,
no solo de sí mismo sino también del gen que porta.
4 Cuando la célula huésped se divide, se pasan copias de la molécula de ADN recombinante a la
progenie y se lleva a cabo una mayor replicación del vector.
5 Después de una gran cantidad de divisiones celulares, se produce una colonia o clon de
células huésped idénticas. Cada célula del clon contiene una o más copias de la molécula de
ADN recombinante; ahora se dice que el gen que porta la molécula recombinante está clonado.
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6 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

1.4 ¿Qué es PCR?

La reacción en cadena de la polimerasa es muy diferente de la clonación de genes. En lugar de una

serie de manipulaciones que involucran células vivas, la PCR se lleva a cabo en un solo tubo de
ensayo simplemente mezclando el ADN con un conjunto de reactivos y colocando el tubo en un
termociclador, un equipo que permite incubar la mezcla a una temperatura determinada. serie de
temperaturas que se varían de manera preprogramada. Los pasos básicos en un experimento de PCR
son los siguientes (Figura 1.2):

Figura 1.2 Los Plantilla de ADN

3' 5'
pasos básicos en la reacción en cadena de la polimerasa. 5' 3'

Desnaturalización del
ADN molde a 94°C

3' 5'

5' 3'

Recocido de los
cebadores de
oligonucleótidos a 50–60 °C

3' 5'

imprimaciones 5'
5'

5' 3'

Síntesis de nuevos
ADN a 74°C

3' 5'

3'
5'

3' 5'

5' 3'

3' 5'

5' 3'

3' 5'

5' 3'

Repita el ciclo 25-30 veces

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Capítulo 1 Por qué son importantes la clonación de genes y el análisis de ADN 7

1 La mezcla se calienta a 94 °C, a cuya temperatura se une el hidrógeno que

mantienen unidas las dos hebras de la molécula de ADN de doble hebra se rompen, lo que hace
que la molécula se desnaturalice.
2 La mezcla se enfría a 50–60°C. Las dos hebras de cada molécula podrían volver a unirse a esta
temperatura, pero la mayoría no lo hace porque la mezcla contiene un gran exceso de moléculas de
ADN cortas, llamadas oligonucleótidos o cebadores, que se hibridan con las moléculas de ADN
en posiciones específicas.
3 La temperatura se eleva a 74°C. Esta es una buena temperatura de trabajo para la ADN
polimerasa Taq que está presente en la mezcla. Aprenderemos más sobre las ADN
polimerasas en la p. 48. Todo lo que necesitamos entender en esta etapa es que la ADN
polimerasa Taq se une a un extremo de cada cebador y sintetiza nuevas hebras de ADN,
complementarias a las moléculas de ADN molde , durante este paso de la PCR. Ahora tenemos
cuatro soportes de ADN en lugar de los dos que había al principio.

4 La temperatura se vuelve a aumentar a 94°C. El ADN de doble cadena

Las moléculas, cada una de las cuales consta de una hebra de la molécula original y una
nueva hebra de ADN, se desnaturalizan en hebras simples. Esto comienza un segundo ciclo de
desnaturalización-recocido-síntesis, al final del cual hay ocho hebras de ADN. Al repetir el ciclo 30
veces, la molécula de doble cadena con la que comenzamos se convierte en más de 130 millones
de nuevas moléculas de doble cadena, cada una de las cuales es una copia de la región de la
molécula inicial delineada por los sitios de hibridación de los dos cebadores.

1.5 Por qué son tan importantes la clonación de genes y la PCR

Como puede ver en las Figuras 1.1 y 1.2, la clonación de genes y la PCR son procedimientos
relativamente sencillos. ¿Por qué, entonces, han asumido tal importancia en biología? La respuesta se
debe en gran medida a que ambas técnicas pueden proporcionar una muestra pura de un gen individual,
separada de todos los demás genes de la célula.

1.5.1 Obtención de una muestra pura de un gen por clonación

Para entender exactamente cómo la clonación puede proporcionar una muestra pura de un gen, considere
el experimento básico de la Figura 1.1, pero dibujado de una manera ligeramente diferente (Figura 1.3).
En este ejemplo, el fragmento de ADN que se va a clonar es un miembro de una mezcla de muchos
fragmentos diferentes, cada uno de los cuales porta un gen diferente o parte de un gen. De hecho, esta
mezcla podría ser el complemento genético completo de un organismo, un ser humano, por ejemplo.
Cada uno de estos fragmentos se inserta en una molécula de vector diferente para producir una familia
de moléculas de ADN recombinante, una de las cuales porta el gen de interés. Por lo general, solo se
transporta una molécula de ADN recombinante a una sola célula huésped, de modo que, aunque el
conjunto final de clones puede contener muchas moléculas de ADN recombinante diferentes, cada clon
individual contiene múltiples copias de una sola molécula. El gen ahora está separado de todos los demás
genes en la mezcla original y sus características específicas pueden estudiarse en detalle.

En la práctica, la clave para el éxito o el fracaso de un experimento de clonación de genes es la

capacidad de identificar el clon particular de interés entre los muchos diferentes que se obtienen. Si
consideramos el genoma de la bacteria Escherichia coli, que contiene
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8 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 1.3 La
clonación permite purificar fragmentos individuales
de ADN.
+

Vectores fragmentos de ADN

Construir recombinante
moléculas de ADN

Cada uno lleva un fragmento diferente.

Introducir en bacterias

plato fuera

Cada colonia contiene múltiples copias

de un solo recombinante
molécula de adn

con poco más de 4000 genes diferentes, al principio podríamos perder la esperanza de poder
encontrar un solo gen entre todos los clones posibles (Figura 1.4). El problema se vuelve aún más
abrumador cuando recordamos que las bacterias son organismos relativamente simples y que el
genoma humano contiene aproximadamente cinco veces más genes. Sin embargo, como se
explica en el Capítulo 8, se puede utilizar una variedad de estrategias diferentes para asegurar
que se pueda obtener el gen correcto al final del experimento de clonación. Algunas de estas
estrategias implican modificaciones en el procedimiento básico de clonación, de modo que solo
las células que contienen la molécula de ADN recombinante deseada pueden dividirse y el clon de
interés se selecciona automáticamente. Otros métodos implican técnicas que permiten identificar
el clon deseado a partir de una mezcla de muchos clones diferentes.
Una vez que se ha clonado un gen, casi no hay límite para la información que se puede obtener
sobre su estructura y expresión. La disponibilidad de material clonado ha estimulado el desarrollo
de métodos analíticos para el estudio de genes, con la introducción constante de nuevas técnicas.
Los métodos para estudiar la estructura y la expresión de un gen clonado se describen en los
Capítulos 10 y 11, respectivamente.
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Capítulo 1 Por qué son importantes la clonación de genes y el análisis de ADN 9

Figura 1.4 El
pirF ADN problema de la selección.
cosB
sufrir

trpD

Una parte muy pequeña

del genoma de E.coli trpC

trpB

tonoB trpA
hasta aroT

El gen a clonar

trpB pirF
ADN
hasta tonoB

trpC sufrir trpD

aroT cosB

trpA

trpA

¿Cómo podemos
seleccionar o identificar un solo gen?

1.5.2 La PCR también se puede utilizar para purificar un gen

La reacción en cadena de la polimerasa también se puede utilizar para obtener una muestra pura de un gen. Esto
se debe a que la región de la molécula de ADN inicial que se copia durante la PCR es el segmento cuyos límites
están marcados por las posiciones de hibridación de los dos cebadores de oligonucleótidos. Si los cebadores
hibridan cualquiera de los lados del gen de interés, se sintetizarán muchas copias de ese gen (Figura 1.5). El
resultado es el mismo que con un experimento de clonación de genes, aunque el problema de la selección no surge
porque el gen deseado se "selecciona" automáticamente como resultado de las posiciones en las que se hibridan
los cebadores.
Un experimento de PCR se puede completar en unas pocas horas, mientras que se necesitan semanas, si no
meses, para obtener un gen por clonación. Entonces, ¿por qué todavía se usa la clonación de genes? Esto se debe
a que la PCR tiene dos limitaciones:

l Para que los cebadores se hibernen en las posiciones correctas, a ambos lados del gen de interés, se deben
conocer las secuencias de estos sitios de hibridación. Es fácil sintetizar un cebador con una secuencia
predeterminada (ver pág. 139), pero si se desconocen las secuencias de los sitios de hibridación, entonces
no se pueden fabricar los cebadores apropiados. Esto significa que la PCR no se puede usar para aislar genes
que no se han estudiado antes, eso se tiene que hacer mediante la clonación.
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10 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 1.5
Aislamiento de genes por PCR. pirF ADN
cosB
sufrir

trpD

trpC

trpB

tonoB trpA
hasta aroT

Reacción en cadena de la polimerasa

trpA
trpA
trpA trpA
trpA
trpA
trpA

× varios millones

l Existe un límite en la longitud de la secuencia de ADN que se puede copiar mediante PCR.
Se pueden copiar cinco kilobases (kb) con bastante facilidad, y se pueden tratar segmentos de
hasta cuarenta kb mediante el uso de técnicas especializadas, pero esto es más corto que la
longitud de muchos genes, especialmente los de humanos y otros vertebrados. La clonación
debe usarse si se requiere una versión intacta de un gen largo.

La clonación de genes es, por lo tanto, la única forma de aislar genes largos o que nunca antes se
hayan estudiado. Pero la PCR todavía tiene muchas aplicaciones importantes. Por ejemplo, incluso si
no se conoce la secuencia de un gen, aún puede ser posible determinar las secuencias apropiadas
para un par de cebadores, en función de lo que se sabe sobre la secuencia del gen equivalente en un
organismo diferente. Por lo tanto, un gen que ha sido aislado y secuenciado de, por ejemplo, un ratón
podría usarse para diseñar un par de cebadores para el aislamiento del gen equivalente de humanos.

Además, existen muchas aplicaciones donde es necesario aislar o detectar genes cuyas secuencias
ya se conocen. Una PCR de genes de globina humana, por ejemplo, se usa para detectar la presencia
de mutaciones que podrían causar la enfermedad de la sangre llamada talasemia. El diseño de
cebadores apropiados para esta PCR es fácil porque se conocen las secuencias de los genes de la
globina humana. Después de la PCR, las copias del gen se secuencian o se estudian de alguna otra
manera para determinar si alguna de las mutaciones de talasemia está presente.
Otra aplicación clínica de la PCR implica el uso de cebadores específicos para el ADN de un virus
causante de enfermedades. Un resultado positivo indica que una muestra contiene el virus y que la
persona que proporcionó la muestra debe someterse a un tratamiento para prevenir la aparición de la
enfermedad. La reacción en cadena de la polimerasa es tremendamente sensible: una reacción
cuidadosamente preparada produce cantidades detectables de ADN, incluso si solo hay una molécula
de ADN en la mezcla inicial. Esto significa que la técnica puede detectar virus en las primeras etapas
de una infección, lo que aumenta las posibilidades de éxito del tratamiento. Esta gran sensibilidad
significa que la PCR también se puede usar con ADN de material forense, como cabellos y manchas
de sangre seca, o incluso de huesos de humanos muertos hace mucho tiempo (Capítulo 16).
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Capítulo 1 Por qué son importantes la clonación de genes y el análisis de ADN 11

1.6 Cómo orientarse en este libro

Este libro explica cómo se llevan a cabo la clonación de genes, PCR y otras técnicas de análisis de ADN y
describe las aplicaciones de estas técnicas en la biología moderna.
Las aplicaciones se tratan en la segunda y tercera parte del libro. La Parte II describe cómo se estudian los genes
y los genomas y la Parte III da cuenta de las aplicaciones más amplias de la clonación de genes y PCR en
biotecnología, medicina, agricultura y ciencia forense.

En la Parte I nos ocupamos de los principios básicos. La mayoría de los nueve capítulos están dedicados a la
clonación de genes porque esta técnica es más complicada que la PCR. Cuando haya entendido cómo se lleva a
cabo la clonación, habrá entendido muchos de los principios básicos de cómo se analiza el ADN. En el Capítulo 2
analizamos el componente central de un experimento de clonación de genes, el vector, que transporta el gen a la
célula huésped y es responsable de su replicación. Para actuar como vector de clonación, una molécula de ADN
debe ser capaz de entrar en una célula huésped y, una vez dentro, replicarse para producir múltiples copias de sí
misma. Dos tipos naturales de moléculas de ADN satisfacen estos requisitos:

l Plásmidos, que son pequeños círculos de ADN que se encuentran en las bacterias y algunos
otros organismos. Los plásmidos pueden replicarse independientemente del cromosoma de
la célula huésped.

l Los cromosomas de los virus, en particular los cromosomas de los bacteriófagos, que son virus que
infectan específicamente a las bacterias. Durante la infección, la molécula de ADN del bacteriófago se
inyecta en la célula huésped donde se replica.

El Capítulo 3 describe cómo se purifica el ADN de las células vivas (tanto el ADN que se clonará como el ADN
del vector) y el Capítulo 4 cubre las diversas técnicas para manipular moléculas de ADN purificadas en el
laboratorio. Hay muchas de estas técnicas, pero dos son particularmente importantes en la clonación de genes.
Estas son la capacidad de cortar el vector en un punto específico y luego repararlo de tal manera que se inserte
el gen (ver Figura 1.1). Estas y otras manipulaciones del ADN se desarrollaron como una rama de la investigación
básica sobre la síntesis y modificación del ADN en células vivas, y la mayoría de las manipulaciones utilizan
enzimas purificadas. Las propiedades de estas enzimas y la forma en que se utilizan en los estudios de ADN se
describen en el Capítulo 4.

Una vez que se ha construido una molécula de ADN recombinante, debe introducirse en la célula huésped
para que pueda tener lugar la replicación. El transporte a la célula huésped utiliza procesos naturales para la
captación de moléculas de ADN plasmídico y viral. Estos procesos y las formas en que se utilizan en la clonación
de genes se describen en el Capítulo 5, y los tipos más importantes de vectores de clonación se presentan y sus
usos se examinan en los Capítulos 6 y 7. Para concluir la cobertura de la clonación de genes, en el Capítulo 8
investigamos el problema de la selección (ver Figura 1.4), antes de regresar en el Capítulo 9 a una descripción
más detallada de la PCR y sus técnicas relacionadas.
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12 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Blackman, K. (2001) El advenimiento de la ingeniería genética. Tendencias en Ciencias Bioquímicas,
26, 268–270. [Una cuenta de los primeros días de la clonación de genes.]
Brock, TD (1990) El surgimiento de la genética bacteriana. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.
[Detalla el descubrimiento de plásmidos y bacteriófagos.]
Brown, TA (2006) Genomas, 3.ª ed. Garland Science, Oxford. [Una introducción a la genética moderna y la
biología molecular.]
Cherfas, J. (1982) El hombre hizo la vida. Blackwell, Oxford. [Una historia de los primeros años de la genética
Ingenieria.]
Judson, HF (1979) El Octavo Día de la Creación. Penguin Science, Londres. [Un relato muy ameno del
desarrollo de la biología molecular en los años previos a la revolución de la clonación de genes.]

Mullis, KB (1990) Los orígenes inusuales de la reacción en cadena de la polimerasa. Scientific American,
262(4), 56–65. [Un relato entretenido de cómo se inventó la PCR.]
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Capítulo 2
Vectores para gen
Clonación: Plásmidos y
bacteriófagos

Contenido del capítulo

CONTENIDO DEL CAPÍTULO

2.1 Plásmidos
2.2 Bacteriófagos

Una molécula de ADN necesita mostrar varias características para poder actuar como vector para la clonación
de genes. Lo que es más importante, debe poder replicarse dentro de la célula huésped, de modo que se puedan
producir numerosas copias de la molécula de ADN recombinante y pasarlas a las células hijas. Un vector de
clonación también debe ser relativamente pequeño, idealmente de menos de 10 kb de tamaño, ya que las
moléculas grandes tienden a descomponerse durante la purificación y también son más difíciles de manipular.
En las células bacterianas se pueden encontrar dos tipos de moléculas de ADN que satisfacen estos criterios:
plásmidos y cromosomas de bacteriófagos.

2.1 Plásmidos
Los plásmidos son moléculas circulares de ADN que llevan una existencia independiente en la célula bacteriana
(Figura 2.1). Los plásmidos casi siempre portan uno o más genes y, a menudo, estos genes son responsables
de una característica útil que muestra la bacteria huésped.
Por ejemplo, la capacidad de sobrevivir en concentraciones normalmente tóxicas de antibióticos como el
cloranfenicol o la ampicilina a menudo se debe a la presencia en la bacteria de un plásmido que porta genes de
resistencia a los antibióticos. En el laboratorio, la resistencia a los antibióticos se usa a menudo como un
marcador seleccionable para garantizar que las bacterias en un cultivo contengan un plásmido particular
(Figura 2.2).
La mayoría de los plásmidos poseen al menos una secuencia de ADN que puede actuar como origen de
replicación, por lo que son capaces de multiplicarse dentro de la célula independientemente de la bacteria principal.

Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010 13
por Blackwell Publishing.
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14 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 2.1 Plásmidos:

plásmidos plásmidos
elementos genéticos independientes que se encuentran en las
células bacterianas.

cromosoma bacteriano

Figura 2.2 resistencia a

El uso de la resistencia a los antibióticos como marcador la ampicilina

seleccionable para un plásmido. RP4 (arriba) porta genes de

RP4
resistencia a ampicilina, tetraciclina y kanamicina. Solo aquellas
células de E. coli que contienen RP4 (o un plásmido relacionado) Resistencia a Resistencia a la
pueden sobrevivir y crecer en un medio que contiene cantidades la kanamicina tetraciclina

tóxicas de uno o más de estos antibióticos.

Célula con plásmido

Célula sin Células de E. coli ,

plásmido algunas que contienen RP4

Medio de crecimiento Medio de cultivo +50

normal – sin µg/ml de tetraciclina
antibiótico

Todas las Solo las celdas que contienen

células pueden crecer. RP4 puede crecer

cromosoma (Figura 2.3a). Los plásmidos más pequeños utilizan las propias enzimas replicativas del
ADN de la célula huésped para hacer copias de sí mismos, mientras que algunos de los más grandes
llevan genes que codifican enzimas especiales que son específicas para la replicación de plásmidos.
Algunos tipos de plásmidos también pueden replicarse insertándose en el cromosoma bacteriano
(Figura 2.3b). Estos plásmidos o episomas integradores pueden mantenerse de forma estable en
esta forma a través de numerosas divisiones celulares, pero siempre en alguna etapa existen como
elementos independientes.
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Capítulo 2 Vectores para la clonación de genes: plásmidos y bacteriófagos 15

(a) Plásmido no integrativo

plásmidos

División celular

cromosoma bacteriano

(b) Episoma

plásmido

División celular

cromosoma bacteriano Cromosoma portador de

plásmido integrado

Figura 2.3
Estrategias de replicación para (a) un plásmido no integrativo y (b) un episoma.

Tabla 2.1
Tamaños de plásmidos representativos.

TALLA

NUCLEOTIDO LONGITUD MASA MOLECULAR (kb)

PLASMIDO (MDa) ORGANISMO

pUC8 2,1 1,8 E. coli

ColE1 6,4 4,2 E. coli
RP4 54,0 36,0 Pseudomonas y otras E. coli
F 95,0 63,0 Pseudomonas putida
TOL 117,0 78,0 Agrobacterium tumefaciens
pTiAch5 213,0 142,0

2.1.1 Tamaño y número de copias

El tamaño y el número de copias de un plásmido son particularmente importantes en lo que respecta a la
clonación. Ya hemos mencionado la relevancia del tamaño del plásmido y afirmado que es deseable menos
de 10 kb para un vector de clonación. Los plásmidos varían desde aproximadamente 1,0 kb para los más
pequeños hasta más de 250 kb para los plásmidos más grandes (Tabla 2.1), por lo que solo unos pocos son
útiles para fines de clonación. Sin embargo, como veremos en el Capítulo 7, los plásmidos más grandes se
pueden adaptar para la clonación en algunas circunstancias.
El número de copias se refiere al número de moléculas de un plásmido individual que normalmente se
encuentran en una sola célula bacteriana. Los factores que controlan el número de copias no se comprenden
bien. Algunos plásmidos, especialmente los más grandes, son estrictos y tienen una
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dieciséis
Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 2.4 Célula donante plásmido Celda receptora

conjugativo
Transferencia de plásmido por conjugación entre células
bacterianas. Las células donante y receptora se unen
entre sí mediante un pilus, un apéndice hueco presente
en la superficie de la célula donante. A continuación, se
pasa una copia del plásmido a la célula receptora.
Se cree que la transferencia ocurre a través del pilus, pero
esto no ha sido probado y la transferencia por algún otro
medio (p. ej., directamente a través de las paredes de las
células bacterianas) sigue siendo una posibilidad.
pilo

bajo número de copias de quizás solo una o dos por celda; otros, llamados plásmidos relajados , están
presentes en múltiples copias de 50 o más por célula. En términos generales, un vector de clonación útil
debe estar presente en la célula en múltiples copias para que se puedan obtener grandes cantidades de la
molécula de ADN recombinante.

2.1.2 Conjugación y compatibilidad

Los plásmidos se dividen en dos grupos: conjugativos y no conjugativos. Los plásmidos conjugativos se
caracterizan por la capacidad de promover la conjugación sexual entre células bacterianas (Figura 2.4),
un proceso que puede dar como resultado que un plásmido conjugativo se propague de una célula a todas
las demás células en un cultivo bacteriano. La conjugación y la transferencia de plásmidos están controladas
por un conjunto de genes de transferencia o trans , que están presentes en los plásmidos conjugativos pero
ausentes en el tipo no conjugativo. Sin embargo, un plásmido no conjugativo puede, en algunas
circunstancias, cotransferirse junto con un plásmido conjugativo cuando ambos están presentes en la
misma célula.
Se pueden encontrar varios tipos diferentes de plásmido en una sola célula, incluidos más de un
plásmido conjugativo diferente en cualquier momento. De hecho, se sabe que las células de E. coli
contienen hasta siete plásmidos diferentes a la vez. Para poder coexistir en una misma célula, diferentes
plásmidos deben ser compatibles. Si dos plásmidos son incompatibles, uno u otro se perderán rápidamente
de la célula. Por lo tanto, se pueden asignar diferentes tipos de plásmidos a diferentes grupos de
incompatibilidad sobre la base de si pueden coexistir o no, y los plásmidos de un solo grupo de
incompatibilidad a menudo se relacionan entre sí de varias formas. La base de la incompatibilidad no se
comprende bien, pero se cree que los eventos durante la replicación del plásmido subyacen al fenómeno.

2.1.3 Clasificación de plásmidos

La clasificación más útil de los plásmidos naturales se basa en la característica principal codificada por los
genes del plásmido. Los cinco tipos principales de plásmidos según esta clasificación son los siguientes:

l Los plásmidos de fertilidad o F solo portan genes tra y no tienen ninguna característica más allá de
la capacidad de promover la transferencia conyugal de plásmidos. Un ejemplo bien conocido es el
plásmido F de E. coli.
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Capítulo 2 Vectores para la clonación de genes: plásmidos y bacteriófagos 17

Los plásmidos de resistencia o R portan genes que confieren a la bacteria huésped resistencia
a uno o más agentes antibacterianos, como el cloranfenicol, la ampicilina y el mercurio. Los
plásmidos R son muy importantes en microbiología clínica ya que su diseminación a través
de poblaciones naturales puede tener profundas consecuencias en el tratamiento de
infecciones bacterianas. Un ejemplo es RP4, que se encuentra comúnmente en
Pseudomonas, pero también ocurre en muchas otras bacterias.
l Los plásmidos Col codifican colicinas, proteínas que matan otras bacterias. Un ejemplo
es ColE1 de E. coli.
l Los plásmidos degradativos permiten a la bacteria huésped metabolizar moléculas inusuales
como el tolueno y el ácido salicílico, por ejemplo, TOL de Pseudomonas putida. l Los
plásmidos de virulencia confieren patogenicidad a la bacteria huésped; estos incluyen los
plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens, que inducen la enfermedad de la agalla de
la corona en plantas dicotiledóneas.

2.1.4 Plásmidos en organismos distintos de las bacterias

Aunque los plásmidos están muy extendidos en las bacterias, no son tan comunes en otros
organismos. El plásmido eucariótico mejor caracterizado es el círculo de 2 Fm que se presenta en
muchas cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae. El descubrimiento del plásmido 2 fm fue
muy fortuito ya que permitió la construcción de vectores de clonación para este organismo industrial
tan importante (p. 105). Sin embargo, la búsqueda de plásmidos en otros eucariotas (como hongos
filamentosos, plantas y animales) ha resultado decepcionante, y se sospecha que muchos
organismos superiores simplemente no albergan plásmidos dentro de sus células.

2.2 bacteriófagos
Los bacteriófagos, o fagos como se les conoce comúnmente, son virus que infectan específicamente
a las bacterias. Como todos los virus, los fagos tienen una estructura muy simple y consisten
simplemente en una molécula de ADN (u ocasionalmente ácido ribonucleico (ARN)) que lleva
varios genes, incluidos varios para la replicación del fago, rodeados por una capa protectora o
cápside compuesta por moléculas de proteína (Figura 2.5).

(a) cabeza y cola (b) Filamentoso Figura 2.5 Los

dos tipos principales de estructura del fago: (a) cabeza y

Cabeza Moléculas cola (p. ej ., ÿ); (b) filamentoso (por ejemplo, M13).
(contiene de proteína

ADN) (cápside)

molécula de adn

Cola
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18 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

partícula de fago
ADN

1 El fago se adhiere a la bacteria

e inyecta su ADN.

Molécula de ADN de fago

2 La molécula de ADN del fago

se replica

de Se
la cápside,
sintetizan
selos
ensamblan
componentes
y
liberan nuevas partículas de
fago.

Componentes de la cápside
Lisis celular

Nueva partícula de fago

Figura 2.6 El
patrón general de infección de una célula bacteriana por un bacteriófago.

2.2.1 El ciclo de infección por fagos

El patrón general de infección, que es el mismo para todos los tipos de fagos, es un proceso de tres pasos
(Figura 2.6):

1 La partícula de fago se adhiere al exterior de la bacteria e inyecta su ADN

cromosoma en la célula.

2 La molécula de ADN del fago se replica, por lo general, mediante enzimas específicas del fago codificadas por
genes en el cromosoma del fago.
3 Otros genes de fagos dirigen la síntesis de los componentes proteicos de la cápside, y se ensamblan y
liberan nuevas partículas de fagos de la bacteria.

Con algunos tipos de fagos, todo el ciclo de infección se completa muy rápidamente, posiblemente en menos
de 20 minutos. Este tipo de infección rápida se denomina ciclo lítico, ya que la liberación de nuevas partículas
de fago se asocia con la lisis de la célula bacteriana. El rasgo característico de un ciclo de infección lítica es que
la replicación del ADN del fago es seguida inmediatamente
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Capítulo 2 Vectores para la clonación de genes: plásmidos y bacteriófagos 19

por síntesis de proteínas de la cápside, y la molécula de ADN del fago nunca se mantiene en una
condición estable en la célula huésped.

2.2.2 Fagos lisogénicos

En contraste con un ciclo lítico, la infección lisogénica se caracteriza por la retención de la molécula
de ADN del fago en la bacteria huésped, posiblemente durante muchos miles de divisiones celulares.
Con muchos fagos lisogénicos, el ADN del fago se inserta en el genoma bacteriano, de manera
similar a la inserción episomal (ver Figura 2.3b). La forma integrada del ADN del fago (llamado
profago) está inactiva, y una bacteria (denominada lisógeno) que porta un profago suele ser
fisiológicamente indistinguible de una célula no infectada.
Sin embargo, el profago finalmente se libera del genoma huésped y el fago vuelve al modo lítico y
lisa la célula. El ciclo de infección de lambda (E), un fago lisogénico típico de este tipo, se muestra
en la Figura 2.7.
Un número limitado de fagos lisogénicos siguen un ciclo de infección bastante diferente. Cuando
M13 o un fago relacionado infecta a E. coli, se ensamblan y liberan continuamente nuevas partículas
de fago de la célula. El ADN de M13 no se integra en el genoma bacteriano y no se vuelve inactivo.
Con estos fagos, la lisis celular nunca ocurre y la bacteria infectada puede continuar creciendo y
dividiéndose, aunque a un ritmo más lento que las células no infectadas. La figura 2.8 muestra el
ciclo de infección por M13.
Aunque hay muchas variedades diferentes de bacteriófagos, solo e y M13 han encontrado un
papel importante como vectores de clonación. Ahora consideraremos las propiedades de estos dos
fagos con más detalle.

La organización de genes en la molécula de

ADN 5e es un ejemplo típico de un fago de cabeza y cola (ver Figura 2.5a). El ADN está contenido
en la estructura poliédrica de la cabeza y la cola sirve para unir el fago a la superficie bacteriana e
inyectar el ADN en la célula (ver Figura 2.7).
La molécula de ADN e tiene un tamaño de 49 kb y ha sido intensamente estudiada mediante las
técnicas de mapeo de genes y secuenciación de ADN. Como resultado, se conocen las posiciones
e identidades de todos los genes en la molécula de ADN e (Figura 2.9). Una característica del mapa
genético e es que los genes relacionados en términos de función se agrupan en el genoma. Por
ejemplo, todos los genes que codifican los componentes de la cápside se agrupan en el tercio
izquierdo de la molécula, y los genes que controlan la integración del profago en el genoma del
huésped se agrupan en el centro de la molécula. La agrupación de genes relacionados es sumamente
importante para controlar la expresión del genoma e, ya que permite que los genes se activen y
desactiven como grupo en lugar de individualmente. La agrupación también es importante en la
construcción de vectores de clonación basados en e, como descubriremos cuando volvamos a este
tema en el Capítulo 6.

Las formas lineal y circular de 5 ADN Una

segunda característica de e que resulta ser importante en la construcción de vectores de clonación
es la conformación de la molécula de ADN. La molécula que se muestra en la figura 2.9 es lineal,
con dos extremos libres y representa el ADN presente en la estructura de la cabeza del fago. Esta
molécula lineal consta de dos cadenas complementarias de ADN, apareadas según las reglas de
Watson-Crick (es decir, ADN de doble cadena). Sin embargo, en cada extremo de la molécula hay
un tramo corto de 12 nucleótidos en el que el ADN es monocatenario (Figura 2.10a). Las dos
cadenas sencillas son complementarias y, por lo tanto, pueden aparearse entre sí para formar una
molécula circular completamente bicatenaria (Figura 2.10b).
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20 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

La partícula de fago ÿ se
adhiere a una célula de E.coli e
inyecta su ADN

cromosoma
bacteriano

El ADN ÿ se circulariza

ÿ ADN

El ADN ÿ se integra en el
cromosoma huésped.

División celular División celular

Inducción:
Un ADN ÿ se escinde del
cromosoma huésped

B Se producen nuevas partículas

de fago (véanse los pasos 2
y 3 de la figura 2.6)
B

Figura 2.7 El
ciclo de infección lisogénica del bacteriófago ÿ.

Las hebras simples complementarias a menudo se denominan extremos "pegajosos" o

extremos cohesivos, porque el emparejamiento de bases entre ellos puede "pegar" los dos extremos
de una molécula de ADN (o los extremos de dos moléculas de ADN diferentes). Los extremos
cohesivos se denominan sitios cos y desempeñan dos funciones distintas durante el ciclo de
infección. En primer lugar, permiten circularizar la molécula de ADN lineal que se inyecta en la
célula, lo cual es un requisito previo necesario para la inserción en el genoma bacteriano (véase la figura 2.7).
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Capítulo 2 Vectores para la clonación de genes: plásmidos y bacteriófagos 21

fago M13

pilo
ADN M13

El fago M13 se adhiere a un

pilus en una célula de E.coli
e inyecta su ADN

Replicación del ADN M13

Los nuevos fagos M13 se

expulsan continuamente de fagos M13
una célula infectada

Las células infectadas continúan

creciendo y dividiéndose.

Las células hijas continúan

liberando partículas M13

Figura 2.8 El
ciclo de infección del bacteriófago M13.

Integración
yescisión Regulación
temprana síntesis
ADN
de Regulación
tardía huésped
Lisis
del

Componentes y región b2
ensamblaje de la cápside (no esencial)

AWB C EFZUVGT D HM J LKI int xis exo clll N cl OP cro q RS

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 49 kb

Figura 2.9 El
mapa genético ÿ , que muestra las posiciones de los genes importantes y las funciones de los grupos de genes.

El segundo papel de los sitios cos es bastante diferente y entra en juego después de que el
profago se ha eliminado del genoma del huésped. En esta etapa, se produce una gran cantidad
de nuevas moléculas de ADN-e mediante el mecanismo de círculo rodante de la replicación
(Figura 2.10c), en el que una hebra continua de ADN se “desprende” de la molécula molde. El
resultado es un catenano que consta de una serie de genomas e lineales unidos en los sitios cos .
El papel de los sitios cos ahora es actuar como secuencias de reconocimiento para una
endonucleasa que escinde el catenano en los sitios cos , produciendo genomas e individuales.
Esta endonucleasa, que es el producto del gen A en la molécula de ADN e, crea los extremos
cohesivos monocatenarios y también actúa junto con otras proteínas para empaquetar cada
genoma e en una estructura de cabeza de fago. Los procesos de escisión y empaquetamiento
reconocen solo los sitios cos y las secuencias de ADN a cada lado de ellos, por lo que cambiar
la estructura de las regiones internas del genoma e, por ejemplo mediante la inserción de
nuevos genes, no tiene efecto en estos eventos siempre que el la longitud total del genoma e
no se altera demasiado.
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22 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) La forma lineal de la molécula de ADN ÿ

Extremo cohesivo derecho
CCC CC
GGCT
GGA

GA CCCC
GGG GG T
Extremo cohesivo izquierdo

(b) La forma circular de porque el sitio

la molécula de ADN ÿ C C GRAMO
T GRAMO

C GRAMO

C
C A
GRAMO

C GRAMO
GRAMO
CAC
GRAMO
GRAMO
GRAMO
CT

(c) Replicación y empaquetamiento de ADN ÿ

porque porque porque
El catenano se 'desprendió'
porque
de la molécula de ADN ÿ
32 1

La endonucleasa del gen

A escinde el catenano en
los sitios cos

Componentes proteicos
de la cápside

Se ensamblan nuevas
partículas de fago.

Figura 2.10 Las

formas lineal y circular del ADN ÿ . (a) La forma lineal, que muestra los extremos cohesivos izquierdo y derecho. (b) El emparejamiento de
bases entre los extremos cohesivos da como resultado la forma circular de la molécula. (c) La replicación en círculo rodante produce una catenana
de nuevas moléculas de ADN ÿ lineales , que se empaquetan individualmente en cabezas de fago a medida que se ensamblan nuevas partículas ÿ .

M13: un fago filamentoso

M13 es un ejemplo de un fago filamentoso (ver Figura 2.5b) y tiene una estructura completamente
diferente de e. Además, la molécula de ADN M13 es mucho más pequeña que el genoma e,
con solo 6407 nucleótidos de longitud. Es circular y es inusual porque consiste completamente
en ADN monocatenario.
El tamaño más pequeño de la molécula de ADN M13 significa que tiene espacio para menos
genes que el genoma e. Esto es posible porque la cápside M13 se construye a partir de
múltiples copias de solo tres proteínas (que requieren solo tres genes), mientras que la síntesis de la e
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Capítulo 2 Vectores para la clonación de genes: plásmidos y bacteriófagos 23

La partícula M13 Figura 2.11 El ciclo

inyecta ADN de infección de M13, que muestra los diferentes tipos
en la célula
pilo de replicación de ADN que ocurren. (a) Después de
la infección, la molécula de ADN M13 de cadena
(a) Inyección de ADN sencilla se convierte en la forma replicativa (RF) de
monocatenario en la
cadena doble. (b) La RF se replica para producir
célula huésped, seguida de
múltiples copias de sí misma. (c) Las moléculas
la síntesis de la segunda
cadena monocatenarias se sintetizan mediante replicación en
círculo rodante y se utilizan en el ensamblaje de nuevas
monocatenario Doble cadena
ADN partículas M13.
ADN - forma
replicativa (RF)

(b) replicación de la
RF para producir nuevas
moléculas de doble
cadena

(C) El fago M13 maduro se

produce continuamente

RF se replica mediante un
mecanismo de círculo rodante
para producir ADN
monocatenario lineal ADN circularizado

Partículas de
fagos maduros

La estructura de cabeza y cola involucra más de 15 proteínas diferentes. Además, M13 sigue un
ciclo de infección más simple que e y no necesita genes para insertarse en el huésped.
genoma
La inyección de una molécula de ADN M13 en una célula de E. coli se produce a través del
pilus, la estructura que conecta dos células durante la conjugación sexual (ver Figura 2.4). Una
vez dentro de la célula, la molécula monocatenaria actúa como molde para la síntesis de una
cadena complementaria, lo que da como resultado un ADN normal de doble cadena (Figura 2.11a).
Esta molécula no se inserta en el genoma bacteriano, sino que se replica hasta que hay más de
100 copias presentes en la célula (Figura 2.11b). Cuando la bacteria se divide, cada célula hija
recibe copias del genoma del fago, que continúa replicándose, manteniendo así su número total
por célula. Como se muestra en la figura 2.11c, se ensamblan y liberan continuamente nuevas
partículas de fagos, produciéndose alrededor de 1000 nuevos fagos durante cada generación de
una célula infectada.
Varias características de M13 hacen que este fago sea atractivo como vector de clonación. El
genoma tiene un tamaño inferior a 10 kb, muy dentro del rango deseable para un vector potencial.
Además, la forma replicativa (RF) de doble cadena del genoma M13 se comporta de manera muy
parecida a un plásmido y puede tratarse como tal con fines experimentales. Se prepara fácilmente
a partir de un cultivo de células de E. coli infectadas (pág. 43) y se puede reintroducir por
transfección (pág. 81). Lo que es más importante, los genes clonados con un vector basado en
M13 se pueden obtener en forma de ADN monocatenario. Las versiones monocatenarias de genes
clonados son útiles para varias técnicas, en particular la secuenciación del ADN y la mutagénesis
in vitro (págs. 169 y 203). La clonación en un vector M13 es una forma fácil y fiable de obtener
ADN monocatenario para este tipo de trabajos. Los vectores M13 también se utilizan en la
presentación de fagos, una técnica para identificar pares de genes cuyos productos proteicos interactúan entre sí (pág. 220).
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24 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

2.2.3 Los virus como vectores de clonación para otros organismos La

mayoría de los organismos vivos están infectados por virus y no sorprende que haya habido un
gran interés en la posibilidad de que los virus puedan usarse como vectores de clonación para
organismos superiores. Esto es especialmente importante cuando se recuerda que los plásmidos
no se encuentran comúnmente en organismos que no sean bacterias y levaduras. Se han
empleado varios virus eucarióticos como vectores de clonación para aplicaciones especializadas:
por ejemplo, los adenovirus humanos se usan en terapia génica (pág. 259), los baculovirus
se usan para sintetizar proteínas farmacéuticas importantes en células de insectos (pág. 240) y
los caulimovirus y geminivirus han sido utilizados para la clonación en plantas (p. 120). Estos
vectores se analizan con más detalle en el Capítulo 7.

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Dale, JW y Park, ST (2004) Genética molecular de bacterias, 4ª ed. Wiley Blackwell,
Chichester. [Proporciona una descripción detallada de plásmidos y bacteriófagos.]
Willey, J., Sherwood, L. y Woolverton, C. (2007) Microbiología de Prescott, 7ª ed. Educación
Superior McGraw Hill, Maidenhead. [Una buena introducción a la microbiología, incluidos
plásmidos y fagos.]
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Capítulo 3
Purificación de
ADN de células vivas
Contenido del capítulo
CONTENIDO DEL CAPÍTULO

3.1 Preparación del ADN celular total

3.2 Preparación del ADN del plásmido
3.3 Preparación del ADN del bacteriófago

El ingeniero genético necesitará, en diferentes momentos, preparar al menos tres tipos distintos de
ADN. En primer lugar, a menudo se requerirá el ADN celular total como fuente de material a partir
del cual obtener los genes que se clonarán. El ADN celular total puede ser ADN de un cultivo de
bacterias, de una planta, de células animales o de cualquier otro tipo de organismo que se esté estudiando.
Consiste en el ADN genómico del organismo junto con cualquier molécula de ADN adicional, como
plásmidos, que estén presentes.
El segundo tipo de ADN que se requerirá es ADN plasmídico puro. La preparación de ADN
plasmídico a partir de un cultivo de bacterias sigue los mismos pasos básicos que la purificación del
ADN celular total, con la diferencia crucial de que, en algún momento, el ADN plasmídico debe
separarse de la mayor parte del ADN cromosómico también presente en la célula.
Finalmente, se necesitará ADN de fago si se va a utilizar un vector de clonación de fago. El ADN
del fago generalmente se prepara a partir de partículas de bacteriófagos en lugar de células infectadas,
por lo que no hay problema con la contaminación del ADN bacteriano. Sin embargo, se necesitan
técnicas especiales para eliminar la cápside del fago. Una excepción es la forma replicativa de doble
cadena de M13, que se prepara a partir de células de E. coli de la misma manera que un plásmido
bacteriano.

3.1 Preparación del ADN celular total

Los fundamentos de la preparación del ADN se entienden más fácilmente considerando primero el
tipo más simple de procedimiento de purificación del ADN, aquel en el que todo el complemento del ADN

Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010 25
por Blackwell Publishing.
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26 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

centrifugación

Cultivo bacteriano Pellet de células extracto celular ADN puro

1 2 3 4
Se cultiva un cultivo de Las células se extraen y se El ADN se purifica a El ADN se
bacterias y luego se cosecha. rompen para dar un extracto celular. partir del extracto celular. concentra

Figura 3.1 Los

pasos básicos en la preparación del ADN celular total a partir de un cultivo de bacterias.

Se requiere una célula bacteriana. Las modificaciones necesarias para la preparación del ADN del plásmido
y el fago se pueden describir más adelante.
El procedimiento para la preparación de ADN total a partir de un cultivo de células bacterianas puede ser
se divide en cuatro etapas (Figura 3.1): 1 Se

cultiva un cultivo de bacterias y luego se cosecha.

2 Las celdas se abren para liberar su contenido.
3 Este extracto celular se trata para eliminar todos los componentes excepto el ADN.
4 La solución de ADN resultante se concentra.

3.1.1 Crecimiento y recolección de un cultivo bacteriano La mayoría de las

bacterias se pueden cultivar sin demasiada dificultad en un medio líquido (cultivo en caldo). El medio de
cultivo debe proporcionar una mezcla equilibrada de los nutrientes esenciales en concentraciones que
permitan que las bacterias crezcan y se dividan de manera eficiente. Dos medios de crecimiento típicos se
detallan en la Tabla 3.1.
M9 es un ejemplo de un medio definido en el que se conocen todos los componentes. Este medio
contiene una mezcla de nutrientes inorgánicos para proporcionar elementos esenciales como

Tabla 3.1
La composición de dos medios típicos para el crecimiento de cultivos bacterianos.

MEDIO COMPONENTE g/l DE MEDIO

M9 medio Na2HPO4 6,0

KH2PO4 3,0
NaCl 0,5

NH4Cl 1,0

MgSO4 0,5
Glucosa 2,0

CaCl2 0,015

LB (medio Luria-Bertani) triptona 10,0 5,0

Extracto de levadura 10,0
NaCl
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Capítulo 3 Purificación de ADN a partir de células vivas 27

nitrógeno, magnesio y calcio, así como glucosa para suministrar carbono y energía. En la práctica,
se deben agregar a M9 factores de crecimiento adicionales, como oligoelementos y vitaminas,
antes de que apoye el crecimiento bacteriano. Precisamente qué suplementos se necesitan
depende de la especie en cuestión.
El segundo medio descrito en la Tabla 3.1 es bastante diferente. Luria-Bertani (LB) es un medio
complejo o indefinido, lo que significa que se desconoce la identidad precisa y la cantidad de sus
componentes. Esto se debe a que dos de los ingredientes, la triptona y el extracto de levadura, son
mezclas complicadas de compuestos químicos desconocidos. De hecho, la triptona proporciona
aminoácidos y péptidos pequeños, mientras que el extracto de levadura (una preparación seca de
células de levadura parcialmente digeridas) proporciona los requisitos de nitrógeno, junto con
azúcares y nutrientes inorgánicos y orgánicos. Los medios complejos como LB no necesitan más
suplementos y favorecen el crecimiento de una amplia gama de especies bacterianas.
Los medios definidos deben usarse cuando el cultivo bacteriano debe crecer en condiciones
controladas con precisión. Sin embargo, esto no es necesario cuando el cultivo se cultiva
simplemente como una fuente de ADN y, en estas circunstancias, es apropiado un medio complejo.
En medio LB a 37 °C, aireado mediante agitación a 150–250 rpm en una plataforma rotatoria, las
células de E. coli se dividen una vez cada 20 minutos aproximadamente hasta que el cultivo alcanza
una densidad máxima de aproximadamente 2–3 × 109 células/ml. El crecimiento del cultivo se
puede monitorear leyendo la densidad óptica (OD) a 600 nm (Figura 3.2), a la cual 1 unidad de OD
de longitud de onda corresponde a aproximadamente 0,8 × 109 células/ml.
Para preparar un extracto celular, las bacterias deben obtenerse en el menor volumen posible.
Por lo tanto, la cosecha se realiza girando el cultivo en una centrífuga (Figura 3.3). Las velocidades
de centrifugación relativamente bajas sedimentarán las bacterias en el fondo del tubo de centrífuga,
lo que permitirá que se vierta el medio de cultivo. bacterias de un

(a) Medición de la densidad óptica Figura 3.2

Estimación del número de células
Luz incidente a bacterianas mediante la medición de la
una longitud de Luz transmitida densidad óptica (DO). (a) Se coloca una muestra
DE
onda de 600 nm del cultivo en una cubeta de vidrio y se hace pasar
luz con una longitud de onda de 600 nm. Se mide la
Detector cantidad de luz que pasa a través del cultivo y se
calcula la OD (también llamada absorbancia) como:

Cultivo bacteriano contenido en intensidad de la luz transmitida

1 unidad OD = log10
una cubeta de 1 cm de ancho intensidad de la luz incidente

La operación se realiza con un

(b) Estimación del número de celdas espectrofotómetro. (b) El número de celda
de una curva de calibración correspondiente a la lectura de OD se calcula a partir
2.5 de una curva de calibración. Esta curva se traza a partir
de los valores de DO de una serie de cultivos de

2.0 densidad celular conocida. Para E. coli, 1 unidad OD =

0,8 × 109 células/ml.

1.5
Densidad
óptica
600
nm
a

1.0

0.5

0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

Número de células (× 109 ) por ml

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28 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Girar a 8000 rpm

durante 10 minutos

Cultivo bacteriano Pellet de bacterias

Rotor centrífugo

Figura 3.3

Recolección de bacterias por centrifugación.

A continuación, se pueden resuspender 1000 ml de cultivo a la máxima densidad celular en un volumen

de 10 ml o menos.

3.1.2 Preparación de un extracto celular

La célula bacteriana está encerrada en una membrana citoplasmática y rodeada por una pared celular
rígida. Con algunas especies, incluida E. coli, la pared celular puede estar envuelta por una segunda
membrana externa. Todas estas barreras deben romperse para liberar los componentes celulares.

Las técnicas para abrir células bacterianas se pueden dividir en métodos físicos, en los que las células
se rompen mediante fuerzas mecánicas, y métodos químicos, en los que la lisis celular se produce por
exposición a agentes químicos que afectan la integridad de las barreras celulares. Los métodos químicos
se usan más comúnmente con células bacterianas cuando el objetivo es la preparación de ADN.

La lisis química generalmente implica que un agente ataque la pared celular y otro rompa la membrana
celular (Figura 3.4a). Los productos químicos que se usan dependen de la especie de bacteria involucrada,
pero con E. coli y organismos relacionados, el debilitamiento de la pared celular generalmente lo provoca
la lisozima, el tetraacetato de etilendiamina (EDTA) o una combinación de ambos. La lisozima es una
enzima que está presente en la clara de huevo y en secreciones como lágrimas y saliva, y que digiere los
compuestos poliméricos que dan rigidez a la pared celular. El EDTA elimina los iones de magnesio que
son esenciales para preservar la estructura general de la envoltura celular y también inhibe las enzimas
celulares que podrían degradar el ADN. Bajo algunas condiciones, el debilitamiento de la pared celular con
lisozima o

(a) Lisis celular (b) Centrifugación para eliminar los restos celulares.
Romper la pared celular

extracto celular
extracto celular

Rompe la
Centrífugo ADN, ARN,
membrana celular
proteína

Restos celulares

Figura 3.4

Preparación de un extracto celular. (a) Lisis celular. (b) Centrifugación del extracto celular para eliminar los residuos insolubles.
Machine Translated by Google

Capítulo 3 Purificación de ADN a partir de células vivas 29

El EDTA es suficiente para hacer que las células bacterianas revienten, pero generalmente también se agrega
un detergente como el dodecilsulfato de sodio (SDS). Los detergentes ayudan en el proceso de lisis al eliminar
las moléculas de lípidos y, por lo tanto, provocan la ruptura de las membranas celulares.
Habiendo lisado las células, el paso final en la preparación de un extracto celular es la eliminación de restos
celulares insolubles. Los componentes, como las fracciones de la pared celular parcialmente digeridas, pueden
sedimentarse mediante centrifugación (Figura 3.4b), dejando el extracto celular como un sobrenadante
razonablemente claro.

3.1.3 Purificación de ADN a partir de un extracto celular

Además de ADN, un extracto de células bacterianas contiene cantidades significativas de proteína y ARN. Se
puede utilizar una variedad de métodos para purificar el ADN de esta mezcla. Un enfoque es tratar la mezcla
con reactivos que degraden los contaminantes, dejando una solución pura de ADN (Figura 3.5a). Otros métodos
utilizan la cromatografía de intercambio iónico para separar la mezcla en sus diversos componentes, de
modo que el ADN se elimine de las proteínas y el ARN del extracto (Figura 3.5b).

Eliminación de contaminantes mediante extracción orgánica y digestión enzimática La

forma estándar de desproteinizar un extracto celular es agregar fenol o una mezcla 1:1 de fenol y cloroformo.
Estos solventes orgánicos precipitan las proteínas pero dejan los ácidos nucleicos (ADN y ARN) en solución
acuosa. El resultado es que si el extracto celular se mezcla suavemente con el solvente y las capas luego se
separan por centrifugación, las moléculas de proteína precipitadas quedan como una masa blanca coagulada
en la interfaz entre las capas acuosa y orgánica (Figura 3.6). A continuación, la solución acuosa de ácidos
nucleicos se puede eliminar con una pipeta.

Con algunos extractos de células, el contenido de proteína es tan grande que una sola extracción con fenol
no es suficiente para purificar completamente los ácidos nucleicos. Este problema podría resolverse realizando
varias extracciones con fenol una tras otra, pero esto no es deseable ya que cada paso de mezcla y
centrifugación da como resultado una cierta cantidad de rotura de las moléculas de ADN. La respuesta es tratar
el extracto celular con una proteasa como la pronasa o

(a) Degradación de contaminantes Figura 3.5 Dos

enfoques para la purificación del ADN. (a) Tratar
la mezcla con reactivos que degradan los
contaminantes, dejando una solución pura de
ADN. (b) Separar la mezcla en diferentes
fracciones, una de las cuales es ADN puro.

Contaminantes de ADN ADN puro

(b) Separación del ADN de los contaminantes.

ADN puro Contaminantes

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30 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 3.6
capa acuosa
Eliminación de contaminantes proteicos mediante (ADN + ARN)
extracción con fenol.
Interfaz
(proteínas
coaguladas)
Fenol

extracto celular Mezclar Capas separadas

con fenol por centrifugación

proteinasa K antes de la extracción con fenol. Estas enzimas descomponen los polipéptidos en
unidades más pequeñas, que el fenol elimina más fácilmente.
Algunas moléculas de ARN, especialmente el ARN mensajero (ARNm), se eliminan mediante
el tratamiento con fenol, pero la mayoría permanece con el ADN en la capa acuosa. La única
forma eficaz de eliminar el ARN es con la enzima ribonucleasa, que degrada rápidamente estas
moléculas en subunidades de ribonucleótidos.

Uso de la cromatografía de intercambio iónico para purificar el ADN de un

extracto celular Los bioquímicos han ideado varios métodos para usar diferencias en la carga
eléctrica para separar mezclas de productos químicos en sus componentes individuales. Uno de
estos métodos es la cromatografía de intercambio iónico, que separa las moléculas según la
fuerza con que se unen a las partículas cargadas eléctricamente presentes en una matriz o resina
cromatográfica. Tanto el ADN como el ARN están cargados negativamente, al igual que algunas
proteínas, por lo que se unen a una resina cargada positivamente. La unión eléctrica se ve
interrumpida por la sal (Figura 3.7a), y la eliminación de las moléculas más unidas requiere
concentraciones más altas de sal. Al aumentar gradualmente la concentración de sal, se pueden
separar diferentes tipos de moléculas de la resina una tras otra.
La forma más sencilla de llevar a cabo la cromatografía de intercambio iónico es colocar la
resina en una columna de vidrio o plástico y luego agregar el extracto celular en la parte superior
(Figura 3.7b). El extracto pasa a través de la columna, y debido a que este extracto contiene muy
poca sal, todas las moléculas cargadas negativamente se unen a la resina y quedan retenidas en
la columna. Si ahora se pasa a través de la columna una solución salina de concentración
gradualmente creciente, los diferentes tipos de moléculas eluirán (es decir, se soltarán) en la
secuencia proteína, ARN y finalmente ADN. Sin embargo, normalmente no se necesita una
separación tan cuidadosa, por lo que solo se utilizan dos soluciones salinas, una cuya
concentración es suficiente para eluir la proteína y el ARN, dejando solo el ADN unido, seguida
de una segunda de mayor concentración que eluye el ADN, ahora libre. de proteínas y contaminantes de ARN.

3.1.4 Concentración de muestras de ADN

La extracción orgánica a menudo da como resultado una solución muy espesa de ADN que no
necesita concentrarse más. Otros métodos de purificación dan soluciones más diluidas y, por lo
tanto, es importante considerar métodos para aumentar la concentración de ADN.
El método de concentración más utilizado es la precipitación con etanol. En presencia de
sal (estrictamente hablando, cationes monovalentes como los iones de sodio (Na+)) y a una
temperatura de -20 °C o menos, el etanol absoluto precipita eficazmente los ácidos nucleicos
poliméricos. Con una solución espesa de ADN, el etanol se puede colocar en capas sobre la
muestra, lo que hace que las moléculas se precipiten en la interfase. Un truco espectacular es
empujar una barra de vidrio a través del etanol hacia la solución de ADN. Cuando se quita la varilla,
Machine Translated by Google
Capítulo 3 Purificación de ADN a partir de células vivas 31

(a) Unión de ADN a partículas de intercambio iónico Figura 3.7

Purificación de ADN por cromatografía

+ + + de intercambio iónico. (a) Unión de ADN a partículas
+ de intercambio iónico. (b) El ADN se purifica por
+ Sal
+ + cromatografía en columna. Las soluciones que pasan a

+ través de la columna se pueden recolectar por flujo de

+
gravedad o por el método de columna giratoria , en el
+ que la columna se coloca en una centrífuga de baja velocidad.
partícula de ADN
intercambio largo molécula

(b) Purificación de ADN por cromatografía de intercambio iónico.

extracto celular

mas
Sal sal

resina de intercambio
largo

Proteína ADN
+ ARN

Desechar

Las moléculas de ADN se adhieren y pueden extraerse de la solución en forma de fibra larga (Figura
3.8a). Alternativamente, si se mezcla etanol con una solución diluida de ADN, el precipitado se
puede recolectar por centrifugación (Figura 3.8b) y luego se vuelve a disolver en un volumen
apropiado de agua. La precipitación con etanol tiene la ventaja añadida de dejar en solución los
componentes de ácido nucleico monomérico y de cadena corta. Por lo tanto, los ribonucleótidos
producidos por el tratamiento con ribonucleasa se pierden en esta etapa.

3.1.5 Medición de la concentración de ADN

Es crucial saber exactamente cuánto ADN está presente en una solución cuando se lleva a cabo un
experimento de clonación de genes. Afortunadamente, las concentraciones de ADN se pueden
medir con precisión mediante espectrofotometría de absorbancia ultravioleta (UV). La cantidad
de radiación UV absorbida por una solución de ADN es directamente proporcional a la cantidad de ADN en el
Machine Translated by Google
32 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 3.8

Recolección de ADN por precipitación con

etanol. (a) Se coloca etanol absoluto sobre una Varilla de vidrio
solución concentrada de ADN. Las fibras de ADN
se pueden retirar con una varilla de vidrio. (b) Para
soluciones menos concentradas, se agrega etanol (en
una proporción de 2,5 volúmenes de etanol absoluto por fibras de ADN
1 volumen de solución de ADN) y el ADN precipitado se
recolecta por centrifugación.
Etanol Etanol

Concentrado precipitado
solución de ADN ADN, recogido por
centrifugación

(a) (b)

muestra. Por lo general, la absorbancia se mide a 260 nm, a cuya longitud de onda una absorbancia (A260) de
1,0 corresponde a 50 mg de ADN de doble cadena por ml. Se pueden realizar mediciones de tan solo 1 fl de
una solución de ADN en espectrofotómetros diseñados especialmente para este propósito.

La absorbancia ultravioleta también se puede utilizar para comprobar la pureza de una preparación de ADN.
Con una muestra pura de ADN, la relación de las absorbancias a 260 y 280 nm (A260/A280) es de 1,8. Las
proporciones de menos de 1,8 indican que la preparación está contaminada, ya sea con proteína o con fenol.

3.1.6 Otros métodos para la preparación de ADN celular total

Las bacterias no son los únicos organismos de los que se puede requerir ADN. Se necesitará ADN celular total
de, por ejemplo, plantas o animales si el objetivo del proyecto de ingeniería genética es clonar genes de estos
organismos. Aunque los pasos básicos en la purificación del ADN son los mismos independientemente del
organismo, es posible que deban introducirse algunas modificaciones para tener en cuenta las características
especiales de las células que se utilizan.
Obviamente, el crecimiento de células en medio líquido es apropiado solo para bacterias, otros
microorganismos y cultivos de células vegetales y animales. Sin embargo, es probable que se necesiten las
principales modificaciones en la etapa de rotura celular. Los productos químicos utilizados para alterar las
células bacterianas no suelen funcionar con otros organismos: la lisozima, por ejemplo, no tiene ningún efecto
sobre las células vegetales. Las enzimas degradantes específicas están disponibles para la mayoría de los
tipos de paredes celulares, pero a menudo las técnicas físicas, como moler material congelado con un mortero,
son más eficientes. Por otro lado, la mayoría de las células animales no tienen pared celular y pueden lisarse
simplemente tratándolas con detergente.
Otra consideración importante es el contenido bioquímico de las células de las que se extrae el ADN. Con
la mayoría de las bacterias, los principales bioquímicos presentes en un extracto celular son proteínas, ADN y
ARN, por lo que la extracción con fenol y/o el tratamiento con proteasa, seguido de la eliminación del ARN con
ribonucleasa, deja una muestra de ADN puro. Sin embargo, estos tratamientos pueden no ser suficientes para
producir ADN puro si las células también contienen cantidades significativas de otros productos bioquímicos.
Los tejidos vegetales son particularmente difíciles a este respecto, ya que a menudo contienen grandes
cantidades de carbohidratos que no se eliminan mediante la extracción con fenol. En su lugar, se debe utilizar
un enfoque diferente. Un método utiliza un detergente llamado bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), que
forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos. Cuando se agrega CTAB a una célula vegetal, se extrae
el
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Capítulo 3 Purificación de ADN a partir de células vivas 33

Carbohidratos,
proteínas, etc.

Desechar
CTAB Centrífugo el sobrenadante Precipitación con
etanol, tratamiento
Resuspender el Puro
con ribonucleasa
sedimento en NaCl 1 M ADN

extracto celular Complejo ácido nucleico Ácido nucleico-

precipitado-CTAB complejo CTAB

Figura 3.9 El
método CTAB para la purificación de ADN vegetal.

El complejo ácido nucleico-CTAB precipita, dejando carbohidratos, proteínas y otros contaminantes

en el sobrenadante (Figura 3.9). Luego, el precipitado se recolecta por centrifugación y se resuspende
en cloruro de sodio 1 M, lo que hace que el complejo se descomponga. Los ácidos nucleicos ahora
se pueden concentrar mediante precipitación con etanol y el ARN se puede eliminar mediante
tratamiento con ribonucleasa.
La necesidad de adaptar los métodos de extracción orgánica para tener en cuenta los contenidos
bioquímicos de los diferentes tipos de material de partida ha estimulado la búsqueda de métodos de
purificación de ADN que puedan utilizarse con cualquier especie. Esta es una de las razones por las
que la cromatografía de intercambio iónico se ha vuelto tan popular. Un método similar implica un
compuesto llamado tiocianato de guanidinio, que tiene dos propiedades que lo hacen útil para la
purificación del ADN. En primer lugar, desnaturaliza y disuelve todos los productos bioquímicos
distintos de los ácidos nucleicos y, por lo tanto, puede utilizarse para liberar ADN de prácticamente
cualquier tipo de célula o tejido. En segundo lugar, en presencia de tiocianato de guanidinio, el ADN
se une fuertemente a las partículas de sílice (Figura 3.10a). Esto proporciona una manera fácil de
recuperar el ADN de la mezcla desnaturalizada de productos bioquímicos. Una posibilidad es agregar
la sílice directamente al extracto celular pero, al igual que con los métodos de intercambio iónico, es
más conveniente usar una columna de cromatografía. La sílice se coloca en la columna y se agrega
el extracto celular (Figura 3.10b). El ADN se une a la sílice y se retiene en la columna, mientras que
los productos bioquímicos desnaturalizados pasan directamente. Después de lavar los últimos
contaminantes con una solución de tiocianato de guanidinio, el ADN se recupera agregando agua, lo
que desestabiliza las interacciones entre las moléculas de ADN y la sílice.

3.2 Preparación de ADN plasmídico

La purificación de plásmidos de un cultivo de bacterias implica la misma estrategia general que la
preparación del ADN celular total. Se cultiva un cultivo de células, que contiene plásmidos, en medio
líquido, se recolecta y se prepara un extracto celular. La proteína y el ARN se eliminan y el ADN
probablemente se concentra por precipitación con etanol. Sin embargo, existe una distinción
importante entre la purificación de plásmidos y la preparación del ADN celular total.
En una preparación de plásmido siempre es necesario separar el ADN del plásmido de la gran
cantidad de ADN cromosómico bacteriano que también está presente en las células.
La separación de los dos tipos de ADN puede ser muy difícil, pero no obstante es esencial si los
plásmidos se van a utilizar como vectores de clonación. La presencia de la menor cantidad de ADN
bacteriano contaminante en un experimento de clonación de genes puede conducir fácilmente a
resultados no deseados. Afortunadamente, existen varios métodos para eliminar el ADN bacteriano durante la
Machine Translated by Google
34 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 3.10 (a) Unión de ADN a partículas de sílice

Purificación de ADN por el método de sílice y

tiocianato de guanidinio. (a) En presencia de + + +

tiocianato de guanidinio, el ADN se une a las +

+ Sal
partículas de sílice. (b) El ADN se purifica por + +

cromatografía en columna. +
+

partícula de sílice molécula de adn

(b) Purificación de ADN por cromatografía en columna.

extracto celular

Agua

Partículas de sílice

Desnaturalizado ADN
productos bioquimicos

Desechar

la purificación de plásmidos y el uso de estos métodos, individualmente o en combinación, pueden dar como
resultado el aislamiento de ADN de plásmido muy puro.
Los métodos se basan en las diversas diferencias físicas entre el ADN plasmídico y el ADN bacteriano,
la más obvia de las cuales es el tamaño. Los plásmidos más grandes tienen solo el 8% del tamaño del
cromosoma de E. coli , y la mayoría son mucho más pequeños que esto. Por lo tanto, las técnicas que
pueden separar las moléculas de ADN pequeñas de las grandes deberían purificar eficazmente el ADN del
plásmido.
Además del tamaño, los plásmidos y el ADN bacteriano difieren en su conformación. Cuando se aplica
a un polímero como el ADN, el término conformación se refiere a la configuración espacial general de la
molécula, siendo las dos conformaciones más simples la lineal y la circular.
Los plásmidos y el cromosoma bacteriano son circulares, pero durante la preparación del extracto celular el
cromosoma siempre se rompe para dar fragmentos lineales. Por lo tanto, un método para separar moléculas
circulares de lineales dará como resultado plásmidos puros.
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Capítulo 3 Purificación de ADN a partir de células vivas 35

3.2.1 Separación en función del tamaño La etapa

habitual en la que se realiza el fraccionamiento por tamaño es durante la preparación del extracto
celular. Si las células se lisan en condiciones muy controladas, solo se produce una cantidad
mínima de rotura del ADN cromosómico. Los fragmentos de ADN resultantes siguen siendo muy
grandes, mucho más grandes que los plásmidos, y se pueden eliminar con los restos celulares
mediante centrifugación. Este proceso se ve favorecido por el hecho de que el cromosoma
bacteriano está unido físicamente a la envoltura de la célula, por lo que los fragmentos del
cromosoma sedimentan con los restos celulares si estas uniones no se rompen.
Por lo tanto, la ruptura celular debe llevarse a cabo con mucho cuidado para evitar la
ruptura total del ADN bacteriano. Para E. coli y especies relacionadas, la lisis controlada se
realiza como se muestra en la Figura 3.11. El tratamiento con EDTA y lisozima se realiza en
presencia de sacarosa, lo que evita que las células revienten inmediatamente. En cambio, se
forman esferoplastos , células con paredes celulares parcialmente degradadas que retienen
una membrana citoplasmática intacta. La lisis celular ahora se induce agregando un detergente
no iónico como Triton X-100 (los detergentes iónicos, como SDS, causan la rotura cromosómica).
Este método provoca muy poca rotura del ADN bacteriano, por lo que la centrifugación deja un
lisado claro, que consiste casi en su totalidad en ADN plasmídico.
Sin embargo, un lisado aclarado retendrá invariablemente algo de ADN cromosómico.
Además, si los propios plásmidos son moléculas grandes, también pueden sedimentar con el

Figura 3.11
cromosoma
plásmidos Preparación de un lisado aclarado.
bacteriano

lisozima
+ EDTA
25% sacarosa

Membrana
celular intacta

esferoplasto
Pared celular
rota

Tritón X-100

extracto celular

Centrífugo

lisado
plásmidos
aclarado

Grandes
Restos celulares
fragmentos de ADN
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36 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 3.12
Dos conformaciones de ADN de doble cadena circular: (a)
superenrollado: ambas cadenas están intactas; (b) circular Mella
abierta: una o ambas hebras están melladas.

(a) Superenrollado (b) circular abierta

restos celulares. Por lo tanto, el fraccionamiento por tamaño rara vez es suficiente por sí solo y debemos
considerar formas alternativas de eliminar los contaminantes del ADN bacteriano.

3.2.2 Separación sobre la base de la conformación

Antes de considerar las formas en que se pueden usar las diferencias conformacionales entre los plásmidos
y el ADN bacteriano para separar los dos tipos de ADN, debemos observar más de cerca la estructura
general del ADN plasmídico. No es estrictamente correcto decir que los plásmidos tienen una conformación
circular, porque los círculos de ADN de doble cadena pueden adoptar una de dos configuraciones bastante
distintas. La mayoría de los plásmidos existen en la célula como moléculas superenrolladas (Figura 3.12a).
El superenrollamiento se produce porque la doble hélice del ADN del plásmido se desenrolla parcialmente
durante el proceso de replicación del plásmido mediante enzimas denominadas topoisomerasas (pág. 69).
La conformación superenrollada se puede mantener solo si ambas cadenas de polinucleótidos están
intactas, de ahí el nombre más técnico de ADN circular covalentemente cerrado (ccc). Si una de las
cadenas de polinucleótidos se rompe, la doble hélice vuelve a su estado relajado normal y el plásmido
adopta la conformación alternativa, denominada circular abierta (oc) (figura 3.12b).

El superenrollamiento es importante en la preparación de plásmidos porque las moléculas superenrolladas

se pueden separar con bastante facilidad del ADN no superenrollado. Normalmente se utilizan dos métodos
diferentes. Ambos pueden purificar el ADN del plásmido a partir de extractos celulares crudos, aunque en la
práctica se obtienen mejores resultados si primero se prepara un lisado aclarado.

Desnaturalización alcalina
La base de esta técnica es que existe un estrecho rango de pH en el que el ADN no superenrollado se
desnaturaliza, mientras que los plásmidos superenrollados no lo están. Si se agrega hidróxido de sodio a un
extracto celular o a un lisado aclarado, de modo que el pH se ajuste a 12,0–12,5, entonces se rompe el
enlace de hidrógeno en las moléculas de ADN no superenrolladas, lo que hace que la doble hélice se
desenrolle y las dos cadenas de polinucleótidos se separen. (Figura 3.13). Si ahora se agrega ácido, estas
cadenas de ADN bacteriano desnaturalizado se reagregan en una masa enredada.
La red insoluble se puede sedimentar por centrifugación, dejando el ADN del plásmido en el sobrenadante.
Una ventaja adicional de este procedimiento es que, en algunas circunstancias (específicamente lisis celular
por SDS y neutralización con acetato de sodio), la mayor parte de la proteína y el ARN también se vuelven
insolubles y pueden eliminarse mediante el paso de centrifugación. Por lo tanto, puede no ser necesaria una
purificación adicional mediante extracción orgánica o cromatografía en columna si se utiliza el método de
desnaturalización alcalina.

Centrifugación en gradiente de densidad con bromuro de etidio y cloruro de cesio

Esta es una versión especializada de la técnica más general de centrifugación en equilibrio o en gradiente
de densidad. Se produce un gradiente de densidad al centrifugar una solución de
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Capítulo 3 Purificación de ADN a partir de células vivas 37

pH 12,0 a
12,5 pH 7,0 Centrífugo plásmidos
superenrollados

Pellet de lineal
plásmidos ADN lineal Masa enredada moléculas de ADN
ADN lineal superenrollados monocatenario de ADN lineal

Figura 3.13

Purificación de plásmidos por el método de desnaturalización alcalina.

Figura 3.14
1.55 Proteína
Centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de
cesio. (a) Un gradiente de densidad de CsCl producido
por centrifugación de alta velocidad. (b) Separación de
1.60 proteína, ADN y ARN en un gradiente de densidad.

Creciente Densidad
cm3 )
CsCl
(g/
de

1,65

Concentración de CsCl

1.70 ADN

1.75

ARN
(a) (b)

cloruro de cesio (CsCl) a una velocidad muy alta (Figura 3.14a). Las macromoléculas presentes en la
solución de CsCl cuando se centrifuga forman bandas en distintos puntos del gradiente (Figura 3.14b).
Exactamente donde una molécula en particular se alinea depende de su densidad de flotación: el ADN
tiene una densidad de flotación de alrededor de 1,70 g/cm3 y, por lo tanto, migra al punto en el gradiente
donde la densidad de CsCl también es de 1,70 g/cm3. Por el contrario, las moléculas de proteína tienen
densidades de flotación mucho más bajas y, por lo tanto, flotan en la parte superior del tubo, mientras
que el ARN forma un sedimento en la parte inferior (Figura 3.14b). Por lo tanto, la centrifugación en
gradiente de densidad puede separar el ADN, el ARN y las proteínas y es una alternativa a la extracción
orgánica o la cromatografía en columna para la purificación del ADN.
Más importante aún, la centrifugación en gradiente de densidad en presencia de bromuro de etidio
(EtBr) se puede utilizar para separar el ADN superenrollado de las moléculas no superenrolladas.
El bromuro de etidio se une a las moléculas de ADN mediante la intercalación entre pares de bases
adyacentes, provocando el desenrollado parcial de la doble hélice (Figura 3.15). Este desenrollamiento
da como resultado una disminución de la densidad de flotación, de hasta 0,125 g/cm3 para el ADN lineal.
Sin embargo, el ADN superenrollado, sin extremos libres, tiene muy poca libertad para desenrollarse y
solo puede unirse a una cantidad limitada de EtBr. Por lo tanto, la disminución de la densidad de flotación
de una molécula superenrollada es mucho menor, solo alrededor de 0,085 g/cm3. Como consecuencia,
las moléculas superenrolladas forman una banda en un gradiente de EtBr-CsCl en una posición diferente
al ADN lineal y circular abierto (Figura 3.16a).
La centrifugación en gradiente de densidad con bromuro de etidio y cloruro de cesio es un método
muy eficaz para obtener ADN plasmídico puro. Cuando un lisado aclarado se somete a este
procedimiento, los plásmidos se agrupan en un punto distinto, separados del ADN bacteriano lineal,
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38 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 3.15
NH2
Desenrollamiento parcial de la doble hélice del ADN por
intercalación de EtBr entre pares de bases adyacentes. La
molécula de ADN normal que se muestra a la izquierda se
desenrolla parcialmente al tomar cuatro moléculas de EtBr, Estructura química del
hermano-

lo que da como resultado la estructura "estirada" de la derecha. n+ bromuro de etidio

H2 norte C2 H5

3.4Å

Esqueleto de
fosfato de azúcar intercalado
molécula de etbr
EtBr

3.4Å

>3,4 Å
Base
par

Doble hélice de
ADN normal

Proteína

EtBr en
ADN lineal y Agitar con n-
fase
oc butanol, dejar que orgánica Buffer
las capas se separen

superenrollado
ADN
Eliminar
superenrollado ADN en Solución de
ADN con Fase ADN en
una jeringa acuosa tubos de diálisis

ARN CsCl se difunde en el tampón

(a) Un gradiente de (b) Eliminación de la (c) Extracción de la (d) Eliminación del

banda de ADN EtBr con n-butanol CsCl por diálisis
densidad EtBr-CsCl

Figura 3.16

Purificación de ADN plasmídico mediante centrifugación en gradiente de densidad EtBr-CsCl.

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Capítulo 3 Purificación de ADN a partir de células vivas 39

Incubar en
presencia de
cloranfenicol

Plásmidos multicopia Bacteriano Plásmidos presentes en

(número de copia 20+) ADN un número de copias de 1000+

Figura 3.17
Amplificación del plásmido.

con la proteína flotando en la parte superior del gradiente y el ARN sedimentado en la parte inferior. La
posición de las bandas de ADN se puede ver iluminando el tubo con radiación ultravioleta, lo que hace
que el EtBr unido emita fluorescencia. El ADN plasmídico puro se extrae perforando el costado del tubo y
extrayendo una muestra con una jeringa (Figura 3.16b). El EtBr unido al ADN del plásmido se extrae con
n-butanol (Figura 3.16c) y el CsCl se elimina mediante diálisis (Figura 3.16d). La preparación de plásmido
resultante es prácticamente 100 % pura y está lista para usarse como vector de clonación.

3.2.3 Amplificación de plásmidos

La preparación del ADN plasmídico puede verse obstaculizada por el hecho de que los plásmidos
constituyen sólo una pequeña proporción del ADN total de la célula bacteriana. Por lo tanto, el rendimiento
de ADN de un cultivo bacteriano puede ser decepcionantemente bajo. La amplificación de plásmidos
ofrece un medio para aumentar este rendimiento.
El objetivo de la amplificación es aumentar el número de copias de un plásmido. Algunos plásmidos
de copias múltiples (aquellos con un número de copias de 20 o más) tienen la propiedad útil de poder
replicarse en ausencia de síntesis de proteínas. Esto contrasta con el cromosoma bacteriano principal,
que no puede replicarse en estas condiciones. Esta propiedad se puede utilizar durante el crecimiento de
un cultivo bacteriano para la purificación del ADN plasmídico.
Una vez alcanzada una densidad celular satisfactoria, se añade un inhibidor de la síntesis de proteínas (p.
ej., cloranfenicol) y el cultivo se incuba durante 12 horas más.
Durante este tiempo, las moléculas del plásmido continúan replicándose, aunque la replicación
cromosómica y la división celular estén bloqueadas (Figura 3.17). El resultado es que pueden alcanzarse
números de copias de plásmidos de varios miles. Por lo tanto, la amplificación es una forma muy eficaz de
aumentar el rendimiento de plásmidos multicopia.

3.3 Preparación de ADN de bacteriófagos

La diferencia clave entre la purificación del ADN del fago y la preparación del ADN celular total o del ADN
plasmídico es que, para los fagos, el material de partida normalmente no es un extracto celular. Esto se
debe a que se pueden obtener grandes cantidades de partículas de bacteriófagos del medio extracelular
de un cultivo bacteriano infectado. Cuando se centrifuga un cultivo de este tipo, las bacterias se
sedimentan, dejando las partículas de fago en suspensión (Figura 3.18). A continuación, las partículas de
fago se recogen de la suspensión y su ADN se extrae mediante un solo paso de desproteinización para
eliminar la cápside del fago.
Este proceso general es más sencillo que el procedimiento utilizado para preparar el ADN total de
células o plásmidos. Sin embargo, la purificación exitosa de cantidades significativas de
Machine Translated by Google
40 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 3.18
Suspensión de fagos
Preparación de una suspensión de fagos a
partir de un cultivo de bacterias infectadas.
Centrífugo

cultura infectada
(bacteria +
fago extracelular) Pellet de
bacterias

El ADN del fago está sujeto a varias trampas. La principal dificultad, especialmente con e, es hacer
crecer un cultivo infectado de tal manera que el título de fago extracelular (el número de partículas de
fago por ml de cultivo) sea lo suficientemente alto. En términos prácticos, el título máximo que
razonablemente se puede esperar para e es 1010 por ml; sin embargo , las partículas de 1010 e
producirán solo 500 ng de ADN. Por lo tanto, se necesitan grandes volúmenes de cultivo, en el rango
de 500 a 1000 ml, si se van a obtener cantidades sustanciales de eDNA.

3.3.1 Crecimiento de cultivos para obtener un alto * título

Hacer crecer un cultivo de gran volumen no es un problema (los cultivos bacterianos de 100 litros y
más son comunes en biotecnología), pero obtener el título máximo de fagos requiere cierta habilidad.
El fago natural es lisogénico (pág. 19), y un cultivo infectado consiste principalmente en células que
llevan el profago integrado en el ADN bacteriano (ver Figura 2.7). El título de e extracelular es
extremadamente bajo en estas circunstancias.
Para obtener un alto rendimiento de e extracelular, el cultivo debe ser inducido, de modo que
todas las bacterias entren en la fase lítica del ciclo de infección, lo que resulta en la muerte celular y
la liberación de partículas de e al medio. La inducción es normalmente muy difícil de controlar, pero la
mayoría de las cepas de laboratorio de e portan una mutación sensible a la temperatura (ts) en el
gen cI. Este es uno de los genes que son responsables de mantener el fago en el estado integrado.
Si se inactiva por una mutación, el gen cI ya no funciona correctamente y se produce el cambio a lisis.
En la mutación cIts , el gen cI es funcional a 30 °C, temperatura a la que puede producirse una
lisogenia normal. Pero a 42 °C, el producto del gen cIts no funciona correctamente y no se puede
mantener la lisogenia. Por lo tanto, se puede inducir un cultivo de E. coli infectado con fagos portadores
de la mutación cIts para que produzca fagos extracelulares transfiriéndolos de 30°C a 42°C (Figura
3.19).

3.3.2 Preparación de fagos no lisogénicos *

Aunque la mayoría de las cepas e son lisogénicas, muchos vectores de clonación derivados de e se
modifican mediante deleciones del cI y otros genes, de modo que la lisogenia nunca se produce.
Estos fagos no pueden integrarse en el genoma bacteriano y solo pueden infectar células mediante
un ciclo lítico (pág. 18).
Con estos fagos, la clave para obtener un título alto radica en la forma en que se desarrolla el
cultivo, en particular, la etapa en la que se infectan las células mediante la adición de partículas de
fago. Si se añaden fagos antes de que las células se dividan a su velocidad máxima, todas las células
se lisan muy rápidamente, lo que da como resultado un título bajo (Figura 3.20a). Por otro lado, si la
densidad celular es demasiado alta cuando se agregan los fagos, el cultivo nunca se lisará por
completo y nuevamente el título de fagos será bajo (Figura 3.20b). La situación ideal es cuando la
edad del cultivo y el tamaño del inóculo del fago están equilibrados de manera que el cultivo continúa
creciendo, pero finalmente todas las células se infectan.
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Capítulo 3 Purificación de ADN a partir de células vivas 41

profago ÿ

30°C
Sin inducción

42°C
Inducción

Genoma ÿ extirpado

Lisis celular

Nuevas partículas ÿ

Figura 3.19
Inducción de un lisógeno ÿ cIts transfiriendo de 30°C a 42°C.

ÿ inóculo Figura 3.20 Lograr

el equilibrio adecuado entre la edad del cultivo y
el tamaño del inóculo al preparar una muestra de
Agregar fago un fago no lisogénico.

bacterias Todas las células se lisan

rápidamente = título de fago bajo
(a) La densidad de cultivo es demasiado baja

El cultivo nunca se lisa completamente

= título de fago bajo
(b) La densidad de cultivo es demasiado alta

El cultivo continúa creciendo pero

finalmente se lisa = título de fago alto

(c) La densidad de cultivo es la correcta

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42 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 3.21
Recolección de partículas de Añadir PEG
fago por precipitación con polietilenglicol (PEG). + NaCl Centrífugo

Partículas de Pellet de partículas de fago y Resuspender

Suspensión de fagos fago precipitadas restos de células pellet

y lisado (Figura 3.20c). Como se puede imaginar, se necesita habilidad y experiencia para juzgar
el asunto a la perfección.

3.3.3 Recolección de fagos de un cultivo infectado

Los restos de células bacterianas lisadas, junto con cualquier célula intacta que quede
inadvertidamente, se pueden eliminar de un cultivo infectado mediante centrifugación, dejando las
partículas de fago en suspensión (ver Figura 3.18). El problema ahora es reducir el tamaño de la
suspensión a 5 ml o menos, un tamaño manejable para la extracción de ADN.
Las partículas de fago son tan pequeñas que solo se sedimentan mediante centrifugación a
muy alta velocidad. Por lo tanto, la recolección de fagos se logra generalmente mediante
precipitación con polietilenglicol (PEG). Se trata de un compuesto polimérico de cadena larga
que, en presencia de sal, absorbe agua, provocando así la precipitación de conjuntos
macromoleculares, como partículas de fagos. Luego, el precipitado se puede recolectar por
centrifugación y volver a disolverse en un volumen pequeño adecuado (Figura 3.21).

3.3.4 Purificación de ADN a partir de partículas de fago * La

desproteinización del precipitado de PEG redisuelto a veces es suficiente para extraer ADN de
fago puro, pero normalmente los fagos se someten a un paso de purificación intermedio. Esto
es necesario porque el precipitado de PEG también contiene una cierta cantidad de residuos
bacterianos, que posiblemente incluyan ADN celular no deseado. Estos contaminantes se
pueden separar de las partículas e mediante centrifugación en gradiente de densidad de CsCl.
Las partículas e forman una banda en un gradiente de CsCl de 1,45 a 1,50 g/cm3 (Figura 3.22), y pueden retirarse

Figura 3.22
1.35
Purificación de partículas de fago ÿ por
centrifugación en gradiente de densidad de CsCl.
1.40

1.45

Densidad
cm3)
CsCl
(g/
de

Partículas de fago ÿ
1.50

1.55

1.60
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Capítulo 3 Purificación de ADN a partir de células vivas 43

el gradiente como se describió previamente para las bandas de ADN (ver Figura 3.16). La eliminación
de CsCl por diálisis deja una preparación de fago pura a partir de la cual se puede extraer el ADN
mediante tratamiento con fenol o proteasa para digerir la cubierta proteica del fago.

3.3.5 La purificación del ADN de M13 causa pocos problemas

La mayoría de las diferencias entre los ciclos de infección de M13 y e benefician al biólogo molecular
que desea preparar el ADN de M13. En primer lugar, la forma replicativa de doble cadena de M13
(pág. 23), que se comporta como un plásmido de alto número de copias, se purifica muy fácilmente
mediante los procedimientos estándar para la preparación de plásmidos. Se prepara un extracto
celular a partir de células infectadas con M13 y la forma replicativa se separa del ADN bacteriano,
por ejemplo, mediante centrifugación en gradiente de densidad EtBr-CsCl.
Sin embargo, con frecuencia se requiere la forma monocatenaria del genoma M13, contenido en
las partículas extracelulares del fago. A este respecto, la gran ventaja en comparación con e es que
los títulos altos de M13 son muy fáciles de obtener. Como las células infectadas secretan
continuamente partículas M13 en el medio (consulte la Figura 2.8), sin que ocurra nunca la lisis, se
logra un título alto de M13 simplemente haciendo crecer el cultivo infectado hasta una densidad celular alta.
De hecho, los títulos de 1012 por ml y superiores son bastante fáciles de obtener sin utilizar ningún
truco especial. Títulos tan altos significan que se pueden preparar cantidades significativas de ADN
de M13 monocatenario a partir de cultivos de pequeño volumen, 5 ml o menos. Además, como las
células infectadas no se lisan, no hay problema de que los residuos celulares contaminen la
suspensión de fagos. En consecuencia, el paso de centrifugación en gradiente de densidad de CsCl,
necesario para la preparación de fagos, rara vez se requiere con M13.
En resumen, la preparación de ADN M13 monocatenario implica el crecimiento de un pequeño
volumen de cultivo infectado, la centrifugación para sedimentar las bacterias, la precipitación de las
partículas del fago con PEG, la extracción con fenol para eliminar las cubiertas proteicas del fago y la
precipitación con etanol para concentrar el ADN resultante. (Figura 3.23).

Suspensión de
fago M13

ADN M13

Proteína

Fenol
Células precipitado ADN M13
granuladas fago M13

(a) Cultivo de (b) Centrifugar (c) Añadir PEG a la (d) Resuspender el (e) Añadir fenol (f) Eliminar la g) Resuspender
células infectadas para eliminar las células. suspensión de fagos, fago en tampón para eliminar capa acuosa, ADN M13 en un
centrifugar cápside de proteína agregar etanol, pequeño volumen
centrifugar

Figura 3.23
Preparación de ADN M13 monocatenario a partir de un cultivo de bacterias infectadas.
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44 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Birnboim, HC y Doly, J. (1979) Un procedimiento de extracción alcalina rápida para la detección de ADN
de plásmido recombinante. Investigación de ácidos nucleicos, 7, 1513–1523. [Un método para preparar
ADN plasmídico.]
Boom, R., Sol, CJA, Salimans, MMM, Jansen, CL, Wertheim van Dillen, PME y van der Noordaa, J. (1990)
Método rápido y sencillo para la purificación de ácidos nucleicos.
Revista de Microbiología Clínica, 28, 495–503. [El método de tiocianato de guanidinio y sílice para la
purificación de ADN.]
Clewell, DB (1972) Naturaleza de la replicación del plásmido ColE1 en Escherichia coli en presencia de
cloranfenicol. Revista de Bacteriología, 110, 667–676. [La base biológica de la amplificación de
plásmidos.]
Marmur, J. (1961) Un procedimiento para el aislamiento de ácido desoxirribonucleico de microorganismos.
Revista de Biología Molecular, 3, 208–218. [Preparación de ADN genómico.]
Radloff, R., Bauer, W. & Vinograd, J. (1967) Un método de densidad flotante de colorante para la detección
y aislamiento de ADN dúplex circular cerrado. Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los EE.
UU., 57, 1514–1521. [La descripción original de la centrifugación en gradiente de densidad con bromuro
de etidio.]
Rogers, SO & Bendich, AJ (1985) Extracción de ADN de cantidades de miligramos de tejidos vegetales
frescos, de herbario y momificados. Biología Molecular de Plantas, 5, 69–76. [El método CTAB.]

Yamamoto, KR, Alberts, BM, Benzinger, R., Lawhorne, L. & Trieber, G. (1970) Sedimentación rápida de
bacteriófagos en presencia de polietilenglicol y su aplicación a la preparación de virus a gran escala.
Virología, 40, 734–744. [Preparación de l ADN.]
Zinder, ND & Boeke, JD (1982) El fago filamentoso (Ff) como vectores para ADN recombinante. Gen, 19,
1–10. [Métodos para el crecimiento de fagos y preparación de ADN.]
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Capítulo 4

Manipulación de
ADN purificado

Contenido del capítulo

CONTENIDO DEL CAPÍTULO

4.1 Gama de enzimas manipuladoras del ADN 4.2

Enzimas para cortar el ADN: endonucleasas de restricción 4.3
Ligación: unión de moléculas de ADN

Una vez que se han preparado muestras puras de ADN, el siguiente paso en un experimento de
clonación de genes es la construcción de la molécula de ADN recombinante (ver Figura 1.1). Para
producir esta molécula recombinante, el vector, así como el ADN a clonar, deben cortarse en
puntos específicos y luego unirse de manera controlada. Cortar y unir son dos ejemplos de técnicas
de manipulación de ADN, de las cuales se ha desarrollado una amplia variedad en los últimos
años. Además de cortarse y unirse, las moléculas de ADN pueden acortarse, alargarse, copiarse
en ARN o en nuevas moléculas de ADN y modificarse mediante la adición o eliminación de grupos
químicos específicos. Estas manipulaciones, todas las cuales pueden llevarse a cabo en el tubo de
ensayo, proporcionan la base no solo para la clonación de genes, sino también para estudios de
bioquímica del ADN, estructura de genes y control de la expresión de genes.

Casi todas las técnicas de manipulación del ADN utilizan enzimas purificadas. Dentro de la
célula, estas enzimas participan en procesos esenciales como la replicación y transcripción del
ADN, la descomposición del ADN no deseado o extraño (p. ej., el ADN del virus invasor), la
reparación del ADN mutado y la recombinación entre diferentes moléculas de ADN. Después de
la purificación a partir de extractos celulares, se puede persuadir a muchas de estas enzimas para
que lleven a cabo sus reacciones naturales, o algo estrechamente relacionado con ellas, en condiciones artificiales.
Aunque estas reacciones enzimáticas suelen ser sencillas, la mayoría son absolutamente imposibles
de realizar mediante métodos químicos estándar. Por lo tanto, las enzimas purificadas son cruciales
para la ingeniería genética y ha surgido una importante industria en torno a su preparación,
caracterización y comercialización. Los proveedores comerciales de enzimas de alta pureza brindan
un servicio esencial al biólogo molecular.

Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010 45
por Blackwell Publishing.
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46 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Las manipulaciones de corte y unión que subyacen a la clonación de genes se llevan a cabo mediante
enzimas llamadas endonucleasas de restricción (para cortar) y ligasas (para unir). La mayor parte de
este capítulo se ocupará de las formas en que se utilizan estos dos tipos de enzimas. Primero, sin
embargo, debemos considerar toda la gama de enzimas manipuladoras del ADN, para ver exactamente
qué tipos de reacciones se pueden realizar. Muchas de estas enzimas se mencionarán en capítulos
posteriores cuando se describan los procedimientos que las utilizan.

4.1 La gama de enzimas manipuladoras de ADN

Las enzimas que manipulan el ADN se pueden agrupar en cuatro grandes clases, según el tipo de reacción
que catalizan:

l Las nucleasas son enzimas que cortan, acortan o degradan las moléculas de ácido nucleico. l
Las ligasas unen las moléculas de ácido nucleico. l Las polimerasas hacen copias de
moléculas. l Las enzimas modificadoras eliminan o agregan grupos químicos.

Antes de considerar en detalle cada una de estas clases de enzimas, deben señalarse dos puntos. La
primera es que, aunque la mayoría de las enzimas se pueden asignar a una clase en particular, algunas
muestran múltiples actividades que abarcan dos o más clases. Lo que es más importante, muchas
polimerasas combinan su capacidad para producir nuevas moléculas de ADN con una actividad degradante
de ADN asociada (es decir, nucleasa).
En segundo lugar, debe apreciarse que, además de las enzimas manipuladoras del ADN, se conocen
muchas enzimas similares capaces de actuar sobre el ARN. La ribonucleasa utilizada para eliminar el
ARN contaminante de las preparaciones de ADN (pág. 30) es un ejemplo de tal enzima.
Aunque algunas enzimas que manipulan el ARN tienen aplicaciones en la clonación de genes y se
mencionarán en capítulos posteriores, en general restringiremos nuestros pensamientos a aquellas
enzimas que actúan sobre el ADN.

4.1.1 Nucleasas
Las nucleasas degradan las moléculas de ADN al romper los enlaces fosfodiéster que unen un nucleótido
con el siguiente en una hebra de ADN. Hay dos tipos diferentes de nucleasa (Figura 4.1):

l Las exonucleasas eliminan los nucleótidos de uno en uno desde el extremo de una molécula de ADN.

l Las endonucleasas pueden romper los enlaces fosfodiéster internos dentro de una molécula de ADN.
La distinción principal entre las diferentes exonucleasas radica en el número de hebras que se
degradan cuando se ataca una molécula de doble hebra. La enzima llamada Bal31 (purificada de la
bacteria Alteromonas espejiana) es un ejemplo de exonucleasa que elimina nucleótidos de ambas cadenas
de una molécula de doble cadena (Figura 4.2a). Cuanto mayor sea el tiempo que se permite que Bal31
actúe sobre un grupo de moléculas de ADN, más cortos serán los fragmentos de ADN resultantes. Por el
contrario, enzimas como la exonucleasa III de E. coli degradan solo una hebra de una molécula de doble
hebra, dejando como producto el ADN de una sola hebra (Figura 4.2b).

El mismo criterio se puede utilizar para clasificar las endonucleasas. La endonucleasa S1 (del hongo
Aspergillus oryzae) solo escinde cadenas simples (Figura 4.3a), mientras que la desoxirribonucleasa I
(DNasa I), que se prepara a partir de páncreas de vaca, corta moléculas de cadena simple y doble (Figura
4.3b). La ADNasa I no es específica porque ataca el ADN en cualquier enlace fosfodiéster interno, por lo
que el resultado final de la ADNasa I prolongada
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Capítulo 4 Manipulación del ADN purificado 47

(a) Una exonucleasa Figura 4.1 Las

Escote
reacciones catalizadas por los
dos tipos diferentes de nucleasa.
Enlace de hidrógeno (a) Una exonucleasa, que elimina
nucleótido nucleótidos del extremo de una
Escote Enlace fosfodiéster molécula de ADN. (b) Una endonucleasa,
que rompe los enlaces fosfodiéster internos.

(b) Una endonucleasa

Escote

(a) Bal31 (b) Exonucleasa III

5' 3'

3' 5'

Figura 4.2 Las

reacciones catalizadas por diferentes tipos de exonucleasas. (a) Bal31, que elimina nucleótidos de ambas cadenas
de una molécula de doble cadena. (b) Exonucleasa III, que elimina nucleótidos solo del extremo 3ÿ .

La acción es una mezcla de mononucleótidos y oligonucleótidos muy cortos. Por otro lado, el grupo
especial de enzimas llamadas endonucleasas de restricción escinden el ADN de doble cadena solo
en un número limitado de sitios de reconocimiento específicos (Figura 4.3c). Estas importantes
enzimas se describen en detalle en la pág. 50

4.1.2 Ligasas
En la célula, la función de la ADN ligasa es reparar roturas de cadena sencilla ("discontinuidades")
que surgen en moléculas de ADN de doble cadena durante, por ejemplo, la replicación del ADN.
Las ADN ligasas de la mayoría de los organismos también pueden unir dos fragmentos individuales de
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48 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 4.3 Las (a) nucleasa S1 un nick

reacciones catalizadas por diferentes tipos de (i) (ii)

endonucleasas. (a) La nucleasa S1, que
escinde solo el ADN monocatenario, incluidas
las muescas monocatenarias en moléculas
principalmente de doble cadena. (b) ADNasa I,
que escinde tanto el ADN monocatenario como
el bicatenario. (c) Una endonucleasa de
restricción, que escinde el ADN de doble (b) ADNasa I

cadena, pero solo en un número limitado de (ii)

(i)
sitios.

(c) Una endonucleasa de restricción

Figura 4.4 Las (a) Reparación de discontinuidad (b) Unión de dos moléculas

dos reacciones catalizadas por la ADN ligasa. Discontinuidad

(a) Reparación de una discontinuidad: falta un

enlace fosfodiéster en una hebra de una molécula
de doble hebra. (b) Unión de dos moléculas. ADN ligasa ADN ligasa

ADN de doble cadena (Figura 4.4). El papel de estas enzimas en la construcción de moléculas
de ADN recombinante se describe en la pág. 63.

4.1.3 Polimerasas
Las ADN polimerasas son enzimas que sintetizan una nueva hebra de ADN complementaria a
una plantilla de ADN o ARN existente (Figura 4.5a). La mayoría de las polimerasas pueden
funcionar solo si la plantilla posee una región de doble cadena que actúa como cebador para el
inicio de la polimerización.
Cuatro tipos de ADN polimerasa se utilizan de forma rutinaria en la ingeniería genética. La
primera es la ADN polimerasa I, que generalmente se prepara a partir de E. coli. Esta enzima se
une a una región monocatenaria corta (o muesca) en una molécula de ADN principalmente de
doble cadena y luego sintetiza una cadena completamente nueva, degradando la cadena
existente a medida que avanza (Figura 4.5b). Por lo tanto, la ADN polimerasa I es un ejemplo de
enzima con actividad dual: polimerización del ADN y degradación del ADN.
Las actividades polimerasa y nucleasa de la ADN polimerasa I están controladas por
diferentes partes de la molécula enzimática. La actividad de nucleasa está contenida en los
primeros 323 aminoácidos del polipéptido, por lo que la eliminación de este segmento deja una
enzima modificada que retiene la función de polimerasa pero es incapaz de degradar el ADN. Esta modificado
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Capítulo 4 Manipulación del ADN purificado 49

(a) La reacción básica Hebra recién

sintetizada
Primer
5' 3' 5' 3'
–A–T–G– –A–T–G–C–A–T–T–G–C–A–T–
· · · · · · · ··· · · ··

–T–A–C–G–T–A–A–C–G–T–A– –T–A–C–G–T–A–A–C–G–T–A–
3' 5' 3' 5'
Modelo

(b) ADN polimerasa I

Los nucleótidos existentes
un nick se reemplazan

–A–T–G– G–C–A–T– –A–T–G–C–A–T–T–G–C–A–T–

··· · ·· · ··· · ···· · ··

–T–A–C–G–T–A–A–C–G–T–A– –T–A–C–G–T–A–A–C–G–T–A–

(c) El fragmento de Klenow Solo se Los nucleótidos existentes

rellena el nick no se reemplazan.

–A–T–G– G–C–A–T– –A–T–G–C–A–T–T G–C–A–T–

· ·· ··· · · ·· · ··· · ·· ·

–T–A–C–G–T–A–A–C–G–T–A– –T–A–C–G–T–A–A–C–G–T–A–

(d) transcriptasa inversa Nueva hebra de ADN

–A–T–G– –A–T–G–C–A–T–T–G–C–A–T–
··· · · · ···· · ···
–u–a–c–g–u–a–a–c–g–u–a– –u–a–c–g–u–a–a–c–g–u–a–
plantilla de ARN

Figura 4.5 Las

reacciones catalizadas por ADN polimerasas. (a) La reacción básica: se sintetiza una nueva hebra de ADN en la
dirección 5' a 3' . (b) ADN polimerasa I, que inicialmente rellena las muescas pero luego continúa sintetizando una nueva
hebra, degradando la existente a medida que avanza. (c) El fragmento de Klenow, que solo rellena muescas. (d) Transcriptasa
inversa, que utiliza una plantilla de ARN.

La enzima, llamada fragmento de Klenow, todavía puede sintetizar una hebra de ADN
complementaria en una plantilla monocatenaria, pero como no tiene actividad de nucleasa, no puede
continuar la síntesis una vez que se rellena la muesca (Figura 4.5c). Varias otras enzimas (polimerasas
naturales y versiones modificadas) tienen propiedades similares al fragmento de Klenow. La principal
aplicación de estas polimerasas es la secuenciación del ADN (pág. 166).
La ADN polimerasa Taq utilizada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (consulte la
Figura 1.2) es la enzima ADN polimerasa I de la bacteria Thermus aquaticus. Este organismo vive en
aguas termales y muchas de sus enzimas, incluida la ADN polimerasa Taq , son termoestables, lo
que significa que son resistentes a la desnaturalización por tratamiento térmico. Esta es la
característica especial de la ADN polimerasa Taq que la hace adecuada para la PCR, porque si no
fuera termoestable se inactivaría cuando la temperatura de la reacción se eleva a 94°C para
desnaturalizar el ADN.
El último tipo de ADN polimerasa que es importante en la ingeniería genética es la transcriptasa
inversa, una enzima involucrada en la replicación de varios tipos de virus. La transcriptasa inversa
es única en el sentido de que utiliza como molde no el ADN sino el ARN (Figura 4.5d). La capacidad
de esta enzima para sintetizar una hebra de ADN complementaria a una plantilla de ARN es
fundamental para la técnica llamada clonación de ADN complementario (ADNc) (pág. 133).

4.1.4 Enzimas modificadoras del ADN

Existen numerosas enzimas que modifican las moléculas de ADN mediante la adición o eliminación
de grupos químicos específicos. Los más importantes son los siguientes:
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50 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) Fosfatasa alcalina

2–O3 P
OH A OH

A 2–
PO3 A OH

(b) Polinucleótido quinasa

A OH 2–O3 P
OH

A OH A PO3
2–

(c) Desoxinucleotidil transferasa terminal

(yo) 5' 3' 5' 3'

(ii)
3' 5'

3' 5'

Figura 4.6 Las

reacciones catalizadas por enzimas modificadoras del ADN. (a) Fosfatasa alcalina, que elimina los grupos 5'-
fosfato. (b) Polinucleótido cinasa, que une grupos 5'-fosfato. (c) Desoxinucleotidil transferasa terminal, que une
desoxirribonucleótidos a los extremos 3' de los polinucleótidos en (i) moléculas de cadena sencilla o (ii) de cadena doble.

l Fosfatasa alcalina (de E. coli, tejido intestinal de ternera o camarón ártico), que elimina
el grupo fosfato presente en el extremo 5ÿ de una molécula de ADN (Figura 4.6a).

l Polinucleótido quinasa (de E. coli infectada con el fago T4), que tiene el efecto inverso
a la fosfatasa alcalina, agregando grupos fosfato en los terminales 5' libres (Figura
4.6b).
l Desoxinucleotidil transferasa terminal (del tejido del timo de ternera), que agrega uno
o más desoxirribonucleótidos en el extremo 3ÿ de una molécula de ADN (Figura 4.6c).

4.2 Enzimas para cortar ADN:

endonucleasas de restricción
La clonación de genes requiere que las moléculas de ADN se corten de manera muy
precisa y reproducible. Esto se ilustra por la forma en que se corta el vector durante la
construcción de una molécula de ADN recombinante (Figura 4.7a). Cada molécula del
vector se debe escindir en una sola posición, para abrir el círculo y poder insertar el nuevo
ADN: una molécula que se corta más de una vez se romperá en dos o más fragmentos
separados y no servirá como clonación. vector. Además, cada molécula del vector debe
cortarse exactamente en la misma posición del círculo; como se verá en capítulos
posteriores, la división aleatoria no es satisfactoria. Debe quedar claro que se necesita un
tipo muy especial de nucleasa para llevar a cabo esta manipulación.
A menudo, también es necesario escindir el ADN que se va a clonar (Figura 4.7b). Hay
dos razones para esto. Primero, si el objetivo es clonar un solo gen, que puede consistir en
solo 2 o 3 kb de ADN, entonces ese gen tendrá que ser cortado de las moléculas de ADN
grandes (a menudo más de 80 kb) producidas por el uso hábil de las tecnicas preparatorias
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Capítulo 4 Manipulación del ADN purificado 51

(a) Moléculas vectoriales Figura 4.7 La

Cortar sitios necesidad de manipulaciones de corte muy precisas en un

experimento de clonación de genes.

Cada molécula de vector debe cortarse una

vez, cada una en la misma posición

(b) La molécula de ADN que contiene el gen a ser clonado.

Gene Gene

Cortar sitios

Gran molécula de ADN Fragmentos lo suficientemente

pequeños para ser clonados

descrito en el Capítulo 3. En segundo lugar, las moléculas grandes de ADN pueden tener que descomponerse
simplemente para producir fragmentos lo suficientemente pequeños como para ser transportados por el vector. La
mayoría de los vectores de clonación exhiben una preferencia por los fragmentos de ADN que caen en un rango de
tamaño particular: la mayoría de los vectores basados en plásmidos, por ejemplo, son muy ineficaces para clonar
moléculas de ADN de más de 8 kb de longitud.
Las endonucleasas de restricción purificadas permiten al biólogo molecular cortar moléculas de ADN de la
manera precisa y reproducible requerida para la clonación de genes. El descubrimiento de estas enzimas, que
condujo a los Premios Nobel para W. Arber, H. Smith y D. Nathans en 1978, fue uno de los avances clave en el
desarrollo de la ingeniería genética.

4.2.1 El descubrimiento y la función de las endonucleasas de restricción La observación inicial que condujo

al eventual descubrimiento de las endonucleasas de restricción se realizó a principios de la década de 1950, cuando
se demostró que algunas cepas de bacterias son inmunes a la infección por bacteriófagos, un fenómeno conocido
como infección del huésped . -Restricción controlada.
El mecanismo de restricción no es muy complicado, aunque llevó más de 20 años entenderlo por completo. La
restricción ocurre porque la bacteria produce una enzima que degrada el ADN del fago antes de que tenga tiempo de
replicarse y dirigir la síntesis de nuevas partículas de fago (Figura 4.8a). El propio ADN de la bacteria, cuya
destrucción, por supuesto, sería letal, está protegido del ataque porque lleva grupos metilo adicionales que bloquean
la acción degradante de la enzima (Figura 4.8b).

Estas enzimas degradantes se denominan endonucleasas de restricción y son sintetizadas por muchas especies
de bacterias, quizás por todas: se han aislado más de 2500 diferentes y más de 300 están disponibles para su uso
en el laboratorio. Se reconocen tres clases diferentes de endonucleasas de restricción, cada una de las cuales se
distingue por un modo de acción ligeramente diferente. Los tipos I y III son bastante complejos y solo tienen un papel
limitado en la genética.
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52 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) Restricción del ADN del fago

Fago inyecta ADN en una

bacteria

Las El ADN del fago

endonucleasas de restricción se escinde y se

se unen al ADN del fago. inactiva.

(b) El ADN bacteriano no se escinde

ADN bacteriano

A mí

A mí

Las endonucleasas de restricción no

pueden unirse a la secuencia de reconocimiento. A mí

A mí

Las secuencias de reconocimiento

están metiladas.

Figura 4.8 La

función de una endonucleasa de restricción en una célula bacteriana: (a) el ADN del fago se escinde, pero (b) el ADN bacteriano no.

Ingenieria. Las endonucleasas de restricción de tipo II, por otro lado, son las enzimas de corte que
son tan importantes en la clonación de genes.

4.2.2 Las endonucleasas de restricción de tipo II cortan el ADN en secuencias de

nucleótidos específicas La característica central de las endonucleasas de restricción de
tipo II (a las que nos referiremos simplemente como "endonucleasas de restricción" de ahora en
adelante) es que cada enzima tiene una secuencia de reconocimiento específica en la que corta
una molécula de ADN. Una enzima particular escinde el ADN en la secuencia de reconocimiento y
en ningún otro lugar. Por ejemplo, la endonucleasa de restricción llamada PvuI (aislada de Proteus
vulgaris) corta el ADN solo en el hexanucleótido CGATCG.
En contraste, una segunda enzima de la misma bacteria, llamada PvuII, corta en un hexanucleótido
diferente, en este caso CAGCTG.
Muchas endonucleasas de restricción reconocen sitios diana de hexanucleótidos, pero otras
cortan secuencias de nucleótidos de cuatro, cinco, ocho o incluso más largas. Sau3A (de
Staphylococcus aureus cepa 3A) reconoce GATC y AluI (Arthrobacter luteus) corta en AGCT.
También hay ejemplos de endonucleasas de restricción con secuencias de reconocimiento
degeneradas, lo que significa que cortan el ADN en cualquiera de una familia de sitios relacionados.
HinfI (Haemophilus influenzae cepa Rf ), por ejemplo, reconoce GANTC, por lo que corta en
GAATC, GATTC, GAGTC y GACTC. Las secuencias de reconocimiento de algunas de las
endonucleasas de restricción utilizadas con mayor frecuencia se enumeran en la Tabla 4.1.
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Capítulo 4 Manipulación del ADN purificado 53

Tabla 4.1
Las secuencias de reconocimiento de algunas de las endonucleasas de restricción más utilizadas.

RECONOCIMIENTO ROMBO O
ENZIMA ORGANISMO SECUENCIA* EXTREMO PEGAJOSO

EcoRI Escherichia coli GAATTC Pegajoso

BamHI Bacilo amyloliquefaciens GGATCC Pegajoso

BglII Bacilo globigii AGACTO Pegajoso

PvuI Proteo vulgar CGATCG Pegajoso
Pvu II Proteo vulgar CAGCTG Descortés

HindIII Haemophilus influenzae Rd AGCTT Pegajoso

Hinf Haemophilus influenzae RF GANTC Pegajoso
Sau3A estafilococo aureus AGTC Pegajoso
aluminio Arthrobacter lúteo AGCT Descortés

Todo Termo acuático TCGA Pegajoso

Bandera III Haemophilus aegyptius GGCC Descortés

yo no Nocardia otitis-caviarum GCGGCCGC Pegajoso

tímido Streptomyces fimbriatus GGCCNNNNNGGGCC Pegajoso

*La secuencia que se muestra es la de una hebra, dada en la dirección 5 'a 3'. “N” indica cualquier nucleótido. Tenga en cuenta que casi todas las secuencias de

reconocimiento son palíndromos: cuando se consideran ambas cadenas, se leen igual en cada dirección, por ejemplo:

5ÿ–GAATTC–3ÿ
EcoRI ||||||
3ÿ–CTTAAG–5ÿ

4.2.3 Extremos romos y extremos pegajosos La

naturaleza exacta del corte producido por una endonucleasa de restricción tiene una importancia
considerable en el diseño de un experimento de clonación de genes. Muchas endonucleasas de restricción
hacen un simple corte de doble cadena en el medio de la secuencia de reconocimiento (Figura 4.9a), lo
que da como resultado un extremo romo o un extremo enrasado. PvuII y AluI son ejemplos de cortadores de extremos romos.
Otras endonucleasas de restricción cortan el ADN de una manera ligeramente diferente. Con estas
enzimas, las dos hebras de ADN no se cortan exactamente en la misma posición. En su lugar, la escisión
se escalona, por lo general en dos o cuatro nucleótidos, de modo que los fragmentos de ADN resultantes
tienen protuberancias monocatenarias cortas en cada extremo (Figura 4.9b). Estos se llaman extremos
pegajosos o cohesivos, ya que el emparejamiento de bases entre ellos puede volver a unir la molécula de
ADN (recuerde que los extremos pegajosos se encontraron en la página 20 durante la descripción de la
replicación del fago). Una característica importante de las enzimas con extremos cohesivos es que las
endonucleasas de restricción con diferentes secuencias de reconocimiento pueden producir los mismos extremos cohesivos.
BamHI (secuencia de reconocimiento GGATCC) y BglII (AGATCT) son ejemplos; ambos producen extremos
cohesivos GATC (Figura 4.9c). Sau3A también produce el mismo extremo adhesivo , que reconoce solo el
tetranucleótido GATC. Los fragmentos de ADN producidos por escisión con cualquiera de estas enzimas
se pueden unir entre sí, ya que cada fragmento lleva un extremo adhesivo complementario.

4.2.4 La frecuencia de las secuencias de reconocimiento en una

molécula de ADN
El número de secuencias de reconocimiento para una endonucleasa de restricción particular en una
molécula de ADN de longitud conocida puede calcularse matemáticamente. Una secuencia de
tetranucleótidos (p. ej., GATC) debe ocurrir una vez cada 44 = 256 nucleótidos, y un hexanucleótido
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54 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) Producción de puntas romas

norte norte A TG N
C norte Fondo norte norte A GRAMO C TN _ norte
········ ···· ····

norte norte T CG un nn norte norte T C GRAMO un nn

'N' = A, G, C o T Extremos romos

(b) Producción de extremos cohesivos

norte norte GRAMO A A T T C norte norte EcoRI norte norte GRAMO A A T T C norte norte

······· ··· · · · · · ·
norte norte C T T AG A norte norte norte norte C T T A A GRAMO norte norte

Extremos pegajosos

(c) Los mismos extremos cohesivos producidos

por diferentes endonucleasas de restricción.

norte norte ATC C norte norte

··· ···
GRAMO GRAMO

BamHI
norte N CT
C GA GRAMO norte norte

norte norte A A CT NT norte

··· ···
GRAMO

BglII
norte norte T CTAG A norte norte

norte
···
norte norte GRAMO ATC N ···
norte norte

Sau3A
norte norte norte CTAG norte norte norte

Figura 4.9 Los

extremos producidos por la escisión del ADN con diferentes endonucleasas de restricción. (a) Un extremo romo producido por AluI.
(b) Un extremo adhesivo producido por EcoRI. (c) Los mismos extremos cohesivos producidos por BamHI, BglII y Sau3A.

(por ejemplo, GGATCC) una vez cada 46 = 4096 nucleótidos. Estos cálculos asumen que los
nucleótidos están ordenados al azar y que los cuatro nucleótidos diferentes están presentes en
proporciones iguales (es decir, el contenido de GC = 50%). En la práctica, ninguno de estos
supuestos es del todo válido. Por ejemplo, la molécula de ADN e, de 49 kb, debería contener
alrededor de 12 sitios para una endonucleasa de restricción con una secuencia de reconocimiento
de hexanucleótidos. De hecho, muchos de estos sitios de reconocimiento ocurren con menos
frecuencia (p. ej., seis para BglII, cinco para BamHI y solo dos para SalI), lo que refleja el hecho de
que el contenido de GC para e es bastante inferior al 50 % (Figura 4.10a). ).
Además, los sitios de restricción generalmente no están espaciados uniformemente a lo largo de
una molécula de ADN. Si lo fueran, entonces la digestión con una endonucleasa de restricción
particular daría fragmentos de tamaños aproximadamente iguales. La figura 4.10b muestra los
fragmentos producidos al cortar el ADN con BglII, BamHI y SalI. En cada caso hay una dispersión
considerable de tamaños de fragmentos, lo que indica que en el ADN e los nucleótidos no están ordenados al azar.
La lección que se puede aprender de la figura 4.10 es que, aunque las matemáticas pueden dar
una idea de cuántos sitios de restricción cabe esperar en una molécula de ADN determinada, sólo el
análisis experimental puede proporcionar la imagen real. Por lo tanto, debemos pasar a considerar
cómo se utilizan las endonucleasas de restricción en el laboratorio.

4.2.5 Realización de una digestión de restricción en el laboratorio

Como ejemplo, consideraremos cómo digerir una muestra de ADN e (concentración 125 mg/ml) con
BglII.
Primero, se debe pipetear la cantidad requerida de ADN en un tubo de ensayo. La cantidad de
ADN que se restringirá depende de la naturaleza del experimento. En este caso, digeriremos 2 fg de
ADN e, que está contenido en 16 fl de la muestra (Figura 4.11a). Por lo tanto, se necesitarán
micropipetas muy precisas.
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Capítulo 4 Manipulación del ADN purificado 55

(a) Sitios de escisión en el ADN ÿ

0 10 20 30 40 49 KB

Bglll – 6 sitios

(b) Tamaños de fragmentos

BamHl – 5 sitios

Bglll Sala – 2 sitios

22 010
13 286
9688
2392
651
415
60

bam hl
16 841
7233
6770
6527
5626 5505

Habitación

32 745
15 258
499

Figura 4.10

Restricción de la molécula de ADN ÿ . (a) Las posiciones de las secuencias de reconocimiento para BglII, BamHI y SalI. (b) Los
fragmentos producidos por escisión con cada una de estas endonucleasas de restricción. Los números son los tamaños de los
fragmentos en pares de bases.

Añadir fenol o
Añadir 2 µl Añadir 0,5 µl Incubar a EDTA o calor a
tampón BgIII BgIII + 1,5 µl H2O 37°C durante 1 h 70°C durante 15 min

tercero ADN ÿ escindido

2 µg de ADN ÿ
(a) (16 µl) (b) (C) (d) (y)

Figura 4.11
Realización de un resumen de restricción en el laboratorio.

El otro componente principal en la reacción será la endonucleasa de restricción, obtenida

de un proveedor comercial como una solución pura de concentración conocida. Pero antes de
agregar la enzima, la solución que contiene el ADN debe ajustarse para proporcionar las
condiciones correctas para garantizar la máxima actividad de la enzima. La mayoría de las
endonucleasas de restricción funcionan adecuadamente a pH 7,4, pero las diferentes enzimas
varían en sus requisitos de fuerza iónica (generalmente proporcionada por la concentración de
cloruro de sodio (NaCl)) y magnesio (Mg2+) (todas las endonucleasas de restricción de tipo II
requieren Mg2+ para poder funcionar). También es recomendable añadir un agente reductor,
como el ditiotreitol (DTT), que estabiliza la enzima y evita su inactivación. Es muy importante
proporcionar las condiciones adecuadas para la enzima: las concentraciones incorrectas de
NaCl o Mg2+ no solo disminuyen la actividad de la endonucleasa de restricción, sino que también pueden causar
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56 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Tabla 4.2
Un tampón 10 × adecuado para la restricción de ADN con BglII.

COMPONENTE CONCENTRACIÓN (mM)

Tris–HCl, pH 7,4 500

MgCl2 NaCl 100

Ditiotreitol 500
10

cambios en la especificidad de la enzima, de modo que la escisión del ADN se produce en secuencias
de reconocimiento adicionales no estándar.
La composición de un tampón adecuado para BglII se muestra en la Tabla 4.2. Este tampón es diez
veces la concentración de trabajo y se diluye agregándolo a la mezcla de reacción.
En nuestro ejemplo, un volumen final adecuado para la mezcla de reacción sería de 20 fl, por lo que
agregamos 2 fl de tampón 10 × BglII a los 16 fl de ADN ya presentes (Figura 4.11b).
Ahora se puede añadir la endonucleasa de restricción. Por convención, 1 unidad de enzima se
define como la cantidad necesaria para cortar 1 fg de ADN en 1 hora, por lo que necesitamos 2
unidades de BglII para cortar 2 fg de ADN e. BglII se obtiene con frecuencia a una concentración de 4
unidades/fl, por lo que 0,5 fl es suficiente para escindir el ADN. Por lo tanto, los ingredientes finales de
la mezcla de reacción son 0,5 fl de BglII + 1,5 fl de agua, lo que da un volumen final de 20 fl (Figura
4.11c).
El último factor a considerar es la temperatura de incubación. La mayoría de las endonucleasas
de restricción, incluida la BglII, funcionan mejor a 37 °C, pero algunas tienen requisitos diferentes.
TaqI, por ejemplo, es una enzima de restricción de Thermus aquaticus y, como la ADN polimerasa
Taq , tiene una temperatura de trabajo alta. Las digestiones de restricción con TaqI deben incubarse a
65 °C para obtener la máxima actividad enzimática.
Después de 1 hora, la restricción debería estar completa (Figura 4.11d). Si los fragmentos de ADN
producidos por restricción se van a usar en experimentos de clonación, la enzima debe destruirse de
alguna manera para que no digiera accidentalmente otras moléculas de ADN que puedan agregarse
en una etapa posterior. Hay varias formas de “matar” la enzima. Para muchos es suficiente una
incubación corta a 70 °C, para otros se utiliza la extracción con fenol o la adición de tetraacetato de
etilendiamina (EDTA), que se une a los iones Mg2+ evitando la acción de la endonucleasa de restricción
(Figura 4.11e).

4.2.6 Análisis del resultado de la escisión de la endonucleasa de restricción Una

digestión de restricción da como resultado una serie de fragmentos de ADN, cuyo

tamaño depende de las posiciones exactas de las secuencias de reconocimiento de la endonucleasa

en la molécula original (consulte la Figura 4.10). Se necesita una forma de determinar el número y el
tamaño de los fragmentos si se van a utilizar las endonucleasas de restricción en la clonación de
genes. Si una molécula de ADN se corta o no se puede determinar con bastante facilidad probando la
viscosidad de la solución. Las moléculas de ADN más grandes dan como resultado una solución más
viscosa que las más pequeñas, por lo que la escisión se asocia con una disminución de la viscosidad.
Sin embargo, calcular el número y el tamaño de los productos de escisión individuales es más difícil.
De hecho, durante varios años este fue uno de los aspectos más tediosos de los experimentos con
ADN. Finalmente, los problemas se resolvieron a principios de la década de 1970 cuando se desarrolló
la técnica de electroforesis en gel.
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Capítulo 4 Manipulación del ADN purificado 57

(a) Electroforesis estándar Figura 4.12 (a) La

– + electroforesis estándar no separa fragmentos de

ADN de diferentes tamaños, mientras que (b) la
electroforesis en gel sí lo hace.
ADN Buffer

electroforesis
– +

Buffer

El ADN migra hacia el ánodo,

pero se produce poca separación
en clases de tamaño.

(b) Electroforesis en gel

ADN, cargado en un
– pozo cortado del gel
+
Gel Buffer

electroforesis
– +

Pequeñísimo
El ADN se separa en bandas de
fragmentos de diferentes tamaños.

Separación de moléculas por electroforesis en gel La

electroforesis , como la cromatografía de intercambio iónico (ver pág. 30), es una técnica que usa
diferencias en la carga eléctrica para separar las moléculas en una mezcla. Las moléculas de ADN
tienen cargas negativas, por lo que cuando se colocan en un campo eléctrico migran hacia el polo
positivo (figura 4.12a). La tasa de migración de una molécula depende de dos factores, su forma y
su relación carga-masa. Desafortunadamente, la mayoría de las moléculas de ADN tienen la misma
forma y todas tienen proporciones de carga a masa muy similares. Por lo tanto, los fragmentos de
diferentes tamaños no pueden separarse mediante electroforesis estándar.
Sin embargo, el tamaño de la molécula de ADN se convierte en un factor si la electroforesis se
realiza en un gel. Un gel, que generalmente está hecho de agarosa, poliacrilamida o una mezcla
de ambos, comprende una red compleja de poros, a través de los cuales las moléculas de ADN
deben viajar para alcanzar el electrodo positivo. Cuanto más pequeña es la molécula de ADN, más
rápido puede migrar a través del gel. Por lo tanto, la electroforesis en gel separa las moléculas
de ADN según su tamaño (Figura 4.12b).
En la práctica, la composición del gel determina los tamaños de las moléculas de ADN que se
pueden separar. Una losa de 0,5 cm de espesor de agarosa al 0,5%, que tiene poros relativamente
grandes, se usaría para moléculas en el rango de tamaño de 1 a 30 kb, lo que permitiría, por
ejemplo, distinguir claramente las moléculas de 10 y 12 kb. En el otro extremo de la escala, se
usaría un gel de poliacrilamida al 40% muy delgado (0,3 mm), con poros extremadamente
pequeños, para separar moléculas de ADN mucho más pequeñas, en el rango de 1 a 300 pb, y
podría distinguir moléculas que difieren en longitud. por un solo nucleótido.
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58 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 4.13 Pozos para muestras

Visualización de bandas de ADN en un gel de agarosa

mediante tinción con EtBr e irradiación ultravioleta (UV).
Gel de agarosa

Soporte de plástico
transparente UV

Remojar en solución de
0,5 µg/ml de EtBr, 15 min

Bandas de ADN
fluorescentes

ultravioleta

Visualización de moléculas de ADN en un gel de

agarosa La forma más fácil de ver los resultados de un experimento de electroforesis en gel es teñir el
gel con un compuesto que hace visible el ADN. El bromuro de etidio (EtBr), ya descrito en la p. 37 como
medio para visualizar el ADN en gradientes de cloruro de cesio, también se utiliza habitualmente para
teñir el ADN en geles de agarosa y poliacrilamida (Figura 4.13). Las bandas que muestran las posiciones
de las diferentes clases de tamaños de fragmentos de ADN son claramente visibles bajo la irradiación
ultravioleta después de la tinción con EtBr, siempre que haya suficiente ADN presente.
Desafortunadamente, el procedimiento es muy peligroso porque el bromuro de etidio es un mutágeno
poderoso. La tinción con EtBr también tiene una sensibilidad limitada, y si una banda contiene menos de
10 ng de ADN, es posible que no sea visible después de la tinción.
Por esta razón, en muchos laboratorios ahora se utilizan colorantes no mutagénicos que tiñen el ADN
de verde, rojo o azul. La mayoría de estos tintes se pueden usar como tinción posterior después de la
electroforesis, como se ilustra en la Figura 4.13 para EtBr, o alternativamente, debido a que no son
peligrosos, se pueden incluir en la solución tampón en la que se disuelve la agarosa o la poliacrilamida.
cuando se prepara el gel. Algunos de estos tintes requieren radiación ultravioleta para que las bandas
sean visibles, pero otros se visualizan mediante iluminación en otras longitudes de onda, por ejemplo,
bajo luz azul, lo que elimina un segundo peligro, ya que la radiación ultravioleta puede causar quemaduras
graves. Los colorantes más sensibles pueden detectar bandas que contienen menos de 1 ng de ADN.

4.2.7 Estimación de los tamaños de las moléculas de ADN

La electroforesis en gel separa moléculas de ADN de diferentes tamaños, y las moléculas más pequeñas
viajan la mayor distancia hacia el electrodo positivo. Si hay presentes varios fragmentos de ADN de
diferentes tamaños (el resultado de una digestión de restricción exitosa, por ejemplo), aparece una serie
de bandas en el gel. ¿Cómo se pueden determinar los tamaños de estos fragmentos?
El método más preciso es hacer uso de la relación matemática que vincula la tasa de migración con
la masa molecular. La fórmula relevante es:

D = a ÿ b(registro M)
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Capítulo 4 Manipulación del ADN purificado 59

(a) Estimación aproximada a simple vista Figura 4.14 Estimación

Hind III Desconocido de los tamaños de los fragmentos de ADN en un gel de agarosa. (a) A
ÿ
simple vista se puede obtener una estimación aproximada del tamaño del
fragmento. (b) Se obtiene una medida más precisa del tamaño de los
pb
23 130 fragmentos utilizando las movilidades de los fragmentos HindIII–ÿ para
9416 construir una curva de calibración; los tamaños de los fragmentos
6557
1 desconocidos se pueden determinar a partir de las distancias que han migrado.
4361 C. 5000 pb

2 C. 3200 pb
2322
2027 3 C. 2000 pb

564

(b) Estimación gráfica precisa

10

7.5

Tamaño
ADN
(kb)
del

2.5
1 2 3
00145 2 3
Distancia migrada (cm)

donde D es la distancia recorrida, M es la masa molecular y a y b son constantes que dependen de las
condiciones de la electroforesis.
Debido a que no siempre es necesaria una precisión extrema en la estimación del tamaño de los
fragmentos de ADN, generalmente se usa un método mucho más simple aunque menos preciso. Un digesto
de restricción estándar, que comprende fragmentos de tamaño conocido, generalmente se incluye en cada
gel de electroforesis que se ejecuta. Las digestiones de restricción de ADN e se utilizan a menudo de esta
manera como marcadores de tamaño. Por ejemplo, HindIII escinde el ADN en ocho fragmentos, que varían
en tamaño desde 125 pb para el más pequeño hasta más de 23 kb para el más grande. Como se conocen
los tamaños de los fragmentos en este compendio, los tamaños de los fragmentos en el compendio
experimental pueden estimarse comparando las posiciones de las bandas en las dos pistas (Figura 4.14).
También se pueden utilizar como marcadores de tamaño mezclas especiales de fragmentos de ADN
denominadas escaleras de ADN, cuyos tamaños son múltiplos de 100 pb o de 1 kb. Aunque no es precisa,
la estimación del tamaño por comparación con marcadores de ADN se puede realizar con un error de tan solo
el 5 %, lo cual es satisfactorio para la mayoría de los propósitos.

4.2.8 Mapeo de las posiciones de diferentes sitios de restricción en

una molécula de ADN
Hasta ahora hemos considerado cómo determinar el número y el tamaño de los fragmentos de ADN
producidos por la escisión de la endonucleasa de restricción. El siguiente paso en el análisis de restricción
es construir un mapa que muestre las posiciones relativas en la molécula de ADN de las secuencias de
reconocimiento para varias enzimas diferentes. Solo cuando se dispone de un mapa de restricción se pueden
seleccionar las endonucleasas de restricción correctas para la manipulación de corte particular que se requiere
(Figura 4.15).
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60 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 4.15 Uso de mapa genetico

un mapa de restricción para determinar qué Gen A Gen B Gen C Gen D

endonucleasas de restricción deben usarse para obtener
fragmentos de ADN que contengan genes individuales.

Mapa de restricciones

Bglll bam hl Habitación

Para obtener el gen B, digerir con Bglll

A B
C
A D

Para obtener el gen D, digerir con BamHl + Sall

B D
A
A B
C

Para construir un mapa de restricción, se debe realizar una serie de resúmenes de restricción.
Primero, el número y el tamaño de los fragmentos producidos por cada endonucleasa de restricción
deben determinarse mediante electroforesis en gel seguida de comparación con marcadores de
tamaño (Figura 4.16). Luego, esta información debe complementarse con una serie de digestiones
dobles, en las que el ADN es cortado por dos endonucleasas de restricción a la vez. Podría ser
posible realizar una digestión doble en un paso si ambas enzimas tienen requisitos similares de
pH, concentración de Mg2+ , etc. Alternativamente, es posible que las dos digestiones deban
realizarse una después de la otra, ajustando la mezcla de reacción después de la primera digestión.
para proporcionar un conjunto diferente de condiciones para la segunda enzima.
La comparación de los resultados de las digestiones simples y dobles permitirá mapear muchos,
si no todos, los sitios de restricción (Figura 4.16). Por lo general, las ambigüedades se pueden
resolver mediante digestión parcial, realizada en condiciones que dan como resultado la escisión
de solo un número limitado de sitios de restricción en cualquier molécula de ADN. La digestión
parcial generalmente se logra al reducir el período de incubación, de modo que la enzima no tenga
tiempo de cortar todos los sitios de restricción, o al incubar a una temperatura baja (p. ej., 4 °C en
lugar de 37 °C), lo que limita la actividad de la enzima
El resultado de una digestión parcial es un patrón complejo de bandas en un gel de electroforesis.
Además de los fragmentos estándar, producidos por digestión total, se observan tamaños
adicionales. Son moléculas que comprenden dos fragmentos de restricción adyacentes, separados
por un sitio que no ha sido escindido. Sus tamaños indican qué fragmentos de restricción en el
resumen completo están uno al lado del otro en la molécula sin cortar (Figura 4.16).

4.2.9 Métodos especiales de electroforesis en gel para separar

moléculas más grandes
Durante la electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de ADN migra a una velocidad
proporcional a su tamaño, pero esta relación no es directa. La fórmula que une
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Capítulo 4 Manipulación del ADN purificado 61

Digestiones simples y dobles

Enzima Número de fragmentos Tamaños (kb)

Xbal 2 24,0, 24,5

Xhol 2 15,0, 33,5
kpnl 3 1,5, 17,0, 30,0
Xbal + Xhol 3 9,0, 15,0, 24,5
Xbal + Kpnl 4 1,5, 6,0, 17,0, 24,0

Conclusiones:

(1) Como el ADN ÿ es lineal, el número de sitios de restricción para cada enzima es XbaI
1, XhoI 1, KpnI 2.

(2) Los sitios XbaI y XhoI se pueden mapear:

24.0 24.5
Fragmentos XbaI
XbaI – fragmentos de xhol 9.0 15.0 24.5
15.0 33.5
fragmentos de xhol
Xhol XbaI
La única posibilidad es:
15.0 9.0 24.5

(3) Todos los sitios Kpnl caen en el fragmento Xbal de 24,5 kb , ya que el fragmento de 24,0 kb
está intacto después de la doble digestión Xbal-Kpnl . El orden de los fragmentos Kpnl solo
puede determinarse mediante digestión parcial.

digestión parcial

Enzima Tamaños de fragmentos (kb)

Kpnl – condiciones limitantes 1,5, 17,0, 18,5, 30,0, 31,5, 48,5

Conclusiones:

(1) fragmento de 48,5 kb = ÿ sin cortar.

(2) Los fragmentos de 1,5, 17,0 y 30,0 kb son productos de digestión completa. (3) Los
fragmentos de 18,5 y 31,5 kb son productos de digestión parcial.

kpnls
El mapa Kpnl debe ser:
30.0 1.5 17.0

Xhol Xbal kpnls

Por lo tanto el mapa completo es:
15.0 9,0 6,0 1,5 17,0

Figura 4.16 Mapeo

de restricciones. Este ejemplo muestra cómo se pueden determinar las posiciones de los sitios XbaI, XhoI y KpnI en la
molécula de ADN ÿ .

la tasa de migración a la masa molecular tiene un componente logarítmico (pág. 59), lo que significa que la
diferencia en las tasas de migración se vuelve cada vez más pequeña para moléculas más grandes (Figura
4.17). En la práctica, las moléculas mayores de aproximadamente 50 kb no pueden resolverse de manera
eficiente mediante electroforesis en gel estándar.
Esta limitación de tamaño no suele ser un problema cuando los fragmentos de restricción que se estudian
se han obtenido cortando el ADN con una enzima con secuencia de reconocimiento de tetranucleótidos o
hexanucleótidos. La mayoría de los fragmentos producidos de esta manera, si no todos, tendrán menos de
30 kb de longitud y se resolverán fácilmente mediante electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo, pueden
surgir dificultades si se utiliza una enzima con una secuencia de reconocimiento más larga, como NotI, que
corta en una secuencia de ocho nucleótidos (ver Tabla 4.1). No. Se esperaría, en promedio, que cortara una
molécula de ADN una vez cada
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62 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 4.17 La

influencia del tamaño del ADN en la tasa de Mala resolución de

migración durante la electroforesis en gel convencional. Moléculas de ADN
por encima de cierto tamaño.

molécula
Longitud
ADN
de
de
la

Resolución adecuada de
moléculas de ADN en
este rango de tamaño

distancia recorrida en x horas

Figura 4.18 (a) Electroforesis en gel de agarosa convencional

La diferencia entre la electroforesis en –

gel convencional y la electroforesis en
gel con alternancia de campo ortogonal
(OFAGE).

Migración

(b) OFAJE
– –

+ +

(c) Separación de cromosomas de levadura por OFAGE

Número de cromosomas

700 kb

IV VII, XV XIII, XVI II XIV X XI VIII, V IX III VI

500kb yo

200kb

48 = 65.536 pb. Por lo tanto, es poco probable que los fragmentos de NotI se separen mediante
electroforesis en gel estándar.
Las limitaciones de la electroforesis en gel estándar se pueden superar si se utiliza un campo
eléctrico más complejo. Se han diseñado varios sistemas diferentes, pero el principio se ilustra mejor
mediante electroforesis en gel con alternancia de campo ortogonal (OFAGE).
En lugar de aplicarse directamente a lo largo del gel, como en el método estándar (Figura 4.18a), el
campo eléctrico ahora alterna entre dos pares de electrodos, cada uno
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Capítulo 4 Manipulación del ADN purificado 63

par fijado en un ángulo de 45° a la longitud del gel (Figura 4.18b). El resultado es un campo
pulsado, en el que las moléculas de ADN en el gel tienen que cambiar continuamente de dirección
de acuerdo con los pulsos. Como los dos campos se alternan de manera regular, el movimiento
neto de las moléculas de ADN en el gel sigue siendo de un extremo al otro, más o menos en línea
recta. Sin embargo, con cada cambio en la dirección del campo, cada molécula de ADN tiene que
realinearse 90° antes de que pueda continuar su migración. Este es el punto clave, porque una
molécula corta puede realinearse más rápido que una larga, lo que permite que la molécula corta
progrese hacia el fondo del gel más rápidamente. Esta dimensión añadida aumenta el poder de
resolución del gel de manera espectacular, de modo que se pueden separar moléculas de hasta
varios miles de kilobases de longitud.
Este rango de tamaño incluye no solo fragmentos de restricción sino también moléculas
cromosómicas intactas de muchos eucariotas inferiores, incluidas levaduras, varios hongos
filamentosos importantes y protozoos como el parásito de la malaria Plasmodium falciparum. Por lo
tanto, OFAGE y técnicas relacionadas, como los campos eléctricos homogéneos delimitados
por contorno (CHEF) y la electroforesis en gel de inversión de campo (FIGE) , se pueden usar
para preparar geles que muestren los cromosomas separados de estos organismos (Figura 4.18c),
lo que permite que el ADN de estos cromosomas individuales sea purificado.

4.3 Ligación: unión de moléculas de ADN

El paso final en la construcción de una molécula de ADN recombinante es la unión de la molécula
vector y el ADN que se va a clonar (Figura 4.19). Este proceso se conoce como ligadura, y la
enzima que cataliza la reacción se llama ADN ligasa.

4.3.1 El modo de acción de la ADN ligasa

Todas las células vivas producen ligasas de ADN, pero la enzima utilizada en la ingeniería genética
generalmente se purifica a partir de bacterias E. coli que han sido infectadas con el fago T4. Dentro
de la célula, la enzima lleva a cabo la función muy importante de reparar cualquier discontinuidad
que pueda surgir en una de las cadenas de una molécula de doble cadena (ver Figura 4.4a). Una
discontinuidad es simplemente una posición en la que falta un enlace fosfodiéster entre nucleótidos
adyacentes (en contraste con una muesca, en la que faltan uno o más nucleótidos). Aunque las
discontinuidades pueden surgir por la rotura fortuita de las moléculas de ADN de la célula, también
son el resultado natural de procesos como la replicación y la recombinación del ADN. Por lo tanto,
las ligasas desempeñan varias funciones vitales en la célula.
En el tubo de ensayo, las ligasas de ADN purificadas, además de reparar discontinuidades
monocatenarias, también pueden unir moléculas de ADN individuales o los dos extremos de la
misma molécula. La reacción química involucrada en la unión de dos moléculas es exactamente la
misma que la reparación de discontinuidades, excepto que se deben formar dos enlaces
fosfodiéster, uno para cada hebra (Figura 4.20a).

Gene Figura 4.19

ADN Gene
+ ligasa
Ligación: el paso final en la construcción de
una molécula de ADN recombinante.
ADN a
clonar
Vector recombinante
molécula de adn
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64 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) Ligadura de extremos romos

(b) Ligadura de extremos cohesivos

Estructura

transitoria de pares de bases

discontinuidades

La ADN ligasa sella las

discontinuidades.

Figura 4.20 Las

diferentes reacciones de unión catalizadas por la ADN ligasa: (a) ligadura de moléculas de extremos romos; (b) ligadura de moléculas con
extremos cohesivos.

4.3.2 Los extremos adhesivos aumentan la eficiencia de la ligadura

La reacción de ligadura de la figura 4.20a muestra la unión de dos fragmentos de extremos romos.
Aunque esta reacción se puede llevar a cabo en el tubo de ensayo, no es muy eficiente.
Esto se debe a que la ligasa no puede "agarrar" la molécula que se va a ligar y tiene que esperar a que
las asociaciones fortuitas junten los extremos. Si es posible, la ligadura de extremos romos se debe
realizar a altas concentraciones de ADN, para aumentar las posibilidades de que los extremos de las
moléculas se unan de la manera correcta.
Por el contrario, la ligadura de extremos cohesivos complementarios es mucho más eficiente. Esto
se debe a que los extremos cohesivos compatibles pueden formar pares de bases entre sí mediante
enlaces de hidrógeno (Figura 4.20b), formando una estructura relativamente estable sobre la que
trabajar la enzima. Si los enlaces fosfodiéster no se sintetizan con bastante rapidez, los extremos
cohesivos vuelven a desmoronarse. Sin embargo, estas estructuras transitorias de pares de bases
aumentan la eficacia de la ligadura al aumentar el tiempo que los extremos están en contacto entre sí.

4.3.3 Colocación de extremos adhesivos en una molécula de extremos romos

Por las razones detalladas en la sección anterior, los extremos cohesivos compatibles son deseables
en las moléculas de ADN que se van a unir en un experimento de clonación de genes. A menudo, estos
extremos cohesivos pueden obtenerse digiriendo tanto el vector como el ADN que se va a clonar con la
misma endonucleasa de restricción, o con diferentes enzimas que producen el mismo extremo cohesivo,
pero esto no siempre es posible. Una situación común es cuando la molécula del vector tiene extremos
pegajosos, pero los fragmentos de ADN que se clonarán tienen los extremos romos.
En estas circunstancias, se puede utilizar uno de los tres métodos para colocar los extremos cohesivos
correctos en los fragmentos de ADN.

Enlazadores El primero de estos métodos implica el uso de enlazadores. Estos son fragmentos cortos
de ADN de doble cadena, de secuencia de nucleótidos conocida, que se sintetizan en el tubo de ensayo.
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Capítulo 4 Manipulación del ADN purificado sesenta y cinco

(a) Un enlazador típico

CGA T GAGTCC ATCC

GCTA CC ETIQUETA ETIQUETA

sitio BamHI

(b) El uso de enlazadores

Enlazadores Molécula de extremos romos

ADN ligasa

Enlazadores adjuntos
BamHI
Extremo adhesivo BamHI

enlazadores escindidos

Figura 4.21
Enlazadores y su uso: (a) la estructura de un enlazador típico; (b) la unión de enlazadores a una molécula de extremos romos.

En la figura 4.21a se muestra un enlazador típico. Tiene los extremos romos, pero contiene un sitio de restricción,
BamHI en el ejemplo que se muestra. La ligasa de ADN puede unir conectores a los extremos de moléculas de
ADN de extremos romos más grandes. Aunque se trata de una ligadura de extremos romos, esta reacción en
particular se puede realizar de manera muy eficiente porque los oligonucleótidos sintéticos, como los enlazadores,
se pueden producir en cantidades muy grandes y se pueden agregar a la mezcla de ligadura a una concentración alta.
Más de un enlazador se unirá a cada extremo de la molécula de ADN, produciendo la estructura de cadena
que se muestra en la figura 4.21b. Sin embargo, la digestión con BamHI escinde las cadenas en las secuencias
de reconocimiento, produciendo una gran cantidad de enlazadores escindidos y el fragmento de ADN original,
que ahora lleva extremos cohesivos de BamHI . Este fragmento modificado está listo para ligarse en un vector de
clonación restringido con BamHI.

Adaptadores
Hay un inconveniente potencial con el uso de enlazadores. Considere lo que sucedería si la molécula de extremos
romos que se muestra en la figura 4.21b contuviera una o más secuencias de reconocimiento de BamHI . Si este
fuera el caso, el paso de restricción necesario para escindir los conectores y producir los extremos cohesivos
también escindiría la molécula de extremos romos (Figura 4.22). Los fragmentos resultantes tendrán los extremos
cohesivos correctos, pero eso no es un consuelo si el gen contenido en el fragmento de extremos romos ahora se
ha roto en pedazos.

Figura 4.22 Un

BamHI
posible problema con el uso de enlazadores.
Compare esta situación con el resultado deseado de la
restricción BamHI , como se muestra en la Figura 4.21(b).

Escisión debido a
sitios BamHI internos
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66 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 4.23 (a) Un adaptador típico

Adaptadores y el problema potencial con su uso. (a) Un GRAMO ATC C C GG
adaptador típico. (b) Dos adaptadores podrían ligarse entre
G CG C
sí para producir una molécula similar a un enlazador, de
modo que (c) después de la ligadura de los adaptadores, Extremo adhesivo BamHI
una molécula con extremos romos todavía tiene extremos

romos y aún se necesita el paso de restricción. (b) Los adaptadores podrían ligarse entre sí
CGCG GRAMO ATC CGCG

GCGC CTAG GCGC

(c) La nueva molécula de ADN todavía tiene extremos romos

Adaptadores Molécula de
extremos romos
ADN ligasa

Los adaptadores se ligan a sí mismos

El segundo método de unir extremos cohesivos a una molécula de extremos romos está diseñado
para evitar este problema. Los adaptadores, como los enlazadores, son oligonucleótidos sintéticos cortos.
Pero a diferencia de los enlazadores, un adaptador se sintetiza de manera que ya tiene un extremo
adhesivo (Figura 4.23a). La idea es, por supuesto, ligar el extremo romo del adaptador a los extremos
romos del fragmento de ADN, para producir una nueva molécula con extremos adhesivos. Este puede
parecer un método simple, pero en la práctica surge un nuevo problema. Los extremos cohesivos de
las moléculas adaptadoras individuales podrían formar pares de bases entre sí para formar dímeros
(figura 4.23b), de modo que la nueva molécula de ADN aún tenga extremos romos (figura 4.23c). Los
extremos cohesivos podrían recrearse mediante digestión con una endonucleasa de restricción, pero
eso frustraría el propósito de usar adaptadores en primer lugar.
La respuesta al problema radica en la estructura química precisa de los extremos de la molécula
adaptadora. Normalmente, los dos extremos de una cadena de polinucleótidos son químicamente
distintos, un hecho que queda claro a partir de un examen cuidadoso de la estructura polimérica del
ADN (Figura 4.24a). Un extremo, denominado terminal 5', lleva un grupo fosfato (5'-P); el otro, el terminal
3', tiene un grupo hidroxilo (3'-OH). En la doble hélice, las dos cadenas son antiparalelas (figura 4.24b),
por lo que cada extremo de una molécula de doble cadena consta de un extremo 5ÿ-P y un extremo 3ÿ-
OH. La ligadura tiene lugar entre los extremos 5ÿ-P y 3ÿ-OH (figura 4.24c).

Las moléculas adaptadoras se sintetizan para que el extremo romo sea el mismo que el "natural"
ADN, pero el extremo pegajoso es diferente. El extremo 3ÿ-OH del extremo cohesivo es el mismo de
siempre, pero el extremo 5ÿ-P está modificado: carece del grupo fosfato y, de hecho, es un extremo 5ÿ-
OH (figura 4.25a). La ADN ligasa no puede formar un puente fosfodiéster entre los extremos 5ÿ-OH y
3ÿ-OH. El resultado es que, aunque siempre se produce un apareamiento de bases entre los extremos
cohesivos de las moléculas adaptadoras, la asociación nunca se estabiliza mediante la ligadura (figura
4.25b).
Por lo tanto, los adaptadores se pueden ligar a una molécula de ADN de extremos romos, pero no
a ellos mismos. Después de conectar los adaptadores, el extremo 5ÿ-OH anormal se convierte en la
forma 5ÿ-P natural mediante el tratamiento con la enzima polinucleótido quinasa (pág. 50), lo que
produce un fragmento con extremos pegajosos que se puede insertar en un lugar apropiado. vector.
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Capítulo 4 Manipulación del ADN purificado 67

(a) La estructura de una cadena de polinucleótidos que muestra la distinción Figura 4.24 La
química entre los terminales 5'-P y 3'-OH
distinción entre los extremos 5' y 3' de un
5'
polinucleótido.
LA-

– ABIERTO
LA

CH2 Base
nucleótido
un LA

LA

-OO _ PAG

LA

CH2 Base
LA

LA

– ABIERTO
LA

CH2 Base
LA

OH

3'

(b) En la doble hélice, las cadenas de polinucleótidos son antiparalelas

5' 3'

3' 5'

(c) La ligadura tiene lugar entre los extremos 5'-P y 3'-OH

5' 3' 5' 3'

3' 5' 3' 5'

5' 3'

3' 5'

Producción de extremos cohesivos mediante colas

de homopolímeros La técnica de colas de homopolímeros ofrece un enfoque radicalmente
diferente para la producción de extremos cohesivos en una molécula de ADN de extremos romos.
Un homopolímero es simplemente un polímero en el que todas las subunidades son iguales. Una
hebra de ADN compuesta completamente de, digamos, desoxiguanosina es un ejemplo de
homopolímero y se denomina polidesoxiguanosina o poli(dG).
La cola involucra el uso de la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (pág. 50) para
agregar una serie de nucleótidos en los terminales 3ÿ-OH de una molécula de ADN de doble cadena.
Si esta reacción se lleva a cabo en presencia de un solo desoxirribonucleótido, se produce una cola
de homopolímero (Figura 4.26a). Por supuesto, para poder ligar juntos
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68 68
Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 4.25 El uso (a) La estructura precisa de un adaptador

de adaptadores: (a) la estructura real de un adaptador, A OH

que muestra el extremo 5ÿ-OH modificado; (b) GRAMO ATC CGCG
conversión de extremos romos en extremos adhesivos
el modificado GCGC
mediante la unión de adaptadores.
terminal 5'-OH A PO3
2–

(b) Ligadura usando adaptadores

OH A
A OH
Molécula de
extremos romos ADN ligasa Adaptador

A A
OH OH

Polinucleótido quinasa

2–O3 P 2–
PO3
terminal 5'-P

Figura 4.26 Residuos (a) Síntesis de una cola de homopolímero 3'

CC
CC
de homopolímero: (a) síntesis de un residuo de
3' CCCCCCCC
homopolímero; (b) construcción de una molécula
5' 5'
de ADN recombinante a partir de un vector con cola más

ADN insertado con cola; (c) reparación de la molécula de

ADN recombinante.
Transferasa
terminal + dCTP

(b) Ligadura de colas de homopolímero

GRAMO

GRAMO

C GRAMO

C GRAMO

C GRAMO

C
C
C C
C GRAMO C
C

+
GRAMO

C GRAMO C
C GRAMO C
C GRAMO

recombinante
molécula de adn
GRAMO

GRAMO

Foto de archivo - Colas GRAMO

poli (dC) GRAMO

GRAMO

C
C
Insertar
GRAMO

C GRAMO

C GRAMO

ADN - colas poli(dG) C GRAMO

GRAMO

(c) Los pasos de reparación

Mella
AAAA
CCCCCCCC
Discontinuidad

La polimerasa
Klenow repara la mella

GGG G GGG
CCCCCCCC

La ligasa repara
las discontinuidades.
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Capítulo 4 Manipulación del ADN purificado 69

moléculas de dos colas, los homopolímeros deben ser complementarios. Con frecuencia, las colas
de polidesoxicitosina (poli(dC)) se unen al vector y poli(dG) al ADN que se va a clonar. El
emparejamiento de bases entre los dos ocurre cuando se mezclan las moléculas de ADN (Figura
4.26b).
En la práctica, las colas poli(dG) y poli(dC) no suelen tener exactamente la misma longitud, y las
moléculas recombinantes con pares de bases resultantes tienen muescas y discontinuidades (figura
4.26c). Por lo tanto, la reparación es un proceso de dos pasos, que utiliza la polimerasa Klenow para
rellenar las mellas, seguida de ADN ligasa para sintetizar los enlaces fosfodiéster finales. Esta reacción
de reparación no siempre tiene que realizarse en el tubo de ensayo. Si las colas del homopolímero
complementario tienen una longitud superior a unos 20 nucleótidos, se forman asociaciones de pares
de bases bastante estables. Una molécula de ADN recombinante, que se mantiene unida por
emparejamiento de bases aunque no esté completamente ligada, suele ser lo suficientemente estable
como para introducirse en la célula huésped en la siguiente etapa del experimento de clonación (ver
Figura 1.1). Una vez dentro del huésped, la propia ADN polimerasa y la ADN ligasa de la célula reparan
la molécula de ADN recombinante, completando la construcción iniciada en el tubo de ensayo.

4.3.4 Ligadura de extremos romos con una topoisomerasa de ADN

Una forma más sofisticada, pero más fácil y generalmente más eficiente de llevar a cabo la ligadura
de extremos romos, es usar un tipo especial de enzima llamada topoisomerasa de ADN. En la célula,
las topoisomerasas de ADN están involucradas en procesos que requieren giros de la doble hélice
para ser removidos o agregados a una molécula de ADN de doble cadena. Los giros se eliminan
durante la replicación del ADN para desenrollar la hélice y permitir que cada polinucleótido se replique,
y se agregan a las moléculas circulares recién sintetizadas para introducir el superenrollamiento. Las
topoisomerasas de ADN pueden separar las dos hebras de una molécula de ADN sin girar realmente
la doble hélice. Logran esta hazaña provocando roturas transitorias de una o dos cadenas en la
columna vertebral del ADN (Figura 4.27). Por lo tanto, las topoisomerasas de ADN tienen actividades
tanto de nucleasa como de ligasa.
Para llevar a cabo la ligadura de extremos romos con una topoisomerasa, se necesita un tipo
especial de vector de clonación. Este es un plásmido que ha sido linealizado por la actividad nucleasa
de la enzima ADN topoisomerasa del virus vaccinia. La topoisomerasa vaccinia corta el ADN en la
secuencia CCCTT, que está presente solo una vez en el plásmido. Después de cortar el

Figura 4.27 El
modo de acción de una topoisomerasa
de ADN tipo 1, que elimina o agrega vueltas a
una doble hélice haciendo una ruptura transitoria
en una de las hebras.

Mella
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70 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) Los extremos del vector resultantes de la escisión de la topoisomerasa

3' PO32– A 5'

CCC TT AA GGG
GGGA A 5' TT CCC 3'
2–O3 OH PAG

(b) Eliminación de fosfatos terminales de la molécula a clonar

2–O3 P 5' 3' OH A OH

Fosfatasa alcalina
3' 5' 2–
A PO3 A OH

(c) Estructura del producto de ligadura

A
OH
CCC TT AA GGG
GGGA A TT CCC
A
OH

Figura 4.28
Ligadura de extremos romos con una topoisomerasa de ADN. (a) La escisión del vector con la topoisomerasa deja extremos
romos con extremos 5ÿ-OH y 3ÿ-P. (b) Por lo tanto, la molécula a clonar debe tratarse con fosfatasa alcalina para convertir
sus extremos 5'-P en extremos 5'-OH. (c) La topoisomerasa liga los extremos 3ÿ-P y 5ÿ-OH, creando una molécula de doble
cadena con dos discontinuidades, que son reparadas por enzimas celulares después de la introducción en la bacteria huésped.

plásmido, las enzimas topoisomerasas permanecen unidas covalentemente a los extremos romos resultantes.
La reacción se puede detener en este punto, lo que permite almacenar el vector hasta que se necesite.

La escisión por la topoisomerasa da como resultado extremos 5ÿ-OH y 3ÿ-P (figura 4.28a). Si las moléculas
de extremos romos que se van a clonar se han producido a partir de una molécula más grande cortando con
una enzima de restricción, tendrán extremos 5'-P y 3'-OH. Antes de mezclar estas moléculas con el vector, se
deben eliminar sus fosfatos terminales para dar extremos 5'-OH que puedan ligarse a los extremos 3'-P del
vector. Por lo tanto, las moléculas se tratan con fosfatasa alcalina (Figura 4.28b).

La adición de las moléculas fosfatadas al vector reactiva las topoisomerasas unidas, que pasan a la fase
de ligación de su reacción. La ligadura se produce entre los extremos 3ÿ-P de los vectores y los extremos 5ÿ-
OH de las moléculas fosfatadas. Por lo tanto, las moléculas de extremos romos se insertan en los vectores.
Solo se liga una hebra en cada punto de unión (Figura 4.28c), pero esto no es un problema porque las
discontinuidades serán reparadas por las enzimas celulares después de que las moléculas recombinantes se
hayan introducido en la bacteria huésped.
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Capítulo 4 Manipulación del ADN purificado 71

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Deng, G. & Wu, R. (1981) Un procedimiento mejorado para utilizar transferasa terminal para agregar
homopolímeros a los extremos 3' del ADN. Investigación de ácidos nucleicos, 9, 4173–4188.
Helling, RB, Goodman, HM & Boyer, HW (1974) Análisis de fragmentos de ADN de endonucleasa R·EcoRI
de bacteriófagos lambdoides y otros virus mediante electroforesis en gel de agarosa. Revista de Virología,
14, 1235-1244.
Heyman, JA, Cornthwaite, J., Foncerrada, L. et al. (1999) Clonación a escala del genoma y expresión de
marcos de lectura abiertos individuales usando ligación mediada por topoisomerasa I.
Investigación del genoma, 9, 383–392. [Una descripción de la ligadura usando topoisomerasa.]
Jacobsen, H., Klenow, H. & Overgaard-Hansen, K. (1974) Las secuencias de aminoácidos N-terminales de la
ADN polimerasa I de Escherichia coli y de los fragmentos grandes y pequeños obtenidos por una
proteólisis limitada. Revista Europea de Bioquímica, 45, 623–627.
[Producción del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I.]
Lehnman, IR (1974) ADN ligasa: estructura, mecanismo y función. Ciencias, 186,
790–797.
REBASE: http://rebase.neb.com/rebase/ [Una lista completa de todas las restricciones conocidas
endonucleasas y sus secuencias de reconocimiento.]
Rothstein, RJ, Lau, LF, Bahl, CP, Narang, NA y Wu, R. (1979) Adaptadores sintéticos para
clonación de ADN. Métodos en Enzimología, 68, 98–109.
Schwartz, DC y Cantor, CR (1984) Separación de ADN del tamaño de un cromosoma de levadura mediante
electroforesis en gel de gradiente de campo pulsado. Celda, 37, 67–75.
Smith, HO & Wilcox, KW (1970) Una enzima de restricción de Haemophilus influenzae.
Revista de Biología Molecular, 51, 379–391. [Una de las primeras descripciones completas de una
endonucleasa de restricción.]
Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J. & Vitzthum, F. (2004) Investigaciones sobre la intercalación del ADN
y la unión a la superficie mediante SYBR Green I, su determinación estructural e implicaciones
metodológicas. Investigación de ácidos nucleicos, 32, e103. [Detalles de uno de los tintes de ADN que
ahora se usan como alternativa al bromuro de etidio para teñir geles de agarosa.]
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Capítulo 5
Introducción de
ADN en células vivas
Contenido del capítulo
CONTENIDO DEL CAPÍTULO

5.1 Transformación: la absorción de ADN por células bacterianas 5.2

Identificación de recombinantes 5.3 Introducción de ADN de fagos en
células bacterianas 5.4 Identificación de fagos recombinantes 5.5
Introducción de ADN en células no bacterianas

Las manipulaciones descritas en el Capítulo 4 permiten al biólogo molecular crear nuevas moléculas
de ADN recombinante. El siguiente paso en un experimento de clonación de genes es introducir estas
moléculas en células vivas, generalmente bacterias, que luego crecen y se dividen para producir clones
(ver Figura 1.1). Estrictamente hablando, la palabra "clonación" se refiere solo a las últimas etapas del
procedimiento, y no a la construcción de la molécula de ADN recombinante en sí.

La clonación tiene dos propósitos principales. En primer lugar, permite producir un gran número de
moléculas de ADN recombinante a partir de una cantidad limitada de material de partida. Al principio,
puede que solo estén disponibles unos pocos nanogramos de ADN recombinante, pero cada bacteria
que toma un plásmido se divide posteriormente varias veces para producir una colonia, cada célula de
la cual contiene múltiples copias de la molécula. Por lo general, se pueden preparar varios microgramos
de ADN recombinante a partir de una sola colonia bacteriana, lo que representa un aumento de mil
veces sobre la cantidad inicial (Figura 5.1). Si la colonia no se usa como fuente de ADN sino como
inóculo para un cultivo líquido, las células resultantes pueden proporcionar miligramos de ADN, un
aumento de un millón de veces en el rendimiento. De esta forma, la clonación puede proporcionar las
grandes cantidades de ADN necesarias para los estudios de biología molecular de la estructura y
expresión de los genes (capítulos 10 y 11).
La segunda función importante de la clonación puede describirse como purificación. Las
manipulaciones que dan como resultado una molécula de ADN recombinante rara vez pueden
controlarse en la medida en que no haya otras moléculas de ADN presentes al final del procedimiento. Él

72 Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010
por Blackwell Publishing.
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Capítulo 5 Introducción del ADN en las células vivas 73

Inocular en 500
ml de caldo líquido,
Crecimiento incubar por 18 horas
a una colonia

Célula única que contiene Proporciona varios µg de Aporta varios mg de ADN

múltiples copias de una ADN recombinante recombinante
molécula de ADN recombinante

Figura 5.1 La

clonación puede suministrar grandes cantidades de ADN recombinante.

(a) Los productos de la ligadura

Moléculas
vectoriales no ligadas

Gene

sin ligar
fragmentos de ADN

Gene

Moléculas El recombinante deseado Recombinante 'incorrecto'

vectoriales autoligadas molécula de adn moléculas de ADN

(b) Todas las moléculas circulares serán clonadas

Célula que contiene Célula que contiene Célula que contiene

vector autoligado la molécula deseada un recombinante "incorrecto"
molécula de adn

Clon de El Clon de
vector clon una molécula
autoligado deseado 'equivocada'

Figura 5.2 La

clonación es análoga a la purificación. A partir de una mezcla de diferentes moléculas se pueden obtener clones que contengan copias de una
sola molécula.
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74 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

la mezcla de ligadura puede contener, además de la molécula recombinante deseada, cualquiera de

los siguientes (Figura 5.2a): l Moléculas de vector no ligadas l Fragmentos de ADN no ligados l
Moléculas de vector que se han recircularizado sin que se inserte ADN nuevo (vector "autoligado") ) l
Moléculas de ADN recombinante que llevan el fragmento de ADN mal insertado.

Las moléculas no ligadas rara vez causan un problema porque, aunque pueden ser absorbidas
por células bacterianas, solo en circunstancias excepcionales se replicarán. Es mucho más probable
que las enzimas dentro de la bacteria huésped degraden estas piezas de ADN.
Las moléculas de vector autoligadas y los plásmidos recombinantes incorrectos son más importantes
porque se replican con la misma eficacia que la molécula deseada (Figura 5.2b). Sin embargo, la
purificación de la molécula deseada aún se puede lograr mediante la clonación porque es
extremadamente inusual que una célula tome más de una molécula de ADN. Cada célula da lugar a
una única colonia, por lo que cada uno de los clones resultantes consta de células que contienen la
misma molécula. Por supuesto, diferentes colonias contienen diferentes moléculas: algunas contienen
la molécula de ADN recombinante deseada, algunas tienen diferentes moléculas de hormiga
recombinante y algunas contienen vector autoligado. Por lo tanto, el problema se convierte en una
cuestión de identificar las colonias que contienen los plásmidos recombinantes correctos.
Este capítulo se ocupa de la forma en que los vectores de plásmidos y fagos, y las moléculas
recombinantes derivadas de ellos, se introducen en las células bacterianas. Durante el transcurso del
capítulo se hará evidente que la selección de colonias que contienen moléculas recombinantes, a
diferencia de las colonias que contienen vector autoligado, es relativamente fácil. La propuesta más
difícil de cómo distinguir los clones que contienen la molécula de ADN recombinante correcta de todos
los demás clones recombinantes se abordará en el Capítulo 8.

5.1 Transformación: la absorción de ADN por

células bacterianas
La mayoría de las especies de bacterias pueden absorber moléculas de ADN del medio en el que
crecen. A menudo, una molécula de ADN absorbida de esta manera se degradará, pero ocasionalmente
puede sobrevivir y replicarse en la célula huésped. En particular, esto sucede si la molécula de ADN
es un plásmido con un origen de replicación reconocido por el huésped.

5.1.1 No todas las especies de bacterias son igualmente eficientes en la captación

de ADN En la naturaleza, la transformación probablemente no sea un proceso importante
mediante el cual las bacterias obtengan información genética. Esto se refleja en el hecho de que en
el laboratorio solo unas pocas especies (sobre todo miembros de los géneros Bacillus y Streptococcus)
pueden transformarse con facilidad.
Un estudio minucioso de estos organismos ha revelado que poseen mecanismos sofisticados para la
unión y captación de ADN.
La mayoría de las especies de bacterias, incluida la E. coli, solo absorben cantidades limitadas de
ADN en circunstancias normales. Para transformar estas especies de manera eficiente, las bacterias
deben someterse a algún tipo de tratamiento físico y/o químico que mejore su capacidad para absorber
el ADN. Se dice que las células que se han sometido a este tratamiento son competentes.
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Capítulo 5 Introducción del ADN en las células vivas 75

Plásmido unido al
exterior de la célula Plásmido transportado a
la célula.

CaCl2 42°C
tratamiento durante 2 minutos

bacteria normal célula competente Célula transformada

Figura 5.3
Unión y captación de ADN por una célula bacteriana competente.

5.1.2 Preparación de células de E. coli competentes

Al igual que con muchos avances en la tecnología del ADN recombinante, el desarrollo clave en lo
que respecta a la transformación se produjo a principios de la década de 1970, cuando se observó
que las células de E. coli que se habían sumergido en una solución salina helada eran más eficientes
en la absorción de ADN que células sin remojar. Tradicionalmente se utiliza una solución de cloruro
de calcio (CaCl2) 50 mM , aunque también son eficaces otras sales, en particular el cloruro de rubidio.
No se comprende exactamente por qué funciona este tratamiento. Posiblemente, el CaCl2 hace
que el ADN se precipite en el exterior de las células, o quizás la sal sea responsable de algún tipo de
cambio en la pared celular que mejora la unión del ADN. En cualquier caso, la inmersión en CaCl2
solo afecta la unión del ADN y no la absorción real en la célula. Cuando se agrega ADN a las células
tratadas, permanece adherido al exterior de la célula y en esta etapa no se transporta al citoplasma
(Figura 5.3). El movimiento real del ADN hacia las células competentes se estimula elevando
brevemente la temperatura a 42°C. Una vez más, no se entiende la razón exacta por la que este
choque térmico es efectivo.

5.1.3 Selección de células transformadas

La transformación de células competentes es un procedimiento ineficaz, por muy cuidadosamente
que se hayan preparado las células. Aunque 1 ng del vector plásmido llamado pUC8 (pág. 92) puede
producir entre 1000 y 10 000 transformantes, esto representa la absorción de solo el 0,01 % de todas
las moléculas disponibles. Además, 10.000 transformantes es sólo una proporción muy pequeña del
número total de células que están presentes en un cultivo competente. Este último hecho significa
que debe encontrarse alguna manera de distinguir una célula que ha tomado un plásmido de los
muchos miles que no han sido transformados.
La captación y la retención estable de un plásmido generalmente se detectan buscando la
expresión de los genes portados por el plásmido. Por ejemplo, las células de E. coli normalmente
son sensibles a los efectos inhibidores del crecimiento de los antibióticos ampicilina y tetraciclina.
Sin embargo, las células que contienen el plásmido pBR322 (pág. 89), que fue uno de los primeros
vectores de clonación desarrollados en la década de 1970, son resistentes a estos antibióticos.
Esto se debe a que pBR322 porta dos conjuntos de genes, un gen que codifica una enzima b-
lactamasa que modifica la ampicilina en una forma que no es tóxica para la bacteria, y un segundo
conjunto de genes que codifica enzimas que desintoxican la tetraciclina. Después de un experimento
de transformación con pBR322, solo las células de E. coli que han absorbido un plásmido son
ampRtetR y pueden formar colonias en un medio de agar que contiene ampicilina o tetraciclina
, selectivo.
(Figura 5.4); los no transformantes, que todavía son ampS tetS , no producen colonias en el medio
Por lo
tanto, los transformantes y los no transformantes se distinguen fácilmente.
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76 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Célula normal de E. coli Célula de E. coli que contiene

(sin plásmidos) plásmidos pBR322

no sobrevive Sobrevive y

produce una colonia.

Agar que contiene 40 µg/ml de ampicilina, 15 µg/ml

de tetraiclina o una combinación de ambos

Figura 5.4

Selección de células que contienen plásmidos pBR322 sembrando en medio de agar que contiene ampicilina y/o tetraciclina.

Proteína de resistencia a

antibióticos plásmido

Inmediatamente después Después de la incubación

de la transformación a 37°C durante 1 hora

Figura 5.5

Expresión fenotípica. La incubación a 37 °C durante 1 hora antes de la siembra mejora la supervivencia de los transformantes en
un medio selectivo, porque las bacterias han tenido tiempo de comenzar la síntesis de las enzimas de resistencia a los antibióticos.

La mayoría de los vectores de clonación de plásmidos portan al menos un gen que confiere
resistencia a los antibióticos a las células huésped, y la selección de transformantes se logra mediante
la siembra en un medio de agar que contiene el antibiótico relevante. Tenga en cuenta, sin embargo,
que la resistencia al antibiótico no se debe únicamente a la presencia del plásmido en las células transformadas.
También se debe expresar el gen de resistencia en el plásmido, para que se sintetice la enzima que
detoxifica el antibiótico. La expresión del gen de resistencia comienza inmediatamente después de la
transformación, pero pasarán unos minutos antes de que la célula contenga suficiente enzima para
poder resistir los efectos tóxicos del antibiótico. Por esta razón, las bacterias transformadas no deben
sembrarse en placas en el medio selectivo inmediatamente después del tratamiento de choque térmico,
sino colocarse primero en un pequeño volumen de medio líquido, en ausencia de antibiótico, e
incubarse durante un tiempo breve. Entonces puede comenzar la replicación y la expresión del
plásmido, de modo que cuando las células se coloquen en placas y se encuentren con el antibiótico,
ya habrán sintetizado suficientes enzimas de resistencia para poder sobrevivir (Figura 5.5).

5.2 Identificación de recombinantes

La siembra en un medio selectivo permite distinguir los transformantes de los no transformantes. El
siguiente problema es determinar cuál de las colonias transformadas
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Capítulo 5 Introducción del ADN en las células vivas 77

producto genético Ningún producto genético Figura 5.6

Gen
diana para Gen Inactivación por inserción. (a) La molécula de
la inactivación diana vector normal, no recombinante, porta un gen
por inserción interrumpido
cuyo producto confiere una característica
seleccionable o identificable a la célula huésped. (b)
este gen se interrumpe cuando se inserta nuevo
ADN en el vector; como resultado, el huésped
recombinante no muestra la característica relevante.

(a) Molécula de vector normal (b) Molécula de vector recombinante

BamHI Nuevo ADN insertado

resistencia a
en el sitio BamHI
la ampicilina
gene

Grupo de genes
de resistencia
a la tetraciclina

ampRtetR ampRtetS

(a) La molécula de vector normal (b) Una molécula pBR322 recombinante

Figura 5.7 El

vector de clonación pBR322: (a) la molécula del vector normal; (b) una molécula recombinante que contiene una pieza extra de
ADN insertada en el sitio BamHI . Para obtener un mapa más detallado de pBR322, consulte la Figura 6.1.

comprenden células que contienen moléculas de ADN recombinante y que contienen moléculas
de vector autoligadas (ver Figura 5.2). Con la mayoría de los vectores de clonación, la inserción
de un fragmento de ADN en el plásmido destruye la integridad de uno de los genes presentes
en la molécula. Por lo tanto, los recombinantes pueden identificarse porque las células huésped
ya no muestran la característica codificada por el gen inactivado (Figura 5.6). Exploraremos los
principios generales de la inactivación por inserción observando los diferentes métodos
utilizados con los dos vectores de clonación mencionados en la sección anterior: pBR322 y pUC8.

5.2.1 Selección recombinante con pBR322: inactivación

por inserción de un gen de resistencia a antibióticos
pBR322 tiene varios sitios de restricción únicos que se pueden usar para abrir el vector antes de
la inserción de un nuevo fragmento de ADN (Figura 5.7a). BamHI, por ejemplo, corta pBR322 en
una sola posición, dentro del grupo de genes que codifican la resistencia a la tetraciclina. Una
molécula pBR322 recombinante, que lleva una pieza adicional de ADN en el sitio BamHI (Figura
5.7b), ya no puede conferir resistencia a la tetraciclina en su huésped, ya que uno de los genes
necesarios ahora está interrumpido por el ADN insertado. Las células que contienen esta
molécula pBR322 recombinante siguen siendo resistentes a la ampicilina, pero sensibles a la
tetraciclina (ampRtetS ).
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78 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) Colonias en medio de ampicilina

(b) Recubrimiento de réplicas

Bloque de madera

Celdas unidas al
Superficie táctil Superficie táctil bloque
colonias tetR

Incubar

Colonias en medio de
medio de ampicilina tetraciclina

(c) las colonias ampRtetR crecen en medio de tetraciclina

Posición de ampRtetS
recombinante

ampRtetR
no recombinantes

Figura 5.8

Detección de recombinantes pBR322 mediante la inactivación por inserción del gen de resistencia a la tetraciclina. (a) Las células
se sembraron en agar con ampicilina: todos los transformantes produjeron colonias. (b) Las colonias se replican en placas en medio
de tetraciclina. (c) Las colonias que crecen en medio de tetraciclina son ampRtetR y, por lo tanto, no recombinantes. Los recombinantes
(ampRtetS) no crecen, pero ahora se conoce su posición en la placa de ampicilina.

La selección de recombinantes de pBR322 se realiza de la siguiente manera. Después de la

transformación, las células se sembraron en medio de ampicilina y se incubaron hasta que
aparecieron colonias (Figura 5.8a). Todas estas colonias son transformantes (recuerde, las células
no transformadas son ampS y, por lo tanto, no producen colonias en el medio selectivo), pero solo
unas pocas contienen moléculas pBR322 recombinantes: la mayoría contiene el plásmido normal autoligado.
Para identificar los recombinantes, las colonias se replican en medio de agar que contiene
tetraciclina (Figura 5.8b) . Después de la incubación, algunas de las colonias originales vuelven a
crecer, pero otras no (Figura 5.8c). Los que crecen consisten en células que llevan el pBR322
normal sin ADN insertado y, por lo tanto, una tetraciclina funcional.
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Capítulo 5 Introducción del ADN en las células vivas 79

grupo de genes de resistencia (ampRtetR). Las colonias que no crecen en agar de tetraciclina son
recombinantes (ampRtetS); una vez que se conocen sus posiciones, se pueden recuperar muestras
para estudios posteriores de la placa de agar con ampicilina original.

5.2.2 La inactivación por inserción no siempre implica resistencia

a los antibióticos
Aunque la inactivación por inserción de un gen de resistencia a los antibióticos proporciona un medio
eficaz de identificación recombinante, el método se vuelve inconveniente por la necesidad de realizar
dos exámenes de detección, uno con el antibiótico que selecciona los transformantes, seguido por el
segundo examen, después de la replicación en placa, con el antibiótico que distingue a los
recombinantes. Por lo tanto, la mayoría de los vectores de plásmidos modernos utilizan un sistema
diferente. Un ejemplo es pUC8 (Figura 5.9a), que porta el gen de resistencia a la ampicilina y un gen
llamado lacZÿ, que codifica parte de la enzima b-galactosidasa. La clonación con pUC8 implica la
inactivación por inserción del gen lacZÿ , con recombinantes identificados debido a su incapacidad
para sintetizar b-galactosidasa (Figura 5.9b). La b-galactosidasa es una de una serie de enzimas
involucradas en la descomposición de la lactosa en glucosa más galactosa. Normalmente está
codificado por el gen lacZ, que reside en el cromosoma de E. coli . Algunas cepas de E. coli tienen
un gen lacZ modificado , uno que carece del segmento denominado lacZ' y que codifica la porción
del péptido a de la b-galactosidasa (Figura 5.10a). Estos mutantes pueden sintetizar la enzima solo
cuando albergan un plásmido, como pUC8, que porta el segmento lacZ' faltante del gen.

Un experimento de clonación con pUC8 implica la selección de transformantes en agar de

ampicilina seguida de la detección de actividad de b-galactosidasa para identificar recombinantes. Células

resistencia Figura 5.9 El

a la ampicilina
vector de clonación pUC8: (a) la molécula del vector
gene
normal; (b) una molécula recombinante que contiene
una pieza adicional de ADN insertada en el sitio BamHI .
Para un mapa más detallado de pUC8, vea la Figura 6.3.

BamHI

gen IacZ'

ampR -gal+
b
(a) pUC8

Nuevo ADN insertado

en el sitio BamHI

ampR -bgal -

(b) Una molécula de pUC8 recombinante

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80 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

( a ) El papel del gen lacZ'

Moléculas de Moléculas
enzimas completas de ÿ-
E.coli lacZ' – incompletas + pUC8 galactosidasa

Gene

pUC8

Fragmento de ÿ-galactosidasa codificado por gen bacteriano

Fragmento de ÿ-galactosidasa codificado por el gen del plásmido

Molécula completa de ÿ-galactosidasa

(b) Detección de recombinantes pUC8

Colonia azul = no recombinante

Agar + X-gal + IPTG

Colonia blanca = recombinante

Colonias azules = ÿ-galactosidasa sintetizada

Producto azul X-gal

Colonias blancas = ÿ-galactosidasa no sintetizada

X-gal sin producto azul

Figura 5.10 La
justificación detrás de la inactivación por inserción del gen lacZ' portado por pUC8. (a) Los genes bacterianos y plasmídicos
se complementan entre sí para producir una molécula de ÿ-galactosidasa funcional. (b) Los recombinantes se seleccionan
sembrando en agar que contiene X-gal e IPTG.

que albergan un plásmido pUC8 normal son ampR y pueden sintetizar b-galactosidasa
(Figura 5.9a); los recombinantes también son ampR pero no pueden producir b-galactosidasa
(Figura 5.9b).
De hecho, la detección de la presencia o ausencia de b-galactosidasa es bastante fácil.
En lugar de analizar la lactosa que se divide en glucosa y galactosa, probamos una reacción
ligeramente diferente que también es catalizada por la b-galactosidasa. Se trata de un
análogo de lactosa llamado X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-bD-galactopiranósido) que la b-
galactosidasa descompone en un producto de color azul intenso. Si se añade X-gal (más un
inductor de la enzima como isopropiltiogalactósido, IPTG) al agar, junto con ampicilina, las
colonias no recombinantes, cuyas células sintetizan b-galactosidasa, se colorearán de azul,
mientras que las recombinantes con un gen lacZ ' interrumpido e incapaz de producir b-
galactosidasa, será blanco. Este sistema, que se denomina selección Lac, se resume en la
figura 5.10b. Tenga en cuenta que tanto la resistencia a la ampicilina como la presencia o
ausencia de b-galactosidasa se prueban en una sola placa de agar. Por lo tanto, los dos
exámenes se llevan a cabo juntos y no hay necesidad del paso de replicación en placa que
requiere mucho tiempo y que es necesario con plásmidos como pBR322.
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Capítulo 5 Introducción del ADN en las células vivas 81

5.3 Introducción de ADN de fago en células bacterianas

Existen dos métodos diferentes mediante los cuales una molécula de ADN recombinante construida
con un vector fago puede introducirse en una célula bacteriana: transfección y empaquetamiento in vitro .

5.3.1 Transfección
La transfección es equivalente a la transformación, siendo la única diferencia que está involucrado el
ADN del fago en lugar de un plásmido. Al igual que con un plásmido, el ADN del fago purificado, o la
molécula del fago recombinante, se mezcla con células competentes de E. coli y se induce la captación
de ADN por choque térmico. La transfección es el método estándar para introducir la forma RF de
doble cadena de un vector de clonación M13 en E. coli.

5.3.2 Envasado in vitro de * vectores de clonación La

transfección con moléculas de ADN e no es un proceso muy eficaz en comparación con la
infección de un cultivo de células con partículas de fago e maduras. Por lo tanto, sería útil
si las moléculas e recombinantes pudieran empaquetarse en sus estructuras e de cabeza
y cola en el tubo de ensayo.
Esto puede sonar difícil, pero en realidad es relativamente fácil de lograr. El empaquetamiento
requiere una serie de proteínas diferentes codificadas por el genoma e, pero éstas se pueden preparar
en una alta concentración a partir de células infectadas con cepas de fagos defectuosas. Se utilizan
dos sistemas diferentes. Con el sistema de cepa única, el fago defectuoso lleva una mutación en los
sitios cos , de modo que la endonucleasa que normalmente escinde los ecatenanos durante la
replicación del fago no los reconoce (pág. 21). Esto significa que el fago defectuoso no puede
replicarse, aunque sí sintetiza directamente todas las proteínas necesarias para el empaquetamiento.
Las proteínas se acumulan en la bacteria y pueden purificarse a partir de cultivos de E. coli infectados
con la e. La preparación de proteína se usa luego para el empaquetamiento in vitro de moléculas e
recombinantes (Figura 5.11a).
Con el segundo sistema se necesitan dos cepas e defectuosas. Ambas cepas portan una mutación
en un gen para uno de los componentes de la cubierta proteica del fago: con una cepa la mutación
está en el gen D y con la segunda cepa está en el gen E (ver Figura 2.9).
Ninguna cepa es capaz de completar un ciclo de infección en E. coli porque en ausencia del producto
del gen mutado no se puede formar la estructura completa de la cápside. En cambio, se acumulan los
productos de todos los demás genes de la proteína de la cubierta (Figura 5.11b). Por lo tanto, se puede
preparar una mezcla de empaquetamiento in vitro combinando lisados de dos cultivos de células, uno
infectado con la cepa e Dÿ y el otro infectado con la cepa Eÿ . La mezcla ahora contiene todos los
componentes necesarios para el envasado in vitro .
Con ambos sistemas, la formación de partículas de fago se logra simplemente al mezclar las
proteínas de empaquetamiento con el ADN e; el ensamblaje de las partículas ocurre automáticamente
en el tubo de ensayo (Figura 5.11c). El ADN e empaquetado se introduce luego en las células de E.
coli simplemente agregando los fagos ensamblados al cultivo bacteriano y permitiendo que tenga lugar
el proceso infeccioso normal.

5.3.3 La infección por fagos se visualiza como placas en un medio de agar La etapa
final del ciclo de infección por fagos es la lisis celular (pág. 18). Si las células infectadas se

esparcen en un medio de agar sólido inmediatamente después de la adición de las partículas de fago,
o inmediatamente
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82 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) Un sistema de envasado de una sola cepa

Las proteínas
ÿ se acumulan
ÿ ADN
en la célula.

E. coli SMR10: el ADN ÿ tiene

sitios cos defectuosos

(b) Un sistema de envasado de dos cepas

ÿ ADN proteínas ÿ ÿ ADN proteínas ÿ

E. coli BHB2688 - ÿ defectuosa para E. coli BHB2690 - ÿ defectuosa para

la síntesis de la proteína E ( ) la síntesis de proteína D ( )

c) Envasado in vitro cos cos cos cos

Cadenas de ADN ÿ

proteínas ÿ de SMR10, o una Partículas de fago ÿ

mezcla de que transportan paquetes
BHB2688 y BHB2690 moléculas de ADN

Figura 5.11

Envasado in vitro . (a) Síntesis de proteínas de la cápside ÿ por la cepa SMR10 de E. coli , que porta un fago ÿ que tiene sitios cos defectuosos .
(b) Síntesis de conjuntos incompletos de proteínas de la cápside ÿ por las cepas BHB2688 y BHB2690 de E. coli . (c) Los lisados celulares
proporcionan el conjunto completo de proteínas de la cápside y pueden empaquetar moléculas de ADN ÿ en el tubo de ensayo.

después de la transfección con ADN del fago, la lisis celular se puede visualizar como placas en un césped
de bacterias (Figura 5.12a). Cada placa es una zona de aclaramiento que se produce cuando los fagos lisan
las células y pasan a infectar y eventualmente lisar a las bacterias vecinas (Figura 5.12b).

Tanto e como M13 forman placas. Con e estas son verdaderas placas, producidas por lisis celular.
Sin embargo, las placas de M13 son ligeramente diferentes ya que M13 no lisa las células huésped (pág. 19).
En cambio, M13 provoca una disminución en la tasa de crecimiento de las células infectadas, suficiente para
producir una zona de limpieza relativa en un césped bacteriano. Aunque no son verdaderas placas, estas
zonas de aclaramiento son visualmente idénticas a las placas de fagos normales (Figura 5.12c).
Por lo tanto, el resultado final de un experimento de clonación de genes utilizando el vector ae o M13 es
una placa de agar cubierta con placas de fago. Cada placa se deriva de una sola célula transfectada o
infectada y, por lo tanto, contiene partículas de fago idénticas. Estos pueden contener moléculas de vector
autoligadas o pueden ser recombinantes.
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Capítulo 5 Introducción del ADN en las células vivas 83

(a) Placas en un césped de bacterias Figura 5.12 Placas

de bacteriófagos. (a) La aparición de placas en

un césped de bacterias. (b) Placas producidas por
Césped de crecimiento
un fago que lisa la célula huésped (p. ej., ÿ en el
bacteriano confluente
ciclo de infección lítica); las placas contienen células
lisadas además de muchas partículas de fago. (c)
Placas producidas por M13; estas placas contienen
Una placa - una bacterias de crecimiento lento además de muchas
zona de limpieza partículas del fago M13.

(b) Placas líticas

Placa: todas las bacterias se

lisan, lo que conduce a un alto
título de bacteriófagos.

césped de bacterias

(c) placas M13

Las placas contienen

bacterias de crecimiento lento y
Partículas de fago M13

5.4 Identificación de fagos recombinantes

Se han ideado una variedad de formas de distinguir las placas recombinantes, siendo las
siguientes las más importantes.

5.4.1 Inactivación por inserción de un gen lacZ' portado por el vector fago Todos
los vectores de clonación M13 (pág. 94), así como varios vectores e, portan una copia
del gen lacZ' . La inserción de nuevo ADN en este gen inactiva la síntesis de b-galactosidasa,
al igual que con el vector plásmido pUC8. Los recombinantes se distinguen por sembrar
células en placas de agar X-gal: las placas que comprenden fagos normales son azules; las
placas recombinantes son claras (Figura 5.13a).

5.4.2 Inactivación por inserción del gen cI * Varios tipos de

vectores de clonación tienen sitios de restricción únicos en el gen cI (posición 38 del mapa
en la Figura 2.9). La inactivación por inserción de este gen provoca un cambio en la
morfología de la placa. Las placas normales parecen “turbias”, mientras que las recombinantes
con un gen cI alterado son “claras” (Figura 5.13b). La diferencia es evidente para el ojo experimentado.

5.4.3 Selección usando el fenotipo Spi Los fagos

normalmente no pueden infectar células de E. coli que ya poseen una forma integrada de un
fago relacionado llamado P2. por lo tanto, se dice que e es Spi+ (sensible al profago P2
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84 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 5.13 (a) Activación por inserción del gen lacZ'

Estrategias para la selección de fagos recombinantes.

Agar + X-gal + IPTG

Placa clara = recombinante

Placa azul = no recombinante

(b) Activación por inserción del gen ÿ cl

Placa clara = recombinante

Placa turbia = no recombinante

(c) Selección usando el fenotipo Spi

Solo el fago ÿ
recombinante puede infectar

ÿ no recombinante: no
puede infectar
profago P2

(d) Selección sobre la base del porque los sitios

tamaño del genoma ÿ

cadena ÿ

Tamaño correcto Paquete

para el embalaje. demasiado pequeño

inhibición). Algunos vectores de clonación están diseñados para que la inserción de nuevo ADN
provoque un cambio de Spi+ a Spiÿ, lo que permite que los recombinantes infecten células que portan
profagos P2. Estas células se utilizan como huésped para experimentos de clonación con estos
vectores; solo los recombinantes son Spiÿ, por lo que solo los recombinantes forman placas (Figura 5.13c).

5.4.4 Selección en base al * tamaño del genoma

El sistema de empaquetamiento electrónico, que ensambla las partículas maduras del fago, solo puede
insertar moléculas de ADN de entre 37 y 52 kb en la estructura de la cabeza. Todo lo que tenga menos
de 37 kb no está empaquetado. Se han construido muchos vectores e eliminando grandes segmentos
de la molécula de ADN e (pág. 98) y, por lo tanto, tienen menos de 37 kb de longitud. Estos solo se
pueden empaquetar en partículas de fagos maduros después de que se haya insertado ADN adicional,
lo que aumenta el tamaño total del genoma hasta 37 kb o más (Figura 5.13d). Por lo tanto, con estos
vectores solo los fagos recombinantes pueden replicarse.
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Capítulo 5 Introducción del ADN en las células vivas 85

5.5 Introducción de ADN en células no bacterianas

También se necesitan formas de introducir ADN en levaduras, hongos, animales y plantas si estos organismos
se van a utilizar como huéspedes para la clonación de genes. Estrictamente hablando, estos procesos no son
"transformación", ya que ese término tiene un significado específico que se aplica solo a la absorción de ADN
por bacterias. Sin embargo, los biólogos moleculares han olvidado esto a lo largo de los años y ahora se usa
"transformación" para describir la absorción de ADN por parte de cualquier organismo.
En términos generales, remojar las células en sal es efectivo solo con unas pocas especies de bacterias,
aunque el tratamiento con cloruro de litio o acetato de litio mejora la absorción de ADN por las células de
levadura y se usa con frecuencia en la transformación de Saccharomyces cerevisiae.
Sin embargo, para la mayoría de los organismos superiores, se necesitan métodos más sofisticados.

5.5.1 Transformación de células individuales

En la mayoría de los organismos, la principal barrera para la captación de ADN es la pared celular. Las células
animales cultivadas, que normalmente carecen de paredes celulares, se transforman fácilmente, especialmente
si el ADN se precipita sobre la superficie celular con fosfato de calcio (Figura 5.14a) o se encierra en liposomas
que se fusionan con la membrana celular (Figura 5.14b). Para otros tipos de células, la respuesta suele ser
eliminar la pared celular. Las enzimas que degradan las paredes celulares de levaduras, hongos y plantas
están disponibles y, en las condiciones adecuadas, se pueden obtener protoplastos intactos (Figura 5.14c).
Por lo general, los protoplastos captan el ADN con bastante facilidad, pero la transformación puede estimularse
mediante técnicas especiales, como la electroporación, durante la cual las células se someten a un pulso
eléctrico corto, que se cree que induce la formación transitoria de poros en la membrana celular, a través de
los cuales se liberan las moléculas de ADN. capaz de entrar en la celda. Después de la transformación, los
protoplastos se lavan para eliminar las enzimas degradantes y la pared celular se vuelve a formar
espontáneamente.
A diferencia de los sistemas de transformación descritos hasta ahora, existen dos métodos físicos para
introducir ADN en las células. El primero de ellos es la microinyección, que utiliza una pipeta muy fina para
inyectar moléculas de ADN directamente en el núcleo de las células a transformar (Figura 5.15a). Esta técnica
se aplicó inicialmente a células animales pero posteriormente ha tenido éxito con células vegetales. El segundo
método involucra el bombardeo de las células con microproyectiles de alta velocidad, generalmente partículas
de oro o tungsteno que han sido recubiertas con ADN. Estos microproyectiles se disparan a las células desde
un cañón de partículas (Figura 5.15b). Esta técnica inusual se denomina biolística y se ha utilizado con varios
tipos diferentes de células.

5.5.2 Transformación de organismos completos Con animales y

plantas, el producto final deseado podría no ser células transformadas, sino un organismo transformado. Las
plantas son relativamente fáciles de regenerar a partir de células cultivadas, aunque se han experimentado
problemas en el desarrollo de procedimientos de regeneración para especies monocotiledóneas tales como
cereales y gramíneas. Por lo tanto, una sola célula vegetal transformada puede dar lugar a una planta
transformada, que lleva el ADN clonado en cada célula y pasa el ADN clonado a su progenie después de la
floración y la formación de semillas (ver Figura 7.13). Los animales, por supuesto, no pueden regenerarse a
partir de células cultivadas, por lo que obtener animales transformados requiere un enfoque bastante más sutil.
Una técnica con mamíferos como los ratones es extraer óvulos fertilizados del oviducto, microinyectar ADN y
luego reimplantar las células transformadas en el tracto reproductivo de la madre. Veremos más de cerca estos
métodos para obtener animales transformados en el Capítulo 13.
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86 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) Precipitación de ADN sobre células animales

Solución de fosfato de
calcio

ADN precipitado sobre

la superficie celular

Monocapa de
células animales

(b) Fusión con liposomas que contienen ADN

Célula animal

Fusión

liposoma fusionado
ADN
Transferencia de
liposomas ADN al núcleo.

(c) Transformación de protoplastos vegetales

Entrada de ADN

Degradar la Reformar la Regenerar

pared celular pared celular planta

Núcleo

Vacuolas

Célula vegetal Protoplasto Célula vegetal planta transformada

transformada

Figura 5.14

Estrategias para introducir ADN nuevo en células animales y vegetales: (a) precipitación de ADN en células animales;
(b) introducción de ADN en células animales mediante fusión de liposomas; (c) transformación de protoplastos vegetales.

Figura 5.15 Dos (a) Microinyección

métodos físicos para introducir ADN en

las células.

Núcleo

solución de ADN

(b) Transformación con microproyectiles

Células objetivo

Percutor Carga microproyectiles

Células diana
bombardeadas con
microproyectiles
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Capítulo 5 Introducción del ADN en las células vivas 87

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Calvin, NM & Hanawalt, PC (1988) Transformación de alta eficiencia de células bacterianas por
electroporación. Revista de Bacteriología, 170, 2796–2801.
Capecchi, MR (1980) Transformación de alta eficiencia por microinyección directa de ADN en
células de mamífero cultivadas. Celda, 22, 479–488.
Hammer, RE, Pursel, VG, Rexroad, CE et al. (1985) Producción de conejos, ovejas y cerdos transgénicos
por microinyección. Naturaleza, 315, 680–683.
Hohn, B. (1979) Empaquetado in vitro de ADN lambda y cósmido. Métodos en Enzimología,
68, 299–309.
Klein, TM, Wolf, ED, Wu, R. & Sanford, JC (1987) Microproyectiles de alta velocidad para entregar
ing ácidos nucleicos en las células vivas. Naturaleza, 327, 70–73. [Biolística.]
Lederberg, J. & Lederberg, EM (1952) Placas de réplica y selección indirecta de bacterias
mutantes Revista de Bacteriología, 63, 399–406.
Mandel, M. & Higa, A. (1970) Infección por ADN de bacteriófagos dependientes de calcio. Revista de
Biología Molecular, 53, 159–162. [La primera descripción del uso de cloruro de calcio para preparar
células competentes de E. coli .]
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Capítulo 6

Vectores de clonación
para E. coli

Contenido del capítulo

CONTENIDO DEL CAPÍTULO

6.1 Vectores de clonación basados en plásmidos de E.

coli 6.2 Vectores de clonación basados en bacteriófago M13
6.3 Vectores de clonación basados en bacteriófago e 6.4 e
y otros vectores de alta capacidad permiten construir bibliotecas genómicas 6.5 Vectores para
otras bacterias

Ya se han descrito las técnicas experimentales básicas implicadas en la clonación de genes.

En los capítulos 3, 4 y 5 hemos visto cómo se purifica el ADN a partir de extractos celulares, cómo se
construyen las moléculas de ADN recombinante en el tubo de ensayo, cómo se reintroducen las
moléculas de ADN en las células vivas y cómo se distinguen los clones recombinantes. Ahora debemos
mirar más de cerca el vector de clonación en sí mismo, para considerar la gama de vectores disponibles
para el biólogo molecular y comprender las propiedades y usos de cada tipo individual.

Existe la mayor variedad de vectores de clonación para uso con E. coli como organismo huésped.
Esto no es sorprendente en vista del papel central que ha jugado esta bacteria en la investigación básica
durante los últimos 50 años. La enorme riqueza de información que existe sobre la microbiología, la
bioquímica y la genética de E. coli ha significado que prácticamente todos los estudios fundamentales
de la estructura y función de los genes se llevaron a cabo inicialmente con esta bacteria como organismo
experimental. Incluso cuando se está estudiando un eucariota, E. coli todavía se usa como caballo de
batalla para la preparación de ADN clonado para la secuenciación y para la construcción de genes
recombinantes que posteriormente se colocarán nuevamente en el huésped eucariota para estudiar su
función y expresión.
En los últimos años, la clonación de genes y la investigación en biología molecular se han vuelto
mutuamente sinérgicas: los avances en la clonación de genes han actuado como un estímulo para la
investigación, y las necesidades de la investigación han estimulado el desarrollo de vectores de clonación
nuevos y más sofisticados.

88 Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010
por Blackwell Publishing.
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Capítulo 6 Vectores de clonación para E. coli 89

En este capítulo se describirán los tipos más importantes de vector de clonación de E. coli y se describirán
sus usos específicos. En el Capítulo 7, se considerarán los vectores de clonación para levaduras, hongos,
plantas y animales.

6.1 Vectores de clonación basados en plásmidos de E. coli

Los vectores de clonación más sencillos, y los más utilizados en la clonación de genes, son los basados en
pequeños plásmidos bacterianos. Hay disponible una gran cantidad de vectores de plásmidos diferentes para
su uso con E. coli, muchos de los cuales se pueden obtener de proveedores comerciales. Combinan la facilidad
de purificación con propiedades deseables, como una alta eficiencia de transformación, marcadores
seleccionables convenientes para transformantes y recombinantes, y la capacidad de clonar piezas de ADN
razonablemente grandes (hasta aproximadamente 8 kb). La mayoría de los experimentos de clonación de
genes "rutinarios" hacen uso de uno u otro de estos vectores plasmídicos.
Uno de los primeros vectores que se desarrolló fue pBR322, que se presentó en el Capítulo 5 para ilustrar
los principios generales de la selección de transformantes y la identificación de recombinantes (pág. 77).
Aunque pBR322 carece de las características más sofisticadas de los vectores de clonación más nuevos y,
por lo tanto, ya no se usa mucho en la investigación, aún ilustra las propiedades fundamentales e importantes
de cualquier vector de clonación de plásmido. Por lo tanto, comenzaremos nuestro estudio de los vectores de
E. coli mirando más de cerca a pBR322.

6.1.1 La nomenclatura de los vectores de clonación de plásmidos

El nombre “pBR322” cumple con las reglas estándar para la nomenclatura de vectores:

l "p" indica que esto es de hecho un plásmido. l “BR”

identifica el laboratorio en el que se construyó originalmente el vector
(BR significa Bolívar y Rodríguez, los dos investigadores que desarrollaron pBR322).
l “322” distingue este plásmido de otros desarrollados en el mismo laboratorio (también existen plásmidos
llamados pBR325, pBR327, pBR328, etc.).

6.1.2 Las propiedades útiles de pBR322

El mapa genético y físico de pBR322 (Figura 6.1) da una indicación de por qué este plásmido fue un vector de
clonación tan popular.
La primera característica útil de pBR322 es su tamaño. En el Capítulo 2 se indicó que un vector de
clonación debe tener un tamaño inferior a 10 kb, para evitar problemas como la descomposición del ADN.

EcoRI HindIII Figura 6.1 Un

velcro BamHI mapa de pBR322 que muestra las posiciones de
PvuI los genes de resistencia a ampicilina (ampR ) y
resistencia a tetraciclina (tetR ), el origen de
ampR
tetR replicación (ori) y algunos de los sitios de restricción
PstI más importantes.

4363 pb SalI

o
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90 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

durante la purificación. pBR322 tiene 4363 pb, lo que significa que no solo se puede purificar el vector
con facilidad, sino que también se pueden construir moléculas de ADN recombinante con él. Incluso con
6 kb de ADN adicional, una molécula de pBR322 recombinante sigue teniendo un tamaño manejable.
La segunda característica de pBR322 es que, como se describe en el Capítulo 5, porta dos conjuntos
de genes de resistencia a los antibióticos. Se puede utilizar la resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina
como marcador seleccionable para las células que contienen el plásmido, y cada gen marcador incluye
sitios de restricción únicos que se pueden utilizar en experimentos de clonación. La inserción de ADN
nuevo en pBR322 que se ha restringido con PstI, PvuI o ScaI inactiva el gen ampR , y la inserción usando
cualquiera de las ocho endonucleasas de restricción (principalmente BamHI y HindIII) inactiva la
resistencia a la tetraciclina. Esta gran variedad de sitios de restricción que se pueden usar para la
inactivación por inserción significa que pBR322 se puede usar para clonar fragmentos de ADN con varios
tipos de extremos cohesivos.
Una tercera ventaja de pBR322 es que tiene un número de copias razonablemente alto. Por lo general,
hay alrededor de 15 moléculas presentes en una célula de E. coli transformada , pero este número se
puede aumentar, hasta 1000–3000, mediante la amplificación del plásmido en presencia de un inhibidor
de la síntesis de proteínas como el cloranfenicol (pág. 39). Por lo tanto, un cultivo de E. coli proporciona
un buen rendimiento de moléculas de pBR322 recombinantes.

6.1.3 El pedigrí de pBR322

La notable conveniencia de pBR322 como vector de clonación no surgió por casualidad.
De hecho, el plásmido se diseñó de tal manera que la construcción final poseyera estas propiedades
deseables. En la Figura 6.2a se muestra un esquema del esquema utilizado para construir pBR322. Se
puede ver que su producción fue un asunto tortuoso que requirió el uso completo y hábil de las técnicas
de manipulación de ADN descritas en el Capítulo 4. En la Figura 6.2b se proporciona un resumen del
resultado de estas manipulaciones, de donde se puede ver que pBR322 comprende ADN derivado de
tres plásmidos naturales diferentes. El gen ampR residía originalmente en el plásmido R1, un plásmido
típico de resistencia a antibióticos que se presenta en poblaciones naturales de E. coli (pág. 17). El gen
tetR se deriva de R6-5, un segundo plásmido resistente a los antibióticos. El origen de replicación de
pBR322, que dirige la multiplicación del vector en las células huésped, es originalmente de pMB1, que
está estrechamente relacionado con el plásmido productor de colicina ColE1 (pág. 17).

6.1.4 Vectores de clonación de plásmidos de E. coli más sofisticados

pBR322 se desarrolló a fines de la década de 1970 y el primer artículo de investigación que describe su
uso se publicó en 1977. Desde entonces, se han construido muchos otros vectores de clonación de
plásmidos, la mayoría de los cuales derivan de pBR322 mediante manipulaciones similares a las
resumidas en la figura 6.2a. Uno de los primeros fue pBR327, que se produjo eliminando un segmento
de 1089 pb de pBR322. Esta eliminación dejó intactos los genes ampR y tetR , pero cambió las
capacidades de replicación y conjugación del plásmido resultante.
Como resultado, pBR327 se diferencia de pBR322 en dos formas importantes:

l pBR327 tiene un número de copias mayor que pBR322, estando presente en alrededor de 30 a 45
moléculas por célula de E. coli . Esto no es de gran relevancia en lo que respecta al rendimiento
de plásmidos, ya que ambos plásmidos se pueden amplificar para copiar números superiores a 1000.
Sin embargo, el mayor número de copias de pBR327 en células normales hace que este vector
sea más adecuado si el objetivo del experimento es estudiar la función del gen clonado. En estos
casos la dosificación del gen cobra importancia, ya que cuantas más copias haya
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Capítulo 6 Vectores de clonación para E. coli 91

(a) Construcción de pBR322

tetR

R1 R6-5
Tn3
ampR ColE1
EcoRI*
Tn3 recircularizado
tetR
fragmento
EcoRI* pSC101

pSF2124 Fragmento EcoRI*

Tn3 en el sitio EcoRI
ampR

Tn3 pMB8
tetR
veces
pMB9 EcoRI

ampR tetR

pBR312 pMB1

o o
ampR

Reordenamiento tetR
pBR313

o ampR
Dos
tetR
(b) Los orígenes de pBR322 fragmentos pBR322
1R R
ligados veces

-
6
5
ampR
tetR

pagMETRO
B1

Figura 6.2 El
pedigrí de pBR322. (a) Las manipulaciones involucradas en la construcción de pBR322. (b) Un resumen de los orígenes de pBR322.

son de un gen clonado, más probable es que el efecto del gen clonado en la célula huésped
sea detectable. pBR327, con su alto número de copias, es por lo tanto una mejor opción
que pBR322 para este tipo de trabajo. l La eliminación también destruye la capacidad
conjugativa de pBR322, lo que convierte a pBR327 en un plásmido no conjugativo que no
puede dirigir su propia transferencia a otras células de E. coli . Esto es importante para la
contención biológica, evitando la posibilidad de que una molécula pBR327 recombinante
se escape del tubo de ensayo y colonice bacterias en el intestino de un biólogo molecular
descuidado. Por el contrario, pBR322 teóricamente podría pasar a poblaciones naturales de
E. coli por conjugación, aunque de hecho pBR322 también tiene salvaguardas (aunque menos
sofisticadas) para minimizar las posibilidades de que esto suceda. Sin embargo, pBR327 es
preferible si el gen clonado es potencialmente dañino en caso de que ocurra un accidente.

Aunque pBR327, como pBR322, ya no se usa ampliamente, sus propiedades han sido
heredadas por la mayoría de los vectores plásmidos modernos de hoy. Hay un gran número de
estos, y sería inútil tratar de describirlos a todos. Dos ejemplos adicionales serán suficientes para
ilustrar las características más importantes.
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92 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) pUC8 (b) Sitios de restricción en pUC8 ( c ) Sitios de restricción en pUC18

HindIII

ampR SpI
PstI
HindIII pUC18
2750 pb pUC8 SalI, AccI, Hincll
PstI
lacZ' wxya
SalI, AccI, Hincll
o grupo de lacZ' lacZ' BamHI
BamHI
sitios pequeño, navidad
pequeño, navidad
EcoRI KpnI
bolsas

EcoRI

(d) Transporte de un fragmento de ADN de pUC8 a M13mp8

pUC8 M13mp8
BamHI
recombinante
Nuevo ADN Sitios de
BamHI
EcoRI restricción
Restringir con
Restringir EcoRI BamHI y EcoRI
con BamHI y Vincularse
EcoRI

recombinante
BamHI
M13mp8
Nuevo ADN
EcoRI

Figura 6.3 Los

plásmidos pUC. ( a ) La estructura de pUC8. ( b ) El grupo de sitios de restricción en el gen lacZ ' de pUC8. ( c ) El grupo de sitios
de restricción en pUC18. (d) Traslado de un fragmento de ADN de pUC8 a M13mp8.

pUC8: un plásmido de selección

Lac Este vector se mencionó en el Capítulo 5 cuando se describió la identificación de recombinantes
mediante la inactivación por inserción del gen de la b-galactosidasa (pág. 79). pUC8 (Figura 6.3a)
desciende de pBR322, aunque solo quedan el origen de replicación y el gen ampR . La secuencia
de nucleótidos del gen ampR se ha cambiado para que ya no contenga los sitios de restricción
únicos: todos estos sitios de clonación ahora están agrupados en un segmento corto del gen lacZ'
que porta pUC8. pUC8 tiene tres ventajas importantes que lo han llevado a convertirse en uno de
los vectores de clonación de E. coli más populares. El primero de ellos es fortuito: las
manipulaciones involucradas en la construcción de pUC8 estuvieron acompañadas de una mutación
aleatoria, dentro del origen de la replicación, lo que da como resultado que el plásmido tenga un
número de copias de 500 a 700 incluso antes de la amplificación. Esto tiene un efecto significativo
sobre el rendimiento de ADN clonado obtenible a partir de células de E. coli transformadas con
plásmidos pUC8 recombinantes.
La segunda ventaja es que la identificación de las células recombinantes se puede lograr
mediante un proceso de un solo paso, colocando placas en un medio de agar que contiene ampicilina
más X-gal (pág. 79). Tanto con pBR322 como con pBR327, la selección de recombinantes es un
procedimiento de dos pasos, que requiere replicación en placas de un medio antibiótico a otro (pág.
78). Por lo tanto, se puede realizar un experimento de clonación con pUC8 en la mitad del tiempo
que se necesita con pBR322 o pBR327.
La tercera ventaja de pUC8 radica en la agrupación de los sitios de restricción, lo que permite
clonar un fragmento de ADN con dos extremos cohesivos diferentes (por ejemplo, EcoRI en un
extremo y BamHI en el otro) sin recurrir a manipulaciones adicionales, como la unión del enlazador
(Figura 6.3b). Otros vectores pUC llevan diferentes combinaciones de restricciones.
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Capítulo 6 Vectores de clonación para E. coli 93

(a) pGEM3Z Figura 6.4

pGEM3Z. (a) Mapa del vector. (b) Síntesis de
ampR
ARN in vitro . R = grupo de sitios de restricción
2750 pb para EcoRI, SacI, KpnI, AvaI, SmaI, BamHI,
promotor T7 XbaI, SalI, AccI, HincII, PstI, SphI y HindIII.
lacZ'
o
R

promotor SP6

(b) Síntesis de ARN in vitro

promotor T7

inserto de ADN

ARN
polimerasa T7

Transcripciones de ARN

sitios y proporcionan una flexibilidad aún mayor en los tipos de fragmentos de ADN que se
pueden clonar (Figura 6.3c). Además, las agrupaciones de sitios de restricción en estos vectores
son las mismas que las agrupaciones en la serie equivalente de vectores M13mp (pág. 95). Por
lo tanto, el ADN clonado en un miembro de la serie pUC puede transferirse directamente a su
homólogo M13mp, lo que permite obtener el gen clonado como ADN monocatenario (Figura 6.3d).

pGEM3Z: transcripción in vitro de ADN clonado

pGEM3Z (Figura 6.4a) es muy similar a un vector pUC: lleva los genes ampR y lacZÿ , este último
contiene un grupo de sitios de restricción y tiene casi exactamente el mismo tamaño. La distinción
es que pGEM3Z tiene dos fragmentos cortos de ADN adicionales, cada uno de los cuales actúa
como sitio de reconocimiento para la unión de una enzima ARN polimerasa. Estas dos secuencias
promotoras se encuentran a ambos lados del grupo de sitios de restricción usados para la
introducción de nuevo ADN en la molécula pGEM3Z. Esto significa que si una molécula de
pGEM3Z recombinante se mezcla con ARN polimerasa purificada en el tubo de ensayo, se
produce la transcripción y se sintetizan copias de ARN del fragmento clonado (Figura 6.4b). El
ARN que se produce podría usarse como sonda de hibridación (pág. 133), o podría ser necesario
para experimentos destinados a estudiar el procesamiento del ARN (p. ej., la eliminación de
intrones) o la síntesis de proteínas.
Los promotores portados por pGEM3Z y otros vectores de este tipo no son las secuencias
estándar reconocidas por la ARN polimerasa de E. coli . En cambio, uno de los promotores es
específico para la ARN polimerasa codificada por el bacteriófago T7 y el otro para la ARN
polimerasa del fago SP6. Estas polimerasas de ARN se sintetizan durante la infección de E. coli
con uno u otro de los fagos y son responsables de transcribir los genes del fago. Se eligen para
su uso en la transcripción in vitro ya que son enzimas muy activas; recuerde que todo el ciclo de
infección lítica dura solo 20 minutos (pág. 18), por lo que el
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94 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

los genes del fago deben transcribirse muy rápidamente. Estas polimerasas pueden sintetizar de 1 a 2
mg de ARN por minuto, mucho más de lo que puede producir la enzima estándar de E. coli .

6.2 Vectores de clonación basados en el bacteriófago M13

El requisito más esencial para cualquier vector de clonación es que tenga un medio para replicarse en
la célula huésped. Para los vectores de plásmidos, este requisito es fácil de satisfacer, ya que las
secuencias de ADN relativamente cortas pueden actuar como orígenes de replicación de plásmidos, y la
mayoría, si no todas, las enzimas necesarias para la replicación son proporcionadas por la célula
huésped. Las manipulaciones elaboradas, como las que dieron como resultado pBR322 (ver Figura 6.2a),
son por lo tanto posibles siempre que la construcción final tenga un origen de replicación funcional intacto.
Con bacteriófagos como M13 y e, la situación en cuanto a la replicación es más compleja. Las
moléculas de ADN del fago generalmente portan varios genes que son esenciales para la replicación,
incluidos los genes que codifican los componentes de la cubierta proteica del fago y las enzimas
replicativas del ADN específicas del fago. La alteración o eliminación de cualquiera de estos genes
afectará o destruirá la capacidad replicativa de la molécula resultante. Por lo tanto, hay mucha menos
libertad para modificar las moléculas de ADN del fago y, en general, los vectores de clonación del fago
son solo ligeramente diferentes de la molécula original.

6.2.1 Cómo construir un vector de clonación de fagos

Los problemas en la construcción de un vector de clonación de fagos se ilustran considerando M13.
El genoma M13 normal tiene una longitud de 6,4 kb, pero la mayor parte está ocupada por diez genes
estrechamente empaquetados (Figura 6.5), cada uno de los cuales es esencial para la replicación del
fago. Solo hay una única secuencia intergénica de 507 nucleótidos en la que se podría insertar ADN
nuevo sin alterar uno de estos genes, y esta región incluye el origen de replicación que debe permanecer
intacto. Claramente, solo hay un alcance limitado para modificar el genoma M13.

El primer paso en la construcción de un vector de clonación M13 fue introducir el gen lacZ' en la
secuencia intergénica. Esto dio lugar a M13mp1, que forma placas azules en agar X-gal (Figura 6.6a).
M13mp1 no posee ningún sitio de restricción único en el gen lacZ' . Sin embargo, contiene el
hexanucleótido GGATTC cerca del comienzo del gen. Un solo cambio de nucleótido haría este GAATTC,
que es un sitio EcoRI .
Esta alteración se realizó mediante mutagénesis in vitro (pág. 200), dando como resultado M13mp2

ES
Figura 6.5 El
o
genoma M13, que muestra las
posiciones de los genes I a X. IV
II

EN

VII
6407 pb IX
viii

yo

NOSOTROS

tercero
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Capítulo 6 Vectores de clonación para E. coli 95

(a) Construcción de M13mp1

lacZ'
Restricción,
o ligadura o
IV II IV
M13 II
M13mp1

(b) Construcción de M13mp2 EcoRI

o lacZ' Mutagénesis in vitro o lacZ'

IV II IV II
M13mp1 M13mp2

de thr met ile thr áspid ser

Inicio de lacZ' en M13mp1
ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA
*
de thr met ile thr como ser
Comienzo de lacZ' en M13mp2
ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCA
*
EcoRI

Figura 6.6
Construcción de (a) M13mp1 y (b) M13mp2 a partir del genoma de M13 de tipo salvaje.

(Figura 6.6b). M13mp2 tiene un gen lacZ' ligeramente alterado (el sexto codón ahora especifica
asparagina en lugar de ácido aspártico), pero la enzima b-galactosidasa producida por células
infectadas con M13mp2 sigue siendo perfectamente funcional.
El siguiente paso en el desarrollo de vectores M13 fue introducir sitios de restricción
adicionales en el gen lacZ' . Esto se logró sintetizando en el tubo de ensayo un oligonucleótido
corto, denominado policonector, que consta de una serie de sitios de restricción y tiene extremos
cohesivos EcoRI (Figura 6.7a). Este polienlazador se insertó en el sitio EcoRI de M13mp2 para
dar M13mp7 (Figura 6.7b), un vector más complejo con cuatro posibles sitios de clonación (EcoRI,
BamHI, SalI y PstI). El policonector está diseñado para que no

(a) El policonector

Automóvil club británico TT C C C C GRAMO GRAMO A T C C T C A C C T

GRAMO CA T C A C
GRAMO A T CC GRAMO GRAMO GRAMO GRAMO GRAMO GRAMO GRAMO GRAMO GRAMO GRAMO

· · · · · · ··· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·
GRAMO GRAMO GRAMO GRAMO C C T A GRAMO GRAMO C A GRAMO C T GRAMO GRAMO A C GRAMO T C C A GRAMO C T GRAMO C C T A GRAMO GRAMO C C C C TT una

EcoRI BamHI SalI PstI SalI BamHI EcoRI

AccI AccI
Hinc III Hinc III

(b) Construcción de M13mp7

Sitios de restricción
EcoRI

EcoRI, lacZ'
lacZ' o
o ligasa

IV M13mp2 II IV M13mp7 II

polienlazador

Figura 6.7
Construcción de M13mp7: (a) el policonector y (b) su inserción en el sitio EcoRI de M13mp2. Tenga en cuenta que los
sitios de restricción SalI también son reconocidos por AccI y HincII.
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96 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

no interrumpe totalmente el gen lacZ' : se mantiene un marco de lectura en todo el polienlazador

y todavía se produce una enzima b-galactosidasa funcional, aunque alterada.
Los vectores M13 más sofisticados tienen polienlazadores más complejos insertados en el gen
lacZ' . Un ejemplo es M13mp8, que tiene la misma serie de sitios de restricción que el plásmido
pUC8 (pág. 92). Al igual que con el vector de plásmido, una ventaja de M13mp8 es su capacidad
para tomar fragmentos de ADN con dos extremos cohesivos diferentes.

6.2.2 Vectores híbridos plásmido-M13

Aunque los vectores M13 son muy útiles para la producción de versiones monocatenarias de
genes clonados, tienen una desventaja. Hay un límite en el tamaño del fragmento de ADN que se
puede clonar con un vector M13, generalmente se considera que 1500 pb es la capacidad máxima,
aunque ocasionalmente se han clonado fragmentos de hasta 3 kb. Para solucionar este problema,
se han desarrollado varios vectores híbridos ("fagémidos") mediante la combinación de una parte
del genoma de M13 con el ADN del plásmido.
pEMBL8 proporciona un ejemplo (Figura 6.8a), que se hizo transfiriendo a pUC8 un fragmento
de 1300 pb del genoma M13. Esta pieza de ADN M13 contiene

Figura 6.8 (a) pEMBL8

Fragmento
pEMBL8: un plásmido híbrido–vector M13 que de ADN M13
se puede convertir en ADN monocatenario.

3997 pb
ampR

lacZ' Grupo de sitios (ver

fig. 6.3b)

(b) Conversión de pEMBL8 en ADN monocatenario

proteína de
replicación M13

Región M13 La proteína M13

replica pEMBL8 en ADN
monocatenario

pEMBL8 de doble
cadena

Moléculas pEMBL8
monocatenarias

Partículas de 'fago'
pEMBL8
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Capítulo 6 Vectores de clonación para E. coli 97

la secuencia señal reconocida por las enzimas que convierten la molécula M13 bicatenaria normal en
ADN monocatenario antes de la secreción de nuevas partículas de fago. Esta secuencia señal sigue
siendo funcional aunque esté separada del resto del genoma de M13, por lo que las moléculas de
pEMBL8 también se convierten en ADN monocatenario y se secretan como partículas de fago
defectuosas (Figura 6.8b). Todo lo que se necesita es que las células de E. coli utilizadas como
huéspedes para un experimento de clonación de pEMBL8 se infecten posteriormente con M13 normal
para que actúe como un fago auxiliar, proporcionando las enzimas replicativas y las proteínas de la
cubierta del fago necesarias. pEMBL8, derivado de pUC8, tiene los sitios de clonación del polienlazador
dentro del gen lacZ' , por lo que las placas recombinantes pueden identificarse de la manera estándar
en agar que contiene X-gal. Con pEMBL8, se pueden obtener versiones monocatenarias de fragmentos
de ADN clonados de hasta 10 kb de longitud, lo que amplía en gran medida el rango del sistema de clonación M13.

6.3 Vectores de clonación basados en 8 bacteriófagos

Había que resolver dos problemas antes de poder desarrollar vectores de clonación basados en e:

l La molécula de ADN e puede aumentar de tamaño solo alrededor del 5 %, lo que representa la
adición de solo 3 kb de ADN nuevo. Si el tamaño total de la molécula es superior a 52 kb,
entonces no se puede empaquetar en la estructura de cabeza e y no se forman partículas de
fago infectivas. Esto limita severamente el tamaño de un fragmento de ADN que se puede
insertar en un vector e no modificado (Figura 6.9a).
l El genoma e es tan grande que tiene más de una secuencia de reconocimiento para
prácticamente todas las endonucleasas de restricción. La restricción no se puede usar para
escindir la molécula e normal de una manera que permita la inserción de nuevo ADN, porque
la molécula se cortaría en varios fragmentos pequeños que sería muy poco probable que
vuelvan a formar un genoma e viable en la religación (Figura 6.9b ).

En vista de estas dificultades, quizás sea sorprendente que se haya desarrollado una amplia
variedad de vectores de clonación e, siendo su uso principal clonar grandes fragmentos de ADN, de 5
a 25 kb, demasiado grandes para ser manipulados por plásmidos o vectores M13.

(a) La limitación de tamaño Figura 6.9 Los dos

Genoma ÿ normal 49 Posible recombinante > 52 problemas que debían resolverse antes de poder
kb kb
desarrollar los vectores de clonación ÿ . (a) La limitación
de tamaño impuesta al genoma ÿ por la necesidad de
ADN nuevo
> 3 kb empaquetarlo en la cabeza del fago. (b) El ADN ÿ tiene
múltiples sitios de reconocimiento para casi todas las
endonucleasas de restricción.
Demasiado grande

para empaquetar

Paquetes

(b) Múltiples sitios de restricción

1 2 3 4 5 6
EcoRI

EcoRI

1
2 3
Mezcla compleja de religación
4 5
6 de moléculas
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98 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 6.10 El
mapa genético ÿ , que muestra la posición de
la principal región no esencial que se puede Componentes
cápside
de
la b2 Integración
yescisión Regulación
temprana síntesis
ADN
de Regulación
tardía huésped
lisis
del

eliminar sin afectar la capacidad del fago para

seguir el ciclo de infección lítica. Hay otras
regiones no esenciales mucho más cortas en
otras partes del genoma.

6.3.1 Los segmentos del * genoma pueden eliminarse sin afectar

la viabilidad
El camino a seguir para el desarrollo de vectores de clonación e fue proporcionado por el
descubrimiento de que un gran segmento en la región central de la molécula de ADN e puede
eliminarse sin afectar la capacidad del fago para infectar células de E. coli . La eliminación de toda o
parte de esta región no esencial, entre las posiciones 20 y 35 en el mapa que se muestra en la Figura
2.9, disminuye el tamaño de la molécula e resultante hasta en 15 kb. Esto significa que ahora se
pueden agregar hasta 18 kb de ADN nuevo antes de que se alcance el punto de corte para el
empaquetamiento (Figura 6.10).
De hecho, esta región "no esencial" contiene la mayoría de los genes implicados en la integración
y escisión del profago e del cromosoma de E. coli . Por lo tanto, un genoma e eliminado no es
lisogénico y solo puede seguir el ciclo de infección lítica. Esto en sí mismo es deseable para un
vector de clonación, ya que significa que no es necesaria la inducción antes de que se formen las
placas (pág. 40).

6.3.2 La selección natural se puede utilizar para aislar * modificados que

carecen de ciertos sitios de restricción
Incluso un genoma e eliminado, con la región no esencial eliminada, tiene múltiples sitios de
reconocimiento para la mayoría de las endonucleasas de restricción. Este es un problema que se
encuentra a menudo cuando se desarrolla un nuevo vector. Si solo se necesita eliminar uno o dos
sitios, se puede usar la técnica de mutagénesis in vitro (pág. 200). Por ejemplo, un sitio EcoRI ,
GAATTC, podría cambiarse a GGATTC, que no es reconocido por la enzima.
Sin embargo, la mutagénesis in vitro estaba en su infancia cuando los primeros vectores e estaban
en desarrollo, e incluso hoy en día no sería un medio eficaz para cambiar más que unos pocos sitios
en una sola molécula.
En su lugar, se utilizó la selección natural para proporcionar cepas de e que carecen de los sitios
de restricción no deseados. La selección natural puede entrar en juego utilizando como huésped una
cepa de E. coli que produce EcoRI. La mayoría de las moléculas de ADN que invaden la célula son
destruidas por esta endonucleasa de restricción, pero algunas sobreviven y producen placas. Estos
son fagos mutantes, de los cuales uno o más sitios EcoRI se han perdido espontáneamente (Figura
6.11). Varios ciclos de infección eventualmente darán como resultado moléculas e que carecen de
todos o la mayoría de los sitios EcoRI .

6.3.3 Vectores de inserción y reemplazo

Una vez resueltos los problemas planteados por las limitaciones de empaquetado y por los múltiples
sitios de restricción, quedó abierto el camino para el desarrollo de diferentes tipos de vectores de
clonación basados en e. Las dos primeras clases de vectores que se produjeron fueron vectores de
inserción y reemplazo (o sustitución).
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Capítulo 6 Vectores de clonación para E. coli 99

5 sitios EcoRI Figura 6.11 Uso de

la selección natural para aislar el fago ÿ que carece de

sitios de restricción EcoRI .
ADN ÿ normal

Infectar células de E.
coli productoras de EcoRI

Solo 3 sitios
EcoRI

Placa formada
por fago mutante

Muy pocas placas

Infección repetida
con fago mutante

Sin sitios
EcoRI

Segunda cepa de
fago mutante

Algunas placas más

(a) Construcción de un vector de inserción ÿ Figura 6.12 vectores

ADN ÿ normal vector de inserción de inserción ÿ . P = policonector en el gen lacZ' de ÿZAPII,

(49 kb) escindir, ligar ÿ (35–40 kb) que contiene sitios de restricción únicos para SacI, NotI,
XbaI, SpeI, EcoRI y XhoI.

Región no
esencial

(b) ÿgt10 (c) ÿZAPII

EcoRI PAG

40 KB 41 KB

Supresión cl lacZ' Supresión

Vectores de
inserción Con un vector de inserción (Figura 6.12a), se eliminó un gran segmento de la región no
esencial y se ligaron los dos brazos. Un vector de inserción posee al menos un sitio de restricción
único en el que se puede insertar nuevo ADN. El tamaño del fragmento de ADN que puede
transportar un vector individual depende, por supuesto, del grado en que se haya delecionado la
región no esencial. Dos vectores de inserción populares son:

l Egt10 (Figura 6.12b), que puede transportar hasta 8 kb de ADN nuevo, insertado en un
único sitio EcoRI ubicado en el gen cI. La inactivación por inserción de este gen significa que
los recombinantes se distinguen como placas claras en lugar de placas turbias (pág. 83).
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100 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) Clonación con un vector de reemplazo ÿ

Restringir, atar

Nuevo ADN

Fragmento de relleno

(b) ÿEMBL4
EcoRI, BamHI, SalI o
una combinación

RBS SBR ADN nuevo,

hasta 23 kb

R = EcoRI B = BamHI S = SalI

Figura 6.13
Vectores de reemplazo ÿ . (a) Clonación con un vector de reemplazo ÿ . (b) Clonación con ÿEMBL4.

l EZAPII (Figura 6.12c), con el que se inserta hasta 10 kb de ADN en cualquiera de los 6
los sitios de restricción dentro de un polienlazador inactivan el gen lacZ' portado por el vector.
Los recombinantes dan placas claras en lugar de azules en agar X-gal.

Vectores de reemplazo Un
vector de reemplazo e tiene dos sitios de reconocimiento para la endonucleasa de restricción utilizada para la
clonación. Estos sitios flanquean un segmento de ADN que es reemplazado por el ADN que se clonará (Figura
6.13a). A menudo, el fragmento reemplazable (o "fragmento de relleno" en la jerga de la clonación) lleva
sitios de restricción adicionales que se pueden usar para cortarlo en pedazos pequeños, por lo que es muy
poco probable que se vuelva a insertar durante un experimento de clonación. Los vectores de reemplazo
generalmente están diseñados para transportar piezas de ADN más grandes que las que pueden manejar los
vectores de inserción. La selección recombinante a menudo se basa en el tamaño, siendo los vectores no
recombinantes demasiado pequeños para empaquetarse en cabezas de fagos (pág. 84).
Un ejemplo de un vector de reemplazo es:

l EEMBL4 (Figura 6.13b) puede transportar hasta 20 kb de ADN insertado reemplazando un segmento
flanqueado por pares de sitios EcoRI, BamHI y SalI . Cualquiera de estas tres endonucleasas de
restricción se puede usar para eliminar el fragmento de relleno, por lo que se pueden clonar
fragmentos de ADN con una variedad de extremos cohesivos. La selección recombinante con eEMBL4
puede basarse en el tamaño o puede utilizar el fenotipo Spi (pág. 83).

6.3.4 Experimentos de clonación con * vectores de inserción

o reemplazo
Un experimento de clonación con el vector ae puede proceder de la misma manera que con un vector de
plásmido: se restringen las moléculas e, se agrega nuevo ADN, se liga la mezcla y las moléculas resultantes
se usan para transfectar un huésped E. coli competente (Figura 6.14a).
Este tipo de experimento requiere que el vector esté en su forma circular, con los sitios coseno unidos por
hidrógeno entre sí.
Aunque satisfactorio para muchos fines, un procedimiento basado en la transfección no es particularmente
eficaz. Se obtendrá un mayor número de recombinantes si se introducen uno o dos refinamientos. La primera
es usar la forma lineal del vector. Cuando la forma lineal del vector se digiere con la endonucleasa de
restricción pertinente, los brazos izquierdo y derecho se liberan como fragmentos separados. Una molécula
recombinante puede
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Capítulo 6 Vectores de clonación para E. coli 101

(a) Clonación con ADN ÿ circular

EcoRI
EcoRI EcoRI
Nuevo ADN

EcoRI

EcoRI, ligar
porque porque
Transfectar
E. coli
factor de inserción ÿ Molécula
– forma circular recombinante

(b) Clonación con ADN ÿ lineal

porque
porque

Vincularse porque
EcoRI porque
porque Cadenas porque
EcoRI

brazos

EcoRI EcoRI

Nuevo ADN
mezcla
de envasado in vitro

L recombinante

Infectar E. coli

Figura 6.14

Diferentes estrategias de clonación con un vector ÿ . (a) Usando la forma circular de ÿ como un plásmido. (b) Uso de los brazos izquierdo
y derecho del genoma ÿ , más empaquetamiento in vitro , para lograr un mayor número de placas recombinantes.

construirse mezclando el ADN que se va a clonar con los brazos del vector (Figura 6.14b). La ligadura da
como resultado varios arreglos moleculares, incluidos los catenanos que comprenden brazo izquierdo-ADN-
brazo derecho repetidos muchas veces (Figura 6.14b). Si el ADN insertado tiene el tamaño correcto,
entonces los sitios cos que separan estas estructuras estarán separados por la distancia adecuada para el
empaque in vitro (pág. 81). Por lo tanto, se producen fagos recombinantes en el tubo de ensayo y se
pueden usar para infectar un cultivo de E. coli . Esta estrategia, en particular el uso de empaquetamiento in
vitro , da como resultado un gran número de placas recombinantes.

6.3.5 Los fragmentos largos de ADN se pueden clonar usando un cósmido

El último y más sofisticado tipo de vector basado en e es el cósmido. Los cósmidos son híbridos entre una
molécula de ADN de fago y un plásmido bacteriano, y su diseño se centra en el hecho de que las enzimas
que empaquetan la molécula de ADN e en la cubierta proteica del fago solo necesitan los sitios cos para
funcionar (pág. 21). La reacción de empaquetamiento in vitro funciona no solo con genomas e, sino también
con cualquier molécula que lleve sitios cos separados por 37–52 kb de ADN.

Un cósmido es básicamente un plásmido que lleva un sitio cos (Figura 6.15a). También necesita un
marcador seleccionable, como el gen de resistencia a la ampicilina, y un origen de replicación del plásmido,
ya que los cósmidos carecen de todos los genes e y, por lo tanto, no producen placas. En cambio, las
colonias se forman en medios selectivos, al igual que con un vector plásmido.
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102 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) Un cósmido típico BamHI

ampR

pJB8
5.4 kb porque
ÿ ADN
o

(b) Clonación con pJB8

BamHI

ampR
BamHI BamHI
Restringir con
Circular porque ampR
BamHI
pJB8
porque

pJB8 lineal BamHI BamHI

Vincularse

Nuevo ADN

BamHI BamHI BamHI

porque ampR Nuevo porque Cadenas

ADN

Paquete in vitro
Colonias que contienen moléculas
pJB8 recombinantes circulares
recombinante
Infectar E. coli
ADN cósmido

partículas ÿ medio de ampicilina

Figura 6.15 Un
cósmido típico y la forma en que se usa para clonar fragmentos largos de ADN.

Un experimento de clonación con un cósmido se lleva a cabo de la siguiente manera (Figura 6.15b). El
cósmido se abre en su sitio de restricción único y se insertan nuevos fragmentos de ADN. Estos fragmentos
generalmente se producen por digestión parcial con una endonucleasa de restricción, ya que la digestión
total casi siempre da como resultado fragmentos que son demasiado pequeños para ser clonados con un
cósmido. Se lleva a cabo la ligadura para que se formen catenanos. Siempre que el ADN insertado tenga
el tamaño correcto, el empaquetamiento in vitro escinde los sitios cos y coloca los cósmidos recombinantes
en partículas de fagos maduros. Estos fagos se utilizan luego para infectar un cultivo de E. coli , aunque,
por supuesto, no se forman placas. En su lugar, las células infectadas se colocan en placas en un medio
selectivo y se cultivan colonias resistentes a los antibióticos. Todas las colonias son recombinantes, ya que
los cósmidos lineales no recombinantes son demasiado pequeños para empaquetarse en cabezas electrónicas.

6.4 8 y otros vectores de alta capacidad

permiten construir bibliotecas genómicas
El uso principal de todos los vectores basados en e es clonar fragmentos de ADN que son demasiado
largos para ser manipulados por plásmidos o vectores M13. Un vector de reemplazo, como eEMBL4, puede
transportar hasta 20 kb de ADN nuevo y algunos cósmidos pueden administrar fragmentos de hasta 40 kb. Esto
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Capítulo 6 Vectores de clonación para E. coli 103

Tabla 6.1
Número de clones necesarios para bibliotecas genómicas de una variedad de organismos.

NÚMERO DE CLONES*

ESPECIES TAMAÑO DEL GENOMA (pb) FRAGMENTOS DE 17 kb† FRAGMENTOS DE 35 kb‡

E. coli 4,6 × 106 820 410

Saccharomyces cerevisiae 1,8 × 107 3225 1500

Drosophila melanogaster Arroz 1,2 × 108 21.500 10,000

Humano Rana 5,7 × 108 100.000 49,000
3,2 × 109 564.000 274,000
2,3 × 1010 4.053.000 1,969,000

*Calculado para una probabilidad ( p) del 95 % de que cualquier gen en particular esté presente en la biblioteca.
†
Fragmentos adecuados para un vector de reemplazo como yEMBL4.

‡
Fragmentos adecuados para un cósmido.

se compara con un tamaño de inserción máximo de aproximadamente 8 kb para la mayoría de los plásmidos y menos de 3
kb para los vectores M13.

La capacidad de clonar fragmentos de ADN tan largos significa que se pueden generar bibliotecas
genómicas . Una biblioteca genómica es un conjunto de clones recombinantes que contiene todo el ADN
presente en un organismo individual. Una biblioteca genómica de E. coli , por ejemplo, contiene todos los genes
de E. coli , por lo que cualquier gen deseado puede retirarse de la biblioteca y estudiarse.
Las bibliotecas genómicas se pueden conservar durante muchos años y propagar para que se puedan enviar
copias de un grupo de investigación a otro.
La gran pregunta es ¿cuántos clones se necesitan para una biblioteca genómica? La respuesta
se puede calcular con la fórmula:

ln(1 ÿ p)
norte =

lnA 1 ÿ aD
CbF _

donde N es el número de clones que se requieren, p es la probabilidad de que un gen dado esté presente, a es
el tamaño promedio de los fragmentos de ADN insertados en el vector y b es el tamaño total del genoma.

La tabla 6.1 muestra el número de clones necesarios para las bibliotecas genómicas de una variedad de
organismos, construidos usando un vector de reemplazo o un cósmido. Para humanos y otros mamíferos, se
requieren varios cientos de miles de clones. De ninguna manera es imposible obtener varios cientos de miles
de clones, y los métodos utilizados para identificar un clon portador de un gen deseado (Capítulo 8) se pueden
adaptar para manejar cantidades tan grandes, por lo que las bibliotecas genómicas de estos tamaños no son
de ninguna manera irrazonables. Sin embargo, continuamente se buscan formas de reducir el número de clones
necesarios para las bibliotecas genómicas de mamíferos.

Una solución es desarrollar nuevos vectores de clonación capaces de manejar insertos de ADN más largos.
Los más populares de estos vectores son los cromosomas artificiales bacterianos (BAC), que se basan en
el plásmido F (pág. 16). El plásmido F es relativamente grande y los vectores derivados de él tienen una mayor
capacidad que los vectores de plásmidos normales. Los BAC pueden manejar insertos de ADN de hasta 300
kb de tamaño, lo que reduce el tamaño de la biblioteca genómica humana a solo 30 000 clones. Se han
construido otros vectores de alta capacidad a partir del bacteriófago P1, que tiene la ventaja sobre e de poder
comprimir 110 kb de ADN en su
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104 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

estructura de la cápside. Se han diseñado y utilizado vectores de tipo cósmido basados en P1 para
clonar fragmentos de ADN que varían en tamaño de 75 a 100 kb. Los vectores que combinan las
características de los vectores P1 y BAC, llamados cromosomas artificiales derivados de P1 (PAC),
también tienen una capacidad de hasta 300 kb.

6.5 Vectores para otras bacterias

También se han desarrollado vectores de clonación para varias otras especies de bacterias, incluidas
Streptomyces, Bacillus y Pseudomonas. Algunos de estos vectores se basan en plásmidos específicos
del organismo huésped, y algunos en plásmidos de amplio rango de huéspedes capaces de replicarse
en una variedad de huéspedes bacterianos. Algunos se derivan de bacteriófagos específicos de estos
organismos. Los genes de resistencia a los antibióticos se usan generalmente como marcadores
seleccionables. La mayoría de estos vectores son muy similares a los vectores de E. coli en cuanto a
sus propósitos y usos generales.

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Bolívar, F., Rodríguez, RL, Green, PJ et al. (1977) Construcción y caracterización de nuevos vectores
de clonación. II. Un sistema de clonación polivalente. Gene, 2, 95–113. [pBR322.]
Frischauf, A.-M., Lehrach, H., Poustka, A. y Murray, N. (1983) Vectores de sustitución lambda que llevan
secuencias polienlazadoras. Revista de Biología Molecular, 170, 827–842.
[Los vectores lEMBL.]
Iouannou, PA, Amemiya, CT, Garnes, J. et al. (1994) Un vector derivado de P1 para la propagación de
grandes fragmentos de ADN humano. Genética de la naturaleza, 6, 84–89.
Melton, DA, Krieg, PA, Rebagliati, MR, Maniatis, T., Zinn, K. & Green, MR (1984).
Síntesis in vitro eficiente de ARN biológicamente activo y sondas de hibridación de ARN a partir de
plásmidos que contienen un promotor del bacteriófago SP6. Investigación de ácidos nucleicos, 12,
7035–7056. [Síntesis de ARN a partir de ADN clonado en un plásmido como pGEM3Z.]
Sanger, F., Coulson, AR, Barrell, BG et al. (1980) Clonación en bacteriófagos monocatenarios como
ayuda para la secuenciación rápida del ADN. Revista de Biología Molecular, 143, 161–178.
[Vectores M13.]
Shiyuza, H., Birren, B., Kim, UJ et al. (1992) Clonación y mantenimiento estable de fragmentos de 300
kilopares de bases de ADN humano en Escherichia coli utilizando un vector basado en el factor F.
Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los EE. UU., 89, 8794–8797.
[La primera descripción de un BAC.]
Sternberg, N. (1992) Clonación de fragmentos de ADN de alto peso molecular por el sistema del
bacteriófago P1. Tendencias en genética, 8, 11–16.
Yanisch-Perron, C., Vieira, J. & Messing, J. (1985) Vectores de clonación de fagos M13 mejorados y
cepas huésped: secuencias de nucleótidos de los vectores M13mp18 y pUC19. Gene, 33, 103–119.
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Capítulo 7
Vectores de clonación para
eucariotas
Contenido del capítulo
CONTENIDO DEL CAPÍTULO

7.1 Vectores de levaduras y otros hongos 7.2

Vectores de clonación de plantas superiores
7.3 Vectores de clonación de animales

La mayoría de los experimentos de clonación se llevan a cabo con E. coli como huésped, y se dispone
de la más amplia variedad de vectores de clonación para este organismo. E. coli es particularmente
popular cuando el objetivo del experimento de clonación es estudiar las características básicas de la
biología molecular, como la estructura y función de los genes. Sin embargo, en algunas circunstancias
puede ser deseable utilizar un huésped diferente para un experimento de clonación de genes. Esto es
especialmente cierto en biotecnología (capítulo 13), donde el objetivo puede no ser estudiar un gen, sino
utilizar la clonación para obtener grandes cantidades de una importante proteína farmacéutica (p. ej., una
hormona como la insulina), o cambiar la propiedades del organismo (p. ej., para introducir resistencia a
herbicidas en una planta de cultivo). Por lo tanto, debemos considerar la clonación de vectores para
organismos distintos de E. coli.

7.1 Vectores de levaduras y otros hongos

La levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de los organismos más importantes en biotecnología.
Además de su papel en la elaboración de cerveza y el pan, la levadura se ha utilizado como organismo
huésped para la producción de importantes productos farmacéuticos a partir de genes clonados (pág.
237). El desarrollo de vectores de clonación para levaduras fue inicialmente estimulado por el
descubrimiento de un plásmido que está presente en la mayoría de las cepas de S. cerevisiae (Figura
7.1). El plásmido 2 fm, como se le llama, es uno de los pocos plásmidos que se encuentran en las células
eucariotas.

Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010 105
por Blackwell Publishing.
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106 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 7.1 El FLP

plásmido de levadura de 2 µm. REP1 y REP2 participan en la replicación del

plásmido, y FLP codifica una proteína que puede convertir la forma A del
plásmido (que se muestra aquí) en la forma B, en la que el orden de los genes
se ha reorganizado por recombinación intramolecular. La función de D no se REP1
conoce exactamente. REP2 6kb

D
o

7.1.1 Marcadores seleccionables para el plásmido 2 (m) El

plásmido 2 fm es una base excelente para un vector de clonación. Tiene un tamaño de 6 kb,
que es ideal para un vector, y existe en la célula de levadura con un número de copias de entre 70 y 200.
La replicación utiliza un origen plásmido, varias enzimas proporcionadas por la célula huésped y las
proteínas codificadas por los genes REP1 y REP2 transportados por el plásmido.
Sin embargo, no todo es perfectamente sencillo al usar el plásmido 2 fm como vector de clonación.
En primer lugar, está la cuestión de un marcador seleccionable. Algunos vectores de clonación de
levadura portan genes que confieren resistencia a inhibidores como el metotrexato y el cobre, pero la
mayoría de los vectores de levadura populares utilizan un tipo de sistema de selección radicalmente
diferente. En la práctica, se usa un gen de levadura normal, generalmente uno que codifica una enzima
involucrada en la biosíntesis de aminoácidos. Un ejemplo es el gen LEU2, que codifica para la b-
isopropil-malato deshidrogenasa, una de las enzimas implicadas en la conversión del ácido pirúvico en
leucina.
Para utilizar LEU2 como marcador seleccionable, se necesita un tipo especial de organismo
huésped. El huésped debe ser un mutante auxotrófico que tenga un gen LEU2 no funcional.
Tal levadura leu2 no puede sintetizar leucina y puede sobrevivir solo si este aminoácido se suministra
ÿ

como nutriente en el medio de crecimiento (Figura 7.2a). La selección es posible porque los
transformantes contienen una copia del gen LEU2 transmitida por un plásmido y, por lo tanto, pueden
crecer en ausencia del aminoácido. En un experimento de clonación, las células se sembraron en
medio mínimo, que no contiene aminoácidos añadidos. Solo las células transformadas pueden
sobrevivir y formar colonias (Figura 7.2b).

7.1.2 Vectores basados en el plásmido 2 (m—plásmidos episomales de levadura

Los vectores derivados del plásmido 2 fm se denominan plásmidos episomales de levadura (YEps).
Algunos YEps contienen el plásmido de 2 fm completo, otros incluyen solo el origen de replicación de 2 fm.
Un ejemplo de este último tipo es YEp13 (Figura 7.3).
YEp13 ilustra varias características generales de los vectores de clonación de levadura. Primero, es
un vector lanzadera. Además del origen de replicación de 2 fm y el gen LEU2 seleccionable , YEp13
también incluye la secuencia completa de pBR322 y, por lo tanto, puede replicarse y seleccionarse
tanto en levadura como en E. coli. Hay varias líneas de razonamiento detrás del uso de vectores
lanzadera. Una es que podría ser difícil recuperar la molécula de ADN recombinante de una colonia de
levadura transformada. Este no es un problema con YEps, que están presentes en las células de
levadura principalmente como plásmidos, pero con otros vectores de levadura, que pueden integrarse
en uno de los cromosomas de levadura (pág. 108), la purificación puede ser imposible. Esto es una
desventaja porque en muchos experimentos de clonación, la purificación de
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Capítulo 7 Vectores de clonación para eucariotas 107

(a) leu2 – levadura

leu2 – colonias

El medio debe
contener leucina

Cromosomas - sin
gen LEU2

(b) Uso de LEU2 como marcador seleccionable

LEU2

Solo las células transformadas

Transformar la levadura pueden sobrevivir.

Medio mínimo: sin

leucina
Foto de archivo -
Lleva el gen LEU2 correcto

Figura 7.2 Uso

del gen LEU2 como marcador seleccionable en un experimento de clonación de levadura.

ampR tetR Figura 7.3 Un

plásmido episomal de levadura, YEp13.

pBR322 ADN

10.7 kb o ADN de 2 µm

Levadura cromosómica
ADN

LEU2

El ADN recombinante es esencial para identificar la construcción correcta, por ejemplo, mediante
la secuenciación del ADN.
Por lo tanto, el procedimiento estándar cuando se clona en levadura es realizar el experimento
de clonación inicial con E. coli y seleccionar recombinantes en este organismo.
Luego, los plásmidos recombinantes se pueden purificar, caracterizar e introducir la molécula
correcta en la levadura (Figura 7.4).

7.1.3 Un YEp puede insertarse en el ADN cromosómico de la levadura

La palabra "episomal" indica que un YEp puede replicarse como un plásmido independiente, pero
también implica que puede ocurrir la integración en uno de los cromosomas de la levadura
(consulte la definición de "episoma" en la página 14). La integración se produce porque el gen que
lleva el vector como marcador seleccionable es muy similar a la versión mutante del gen presente
en el ADN cromosómico de la levadura. Con YEp13, por ejemplo, puede ocurrir una recombinación
homóloga entre el gen LEU2 del plásmido y el gen LEU2 mutante de levadura , lo que da como resultado
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108 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 7.4 Moléculas YEp13 recombinantes

Clonación con un vector lanzadera de E. coli- el deseado

recombinante
levadura como YEp13.

tetR
Transformar
LEU2
E. coli

ampR

Vector Clones de E. coli

autoligado

medio de ampicilina

Purifique el ADN de
varios clones,
identifique la
molécula correcta

Transformar la

levadura
Medio mínimo: sin
Levadura recombinante leucina

Figura 7.5 La
recombinación entre el plásmido y los
genes LEU2 cromosómicos puede integrar YEp13 YEp13
en el ADN cromosómico de la levadura. Después
de la integración hay dos copias del gen LEU2 ;
normalmente uno es funcional y el otro mutado.
LEU2
LEU2 mutado
Levadura

cromosómico
ADN
recombinación

LEU2 LEU2

ADN plásmido

en la inserción del plásmido completo en uno de los cromosomas de la levadura (Figura 7.5). El plásmido puede
permanecer integrado, o un evento de recombinación posterior puede dar como resultado que se elimine
nuevamente.

7.1.4 Otros tipos de vector de clonación de levadura

Además de YEps, existen varios otros tipos de vectores de clonación para usar con S. cerevisiae. Dos importantes
son los siguientes:

l Los plásmidos integradores de levadura (YIps) son básicamente plásmidos bacterianos que llevan un
gen de levadura. Un ejemplo es YIp5, que es pBR322 con un gen URA3 insertado
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Capítulo 7 Vectores de clonación para eucariotas 109

(a) YIp5 URA3 (b) YRp7 TRP1

ampR ampR
5.5 kb 5.8 kb
tetR tetR

Figura 7.6
Un YIp y un YRp.

(Figura 7.6a). Este gen codifica la orotidina-5ÿ-fosfato descarboxilasa (una enzima

que cataliza uno de los pasos en la ruta de biosíntesis de los nucleótidos de
pirimidina) y se usa como marcador seleccionable exactamente de la misma manera
que LEU2. Un YIp no puede replicarse como un plásmido ya que no contiene ninguna parte
del plásmido 2 fm y, en cambio, su supervivencia depende de la integración en el ADN
cromosómico de la levadura. La integración ocurre tal como se describe para un YEp (Figura
7.5). l Los plásmidos replicativos de levadura (YRps) pueden multiplicarse como plásmidos
independientes porque llevan una secuencia de ADN cromosómico que incluye un origen de
replicación. Se sabe que los orígenes de replicación están ubicados muy cerca de varios
genes de levadura, incluidos uno o dos que pueden usarse como marcadores seleccionables.
YRp7 (Figura 7.6b) es un ejemplo de un plásmido replicativo. Está compuesto por pBR322
más el gen de levadura TRP1. Este gen, que está implicado en la biosíntesis del triptófano,
está situado junto a un origen cromosómico de replicación. El fragmento de ADN de levadura
presente en YRp7 contiene tanto TRP1 como el origen.

Tres factores entran en juego al decidir qué tipo de vector de levadura es el más adecuado
para un experimento de clonación en particular. El primero de ellos es la frecuencia de
transformación, una medida del número de transformantes que se pueden obtener por
microgramo de ADN plasmídico. Es necesaria una alta frecuencia de transformación si se necesita
un gran número de recombinantes, o si el ADN de partida es escaso. YEps tiene la frecuencia de
transformación más alta, proporcionando entre 10 000 y 100 000 células transformadas por fg.
Los YRps también son bastante productivos, ya que dan entre 1000 y 10 000 transformantes por
fg, pero un YIp produce menos de 1000 transformantes por fg y solo de 1 a 10, a menos que se
utilicen procedimientos especiales. La baja frecuencia de transformación de un YIp refleja el
hecho de que el evento de integración cromosómica bastante raro es necesario antes de que el
vector pueda retenerse en una célula de levadura.
El segundo factor importante es el número de copias. YEps y YRps tienen los números de
copias más altos: 20–50 y 5–100, respectivamente. Por el contrario, un YIp suele estar presente
en una sola copia por celda. Estas cifras son importantes si el objetivo es obtener proteína a partir
del gen clonado, ya que cuantas más copias haya del gen, mayor será el rendimiento esperado
del producto proteico.
Entonces, ¿por qué uno desearía usar un YIp? La respuesta es porque las YIp producen
recombinantes muy estables, ya que la pérdida de una YIp que se ha integrado en un cromosoma
se produce con una frecuencia muy baja. Por el contrario, los recombinantes YRp son
extremadamente inestables, los plásmidos tienden a congregarse en la célula madre cuando
brota una célula hija, por lo que la célula hija no es recombinante. Los recombinantes YEp sufren
problemas similares, aunque una mejor comprensión de la biología del plásmido de 2 fm ha permitido
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110 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 7.7 Telómero

Estructura cromosómica. Centrómero

Posiciones de orígenes
de replicación
Telómero

YEps más estables que se desarrollarán en los últimos años. No obstante, un YIp es el vector de
elección si las necesidades del experimento dictan que las células de levadura recombinantes deben
retener el gen clonado durante largos períodos en cultivo.

7.1.5 Se pueden utilizar cromosomas artificiales para clonar fragmentos

largos de ADN en levadura
El último tipo de vector de clonación de levadura a considerar es el cromosoma artificial de levadura
(YAC), que presenta un enfoque totalmente diferente para la clonación de genes. El desarrollo de los
YAC fue un resultado derivado de la investigación fundamental sobre la estructura de los cromosomas
eucariotas, trabajo que identificó los componentes clave de un cromosoma como (Figura 7.7):

l El centrómero, que se requiere para que el cromosoma se distribuya correctamente a las células
hijas durante la división celular; l Dos telómeros, las estructuras en los extremos de un cromosoma,
que son necesarios para que los extremos se repliquen correctamente y que también evitan que el
cromosoma sea mordisqueado por exonucleasas;

l Los orígenes de replicación, que son las posiciones a lo largo del cromosoma en las que se inicia la
replicación del ADN, similar al origen de replicación de un plásmido.

Una vez definida la estructura cromosómica de esta manera, surgió la posibilidad de que los
componentes individuales pudieran aislarse mediante técnicas de ADN recombinante y luego unirse
nuevamente en el tubo de ensayo, creando un cromosoma artificial. Dado que las moléculas de ADN
presentes en los cromosomas de la levadura natural tienen varios cientos de kilobases de longitud,
podría ser posible con un cromosoma artificial clonar fragmentos largos de ADN.

La estructura y el uso de un vector YAC Se

han desarrollado varios vectores YAC, pero cada uno está construido de la misma manera, siendo
pYAC3 un ejemplo típico (Figura 7.8a). A primera vista, pYAC3 no se parece mucho a un cromosoma
artificial, pero al examinarlo más de cerca, sus características únicas se hacen evidentes. pYAC3 es
esencialmente un plásmido pBR322 en el que se han insertado varios genes de levadura. Dos de
estos genes, URA3 y TRP1, ya se han encontrado como marcadores seleccionables para YIp5 y
YRp7, respectivamente. Al igual que en YRp7, el fragmento de ADN que porta TRP1 también contiene
un origen de replicación, pero en pYAC3 este fragmento se extiende aún más para incluir la secuencia
denominada CEN4, que es el ADN de la región del centrómero del cromosoma 4. El TRP1 –origen–
Por lo tanto, el fragmento CEN4 contiene dos de los tres componentes del cromosoma artificial.

El tercer componente, los telómeros, lo proporcionan las dos secuencias denominadas TEL.
Estas no son en sí mismas secuencias completas de telómeros, pero una vez dentro del núcleo de la
levadura, actúan como secuencias de siembra sobre las cuales se construirán los telómeros. Esto solo
deja otra parte de pYAC3 que no se ha mencionado: SUP4, que es el marcador seleccionable en el
que se inserta el nuevo ADN durante el experimento de clonación.
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Capítulo 7 Vectores de clonación para eucariotas 111

(a) pYAC3 CEN4

SnaBI Figura 7.8 Un

o vector YAC y la forma en que se usa para clonar grandes

SUP4
fragmentos de ADN.

TRP1

URA3
11.4 kb

TELÉFONO TELÉFONO

BamHI BamHI

(b) La estrategia de clonación con pYAC3

SnaBI

Restringir con
BamHI + SnaBI

Brazo izquierdo Brazo derecho

BamHI BamHI

Ligar con
inserto de ADN
de extremos romos

TELÉFONO TRP1-o-CEN4 URA3 TELÉFONO

Insertar ADN

La estrategia de clonación con pYAC3 es la siguiente (Figura 7.8b). Primero se restringe el

vector con una combinación de BamHI y SnaBI, cortando la molécula en tres fragmentos. El
fragmento flanqueado por sitios BamHI se descarta, dejando dos brazos, cada uno limitado por una
secuencia TEL y un sitio SnaBI . El ADN a clonar, que debe tener extremos romos (SnaBI es un
cortador de extremos romos, que reconoce la secuencia TACGTA), se liga entre los dos brazos,
produciendo el cromosoma artificial. Luego se utiliza la transformación de protoplastos (pág. 85)
para introducir el cromosoma artificial en S. cerevisiae.
La cepa de levadura que se utiliza es un mutante auxotrófico doble, trp1ÿ ura3ÿ, que se convierte
en trp1+ ura3+ mediante los dos marcadores en el cromosoma artificial. Por lo tanto, los
transformantes se seleccionan sembrando en medio mínimo, en el que solo las células que
contienen un cromosoma artificial construido correctamente pueden crecer. Cualquier célula
transformada con un cromosoma artificial incorrecto, que contenga dos brazos izquierdos o dos
derechos en lugar de uno de cada uno, no puede crecer en medio mínimo porque uno de los
marcadores está ausente. La presencia del inserto de ADN en el vector puede verificarse mediante
la prueba de inactivación por inserción de SUP4, que se lleva a cabo mediante una simple prueba
de color: las colonias blancas son recombinantes, las colonias rojas no lo son.

Aplicaciones para vectores YAC

El estímulo inicial para diseñar cromosomas artificiales vino de los genetistas de levadura que
querían usarlos para estudiar varios aspectos de la estructura y el comportamiento de los cromosomas.
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112 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

por ejemplo, para examinar la segregación de cromosomas durante la meiosis. Estos experimentos
establecieron que los cromosomas artificiales son estables durante la propagación en células de
levadura y plantearon la posibilidad de que pudieran usarse como vectores para genes que son
demasiado largos para ser clonados como un solo fragmento en un vector de E. coli . Varios genes
de mamíferos importantes tienen más de 100 kb de longitud (por ejemplo, el gen de la fibrosis
quística humana tiene 250 kb), más allá de la capacidad de todos los sistemas de clonación de E.
coli excepto los más sofisticados (pág. 102), pero dentro del rango de un vector YAC. Por lo tanto,
los cromosomas artificiales de levadura abrieron el camino a los estudios de las funciones y modos
de expresión de los genes que previamente habían sido intratables para el análisis mediante técnicas
de ADN recombinante. Una nueva dimensión a estos experimentos fue proporcionada por el
descubrimiento de que, en algunas circunstancias, los YAC pueden propagarse en células de
mamíferos, lo que permite que el análisis funcional se lleve a cabo en el organismo en el que normalmente reside el gen.
Los cromosomas artificiales de levadura son igualmente importantes en la producción de
bibliotecas de genes. Recuerde que con fragmentos de 300 kb, el tamaño máximo de inserción para
el vector de E. coli de mayor capacidad , se necesitan unos 30.000 clones para una biblioteca de
genes humanos (pág. 103). Sin embargo, los vectores YAC se usan habitualmente para clonar
fragmentos de 600 kb, y los tipos especiales pueden manejar ADN de hasta 1400 kb de longitud, lo
que reduce el tamaño de una biblioteca de genes humanos a solo 6500 clones. Desafortunadamente,
estos "mega-YAC" han tenido problemas con la estabilidad del inserto, el ADN clonado a veces se
reorganiza por recombinación intramolecular. Sin embargo, los YAC han tenido un valor inmenso al
proporcionar fragmentos largos de ADN clonado para su uso en proyectos de secuenciación de ADN
a gran escala.

7.1.6 Vectores para otras levaduras y hongos

Se necesitan vectores de clonación para otras especies de levaduras y hongos para estudios básicos
de la biología molecular de estos organismos y para ampliar los posibles usos de levaduras y hongos
en biotecnología. Los plásmidos episomales basados en el plásmido 2 fm de S. cerevisiae pueden
replicarse en algunos otros tipos de levadura, pero la gama de especies no es lo suficientemente
amplia como para que los vectores 2 fm sean de valor general. En cualquier caso, los requisitos de
la biotecnología se satisfacen mejor con plásmidos integradores, equivalentes a YIps, ya que
proporcionan recombinantes estables que pueden cultivarse durante largos períodos en biorreactores
(pág. 225). Ahora están disponibles vectores integradores eficientes para varias especies, incluidas
levaduras tales como Pichia pastoris y Kluveromyces lactis, y hongos filamentosos tales como
Aspergillus nidulans y Neurospora crassa.

7.2 Vectores de clonación para plantas superiores

Los vectores de clonación para plantas superiores se desarrollaron en la década de 1980 y su uso
ha llevado a los cultivos genéticamente modificados (GM) que están en los titulares de la
actualidad. Examinaremos la modificación genética de cultivos y otras plantas en el Capítulo 15.
Aquí veremos los vectores de clonación y cómo se utilizan.
Se han utilizado tres tipos de sistemas de vectores con diversos grados de éxito con plantas
superiores:

l Vectores basados en plásmidos naturales de Agrobacterium; l Transferencia

directa de genes usando varios tipos de ADN plasmídico; l Vectores basados
en virus de plantas.
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Capítulo 7 Vectores de clonación para eucariotas 113

Las bacterias invaden

la herida

planta sana agrobacterias Herida en tallo División celular rápida - hiel de la corona
agalla de la corona

Figura 7.9 Enfermedad

de la agalla de la corona.

7.2.1 Agrobacterium tumefaciens: el ingeniero genético más pequeño

de la naturaleza
Aunque no se conocen plásmidos naturales en plantas superiores, un plásmido bacteriano, el plásmido
Ti de Agrobacterium tumefaciens, es de gran importancia.
A. tumefaciens es un microorganismo del suelo que causa la enfermedad de la agalla de la corona
en muchas especies de plantas dicotiledóneas. La agalla de la corona ocurre cuando una herida en el
tallo permite que la bacteria A. tumefaciens invada la planta. Después de la infección, la bacteria
provoca una proliferación cancerosa del tejido del tallo en la región de la copa (Figura 7.9).
La capacidad de causar la enfermedad de la agalla de la corona está asociada con la presencia del
plásmido Ti (inductor de tumores ) dentro de la célula bacteriana. Este es un plásmido grande (más de
200 kb) que porta numerosos genes involucrados en el proceso infeccioso (Figura 7.10a). Una
característica notable del plásmido Ti es que, después de la infección, parte de la molécula se integra
en el ADN cromosómico de la planta (Figura 7.10b). Este segmento, llamado T-DNA, tiene un tamaño
de entre 15 y 30 kb, dependiendo de la cepa. Se mantiene en forma estable en la célula vegetal y se
transmite a las células hijas como parte integral de los cromosomas. Pero la característica más notable
del plásmido Ti es que el T-DNA contiene aproximadamente ocho genes que se expresan en la célula
vegetal y son responsables de las propiedades cancerosas de las células transformadas. Estos genes
también dirigen la síntesis de compuestos inusuales, llamados opiniones, que las bacterias utilizan
como nutrientes (Figura 7.10c). En resumen, A. tumefaciens modifica genéticamente la célula vegetal
para sus propios fines.

Uso del plásmido Ti para introducir nuevos genes en una célula vegetal
Rápidamente se descubrió que el plásmido Ti podía usarse para transportar nuevos genes a las células
vegetales. Todo lo que sería necesario sería insertar los nuevos genes en el T-DNA y luego la bacteria
podría hacer el trabajo duro de integrarlos en el ADN cromosómico de la planta. En la práctica, esto ha
demostrado ser una propuesta engañosa, principalmente porque el gran tamaño del plásmido Ti hace
que la manipulación de la molécula sea muy difícil.

El problema principal es, por supuesto, que un sitio de restricción único es imposible con un
plásmido de 200 kb de tamaño. Deben desarrollarse nuevas estrategias para insertar nuevo ADN en
el plásmido. Dos son de uso general:

l La estrategia del vector binario (Figura 7.11) se basa en la observación de que el ADN-T
no necesita estar unido físicamente al resto del plásmido Ti.
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114 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 7.10 El (a) A Ti plasmid ADN-T (oncogenes)

plásmido Ti y su integración en el ADN cromosómico

de la planta después de la infección por A. tumefaciens .

Región de virulencia
~200kb

Región de especificidad

del huésped

(b) Integración del T-DNA en el genoma de la planta

Planta
cromosómica
recombinación ADN
De
ADN-T
ADN-T integrado

(c) Expresión de los genes de ADN-T

ADN-T

ADN vegetal

División Síntesis de
celular rápida opiniones

Un sistema de dos plásmidos, con el ADN-T en una molécula relativamente pequeña y el resto
del plásmido en forma normal, es igual de efectivo para transformar células vegetales.
De hecho, algunas cepas de A. tumefaciens y agrobacterias relacionadas tienen sistemas
de plásmidos binarios naturales. El plásmido T-DNA es lo suficientemente pequeño para tener
un sitio de restricción único y para ser manipulado utilizando técnicas estándar. l La estrategia
de cointegración (Figura 7.12) utiliza un plásmido completamente nuevo, basado
en un vector de E. coli , pero que lleva una pequeña porción del T-DNA. La homología entre la
nueva molécula y el plásmido Ti significa que si ambos están presentes en la misma célula de
A. tumefaciens , la recombinación puede integrar el plásmido de E. coli en la región T-DNA. Por
lo tanto, el gen a clonar se inserta en un sitio de restricción único en el pequeño plásmido de E.
coli , se introduce en células de A. tumefaciens que portan un plásmido Ti y se deja el proceso de
recombinación natural para integrar el nuevo gen en el T-DNA. La infección de la planta conduce
a la inserción del nuevo gen, junto con el resto del T-DNA, en los cromosomas de la planta.
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Capítulo 7 Vectores de clonación para eucariotas 115

Figura 7.11 La
Sitio de
estrategia del vector binario. Los plásmidos A y B se
restricción único
complementan cuando están presentes juntos en la
Región de misma célula de A. tumefaciens . El T-DNA transportado
virulencia por el plásmido B se transfiere al ADN cromosómico
Región
ADN-T de la planta mediante proteínas codificadas por genes
de especificidad
transportados por el plásmido A.
del huésped

Plásmido A Plásmido B
~170 kb ~20 kb

Especificidad del huésped

Fragmento de ADN-T

Plásmido Ti
Pequeño ADN-T
normal
plásmido tipo E. coli
Gen a
clonar recombinación

Virulencia

ADN-T
Especificidad del huésped

Nuevo gen
Plásmido Ti
recombinante

ADN-T

Virulencia

Figura 7.12 La
estrategia de cointegración.

Producción de plantas transformadas con el plásmido Ti

Si la bacteria A. tumefaciens que contiene un plásmido Ti manipulado se introduce en una
planta de forma natural, mediante la infección de una herida en el tallo, entonces solo las
células de la agalla de la corona resultante poseerán la gen clonado (Figura 7.13a).
Obviamente, esto tiene poco valor para el biotecnólogo. En cambio, se necesita una forma de
introducir el nuevo gen en cada célula de la planta.
Hay varias soluciones, la más simple es infectar no la planta madura sino un cultivo de
células vegetales o protoplastos (pág. 85) en medio líquido (Figura 7.13b). Las células
vegetales y los protoplastos cuyas paredes celulares se han vuelto a formar se pueden tratar
de la misma manera que los microorganismos: por ejemplo, se pueden sembrar en un medio selectivo para
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116 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) Infección de heridas por A. tumefaciens recombinante

Aplicar bacterias Gen clonado solo

recombinantes presente en la agalla
de la corona

(b) Transformación de células vegetales cultivadas

Inocular con A.
tumefaciens
recombinante

Bacteria

planta
Placa sobre transformada
medio sólido
Célula vegetal
suspensión
Transferir a un medio con
Planta
de células vegetales Forma de brotes
diferente equilibrio de la en el
Callo transformado
hormona del crecimiento
suelo

Figura 7.13

Transformación de células vegetales por A. tumefaciens recombinante. (a) Infección de una herida: las células vegetales transformadas
están presentes solo en la agalla de la corona. (b) Transformación de una suspensión celular: se transforman todas las células de la planta resultante.

aislar transformantes. Una planta madura regenerada a partir de células transformadas contendrá el
gen clonado en cada célula y pasará el gen clonado a su descendencia. Sin embargo, la regeneración
de una planta transformada puede ocurrir solo si el vector Ti ha sido "desarmado" para que las
células transformadas no muestren propiedades cancerosas. El desarme es posible porque los genes
del cáncer, todos los cuales se encuentran en el T-DNA, no son necesarios para el proceso de
infección, ya que la infectividad está controlada principalmente por la región de virulencia del plásmido
Ti. De hecho, las únicas partes del T-DNA que están involucradas en la infección son dos secuencias
repetidas de 25 pb que se encuentran en los bordes izquierdo y derecho de la región integrada en el
ADN de la planta. Cualquier ADN colocado entre estas dos secuencias repetidas se tratará como
"ADN-T" y se transferirá a la planta. Por lo tanto, es posible eliminar todos los genes del cáncer del T-
DNA normal y reemplazarlos con un conjunto de genes completamente nuevo, sin alterar el proceso
de infección.
Ahora hay disponibles varios vectores de clonación de Ti desarmados, siendo un ejemplo típico el
vector binario pBIN19 (Figura 7.14). Los bordes izquierdo y derecho del T-DNA presentes en este
vector flanquean una copia del gen lacZ' , que contiene varios sitios de clonación y un gen de
resistencia a la kanamicina que funciona después de la integración de las secuencias del vector en el
cromosoma de la planta. Al igual que con un vector lanzadera de levadura (pág. 106), las manipulaciones iniciales
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Capítulo 7 Vectores de clonación para eucariotas 117

Sitios de restricción Figura 7.14 El vector

lacZ' binario de Ti pBIN19. kan R = gen de resistencia a la kanamicina.

Repetir a la izquierda

kanR
10 KB

Repetir a la derecha

que dan como resultado la inserción del gen a clonar en pBIN19 se llevan a cabo en E. coli, transfiriendo
luego la molécula de pBIN19 recombinante correcta a A. tumefaciens y de allí a la planta. Las células
vegetales transformadas se seleccionan sembrando en medio de agar que contiene kanamicina.

El plásmido Ri A
lo largo de los años también ha habido interés en desarrollar vectores de clonación de plantas basados en
el plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes. Los plásmidos Ri y Ti son muy similares, la principal
diferencia es que la transferencia del ADN-T de un plásmido Ri a una planta no produce una agalla en la
corona sino una enfermedad de la raíz pilosa, tipificada por una proliferación masiva de un sistema
radicular muy ramificado. Los biotecnólogos han explorado la posibilidad de hacer crecer raíces
transformadas a alta densidad en cultivo líquido como un medio potencial para obtener grandes cantidades
de proteína a partir de genes clonados en plantas (pág. 242).

Limitaciones de la clonación con plásmidos de Agrobacterium

Las plantas superiores se dividen en dos amplias categorías, las monocotiledóneas y las dicotiledóneas.
Varios factores se han combinado para hacer mucho más fácil clonar genes en dicotiledóneas como
tomate, tabaco, patata, guisantes y frijoles, pero mucho más difícil obtener los mismos resultados con
monocotiledóneas. Esto ha sido frustrante porque las monocotiledóneas incluyen trigo, cebada, arroz y
maíz, que son las plantas de cultivo más importantes y, por lo tanto, los objetivos más deseables para los
proyectos de ingeniería genética.
La principal dificultad radica en el hecho de que en la naturaleza A. tumefaciens y A. rhizogenes
infectan únicamente plantas dicotiledóneas; las monocotiledóneas están fuera del rango normal de hospedantes.
Durante algún tiempo se pensó que esta barrera natural era infranqueable y que las monocotiledóneas
eran totalmente resistentes a la transformación con vectores Ti y Ri, pero finalmente se idearon técnicas
artificiales para lograr la transferencia de T-DNA. Sin embargo, este no fue el final de la historia. La
transformación con un vector de Agrobacterium implica normalmente la regeneración de una planta intacta
a partir de un cultivo transformado de protoplastos, células o callos. La facilidad con la que se puede
regenerar una planta depende mucho de la especie particular involucrada y, una vez más, las plantas más
difíciles son las monocotiledóneas. Los intentos de eludir este problema se han centrado en el uso de la
biolística —bombardeo con microproyectiles (pág. 85)— para introducir ADN plasmídico directamente en
embriones de plantas. Aunque este es un procedimiento de transformación bastante violento, no parece
ser demasiado dañino para los embriones, que aún continúan su programa normal de desarrollo para
producir plantas maduras. El enfoque ha tenido éxito con el maíz y varias otras monocotiledóneas
importantes.
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118 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 7.15 Nuevo gen

Transferencia directa de genes.

plásmido

Transformar
protoplastos vegetales

Planta
plásmido
ADN
superenrollado

Recombinación no
homóloga

plásmido

Nuevo gen insertado en

el ADN de la planta

7.2.2 Clonación de genes en plantas por transferencia directa de genes

La biolística elude la necesidad de utilizar Agrobacterium como medio de transferencia de ADN a las
células vegetales. La transferencia directa de genes lleva el proceso un paso más allá y prescinde
del plásmido Ti por completo.

Transferencia directa de genes al núcleo

La transferencia directa de genes se basa en la observación, realizada por primera vez en 1984, de
que un plásmido bacteriano superenrollado, aunque no puede replicarse en una célula vegetal por sí
solo, puede integrarse por recombinación en uno de los cromosomas de la planta. El evento de
recombinación no se comprende bien, pero es casi seguro que es distinto de los procesos responsables
de la integración del ADN-T. También es distinta de la integración cromosómica de un vector de
levadura (pág. 107), ya que no se requiere una región de similitud entre el plásmido bacteriano y el
ADN de la planta. De hecho, la integración parece ocurrir aleatoriamente en cualquier posición de
cualquiera de los cromosomas de la planta (Figura 7.15).
Por lo tanto, la transferencia génica directa hace uso de ADN plasmídico superenrollado,
posiblemente un plásmido bacteriano simple, en el que se han insertado un marcador seleccionable
apropiado (p. ej., un gen de resistencia a la kanamicina) y el gen a clonar. La biolística se usa con
frecuencia para introducir el ADN del plásmido en embriones de plantas, pero si la especie que se está
modificando puede regenerarse a partir de protoplastos o células individuales, entonces son posibles
otras estrategias, posiblemente más eficientes que la biolística.
Un método consiste en resuspender los protoplastos en una solución viscosa de polietilenglicol, un
compuesto polimérico cargado negativamente que se cree que precipita el ADN en las superficies de
los protoplastos e induce la captación por endocitosis (Figura 7.16).
La electroporación (pág. 85) también se usa a veces para aumentar la frecuencia de transformación.
Después del tratamiento, los protoplastos se dejan unos días en una solución que favorece la
regeneración de las paredes celulares. Luego, las células se esparcen en un medio selectivo para
identificar transformantes y proporcionar cultivos de callos a partir de los cuales se pueden cultivar
plantas intactas (exactamente como se describe para el sistema Agrobacterium , Figura 7.13b).
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Capítulo 7 Vectores de clonación para eucariotas 119

Figura 7.16
ADN
Transferencia directa de genes por precipitación de
ADN sobre la superficie de los protoplastos.

protoplastos vegetales

Transferencia de genes al genoma del cloroplasto Si

se utiliza la biolística para introducir ADN en el embrión de una planta, entonces algunas partículas
pueden penetrar en uno o más de los cloroplastos presentes en las células. Los cloroplastos
contienen sus propios genomas, distintos (y mucho más cortos) que las moléculas de ADN en el
núcleo y, en algunas circunstancias, el ADN plasmídico puede integrarse en este genoma del
cloroplasto. A diferencia de la integración del ADN en los cromosomas nucleares, la integración en
el genoma del cloroplasto no ocurrirá al azar. En su lugar, el ADN que se va a clonar debe estar
flanqueado por secuencias similares a la región del genoma del cloroplasto en el que se va a
insertar el ADN, de modo que la inserción pueda tener lugar mediante recombinación homóloga
(ver pág. 107). Cada una de estas secuencias flanqueantes debe tener una longitud de 500 pb
aproximadamente. También se puede lograr un bajo nivel de transformación de cloroplastos
después de la entrega de ADN inducida por PEG en protoplastos si el plásmido que se toma lleva estas secuencias flanquean
Una célula vegetal contiene decenas de cloroplastos, y probablemente sólo uno por célula se
transforma, por lo que el ADN insertado debe llevar un marcador seleccionable, como el gen de
resistencia a la kanamicina, y los embriones deben tratarse con el antibiótico durante un período
considerable para asegurar que el los genomas transformados se propagan dentro de la célula.
Aunque esto significa que la transformación de cloroplastos es un método difícil de llevar a cabo
con éxito, podría convertirse en un complemento importante de los métodos más tradicionales para
obtener cultivos transgénicos. Como cada célula tiene muchos cloroplastos, pero solo un núcleo,
es probable que un gen insertado en el genoma del cloroplasto se exprese a un nivel más alto que
uno colocado en el núcleo. Esto es particularmente importante cuando las plantas manipuladas se
van a utilizar para la producción de proteínas farmacéuticas (Capítulo 13). Hasta ahora, el enfoque
ha tenido más éxito con el tabaco, pero la transformación de los cloroplastos también se ha logrado
con cultivos más útiles, como la soja y el algodón.

7.2.3 Intentos de utilizar virus de plantas como vectores de clonación

Las versiones modificadas de los bacteriófagos e y M13 son importantes vectores de clonación
para E. coli (Capítulo 6). La mayoría de las plantas están sujetas a infecciones virales, entonces,
¿podrían usarse los virus para clonar genes en las plantas? Si pudieran, serían mucho más
convenientes de usar que otros tipos de vectores, porque con muchos virus la transformación se
puede lograr simplemente frotando el ADN del virus sobre la superficie de una hoja. El proceso de
infección natural propaga el virus por toda la planta.
El potencial de los virus de plantas como vectores de clonación se ha explorado durante varios
años, pero sin mucho éxito. Un problema es que la gran mayoría de los virus de plantas no tienen
genomas de ADN sino de ARN. Los virus de ARN no son tan útiles como posibles vectores de
clonación porque las manipulaciones con ARN son más difíciles de realizar. Solo se conocen dos
clases de virus de ADN que infectan plantas superiores, los caulimovirus y los geminivirus, y
ninguno es ideal para la clonación de genes.
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120 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Vectores de caulimovirus
Aunque uno de los primeros experimentos exitosos de ingeniería genética de plantas, allá por 1984, usó un
vector de caulimovirus para clonar un nuevo gen en plantas de nabo, dos dificultades generales con estos
virus han limitado su utilidad.
La primera es que el tamaño total del genoma de un caulimovirus está, como el de e, limitado por la
necesidad de empaquetarlo en su cubierta proteica. Incluso después de la eliminación de secciones no
esenciales del genoma del virus, la capacidad de transportar el ADN insertado sigue siendo muy limitada.
Investigaciones recientes han demostrado que podría ser posible sortear este problema adoptando una
estrategia de virus auxiliar, similar a la que se usa con los fagémidos (pág. 96). En esta estrategia, el vector
de clonación es un genoma del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) que carece de varios de los genes
esenciales, lo que significa que puede transportar una gran inserción de ADN pero no puede por sí mismo
dirigir la infección. Las plantas se inoculan con el vector de ADN junto con un genoma de CaMV normal. El
genoma viral normal proporciona los genes necesarios para que el vector de clonación se empaquete en
proteínas virales y se propague por la planta.
Este enfoque tiene un potencial considerable, pero no resuelve el segundo problema, que es la gama
de huéspedes extremadamente estrecha de los caulimovirus. Esto restringe los experimentos de clonación
a unas pocas plantas, principalmente brasicáceas como nabos, coles y coliflores.
Sin embargo, los caulimovirus han sido importantes en la ingeniería genética como fuente de promotores
altamente activos que funcionan en todas las plantas y que se utilizan para obtener la expresión de genes
introducidos por la clonación del plásmido Ti o la transferencia directa de genes.

Vectores de geminivirus
¿Qué pasa con los geminivirus? Estos son particularmente interesantes porque sus huéspedes naturales
incluyen plantas como el maíz y el trigo y, por lo tanto, podrían ser vectores potenciales para estas y otras
monocotiledóneas. Pero los geminivirus han presentado su propio conjunto de dificultades, uno de los
cuales es que durante el ciclo de infección los genomas de algunos geminivirus sufren reordenamientos y
eliminaciones, lo que desordenaría cualquier ADN adicional que se haya insertado, una desventaja obvia
para un vector de clonación.
La investigación a lo largo de los años ha abordado estos problemas, y los geminivirus están comenzando
a encontrar algunas aplicaciones especializadas en la clonación de genes de plantas. Uno de ellos es el
silenciamiento génico inducido por virus (VIGS), una técnica utilizada para investigar las funciones de
genes de plantas individuales. Este método explota uno de los mecanismos de defensa naturales que
utilizan las plantas para protegerse contra el ataque viral. Este método, llamado silenciamiento de ARN, da
como resultado la degradación de los ARNm virales. Si uno de los ARN virales se transcribe a partir de un
gen clonado contenido en el genoma de un geminivirus, no solo se degradan los transcritos virales, sino
también los ARNm celulares derivados de la copia del gen de la planta (Figura 7.17). Por lo tanto, el gen de
la planta se silencia y se puede estudiar el efecto de su inactivación sobre el fenotipo de la planta.

7.3 Vectores de clonación para animales

Se ha realizado un esfuerzo considerable en el desarrollo de sistemas de vectores para la clonación de
genes en células animales. Estos vectores son necesarios en biotecnología para la síntesis de proteína
recombinante a partir de genes que no se expresan correctamente cuando se clonan en E. coli o levadura
(Capítulo 13), y los biólogos moleculares clínicos están buscando métodos para la clonación en humanos
que intentan idear técnicas para terapia génica (pág. 259), en la que se trata una enfermedad mediante la
introducción de un gen clonado en el paciente.
El aspecto clínico ha significado que la mayor parte de la atención se ha dirigido a los sistemas de
clonación para mamíferos, pero también se han logrado avances importantes con insectos. Clonación en insectos
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Capítulo 7 Vectores de clonación para eucariotas 121

Gen Figura 7.17 El uso de

vegetal clonado
un vector de geminivirus para silenciar un gen de una planta a
través del silenciamiento de genes inducido por virus.
vector Transcripción SIDA
geminivirus

ARNm ARNm
degradado

El gen vegetal equivalente

también se silencia

cromosoma vegetal

es interesante porque hace uso de un nuevo tipo de vector que no hemos conocido hasta ahora.
Por lo tanto, examinaremos los insectos vectores antes de concluir el capítulo con una descripción
general de los métodos de clonación utilizados con los mamíferos.

7.3.1 Clonación de vectores para insectos

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, ha sido y sigue siendo uno de los organismos modelo
más importantes utilizados por los biólogos. Su potencial fue reconocido por primera vez por el famoso
genetista Thomas Hunt Morgan, quien en 1910 comenzó a realizar cruces genéticos entre moscas de la
fruta con diferentes colores de ojos, formas corporales y otras características heredadas. Estos
experimentos condujeron a las técnicas que todavía se utilizan hoy en día para el mapeo de genes en
insectos y otros animales. Más recientemente, el descubrimiento de que los genes selectores homeóticos
de Drosophila, los genes que controlan el plan general del cuerpo de la mosca, están estrechamente
relacionados con genes equivalentes en los mamíferos, ha llevado a que D. melanogaster se utilice como
modelo para el estudio de humanos . procesos de desarrollo. La importancia de la mosca de la fruta en
la biología moderna hace imperativo que los vectores para la clonación de genes en este organismo
estén disponibles.

Elementos P como vectores de clonación para

Drosophila El desarrollo de vectores de clonación para Drosophila ha tomado una ruta diferente a la
seguida con bacterias, levaduras, plantas y mamíferos. No se conocen plásmidos en Drosophila y aunque
las moscas de la fruta son, como todos los organismos, susceptibles a la infección por virus, estos no se
han utilizado como base para la clonación de vectores. En cambio, la clonación en Drosophila hace uso
de un transposón llamado elemento P.
Los transposones son comunes en todos los tipos de organismos. Son piezas cortas de ADN
(generalmente de menos de 10 kb de longitud) que pueden moverse de una posición a otra en los
cromosomas de una célula. Los elementos P, que son uno de varios tipos de transposones en Drosophila,
tienen una longitud de 2,9 kb y contienen tres genes flanqueados por secuencias repetidas invertidas
cortas en cada extremo del elemento (Figura 7.18a). Los genes codifican la transposasa, la enzima que
lleva a cabo el proceso de transposición, y las repeticiones invertidas forman las secuencias de
reconocimiento que permiten a la enzima identificar los dos extremos del transposón insertado.

Además de moverse de un sitio a otro dentro de un solo cromosoma, los elementos P también pueden
saltar entre cromosomas, o entre un plásmido que lleva un elemento P y uno de los cromosomas de la
mosca (Figura 7.18b). Esta última es la clave para el uso de P
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122 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 7.18 Clonación (a) La estructura de un elemento P

genes
en Drosophila con un vector del elemento P. (a) La
estructura de un elemento P. (b) Transposición de un
elemento P de un plásmido a un cromosoma de mosca.
( c ) La estructura de un vector de clonación de elementos
Repetición terminal invertida
P. El elemento P de la izquierda contiene un sitio de
clonación (R) que interrumpe su gen transposasa. El
elemento P de la derecha tiene un gen de transposasa
(b) Transposición del elemento P
intacto, pero no puede transponerse porque tiene las "alas
recortadas", carece de repeticiones terminales invertidas. Transposición

Elemento P
insertado en un
cromosoma de mosca
Elemento P transportado
por un plásmido

(c) La estructura de un vector de clonación de elementos P

R Elemento 'alas recortadas'

repeticiones invertidas ADN plásmido

elementos como vectores de clonación. El vector es un plásmido que lleva dos elementos P, uno de los
cuales contiene el sitio de inserción del ADN que se clonará. La inserción del nuevo ADN en este elemento
P da como resultado la interrupción de su gen transposasa, por lo que este elemento está inactivo. El
segundo elemento P portado por el plásmido es, por tanto, uno que tiene una versión intacta del gen de la
transposasa. Idealmente, este segundo elemento no debería transferirse a los cromosomas de Drosophila ,
por lo que tiene sus "alas recortadas": sus repeticiones invertidas se eliminan para que la transposasa no
lo reconozca como un elemento P real (Figura 7.17c).
Una vez insertado el gen a clonar en el vector, el ADN del plásmido se microinyecta en embriones de
mosca de la fruta. La transposasa del elemento P con las alas recortadas dirige la transferencia del
elemento P manipulado a uno de los cromosomas de la mosca de la fruta. Si esto sucede dentro de un
núcleo de línea germinal, entonces la mosca adulta que se desarrolla a partir del embrión llevará copias
del gen clonado en todas sus células. La clonación del elemento P se desarrolló por primera vez en la
década de 1980 y ha realizado varias contribuciones importantes a la genética de Drosophila .

Vectores de clonación basados en virus de

insectos Aunque no se han desarrollado vectores de virus para clonar genes en Drosophila, un tipo de
virus, el baculovirus, ha jugado un papel importante en la clonación de genes con otros insectos. El uso
principal de los vectores de baculovirus es en la producción de proteína recombinante, y volveremos a
ellos cuando consideremos este tema en el Capítulo 13.

7.3.2 Clonación en mamíferos

En la actualidad, la clonación de genes en mamíferos se lleva a cabo por una de tres razones:

l Para lograr una desactivación genética, que es una técnica importante que se usa para ayudar
determinar la función de un gen no identificado (pág. 213). Estos experimentos generalmente se
llevan a cabo con roedores como ratones.
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Capítulo 7 Vectores de clonación para eucariotas 123

l Para la producción de proteína recombinante en un cultivo de células de mamíferos y en la técnica

relacionada de pharming, que involucra la ingeniería genética de un animal de granja para que
sintetice una proteína importante como un fármaco, a menudo en su leche (p. 241).

l En la terapia génica, en la que se modifican células humanas para tratar una enfermedad
(pág. 259).

Los virus como vectores de clonación para

mamíferos Durante muchos años se pensó que los virus serían la clave para la clonación en mamíferos. Esta
expectativa sólo se ha cumplido parcialmente. El primer experimento de clonación con células de mamífero
se llevó a cabo en 1979 con un vector basado en el virus de simio 40 (SV40). Este virus es capaz de infectar
a varias especies de mamíferos, siguiendo un ciclo lítico en algunos huéspedes y un ciclo lisogénico en otros.
El genoma tiene un tamaño de 5,2 kb (Figura 7.19a) y contiene dos conjuntos de genes, los genes
"tempranos", que se expresan en las primeras etapas del ciclo de infección y codifican proteínas implicadas
en la replicación del ADN viral, y los genes "tardíos", que codifican Proteínas de la cápside viral. SV40 sufre
el mismo problema que e y los caulimovirus de plantas, en el sentido de que las restricciones de empaque
limitan la cantidad de ADN nuevo que se puede insertar en el genoma. Por lo tanto, la clonación con SV40
implica reemplazar uno o más de los genes existentes con el ADN a clonar. En el experimento original, se
reemplazó un segmento de la región del gen tardío (Figura 7.19b), pero el reemplazo del gen temprano
también es una opción.

En los años transcurridos desde 1979, se han utilizado otros tipos de virus para clonar
genes en mamíferos. Éstos incluyen:

l Adenovirus, que permiten clonar fragmentos de ADN de hasta 8 kb, más largos de lo que es posible
con un vector SV40, aunque los adenovirus son más difíciles de manejar porque sus genomas son
más grandes.
l Virus del papiloma, que también tienen una capacidad relativamente alta para insertar ADN.
El virus del papiloma bovino (BPV), que causa verrugas en el ganado, es particularmente
atractivo porque tiene un ciclo de infección inusual en células de ratón, tomando la forma de un plásmido
multicopia con unas 100 moléculas presentes por célula. No es asi

(a) El genoma SV40 (b) SVGT-5 con el gen de ÿ-globina de conejo insertado
HindIII
Gen de la ÿ-globina de conejo
BamHI
Genes tardíos
(proteínas de la cápside)

5.2 kb

Genes
tempranos (replicación del virus)

Figura 7.19 SV40 y

un ejemplo de su uso como vector de clonación. Para clonar el gen de la ÿ-globina de conejo, se eliminó el fragmento de restricción
HindIII a BamHI (dando como resultado SVGT-5) y se reemplazó con el gen de conejo.
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124 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

causan la muerte de la célula de ratón, y las moléculas de BPV pasan a las células hijas en la
división celular, dando lugar a una línea celular permanentemente transformada. Los vectores
lanzadera que consisten en secuencias de BPV y E. coli , y capaces de replicarse tanto en células
bacterianas como de ratón, se han utilizado para la producción de proteínas recombinantes en
líneas celulares de ratón.
l Virus adenoasociado (AAV), que no está relacionado con el adenovirus pero que a menudo se
encuentra en los mismos tejidos infectados, porque el AAV utiliza algunas de las proteínas
sintetizadas por el adenovirus para completar su ciclo de replicación. En ausencia de este virus
auxiliar, el genoma AAV se inserta en el ADN de su huésped. Con la mayoría de los virus
integradores, este es un evento aleatorio, pero AAV tiene la propiedad inusual de insertarse
siempre en la misma posición, dentro del cromosoma 19 humano. Saber exactamente dónde
estará el gen clonado en el genoma del huésped es importante si el resultado del experimento de
clonación es positivo. debe comprobarse rigurosamente, como es el caso de aplicaciones como la
terapia génica. Por lo tanto, se considera que los vectores AAV tienen un gran potencial en esta
área.
l Retrovirus, que son los vectores más utilizados para la terapia génica.
Aunque se insertan en posiciones aleatorias, los integrantes resultantes son muy estables, lo
que significa que los efectos terapéuticos del gen clonado persistirán durante algún tiempo.
Volveremos a la terapia génica en el capítulo 14.

Clonación de genes sin un vector

Una de las razones por las que los vectores de virus no se han generalizado en la clonación de genes
de mamíferos es que a principios de la década de 1990 se descubrió que la forma más eficaz de
transferir nuevos genes a células de mamíferos es mediante microinyección. Aunque es un
procedimiento difícil de llevar a cabo, la microinyección de plásmidos bacterianos, o copias lineales de
genes de ADN, en núcleos de mamíferos da como resultado que el ADN se inserte en los cromosomas,
posiblemente como copias múltiples en una disposición en tándem, de la cabeza a la cola (Figura
7.20). ). Este procedimiento generalmente se considera más satisfactorio que el uso de un vector viral
porque evita la posibilidad de que el ADN viral infecte las células y provoque defectos de un tipo u otro.

La microinyección de ADN es la base para la creación de un animal transgénico, que contiene un

gen clonado en todas sus células. Se puede generar un ratón transgénico mediante microinyección de
un óvulo fertilizado que posteriormente se cultiva in vitro para varias divisiones celulares y luego se
implanta en una madre adoptiva. Alternativamente, se puede utilizar una célula madre embrionaria
(ES) . Estos se obtienen dentro de un embrión temprano y, a diferencia de la mayoría de las células
de mamíferos, son totipotentes, lo que significa que su patrón de desarrollo no está preestablecido y
las células que descienden de ellos pueden formar muchas estructuras diferentes en el ratón adulto.
Después de la microinyección, la célula ES se vuelve a colocar en un embrión que se implanta en la
madre adoptiva. El ratón resultante es una quimera, que comprende una mezcla de células modificadas
y no modificadas, porque el embrión que recibe la célula ES también contiene varias células ordinarias
que contribuyen, junto con la célula ES, a la composición del adulto. ratón. Los ratones no quiméricos,
que contienen el gen clonado en todas sus células, se obtienen permitiendo que la quimera se
reproduzca, ya que parte de la descendencia derivará de óvulos que contienen el gen clonado.

Figura 7.20 Múltiples Múltiples copias del ADN clonado.

copias de moléculas de ADN clonadas insertadas como
una matriz en tándem en una molécula de ADN
cromosómico. ADN cromosómico
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Capítulo 7 Vectores de clonación para eucariotas 125

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Brisson, N., Paszkowski, J., Penswick, JR y col. (1984) Expresión de un gen bacteriano en plantas usando un vector
viral. Naturaleza, 310, 511–114. [El primer experimento de clonación con un caulimovirus.]

Broach, JR (1982) El círculo de levadura de 2 mm. Celda, 28, 203–204.

Burke, DT, Carle, GF & Olson, MV (1987) Clonación de grandes segmentos de ADN exógeno en levadura por medio
de vectores cromosómicos artificiales. Ciencia, 236, 806–812.
Carrillo-Tripp, J., Shimada-Beltrán, H. & Rivera-Bustamante, R. (2006) Uso de vectores geminivirales para genómica
funcional. Opinión actual en biología vegetal, 9, 209–215. [Silenciamiento de genes inducido por virus.]

Chilton, MD (1983) Un vector para introducir nuevos genes en las plantas. Científico americano, 248
(junio), 50–59. [El plásmido Ti.
Colosimo, A., Goncz, KK, Holmes, AR et al. (2000) Transferencia y expresión de genes extraños en células de
mamíferos. Biotécnicas , 29, 314–321.
Daniel, H., Kumar, S. & Dufourmantel, N. (2005) Avance en la ingeniería genética de cloroplastos de cultivos
agronómicamente importantes. Tendencias en Biotecnología, 23, 238–245.
Evans, MJ, Carlton, MBL y Russ, AP (1997) Atrapamiento de genes y genómica funcional.
Tendencias en genética, 13, 370–374. [Incluye una descripción del uso de células madre embrionarias.]
Graham, FL (1990) Adenovirus como vectores de expresión y vacunas recombinantes.
Tendencias en Biotecnología, 8, 20–25.
Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, PK, Rideau, M. & Gantet, P. (2006) Investigación de raíces peludas:
escenario reciente y perspectivas emocionantes. Opinión actual en biología vegetal, 9, 341–346. [Aplicaciones
del plásmido Ri.]
Hamer, DH & Leder, P. (1979) Expresión del gen cromosómico de b-maj-globina de ratón clonado en SV40.
Naturaleza, 281, 35–40.
Komori, T., Imayama, T., Kato, N., Ishida, Y., Ueki, J. y Komari, T. (2007). Fisiología vegetal, 145, 1155–1160.
[Últimas versiones de vectores de plásmidos Ti.

Maliga, P. (2004) Transformación de plástidos de plantas superiores. Revisiones anuales de biología vegetal,
55, 289–313.
Padre, SA et al. (1985) Sistemas de vectores para la expresión, análisis y clonación de secuencias de ADN en S.
cerevisiae. Levadura, 1, 83–138. [Detalles de diferentes vectores de clonación de levadura.]
Paszkowski, J., Shillito, RD, Saul, M. et al. (1984) Transferencia directa de genes a las plantas. EMBÓ
Revista, 3, 2717–2722.
Rubin, GM & Spradling, AC (1982) Transformación genética de Drosophila con vectores de elementos transponibles.
Ciencia, 218, 348–353. [Clonación con elementos P.]
Viaplana, R., Turner, DS y Covey, SN (2001) Expresión transitoria de un gen informador GUS de vectores de
reemplazo del virus del mosaico de la coliflor en presencia y ausencia de virus auxiliar. Revista de Virología
General, 82, 59–65. [El enfoque del virus auxiliar para la clonación con CaMV.]
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Capítulo 8
Cómo obtener un clon
de un gen específico
Contenido del capítulo
CONTENIDO DEL CAPÍTULO

8.1 El problema de la selección 8.2

Selección directa 8.3 Identificación
de un clon a partir de una biblioteca de genes 8.4 Métodos
para la identificación de clones

En los capítulos anteriores hemos examinado la metodología básica utilizada para clonar genes y
estudiado la variedad de tipos de vectores que se utilizan con bacterias, levaduras, plantas y animales.
Ahora debemos examinar los métodos disponibles para obtener un clon de un gen específico e individual.
Esta es la prueba crítica de un experimento de clonación de genes, el éxito o el fracaso a menudo
depende de si se puede idear o no una estrategia mediante la cual los clones del gen deseado se
pueden seleccionar directamente o, alternativamente, diferenciarlos de otros recombinantes. Una vez
que se ha resuelto este problema y se ha obtenido un clon, el biólogo molecular puede hacer uso de
una amplia variedad de técnicas diferentes que extraerán información sobre el gen. Los más importantes
se describirán en los capítulos 10 y 11.

8.1 El problema de la selección

El problema al que se enfrenta el biólogo molecular que desea obtener un clon de un solo gen específico
se ilustra en la figura 1.4. Incluso los organismos más simples, como E. coli, contienen varios miles de
genes, y una digestión de restricción del ADN celular total produce no solo el fragmento que contiene el
gen deseado, sino también muchos otros fragmentos que contienen todos los demás genes (Figura
8.1a). . Durante la reacción de ligación no hay selección de un fragmento individual: se producen
numerosas moléculas de ADN recombinante diferentes, todas con diferentes fragmentos de ADN (Figura
8.1b). En consecuencia, una variedad de

126 Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010
por Blackwell Publishing.
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Capítulo 8 Cómo obtener un clon de un gen específico 127

(a) Restricción de una molécula grande de ADN

EcoRI
Molécula de
ADN de ~50 kb

Muchos
fragmentos de ADN
El gen a clonar

Insertar en vector

(b) Las moléculas de ADN recombinante resultantes

(c) Todos producirán colonias

Figura 8.1 El
problema de la selección.

los clones recombinantes se obtienen después de la transformación y cultivo (Figura 8.1c).

De alguna manera se debe identificar el correcto.

8.1.1 Existen dos estrategias básicas para obtener el

clon que deseas
Aunque existen muchos procedimientos diferentes mediante los cuales se puede obtener el clon
deseado, todos son variaciones sobre dos temas básicos:

l Selección directa para el gen deseado (Figura 8.2a), lo que significa que el experimento de
clonación está diseñado de tal manera que los únicos clones que se obtienen son clones del gen
requerido. Casi invariablemente, la selección ocurre en la etapa de siembra.

l Identificación del clon a partir de una biblioteca de genes (Figura 8.2b), lo que implica una
experimento inicial de clonación “escopeta” , para producir una biblioteca de clones que represente
todos o la mayoría de los genes presentes en la célula, seguido de un análisis de los clones
individuales para identificar el correcto.

En términos generales, la selección directa es el método preferido, ya que es rápido y, por lo general,
sin ambigüedades. Sin embargo, como veremos, no es aplicable a todos los genes, por lo que las
técnicas de identificación de clones son muy importantes.
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128 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 8.2 Las (a) Selección directa

estrategias básicas que se pueden utilizar

para obtener un clon particular: (a) selección
directa; (b) identificación del recombinante deseado
de una biblioteca de clones.

Solo el recombinante
correcto puede sobrevivir.

(b) Identificación de clones

Una biblioteca

de clones

Clon correcto

8.2 Selección directa

Para poder seleccionar un gen clonado, es necesario sembrar los transformantes en un medio de
agar en el que solo puedan crecer los recombinantes deseados y ningún otro. Las únicas colonias
que se obtendrán serán, por tanto, las que comprendan células que contengan la molécula de ADN
recombinante deseada.
El ejemplo más simple de selección directa ocurre cuando el gen deseado especifica resistencia
a un antibiótico. Como ejemplo, consideraremos un experimento para clonar el gen de resistencia a
la kanamicina del plásmido R6-5. Este plásmido porta genes de resistencia a cuatro antibióticos:
kanamicina, cloranfenicol, estreptomicina y sulfonamida. El gen de resistencia a la kanamicina se
encuentra dentro de uno de los 13 fragmentos EcoRI (Figura 8.3a).
Para clonar este gen, los fragmentos EcoRI de R6-5 podrían insertarse en el sitio EcoRI de un
vector como pBR322. La mezcla ligada comprenderá muchas copias de 13 moléculas de ADN
recombinante diferentes, una de las cuales porta el gen de resistencia a la kanamicina (Figura 8.3b).

La inactivación por inserción no se puede usar para seleccionar recombinantes cuando se usa el
sitio EcoRI de pBR322. Esto se debe a que este sitio no se encuentra ni en los genes de resistencia
a la ampicilina ni a la tetraciclina de este plásmido (ver Figura 6.1). Pero esto es irrelevante para la
clonación del gen de resistencia a la kanamicina porque en este caso el gen clonado se puede usar
como marcador seleccionable. Los transformantes se sembraron en agar con kanamicina, en el que
las únicas células capaces de sobrevivir y producir colonias son aquellas recombinantes que
contienen el gen de resistencia a la kanamicina clonado (Figura 8.3c).
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Capítulo 8 Cómo obtener un clon de un gen específico 129

(a) Plásmido R6-5 Figura 8.3

kanR molestar
Selección directa del gen de resistencia a la
kanamicina (kanR) R6-5 clonado .

Sitios EcoRI

EcoRI

13 fragmentos

diferentes

Ligar en el sitio
EcoRI de pBR322
(b) La ligación da 13 moléculas de ADN
recombinante diferentes

Transformar

E. coli, colocar en placa

(C) Solo uno permite el crecimiento

en agar de kanamicina.

El medio contiene 50 µg/ Solo el recombinante que lleva el gen kanR

ml de kanamicina puede sobrevivir

8.2.1 El rescate de marcadores amplía el alcance de la selección directa

La selección directa sería muy limitada si pudiera utilizarse únicamente para clonar genes de
resistencia a antibióticos. Afortunadamente, la técnica se puede ampliar haciendo uso de cepas
mutantes de E. coli como huéspedes para la transformación.
Como ejemplo, considere un experimento para clonar el gen trpA de E. coli. Este gen
codifica la enzima triptófano sintasa, que participa en la biosíntesis del aminoácido esencial
triptófano. Una cepa mutante de E. coli que tiene un gen trpA no funcional se denomina trpA- y
solo puede sobrevivir si se agrega triptófano al medio de cultivo. E. coli trpAÿ es, por lo tanto,
otro ejemplo de un auxótrofo (pág. 106).
El auxótrofo trpAÿ de E. coli se puede utilizar para clonar la versión correcta del gen trpA .
El ADN total se purifica primero a partir de una cepa normal (de tipo salvaje) de la bacteria. La
digestión con una endonucleasa de restricción, seguida de ligadura en un vector, produce
numerosas moléculas de ADN recombinante, una de las cuales puede, con suerte, llevar una
copia intacta del gen trpA (Figura 8.4a). Este es, por supuesto, el gen funcional, ya que se ha
obtenido de la cepa de tipo salvaje.
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130 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) Construcción de pBR322 recombinante

trpA
ligado
EcoRI
Sitios EcoRI

(b) Transformar E. coli trpA-

trpA–
trpA–
no recombinante

recombinantes
trpA+

(c) El gen del plásmido se expresa

proteína trpA

Solo recombinantes trpA+

puede sobrevivir
(d) placa en medio mínimo

Figura 8.4
Selección directa del gen trpA clonado en una cepa trpAÿ de E. coli.

La mezcla de ligación se usa ahora para transformar las células auxotróficas de E. coli trpAÿ
(Figura 8.4b). La gran mayoría de los transformantes resultantes serán auxotróficos, pero unos pocos
ahora tienen la copia del gen trpA correcta transmitida por plásmidos. Estos recombinantes no son
auxotróficos: ya no requieren triptófano, ya que el gen clonado puede dirigir la producción de
triptófano sintasa (Figura 8.4c). Por lo tanto, la selección directa se realiza colocando los
transformantes en placas en un medio mínimo, que carece de suplementos agregados y, en
particular, no tiene triptófano (Figura 8.4d). Los auxótrofos no pueden crecer en un medio mínimo,
por lo que las únicas colonias que aparecen son recombinantes que contienen el gen trpA clonado.

8.2.2 Alcance y limitaciones del rescate de balizas

Aunque el rescate de marcadores se puede utilizar para obtener clones de muchos genes, la técnica
está sujeta a dos limitaciones:

l Debe estar disponible una cepa mutante para el gen en cuestión. l Se

necesita un medio en el que solo pueda sobrevivir el tipo salvaje.

El rescate de marcadores es aplicable para la mayoría de los genes que codifican enzimas
biosintéticas, ya que los clones de estos genes pueden seleccionarse en medio mínimo de la manera
descrita para trpA. La técnica no se limita a E. coli o incluso a bacterias. cepas auxotróficas de
Machine Translated by Google
Capítulo 8 Cómo obtener un clon de un gen específico 131

también están disponibles levaduras y hongos filamentosos, y se ha utilizado el rescate de marcadores para
seleccionar genes clonados en estos organismos.
Además, los auxótrofos de E. coli se pueden utilizar como huéspedes para la selección de algunos genes de
otros organismos. A menudo, hay suficiente similitud entre enzimas equivalentes de diferentes bacterias, o incluso
de levadura, para que la enzima extraña funcione en E. coli, de modo que el gen clonado pueda transformar el
huésped en un tipo salvaje.

8.3 Identificación de un clon a partir de una biblioteca de genes

Aunque el rescate de marcadores es una técnica poderosa, no lo abarca todo y hay muchos genes importantes
que no se pueden seleccionar con este método. Muchos mutantes bacterianos no son auxótrofos, por lo que las
cepas mutantes y de tipo salvaje no se pueden distinguir mediante la siembra en placas en un medio mínimo o
cualquier otro medio especial. Además, ni el rescate de marcadores ni ningún otro método de selección directa es
de mucha utilidad para proporcionar clones bacterianos de genes de animales o plantas, ya que en estos casos
las diferencias suelen ser tan grandes que las enzimas extrañas no funcionan en la célula bacteriana.

Por lo tanto, se debe considerar la estrategia alternativa. Aquí es donde un gran número
de diferentes clones se obtienen y se identifica de alguna manera el deseado.

8.3.1 Bibliotecas de genes

Antes de ver los métodos utilizados para identificar clones individuales, se debe considerar la biblioteca en sí. Una
biblioteca genómica (pág. 102) es una colección de clones en número suficiente para contener cada gen presente
en un organismo en particular. Las bibliotecas genómicas se preparan purificando el ADN celular total y luego
haciendo una digestión de restricción parcial, lo que da como resultado fragmentos que se pueden clonar en un
vector adecuado (Figura 8.5), generalmente un vector de reemplazo, un cósmido o posiblemente un cromosoma
artificial de levadura ( YAC), cromosoma artificial bacteriano (BAC) o vector P1.

Para bacterias, levaduras y hongos, la cantidad de clones necesarios para una biblioteca genómica completa
no es tan grande como para ser inmanejable (consulte la Tabla 6.1). Sin embargo, para plantas y animales, una
biblioteca completa contiene tantos clones diferentes que la identificación del deseado puede resultar una tarea
gigantesca. Con estos organismos puede ser más útil un segundo tipo de biblioteca, específica no para todo el
organismo sino para un tipo de célula particular.

8.3.2 No todos los genes se expresan al mismo tiempo

Una característica de la mayoría de los organismos multicelulares es la especialización de las células individuales.
Un ser humano, por ejemplo, está formado por una gran cantidad de tipos de células diferentes: células cerebrales,
células sanguíneas, células hepáticas, etc. Cada célula contiene el mismo complemento de genes, pero en
diferentes tipos de células se intercambian diferentes conjuntos de genes. encendido, mientras que otros están en
silencio (Figura 8.6).
El hecho de que sólo se expresen relativamente pocos genes en cualquier tipo de célula puede utilizarse en la
preparación de una biblioteca si el material que se clona no es ADN sino ARN mensajero (ARNm). Solo aquellos
genes que se expresan se transcriben en ARNm, por lo que si se usa ARNm como material de partida, los clones
resultantes comprenden solo una selección del número total de genes en la célula.

Un método de clonación que use ARNm sería particularmente útil si el gen deseado se expresa a una tasa
alta en un tipo de célula individual. Por ejemplo, el gen de la gliadina, una de las proteínas nutricionalmente
importantes presentes en el trigo, se expresa a un nivel muy alto.
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132 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

ADN celular total

Figura 8.5

Preparación de una biblioteca de genes en un vector cósmido.

Sitios Sau3A

Digestión parcial

con Sau3A

fragmentos de ~35 kb

Ligar en cósmico

porque porque porque

paquete in vitro , infectar

E. coli

colonias

+ otras placas de Petrie =

biblioteca de genes

ARNm Proteína
Figura 8.6

Diferentes genes se expresan en diferentes tipos de

células.

genes silenciosos

Célula tipo A

Proteína de ARNm

genes silenciosos

Proteína de ARNm
Célula tipo B

ARNm Proteína
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Capítulo 8 Cómo obtener un clon de un gen específico 133

nivel en las células de las semillas de trigo en desarrollo. En estas células, más del 30% del ARNm
total especifica gliadina. Claramente, si pudiéramos clonar el ARNm de las semillas de trigo,
obtendríamos una gran cantidad de clones específicos para la gliadina.

8.3.3 El ARNm se puede clonar como ADN complementario El ARN mensajero

no se puede ligar por sí mismo en un vector de clonación. Sin embargo, el ARNm se puede convertir
en ADN mediante la síntesis de ADN complementario (ADNc) .
La clave de este método es la enzima transcriptasa inversa (pág. 49), que sintetiza un
polinucleótido de ADN complementario a una hebra de ARN existente (Figura 8.7a).
Una vez que se ha sintetizado la cadena de ADNc, el miembro de ARN de la molécula híbrida se
puede degradar parcialmente tratándolo con ribonucleasa (RNasa) HI (Figura 8.7b). Los fragmentos
de ARN restantes luego sirven como cebadores (pág. 48) para la ADN polimerasa I, que sintetiza la
segunda cadena de ADNc (Figura 8.7c), lo que da como resultado un fragmento de ADN de doble
cadena que se puede ligar en un vector y clonar (Figura 8.7). d).
Los clones de ADNc resultantes son representativos del ARNm presente en la preparación original.
En el caso de mRNA preparado a partir de semillas de trigo, la biblioteca de cDNA contendría una
gran proporción de clones que representan mRNA de gliadina (Figura 8.7e). También estarán
presentes otros clones, pero localizar el ADNc de gliadina clonado es un proceso mucho más fácil que
identificar el gen equivalente de una biblioteca genómica de trigo completa.

8.4 Métodos para la identificación de clones

Una vez que se ha preparado una biblioteca adecuada, se pueden emplear una serie de procedimientos
para intentar la identificación del clon deseado. Aunque algunos de estos procedimientos se basan en
la detección del producto de traducción del gen clonado, normalmente es más fácil identificar
directamente la molécula de ADN recombinante correcta. Esto se puede lograr mediante la importante
técnica de sondeo de hibridación.

8.4.1 Las cadenas de ácido nucleico complementarias se

hibridan entre sí
Cualesquiera dos moléculas de ácido nucleico monocatenario tienen el potencial de formar pares de
bases entre sí. Con la mayoría de los pares de moléculas, las estructuras híbridas resultantes son
inestables, ya que solo se forma una pequeña cantidad de enlaces entre hebras individuales (Figura 8.8a).
Sin embargo, si los polinucleótidos son complementarios, puede ocurrir un extenso apareamiento de
bases para formar una molécula de doble cadena estable (Figura 8.8b). Esto no solo puede ocurrir
entre moléculas de ADN monocatenario para formar la doble hélice de ADN, sino también entre un
par de moléculas de ARN monocatenario o entre combinaciones de una cadena de ADN y una cadena
de ARN (Figura 8.8c).
La hibridación de ácidos nucleicos se puede utilizar para identificar un clon recombinante
particular si se dispone de una sonda de ADN o ARN, complementaria al gen deseado. La naturaleza
exacta de la sonda se discutirá más adelante en este capítulo. Primero debemos considerar la técnica en sí.

8.4.2 Sondeo de hibridación de colonias y placas

El sondeo de hibridación se puede utilizar para identificar moléculas de ADN recombinante contenidas
en colonias bacterianas o placas de bacteriófagos. Primero las colonias o placas son
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134 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 8.7 Un (a) Síntesis de la primera cadena

esquema posible para la clonación de ADNc. 5' 3'

AAAA AAAA
Poli(A) = poliadenosina, oligo(dT) = oligodesoxitimidina.ARNm Recocer una TTTTT
Cola de
poli(A) imprimación oligo(dT) Primer

La transcriptasa inversa

(b) degradación del ARN ARN

AAAA
TTTTT
ADN

RNasa HI

fragmentos de ARN

TTTTT

ADN pol I
(c) Síntesis de la segunda cadena

Los fragmentos de ARN

TTTTT
actúan como cebadores. ADN

AAAA
TTTTT
ADN de doble cadena

Adjuntar extremos
adhesivos, ligar

(d) Ligadura en un vector

ADNc

(e) Transformar
clones de ADNc

Clon de gliadina

se transfirió a una membrana de nitrocelulosa o nailon (Figura 8.9a) y luego se trató para eliminar
todo el material contaminante, dejando solo el ADN (Figura 8.9b). Por lo general, este tratamiento
también da como resultado la desnaturalización de las moléculas de ADN, de modo que se rompen
los enlaces de hidrógeno entre las hebras individuales en la doble hélice. Estas moléculas
monocatenarias pueden luego unirse fuertemente a la membrana por un corto período a 80°C si se
usa una membrana de nitrocelulosa, o con una membrana de nailon por irradiación ultravioleta. Las
moléculas se unen a la membrana a través de sus cadenas principales de azúcar y fosfato, por lo
que las bases quedan libres para emparejarse con moléculas de ácido nucleico complementarias.
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Capítulo 8 Cómo obtener un clon de un gen específico 135

(a) Un híbrido inestable Figura 8.8

Hibridación de ácidos nucleicos. (a) Una molécula

híbrida inestable formada entre dos cadenas de ADN
no homólogas. (b) Un híbrido estable formado entre
dos hebras complementarias. (c) Un híbrido de ADN-
ARN, como el que se puede formar entre un gen y su
transcrito.

(b) Un híbrido estable

Las regiones cortas no complementarias no

afectan la estabilidad general

(c) Un híbrido ADN-ARN

ADN
ARN

(a) Transferir colonias a nitrocelulosa o nailon.

Membrana de nitrocelulosa/
nylon

Bacterias adheridas a la
membrana.

(b) Degradar las células, purificar el ADN

bacterias ADN
Alcalino +
proteasa

80°C durante 2 horas

o radiación ultravioleta
bases no apareadas
ADN unido a la
membrana

El ADN está unido por el

esqueleto de azúcar-fosfato

(c) Sonda con ADN marcado

Solicitar película de rayos X
película de
* ** * * * * * Lavar * *** rayos X

Unión no Unión
específica específica

(d) La autorradiografía resultante

Hibridación
positiva

Figura 8.9
Sondeo de hibridación de colonias. En este ejemplo, la sonda se marca con un marcador radiactivo y la hibridación se detecta
mediante autorradiografía, pero también se pueden usar otros tipos de marca y sistema de detección.
Machine Translated by Google
136 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

La sonda ahora debe marcarse con un marcador radiactivo o de otro tipo, desnaturalizarse mediante
calentamiento y aplicarse a la membrana en una solución de productos químicos que promuevan la
hibridación de ácidos nucleicos (Figura 8.9c). Después de un período para permitir que tenga lugar la
hibridación, el filtro se lava para eliminar la sonda no unida, se seca y se detecta la etiqueta para
identificar las colonias o placas a las que se ha unido la sonda (Figura 8.9d).

Marcado con un marcador radiactivo Una

molécula de ADN generalmente se marca incorporando nucleótidos que portan un isótopo radiactivo de
fósforo, 32P (Figura 8.10). Hay varios métodos disponibles:

l Traducción de Nick. La mayoría de las muestras de ADN purificadas contienen algunas moléculas
cortadas, sin importar cuán cuidadosamente se haya llevado a cabo la preparación, lo que significa
que la ADN polimerasa I puede unirse al ADN y catalizar una reacción de reemplazo de cadena
(Figura 8.11a). Esta reacción requiere un suministro de nucleótidos: si uno de estos se marca
radiactivamente, la molécula de ADN se marcará a sí misma.
La traducción de Nick se puede usar para etiquetar cualquier molécula de ADN, pero en algunas
circunstancias también puede causar la escisión del ADN. l El relleno de extremos es un método
más suave que la traducción de muescas y rara vez provoca la rotura del ADN, pero desafortunadamente
solo se puede usar para etiquetar moléculas de ADN que tienen extremos cohesivos. La enzima
utilizada es el fragmento Klenow (pág. 49), que “rellena” un extremo pegajoso al sintetizar la cadena
complementaria (Figura 8.11b)). Al igual que con la traducción de muescas, si la reacción de llenado
final se lleva a cabo en presencia de nucleótidos marcados, el ADN queda marcado.

NH2
Figura 8.10 La
C
estructura de ÿ 32P-desoxiadenosina trifosfato norte

C norte

([ÿ 32P]dATP).
LA- LA- LA- HC
C CH
norte
– OOOO CH2
PAG PAG PAG
norte

LA
OOO
C H H C
32P radiactivo
CC
H
OH H

(a) Etiquetado por traducción de nick (b) Etiquetado por llenado final

ADN Pol I
Fragmento de Klenow
+ 32P-dATP + 32P-dATP

mellas Regiones etiquetadas

Extremo adhesivo EcoRI Extremo etiquetado

(c) Etiquetado por cebado aleatorio

Doble cadena monocatenario
sonda de ADN ADN
Desnaturalizar Agregar Fragmento de Klenow
por calentamiento oligonucleótidos de hexámero aleatorio + 32P-dATP

Etiquetado
ADN
Algunos pares de bases

de hexámeros

Figura 8.11
Métodos para marcar el ADN.
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Capítulo 8 Cómo obtener un clon de un gen específico 137

l El cebado aleatorio da como resultado una sonda con mayor actividad y, por lo tanto, capaz de detectar
cantidades más pequeñas de ADN unido a la membrana. El ADN desnaturalizado se mezcla con un
conjunto de oligonucleótidos hexaméricos de secuencia aleatoria. Por casualidad, estos hexámeros
aleatorios contendrán algunas moléculas que formarán pares de bases con la sonda y prepararán la
síntesis de ADN nuevo. El fragmento Klenow se usa porque esta enzima carece de la actividad
nucleasa de la ADN polimerasa I (pág. 48) y, por lo tanto, solo llena los espacios entre los cebadores
adyacentes (Figura 8.11c). Los nucleótidos marcados se incorporan al nuevo ADN que se sintetiza.

Después de la hibridación, la ubicación de la sonda unida se detecta mediante autorradiografía.

Se coloca una hoja de película fotográfica sensible a los rayos X sobre la membrana. El ADN radioactivo
expone la película, que se revela para revelar las posiciones de las colonias o placas con las que se ha
hibridado la sonda (ver Figura 8.9d).

Etiquetado no radiactivo Los

métodos de etiquetado radiactivo están empezando a perder popularidad, en parte debido al peligro para
el investigador y en parte debido a los problemas asociados con la eliminación de desechos radiactivos.
Como alternativa, la sonda de hibridación se puede marcar de forma no radiactiva. Se han desarrollado
varios métodos, dos de los cuales se ilustran en la Figura 8.12. El primero utiliza nucleótidos de trifosfato
de desoxiuridina (dUTP) modificados por reacción con biotina, una molécula orgánica que tiene una alta
afinidad por una proteína llamada avidina. Después de la hibridación, las posiciones de la sonda biotinilada
unida se pueden determinar lavando con avidina acoplada a un marcador fluorescente (Figura 8.12a).
Este método es tan sensible como el sondeo radiactivo y se está volviendo cada vez más popular.

Lo mismo es válido para un segundo procedimiento de sondeo de hibridación no radiactivo, en el que

el ADN de la sonda forma un complejo con la enzima peroxidasa de rábano picante y se detecta a
través de la capacidad de la enzima para degradar el luminol con la emisión de quimioluminiscencia
(Figura 8.12b). La señal se puede registrar en una película fotográfica normal de manera análoga a la
autorradiografía.

8.4.3 Ejemplos del uso práctico del sondeo de hibridación

Claramente, el éxito de la hibridación de colonias o placas como medio para identificar un clon
recombinante particular depende de la disponibilidad de una molécula de ADN que pueda usarse como
sonda. Esta sonda debe compartir al menos una parte de la secuencia del gen clonado. Si el gen en sí no
está disponible (lo que presumiblemente es el caso si el objetivo del experimento es proporcionar un clon
del mismo), ¿qué se puede usar como sonda?
En la práctica, la naturaleza de la sonda está determinada por la información disponible sobre
el gen deseado. Consideraremos tres posibilidades:

l Cuando el gen deseado se expresa a un alto nivel en un tipo de célula a partir del cual se
ha preparado una biblioteca de clones de ADNc; l Cuando la secuencia de aminoácidos
de la proteína codificada por el gen es completa o
parcialmente
conocido; l Cuando el gen es miembro de una familia de genes relacionados.

Sondeo de abundancia para analizar una biblioteca de

cDNA Como se describió anteriormente en este capítulo, una biblioteca de cDNA a menudo se prepara
para obtener un clon de un gen expresado en un nivel relativamente alto en un tipo de célula particular. En el
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138 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 8.12 Dos (a) Marcaje con un nucleótido biotinilado

métodos para el marcaje no radiactivo de sonda de ADN

sondas de ADN.
Biotina–dUTP

Traducción de nick,
B
relleno final o cebado
B
aleatorio
B
Hibridizar
B
B
BBBBB

Detectar con avidina

acoplada a un marcador
fluorescente
BBBBB

(b) Etiquetado con peroxidasa de rábano picante

Peroxidasa de
monocatenario
sonda de ADN rábano picante
+ glutaraldehído
HP

HP

HP
HP

Hibridizar

HP HP

Agregar luminol

quimioluminiscencia

HP HP

ejemplo de una biblioteca de cDNA de semillas de trigo en desarrollo, una gran proporción de los
clones son copias de las transcripciones de mRNA del gen de la gliadina (ver Figura 8.7e).
La identificación de los clones de gliadina es simplemente un caso de usar clones de ADNc
individuales de la biblioteca para sondear todos los demás miembros de la biblioteca (Figura
8.13). Se selecciona un clon al azar y la molécula de ADN recombinante se purifica, se marca y
se usa para sondear los clones restantes. Esto se repite con diferentes clones como sondas hasta
que se obtiene uno que se hibrida con una gran proporción de la biblioteca. Este ADNc abundante
se considera un posible clon de gliadina y se analiza con mayor detalle (p. ej., mediante
secuenciación de ADN y aislamiento del producto de traducción) para confirmar la identificación.

Sondas de oligonucleótidos para genes cuyos productos de traducción se han caracterizado A

menudo, el gen que se va a clonar codifica para una proteína que ya se ha estudiado con cierto
detalle. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína podría haberse determinado
utilizando técnicas de secuenciación disponibles desde hace más de 50 años. Si el
Machine Translated by Google

Capítulo 8 Cómo obtener un clon de un gen específico 139

Biblioteca de clones Figura 8.13 Sondeo

dentro de una biblioteca para identificar un clon

abundante.
A

Sonda A Sonda B
hibridación de colonias

Autorradiografías

Sonda A = Sonda B =
clon de baja abundancia clon de alta abundancia

Se conoce la secuencia de aminoácidos, entonces es posible usar el código genético para predecir
la secuencia de nucleótidos del gen relevante. Esta predicción es siempre una aproximación, ya que
solo la metionina y el triptófano pueden asignarse sin ambigüedad a codones triples, todos los
demás aminoácidos están codificados por al menos dos codones cada uno. Sin embargo, en la
mayoría de los casos, los diferentes codones de un aminoácido individual están relacionados. La
alanina, por ejemplo, está codificada por GCA, GCC, GCG y GCT, por lo que se pueden predecir
con certeza dos de los tres nucleótidos del triplete que codifica la alanina.
Como ejemplo para aclarar cómo se hacen estas predicciones, considere el citocromo c, una
proteína que juega un papel importante en la cadena respiratoria de todos los organismos aeróbicos.
La proteína citocromo c de la levadura se secuenció en 1963, y el resultado se muestra en la figura
8.14. Esta secuencia contiene un segmento, comenzando en el aminoácido 59, que corre Trp–Asp–
Glu–Asn–Asn–Met. El código genético establece que este hexapéptido está codificado por TGG–
GAT C–GAA G–AAT C–AAT C–ATG. Aunque esto representa un total de 16 secuencias posibles
diferentes, 14 de los 18 nucleótidos se pueden predecir con certeza.
Los oligonucleótidos de hasta unos 150 nucleótidos de longitud se pueden sintetizar fácilmente
en el laboratorio (Figura 8.15). Por lo tanto, se podría construir una sonda de oligonucleótidos de
acuerdo con la secuencia de nucleótidos predicha, y esta sonda podría ser capaz de

15
GLY– SER- ABAJO- LIGERO- LIGERO- GLY– ABAJO- THR– LEU– PHE– LIGERO- THR– ARG– CYS– GLU-30

LEU– CYS– SU– THR– VAL– GLU– LIGERO- GLY– GLY– PRO- SU- LIGERO- VAL– GLY– PRO–
45
ASN– LEU– SU- GLY– CON- PHE– GLY– ARG– SU- SER- GLY– GLN– ABAJO- GLN– GLY– 60

TYR– SER- TYR– THR– ÁSPID-ABAJO-ASN– CON- LEU– PRT– ASP–

LIGERO- LIGERO- ASN– VAL–
75
GLU- ASN– ASN–CON– SER- GLU- TYR– LEU– THR– ASN– PRO- TYR– ILE– LUZ TENUE-
90
PRO- GLY– THR– LIGERO- DE- ABAJO- PHE– GLY– GLY– LEU– LUZ TENUE- GLU- LIGERO- ASP–
103
ARG– ASN– ÁSPID- LEU– CON- THR– TYR– LEU– LUZ TENUE- ABAJO- CYS– GLU

Figura 8.14 La

secuencia de aminoácidos del citocromo c de levadura. El hexapéptido que está resaltado en rojo es el que se usa para ilustrar cómo se
puede predecir una secuencia de nucleótidos a partir de una secuencia de aminoácidos.
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140 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 8.15 Un 3'

5'
T Carbono 5' protegido
esquema simplificado para la síntesis de oligonucleótidos.
Soporte
Cada nucleótido se modifica mediante la unión de
de sílice Une el primer nucleótido
un grupo activador al carbono 3' y un grupo protector
al soporte.
al carbono 5' . El grupo activador permite que el
proceso normalmente ineficiente de unión de
T
nucleótidos avance mucho más rápidamente.
El grupo protector asegura que los nucleótidos
Segundo nucleótido:
individuales no puedan unirse entre sí y, en
Retire la carbonos 5 'protegidos y
cambio, reaccionen solo con el grupo 5 ' terminal del protección de 5' 3' activados
oligonucleótido en crecimiento, y este grupo 5' se
desprotege mediante tratamiento químico en el punto
3' 5'
5'
apropiado de cada ciclo de síntesis. T GRAMO

Condensación

T GRAMO

Retire la tercer
protección de 5' nucleótido

3' 5'
T GRAMO
5' GRAMO

Condensación

T GRAMO GRAMO

Continúe hasta la longitud deseada,

luego separe del soporte

GRAMO
nucleótido Soporte de sílice

Grupo protector 5', por ejemplo, dimetoxitritilo

Grupo activador en 3', por ejemplo, diisopropilfosforamidita

identificar el gen que codifica la proteína en cuestión. En el ejemplo del citocromo c de

levadura, los 16 posibles oligonucleótidos que pueden codificar Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met se
sintetizarían, ya sea por separado o como un grupo, y luego se usarían para sondear una
biblioteca genómica o de ADNc de levadura ( Figura 8.16). Uno de los oligonucleótidos de la
sonda tendrá la secuencia correcta para esta región del gen del citocromo c, y su señal de
hibridación indicará qué clones portan este gen.
El resultado se puede comprobar realizando un segundo sondeo con una mezcla de
oligonucleótidos cuyas secuencias se predicen a partir de un segmento diferente de la proteína
citocromo c (Figura 8.16). Sin embargo, el segmento de la proteína utilizado para la predicción
de la secuencia de nucleótidos debe elegirse con cuidado: el hexapéptido Ser–Glu–Tyr–Leu–
Thr–Asn, que sigue inmediatamente a nuestra primera elección, podría estar codificado por
varios miles de secuencias diferentes de 18 nucleótidos. , claramente una elección inadecuada
para una sonda sintética.
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Capítulo 8 Cómo obtener un clon de un gen específico 141

Biblioteca de genes Figura 8.16 El uso

de ADN de levadura
Oligonucleótidos sintéticos de un oligonucleótido sintético marcado
marcados en el extremo en el extremo para identificar un clon del gen del
citocromo c de levadura.

Sondeo
de hibridación
de colonias
Los oligonucleótidos se hibridan
con el clon del citocromo c

Autorradiografía

Probable
clon de
citocromo c

¿Señal no
específica?

Reprobar con el segundo

oligonucleótido predicho

Identificación
definitiva del
clon de citocromo c

El sondeo heterólogo permite identificar genes relacionados A menudo,

se observa una cantidad sustancial de similitud de nucleótidos cuando se comparan dos genes para la
misma proteína, pero de diferentes organismos, un reflejo de la conservación de la estructura del gen
durante la evolución. Con frecuencia, dos genes de organismos relacionados son suficientemente
similares para que una sonda monocatenaria preparada a partir de un gen forme un híbrido estable con
el segundo gen. Aunque las dos moléculas no son del todo complementarias, se forman suficientes
pares de bases para producir una estructura estable (figura 8.17a).
El sondeo heterólogo hace uso de la hibridación entre secuencias relacionadas para la identificación
de clones. Por ejemplo, el gen del citocromo c de levadura, identificado en la sección anterior mediante
sondeo de oligonucleótidos, podría utilizarse como sonda de hibridación para identificar genes del
citocromo c en bibliotecas de clones de otros organismos. Una sonda preparada a partir del gen de la
levadura no sería completamente complementaria al gen de, digamos, el hongo Neurospora crassa,
pero debería ocurrir suficiente apareamiento de bases para que se forme un híbrido (Figura 8.17b).

El sondeo heterólogo también puede identificar genes relacionados en el mismo organismo. Si el

clon de cDNA de gliadina de trigo, identificado anteriormente en el capítulo por sondeo de abundancia,
se utiliza para sondear una biblioteca genómica, se hibridará no solo con su propio gen sino también con un
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142 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

(a) Un híbrido entre dos hebras de ADN relacionadas

Emparejamiento suficiente
para formar una estructura estable

(b) Sondeo heterólogo entre especies Clon probable del citocromo c

de Neurospora

Gen del citocromo c

de levadura marcado

Biblioteca de genes de
ADN de neurospora

(c) Sondaje heterólogo dentro de una especie

ADNc de gliadina
marcado

Miembros de la

familia multigénica
de las gliadinas

Biblioteca de genes de trigo

Figura 8.17
Sondaje heterólogo.

variedad de otros genes también (Figura 8.17c). Todos ellos están relacionados con el ADNc de la
gliadina, pero tienen secuencias de nucleótidos ligeramente diferentes. Esto se debe a que las gliadinas
del trigo forman un grupo complejo de proteínas relacionadas que están codificadas por los miembros
de una familia multigénica. Una vez que se ha clonado un gen de la familia, todos los demás
miembros pueden aislarse mediante sondeo heterólogo.

La hibridación Southern permite identificar un fragmento de restricción específico que contiene

un gen . Además del análisis de hibridación de colonias y placas, también hay ocasiones en las
que es necesario usar sondeo de hibridación para identificar cuál de una serie de fragmentos de
restricción contiene un gen de interés. Como ejemplo, volveremos al clon genómico del gen del
citocromo c de levadura, que identificamos mediante sondeo de hibridación de oligonucleótidos.
Imaginemos que esta biblioteca genómica particular se preparó mediante restricción parcial de ADN
de levadura con BamHI seguida de clonación en el vector cósmido pJB8 (pág. 101). El fragmento
clonado que contiene el gen del citocromo c tendrá, por tanto, una longitud aproximada de 40 kb, y
probablemente contendrá unos diez fragmentos BamHI , recordando que el sitio de reconocimiento del
hexanucleótido para esta enzima estará presente, en promedio, una vez cada 46 = 4096 pb.

El gen del citocromo c, por otro lado, se prevé que tenga solo 309 pb de longitud (sabemos que la
proteína tiene 103 aminoácidos; consulte la figura 8.14). Por lo tanto, el gen constituye menos del 1%
del fragmento de ADN clonado y es muy posible que otros genes
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Capítulo 8 Cómo obtener un clon de un gen específico 143

Gen del citocromo c Otros genes

B BBB
B B B
B
B

Figura 8.18 Un
fragmento largo de ADN clonado puede contener varios genes además del que nos interesa. B = sitio de
restricción BamHI .

(a) Electroforesis de ADN restringido con BamHI Figura 8.19

Hibridación Southern.

Fragmentos BamHI

(b) Transferencia Sur

Toallas de papel
Membrana de
Mecha
nitrocelulosa o nylon
Buffer Gel

Apoyo

(c) Resultado del sondeo de hibridación

señal positiva

que no nos interesan también están presentes en este inserto (Figura 8.18). El método
denominado hibridación Southern permite identificar el fragmento de restricción individual que
contiene el gen del citocromo c.
El primer paso en el uso de la hibridación de Southern para este propósito sería digerir el
clon con BamHI y luego separar los fragmentos de restricción por electroforesis en un gel de
agarosa (Figura 8.19a). El objetivo es utilizar la sonda de oligonucleótidos para el citocromo c
para identificar el fragmento que contiene el gen. Esto se puede intentar mientras los fragmentos
de restricción todavía están contenidos en el gel de electroforesis, pero los resultados no suelen
ser muy buenos, ya que la matriz del gel provoca una gran cantidad de hibridación de fondo
falsa que oscurece la señal de hibridación específica. En cambio, las bandas de ADN en el gel
de agarosa se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o nailon, lo que proporciona un
entorno mucho más "limpio" para el experimento de hibridación.
La transferencia de bandas de ADN de un gel de agarosa a una membrana hace uso de la
técnica perfeccionada en 1975 por el profesor EM Southern y denominada transferencia
Southern. La membrana se coloca en el gel y se deja que el tampón penetre, transportando el
ADN del gel a la membrana donde se une el ADN. Se pueden comprar aparatos sofisticados
para ayudar en este proceso, pero muchos biólogos moleculares prefieren una configuración
casera que incorpore muchas toallas de papel y un equilibrio considerable.
Machine Translated by Google
144 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

habilidades (Figura 8.19b). El mismo método también se puede utilizar para la transferencia de moléculas
de ARN (transferencia "norteña") o proteínas (transferencia "occidental"). ¡Hasta ahora a nadie se le
han ocurrido transferencias "orientales"!
La transferencia Southern da como resultado una membrana que lleva una réplica de las bandas de
ADN del gel de agarosa. Si ahora se aplica la sonda marcada, se produce la hibridación y la autoradiografía
(o el sistema de detección equivalente para una sonda no radiactiva) revela qué fragmento de restricción
contiene el gen clonado (Figura 8.19c).

8.4.4 Métodos de identificación basados en la detección del producto de traducción

del gen clonado El sondeo de hibridación suele ser el método preferido para la

identificación de un recombinante particular de una biblioteca de clones. La técnica es fácil de realizar y,

con las modificaciones introducidas en los últimos años, se puede utilizar para comprobar hasta 10 000
recombinantes por experimento, lo que permite examinar grandes bibliotecas genómicas en un tiempo
razonablemente corto. Sin embargo, el requerimiento de una sonda que sea al menos parcialmente
complementaria al gen deseado a veces hace que sea imposible usar la hibridación en la identificación de
clones. En estas ocasiones se necesita una estrategia diferente.

La principal alternativa al sondeo de hibridación es el cribado inmunológico. La distinción es que,

mientras que con el sondeo de hibridación el fragmento de ADN clonado se identifica directamente, un
método inmunológico detecta la proteína codificada por el gen clonado. Por tanto, las técnicas
inmunológicas presuponen que el gen clonado se está expresando, de modo que se está produciendo la
proteína, y que esta proteína normalmente no está presente en las células huésped.

Los anticuerpos son necesarios para los métodos de detección

inmunológicos. Si se inyecta una muestra purificada de una proteína en el torrente sanguíneo de un
conejo, el sistema inmunitario del animal responde sintetizando anticuerpos que se unen a la molécula
extraña y ayudan a degradarla (Figura 8.20a). Esta es una versión de la defensa natural.

Figura 8.20 (a) Los anticuerpos se unen a moléculas extrañas

Anticuerpos. (a) Los anticuerpos en el torrente

sanguíneo se unen a moléculas extrañas y ayudan a
degradarlas. (b) Los anticuerpos purificados se pueden
Molécula extraña, por
obtener de un pequeño volumen de sangre extraído de
ejemplo, proteína
un conejo inyectado con la proteína extraña.

anticuerpos

(b) Purificación de anticuerpos

Quitar 10ml
de sangre

Conejo inyectado con Sangre Anticuerpo

proteína extraña purificado
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Capítulo 8 Cómo obtener un clon de un gen específico 145

(a) Inmunodetección colonias

Figura 8.21 Uso de

un anticuerpo purificado para detectar proteína

Membrana
en colonias recombinantes. En lugar de la proteína
A marcada, se puede marcar el propio anticuerpo o,
Lyse células
alternativamente, se puede usar un segundo anticuerpo
(cloroformo)
marcado que se une específicamente al anticuerpo
primario.

El anticuerpo se adhiere a Agregar anticuerpo

las células lisadas que específico

contienen proteína clonada.

Agregar proteína A

marcada con 125I

La proteína A se une
al anticuerpo

(b) La autorradiografía
Señal positiva =
resultante proteína clonada
de síntesis
recombinante

mecanismo que utiliza el animal para hacer frente a la invasión de bacterias, virus y otros agentes
infecciosos.
Una vez que un conejo es desafiado con una proteína, los niveles de anticuerpos presentes en
su torrente sanguíneo permanecen lo suficientemente altos durante los próximos días para que se
purifiquen cantidades sustanciales. No es necesario matar al conejo, porque tan solo 10 ml de sangre
proporcionan una cantidad considerable de anticuerpos (Figura 8.20b). Este anticuerpo purificado se
une únicamente a la proteína con la que se expuso originalmente al animal.

Uso de un anticuerpo purificado para detectar proteínas en colonias

recombinantes Hay varias versiones de detección inmunológica, pero el método más útil es una
contrapartida directa del sondeo de hibridación de colonias. Las colonias recombinantes se transfieren
a una membrana de polivinilo o nitrocelulosa, se lisan las células y se agrega una solución que
contiene el anticuerpo específico (Figura 8.21a). En los métodos originales, se marcaba el propio
anticuerpo o se lavaba posteriormente la membrana con una solución de proteína A marcada, una
proteína bacteriana que se une específicamente a las inmunoglobulinas de las que están hechos los
anticuerpos (como se muestra en la figura 8.21a). En los métodos más modernos, el anticuerpo unido,
el anticuerpo primario, se detecta lavando la membrana con un anticuerpo secundario marcado,
que se une específicamente al anticuerpo primario. Varias moléculas de anticuerpos secundarios
pueden unirse a una única molécula de anticuerpo primario, lo que aumenta la cantidad de señal que
se produce y permite una detección más clara de cada colonia positiva. En los tres métodos, el
marcador puede ser radiactivo, en cuyo caso las colonias que se unen al marcador se detectan
mediante autorradiografía (Figura 8.21b), o se pueden utilizar marcadores no radiactivos que
produzcan una señal fluorescente o quimioluminiscente.
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146 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

El problema de la expresión génica

El cribado inmunológico depende de que el gen clonado se exprese de modo que el producto
de traducción de la proteína esté presente en las células recombinantes. Sin embargo, como
se discutirá con mayor detalle en el Capítulo 13, un gen de un organismo a menudo no se
expresa en un organismo diferente. En particular, es muy poco probable que un gen animal o
vegetal clonado (con la excepción de los genes del cloroplasto) se exprese en células de E. coli .
Este problema se puede sortear usando un tipo especial de vector, llamado vector de
expresión (pág. 227), diseñado específicamente para promover la expresión del gen clonado
en un huésped bacteriano. La selección inmunológica de colonias de E. coli recombinantes
que portan genes animales clonados en vectores de expresión ha sido muy útil para identificar
genes para varias hormonas importantes.

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Benton, WD & Davis, RW (1977) Detección de clones recombinantes de lgt por hibridación con
placas individuales in situ. Ciencia, 196, 180–182.
Feinberg, AP & Vogelstein, B. (1983) Una técnica para marcar fragmentos de restricción de ADN para una
alta actividad específica. Bioquímica analítica, 132, 6–13. [Etiquetado de cebado aleatorio.]
Grunstein, M. & Hogness, DS (1975) Hibridación de colonias: un método para el aislamiento de ADNc
clonados que contienen un gen específico. Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los EE. UU.,
72, 3961–3965.
Gubler, U. & Hoffman, BJ (1983) Un método simple y muy eficiente para generar ADNc
bibliotecas Gene, 25, 263–269.
Southern, EM (2000) Blotting en 25. Trends in Biochemical Science, 25, 585–588. [Él
orígenes de la hibridación sureña.]
Thorpe, GHG, Kricka, LJ, Moseley, SB & Whitehead, TP (1985) Fenoles como potenciadores de la
reacción quimioluminiscente de peroxidasa de rábano picante-luminol-peróxido de hidrógeno:
aplicación en inmunoensayos enzimáticos monitoreados por luminiscencia. Química clínica, 31,
1335-1341. [Describe la base de un método de etiquetado no radiactivo.]
Young, RA & Davis, RW (1983) Aislamiento eficiente de genes mediante el uso de sondas de anticuerpos.
Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los EE. UU., 80, 1194–1198.
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Capítulo 9

La cadena de la polimerasa
Reacción

Contenido del capítulo

CONTENIDO DEL CAPÍTULO

9.1 Resumen de la reacción en cadena de la

polimerasa 9.2 PCR con más detalle 9.3 Después de
la PCR: estudio de los productos de la PCR 9.4 La
PCR en tiempo real permite cuantificar la cantidad de material de partida

Como resultado de los últimos siete capítulos, nos hemos familiarizado no solo con los principios
básicos de la clonación de genes, sino también con técnicas fundamentales de biología molecular
como el análisis de restricción, la electroforesis en gel, el marcaje de ADN y la hibridación ADN-ADN.
Para completar nuestra educación básica en análisis de ADN, ahora debemos volver a la segunda
técnica importante para estudiar genes, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR es una
técnica muy sencilla: todo lo que sucede es que una región corta de una molécula de ADN, por ejemplo
un solo gen, es copiada muchas veces por una enzima ADN polimerasa (ver Figura 1.2). Este puede
parecer un ejercicio bastante trivial, pero tiene multitud de aplicaciones en la investigación genética y
en áreas más amplias de la biología.
Comenzamos este capítulo con un resumen de la reacción en cadena de la polimerasa para
comprender exactamente lo que logra. Luego veremos las cuestiones clave que determinan si un
experimento de PCR individual tiene éxito o no, antes de examinar algunos de los métodos que se han
ideado para estudiar los fragmentos de ADN amplificados que se obtienen.

9.1 Resumen de la reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa da como resultado la amplificación selectiva de una región
elegida de una molécula de ADN. Se puede elegir cualquier región de cualquier molécula de ADN,
siempre que se conozcan las secuencias en los bordes de la región. Las secuencias fronterizas deben
conocerse porque para llevar a cabo una PCR, dos oligonucleótidos cortos deben hibridarse con el

Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010 147
por Blackwell Publishing.
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148 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 9.1 3' 5'

Hibridación de los cebadores de oligonucleótidos con el 5' 3'
ADN molde al comienzo de una PCR.
Desnaturalizar

3' 5'

5' 3'

Agregar cebadores de oligonucleótidos

3' 5'

5' 3'
3' 5'

5' 3'
Región a amplificar

Molécula de ADN, una para cada hebra de la doble hélice (Figura 9.1). Estos oligonucleótidos,
que actúan como cebadores de las reacciones de síntesis del ADN, delimitan la región que será
amplificada.
La amplificación suele llevarse a cabo mediante la enzima ADN polimerasa I de Thermus
aquaticus. Como se menciona en la pág. 49, este organismo vive en aguas termales y muchas de
sus enzimas, incluida la polimerasa Taq , son termoestables, lo que significa que son resistentes a
la desnaturalización por tratamiento térmico. Como será evidente en un momento, la termoestabilidad
de la polimerasa Taq es un requisito esencial en la metodología de PCR.
Para llevar a cabo un experimento de PCR, el ADN objetivo se mezcla con la polimerasa Taq ,
los dos cebadores de oligonucleótidos y un suministro de nucleótidos. La cantidad de ADN objetivo
puede ser muy pequeña porque la PCR es extremadamente sensible y funcionará con una sola
molécula inicial. La reacción se inicia calentando la mezcla a 94°C. A esta temperatura, los enlaces
de hidrógeno que mantienen unidos a los dos polinucleótidos de la doble hélice se rompen, por lo
que el ADN diana se desnaturaliza en moléculas monocatenarias (Figura 9.2). Luego, la temperatura
se reduce a 50–60 °C, lo que da como resultado que las hebras simples del ADN objetivo se
vuelvan a unir, pero también permite que los cebadores se adhieran a sus posiciones de hibridación.
Ahora puede comenzar la síntesis de ADN, por lo que la temperatura se eleva a 74°C, justo por
debajo del nivel óptimo para la polimerasa Taq . En esta primera etapa de la PCR, se sintetiza un
conjunto de “productos largos” a partir de cada hebra del ADN diana. Estos polinucleótidos tienen
extremos 5' idénticos pero extremos 3' aleatorios, estos últimos representan posiciones en las que
la síntesis de ADN termina por casualidad.
El ciclo de desnaturalización-recocido-síntesis ahora se repite (Figura 9.3). Los productos largos
se desnaturalizan y las cuatro hebras resultantes se copian durante la etapa de síntesis del ADN.
Esto da cuatro moléculas de doble cadena, dos de las cuales son idénticas a los productos largos
del primer ciclo y dos de las cuales están hechas completamente de ADN nuevo. Durante el tercer
ciclo, estos últimos dan lugar a “productos cortos”, cuyos extremos 5' y 3' están fijados por las
posiciones de recocido del primer. En ciclos posteriores, el número de productos cortos se acumula
de forma exponencial (duplicándose durante cada ciclo) hasta que uno de los componentes de la
reacción se agota. Esto significa que después de 30 ciclos, habrá más de 130 millones de productos
cortos derivados de cada molécula inicial. En términos reales, esto equivale a varios microgramos
de producto de PCR a partir de unos pocos nanogramos o menos de ADN objetivo.
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Capítulo 10 La reacción en cadena de la polimerasa 149

Región a amplificar Figura 9.2 La

5' 3'
primera etapa de una PCR, que da como
ADN diana
3' 5' resultado la síntesis de los productos largos.

Desnaturalización a 94°C

5' 3'

3' 5'

Enfriar a 50–60°C

5' 3'

imprimaciones

3' 5'

Síntesis de ADN a 74°C

5' 3'

3' 5'
Productos 'largos'
5' 3'

3' 5'

Al final de una PCR, se suele analizar una muestra de la mezcla de reacción mediante electroforesis
en gel de agarosa, habiendo producido suficiente ADN para que el fragmento amplificado sea visible como
una banda discreta después de la tinción con bromuro de etidio. Esto por sí mismo puede proporcionar
información útil sobre la región de ADN que se ha amplificado o, alternativamente, el producto de PCR
puede examinarse mediante técnicas como la secuenciación de ADN.

9.2 PCR en más detalle

Aunque los experimentos de PCR son muy fáciles de configurar, deben planificarse cuidadosamente para
que los resultados sean de algún valor. Las secuencias de los cebadores son fundamentales para el éxito
del experimento, al igual que las temperaturas precisas utilizadas en las etapas de calentamiento y
enfriamiento del ciclo de reacción.

9.2.1 Diseño de los cebadores de oligonucleótidos para una PCR

Los cebadores son la clave del éxito o el fracaso de un experimento de PCR. Si los cebadores están
diseñados correctamente, el experimento da como resultado la amplificación de un solo fragmento de
ADN, correspondiente a la región objetivo de la molécula molde. Si los cebadores están diseñados
incorrectamente, el experimento fallará, posiblemente porque no se produce la amplificación, o posiblemente
porque se amplifica el fragmento incorrecto o más de un fragmento (Figura 9.4).
Claramente, se debe pensar mucho en el diseño de los cebadores.
Elaborar secuencias apropiadas para los cebadores no es un problema: deben corresponder con las
secuencias que flanquean la región diana en la molécula plantilla.
Cada cebador debe, por supuesto, ser complementario (no idéntico) a su hebra molde en
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150 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

5' 3'

3' 5' productos

5' 3' primer ciclo

3' 5'

Desnaturalizar

síntesis de ADN

Productos de
segundo ciclo

Desnaturalizar

síntesis de ADN

Producto 'corto':
Productos de
se acumula de
tercer ciclo
manera exponencial

Figura 9.3 El
segundo y tercer ciclo de una PCR, durante los cuales se sintetizan los primeros productos cortos.

Figura 9.4 Los

resultados de las PCR con cebadores bien 1 234
diseñados y mal diseñados. El carril 1 muestra
un solo fragmento amplificado del tamaño
esperado, resultado de un experimento bien diseñado.
Marcadores de tamaño
En el carril 2 no hay producto de amplificación,
lo que sugiere que uno o ambos cebadores no
pudieron hibridar con el ADN molde.
Los carriles 3 y 4 muestran,
respectivamente, un producto de amplificación de
tamaño incorrecto y una mezcla de productos (el
producto correcto más dos incorrectos); ambos
resultados se deben a la hibridación de uno o
ambos cebadores con sitios no diana en la molécula de ADN molde.
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Capítulo 10 La reacción en cadena de la polimerasa 151

Gen de la ÿ-globina humana Figura 9.5 Un par

de cebadores diseñados para amplificar el gen de la

100 pb globina ÿ1 humana. Los exones del gen se muestran como

recuadros cerrados, los intrones como recuadros abiertos.

3'...GTGTTCTGAGTCTCTCTTGGGTGG...
AGACTCAGAGAGAACCC 5'
3'
5'... CACAGACTCAGAGAGAACCCACC...

... ATGGGGGCACCAGAAACTTATTT ... 5'

3' 5'
GGGGCACCAGAAACTTA
... TACCCCCGTGGTCTTTGAATAAA ... 3'

(a) PCR de ADN humano con cebadores 8-mer Figura 9.6 Las
Sitios de hibridación longitudes de los cebadores son fundamentales
para la especificidad de la PCR.
3' 5'

5' 3'

Varios pares de cebadores

pueden dar productos de amplificación
1Kb

(b) PCR de ADN humano con cebadores de 17 meros

3' 5'

5' 3'

Solo se amplifica el
fragmento deseado.

para que ocurra la hibridación, y los extremos 3' de los cebadores hibridados deben apuntar uno hacia el
otro (Figura 9.5). El fragmento de ADN a amplificar no debe tener más de 3 kb de longitud e idealmente
menos de 1 kb. Los fragmentos de hasta 10 kb pueden amplificarse mediante técnicas de PCR estándar,
pero cuanto más largo es el fragmento, menos eficiente es la amplificación y más difícil es obtener
resultados consistentes. La amplificación de fragmentos muy largos (hasta 40 kb) es posible, pero requiere
métodos especiales.
El primer tema importante a abordar es la longitud de los cebadores. Si los cebadores son demasiado
cortos, pueden hibridarse con sitios no objetivo y generar productos de amplificación no deseados. Para
ilustrar este punto, imagine que el ADN humano total se usa en un experimento de PCR con un par de
cebadores de ocho nucleótidos de longitud (en la jerga de PCR, estos se denominan "8-mers"). El
resultado probable es que se amplificarán varios fragmentos diferentes. Esto se debe a que se espera
que los sitios de unión para estos cebadores ocurran, en promedio, una vez cada 48 = 65 536 pb, dando
aproximadamente 49 000 sitios posibles en los 3 200 000 kb de secuencia de nucleótidos que componen
el genoma humano. Esto significa que sería muy poco probable que un par de cebadores de 8 meros
dieran un solo producto de amplificación específico con ADN humano (Figura 9.6a).

¿Qué ocurre si se utilizan los cebadores de 17 mer que se muestran en la figura 9.5? La frecuencia
esperada de una secuencia de 17 mer es una vez cada 417 = 17.179.869.184 pb. Esta cifra es más de cinco
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152 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 9.7 Un 100 Desnaturalización

(1 min)
perfil de temperatura típico para una PCR.

90

80

Extensión (2
Temperatura
°C
70 minutos)

60

50 Recocido
(1 min)

1
40 0 234 567
Tiempo (minutos)

veces mayor que la longitud del genoma humano, por lo que se esperaría que un cebador de 17 mer
tuviera solo un sitio de hibridación en el ADN humano total. Por lo tanto, un par de cebadores de 17
unidades debería dar un único producto de amplificación específico (Figura 9.6b).
¿Por qué no simplemente hacer que los cebadores sean lo más largos posible? La longitud del cebador
influye en la velocidad a la que se hibrida con el ADN molde, los cebadores largos hibridan a una velocidad
más lenta. La eficiencia de la PCR, medida por el número de moléculas amplificadas producidas durante
el experimento, se reduce por lo tanto si los cebadores son demasiado largos, ya que la hibridación
completa con las moléculas molde no puede ocurrir en el tiempo permitido durante el ciclo de reacción. En
la práctica, rara vez se utilizan cebadores de más de 30 mer.

9.2.2 Determinación de las temperaturas correctas de uso

Durante cada ciclo de una PCR, la mezcla de reacción se transfiere entre tres temperaturas (Figura 9.7):

l La temperatura de desnaturalización, generalmente 94 °C, que rompe los pares de bases y libera
ADN monocatenario para que actúe como molde en la siguiente ronda de síntesis de ADN;

l La temperatura de hibridación o hibridación, a la que los cebadores se unen al

plantillas;
l La temperatura de extensión, a la que se produce la síntesis de ADN. Esto generalmente se establece
en 74 ° C, justo por debajo del óptimo para la polimerasa Taq .

La temperatura de recocido es importante porque, nuevamente, esto puede afectar la especificidad de

la reacción. La hibridación ADN-ADN es un fenómeno dependiente de la temperatura. Si la temperatura es
demasiado alta, no tiene lugar la hibridación; en cambio, los cebadores y las plantillas permanecen
disociados (Figura 9.8a). Sin embargo, si la temperatura es demasiado baja, los híbridos no coincidentes
(aquellos en los que no se han formado todos los pares de bases correctos) son estables (Figura 9.8b). Si
esto ocurre, los cálculos anteriores con respecto a las longitudes apropiadas para los cebadores se vuelven
irrelevantes, ya que estos cálculos suponían que solo se podían formar híbridos cebador-plantilla perfectos.
Si se toleran los desajustes,
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Capítulo 10 La reacción en cadena de la polimerasa 153

(a) La temperatura de recocido es demasiado alta Figura 9.8 La

temperatura tiene un efecto importante en la hibridación
de los cebadores con el ADN molde.
Los cebadores y las plantillas
permanecen disociados

(b) La temperatura de recocido es demasiado baja

Híbrido no coincidente: no
se han formado todos los pares
de bases correctos

(c) Temperatura de recocido correcta

El cebado ocurre solo en los

sitios de destino deseados

el número de sitios de hibridación potenciales para cada cebador aumenta considerablemente, y

es más probable que ocurra la amplificación en sitios no diana en la molécula molde.
La temperatura de hibridación ideal debe ser lo suficientemente baja para permitir la hibridación
entre el cebador y la plantilla, pero lo suficientemente alta para evitar que se formen híbridos no
coincidentes (Figura 9.8c). Esta temperatura se puede estimar determinando la temperatura de
fusión o Tm del híbrido cebador-plantilla. La Tm es la temperatura a la que se disocia (“se funde”)
el híbrido con el par de bases correcto. Una temperatura de 1 a 2 °C por debajo de esta debería
ser lo suficientemente baja como para permitir que se forme el híbrido cebador-plantilla correcto,
pero demasiado alta para que un híbrido con un único desajuste sea estable. La Tm se puede
determinar experimentalmente, pero generalmente se calcula a partir de la fórmula simple (Figura 9.9):

Tm = (4 × [G + C]) + (2 × [A + T])°C

donde [G + C] es el número de nucleótidos G y C en la secuencia del cebador, y [A + T] es el

número de nucleótidos A y T.
Por lo tanto, la temperatura de hibridación para un experimento de PCR se determina
calculando la Tm para cada cebador y usando una temperatura de 1 a 2 °C por debajo de esta
cifra. Tenga en cuenta que esto significa que los dos cebadores deben diseñarse para que tengan
Tms idénticos. Si este no es el caso, la temperatura de recocido adecuada para un primer puede
ser demasiado alta o demasiado baja para el otro miembro del par.

9.3 Después de la PCR: estudio de los productos de la PCR

La PCR suele ser el punto de partida de una serie más larga de experimentos en los que el
producto de la amplificación se estudia de varias formas para obtener información sobre la molécula
de ADN que actuó como molde original. Encontraremos muchos estudios de este tipo en las Partes
II y III, cuando examinemos las aplicaciones de la clonación de genes y la PCR.
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154 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 9.9 Secuencia del cebador: 5' AGACTCAGAGAGAACCC 3'

Cálculo de la Tm de un cebador.
4 Gs 5 Cs 7 Como 1 T

Tm = (4 × 9) + (2 × 8)
= 36 + 16
= 52°C

en investigación y biotecnología. Aunque se ha ideado una amplia gama de procedimientos para estudiar los
productos de PCR, tres técnicas son especialmente importantes:

l Electroforesis en gel de productos de PCR l

Clonación de productos de PCR l Secuenciación
de productos de PCR.

Las dos primeras de estas técnicas se tratan en este capítulo. La tercera técnica se pospone hasta el Capítulo
10, cuando se cubrirán todos los aspectos de la secuenciación del ADN.

9.3.1 Electroforesis en gel de productos de PCR

Los resultados de la mayoría de los experimentos de PCR se verifican procesando una porción de la mezcla
de reacción amplificada en un gel de agarosa. Una banda que representa el ADN amplificado puede ser
visible después de la tinción, o si el rendimiento de ADN es bajo, el producto puede detectarse mediante
hibridación de Southern (pág. 142). Si la banda esperada está ausente, o si hay bandas adicionales presentes,
algo salió mal y se debe repetir el experimento.
En algunos casos, la electroforesis en gel de agarosa se usa no solo para determinar si un experimento
de PCR ha funcionado, sino también para obtener información adicional. Por ejemplo, la presencia de sitios
de restricción en la región amplificada del ADN molde se puede determinar tratando el producto de la PCR
con una endonucleasa de restricción antes de pasar la muestra al gel de agarosa (Figura 9.10). Este es un
tipo de análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y es importante tanto
en la construcción de mapas genómicos (p. 180) como en el estudio de enfermedades genéticas (p. 257).

Como alternativa, se puede utilizar el tamaño exacto del producto de la PCR para establecer si el ADN
molde contiene una mutación por inserción o deleción en la región amplificada (Figura 9.10).
Las mutaciones de longitud de este tipo forman la base de la elaboración de perfiles de ADN, una técnica
central en la ciencia forense (capítulo 16).
En algunos experimentos, la mera presencia o ausencia del producto de PCR es la característica de
diagnóstico. Un ejemplo es cuando se usa la PCR como procedimiento de selección para identificar un gen
deseado de una biblioteca genómica o de ADNc. Llevar a cabo PCR con cada clon en una biblioteca genómica
puede parecer una tarea tediosa, pero una de las ventajas de la PCR es que los experimentos individuales se
configuran rápidamente y muchas PCR se pueden realizar en paralelo. La carga de trabajo también se puede
reducir mediante la selección combinatoria, un ejemplo de lo cual se muestra en la Figura 9.11.

9.3.2 Clonación de productos de PCR

Algunas aplicaciones requieren que, después de una PCR, los productos resultantes se unan a un vector y
se examinen mediante cualquiera de los métodos estándar utilizados para estudiar el ADN clonado.
Esto puede sonar fácil, pero hay complicaciones.
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Capítulo 10 La reacción en cadena de la polimerasa 155

R R R
1 2 3

PCR
PCR PCR
Restringir

1 23

Marcadores de tamaño

Figura 9.10 La

electroforesis en gel del producto de PCR puede proporcionar información sobre la molécula de ADN molde. Los carriles 1 y 2 muestran,
respectivamente, un producto de PCR no restringido y un producto restringido con la enzima que corta en el sitio R. El carril 3 muestra el
resultado obtenido cuando el ADN molde contiene una inserción en la región amplificada.

Fila
A mezcla, polimerización en cadena

B
C
D
Y
F
GRAMO

Repita para todas las filas

en las 10 bandejas = 80 PCR

Columna 123456789 10 11 12

Repita para todas las columnas

mezcla, polimerización en cadena
en las 10 bandejas = 120 PCR

Figura 9.11 Cribado

combinatorio de clones en bandejas de microtitulación. Una biblioteca de 960 clones se analiza mediante una serie de PCR, cada una con
una combinación de clones. Las combinaciones de clones que dan resultados positivos permiten identificar los pocillos que contienen clones
positivos. Por ejemplo, si se dan PCR positivas con la fila A de la bandeja 2, la fila D de la bandeja 6, la columna 7 de la bandeja 2 y la columna
9 de la bandeja 6, entonces se puede deducir que hay clones positivos en el pocillo A7 de la bandeja 2. y pozo D9 de la bandeja 6.

Aunque hay 960 clones, la identificación inequívoca de los clones positivos se logra después de solo 200 PCR.
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156 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

5' 3' Figura 9.12 Los

TC CGA
A Georgia A ........... AA TTA
C A TT T
polinucleótidos sintetizados por la polimerasa Taq
A GA T
GCT Connecticut ........... AA TTT
GRAMO Automóvil club británico

T 3' un 5'
suelen tener una adenosina adicional en sus extremos 3' .

producto PCR
A
A

T T A
T A T

Vincularse
vector de cola en T

Figura 9.13 Uso de

un vector de cola en T especial para clonar un producto de PCR.

El primer problema se refiere a los extremos de los productos de PCR. A partir de un examen de la
figura 9.3, se podría imaginar que los productos cortos resultantes de la amplificación por PCR tienen
extremos romos. Si este fuera el caso, podrían insertarse en un vector de clonación mediante ligación de
extremos romos o, alternativamente, los productos de PCR podrían tener extremos cohesivos mediante
la unión de enlazadores o adaptadores (pág. 64). Desafortunadamente, la situación no es tan sencilla. La
polimerasa Taq tiende a agregar un nucleótido adicional, generalmente una adenosina, al final de cada
hebra que sintetiza. Esto significa que un producto de PCR de doble cadena no tiene extremos romos y,
en cambio, la mayoría de los extremos 3 'tienen un solo nucleótido sobresaliente (Figura 9.12). Los
salientes podrían eliminarse mediante el tratamiento con una enzima exonucleasa, lo que daría como
resultado productos de PCR con verdaderos extremos romos, pero este no es un enfoque popular ya que
es difícil evitar que la exonucleasa se vuelva demasiado activa y cause más daño a los extremos de las
moléculas. .
Una solución es utilizar un vector de clonación especial que tenga salientes de timidina (T) y que, por
lo tanto, pueda ligarse a un producto de PCR (Figura 9.13). Estos vectores generalmente se preparan
restringiendo un vector estándar en un sitio de extremos romos y luego tratándolos con polimerasa Taq
en presencia de solo 2'-desoxitimidina 5'-trifosfato (dTTP).
No hay cebador presente, por lo que todo lo que puede hacer la polimerasa es agregar un nucleótido T a
los extremos 3 'de la molécula del vector de extremos romos, lo que da como resultado el vector de cola
T en el que se pueden insertar los productos de PCR. También se han diseñado vectores especiales de
este tipo para usar con el método de ligadura de topoisomerasa descrito en la pág. 69, y esta es
actualmente la forma más popular de clonar productos de PCR.
Una segunda solución es diseñar cebadores que contengan sitios de restricción. Después de la PCR,
los productos se tratan con la endonucleasa de restricción, que corta cada molécula dentro de la
secuencia del cebador, dejando fragmentos con extremos cohesivos que se pueden ligar de manera
eficiente en un vector de clonación estándar (Figura 9.14). El enfoque no se limita a aquellos casos en
los que los cebadores abarcan sitios de restricción que están presentes en el ADN molde.
En cambio, el sitio de restricción se puede incluir dentro de una extensión corta en el extremo 5' de cada
cebador (Figura 9.15). Estas extensiones no pueden hibridarse con la molécula molde, pero se copian
durante la PCR, lo que da como resultado productos de PCR que portan sitios de restricción terminales.
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Capítulo 10 La reacción en cadena de la polimerasa 157

Secuencia de cebadores Figura 9.14

5' 3' Obtención de un producto de PCR con extremo adhesivo mediante
C TCT T GGA CAC ENT TI GRAMO el uso de un cebador cuya secuencia incluye un sitio de restricción.

Producto PCR resultante

C TCT GGATCC A ENT TI GRAMO .....
AG A GA CCTA T GG A
TCTA C .....

Adicional A
Restringir con BamHI

GATCC A ENT TI GRAMO

.....
GRAMO
A
T TCTA C .....

final
pegajoso

Plantilla de ADN Figura 9.15 Un

G G3'.... TTT CGCAGT
CT TT
CTGG T GG .... GRAMO
cebador de PCR con un sitio de restricción presente
AG A CCA
T GA GA AA CCC dentro de una extensión en el extremo 5' .
C
GRAMO

C
Primer
AT
GRAMO

Sitio de restricción
CT
GRAMO

C
T
5'

9.3.3 Problemas con la tasa de error de la polimerasa Taq

Todas las polimerasas de ADN cometen errores durante la síntesis de ADN, insertando
ocasionalmente un nucleótido incorrecto en la hebra de ADN en crecimiento. La mayoría de las
polimerasas, sin embargo, pueden corregir estos errores al revertir el error y volver a sintetizar la
secuencia correcta. Esta propiedad se denomina función de "corrección de pruebas" y depende de
que la polimerasa posea una actividad de exonucleasa de 3' a 5' (pág. 168).
Taq polimerasa carece de actividad de revisión y, como resultado, no puede corregir sus errores.
Esto significa que el ADN sintetizado por la polimerasa Taq no siempre es una copia exacta de la
molécula molde. La tasa de error se ha estimado en un error por cada 9000 nucleótidos de ADN
que se sintetiza, lo que puede parecer casi insignificante pero se traduce en un error por cada 300
pb para los productos de PCR obtenidos después de 30 ciclos. Esto se debe a que la PCR implica
que se hagan copias de copias de copias, por lo que los errores inducidos por la polimerasa se
acumulan gradualmente, los fragmentos producidos al final de una PCR contienen copias de
errores anteriores junto con cualquier error nuevo introducido durante la ronda final de síntesis.

Para muchas aplicaciones, esta alta tasa de error no presenta ningún problema. En particular,
la secuenciación de un producto de PCR proporciona la secuencia correcta de la plantilla, aunque
los productos de PCR contengan los errores introducidos por la polimerasa Taq . Esto se debe a
que los errores se distribuyen aleatoriamente, por lo que por cada molécula que tiene un error en
una posición de nucleótido en particular, habrá muchas moléculas con la secuencia correcta. En
este contexto, la tasa de error es ciertamente insignificante.
Este no es el caso si se clonan los productos de PCR. Cada clon resultante contiene múltiples
copias de un solo fragmento amplificado, por lo que el ADN clonado no necesariamente
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158 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Doble cadena
productos PCR

Ligar en un
vector

Errores en posiciones
aleatorias

recombinante
moléculas de ADN

Clon

Un solo clon contiene

varias copias de la misma
molécula, todas con los
mismos errores

Figura 9.16 La alta

tasa de error de la polimerasa Taq se convierte en un factor cuando se clonan productos de PCR.

tienen la misma secuencia que la molécula molde original utilizada en la PCR (Figura 9.16).
Esta posibilidad genera incertidumbre en todos los experimentos realizados con productos
de PCR clonados y dicta que, siempre que sea posible, el ADN amplificado debe estudiarse
directamente en lugar de clonarse.

9.4 La PCR en tiempo real permite cuantificar la

cantidad de material de partida
La cantidad de producto que se sintetiza durante un número determinado de ciclos de una
PCR depende del número de moléculas de ADN que están presentes en la mezcla inicial
(Tabla 9.1). Si solo hay unas pocas moléculas de ADN al comienzo de la PCR, se producirá
relativamente poco producto, pero si hay muchas moléculas iniciales, el rendimiento del
producto será mayor. Esta relación permite utilizar la PCR para cuantificar el número de
moléculas de ADN presentes en un extracto.
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Capítulo 10 La reacción en cadena de la polimerasa 159

Tabla 9.1

Número de productos cortos sintetizados después de 25 ciclos de PCR con diferente número de moléculas de partida.

NÚMERO DE MOLÉCULAS DE PARTIDA NÚMERO DE PRODUCTOS CORTOS

4.194.304
1 8.388.608
2 20.971.520
5 41.943.040
10 104.857.600
25 209.715.200
50 100 419.430.400

Nota: Los números asumen que la amplificación es 100% eficiente, ninguno de los reactivos se vuelve limitante durante el curso de la PCR.

9.4.1 Realización de un experimento PCR cuantitativo

En la PCR cuantitativa (qPCR), la cantidad de producto sintetizado durante una PCR de prueba se
compara con las cantidades sintetizadas durante las PCR con cantidades conocidas de ADN inicial.
En los primeros procedimientos, se usaba electroforesis en gel de agarosa para hacer estas
comparaciones. Después de teñir el gel, se examinaron las intensidades de las bandas para identificar
la PCR de control cuyo producto era más similar al de la prueba (Figura 9.17). Aunque fácil de realizar,
este tipo de qPCR es impreciso, porque las grandes diferencias en la cantidad de ADN inicial dan
diferencias relativamente pequeñas en las intensidades de banda de los productos de PCR resultantes.

Hoy en día, la cuantificación se lleva a cabo mediante PCR en tiempo real, una modificación de la
técnica de PCR estándar en la que se mide la síntesis del producto a lo largo del tiempo, a medida
que la PCR avanza a través de su serie de ciclos. Hay dos formas de seguir la síntesis del producto
en tiempo real:

l Un tinte que da una señal fluorescente cuando se une al ADN de doble cadena
puede incluirse en la mezcla de PCR. Este método mide la cantidad total de ADN bicatenario
en la PCR en un momento determinado, lo que puede sobreestimar la cantidad real del producto
porque a veces los cebadores se hibridan entre sí de varias formas no específicas, lo que aumenta
la cantidad de ADN doble. cadena de ADN que está presente.

l Se puede utilizar un oligonucleótido corto llamado sonda indicadora, que emite una señal
fluorescente cuando se hibrida con el producto de la PCR. Debido a que la sonda solo se
hibrida con el producto de PCR, este método es menos propenso a las imprecisiones causadas
por la hibridación cebador-cebador. Cada molécula de sonda tiene un par de etiquetas. Un tinte fluorescente

1Prueba 2 3 4 Figura 9.17 Uso de

electroforesis en gel de agarosa para cuantificar la cantidad de

ADN en una prueba de PCR. Los carriles 1 a 4 son PCR de
control realizadas con cantidades decrecientes de ADN molde.

La intensidad de la tinción de la banda de prueba sugiere que

esta PCR contenía aproximadamente la misma cantidad de ADN
que la ejecución de control en el carril 2.
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160 Parte I Los principios básicos de la clonación de genes y el análisis de ADN

Figura 9.18 compuesto Sonda de

de enfriamiento oligonucleótidos
Hibridación de una sonda indicadora con su ADN diana.
objetivo de ADN

Etiqueta
fluorescente

ADN

Investigacion

señal
fluorescente

Figura 9.19
Cuantificación por PCR en tiempo real. El gráfico
muestra la síntesis del producto durante tres PCR,
cada una con una cantidad diferente de ADN inicial. Durante
una PCR, el producto se acumula exponencialmente, la
cantidad presente en cualquier ciclo particular es proporcional
a la cantidad de ADN inicial. La curva azul es por tanto la Cantidad
producto
PCR
de

PCR con mayor cantidad de ADN de partida, y la curva

verde es la que tiene menos ADN de partida. Si se conocen
las cantidades de ADN inicial en estas tres PCR, la cantidad
en una PCR de prueba se puede cuantificar en comparación
con estos controles. En la práctica, la comparación se realiza
Límite
identificando el ciclo en el que la síntesis del producto se
mueve por encima de un umbral, indicado por la línea
horizontal en el gráfico. Número de ciclos

se une a un extremo del oligonucleótido y un compuesto inhibidor, que inhibe la señal

fluorescente, se une al otro extremo (Figura 9.18). Normalmente no hay fluorescencia
porque el oligonucleótido está diseñado de tal manera que sus dos extremos se aparean
entre sí, colocando el extintor junto al colorante.
La hibridación entre el oligonucleótido y el producto de la PCR interrumpe este apareamiento
de bases, alejando el extintor del tinte y permitiendo que se genere la señal fluorescente.

Ambos sistemas permiten seguir la síntesis del producto de PCR midiendo la señal
fluorescente. Nuevamente, la cuantificación requiere una comparación entre las PCR de prueba
y de control, generalmente mediante la identificación de la etapa en la PCR en la que la
cantidad de señal fluorescente alcanza un umbral preestablecido (Figura 9.19). Cuanto más
rápidamente se alcance el umbral, mayor será la cantidad de ADN en la mezcla inicial.

9.4.2 La PCR en tiempo real también puede cuantificar el ARN

La PCR en tiempo real se usa a menudo para cuantificar la cantidad de ADN en un extracto,
por ejemplo, para seguir la progresión de una infección viral midiendo la cantidad de ADN
patógeno que está presente en un tejido. Sin embargo, con más frecuencia, el método se usa
como un medio para medir las cantidades de ARN, en particular para determinar el grado de
expresión de un gen particular mediante la cuantificación de su ARNm. El gen en estudio podría
ser uno que esté activado en células cancerosas, en cuyo caso la cuantificación de su ARNm permitirá la
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Capítulo 10 La reacción en cadena de la polimerasa 161

ARN Figura 9.20 PCR

con transcriptasa inversa.
La transcriptasa inversa

ARN

Degradar la cadena de ARN

PCR estándar

seguimiento del desarrollo del cáncer y evaluación de los efectos del tratamiento subsiguiente.

¿Cómo llevamos a cabo la PCR si el ARN es el material de partida? La respuesta es usar PCR
con transcriptasa inversa. El primer paso en este procedimiento es convertir las moléculas de
ARN en ADN complementario monocatenario (ADNc) (Figura 9.20). Una vez que se ha llevado a
cabo este paso preliminar, se agregan los cebadores de PCR y la Taq polimerasa y el experimento
continúa exactamente como en la técnica estándar. Algunas polimerasas termoestables son
capaces de hacer copias de ADN tanto de moléculas de ARN como de ADN (es decir, tienen
actividades tanto de transcriptasa inversa como de ADN polimerasa dependiente de ADN) y, por
lo tanto, pueden llevar a cabo todos los pasos de este tipo de PCR en una sola reacción.

OTRAS LECTURAS

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, PS y Griffith, R. (1992) Amplificación y detección simultáneas de
secuencias de ADN específicas. Biotecnología, 10, 413–417. [La primera descripción de PCR en
tiempo real].
Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A. & Collins, FS (1991) Construcción de vectores T, un sistema
rápido y general para la clonación directa de productos de PCR no modificados. Investigación de
ácidos nucleicos, 19, 1154.
Rychlik, W., Spencer, WJ & Rhoads, RE (1990) Optimización de la temperatura de hibridación para
la amplificación de ADN in vitro. Investigación de ácidos nucleicos, 18, 6409–6412.
Saiki, RK, Gelfand, DH, Stoffel, S. et al. (1988) Amplificación enzimática de ADN dirigida por cebador
con una ADN polimerasa termoestable. Ciencia, 239, 487–491. [La primera descripción de PCR
con Taq polimerasa.]
Tindall, KR & Kunkel, TA (1988) Fidelidad de la síntesis de ADN por la ADN polimerasa de Thermus
aquaticus. Bioquímica, 27, 6008–6013. [Describe la tasa de error de la polimerasa Taq .]
VanGuilder, HD, Vrana, KE & Freeman, WM (2008) Veinticinco años de PCR cuantitativa para análisis
de expresión génica. Biotécnicas , 44, 619–624.
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PARTE II
Las aplicaciones de los genes
Clonación y Análisis de ADN
en Investigación

10 | Secuenciación de genes y genomas 165

11 | Estudio de la expresión y función génica 185

12 | Estudiando los genomas 207

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Capítulo 10

Secuenciación de genes y
genomas

Contenido del capítulo

CONTENIDO DEL CAPÍTULO

10.1 La metodología para la secuenciación del ADN 10.2

Cómo secuenciar un genoma

La Parte I de este libro ha mostrado cómo un experimento de clonación o PCR hábilmente realizado puede
proporcionar una muestra pura de un gen individual, o cualquier otra secuencia de ADN, separada de todos
los demás genes y secuencias de ADN en la célula. Ahora podemos centrar nuestra atención en las formas en
que se utilizan la clonación, la PCR y otras técnicas de análisis de ADN para estudiar genes y genomas.
Consideraremos tres aspectos de la investigación en biología molecular:

l Las técnicas utilizadas para obtener la secuencia de nucleótidos de genes individuales y

genomas completos (este Capítulo);
l Los métodos utilizados para estudiar la expresión y función de genes individuales
(Capítulo 11); l
Las técnicas que se utilizan para estudiar genomas completos (Capítulo 12).

Probablemente la técnica más importante de que dispone el biólogo molecular es la secuenciación del
ADN, mediante la cual se puede determinar el orden preciso de los nucleótidos en un trozo de ADN. Los
métodos de secuenciación de ADN han existido durante 40 años, y desde mediados de la década de 1970 ha
sido posible una secuenciación rápida y eficiente. Inicialmente, estas técnicas se aplicaron a genes individuales,
pero desde principios de la década de 1990 se ha obtenido un número cada vez mayor de secuencias
genómicas completas. En este capítulo estudiaremos la metodología utilizada en la secuenciación del ADN y
luego examinaremos cómo se utilizan estas técnicas en proyectos genómicos.

10.1 La metodología para la secuenciación del ADN

Existen varios procedimientos para la secuenciación del ADN, siendo el más popular el método de
terminación de cadena ideado por primera vez por Fred Sanger y sus colegas a mediados de la década de 1970. Cadena

Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010 165
por Blackwell Publishing.
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166 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

La secuenciación de terminación ha ganado preeminencia por varias razones, entre las que
destaca la relativa facilidad con la que se puede automatizar la técnica. Como veremos más
adelante en este capítulo, para secuenciar un genoma completo se debe llevar a cabo una gran
cantidad de experimentos de secuenciación individuales, y llevaría muchos años realizarlos todos
a mano. Por lo tanto, las técnicas de secuenciación automatizadas son esenciales si se quiere
completar un proyecto de genoma en un período de tiempo razonable.
Parte de la estrategia de automatización es diseñar sistemas que permitan llevar a cabo muchos
experimentos de secuenciación individuales a la vez. Con el método de terminación de cadena, se
pueden obtener hasta 96 secuencias simultáneamente en una sola ejecución de una máquina de
secuenciación. Esto todavía no es suficiente para satisfacer completamente las demandas de la
secuenciación del genoma, y durante los últimos años se ha popularizado un método alternativo
llamado pirosecuenciación . La pirosecuenciación, que se inventó en 1998, forma la base de una
estrategia paralela masiva que permite generar cientos de miles de secuencias cortas al mismo
tiempo.

10.1.1 Secuenciación de ADN de terminación de cadena

La secuenciación de ADN de terminación de cadena se basa en el principio de que las moléculas
de ADN monocatenario que difieren en longitud en un solo nucleótido pueden separarse entre sí
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Esto significa que es posible resolver una familia
de moléculas, que representan todas las longitudes de 10 a 1500 nucleótidos, en una serie de
bandas en una losa o gel capilar (Figura 10.1).

Resumen de secuenciación de terminación

de cadena El material de partida para un experimento de secuenciación de terminación de cadena
es una preparación de moléculas idénticas de ADN monocatenario. El primer paso es recocer un
oligonucleótido corto en la misma posición en cada molécula, este oligonucleótido actúa
posteriormente como cebador para la síntesis de una nueva cadena de ADN que es complementaria
a la plantilla (Figura 10.2a).
La reacción de síntesis de la hebra, que es catalizada por una enzima ADN polimerasa y
requiere los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP: dATP, dCTP, dGTP y dTTP) como
sustratos, normalmente continuaría hasta que se hayan polimerizado varios miles de nucleótidos.
Esto no ocurre en un experimento de secuenciación de terminación de cadena.

Figura 10.1 La

electroforesis en gel de poliacrilamida puede resolver 50 nucleótidos

moléculas de ADN monocatenario que difieren en longitud
en solo un nucleótido. El patrón de bandas que se muestra
aquí se produce después de la separación de moléculas de
ADN monocatenario mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida desnaturalizante. Las moléculas se marcaron
con un marcador radiactivo y las bandas se visualizaron
mediante autorradiografía.

10 nucleótidos
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Capítulo 10 Secuenciación de genes y genomas 167

(a) Inicio de la síntesis de cadenas (b) Un didesoxinucleótido

Primer LA- LA- LA-

Plantilla de ADN PPA CH2 Base

3'5' – OOOO
LA
OOO
C H H C
3' TTT 5'
3'5' C C
H
H
3' 5'
H*
TTT
3'5'
Posición donde el
-OH de un dNTP se
3' TTT 5' reemplaza por -H

(c) La síntesis de cadenas termina cuando se agrega un ddNTP

3'5'
ddA

3' TTT 5'

ddA
3'5'
ddA
ddA
3' TTT 5'
3'5' ddA
ddA
La familia 'A'
3' TTT 5'

Figura 10.2

Secuenciación del ADN de terminación de cadena.

porque, además de los cuatro desoxinucleótidos, se agrega a la reacción una pequeña

cantidad de cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos (ddNTP: ddATP, ddCTP, ddGTP y
ddTTP). Cada uno de estos didesoxinucleótidos está marcado con un marcador fluorescente diferente.
La enzima polimerasa no discrimina entre desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos, pero
una vez incorporado un didesoxinucleótido bloquea la elongación adicional porque carece del
grupo 3ÿ-hidroxilo necesario para formar una conexión con el siguiente nucleótido (Figura
10.2b). Debido a que los desoxinucleótidos normales también están presentes, en cantidades
mayores que los didesoxinucleótidos, la síntesis de la cadena no siempre termina cerca del
cebador: de hecho, se pueden polimerizar varios cientos de nucleótidos antes de que
finalmente se incorpore un didesoxinucleótido. El resultado es un conjunto de nuevas
moléculas, todas de diferentes longitudes, y cada una termina en un didesoxinucleótido cuya
identidad indica el nucleótido (A, C, G o T) que está presente en la posición equivalente en el
ADN molde (Figura 10.2c). ).
Para determinar la secuencia de ADN, todo lo que tenemos que hacer es identificar el
didesoxinucleótido al final de cada molécula terminada en cadena. Aquí es donde entra en
juego el gel de poliacrilamida. La mezcla se carga en un pocillo de una losa de gel de
poliacrilamida, o en un tubo de un sistema de gel capilar, y se lleva a cabo una electroforesis
para separar las moléculas según sus longitudes. Después de la separación, las moléculas
pasan por un detector fluorescente capaz de discriminar las etiquetas adheridas a los
didesoxinucleótidos (Figura 10.3a). Por lo tanto, el detector determina si cada molécula
termina en A, C, G o T. La secuencia puede imprimirse para que la examine el operador
(Figura 10.3b) o ingresarse directamente en un dispositivo de almacenamiento para análisis futuros.
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168 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Figura 10.3 Lectura (a) Detección de polinucleótidos terminados en cadena

de la secuencia generada por un ddA

experimento de terminación de cadena.
(a) Cada didesoxinucleótido está marcado con ddT
sistema de imagen
un fluorocromo diferente, por lo que los ddC
polinucleótidos terminados en cadena se distinguen
ddG
cuando pasan por el detector. (b) Un ejemplo de Detector
una secuencia impresa. ddA

ddG

Los polinucleótidos se mueven más

allá del detector.

(b) La impresión de un secuenciador automatizado

CACCGCATCGAAATT AACTTCCAAAGTT AAGCTTGG

10 20 30

No todas las polimerasas de ADN se pueden utilizar para

la secuenciación Cualquier polimerasa de ADN es capaz de extender un cebador que se ha
hibridado con una molécula de ADN monocatenario, pero no todas las polimerasas se pueden
utilizar para la secuenciación de ADN. Esto se debe a que muchas ADN polimerasas tienen
una actividad enzimática mixta y pueden degradar y sintetizar ADN (pág. 48). La degradación
puede ocurrir en la dirección 5ÿÿ3ÿ o 3ÿÿ5ÿ (Figura 10.4), y ambas actividades son perjudiciales
para la secuenciación precisa de la terminación de la cadena. La actividad exonucleasa 5ÿÿ3ÿ
permite que la polimerasa elimine nucleótidos de los extremos 5ÿ de las hebras recién
sintetizadas, cambiando la longitud de estas hebras para que ya no pasen por el gel de
poliacrilamida en el orden apropiado. La actividad 3ÿÿ5ÿ podría tener el mismo efecto, pero más importante

(a) 5' actividad exonucleasa 3'

5' 3' 5' 3'

(b) 3' actividad exonucleasa 5'

5' 3'

Figura 10.4 Las

actividades de exonucleasa de las ADN polimerasas. (a) La actividad 5ÿÿ3ÿ tiene un papel importante en la reparación del ADN en la
célula, ya que permite que la polimerasa reemplace una cadena de ADN dañada. En la secuenciación del ADN, esta actividad puede
provocar que los extremos 5 ' de las cadenas recién sintetizadas se acorten. (b) La actividad 3ÿÿ5ÿ también tiene un papel importante en la
célula, ya que permite que la polimerasa corrija sus propios errores, invirtiendo y reemplazando un nucleótido que se ha agregado por error
(p. ej., una T en lugar de una GRAMO). Esto se llama revisión. Durante la secuenciación del ADN, esta actividad puede resultar en la
eliminación de un didesoxinucleótido que se acaba de agregar a la cadena recién sintetizada, de modo que no se produzca la terminación
de la cadena.
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Capítulo 10 Secuenciación de genes y genomas 169

eliminará un didesoxinucleótido que se acaba de agregar en el extremo 3 ', evitando que ocurra la
terminación de la cadena.
En el método original para la secuenciación de terminación de cadena, se utilizó la polimerasa
Klenow como enzima de secuenciación. Como se describe en la pág. 49, esta es una versión
modificada de la enzima ADN polimerasa I de E. coli, eliminando la modificación la actividad
exonucleasa 5'ÿ3' de la enzima estándar. Sin embargo, la polimerasa Klenow tiene una baja
procesividad, lo que significa que solo puede sintetizar una hebra de ADN relativamente corta
antes de disociarse de la plantilla debido a causas naturales. Esto limita la longitud de la secuencia
que se puede obtener de un solo experimento a aproximadamente 250 pb. Para evitar este
problema, la mayoría de las secuencias actuales utilizan una enzima más especializada, como la
Sequenasa, una versión modificada de la ADN polimerasa codificada por el bacteriófago T7.
Sequenase tiene una alta procesividad y no tiene actividad de exonucleasa, por lo que es ideal
para la secuenciación de terminación de cadena, lo que permite obtener secuencias de hasta 750 pb en un solo experimento

La secuenciación de terminación de cadena requiere una plantilla de ADN

monocatenario. La plantilla para un experimento de terminación de cadena es una versión
monocatenaria de la molécula de ADN que se va a secuenciar. Una forma de obtener ADN
monocatenario es utilizar un vector M13, pero el sistema M13, aunque está diseñado
específicamente para proporcionar ADN para secuenciación de terminación de cadena, no es
ideal para este fin. El problema es que los fragmentos de ADN clonados que tienen más de 3 kb
son inestables en un vector M13 y pueden sufrir deleciones y reordenamientos. Esto significa que
la clonación M13 solo se puede usar con fragmentos cortos de ADN.
Los vectores de plásmidos, que no sufren problemas de inestabilidad, son por lo tanto más
populares, pero se necesitan algunos medios para convertir el plásmido de doble cadena en una
forma de cadena sencilla. Hay dos posibilidades:

l El ADN de plásmido de doble cadena se puede convertir en ADN de cadena sencilla

mediante desnaturalización con álcali o mediante ebullición. Este es un método común
para obtener ADN de plantilla para la secuenciación de ADN, pero una desventaja es que
puede ser difícil preparar ADN de plásmido que no esté contaminado con pequeñas cantidades
de ADN y ARN bacterianos, que pueden actuar como plantillas o cebadores falsos en el ADN.
experimento de secuenciacion l El ADN se puede clonar en un fagémido, un vector plasmídico
que contiene un origen de replicación M13 y que, por lo tanto, se puede obtener como versiones
de ADN de cadena doble y sencilla (pág. 96). Los fagémidos evitan las inestabilidades de la
clonación M13 y se pueden utilizar con fragmentos de hasta 10 kb o más.

La necesidad de ADN monocatenario también puede evitarse utilizando una polimerasa de

ADN termoestable como enzima de secuenciación. Este método, llamado secuenciación por
ciclo térmico, se lleva a cabo de manera similar a la PCR, pero solo se usa un cebador y la
mezcla de reacción incluye los cuatro didesoxinucleótidos (Figura 10.5). Debido a que solo hay un
cebador, solo se copia una de las cadenas de la molécula de partida y el producto se acumula de
forma lineal, no exponencialmente como en el caso de una PCR real. La presencia de los
didesoxinucleótidos en la mezcla de reacción provoca la terminación de la cadena, como en la
metodología estándar, y la familia de hebras resultantes puede analizarse y leerse la secuencia
de la forma habitual. Por lo tanto, la secuenciación por ciclo térmico se puede utilizar con ADN
clonado en cualquier tipo de vector.

El cebador determina la región de la plantilla de ADN que se secuenciará. En la primera

etapa de un experimento de secuenciación de terminación de cadena, se hibrida una cebadora de
oligonucleótidos en la plantilla de ADN (consulte la Figura 10.2a). La función principal de la
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170 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Figura 10.5 La 5' 3'

base para la secuenciación del ciclo térmico. Se configura una PCR 3' 5'
con solo un cebador y uno de los didesoxinucleótidos. Una de las
cadenas molde se copia en una familia de polinucleótidos terminados PCR con un cebador y
didesoxiATP
en cadena. ddA = didesoxiATP.

5' 3'

3'5'
ddA

3' 5'

Después de 4 ciclos

ddA

ddA

ddA

ddA

Figura 10.6 Diferentes (a) Una cartilla universal

tipos de cebadores para secuenciación de terminación Primer

de cadena.

3' 5'
ADN vectorial inserto de ADN ADN vectorial

(b) Cebadores internos

3' 5'

imprimación universal imprimación interna

El cebador es proporcionar la región corta de doble cadena que se necesita para que la ADN
polimerasa inicie la síntesis de ADN. El cebador también juega un segundo papel crítico en la
determinación de la región de la molécula molde que será secuenciada.
Para la mayoría de los experimentos de secuenciación se utiliza un cebador universal ,
que es complementario a la parte del vector de ADN inmediatamente adyacente al punto en el
que se liga el nuevo ADN (Figura 10.6a). El extremo 3 'del cebador apunta hacia el ADN
insertado, por lo que la secuencia que se obtiene comienza con un tramo corto del vector y
luego avanza hacia el fragmento de ADN clonado. Si el ADN se clona en un vector de plásmido,
se pueden usar cebadores universales directos e inversos, lo que permite obtener secuencias
de ambos extremos del inserto. Esto es una ventaja si el ADN clonado tiene más de 750 pb y,
por lo tanto, es demasiado largo para secuenciarlo completamente en un experimento.
Alternativamente, es posible extender la secuencia en una dirección sintetizando un cebador
no universal, diseñado para hibridarse en una posición dentro del inserto de ADN (Figura 10.6b).
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Capítulo 10 Secuenciación de genes y genomas 171

Un experimento con este iniciador proporcionará una segunda secuencia corta que se superpone
a la anterior.

10.1.2 Pirosecuenciación
La pirosecuenciación es el segundo tipo importante de metodología de secuenciación de ADN
que se utiliza en la actualidad. La pirosecuenciación no requiere electroforesis ni ningún otro
procedimiento de separación de fragmentos, por lo que es más rápida que la secuenciación por
terminación de cadena. Solo es capaz de generar hasta 150 pb en un solo experimento y, a
primera vista, puede parecer menos útil que el método de terminación de cadena, especialmente
si el objetivo es secuenciar un genoma. La ventaja de la pirosecuenciación es que se puede
automatizar de forma masiva en paralelo, lo que permite obtener cientos de miles de secuencias
a la vez, quizás hasta 1000 Mb en una sola ejecución. Por lo tanto, la secuencia se produce
mucho más rápido de lo que es posible con el método de terminación de cadena, lo que explica
por qué la pirosecuenciación se está convirtiendo gradualmente en el método de elección para
los proyectos genómicos.

La pirosecuenciación implica la detección de pulsos de quimioluminiscencia

La pirosecuenciación, al igual que el método de terminación de cadena, requiere una preparación
de moléculas de ADN monocatenarias idénticas como material de partida. Estos se obtienen
por desnaturalización alcalina de productos de PCR o, más raramente, de moléculas de
plásmidos recombinantes. Después de la unión del cebador, la ADN polimerasa copia la plantilla
de forma directa sin didesoxinucleótidos añadidos. A medida que se produce la nueva hebra,
se detecta el orden en que se incorporan los desoxinucleótidos, por lo que la secuencia se
puede "leer" a medida que avanza la reacción.
La adición de un desoxinucleótido al extremo de la hebra en crecimiento es detectable
porque va acompañada de la liberación de una molécula de pirofosfato, que la enzima sulfurilasa
puede convertir en un destello de quimioluminiscencia. Por supuesto, si los cuatro
desoxinucleótidos se agregaran a la vez, se verían destellos de luz todo el tiempo y no se
obtendría información útil sobre la secuencia. Por lo tanto, cada desoxinucleótido se agrega por
separado, uno tras otro, con una enzima nucleotidasa también presente en la mezcla de
reacción, de modo que si un desoxinucleótido no se incorpora al polinucleótido, se degrada
rápidamente antes de agregar el siguiente (Figura 10.7). Este procedimiento permite seguir el
orden de incorporación de los desoxinucleótidos en la hebra en crecimiento. La técnica suena
complicada, pero simplemente requiere que se realice una serie repetitiva de adiciones a la
mezcla de reacción, precisamente el tipo de procedimiento que se automatiza fácilmente.

Pirosecuenciación masivamente
paralela La versión de alto rendimiento de la pirosecuenciación suele comenzar con el ADN
genómico, en lugar de productos o clones de PCR. El ADN se rompe en fragmentos de entre
300 y 500 pb de longitud (Figura 10.8a), y cada fragmento se liga a un par de adaptadores (pág.
65), un adaptador en cada extremo (Figura 10.8b). Estos adaptadores juegan dos papeles
importantes. En primer lugar, permiten unir los fragmentos de ADN a pequeñas perlas metálicas.
Esto se debe a que uno de los adaptadores tiene una etiqueta de biotina adherida a su extremo
5' y las perlas están cubiertas con estreptavidina, a la que se une la biotina con gran afinidad
(pág. 137). Por lo tanto, los fragmentos de ADN se unen a las perlas a través de enlaces biotina-
estreptavidina (Figura 10.8c). La proporción de fragmentos de ADN a perlas se establece de
modo que, en promedio, solo un fragmento se une a cada perla.
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172 172
Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Primer
Figura 10.7
plantilla de ADN
Pirosecuenciación.

+
dATP degrada

+
dTTP degrada

+
GRAMO

dGTP quimioluminiscencia =

+
dCTP degrada

+
Georgia
dATP quimioluminiscencia =

Figura 10.8 Un (a) Rompe el ADN genómico en fragmentos

ADN genómico
método para la secuenciación masiva de
ADN en paralelo. B = biotina, S = estreptavidina.

(b) Adaptadores de ligadura

(c) Separe las hebras y únalas a las cuentas.

Talón

SB

Unión de estreptavidina-
biotina

(d) PCR en una emulsión de aceite

Gotitas
de agua

emulsión de aceite productos PCR

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Capítulo 10 Secuenciación de genes y genomas 173

Cada fragmento de ADN ahora será amplificado por PCR para que se hagan suficientes copias
para la secuenciación. Los adaptadores ahora desempeñan su segundo papel, ya que proporcionan
los sitios de hibridación para los cebadores de esta PCR. Por lo tanto, se puede usar el mismo par de
cebadores para todos los fragmentos, aunque los propios fragmentos tengan muchas secuencias diferentes.
Si la PCR se realiza inmediatamente lo único que obtendremos será una mezcla de todos los
productos, lo que no nos permitirá obtener las secuencias individuales de cada uno. Para resolver este
problema, la PCR se lleva a cabo en una emulsión de aceite, cada perla reside en su propia gota
acuosa dentro de la emulsión (Figura 10.8d). Cada gota contiene todos los reactivos necesarios para
la PCR y está físicamente separada de todas las demás gotas por la barrera proporcionada por el
componente de aceite de la emulsión. Después de la PCR, las gotitas acuosas se transfieren a pocillos
en una tira de plástico para que haya una gotita y, por lo tanto, un producto de PCR por pocillo, y las
reacciones de pirosecuenciación se llevan a cabo en cada pocillo.

10.2 Cómo secuenciar un genoma

La primera molécula de ADN que se secuenció por completo fue el genoma de 5386 nucleótidos del
bacteriófago dX174, que se completó en 1975. A esto le siguieron rápidamente las secuencias del
virus SV40 (5243 pb) en 1977 y pBR322 (4363 pb) en 1978. La secuenciación fue gradualmente
aplicado a moléculas más grandes. El grupo del profesor Sanger publicó la secuencia del genoma
mitocondrial humano (16,6 kb) en 1981 y del bacteriófago e (49 kb) en 1982. Hoy en día, las secuencias
de 100–200 kb son rutinarias y la mayoría de los laboratorios de investigación tienen la experiencia
necesaria para generar esta cantidad de información.
Los proyectos pioneros en la actualidad son las iniciativas genómicas masivas, cada una de las
cuales tiene como objetivo obtener la secuencia de nucleótidos del genoma completo de un organismo
en particular. La primera secuencia cromosómica, para el cromosoma III de la levadura Saccharomyces
cerevisiae, se publicó en 1992, y el genoma completo de la levadura se completó en 1996. Ahora hay
secuencias genómicas completas para el gusano Caenorhabditis elegans, la mosca Drosophila
melanogaster, la planta Arabidopsis thaliana , el Homo sapiens humano y más de 1000 especies más.
Incluso es posible obtener secuencias del genoma de especies extintas como los mamuts y los
neandertales.
Un experimento de secuenciación de terminación de cadena única produce alrededor de 750 pb de
secuencia, y una sola pirosecuencia produce hasta 150 pb. Pero el tamaño total de un genoma
bacteriano bastante típico es de 4 000 000 pb y el genoma humano es de 3 200 000 000 pb (tabla
10.1). Claramente, se debe llevar a cabo una gran cantidad de experimentos de secuenciación en

Tabla 10.1
Tamaños de genomas representativos.

ESPECIES TIPO DE ORGANISMO TAMAÑO DEL GENOMA (Mb)

Mycoplasma genitalium Bacteria 0,58

Haemophilus influenzae Bacteria 1,83

Escherichia coli Bacteria 4,64

Saccharomyces cerevisiae Levadura 12,10

Caenorhabditis elegans Gusano nematodo 97,00

Drosophila melanogaster Insecto 180,00

Arabidopsis thaliana Planta 125,00

Un hombre sabio Mamífero 3200,00

trigo de verano Planta (trigo) 16.000,00
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174 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

molécula de adn

romper en aleatorio
fragmentos Reúna un conjunto de
fragmentos clonados
superpuestos

Construye la secuencia

secuencia de ADN

(a) El enfoque de escopeta (b) El enfoque clon contig

Figura 10.9
Estrategias para el ensamblaje de una secuencia genómica contigua: (a) el enfoque de escopeta; (b) el enfoque clon contig.

para determinar la secuencia de un genoma completo. En la práctica, gracias a los sistemas

automatizados, la generación de suficientes datos de secuencia es uno de los aspectos más
rutinarios de un proyecto de genoma. El primer problema real que surge es la necesidad de
ensamblar miles o quizás millones de secuencias individuales en una secuencia genómica contigua.
Se han desarrollado dos estrategias diferentes para el ensamblaje de secuencias (Figura 10.9):

l El enfoque de escopeta, en el que el genoma se divide aleatoriamente en

fragmentos Las secuencias resultantes se examinan en busca de superposiciones y se
utilizan para construir la secuencia del genoma contiguo.
l El enfoque clon contig, que implica una fase previa a la secuenciación durante la cual se
identifica una serie de clones superpuestos. Esta serie contigua se llama contig.
Luego se secuencia cada pieza de ADN clonado, y esta secuencia se coloca en su
posición apropiada en el mapa de contig para construir gradualmente la secuencia del
genoma superpuesto.

10.2.1 El enfoque de escopeta para la secuenciación del genoma

El requisito clave del enfoque de escopeta es que debe ser posible identificar superposiciones
entre todas las secuencias individuales que se generan, y este proceso de identificación debe ser
preciso e inequívoco para que se obtenga la secuencia genómica correcta. Un error en la
identificación de un par de secuencias superpuestas podría provocar que la secuencia del genoma
se mezcle o que se pierdan partes por completo. La probabilidad de cometer errores aumenta con
tamaños de genoma más grandes, por lo que el enfoque de escopeta se ha utilizado principalmente
con los genomas bacterianos más pequeños.

El proyecto de secuenciación del genoma de Haemophilus

influenzae El enfoque de escopeta se utilizó por primera vez con éxito con la bacteria Haemophilus.
influenzae, que fue el primer organismo de vida libre cuyo genoma fue completamente
Machine Translated by Google
Capítulo 10 Secuenciación de genes y genomas 175

Figura 10.10 Un
ADN genómico esquema de los pasos clave en el proyecto de
de H. influenzae secuenciación del genoma de H. influenzae .

sonicar

Fragmentos de
ADN de varios tamaños.

Electroforesis en gel de agarosa

1 2
Carril 1: ADN de H.
influenzae sonicado
Carril 2: marcadores de ADN

Purificar el
ADN del gel

Fragmentos de ADN:
1,6–2,0 kb

Preparar una biblioteca de clones

Obtener secuencias finales

de insertos de ADN

Secuencias finales

Construir contigs de
secuencia

secuenciado, y los resultados se publicaron en 1995. El primer paso fue dividir el genoma de
1830 kb de la bacteria en fragmentos cortos, que proporcionarían las plantillas para los
experimentos de secuenciación (Figura 10.10). Se podría haber utilizado una endonucleasa de
restricción, pero se eligió la sonicación porque esta técnica escinde el ADN de una manera
más aleatoria y, por lo tanto, reduce la posibilidad de que aparezcan lagunas en la secuencia del genoma.
Se decidió concentrarse en fragmentos de 1,6 a 2,0 kb porque podrían producir dos
secuencias de ADN, una de cada extremo, lo que reduce la cantidad de clonación y el ADN.
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176 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Figura 10.11 Uso de (a) Preparar sondas de oligonucleótidos

hibridación de oligonucleótidos para cerrar brechas en la

Contigo I
secuencia del genoma de H. influenzae . Los oligonucleótidos 2 1 2
y 5 se hibridan con el mismo clon ÿ , lo que indica que los
cóntigos I y III son adyacentes. La brecha entre ellos se puede Contigo II
3 4
cerrar mediante la secuenciación de la parte adecuada del clon ÿ .
Contigo III
5 6

12 Sondas de oligonucleótidos

(b) Sondear una biblioteca genómica

Sonda con Sonda con

oligonucleótido 2 oligonucleótido 5

Conclusión:

yo tercero Los cóntigos I y III

son adyacentes en
1 2 5 6 el genoma.

preparación que se requería. Por lo tanto, el ADN sonicado se fraccionó mediante electroforesis en gel de
agarosa y los fragmentos del tamaño deseado se purificaron del gel.
Después de la clonación, se llevaron a cabo 28643 experimentos de secuenciación de terminación de
cadena con 19687 de los clones. Algunas de estas secuencias (4339 en total) fueron rechazadas porque
tenían menos de 400 pb de longitud. Las 24.304 secuencias restantes se ingresaron en una computadora,
que pasó 30 horas analizando los datos. El resultado fueron 140 secuencias contiguas, cada una de ellas
un segmento diferente del genoma de H. influenzae .
Podría haber sido posible continuar secuenciando más fragmentos sonicados para eventualmente
cerrar las brechas entre los segmentos individuales. Sin embargo, ya se habían generado 11ÿ631ÿ485 pb
de secuencia, seis veces la longitud del genoma, lo que sugiere que se necesitaría una gran cantidad de
trabajo adicional antes de que, por casualidad, se secuenciaran los fragmentos correctos. En esta etapa
del proyecto, el enfoque más efectivo en términos de tiempo fue utilizar una estrategia más dirigida para
cerrar cada una de las brechas individualmente. Se utilizaron varios enfoques para el cierre de brechas,
el más exitoso de estos implica el análisis de hibridación de una biblioteca de clones preparada en el
vector ae (Figura 10.11).
La biblioteca se sondeó a su vez con una serie de oligonucleótidos cuyas secuencias se correspondían
con los extremos de cada uno de los 140 segmentos. En algunos casos, dos oligonucleótidos se hibridaron
con el mismo clon e, lo que indica que los extremos de los dos segmentos representados por esos
oligonucleótidos se encuentran adyacentes entre sí en el genoma. La brecha entre estos dos extremos
podría cerrarse secuenciando la parte apropiada del clon e.

Problemas con la secuenciación de

escopeta La secuenciación de escopeta ha tenido éxito con muchos genomas bacterianos. Estos genomas
no solo son pequeños, por lo que los requisitos computacionales para encontrar superposiciones de
secuencias no son demasiado grandes, sino que contienen pocas o ninguna secuencia de ADN repetitiva. Estos son
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Capítulo 10 Secuenciación de genes y genomas 177

Secuencias repetidas
idénticas

molécula de adn

Secuencia 1 Secuencia 2

Las secuencias
1 y 2 se superponen

1
2

Montaje de secuencia

Secuencia de
ADN deducida

Figura 10.12 Un
problema con el enfoque de escopeta. Se realiza una superposición incorrecta entre dos secuencias que terminan dentro de un
elemento repetido. El resultado es que un segmento de la molécula de ADN está ausente de la secuencia de ADN.

secuencias, desde unos pocos pares de bases hasta varias kilobases, que se repiten en dos o más
lugares de un genoma. Causan problemas para el enfoque de escopeta porque cuando las
secuencias se ensamblan, aquellas que se encuentran parcial o totalmente dentro de un elemento
repetido pueden accidentalmente superponerse con la secuencia idéntica presente en un elemento
repetido diferente (Figura 10.12). Esto podría llevar a que una parte de la secuencia del genoma se
coloque en la posición incorrecta o se omita por completo. Por esta razón, generalmente se ha
pensado que la secuenciación aleatoria es inapropiada para los genomas eucariotas, ya que estos
tienen muchos elementos repetidos. Más adelante en este capítulo (pág. 183) veremos cómo se
puede eludir esta limitación utilizando un mapa del genoma para dirigir el ensamblaje de las
secuencias obtenidas mediante el enfoque de escopeta.

10.2.2 El enfoque clon contig

El enfoque de contig de clones no sufre las limitaciones de la secuenciación de escopeta y, por lo
tanto, puede proporcionar una secuencia precisa de un genoma grande que contiene ADN repetitivo.
Su inconveniente es que implica mucho más trabajo y, por lo tanto, lleva más tiempo y cuesta más
dinero. Se necesita tiempo y esfuerzo adicionales para construir la serie superpuesta de fragmentos
de ADN clonados. Una vez hecho esto, cada fragmento clonado se secuencia por el método de
escopeta y la secuencia del genoma se construye paso a paso (ver Figura 10.9).
Los fragmentos clonados deben ser lo más largos posible para minimizar el número total necesario
para cubrir todo el genoma. Por lo tanto, se utiliza un vector de alta capacidad.
El primer cromosoma eucariótico que se secuenció, el cromosoma III de Saccharomyces cerevisiae ,
se clonó inicialmente en un vector cósmido (pág. 101) y el cóntigo resultante comprendía 29
fragmentos clonados. Sin embargo, el cromosoma III es relativamente corto y el tamaño promedio
de los fragmentos clonados fue de solo 10,8 kb. La secuenciación del genoma humano mucho más
largo requirió 300.000 clones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) (pág. 103).
Ensamblar todos estos en contigs específicos de cromosomas fue una tarea enorme.

Ensamblaje de clones contig por paseo cromosómico

Una técnica que se puede utilizar para ensamblar un clon contig es el paseo cromosómico. Para
comenzar una caminata cromosómica, se selecciona un clon al azar de la biblioteca, se etiqueta y se
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178 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Figura 10.13 Paseo (a) Sondear la biblioteca con el clon A1

cromosómico. ABCDE FGH IJ

1 A1
2
3
4
B4 I4
56

(b) Sondear la biblioteca con el clon I4

ABCDE FGH IJ

1 A1 F2
2
3
4
B4 I4
56

utilizado como sonda de hibridación frente a todos los demás clones de la biblioteca (Figura 10.13a).
Esos clones que dan señales de hibridación son los que se superponen con la sonda. Ahora se
marca uno de estos clones superpuestos y se lleva a cabo una segunda ronda de sondeo.
Se ven más señales de hibridación, algunas de las cuales indican superposiciones adicionales
(Figura 10.13b). Gradualmente, el clon contig se construye paso a paso. Pero este es un proceso
laborioso y solo se intenta cuando el cóntigo es para un cromosoma corto y, por lo tanto, involucra
relativamente pocos clones, o cuando el objetivo es cerrar una o más pequeñas brechas entre los
cóntigos que se han acumulado mediante métodos más rápidos.

Métodos rápidos para ensamblar clon contig La

debilidad de la caminata cromosómica es que comienza en un punto de inicio fijo y construye el clon
contig paso a paso, y por lo tanto lentamente, desde ese punto fijo. Las técnicas más rápidas para
el ensamblaje de clones contig no utilizan un punto de partida fijo y, en cambio, apuntan a identificar
pares de clones superpuestos: cuando se han identificado suficientes pares superpuestos, se revela
el contig (Figura 10.14). Las diversas técnicas que se pueden utilizar para identificar superposiciones
se conocen colectivamente como clonación de huellas dactilares.
La toma de huellas dactilares de clones se basa en la identificación de características de
secuencia que comparten un par de clones. El enfoque más simple es digerir cada clon con una o
más endonucleasas de restricción y buscar pares de clones que compartan fragmentos de restricción
del mismo tamaño, excluyendo aquellos fragmentos que se derivan del vector en lugar de

F2 I4

G6 F2
H7
Superposiciones identificadas

B4 por clonación de huellas dactilares

A1
B4
I4
A1

H7 A1 F2
Clon contig deducido
B4 I4 G6

Figura 10.14

Construcción de un clon contig mediante una técnica de huellas dactilares de clones.

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Capítulo 10 Secuenciación de genes y genomas 179

(a) La base para IRE-PCR Figura 10.15 PCR

Dos repeticiones idénticas de elementos repetidos intercalados (IRE-PCR).

Imprimadores de recocido

PCR

El producto de PCR
abarca la región entre
repeticiones adyacentes

(b) Interpretación de los resultados

Marcadores Clon I Clon II Clon III

La banda
compartida sugiere
que los clones II y
III se superponen

el ADN insertado. Esta técnica puede parecer fácil de llevar a cabo, pero en la práctica lleva mucho tiempo
escanear los geles de agarosa resultantes en busca de fragmentos compartidos.
También existe una posibilidad relativamente alta de que dos clones que no se superponen, por casualidad,
compartan fragmentos de restricción cuyos tamaños no se pueden distinguir por electroforesis en gel de
agarosa.
Se pueden obtener resultados más precisos mediante la PCR de ADN repetitiva, también conocida
como PCR de elementos repetidos intercalados (IRE-PCR). Este tipo de PCR utiliza cebadores que están
diseñados para hibridarse dentro de secuencias de ADN repetitivas y amplificar directamente el ADN entre
repeticiones adyacentes (Figura 10.15). Las repeticiones de un tipo particular se distribuyen de forma
bastante aleatoria en un genoma eucariótico, con distancias variables entre ellas, por lo que se obtienen
productos de diversos tamaños cuando estos cebadores se utilizan con clones de ADN eucariótico.
Si un par de clones da productos de PCR del mismo tamaño, deben contener repeticiones que estén
espaciadas de manera idéntica, posiblemente porque los fragmentos de ADN clonados se superponen.

Ensamblaje de contig de clones por análisis de contenido de sitio etiquetado con

secuencia Una tercera forma de ensamblar un contig de clones es buscar pares de clones que contengan
una secuencia de ADN específica que ocurra en una sola posición en el genoma bajo estudio. Si dos clones
contienen esta característica, entonces claramente deben superponerse (Figura 10.16). Una secuencia de
este tipo se denomina sitio etiquetado con secuencia (STS). A menudo, un STS es un gen que ha sido
secuenciado en un proyecto anterior. Como se conoce la secuencia, se puede diseñar un par de cebadores
de PCR que sean específicos para ese gen y luego se usen para identificar qué miembros de una biblioteca
de clones contienen el gen. El STS no tiene que ser un gen y puede ser cualquier
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180 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Figura 10.16 yo
II
tercero

La base para el mapeo de colección de

clones IV
contenido STS. EN

IV
Los clones IV y II
deben superponerse II

Sitio etiquetado en secuencia

trozo corto de secuencia de ADN, el único requisito es que ocurra solo una vez en el
genoma

10.2.3 Uso de un mapa para ayudar al ensamblaje de secuencias

El mapeo del contenido del sitio etiquetado en secuencia es un método particularmente importante
para el ensamblaje de clones, porque a menudo las posiciones de los STS dentro del genoma se
habrán determinado mediante mapeo genético o mapeo físico. Esto significa que las posiciones
STS se pueden usar para anclar el clon contig en un mapa del genoma, lo que permite determinar la
posición del contig dentro de un cromosoma. Ahora veremos cómo se obtienen estos mapas.

Mapas genéticos
Un mapa genético es el que se obtiene mediante estudios genéticos utilizando principios mendelianos
e involucrando programas de mejoramiento dirigidos para organismos experimentales o análisis de
pedigrí para humanos. En muchos casos los loci que se estudian son genes, cuyos patrones de
herencia se siguen mediante el seguimiento de los fenotipos de la descendencia producida tras un
cruce entre progenitores con características contrastantes (p. ej., alto y bajo para las plantas de
guisante estudiadas por Mendel). Los patrones de herencia revelan la extensión del vínculo genético
entre genes presentes en el mismo cromosoma, lo que permite deducir las posiciones relativas de
esos genes y construir un mapa genético.
Más recientemente, se han ideado técnicas para el mapeo genético de secuencias de ADN que
no son genes pero que todavía muestran variabilidad en la población humana. Los más importantes
de estos marcadores de ADN son:

l Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), que son posiciones en un genoma donde

puede ocurrir cualquiera de dos nucleótidos diferentes (Figura 10.17). Algunos miembros de la
especie tienen una versión del SNP y otros tienen la otra versión. Los SNP generalmente se
tipifican con sondas de oligonucleótidos cortos que se hibridan con las formas alternativas y, por
lo tanto, distinguen cuál está presente.
Los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en
inglés) son tipos especiales de SNP, que resultan en el cambio de un sitio de restricción.
Cuando se digiere con una endonucleasa de restricción se revela la pérdida del sitio porque
quedan dos fragmentos unidos. Originalmente, los RFLP se tipificaron mediante hibridación Southern

Figura 10.17 ...ATAGAC C ATGGCAA...

...ATAGAC T ATGGCAA...
Dos versiones de un SNP.

SNP
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Capítulo 10 Secuenciación de genes y genomas 181

Sitio de restricción Figura 10.18

Tipificación de un polimorfismo de sitio de restricción

por PCR. En el carril central, el producto de la PCR da
cebadores de PCR dos bandas porque se corta mediante el tratamiento
con la enzima de restricción. En el carril de la derecha solo
hay una banda porque la plantilla de ADN carece del sitio de restricción.
Marcadores PCR, restringir PCR, restringir

CACACA LENTES Figura 10.19

Escribiendo un STR por PCR. El producto de la PCR

cebadores de PCR
en el carril de la derecha es un poco más largo que

Marcadores PCR PCR el del carril central, porque la plantilla de ADN a partir
de la cual se genera contiene una unidad CA adicional.

de ADN genómico restringido, pero este es un proceso que requiere mucho tiempo, por lo que
hoy en día la presencia o ausencia del sitio de restricción generalmente se determina mediante
PCR (Figura 10.18).
l Las repeticiones cortas en tándem (STR), también llamadas microsatélites, están formadas por
secuencias repetitivas de 1 a 13 nucleótidos de longitud, unidas de la cabeza a la cola. El número de
repeticiones presentes en un STR en particular varía, generalmente entre 5 y 20. El número se puede
determinar realizando una PCR utilizando cebadores que hibridan ambos lados del STR y luego
examinando el tamaño del producto resultante mediante agarosa o poliacrilamida. electroforesis en gel
(Figura 10.19).

Todos estos marcadores de ADN son variables y, por lo tanto, existen en dos o más formas alélicas.
Sus patrones de herencia pueden determinarse mediante el análisis del ADN preparado a partir de los
padres y la descendencia de un cruce genético, y los datos se utilizan para ubicar los marcadores de ADN
en un mapa genético, exactamente de la misma manera que se mapean los genes.

Mapas físicos Un
mapa físico se genera mediante métodos que ubican directamente las posiciones de secuencias específicas
en una molécula de ADN cromosómico. Al igual que en el mapeo genético, los loci que se estudian pueden
ser genes o marcadores de ADN. Este último podría incluir etiquetas de secuencia expresada
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182 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Figura 10.20
Hibridación fluorescente in situ.
Células en
división con
cromosomas en metafase

formamida

Los cromosomas
se desnaturalizan

Agregar la sonda

Señal de la sonda

(EST), que son secuencias cortas obtenidas de los extremos de los ADN complementarios (cDNA) (pág. 133).
Las etiquetas de secuencias expresadas son, por lo tanto, secuencias de genes parciales y, cuando se utilizan
en la construcción de mapas, proporcionan una forma rápida de localizar las posiciones de los genes, aunque
la identidad del gen no sea evidente a partir de la secuencia EST.
En el mapeo físico se utilizan dos tipos de técnicas:

l Examen directo de moléculas de ADN cromosómico, por ejemplo mediante

hibridación fluorescente in situ (FISH). En esta técnica, un fragmento de ADN clonado se
marca con un marcador fluorescente y luego se hibrida con una preparación de cromosomas
inmovilizados en un portaobjetos de vidrio. La posición física del fragmento de ADN dentro del
cromosoma se revela simplemente examinando la preparación con un microscopio (Figura 10.20). Si
FISH se lleva a cabo simultáneamente con dos sondas de ADN, cada una marcada con un fluorocromo
diferente, se pueden visualizar las posiciones relevantes en el cromosoma de los dos marcadores
representados por las sondas. Las técnicas especiales para trabajar con cromosomas extendidos,
cuyas moléculas de ADN están estiradas en lugar de enrolladas como en los cromosomas normales,
permiten posicionar los marcadores con un alto grado de precisión.

l Mapeo físico con un reactivo de mapeo, que es una colección de superposición

Fragmentos de ADN que abarcan el cromosoma o el genoma que se está estudiando. Los pares de
marcadores que se encuentran dentro de un solo fragmento deben ubicarse cerca uno del otro en el
cromosoma: qué tan cerca se puede determinar midiendo la frecuencia con la que el par aparece junto
en diferentes fragmentos en el reactivo de mapeo (Figura 10.21). El reactivo de mapeo podría ser una
biblioteca de clones, posiblemente una que también se ensambla en un contig antes de la secuenciación
del ADN. Los híbridos de radiación son un segundo tipo de reactivo de mapeo y fueron particularmente
importantes en el Proyecto Genoma Humano. Se trata de líneas celulares de hámster que contienen
fragmentos de cromosomas humanos, preparados mediante un tratamiento de irradiación (de ahí su
nombre).
El mapeo se lleva a cabo mediante la hibridación de sondas marcadoras con un panel de líneas
celulares, cada una de las cuales contiene una parte diferente del genoma humano.
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Capítulo 10 Secuenciación de genes y genomas 183

marcadores 12 3 4
ADN cromosómico

fragmentos de ADN

Figura 10.21 El
principio detrás del uso de un reactivo de mapeo. Se puede deducir que los marcadores 1 y 2 están relativamente cerca porque
están presentes juntos en cuatro fragmentos de ADN. Por el contrario, los marcadores 3 y 4 deben estar relativamente separados
porque aparecen juntos en un solo fragmento.

La importancia de un mapa en el ensamblaje de

secuencias Es posible obtener una secuencia del genoma sin el uso de un mapa genético o físico.
Esto se ilustra con el proyecto H. influenzae que seguimos en la p. 174, y se han secuenciado
muchos otros genomas bacterianos sin la ayuda de un mapa. Pero un mapa es muy importante
cuando se secuencia un genoma más grande porque proporciona una guía que se puede usar para
verificar que la secuencia del genoma se esté ensamblando correctamente a partir de las muchas
secuencias cortas que surgen del secuenciador automático. Si un marcador que ha sido mapeado
por medios físicos y/o genéticos aparece en la secuencia del genoma en una posición inesperada,
entonces se sospecha de un error en el ensamblaje de la secuencia.
Los mapas genéticos y/o físicos detallados han sido importantes en el Proyecto del Genoma
Humano, así como los de levadura, mosca de la fruta, C. elegans y A. thaliana, todos los cuales se
basaron en el enfoque de clonación contig. Los mapas también se utilizan para dirigir el ensamblaje
de secuencias en proyectos que utilizan el enfoque de escopeta. Como se describe en la pág. 176,
el principal problema al aplicar la secuenciación aleatoria a un genoma grande es la presencia de
secuencias repetidas y la posibilidad de que la secuencia ensamblada “salte” entre dos repeticiones,
por lo que parte del genoma se extravía o se omite (consulte la figura 10.12). Estos errores se
pueden evitar si el ensamblaje de la secuencia hace referencia constante a un mapa del genoma.
Debido a que evita la construcción laboriosa de contigs de clones, este enfoque de escopeta
dirigida se está convirtiendo en el método de elección para secuenciar genomas grandes.

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Adams, MD, Celnicker, SE, Holt, RA y col. (2000) La secuencia del genoma de Drosophila melanogaster.
Ciencia, 287, 2185–2195. [Una descripción clara de este proyecto del genoma.]
Brown, TA (2007) Genomas, 3.ª ed. Ciencia Garland, Abingdon. [Da detalles de las técnicas para
estudiar genomas, incluido el mapeo genético y físico.]
Fleischmann, RD, Adams, MD, White, O. et al. (1995) Secuenciación y ensamblaje aleatorios del
genoma completo de Haemophilus influenzae Rd. Ciencia, 269, 496–512. [La primera secuencia
completa del genoma bacteriano que se publica.]
Heiskanen, M., Peltonen, L. & Palotie, A. (1996) Mapeo visual por FISH de alta resolución.
Tendencias en genética, 12, 379–382.
Margulies, M., Egholm, M., Altman, WE y col. (2005) Secuenciación del genoma en reactores de
picolitros de alta densidad microfabricados. Naturaleza, 437, 376–380. [Pirosecuenciación
masivamente paralela.] s
Machine Translated by Google
184 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

s
Prober, JM, Trainor, GL, Dam, RJ et al. (1987) Un sistema para la secuenciación rápida de ADN con
didesoxinucleótidos fluorescentes que terminan la cadena. Ciencia, 238, 336–341. [El método de terminación
de la cadena como se usa hoy.]
Ronaghi, M., Ehleen, M. & Nyrn, P. (1998) Un método de secuenciación basado en tiempo real
pirofosfato. Ciencia, 281, 363–365. [Pirosecuenciación.]
Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, AR (1977) Secuenciación de ADN con inhibidores de terminación de cadena.
Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los EE. UU., 74, 5463–5467.
[La primera descripción de la secuenciación de la terminación de la cadena.]
Sears, LE, Moran, LS, Kisinger, C. et al. (1992) Secuenciación del ciclo térmico CircumVent y protocolos alternativos
de secuenciación de ADN manuales y automatizados utilizando la polimerasa de ADN Vent (exo-) altamente
termoestable. Biotécnicas , 13, 626–633. [Secuencia del ciclo térmico.]

Walter, MA, Spillett, DJ, Thomas, P., et al. (1994) Un método para construir radiación
mapas híbridos de genomas completos. Genética de la naturaleza, 7, 22–28.
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Capítulo 11

estudiando gen
Expresión y
Función
Contenido del capítulo
CONTENIDO DEL CAPÍTULO

11.1 Estudiar el transcrito de ARN de un gen 11.2

Estudiar la regulación de la expresión génica 11.3 Identificar
y estudiar el producto de traducción de un gen clonado

Todos los genes deben expresarse para funcionar. El primer paso en la expresión es la transcripción del
gen en una cadena de ARN complementaria (Figura 11.1a). Para algunos genes, por ejemplo, los que
codifican moléculas de ARN de transferencia (ARNt) y ARN ribosómico (ARNr), el transcrito en sí mismo
es la molécula funcionalmente importante. Para otros genes, la transcripción se traduce en una molécula
de proteína.
Para comprender cómo se expresa un gen, se debe estudiar la transcripción de ARN. En particular, el
biólogo molecular querrá saber si la transcripción es una copia fiel del gen o si faltan segmentos del gen
en la transcripción (Figura 11.1b). Estas piezas que faltan se llaman intrones y se centra un interés
considerable en su estructura y posible función. Además de los intrones, son importantes las ubicaciones
exactas de los puntos inicial y final de la transcripción. La mayoría de los transcritos son copias no solo
del gen en sí, sino también de las regiones de nucleótidos a ambos lados (Figura 11.1c). Las señales que
determinan el inicio y el final del proceso de transcripción solo se comprenden parcialmente, y sus
posiciones deben ubicarse si se va a estudiar la expresión de un gen.

En este capítulo, comenzaremos analizando los métodos utilizados para el análisis de transcripciones.
Estos métodos se pueden utilizar para mapear las posiciones de los puntos de inicio y finalización de la
transcripción y también para determinar si un gen contiene intrones. Luego consideraremos brevemente
algunas de las numerosas técnicas desarrolladas en los últimos años para examinar cómo se regula la
expresión de un gen. Estas técnicas son importantes ya que las aberraciones en la regulación génica son
la base de muchos trastornos clínicos. Finalmente, abordaremos el difícil problema de cómo identificar el
producto de traducción de un gen.

Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010 185
por Blackwell Publishing.
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186 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Figura 11.1 (a) Los genes se expresan por transcripción y traducción.

Algunos fundamentos de la expresión Gene

génica. ARNm = ARN mensajero, ARNt = ARN de molécula de adn
transferencia, ARNr = ARN ribosomal.
Transcripción

ARN ARNr, ARNt

Traducción de ARNm

Proteína

(b) Algunos genes contienen intrones

intrones

molécula de adn

Transcripción

Transcripción primaria de
ARN: todavía contiene intrones

Procesando

ARN maduro: sin

intrones

Traducción

Proteína

(c) Las transcripciones de ARN incluyen regiones a ambos lados del gen.

Gene
ADN

ARN

Señal de inicio señal final

para la transcripción

11.1 Estudiar el transcrito de ARN de un gen

A lo largo de los años, se han ideado una variedad de técnicas para estudiar las transcripciones de ARN.
Algunas de estas técnicas simplemente detectan la presencia de una transcripción y dan alguna
indicación de su longitud, otras permiten mapear el inicio y el final de la transcripción y ubicar las
posiciones de los intrones.

11.1.1 Detectar la presencia de un transcrito y determinar su secuencia de nucleótidos Antes de

estudiar las técnicas más sofisticadas para el análisis de ARN, debemos considerar los métodos

utilizados para obtener información básica sobre un transcrito. El primero de estos métodos es la
hibridación del norte, el equivalente de ARN de la hibridación del sur.
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Capítulo 11 Estudio de la expresión y función génica 187

123 Figura 11.2

Hibridación Northern. Se sometieron a electroforesis

tres extractos de ARN de diferentes tejidos en un gel
Ribosomal
de agarosa. Los extractos están formados por muchos
bandas de ARN
ARN de diferentes longitudes, por lo que cada uno da
gel de ARN
una mancha de ARN, pero se ven dos bandas distintas,
una para cada uno de los abundantes ARN ribosómicos.
Los tamaños de estos ARNr son conocidos (p. ej., 4718
y 1874 nucleótidos en mamíferos), por lo que pueden
usarse como marcadores de tamaño internos. El gel se
Frotis
transfiere a una membrana, se sondea con un gen
de ARN
clonado y se visualizan los resultados, por ejemplo
mediante autorradiografía si la sonda se ha marcado
hibridación del norte
radiactivamente. Solo el carril 1 da una banda, lo que
muestra que el gen clonado se expresa solo en el tejido
1 23 del que se obtuvo este extracto de ARN.

banda de Autorradiografía
hibridación

(pág. 142), que se utiliza para medir la longitud de una transcripción. Un extracto de ARN se
somete a electroforesis en un gel de agarosa, utilizando un tampón de electroforesis desnaturalizante
(p. ej., uno que contiene formaldehído) para garantizar que los ARN no formen pares de bases
intermoleculares o intramoleculares, ya que el emparejamiento de bases afectaría la velocidad a la
que las moléculas migran a través de el gel Después de la electroforesis, el gel se transfiere a una
membrana de nailon o nitrocelulosa y se hibrida con una sonda marcada (Figura 11.2). Si la sonda
es un gen clonado, la banda que aparece en la autorradiografía es la transcripción de ese gen. El
tamaño de la transcripción se puede determinar a partir de su posición dentro del gel, y si el ARN
de diferentes tejidos se ejecuta en diferentes carriles del gel, entonces se puede examinar la
posibilidad de que el gen se exprese de manera diferencial.
Una vez que se ha identificado un transcrito, se puede usar la síntesis de ADNc (pág. 133) para
convertirlo en una copia de ADN de doble cadena, que se puede clonar y secuenciar. La
comparación entre la secuencia del cDNA y la secuencia de su gen revelará las posiciones de los
intrones y posiblemente los puntos de inicio y finalización de la transcripción. Para que esto sea
posible, el ADNc debe ser una copia completa del ARNm del que se deriva. El extremo 3' de la
transcripción generalmente estará representado en el ADNc, porque la mayoría de los métodos
para la síntesis de ADNc comienzan con un cebador que se hibrida con la cola poli(A) del ARNm,
lo que significa que el extremo 3' es la primera parte en ser copiado (ver Figura 8.7). Sin embargo,
es posible que la síntesis de ADNc no continúe hasta el extremo 5' de la transcripción,
especialmente si el ARN tiene más de unos pocos cientos de nucleótidos de longitud. La
terminación prematura de la síntesis de cDNA dará como resultado un cDNA que no es una copia
completa de su transcrito y cuyo extremo 3' no corresponde al verdadero extremo 5' del mRNA
(Figura 11.3). Si este es el caso, entonces el punto de inicio de la transcripción no puede
identificarse a partir de la secuencia del ADNc. También será imposible mapear las posiciones de
los intrones que se encuentran cerca del inicio del gen.
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188 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

5' 3'
Figura 11.3 ARNm AAAA
El extremo 5' de un ARNm no puede identificarse a partir
de la secuencia de un ADNc incompleto.
Síntesis de ADNc incompleta

AAAA
TTTTT 5'
3'
Conversión a
ADNc de doble cadena

No es equivalente al Equivalente al
extremo 5' del ARNm extremo 3' del ARNm

11.1.2 Mapeo de transcritos por hibridación entre gen

y ARN
Los problemas con la síntesis incompleta de cDNA significan que se necesitan otros métodos
más directos para identificar el punto de inicio de una transcripción. Los más informativos de
estos métodos se basan en el examen del producto de hibridación formado entre un gen
clonado y su ARN.
La hibridación de ácidos nucleicos ocurre tan fácilmente entre cadenas complementarias
de ADN y ARN como entre moléculas de ADN monocatenarias. Si se forma un híbrido entre
una hebra de ADN, que contiene un gen, y su ARNm, entonces los límites entre las regiones
de cadena doble y simple marcarán los puntos inicial y final del ARNm (Figura 11.4a). Los
intrones, que están presentes en el ADN pero no en el ARNm, se "abrirán" como regiones
adicionales de cadena sencilla.
Ahora considere el resultado de tratar el híbrido ADN-ARN con una nucleasa específica
monocatenaria como S1 (pág. 46). La nucleasa S1 degrada los polinucleótidos de ADN o
ARN monocatenarios, incluidas las regiones monocatenarias en los extremos de las moléculas
predominantemente bicatenarias, pero no tiene ningún efecto sobre el ADN bicatenario o
sobre los híbridos ADN-ARN. Por lo tanto, la nucleasa S1 digerirá el ADN monocatenario no hibridado

Figura 11.4 (a) Un híbrido ADN-ARNm

intrones
Híbrido de ADN-ARNm y el efecto de tratar este
híbrido con una nucleasa específica de una sola
hebra como S1. ADN

ARN

(b) Tratamiento del híbrido con nucleasa S1

ADN
Híbrido ADN-ARN
ARN
nucleasa S1

ADN
Las regiones de ADN
ARN monocatenario se digieren
Alcalino
para degradar el ARN

Fragmentos de ADN
monocatenario que
estaban protegidos por el ARN
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Capítulo 11 Estudio de la expresión y función génica 189

regiones en cada extremo del híbrido ADN-ARN, junto con cualquier intrón en bucle (Figura 11.4b). Los
fragmentos de ADN monocatenario protegidos de la digestión con nucleasa S1 se pueden recuperar si la
cadena de ARN se degrada mediante tratamiento con álcali.
Desafortunadamente, las manipulaciones que se muestran en la Figura 11.4 no son muy informativas.
Los tamaños de los fragmentos de ADN protegidos podrían medirse mediante electroforesis en gel, pero
esto no permite determinar su orden o posiciones relativas en la secuencia de ADN. Sin embargo,
algunas modificaciones sutiles a la técnica permiten que los puntos de inicio y finalización precisos de la
transcripción y de cualquier intrón que contenga se mapeen en la secuencia de ADN.

En la figura 11.5 se muestra un ejemplo de la forma en que se usa el mapeo de la nucleasa S1 para
ubicar el punto de inicio de una transcripción. Aquí, un fragmento Sau3A que contiene 100 pb de la región
codificante, junto con 300 pb de la secuencia líder que precede al gen, se ha clonado en un vector M13 y
se ha obtenido como una molécula monocatenaria. Se agrega una muestra de la transcripción de ARN y
se permite que se hibrida con la molécula de ADN. La molécula de ADN todavía es principalmente
monocatenaria, pero ahora tiene una pequeña región protegida por la transcripción de ARN. Todo menos
esta región protegida es digerida por la nucleasa S1 y el ARN se degrada con álcali, dejando un fragmento
corto de ADN monocatenario. Si estos

Gene
Figura 11.5

Localización de un punto de inicio de transcripción por

Inserte el mapeo de nucleasa S1.
Fragmento Sau3A
fragmento Sau3A en
de 400 pb
M13

Sau3A

Sau3A

ADN monocatenario

ARNm de hibridación

Región de doble
cadena

ARNm

nucleasa S1

ADN
ARN

Álcali

ADN

Tamaño por electroforesis,

digamos 150 pb

150 pb

Sau3A Sau3A

Punto de inicio
de la transcripción
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190 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Si se examinan de cerca las manipulaciones, quedará claro que el tamaño de este fragmento
monocatenario corresponde a la distancia entre el punto de inicio de la transcripción y el sitio
Sau3A de la derecha . Por lo tanto, el tamaño del fragmento monocatenario se determina
mediante electroforesis en gel y esta información se utiliza para localizar el punto de inicio de la
transcripción en la secuencia de ADN. Exactamente la misma estrategia podría localizar el punto
final de la transcripción y los puntos de unión entre intrones y exones. La única diferencia sería
la posición del sitio de restricción elegido para delimitar un extremo del fragmento de ADN
monocatenario protegido.

11.1.3 Análisis de transcritos por extensión de cebadores

El análisis de la nucleasa S1 es una técnica poderosa que permite identificar los extremos 5ÿ y
3ÿ de una transcripción, así como las posiciones de los límites entre intrones y exones. El
segundo método de análisis de transcripción que consideraremos, la extensión de cebadores,
es menos adaptable porque solo puede identificar el extremo 5 'de un ARN. Sin embargo, es una
técnica importante que se usa con frecuencia para verificar los resultados de los análisis S1.
La extensión del cebador solo se puede usar si se conoce al menos parte de la secuencia de
la transcripción. Esto se debe a que un cebador oligonucleotídico corto debe hibridarse con el
ARN en una posición conocida, idealmente entre 100 y 200 nucleótidos del extremo 5ÿ del transcrito.
Una vez recocido, el cebador se extiende mediante transcriptasa inversa (pág. 49). Esta es una
reacción de síntesis de cDNA, pero es muy probable que se complete, ya que solo se debe copiar
un segmento corto de RNA (Figura 11.6). Por lo tanto, el extremo 3' de la hebra de ADN recién
sintetizada se corresponderá con el extremo 5' del transcrito. Localizando

5' 3'
Transcripción de ARN

Recocer la imprimación

Primer Extender con transcriptasa inversa

3' 5' Desnaturalizar el ARN,

medir la longitud del ADN,
por ejemplo, 239 nucleótidos

Correlacionar con el
secuencia de ADN

ADN

239 pb

Punto de inicio de Posición del extremo

la transcripción 5' del cebador

Figura 11.6

Localización de un punto de inicio de la transcripción por extensión del cebador.

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Capítulo 11 Estudio de la expresión y función génica 191

la posición de este término en la secuencia de ADN se logra simplemente determinando la longitud de

la molécula de ADN monocatenario y correlacionando esta información con la posición de hibridación
del cebador.

11.1.4 Análisis de transcripciones por PCR

Ya hemos estudiado la forma en que se utiliza la PCR con transcriptasa inversa para cuantificar la
cantidad de un ARN particular en un extracto (pág. 160). El procedimiento estándar de PCR con
transcriptasa inversa proporciona una copia de la región interna de una molécula de ARN, pero no
brinda ninguna información sobre los extremos de la molécula. Se puede usar una versión modificada
llamada amplificación rápida de extremos de cDNA (RACE) para identificar los extremos 5 'y 3' de
las moléculas de ARN y, por lo tanto, como el análisis S1, se puede usar para mapear los extremos de las transcripciones.
Hay varias variaciones del método RACE. Aquí consideraremos cómo se puede mapear el extremo
5 'de una molécula de ARN (Figura 11.7). Este procedimiento utiliza una imprimación

5' 3'
ARN
Figura 11.7
Una versión de RACE.
Recocer un
DNA primer

5' 3'

Síntesis de ADNc con

transcriptasa inversa

5' 3'

3' 5'

ADNc Desnaturalizar

NNNN... 3'

Agregar As al extremo 3'

con transferasa terminal

AAAAANNNN... 3'

Recocer segunda imprimación

Síntesis de la segunda cadena

con Taq polimerasa

Continúe como para la PCR estándar

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192 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

que es específico para una región interna de la molécula de ARN. El cebador se une al ARN y
dirige la primera etapa del proceso, catalizada por transcriptasa inversa, durante la cual se
produce un ADNc monocatenario. Como en el método de extensión del cebador, el extremo 3'
del ADNc se corresponde con el extremo 5' del ARN. La desoxinucleotidil transferasa terminal
(pág. 50) ahora se usa para unir una serie de nucleótidos A al extremo 3ÿ del ADNc, formando el
sitio de cebado para un segundo cebador de PCR, que está formado completamente por Ts y,
por lo tanto, se hibrida con el cola de poli(A) creada por transferasa terminal. Ahora comienza la
PCR estándar, primero convirtiendo el ADNc monocatenario en una molécula de doble cadena y
luego amplificando esta molécula a medida que avanza la PCR. El producto de PCR luego se
secuencia para revelar la posición precisa del comienzo de la transcripción.

11.2 Estudiando la regulación de la expresión génica

Pocos genes se expresan todo el tiempo. La mayoría están sujetos a regulación y se encienden
solo cuando la célula requiere su producto génico. Los sistemas de regulación de genes más
simples se encuentran en bacterias como E. coli, que pueden regular la expresión de genes para
procesos biosintéticos y metabólicos, de modo que no se sinteticen productos génicos que no
son necesarios. Por ejemplo, los genes que codifican las enzimas implicadas en la biosíntesis
del triptófano pueden desactivarse cuando hay cantidades abundantes de triptófano en la célula
y activarse de nuevo cuando los niveles de triptófano caen. De manera similar, los genes para la
utilización de azúcares como la lactosa se activan solo cuando el azúcar relevante está ahí para
ser metabolizado. En los organismos superiores, la regulación génica es más compleja porque
hay muchos más genes que controlar. La diferenciación de las células implica cambios generales
en los patrones de expresión génica, y el proceso de desarrollo desde el óvulo fertilizado hasta
el adulto requiere la coordinación entre diferentes células, así como cambios en la expresión
génica que dependen del tiempo.
Muchos de los problemas en la regulación génica requieren un enfoque genético clásico: la
genética permite distinguir los genes que controlan la regulación, permite identificar las señales
bioquímicas que influyen en la expresión génica y puede explorar las interacciones entre
diferentes genes y familias de genes. Es por esta razón que la mayoría de los avances en la
comprensión del desarrollo en organismos superiores han comenzado con estudios de la mosca
de la fruta Drosophila melanogaster. La clonación de genes y el análisis de ADN complementan
la genética clásica, ya que brindan información mucho más detallada sobre los eventos
moleculares involucrados en la regulación de la expresión de un solo gen.
Ahora sabemos que un gen sujeto a regulación tiene una o más secuencias de control en su
región aguas arriba (Figura 11.8) y que el gen se activa y desactiva mediante la unión de
proteínas reguladoras a estas secuencias. Una proteína reguladora puede reprimir la expresión
génica, en cuyo caso el gen se desactiva cuando la proteína se une a la secuencia de control o,
alternativamente, la proteína puede tener un papel positivo o potenciador, activando o aumentando
la expresión del gen diana. En esta sección examinaremos métodos para localizar secuencias de
control y determinar sus funciones en la regulación de la expresión génica.

Figura 11.8 Secuencias de control Promotor

Gene
Posiciones posibles para las secuencias de control
en la región aguas arriba de un gen.

200 pb
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Capítulo 11 Estudio de la expresión y función génica 193

1 2 Figura 11.9 Una

proteína unida disminuye la movilidad de un
fragmento de ADN durante la electroforesis en gel.

Gel de agarosa

Carril 1: fragmento de ADN

Carril 2: fragmento de ADN
+ proteína unida

11.2.1 Identificación de sitios de unión a proteínas en una molécula de ADN

Una secuencia de control es una región de ADN que puede unirse a una proteína reguladora. Por
lo tanto, debería ser posible identificar secuencias de control aguas arriba de un gen buscando en
la región relevante sitios de unión a proteínas. Hay tres maneras diferentes de hacer esto.

Retardo de gel de los complejos ADN-proteína

Las proteínas son estructuras bastante sustanciales y una proteína unida a una molécula de ADN
da como resultado un gran aumento en la masa molecular total. Si se puede detectar este aumento,
se habrá identificado un fragmento de ADN que contiene un sitio de unión a proteínas. En la
práctica, un fragmento de ADN que lleva una proteína unida se identifica mediante electroforesis
en gel, ya que tiene una movilidad menor que la molécula de ADN no complejada (Figura 11.9). El
procedimiento se denomina retardo de gel.
En un experimento de retardo en gel (Figura 11.10), la región del ADN corriente arriba del gen
que se está estudiando se digiere con una endonucleasa de restricción y luego se mezcla con la
proteína reguladora o, si la proteína aún no ha sido purificada, con un extracto no fraccionado de
núcleo nuclear. proteína (recordemos que la regulación génica se produce en el núcleo). Él

Gene Figura 11.10

1 2 3 4 5
Realización de un experimento de retardo de gel.
R RR R R R R

Digerir con la
endonucleasa de restricción.

1 5
2

4
3

Mezclar con la
proteína reguladora

1 5
2

4
3

Determinar las movilidades de los fragmentos

mediante electroforesis en gel.
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194 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Figura 11.11 Una Proteína reguladora

Base par
proteína unida protege una región de una
molécula de ADN de la degradación por una nucleasa
como la ADNasa I.

molécula de adn

ADNasa I

Fragmento de
ADN protegido por
la proteína unida

el fragmento de restricción que contiene la secuencia de control forma un complejo con la proteína reguladora:
todos los demás fragmentos permanecen como ADN "desnudo". A continuación, se determina la ubicación
de la secuencia de control encontrando la posición en el mapa de restricción del fragmento que se retarda
durante la electroforesis en gel. La precisión con la que se puede ubicar la secuencia de control depende de
cuán detallado sea el mapa de restricción y cuán convenientemente ubicados estén los sitios de restricción.
Una sola secuencia de control puede tener un tamaño inferior a 10 pb, por lo que el retardo de gel rara vez
puede identificarla con precisión. Por lo tanto, se necesitan técnicas más precisas para delinear la posición
de la secuencia de control dentro del fragmento identificado por retardo de gel.

Huella con ADNasa I El

procedimiento generalmente llamado huella permite posicionar una región de control dentro de un fragmento
de restricción que ha sido identificado por retardo de gel. Footprinting funciona sobre la base de que la
interacción con una proteína reguladora protege el ADN en la región de una secuencia de control de la
acción degradante de una endonucleasa como la desoxirribonucleasa (DNasa) I (Figura 11.11). Este
fenómeno se puede utilizar para localizar el sitio de unión a la proteína en la molécula de ADN.

El fragmento de ADN que se estudia se marca primero en un extremo y luego se forma un complejo con
la proteína reguladora (Figura 11.12a). Luego se agrega ADNasa I, pero la cantidad utilizada es limitada para
que no ocurra la degradación completa del fragmento de ADN.
En cambio, el objetivo es cortar cada molécula en un solo enlace fosfodiéster (Figura 11.12b). Si el fragmento
de ADN no tiene proteína adherida, el resultado de este tratamiento es una familia de fragmentos marcados,
que difieren en tamaño en solo un nucleótido cada uno.
Después de eliminar la proteína unida y separarla en un gel de poliacrilamida, la familia de fragmentos
marcados aparece como una escalera de bandas (Figura 11.12c). Sin embargo, la proteína unida protegió
ciertos enlaces fosfodiéster de ser cortados por la DNasa I, lo que significa que en este caso la familia de
fragmentos no está completa, ya que los fragmentos resultantes de la escisión dentro de la secuencia de
control están ausentes. Su ausencia se muestra como una “huella”, que se ve claramente en la Figura
11.12c. La región de la molécula de ADN que contiene la secuencia de control ahora se puede calcular a
partir de los tamaños de los fragmentos a ambos lados de la huella.

Ensayos de interferencia de modificación

El análisis de retardo de gel y la huella permiten localizar las secuencias de control, pero no brindan
información sobre la interacción entre la proteína de unión y el ADN.
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Capítulo 11 Estudio de la expresión y función génica 195

Figura 11.12 Huella

de ADNasa I.

moléculas de ADN

(a) Etiqueta final, agregue la proteína reguladora

etiqueta final
Proteína unida

(b) Digestión limitada de ADNasa I

Las moléculas de ADN se

cortan en cualquier enlace
fosfodiéster no protegido por la proteína.

(c) Eliminación de proteínas, electroforesis en gel,

detección de la etiqueta
Tamaños de fragmentos
de ADN

'Huella'

Carril 1: Control - sin proteína unida Posición donde se

Carril 2: Prueba – ADN + proteína unida une la proteína

Secuencia de control Figura 11.13 Una

proteína unida puede proteger una región de ADN

ADN que es mucho más larga que la secuencia de control.

Proteína
de unión

región protegida

molécula. La más precisa de estas dos técnicas, la huella, solo revela la región del ADN que está
protegida por la proteína unida. Las proteínas son relativamente grandes en comparación con una
doble hélice de ADN y pueden proteger varias decenas de pares de bases cuando se unen a una
secuencia de control que tiene solo unos pocos pares de bases de longitud (Figura 11.13). Por lo
tanto, la huella no delimita la región de control en sí misma, solo la región dentro de la cual se
encuentra.
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196 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Figura 11.14 Fragmentos de

restricción
Ensayo de interferencia de modificación.
marcados en el extremo

sulfato de dimetilo

G modificado

Agregar extracto nuclear

Proteína unida

Sin proteína unida (sitio

bloqueado)

Electroforesis en
gel de agarosa

Banda no retardada (sin

proteína unida)

purificar el ADN

piperidina

Determinar el tamaño
por electroforesis en gel
de poliacrilamida

Los nucleótidos que realmente forman uniones con una proteína unida pueden identificarse
mediante el ensayo de interferencia de modificación. Al igual que en la huella, los
fragmentos de ADN primero deben etiquetarse en un extremo. Luego se tratan con una
sustancia química que modifica nucleótidos específicos, por ejemplo, el sulfato de dimetilo,
que une grupos metilo a los nucleótidos de guanina (Figura 11.14). Esta modificación se lleva
a cabo bajo condiciones limitantes por lo que se modifica un promedio de un solo nucleótido
por fragmento de ADN. Ahora el ADN se mezcla con el extracto de proteína. La clave del
ensayo es que la proteína de unión probablemente no se unirá al ADN si se modifica una de
las guaninas dentro de la región de control, porque la metilación de un nucleótido interfiere
con la reacción química específica que le permite formar una unión con un nucleótido. proteína.
¿Cómo se controla la ausencia de unión a proteínas? Si la mezcla de ADN y proteína se
examina mediante electroforesis en gel de agarosa, se verán dos bandas, una que comprende
el complejo ADN-proteína y otra que contiene ADN sin proteína unida; en esencia, esta parte
del procedimiento es un ensayo de retardo en gel (Figura 11.14). ). La banda formada por
ADN no unido se purifica del gel y se trata con piperidina, una sustancia química que
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Capítulo 11 Estudio de la expresión y función génica 197

Silenciador potenciador Promotor

Gene

Expresión
Eliminar el
potenciador
Eliminar el
silenciador

Menos expresión

Más expresión

Figura 11.15 El
principio detrás del análisis de eliminación.

escinde las moléculas de ADN en los nucleótidos metilados. Los productos del tratamiento con
piperidina se separan ahora en un gel de poliacrilamida y se visualizan las bandas marcadas. Los
tamaños de las bandas que se ven indican la posición en el fragmento de ADN de las guaninas cuya
metilación impidió la unión a proteínas. Estas guaninas se encuentran dentro de la secuencia de control.
El ensayo de modificación ahora se puede repetir con productos químicos que se dirigen a los
nucleótidos A, T o C para determinar la posición precisa de la secuencia de control.

11.2.2 Identificación de secuencias de control mediante análisis de eliminación

Los ensayos de retardo de gel, huella e interferencia de modificación pueden ubicar posibles secuencias
de control corriente arriba de un gen, pero no brindan información sobre la función de las secuencias
individuales. El análisis de eliminación es un enfoque totalmente diferente que no solo puede ubicar
secuencias de control (aunque solo con la precisión del retardo de gel), sino que también puede indicar
la función de cada secuencia.
La técnica depende de la suposición de que la eliminación de la secuencia de control dará como
resultado un cambio en la forma en que se regula la expresión de un gen clonado (Figura 11.15). Por
ejemplo, la eliminación de una secuencia que reprime la expresión de un gen debería dar como
resultado que ese gen se exprese a un nivel más alto. De manera similar, las secuencias de control
específicas de tejido pueden identificarse ya que su deleción da como resultado que el gen diana se
exprese en tejidos distintos al correcto.

Genes informadores
Antes de llevar a cabo un análisis de deleción, se debe encontrar una forma de ensayar el efecto de una
deleción sobre la expresión del gen clonado. El efecto probablemente solo se observará cuando el gen
se clone en la especie de la que se obtuvo originalmente: no será bueno ensayar la regulación de luz
de un gen de planta si el gen se clona en una bacteria.

Ahora se han desarrollado vectores de clonación para la mayoría de los organismos (Capítulo 7),
por lo que la clonación del gen en estudio en su huésped no debería causar ningún problema. La
dificultad es que, en la mayoría de los casos, el huésped ya posee una copia del gen dentro de sus cromosomas.
¿Cómo pueden distinguirse los cambios en el patrón de expresión del gen clonado del patrón normal
de expresión mostrado por la copia cromosómica del gen? La respuesta es usar un gen reportero. Este
es un gen de prueba que se fusiona con la región aguas arriba
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198 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Figura 11.16 Un Secuencias de control Gen en

estudio
gen informador.

Reemplazar el gen
con el gen reportero

gen reportero

Secuencias de control Promotor

Tabla 11.1
Algunos ejemplos de genes informadores utilizados en estudios de regulación génica en organismos superiores.

GENE* PRODUCTO GÉNICO ENSAYO

lacZ v-galactosidasa Prueba histoquímica

neo Neomicina fosfotransferasa Resistencia a la kanamicina
Cloranfenicol acetiltransferasa Resistencia al cloranfenicol
gato Dihidrofolato reductasa Resistencia al metotrexato

dhfr higromicina fosfotransferasa Resistencia a la higromicina

aphIV lux luciferasa Bioluminiscencia
uidA Proteína fluorescente verde v- fluorescencia
de GFP glucuronidasa Prueba histoquímica

*Todos estos genes se obtienen de E. coli, excepto: lux que tiene tres fuentes: las bacterias luminiscentes Vibrio harveyii y V. fischeri, y la
luciérnaga Photinus pyralis; y GFP, que se obtiene de la medusa Aequorea victoria.

del gen clonado (Figura 11.16), reemplazando este gen. Cuando se clona en el organismo huésped,
el patrón de expresión del gen informador debe imitar exactamente al del gen original, ya que el gen
informador está bajo la influencia de exactamente las mismas secuencias de control que el gen
original.
El gen informador debe elegirse con cuidado. El primer criterio es que el gen informador debe
codificar un fenotipo que el organismo huésped aún no haya mostrado. El fenotipo del gen informador
debe ser relativamente fácil de detectar después de haber sido clonado en el huésped, e idealmente
debería ser posible analizar el fenotipo cuantitativamente. Estos criterios no han resultado difíciles de
cumplir y se han utilizado una variedad de genes informadores diferentes en estudios de regulación
génica. En la tabla 11.1 se enumeran algunos ejemplos.

Realización de un análisis de
eliminación Una vez que se ha elegido un gen informador y se ha realizado la construcción necesaria,
realizar un análisis de eliminación es bastante sencillo. Las eliminaciones se pueden hacer en la
región aguas arriba de la construcción mediante cualquiera de varias estrategias, un ejemplo simple
se muestra en la figura 11.17. A continuación, se evalúa el efecto de la deleción clonando la
construcción delecionada en el organismo huésped y determinando el patrón y el grado de expresión
del gen informador. Un aumento en la expresión implicará que se eliminó una secuencia represora o
silenciadora, una disminución indicará la eliminación de un activador o potenciador y un cambio en la
especificidad del tejido (como se muestra en la figura 11.17) señalará una secuencia de control que
responde al tejido.
Los resultados de un proyecto de análisis de eliminación deben interpretarse con mucho cuidado.
Pueden surgir complicaciones si una sola eliminación elimina dos controles estrechamente vinculados
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Capítulo 11 Estudio de la expresión y función génica 199

Secuencia de Figura 11.17 Análisis

control específica de la semilla
gen reportero de eliminación. Se ha unido un gen informador a
la región corriente arriba de un gen específico de semilla
R R
de una planta. La eliminación del fragmento de restricción
Expresión génica
específica de semillas unido por los sitios R elimina la secuencia de control que
media en la expresión del gen específico de la semilla,
de modo que el gen informador ahora se expresa en
Restringir, atar todos los tejidos de la planta.

control eliminado
secuencia

Gen ahora
expresado
en todos los tejidos

secuencias o, como es bastante común, dos secuencias de control distintas cooperan para producir
una sola respuesta. A pesar de estas posibles dificultades, los análisis de deleción, en combinación con
estudios de sitios de unión a proteínas, han proporcionado información importante sobre cómo se regula
la expresión de genes individuales y han complementado y ampliado los análisis genéticos de
diferenciación y desarrollo de base más amplia.

11.3 Identificación y estudio del producto de

traducción de un gen clonado
A lo largo de los años, la clonación de genes se ha vuelto cada vez más útil en el estudio no solo de los
genes en sí, sino también de las proteínas codificadas por los genes clonados. Las investigaciones
sobre la estructura y función de las proteínas se han beneficiado enormemente del desarrollo de
técnicas que permiten introducir mutaciones en puntos específicos de un gen clonado, lo que da como
resultado cambios dirigidos en la estructura de la proteína codificada.
Antes de considerar estos procedimientos, primero debemos analizar el problema más mundano de
cómo aislar la proteína codificada por un gen clonado. En muchos casos este análisis no será necesario,
ya que la proteína se habrá caracterizado mucho antes de que se realice el experimento de clonación
génica y ya se dispondrá de muestras puras de la proteína. Por otro lado, hay ocasiones en las que no
se ha identificado el producto de traducción de un gen clonado. Entonces se necesita un método para
aislar la proteína.

11.3.1 HRT y HART pueden identificar el producto de traducción

de un gen clonado
Se utilizan dos técnicas relacionadas, traducción de liberación híbrida (HRT) y traducción de
detención híbrida (HART), para identificar el producto de traducción codificado por un gen clonado.
Ambos dependen de la capacidad del ARNm purificado para dirigir la síntesis de proteínas en sistemas
de traducción sin células. Estos son extractos celulares, generalmente preparados a partir de semillas
de trigo en germinación o de células de reticulocitos de conejo (ambos son excepcionalmente activos
en la síntesis de proteínas) y contienen ribosomas, ARNt y todas las demás moléculas necesarias para
la síntesis de proteínas. La muestra de ARNm se agrega al sistema de traducción libre de células, junto
con una mezcla de los 20 aminoácidos que se encuentran en las proteínas, uno de los cuales está etiquetado (a menudo
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200 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

+ ADNc específico
+
+ +
++ + Membrana
++
+
+ +
Aplicar la mezcla
Sistema de
de ARNm
traducción sin El ARNm específico
ARNm puro Mezclar con se hibrida
celdas
35S con

Eliminar
+++ ARNm
hibridado
++ Proteína etiquetada

ARNm

Electroforesis en gel,
autorradiografía
Traducción libre de células,
electroforesis y
autorradiografía

Productos
Marcadores de tamaño
de traducción
de peso molecular de proteínas Proteína codificada
etiquetados
por el ADNc

Figura 11.18
Traducción sin celdas.
Figura 11.19
Traducción de liberación híbrida.

se utiliza 35S-metionina). Las moléculas de ARNm se traducen en una mezcla de proteínas

radioactivas (Figura 11.18), que pueden separarse mediante electroforesis en gel y visualizarse
mediante autorradiografía. Cada banda representa una sola proteína codificada por una de las
moléculas de ARNm presentes en la muestra.
Tanto HRT como HART funcionan mejor cuando el gen que se está estudiando se ha obtenido
como un clon de ADNc. Para la TRH, el ADNc se desnaturaliza, se inmoviliza en una membrana de
nitrocelulosa o nailon y se incuba con la muestra de ARNm (Figura 11.19). La contraparte específica
de ARNm del ADNc se hibrida y permanece adherida a la membrana.
Después de descartar las moléculas no unidas, el ARNm hibridado se recupera y se traduce en un
sistema libre de células. Esto proporciona una muestra pura de la proteína codificada por el ADNc.
La traducción de detención híbrida es ligeramente diferente en el sentido de que el ADNc
desnaturalizado se agrega directamente a la muestra de ARNm (Figura 11.20). La hibridación se
produce de nuevo entre el cDNA y su homólogo de mRNA, pero en este caso no se descarta el mRNA no unido.
En su lugar, toda la muestra se traduce en el sistema sin células. El ARNm hibridado no puede dirigir
la traducción, por lo que se sintetizan todas las proteínas excepto la codificada por el gen clonado.
Por lo tanto, el producto de traducción del gen clonado se identifica como la proteína que está
ausente en la autorradiografía.

11.3.2 Análisis de proteínas por mutagénesis in vitro

Aunque HRT y HART pueden identificar el producto de traducción de un gen clonado, estas técnicas
nos dicen poco sobre la proteína en sí. Algunas de las preguntas más importantes que se hacen los
biólogos moleculares en la actualidad se centran en la relación entre la estructura de un
Machine Translated by Google

Capítulo 11 Estudio de la expresión y función génica 201

Figura 11.20 Traslación

de detención híbrida.

preparación de ARNm

Agregar ADNc
específico

cDNA se hibrida con

la contraparte de
mRNA

Traducción
sin celdas

El mRNA
hibridado no se
puede traducir

Electroforesis en gel,
autorradiografía

Proteína codificada
por el ADNc

Productos HART Productos de

traducción totales

Mutación, por ejemplo, TA

Gene
*

*
Proteína Mutación, por ejemplo, ile usted

Propiedades de la Propiedades de la
Comparar
proteína normal proteína mutada

Figura 11.21 Una

mutación puede cambiar la secuencia de aminoácidos de una proteína, afectando posiblemente sus propiedades.

proteínas y su modo de actividad. La mejor manera de abordar estos problemas es inducir

una mutación en el gen que codifica la proteína y luego determinar qué efecto tiene el
cambio en la secuencia de aminoácidos sobre las propiedades del producto de la
traducción (Figura 11.21). En circunstancias normales, las mutaciones ocurren al azar y
es posible que se deba examinar un gran número antes de encontrar una que brinde
información útil. Una solución a este problema la proporciona la mutagénesis in vitro ,
técnica que permite realizar una mutación dirigida en un punto concreto de un gen clonado.
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202 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

(a) Eliminación de fragmentos de restricción

aluminio aluminio aluminio

Alu lo había atado

Normal Eliminado
gene gene

proteínas normales Proteína con una

deleción mayor

(b) Eliminación de nucleótidos en el sitio de restricción

Pequeña supresión
EcoRI
EcoRI ligasa

Bal31
mordisquea extremos

proteínas normales Proteína con una

deleción menor

(c) Inserción de un oligonucleótido

Inserción
EcoRI
EcoRI ligasa

oligonucleótido

proteínas normales
Proteína
desestabilizada

Figura 11.22
Diversas técnicas de mutagénesis in vitro .

Diferentes tipos de técnicas de mutagénesis in vitro Se

puede utilizar una variedad casi ilimitada de manipulaciones de ADN para introducir mutaciones en
genes clonados. Los siguientes son los más simples:

l Se puede eliminar un fragmento de restricción (Figura 11.22a). l

El gen se puede abrir en un sitio de restricción único, se pueden eliminar algunos nucleótidos
con una endonucleasa específica de doble cadena como Bal31 (pág. 46) y se puede volver a
ligar el gen (Figura 11.22b).
l Se puede insertar un oligonucleótido corto de doble cadena en una restricción
sitio (Figura 11.22c). La secuencia del oligonucleótido puede ser tal que la extensión
adicional de aminoácidos insertada en la proteína produzca, por ejemplo, una nueva
estructura como una hélice a, o desestabiliza una existente.
estructura.

Aunque potencialmente útiles, estas manipulaciones dependen de la aparición fortuita de un sitio

de restricción en el área de interés del gen clonado. La mutagénesis dirigida por oligonucleótidos
es una técnica más versátil que puede crear una mutación en cualquier punto de la
gene.
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Capítulo 11 Estudio de la expresión y función génica 203

(a) El oligonucleótido

gly abajo como usted de Secuencia

GGA GCT AAT TTA ATG genética normal
••• ••• ••• ••• •••
TCC CGA ATA AAT TAC
oligonucleótido
gly abajo tiro usted de

Desajuste no complementario

(b) Síntesis de cadenas complementarias

Gen en vector M13

ADN polimerasa
dNTP

oligonucleótido

Se sintetiza toda la cadena

complementaria

(c) Aislamiento del fago portador de la mutación

Fago portador del

gen mutado

Fago portador del

gen normal

plato sobre
así que eso
Placas que contienen el
gen mutado

placas

Hibridación de placa

Sonda con oligonucleótido

marcado

Figura 11.23 Un
método para la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos.

Uso de un oligonucleótido para crear una mutación puntual en un gen

clonado Hay varias formas diferentes de llevar a cabo la mutación dirigida por
oligonucleótidos; consideraremos uno de los más simples de estos métodos. El gen a
mutar debe obtenerse en forma monocatenaria y, por lo tanto, generalmente se clona en
un vector M13. El ADN monocatenario se purifica y la región a mutar se identifica mediante
secuenciación del ADN. Luego se sintetiza un oligonucleótido corto, complementario a la
región relevante, pero que contiene la alteración de nucleótido deseada (Figura 11.23a). A
pesar de este desajuste, el oligonucleótido se hibridará con el ADN monocatenario y
actuará como cebador para la síntesis de la cadena complementaria por una ADN polimerasa (Figura 11.23b). Esto
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204 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

La reacción de síntesis de cadena continúa hasta que se forma una nueva cadena completa y la
molécula recombinante es completamente bicatenaria.
Después de la introducción, por transfección, en células de E. coli competentes , la replicación del
ADN produce numerosas copias de la molécula de ADN recombinante. La naturaleza semiconservadora
de la replicación del ADN significa que la mitad de las moléculas de doble cadena que se producen no
están mutadas en ambas cadenas, mientras que la mitad están mutadas en ambas cadenas.
De manera similar, la mitad de la progenie del fago resultante porta copias de la molécula no mutada
y la otra mitad porta la mutación. Los fagos producidos por las células transfectadas se sembraron en
agar sólido para que se produzcan placas. La mitad de las placas deben contener la molécula
recombinante original y la otra mitad la versión mutada. Cuáles son cuáles se determinan por
hibridación en placas, usando el oligonucleótido como sonda, y empleando condiciones muy estrictas
para que solo el híbrido completamente apareado sea estable.
Las células infectadas con vectores M13 no se lisan, sino que continúan dividiéndose (pág. 19).
Por lo tanto, el gen mutado puede expresarse en las células huésped de E. coli , dando como resultado
la producción de proteína recombinante. La proteína codificada por el gen mutado se puede purificar
a partir de las células recombinantes y se pueden estudiar sus propiedades. Por lo tanto, se puede
evaluar el efecto de una mutación de un solo par de bases sobre la actividad de la proteína.

Otros métodos para crear una mutación puntual en un gen clonado El

procedimiento dirigido por oligonucleótidos ilustrado en la figura 11.23 es una forma eficaz de crear
una mutación puntual única en un gen clonado. Pero, ¿y si el objetivo es realizar una serie de cambios
en la secuencia del gen? Por supuesto, el procedimiento del oligonucleótido podría repetirse varias
veces, introduciendo una nueva mutación en cada etapa, pero sería un proceso muy largo.

Una alternativa para genes cortos (hasta aproximadamente 1 kb) sería construir el gen en el tubo
de ensayo, ubicando las mutaciones en todas las posiciones deseadas. Este enfoque es factible ahora
que se pueden producir oligonucleótidos de 150 unidades y más por síntesis química (pág. 140). El
gen se construye sintetizando una serie de oligonucleótidos parcialmente superpuestos, formando las
secuencias de estos oligonucleótidos la secuencia deseada para el gen. Las superposiciones pueden
ser parciales, en lugar de completas, porque los huecos se pueden llenar con una polimerasa de ADN
y los enlaces fosfodiéster finales se sintetizan con ligasa de ADN para crear el gen de doble cadena
completo (Figura 11.24).
Si se incluyen sitios de restricción en las secuencias finales del gen, el tratamiento con la enzima
adecuada producirá extremos cohesivos que permitirán que el gen se una a un vector de clonación.
Este procedimiento se llama síntesis de genes artificiales.
La PCR también se puede usar para crear mutaciones en genes clonados, aunque al igual que la
mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, solo se puede crear una mutación por experimento.
Se han ideado varios procedimientos, uno de los cuales se muestra en la figura 11.25. En este ejemplo,
la molécula de ADN inicial se amplifica mediante dos PCR. En cada uno de estos, un cebador es
normal y forma un híbrido completamente apareado con el ADN molde, pero el segundo es mutagénico,
ya que contiene un desajuste de un solo par de bases correspondiente a la mutación que deseamos
introducir en la secuencia de ADN. . Por lo tanto, esta mutación está presente en los dos productos de
PCR, cada uno de los cuales representa la mitad de la molécula de ADN de partida. Los dos productos
de PCR se mezclan y se lleva a cabo un ciclo de PCR final.
En este ciclo, las hebras complementarias de los dos productos se hibridan entre sí y luego la
polimerasa las extiende, produciendo la molécula de ADN mutada de longitud completa. Esta técnica,
y otras relacionadas que usan PCR, son muy rápidas y fáciles de llevar a cabo, pero el alto índice de
error de la polimerasa Taq que se usa en la PCR causa un problema importante (pág. 157). Esta tasa
de error hace probable que no solo la mutación deseada, sino también
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Capítulo 11 Estudio de la expresión y función génica 205

Oligonucleótidos superpuestos

5' 3'

3' 5'

ADN polimerasa,
ADN ligasa

Nuevo ADN

Figura 11.24
Síntesis de genes artificiales.

5' 3' 5' 3'

3' 5' 3' 5'

Imprimadores de recocido y

desnaturalización

5' 3' 5' 3'

Los cebadores
contienen mutación

3' 5' 3' 5'

PCR

5' 3' 5' 3'

3' 5' 3' 5'

Recocer hebras
mutadas

5' 3'

3' 5'

Ciclo PCR
final

Mutación

Figura 11.25 Un
método para usar PCR para crear una mutación dirigida.

aleatorias, estarán presentes al final del experimento. Por lo tanto, el producto de la PCR debe
clonarse y las secuencias de los clones individuales deben verificarse para encontrar uno que
tenga la mutación deseada.

El potencial de la mutagénesis in vitro La

mutagénesis in vitro tiene un potencial notable, tanto para la investigación pura como para la
biotecnología aplicada. Por ejemplo, el bioquímico ahora puede hacer preguntas muy específicas
sobre la forma en que la estructura de la proteína afecta la acción de una enzima. En el pasado,
ha sido posible a través del análisis bioquímico obtener una idea de la identidad del amino
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206 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

ácidos que proporcionan la unión al sustrato y las funciones catalíticas de una molécula de enzima.
Las técnicas de mutagénesis proporcionan una imagen mucho más detallada al permitir evaluar el
papel de cada aminoácido individual reemplazándolo con un residuo alternativo y determinando el
efecto que tiene sobre la actividad enzimática.
La capacidad de manipular enzimas de esta manera ha dado lugar a avances espectaculares
en nuestra comprensión de la catálisis biológica y ha dado lugar al nuevo campo de la ingeniería
de proteínas, en el que se utilizan técnicas de mutagénesis para desarrollar nuevas enzimas con
fines biotecnológicos. Por ejemplo, las alteraciones cuidadosas en la secuencia de aminoácidos de
la subtilisina, una enzima utilizada en los detergentes en polvo biológicos, han dado como resultado
versiones diseñadas con mayor resistencia al estrés térmico y de blanqueo (oxidativo) que se
encuentra en las lavadoras.

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Berk, AJ (1989) Caracterización de moléculas de ARN por análisis de nucleasa S1. Métodos en
Enzimología, 180, 334–347.
Fried, M. & Crothers, DM (1981) Equilibrios y cinética de las interacciones represor-operador lac por
electroforesis en gel de poliacrilamida. Investigación de ácidos nucleicos, 9, 6505–6525.
[Retardo de gel.]
Frohman, MA, Dush, DK y Martin, GR (1988) Producción rápida de cDNA de longitud completa a partir de
transcritos raros: amplificación usando un cebador de oligonucleótido específico de un solo gen.
Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los EE. UU., 85, 8998–9002. [Un ejemplo de RACE.]

Galas, DJ & Schmitz, A. (1978) Huella de ADNasa: un método simple para la detección de la especificidad
de unión proteína-ADN. Investigación de ácidos nucleicos, 5, 3157–3170.
Garner, MM & Rezvin, A. (1981) Un método electroforético en gel para cuantificar la unión de proteínas a
regiones específicas de ADN: aplicación a componentes del sistema regulador del operón de lactosa de
Escherichia coli . Investigación de ácidos nucleicos, 9, 3047–3060. [Retardo de gel.]
Hendrickson, W. & Schleif, R. (1985) Un dímero de la proteína AraC contacta con tres regiones adyacentes
del surco principal en el sitio del ADN de Ara I. Actas de la Academia Nacional de Ciencias de EE. UU.,
82, 3129–3133. [Un ejemplo del ensayo de interferencia de modificación.]
Kunkel, TA (1985) Mutagénesis específica de sitio rápida y eficiente sin selección fenotípica. Actas de la
Academia Nacional de Ciencias de los EE. UU., 82, 488–492.
[Mutagénesis dirigida por oligonucleótidos.]
Matzke, AJM, Stöger, EM, Schernthaner, JP & Matzke, MA (1990) Análisis de eliminación de un promotor
del gen zein en plantas de tabaco transgénicas. Biología Molecular de Plantas, 14, 323–332.
Paterson, BM, Roberts, BE & Kuff, EL (1977) Identificación y mapeo de genes estructurales mediante
traducción libre de células detenida por híbridos de ADN.mRNA. Actas de la Academia Nacional de
Ciencias de los EE. UU., 74, 4370–4374.
Pellé, R. & Murphy, NB (1993) Hibridación del norte: electroforesis rápida y simple
condiciones. Investigación de ácidos nucleicos, 21, 2783–2784.
Tsien, R. (1998) La proteína fluorescente verde. Revisiones anuales de bioquímica, 67, 509–544. [Un
sistema de genes informadores.]
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Capítulo 12

estudiando genomas
Contenido del capítulo
CONTENIDO DEL CAPÍTULO

12.1 Anotación del genoma

12.2 Estudios del transcriptoma y proteoma

A principios del siglo XXI, el énfasis en la biología molecular pasó del estudio de genes individuales
al estudio de genomas completos. Este cambio de énfasis fue impulsado por el desarrollo durante
la década de 1990 de métodos para secuenciar genomas grandes. La secuenciación del genoma
es anterior a la década de 1990 (vimos en el Capítulo 10 cómo el primer genoma, el del fago
dX174, se completó en 1975), pero no fue hasta 20 años después, en 1995, que el primer genoma
de un organismo de vida libre, la bacteria Haemophilus influenzae, fue completamente
secuenciada. Los siguientes cinco años fueron un punto de inflexión con las secuencias genómicas
de casi otras 50 bacterias publicadas, junto con secuencias completas de genomas mucho más
grandes de levadura, mosca de la fruta, Caenorhabditis elegans (un gusano nematodo),
Arabidopsis thaliana (una planta) y humanos Hoy en día, la secuenciación de genomas bacterianos
se ha convertido en una rutina, con más de 900 completados y casi 100 genomas eucarióticos
también han sido secuenciados.
La secuenciación del genoma ha llevado al desarrollo de una nueva área de investigación del
ADN, denominada vagamente posgenómica o genómica funcional. La posgenómica incluye el
uso de sistemas informáticos en la anotación del genoma, el proceso mediante el cual se
identifican los genes, las secuencias de control y otras características interesantes en una
secuencia del genoma, así como técnicas experimentales y basadas en la informática destinadas
a determinar las funciones de cualquier genes desconocidos que se descubren. La posgenómica
también abarca técnicas diseñadas para identificar qué genes se expresan en un tipo particular
de célula o tejido, y cómo este patrón de expresión del genoma cambia con el tiempo.

12.1 Anotación del genoma

Una vez que se ha completado una secuencia del genoma, el siguiente paso es localizar todos
los genes y determinar sus funciones. Es en esta área que la bioinformática, a veces denominada

Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010 207
por Blackwell Publishing.
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208 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

como biología molecular in silico, está demostrando ser de gran valor como complemento de los experimentos
convencionales.
La anotación del genoma está lejos de ser un proceso trivial, incluso con genomas que han sido ampliamente
estudiados mediante análisis genético y técnicas de clonación de genes antes de la secuenciación completa.
Por ejemplo, la secuencia de la levadura Saccharomyces cerevisiae, uno de los organismos mejor estudiados,
reveló que este genoma contiene alrededor de 6000 genes.
De estos, a unos 3600 se les pudo asignar una función ya sea sobre la base de estudios previos que se habían
llevado a cabo con levadura o porque el gen de la levadura tenía una secuencia similar a un gen que se había
estudiado en otro organismo. Esto dejó 2400 genes cuyas funciones no se conocían. A pesar de una enorme
cantidad de trabajo desde que se completó el genoma de la levadura en 1996, las funciones de muchos de
estos huérfanos aún no se han determinado.

12.1.1 Identificación de los genes en una secuencia genómica

Localizar un gen en una secuencia del genoma es fácil si se conoce la secuencia de aminoácidos del producto
proteico, lo que permite predecir la secuencia de nucleótidos del gen, o si se ha secuenciado previamente el
ADNc correspondiente. Pero para muchos genes no existe información previa que permita reconocer la
secuencia de ADN correcta. ¿Cómo se pueden ubicar estos genes en una secuencia del genoma?

Búsqueda de marcos de lectura abiertos La

secuencia de ADN de un gen es un marco de lectura abierto (ORF), una serie de tripletes de nucleótidos que
comienzan con un codón de iniciación (generalmente, pero no siempre, ATG) y terminan en un codón de
terminación (TAA, TAG o TGA en la mayoría de los genomas). La búsqueda de ORF en una secuencia
genómica, a ojo o, más generalmente, por computadora, es, por lo tanto, el primer paso en la localización de
genes. Al realizar la búsqueda es importante recordar que cada secuencia de ADN tiene seis marcos de lectura,
tres en una dirección y tres en la dirección inversa en la hebra complementaria (Figura 12.1).

La clave del éxito de la exploración ORF es la frecuencia con la que aparecen los codones de terminación
en la secuencia de ADN. Si el ADN tiene una secuencia aleatoria y un contenido de GC del 50 %, cada uno de
los tres codones de terminación aparecerá, en promedio, una vez cada 43 = 64 pb. Esto significa que no debería
haber muchos ORF de más de 30 a 40 codones en el ADN aleatorio, y no todos estos ORF comenzarán con
ATG. La mayoría de los genes son mucho más largos que esto: la longitud promedio es de 317 codones para
Escherichia coli, 483 codones para S. cerevisiae y aproximadamente 450 codones para humanos. La exploración
ORF, en su forma más simple, por lo tanto, toma una cifra de 100 codones como la longitud más corta de un
gen putativo y registra aciertos positivos para todos los ORF más largos que esto.

Con los genomas bacterianos, la exploración ORF simple es una forma eficaz de localizar la mayoría de los
genes en una secuencia de ADN. La mayoría de los genes bacterianos son mucho más largos que 100 codones.

Figura 12.1 Una 1 GRAMO A C

molécula de ADN de doble cadena tiene seis marcos 2 T GRAMO A

de lectura. 3 A T GRAMO

5'- A T GRAMO A C C A A T GRAMO A C A T GRAMO C A A T A A-3'

3'- T A C T GRAMO GRAMO T T A C T GRAMO T A C GRAMO T T A T T-5'

A T T 4
T A T 5
T T A 6
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Capítulo 12 Estudiando los genomas 209

genes

Espurio
ORF
100 pb

Figura 12.2 El
resultado típico de una búsqueda de ORF en un genoma bacteriano. Las flechas indican las direcciones en las que se ejecutan los
genes y los ORF espurios.

de longitud, por lo que son fácilmente reconocibles (Figura 12.2). Con las bacterias, el análisis se simplifica aún más por
el hecho de que la mayoría de los genes están estrechamente espaciados con muy poco ADN intergénico entre ellos.
Si asumimos que los genes reales no se superponen, lo cual es cierto para la mayoría de los genomas bacterianos,
entonces solo en estas regiones intergénicas cortas existe la posibilidad de confundir un ORF espurio con un gen real.

Las exploraciones ORF simples son menos eficaces para localizar genes en genomas eucariotas Aunque
las exploraciones ORF funcionan bien para genomas bacterianos, son menos eficaces para localizar genes en genomas
eucariotas. Esto se debe en parte a que hay sustancialmente más ADN intergénico en un genoma eucariótico, lo que
aumenta las posibilidades de encontrar ORF espurios, pero el principal problema es la presencia de intrones (ver Figura
11.1). Si un gen contiene uno o más intrones, no aparece como un ORF continuo en la secuencia del genoma.

Muchos exones tienen menos de 100 codones, algunos menos de 50 codones, y continuar el marco de lectura en un
intrón generalmente conduce a una secuencia de terminación que parece cerrar el ORF (Figura 12.3). En otras palabras,
muchos de los genes en un genoma eucariótico no son ORF largos, y el escaneo ORF simple no puede localizarlos.

Encontrar formas de localizar genes mediante la inspección de una secuencia eucariótica es un desafío importante.
aprendizaje en bioinformática. Se están siguiendo tres enfoques:

Se puede tener en cuenta el sesgo de codón . No todos los codones se usan con la misma frecuencia en los genes
de un organismo en particular. Por ejemplo, la leucina se especifica mediante seis codones (TTA, TTG, CTT,
CTC, CTA y CTG), pero en los genes humanos, la leucina se codifica con mayor frecuencia mediante CTG y rara
vez se especifica mediante TTA o CTA.
De manera similar, de los cuatro codones de valina, los genes humanos usan GTG cuatro veces más que
GTA. No se comprende la razón biológica del sesgo del codón, pero todos los organismos tienen un sesgo,
que es diferente en diferentes especies. Los exones reales muestran este sesgo, mientras que las series
aleatorias de trillizos normalmente no lo hacen.

exón intrón exón

ATGGGCAATGCAAGGTACGGTGAGCAGGTAAGTGATTAATGCATTTCTCGCAGTGGCTAGACGATGCATAG
MGNARYGEQ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . WLDDA *
MGNARYGEQ VSD *

Figura 12.3 Los

escaneos ORF se complican por los intrones. Se muestra la secuencia de nucleótidos de un gen corto que contiene un único intrón.
La secuencia de aminoácidos correcta de la proteína traducida del gen se proporciona inmediatamente debajo de la
secuencia de nucleótidos, utilizando las abreviaturas de aminoácidos de una sola letra. En esta secuencia, el intrón se ha
omitido porque se elimina de la transcripción antes de que el ARNm se traduzca en proteína. En la línea inferior, la
secuencia se ha traducido sin reconocer que está presente un intrón. Como resultado de este error, la secuencia de
aminoácidos parece terminar dentro del intrón.
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210 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

exón intrón exón

5' 3'

AG GTAAGT Py Py Py Py Py Py NCAG

Figura 12.4 Las

secuencias de consenso para los límites exón-intrón corriente arriba y corriente abajo de los intrones de vertebrados.
Py = nucleótido de pirimidina (C o T), N = cualquier nucleótido. Las flechas indican las posiciones de los límites.

l Los límites exón-intrón se pueden buscar ya que estos tienen características de secuencia
distintivas, aunque desafortunadamente el carácter distintivo de estas secuencias no es tan
grande como para hacer que su ubicación sea una tarea trivial. En los vertebrados, la
secuencia del límite aguas arriba exón-intrón generalmente se describe como 5ÿ–AGÿGTAAGT–
3ÿ y la secuencia aguas abajo como 5ÿ–PyPyPyPyPyPyNCAGÿ–3ÿ, donde “Py” significa uno
de los nucleótidos de pirimidina ( T o C), “N” es cualquier nucleótido y la flecha muestra la
ubicación precisa del límite (Figura 12.4). Estas son secuencias de consenso, los promedios
de una gran cantidad de secuencias relacionadas pero no idénticas, por lo que la búsqueda debe
incluir no solo las secuencias que se muestran, sino también al menos las variantes más comunes.
A pesar de estos problemas, este tipo de búsqueda a veces puede ayudar a delinear las
ubicaciones de los exones dentro de una región que se cree que contiene un gen. l Las secuencias
reguladoras aguas arriba se pueden usar para ubicar las regiones donde comienzan los genes. Esto
se debe a que estas secuencias reguladoras, como los límites entre exón e intrón, tienen
características de secuencia distintivas que poseen para llevar a cabo su función como señales de
reconocimiento para las proteínas de unión al ADN involucradas en la expresión génica.
Al igual que con los límites exón-intrón, las secuencias reguladoras son variables y no todos los
genes tienen la misma colección de secuencias reguladoras. Por lo tanto, usarlos para localizar
genes es problemático.

Estas tres extensiones del escaneo ORF simple, a pesar de sus limitaciones, son generalmente
aplicables a todos los genomas de eucariotas superiores. También son posibles estrategias adicionales
con organismos individuales basadas en las características especiales de sus genomas. Por ejemplo,
los genomas de vertebrados contienen islas CpG aguas arriba de muchos genes, siendo estas
secuencias de aproximadamente 1 kb en las que el contenido de GC es superior a la media del
genoma en su conjunto. Alrededor del 40-50% de los genes humanos tienen una isla CpG corriente
arriba. Estas secuencias son distintivas y cuando una está ubicada en el ADN de vertebrados, se
puede hacer una fuerte suposición de que un gen comienza en la región inmediatamente aguas abajo.

La búsqueda de homología ayuda a la localización de

genes La identificación tentativa de un gen suele ir seguida de una búsqueda de homología. Se trata
de un análisis, realizado por ordenador, en el que se compara la secuencia del gen con todas las
secuencias de genes presentes en las bases de datos internacionales de ADN, no solo genes
conocidos del organismo en estudio, sino también genes de todas las demás especies. La razón es
que dos genes de diferentes organismos que tienen funciones similares tienen secuencias similares, lo
que refleja sus historias evolutivas comunes (Figura 12.5).
Para llevar a cabo una búsqueda de homología, la secuencia de nucleótidos del gen tentativo
generalmente se traduce a una secuencia de aminoácidos, ya que esto permite una búsqueda más sensible.
Esto se debe a que hay 20 aminoácidos diferentes pero solo 4 nucleótidos, por lo que hay menos
posibilidades de que 2 secuencias de aminoácidos parezcan similares por pura casualidad.
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Capítulo 12 Estudiando los genomas 211

AGGACCAGACCC ATATAGGACC Secuencia ancestral

AGG G CCAGACCCATA C AGGACC

AGGACCAGAC T CATATAGGACC

Dos secuencias modernas

Figura 12.5
Homología entre dos secuencias que comparten un ancestro común. Las dos secuencias han adquirido mutaciones durante
sus historias evolutivas pero sus similitudes de secuencia indican que son homólogos.

GRAMO A P ML
GAS _ F GRAMO WLR A A EH GRAMO

Secuencia 1 GG TA GCCCC GRAMO GRAMO TTA A GTG CC T -CGA TTG GRAMO A A GG CCGA
GT POR T CA
TCAG CA TG GG GRAMO

* *** * * ** * * * ** * * * * * ** ** * * **
** ** * * ** *
* * * ** *

Secuencia CCCC
GRAMO 2A TA C GRAMO TTA A club británico TTG
T T Georgia
CC
Automóvil GRAMO T A C GGG
GG GTA T TGCAC
POR ESO GGG A GRAMO C
D TP
G GW
IP L R NOSOTROS _ A GRAMO HH A

Figura 12.6 La
falta de homología entre dos secuencias suele ser más evidente cuando las comparaciones se realizan a nivel de aminoácidos.
Se muestran dos secuencias de nucleótidos, con nucleótidos que son idénticos en las dos secuencias en rojo y sin
identidades en azul. Las dos secuencias de nucleótidos son idénticas en un 76%, como indican los asteriscos. Esto
podría tomarse como prueba de que las secuencias son homólogas. Sin embargo, cuando las secuencias se traducen a
aminoácidos, la identidad disminuye al 28%, lo que sugiere que los genes no son homólogos y que la similitud a nivel de
nucleótidos fue fortuita. Los aminoácidos idénticos se muestran en marrón y los no idénticos en verde. Las secuencias de
aminoácidos se han escrito utilizando abreviaturas de una letra.

(Figura 12.6). El análisis se lleva a cabo a través de Internet, iniciando sesión en el sitio web de una
de las bases de datos de ADN y utilizando un programa de búsqueda como BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool). Si la secuencia de prueba tiene una longitud de más de 200 aminoácidos y
tiene una identidad del 30% o más con una secuencia en la base de datos (es decir, en 30 de 100
posiciones aparece el mismo aminoácido en ambas secuencias), entonces es casi seguro que las
dos homólogo y el ORF en estudio puede confirmarse como un gen real. Si es necesario, se puede
obtener una confirmación adicional mediante el análisis de transcripción (pág. 186) para mostrar
que el gen se transcribe en ARN.

Comparación de secuencias de genomas relacionados

Una versión más precisa de la búsqueda de homología es posible cuando las secuencias genómicas
están disponibles para dos o más especies relacionadas. Las especies relacionadas tienen genomas
que comparten similitudes heredadas de su ancestro común, sobrecargadas de diferencias
específicas de especie que han surgido desde que las dos especies comenzaron a evolucionar de
manera independiente. Debido a la selección natural, las similitudes de secuencia entre genomas
relacionados son mayores dentro de los genes y menores en las regiones intergénicas. Por lo tanto,
cuando se comparan genomas relacionados, los genes homólogos se identifican fácilmente porque
tienen una gran similitud de secuencia, y cualquier ORF que no tenga un homólogo claro en el
genoma relacionado puede descartarse como una secuencia casual y no un gen genuino. Figura 12.7).
Este tipo de análisis de homología, denominado genómica comparativa, ha demostrado ser
muy valioso para localizar genes en el genoma de S. cerevisiae , ya que ahora se dispone de
secuencias completas o parciales no solo de esta levadura, sino también de varias especies
relacionadas, como Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces mikatae y Saccharomyces bayanus.
Las comparaciones entre estos genomas confirmaron la autenticidad de varios ORF de S. cerevisiae
y también permitieron descartar casi 500 ORF putativos con el argumento de que no tienen
equivalentes en los genomas relacionados. Los mapas genéticos de
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212 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Figura 12.7 Uso de Genoma en estudio

comparaciones entre los genomas de especies

relacionadas para probar la autenticidad de un ORF genes reales ORF corto

corto. En este ejemplo, el ORF cuestionable no está

presente en el genoma relacionado y, por lo tanto,
Genoma relacionado
probablemente no sea un gen real.

ORF está ausente

estas levaduras son muy similares, y aunque cada genoma ha sufrido sus propios reordenamientos
específicos de especie, todavía hay regiones sustanciales donde el orden de los genes en el
genoma de S. cerevisiae es el mismo que en uno o más de los genomas relacionados. La
conservación del orden de los genes se llama sintenia y hace que sea muy fácil identificar genes
homólogos. Más importante aún, un ORF falso, especialmente uno corto, se puede descartar con
confianza, porque su ubicación esperada en un genoma relacionado se puede buscar en detalle
para garantizar que no haya ningún equivalente presente.

12.1.2 Determinación de la función de un gen desconocido

La búsqueda de homología tiene dos propósitos. Además de probar la veracidad de un gen
tentativo, la identificación también puede dar una indicación de la función del gen, suponiendo que
se conoce la función del gen homólogo. A casi 2000 de los genes en el genoma de la levadura se
les asignaron funciones de esta manera. Con frecuencia, sin embargo, las coincidencias
encontradas por la búsqueda de homología son con otros genes cuyas funciones aún no se han
determinado. Estos genes no asignados se denominan huérfanos y determinar su función es uno
de los objetivos clave de la investigación posgenómica.
En los próximos años, probablemente será posible utilizar la bioinformática para obtener al
menos una idea de la función de un gen huérfano. Ya es posible usar la secuencia de nucleótidos
de un gen para predecir las posiciones de las hélices a y las láminas b en la proteína codificada,
aunque con una precisión limitada, y la información estructural resultante puede usarse algunas
veces para hacer inferencias sobre la función de la proteína. Las proteínas que se unen a las
membranas a menudo se pueden identificar porque poseen arreglos helicoidales que se extienden
a lo largo de la membrana y se pueden reconocer motivos de unión al ADN, como los dedos de
zinc. Un mayor alcance y precisión a este aspecto de la bioinformática será posible cuando se
obtenga más información sobre la relación entre la estructura de una proteína y su función.
Mientras tanto, el análisis funcional de los huérfanos depende en gran medida de los experimentos
convencionales.

Asignar la función de un gen mediante análisis experimental requiere un enfoque inverso al

de la genética . La identificación experimental de la función de un gen desconocido está
demostrando ser uno de los mayores desafíos en la investigación genómica. El problema es que
el objetivo, trazar un curso desde el gen hasta la función, es el camino inverso al que normalmente
toma el análisis genético, en el que el punto de partida es un fenotipo y el objetivo es identificar el
gen o genes subyacentes (Figura 12.8). ). En el análisis genético convencional, la base genética
de un fenotipo suele estudiarse buscando organismos mutantes en los que el fenotipo se haya
alterado. Los mutantes pueden obtenerse experimentalmente, por ejemplo, tratando una población
de organismos, como un cultivo de bacterias, con radiación ultravioleta o un químico mutagénico,
o los mutantes pueden estar presentes en una población natural. El gen o genes que han sido
alterados en el organismo mutante son luego estudiados por cruces genéticos, que pueden ubicar
la posición de un gen en un genoma y también
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Capítulo 12 Estudiando los genomas 213

(a) Genética directa Figura 12.8

Identificar y Genética directa e inversa.
estudiar mutantes.
FENOTIPO GENE

(b) Genética inversa

?
FUNCIÓN DEL GEN GENE

determinar si el gen es el mismo que ya ha sido caracterizado. Luego, el gen se puede estudiar más a
fondo mediante técnicas de biología molecular, como la clonación y la secuenciación.

El principio general de este análisis convencional ( genética directa) es que los genes responsables
de un fenotipo pueden identificarse determinando qué genes están inactivados en organismos que
muestran una versión mutante del fenotipo. Si el punto de partida es el gen, en lugar del fenotipo,
entonces la estrategia equivalente, la genética inversa , sería mutar el gen e identificar el cambio
fenotípico resultante. Esta es la base de la mayoría de las técnicas utilizadas para asignar funciones a
genes desconocidos.

Los genes específicos pueden inactivarse mediante recombinación

homóloga La forma más fácil de inactivar un gen específico es romperlo con un segmento de ADN no
relacionado (Figura 12.9). Esto se puede lograr mediante la recombinación homóloga entre la copia
cromosómica del gen y una segunda pieza de ADN que comparte alguna identidad de secuencia con
el gen objetivo.
¿Cómo se lleva a cabo la inactivación de genes en la práctica? Consideraremos dos ejemplos, el
primero con S. cerevisiae. Desde que se completó la secuencia del genoma en 1996, los biólogos
moleculares de la levadura se han embarcado en un esfuerzo internacional coordinado para determinar
las funciones de tantos genes desconocidos como sea posible. Una técnica utiliza un casete de
deleción, que lleva un gen de resistencia a los antibióticos (Figura 12.10). Este gen no es un
componente normal del genoma de la levadura, pero funcionará si se transfiere a un cromosoma de
levadura, dando lugar a una célula de levadura transformada que es resistente a la geneticina
antibiótica. Antes de usar el casete de deleción, los nuevos segmentos de ADN se unen como colas a
cada extremo. Estos segmentos tienen secuencias idénticas a partes del gen de la levadura que se va
a inactivar. Después de que el casete modificado se introduce en una célula de levadura, se produce
una recombinación homóloga entre las colas de ADN y la copia cromosómica del gen de la levadura,
reemplazando esta última por el gen de resistencia a los antibióticos. Por lo tanto, el gen diana se
inactiva. Las células que han sufrido el reemplazo se seleccionan sembrando el cultivo en medio de
agar que contiene geneticina, y se examinan sus fenotipos para obtener una idea de la función del gen.

El segundo ejemplo de inactivación de genes utiliza un proceso análogo, pero con ratones en lugar
de levadura. El ratón se utiliza con frecuencia como organismo modelo para los seres humanos porque

ADN cromosómico Figura 12.9

Disrupción de genes por recombinación homóloga.

ADN vectorial

Recombinación homóloga

ADN cromosómico

El gen está interrumpido

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214 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Cassette de eliminación
Figura 12.10 El uso
geneR
de un casete de eliminación de levadura.
R1 R2 ADN vectorial

Insertar ADN de
levadura en sitios de restricción

R1 R1 R2 R2

Introducir en las

células de levadura
Copia cromosómica del
gen diana

La recombinación homóloga interrumpe

el gen objetivo al insertar la secuencia
genR

genR se expresa

geneR Gen para la resistencia a la geneticina

Secuencia promotora de levadura

R1, R2 Sitios de restricción

el genoma del ratón contiene muchos de los mismos genes. Por lo tanto, la identificación de
las funciones de genes humanos desconocidos se lleva a cabo en gran parte mediante la
inactivación de genes equivalentes en ratones. La parte de recombinación homóloga del
procedimiento es idéntica a la descrita para la levadura y una vez más da como resultado una
célula en la que se ha inactivado el gen diana. El problema es que no queremos una sola
célula mutante, queremos un ratón mutante completo, ya que solo con el organismo completo
podemos hacer una evaluación completa del efecto de la inactivación del gen en el fenotipo.
Para lograr esto, el vector que lleva el casete de deleción se microinyecta inicialmente en una
célula madre embrionaria (pág. 124). El resultado final es un ratón knockout, cuyo fenotipo,
con suerte, proporcionará la información deseada sobre la función del gen que se está estudiando.

12.2 Estudios del transcriptoma y proteoma

Hasta ahora hemos considerado aquellos aspectos de la investigación posgenómica
relacionados con estudios de genes individuales. El cambio de énfasis de los genes al genoma
ha resultado en nuevos tipos de análisis que tienen como objetivo comprender la actividad del
genoma como un todo. Este trabajo ha llevado a la invención de dos nuevos términos:

l El transcriptoma, que es el contenido de ARN mensajero (ARNm) de una célula, y

que refleja el patrón general de expresión génica en esa célula; l El
proteoma, que es el contenido proteico de una célula y que refleja su capacidad
bioquímica.
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Capítulo 12 Estudiando los genomas 215

12.2.1 Estudio del transcriptoma

Los transcriptomas pueden tener composiciones muy complejas, que contienen cientos o miles
de ARNm diferentes, cada uno de los cuales constituye una fracción diferente de la población
total. Por tanto, para caracterizar un transcriptoma es necesario identificar los ARNm que
contiene e, idealmente, determinar su abundancia relativa.

Estudio de un transcriptoma mediante análisis de

secuencias La forma más directa de caracterizar un transcriptoma es convertir su ARNm en
ADNc y luego secuenciar cada clon en la biblioteca de ADNc resultante. Las comparaciones
entre las secuencias de ADNc y la secuencia del genoma revelarán las identidades de los genes
cuyos ARNm están presentes en el transcriptoma. Este enfoque es factible pero es laborioso,
ya que se necesitan muchas secuencias de ADNc diferentes antes de que comience a surgir
una imagen casi completa de la composición del transcriptoma. ¿Se pueden usar atajos para
obtener la información de la secuencia vital más rápidamente?
El análisis en serie de la expresión génica (SAGE) proporciona una posible solución. En
lugar de estudiar ADNc completos, SAGE produce secuencias cortas, de tan solo 12 pb de
longitud, cada una de las cuales representa un ARNm presente en el transcriptoma. La base de
la técnica es que estas secuencias de 12 pb, a pesar de su brevedad, son suficientes para
permitir identificar el gen que codifica el ARNm.
El primer paso para generar las secuencias de 12 pb es inmovilizar el ARNm en una columna
de cromatografía hibridando las colas de poli(A) presentes en los extremos 3' de estas moléculas
con cadenas de oligo(dT) que se han unido a perlas de celulosa (Figura 12.11).
El ARNm se convierte en ADNc de doble cadena y luego se trata con una enzima de restricción
que reconoce un sitio objetivo de 4 pb, como AluI, y por lo tanto corta con frecuencia en cada
ADNc. El fragmento de restricción terminal de cada cDNA permanece unido a las perlas de
celulosa, lo que permite eluir y desechar todos los demás fragmentos. Ahora se une un conector
corto al extremo libre de cada ADNc, este conector contiene una secuencia de reconocimiento
para BsmFI. Esta es una enzima de restricción inusual en el sentido de que, en lugar de cortar
dentro de su secuencia de reconocimiento, corta de 10 a 14 nucleótidos aguas abajo. Por tanto,
el tratamiento con BsmFI elimina un fragmento con una longitud media de 12 pb desde el final
de cada ADNc. Los fragmentos se recogen, se ligan de cabeza a cola para producir un catenano
y se secuencian. Las secuencias individuales se pueden identificar dentro de la catenana porque
están separadas por sitios BsmFI .

El estudio de transcriptomas mediante análisis de microarrays

o chips SAGE permite identificar ARNm individuales en un transcriptoma, pero solo proporciona
información aproximada sobre la abundancia relativa de esos ARNm. El predominio de un tipo
particular de ARNm en un transcriptoma, como los ARNm de gliadina en semillas de trigo (pág.
131), será evidente a partir de la frecuencia de esas secuencias de ARNm entre los fragmentos
SAGE, pero las variaciones más sutiles en los niveles de ARNm no lo serán. ser aparente
Las técnicas que permiten comparaciones más precisas de las cantidades de ARNm
individuales se desarrollaron por primera vez como parte del proyecto posgenómico de la
levadura. En esencia, estas técnicas involucran un tipo sofisticado de análisis de hibridación.
Cada gen de levadura, los 6000, se obtuvo como un clon individual y las muestras se colocaron
en portaobjetos de vidrio en matrices de 80 × 80 puntos. Esto se llama un microarreglo. Para
determinar qué genes están activos en las células de levadura cultivadas en condiciones
particulares, se extrajo el ARNm de las células, se convirtió en ADNc y el ADNc se marcó e
hibridó con los microarrays (Figura 12.12). Se usaron marcadores fluorescentes y se detectó la hibridación por
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216 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Figura 12.11 Análisis 3'

TTTT Celulosa
en serie de la expresión génica (SAGE). talón
Hebra de oligo (dT)

Agregar ARN

5' TTTT
ARNm
AAAA
Convertir a ADNc de
doble cadena
3'
TTTT
ARNc
AAAA
5'

Digerir con AluI

TTTT
AAAA

Descartar el Ligate linker

fragmento final que contiene la secuencia BamFI

TTTT
AAAA

Digerir con BamFI

TTTT
AAAA

Recoger, ligar a otros

fragmentos, secuenciar

Figura 12.12 Análisis

de micromatrices. La micromatriz que se muestra
aquí se ha hibridado con dos preparaciones de micromatriz
cDNA diferentes, cada una marcada con un
marcador fluorescente. Los clones que hibridan con
los ADNc se identifican por microscopía confocal.
Hibridar con
muestras de cDNA

señales de
hibridación

Hibridación detectada por

microscopía confocal

examinando los microarrays por microscopía confocal. Esos puntos que dieron una señal indicaron
genes que estaban activos en las condiciones que se estaban estudiando, y las intensidades de las
señales de hibridación revelaron las cantidades relativas de ARNm en el transcriptoma. Los cambios
en la expresión génica, cuando la levadura se transfirió a diferentes condiciones de crecimiento (p. ej.,
privación de oxígeno), se pudieron controlar repitiendo el experimento con una segunda preparación
de ADNc.
Los microarreglos ahora se están utilizando para monitorear cambios en los transcriptomas de
muchos organismos. En algunos casos, la estrategia es la misma que se usa con la levadura, el
microarreglo representa todos los genes en el genoma, pero esto es posible solo para aquellos organismos que
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Capítulo 12 Estudiando los genomas 217

C C T A Figura 12.13 Un
GRAMO C T C
chip de ADN. Un chip real llevaría muchos más
A A C A
oligonucleótidos que los que se muestran aquí, y
GRAMO

oligonucleótidos
C T C A
GRAMO

cada oligonucleótido tendría una longitud de 20 a

GRAMO
T A GRAMO A 30 nucleótidos.
C A T A
A GRAMO

T
GRAMO

C
T
C
T
A Oblea de silicio

tienen relativamente pocos genes. Una micromatriz para todos los genes humanos podría transportarse con
solo 10 portaobjetos de vidrio de 18 × 18 mm, pero preparar clones de cada uno de los 20 000 a 30 000
genes humanos sería una tarea enorme. Afortunadamente esto no es necesario. Por ejemplo, para estudiar
los cambios en el transcriptoma que se producen como resultado del cáncer, se podría preparar una
micromatriz con una biblioteca de cDNA de tejido normal. La hibridación con ADNc marcado del tejido
canceroso revelaría qué genes están regulados hacia arriba o hacia abajo en respuesta al estado canceroso.

Los chips de ADN proporcionan una alternativa a los microarrays , que son delgadas obleas de silicio
que contienen muchos oligonucleótidos diferentes (Figura 12.13). Estos oligonucleótidos se sintetizan
directamente en la superficie del chip y se pueden preparar a una densidad de 1 millón por cm2,
sustancialmente más alta de lo que es posible con un microarreglo convencional.
La hibridación entre un oligonucleótido y la sonda se detecta electrónicamente.
Debido a que los oligonucleótidos se sintetizan de novo mediante procedimientos automáticos especiales,
es relativamente fácil preparar un chip que contenga 20 000 o 30 000 oligonucleótidos, cada uno específico
para un gen humano diferente.

12.2.2 Estudio del proteoma

El proteoma es la colección completa de proteínas en una célula. Los estudios de proteoma (también llamados
proteómica) brindan información adicional que no se puede obtener simplemente examinando el
transcriptoma. El examen del transcriptoma brinda una indicación precisa de qué genes están activos en una
célula en particular, pero brinda una indicación menos precisa de las proteínas que están presentes. Esto se
debe a que los factores que influyen en el contenido de proteínas incluyen no solo la cantidad de cada ARNm
disponible, sino también la velocidad a la que un ARNm se traduce en proteína y la velocidad a la que se
degrada la proteína.
El método utilizado para identificar los constituyentes de un proteoma se denomina perfilado de proteínas.
Esto se basa en dos técnicas, la electroforesis de proteínas y la espectrometría de masas, las cuales
tienen un largo historial pero que rara vez se aplicaban juntas en la era anterior a la genómica.

Separación de las proteínas en un proteoma

Para caracterizar un proteoma, primero es necesario preparar muestras puras de sus proteínas constituyentes.
Una célula de mamífero puede contener entre 10 000 y 20 000 proteínas diferentes, por lo que se necesita
un sistema de separación altamente discriminatorio.
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218 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Cargue la muestra de proteína

Segunda
Primera electroforesis Girar electroforesis

Figura 12.14
Electroforesis en gel bidimensional.

La electroforesis en gel de poliacrilamida es el método estándar para separar las proteínas en una mezcla.
Dependiendo de la composición del gel y de las condiciones en las que se lleva a cabo la electroforesis, se pueden
utilizar diferentes propiedades químicas y físicas de las proteínas como base para su separación. La técnica más
popular utiliza el detergente llamado dodecilsulfato de sodio, que desnaturaliza las proteínas y les confiere una carga
negativa que es aproximadamente equivalente a la longitud del polipéptido desplegado. En estas condiciones, las
proteínas se separan según sus masas moleculares, migrando más rápidamente las proteínas más pequeñas hacia el
electrodo positivo.

Alternativamente, las proteínas se pueden separar mediante enfoque isoeléctrico en un gel que contiene productos
químicos que establecen un gradiente de pH cuando se aplica la carga eléctrica. En este tipo de gel, una proteína migra
a su punto isoeléctrico, la posición en el gradiente donde su carga neta es cero.

En el perfilado de proteínas, estos métodos se combinan en electroforesis en gel bidimensional. En la primera

dimensión, las proteínas se separan por enfoque isoeléctrico. A continuación, el gel se empapa en dodecilsulfato de
sodio, se gira 90° y se realiza una segunda electroforesis, separando las proteínas según su tamaño, realizada en
ángulo recto con la primera (Figura 12.14). Este enfoque puede separar varios miles de proteínas en un solo gel.

Después de la electroforesis, la tinción del gel revela un patrón complejo de manchas, cada una de las cuales
contiene una proteína diferente. Cuando se comparan dos geles, las diferencias en el patrón y las intensidades de las
manchas indican diferencias en las identidades y cantidades relativas de proteínas individuales en los dos proteomas
que se están estudiando. Por lo tanto, se pueden seleccionar puntos interesantes para la segunda etapa de perfilado
en la que se determinan las identidades de proteínas reales.

Identificación de las proteínas individuales después de la separación

La segunda etapa del perfilado de proteínas consiste en identificar las proteínas individuales que se han separado de
la mezcla inicial. Esto solía ser una propuesta difícil, pero la toma de huellas dactilares de la masa peptídica ha
proporcionado un procedimiento de identificación rápido y preciso.
La toma de huellas dactilares de masas de péptidos fue posible gracias a los avances en espectrometría de masas.
La espectrometría de masas se diseñó originalmente como un medio para identificar un compuesto a partir de las
relaciones masa-carga de las formas ionizadas que se producen cuando las moléculas del compuesto se exponen a un
campo de alta energía. La técnica estándar no se puede utilizar con proteínas porque son demasiado grandes para ser
ionizadas de manera efectiva, pero el tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz
(MALDI-TOF) soluciona este problema, al menos con péptidos de hasta 50 aminoácidos de longitud. Por supuesto, la
mayoría de las proteínas tienen más de 50 aminoácidos y, por lo tanto, es necesario romperlas en fragmentos antes de
examinarlas con MALDI-TOF. El enfoque habitual es digerir la proteína con una proteasa específica de secuencia,
como la tripsina, que escinde las proteínas inmediatamente después de los residuos de arginina o lisina. Con la mayoría
de las proteínas, esto da como resultado una serie de péptidos de 5 a 75 aminoácidos de longitud.
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Capítulo 12 Estudiando los genomas 219

(a) Espectrometría de masas MALDI-TOF

Rutas de péptidos ionizados Matriz de muestra

Reflector

Láser
Péptido de baja
masa a carga

Péptido de alta Detector

masa a carga

(b) espectro MALDI-TOF

100

El péptido debe

Intensidad
relativa
(%)

0 1000 1500 2000

Relación masa-carga

Figura 12.15 El uso

de MALDI-TOF en espectrometría de masas. Los péptidos ionizados se inyectan en el espectrómetro de masas (a) y sus
proporciones de masa a carga se miden y muestran como un espectro (b).

Una vez ionizado, la relación masa-carga de un péptido se determina a partir de su "tiempo de

vuelo" dentro del espectrómetro de masas cuando pasa de la fuente de ionización al detector
(Figura 12.15). La relación masa-carga permite calcular la masa molecular del péptido, lo que a su
vez permite deducir su composición de aminoácidos. Si se analizan varios péptidos de una sola
proteína en el gel bidimensional, la información de composición resultante se puede relacionar con
la secuencia del genoma para identificar el gen que especifica esa proteína.

Si se comparan dos proteomas, entonces un requisito clave es que se puedan identificar las
proteínas que están presentes en diferentes cantidades. Si las diferencias son relativamente
grandes, serán evidentes simplemente observando los geles teñidos después de la electroforesis
bidimensional. Sin embargo, cambios importantes en las propiedades bioquímicas de un proteoma
pueden resultar de cambios relativamente menores en las cantidades de proteínas individuales y,
por lo tanto, los métodos para detectar cambios a pequeña escala son esenciales. Una posibilidad
es etiquetar los constituyentes de dos proteomas con diferentes marcadores fluorescentes y luego
pasarlos juntos en un único gel bidimensional. La visualización del gel bidimensional a diferentes
longitudes de onda permite juzgar las intensidades de puntos equivalentes más fácilmente de lo
que es posible cuando se obtienen dos geles separados. Una alternativa más precisa es etiquetar
cada proteoma con una etiqueta de afinidad codificada por isótopos (ICAT). Estos marcadores
se pueden obtener en dos formas, una que contiene átomos de hidrógeno normales y la otra que
contiene deuterio, el isótopo pesado del hidrógeno. Las versiones normal y pesada se pueden
distinguir mediante espectrometría de masas, lo que permite conocer las cantidades relativas de una proteína en dos
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220 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

100 Péptido marcado con

Figura 12.16
deuterio
Análisis de dos proteomas por ICAT. En el
espectro MALDI TOF, los picos resultantes de
péptidos que contienen átomos de hidrógeno péptido normal
normales se muestran en azul y los de péptidos
que contienen deuterio se muestran en rojo. La Intensidad
relativa
(%)

proteína en estudio es aproximadamente 1,5

veces más abundante en el proteoma marcado
con deuterio.

0 1000 1500 2000

Relación masa-carga

los proteomas que se han mezclado se determinarán durante la etapa MALDI-TOF del procedimiento de
elaboración de perfiles (Figura 12.16).

12.2.3 Estudio de interacciones proteína-proteína

También se puede obtener información importante sobre la actividad de un genoma identificando pares o
grupos de proteínas que trabajan juntas. Dentro de las células vivas, pocas o ninguna proteína actúa en total
aislamiento. En cambio, las proteínas interactúan entre sí en vías bioquímicas y en complejos multiproteicos.
Dos técnicas importantes, la presentación de fagos y el sistema de dos híbridos de levadura, permiten
examinar estas interacciones proteína-proteína.

Exhibición de
fagos Esta técnica se llama exhibición de fagos porque involucra la “presentación” de proteínas en la superficie
de un bacteriófago, generalmente M13 (Figura 12.17a). Esto se logra mediante la clonación del gen de la
proteína en un tipo especial de vector M13, que hace que el gen clonado se fusione con un gen de la proteína
de la cubierta del fago (Figura 12.17b). Después de la transfección de E. coli, esta fusión de genes dirige la
síntesis de una proteína híbrida, formada en parte por la proteína de cubierta y en parte por el producto del
gen clonado. Con suerte, esta proteína híbrida se insertará en la cubierta del fago para que el producto del
gen clonado se encuentre ahora en la superficie de las partículas del fago.

Normalmente, esta técnica se lleva a cabo con una biblioteca de presentación de fagos formada por
muchos fagos recombinantes, cada uno de los cuales presenta una proteína diferente. Se pueden preparar
grandes bibliotecas mediante la clonación de una mezcla de ADNc de un tejido particular o, con menos
facilidad, mediante la clonación de fragmentos de ADN genómico. La biblioteca consta de fagos que muestran
una variedad de proteínas diferentes y se utiliza para identificar aquellas que interactúan con una proteína de
prueba. Esta proteína de prueba podría ser una proteína pura o una que se presente en la superficie de un
fago. La proteína se inmoviliza en los pocillos de una bandeja de microtitulación o en partículas que se pueden
utilizar en una columna de cromatografía de afinidad y luego se mezcla con la biblioteca de presentación de fagos (Figura 12.17c).
Los fagos que se retienen en la bandeja de microtitulación o dentro de la columna después de una serie de
lavados son los que muestran proteínas que interactúan con la proteína de prueba inmovilizada.

El sistema de dos híbridos de

levadura El sistema de dos híbridos de levadura es muy diferente a la exhibición de fagos. Este procedimiento
se basa en el descubrimiento de que la expresión génica en S. cerevisiae depende de las interacciones entre
pares de factores de transcripción (Figura 12.18a). En el sistema de dos híbridos, un par de factores de
transcripción responsables de la expresión de un gen de levadura se reemplaza por proteínas híbridas, cada
una compuesta en parte por factor de transcripción y en parte por proteína de prueba. A continuación, se
analiza la capacidad de este par de híbridos para dirigir la expresión del gen diana de levadura.
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Capítulo 12 Estudiando los genomas 221

(a) Presentación de proteínas en la superficie de un fago

Proteínas mostradas

(b) Fusión entre el gen clonado y un gen de la proteína de cubierta

gen del fago Gen clonado

La
expresion genica

Proteína de la

cubierta del fago Proteína

mostrada

(c) Uso de una biblioteca de presentación de fagos

Biblioteca de visualización fago

Pozo de microtitulación de fagos retenido

Lavados

Proteína de prueba

Figura 12.17

Visualización de fagos. (a) Visualización de proteínas en la superficie de un fago filamentoso recombinante. (b) La fusión de genes
utilizada para mostrar una proteína. (c) Una forma de detectar interacciones entre una proteína de prueba y un fago dentro de una
biblioteca de visualización.

(a) Interacciones entre factores (b) El resultado del primer (C) El resultado del segundo
de transcripción experimento de clonación. experimento de clonación.

1 Dos 1* 1*
2 factores de 2 2*
Factor
transcripción
de transcripción
híbrido

2 2*
1 Interacción 2 Sin Interacción
1* 1*
interacción

La Sin La
expresion genica expresión génica expresion genica

Figura 12.18 El sistema

de dos híbridos de levadura. (a) Un par de factores de transcripción que deben interactuar para que se exprese un gen de levadura.
(b) El reemplazo del factor de transcripción 1 con la proteína híbrida 1* elimina la expresión génica ya que 1* no puede interactuar con el
factor de transcripción 2. (c) El reemplazo del factor de transcripción 2 con la proteína híbrida 2* restaura la expresión génica si el híbrido
parte de 1 * y 2* pueden interactuar.
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222 Parte II Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en la Investigación

Para utilizar el sistema, se deben realizar dos experimentos de clonación de levadura. El primer
experimento de clonación implica el gen cuyo producto proteico se está estudiando. Este gen se liga
al gen de uno de los dos factores de transcripción y la construcción se inserta en un vector de
levadura. Las levaduras recombinantes que se producen no pueden expresar el gen diana porque
este factor de transcripción modificado no puede interactuar con su compañero (Figura 12.18b).

En el segundo experimento de clonación, se crea una versión híbrida de la pareja y se clona en

las células de levadura. La restauración de la expresión del gen objetivo indica que los dos factores
de transcripción híbridos pueden interactuar. Las fusiones están diseñadas de tal manera que esto
solo puede suceder si las interacciones ocurren entre los componentes de la proteína de prueba de
los híbridos, no entre los segmentos del factor de transcripción (Figura 12.18c). Por lo tanto, se
identifican pares de proteínas de prueba que interactúan. El segundo experimento de clonación puede
involucrar una biblioteca de recombinantes que representen diferentes proteínas, de modo que una
proteína pueda probarse contra muchas otras.

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW y Lipman, DJ (1990) Herramienta básica de búsqueda de
alineación local. Revista de Biología Molecular, 215, 403–410. [El programa BLAST.]
Clackson, T. & Wells, JA (1994) Selección in vitro de bibliotecas de proteínas y péptidos. Tendencias
en Biotecnología, 12, 173–184. [Exhibición de fagos.]
Fields, S. & Sternglanz, R. (1994) El sistema de dos híbridos: un ensayo para las interacciones proteína-
proteína. Tendencias en genética, 10, 286–292.
Görg, A., Weiss, W. & Dunn, MJ (2004) Tecnología actual de electroforesis bidimensional
nología para la proteómica. Proteómica, 4, 3665–3685.
Guigó, R., Flicek, P., Abril, JF et al. (2006) EGASP: el proyecto de evaluación de la anotación del genoma
humano ENCODE. Biología del genoma, 7, S2, doi:10.1186/gb-2006-7-s1-s2.
[Comparación de la precisión de diferentes programas informáticos para la localización de genes.]
Kellis, M., Patterson, N., Birren, B. & Lander, ES (2003) Secuenciación y comparación de especies de
levadura para identificar genes y elementos reguladores. Naturaleza, 423, 241–254. [Uso de la genómica
comparativa para anotar la secuencia del genoma de la levadura.]
Ohler, U. & Niemann, H. (2001) Identificación y análisis de promotores eucariotas: reciente
enfoques computacionales. Tendencias en genética, 17, 56–60.
Phizicky, E., Bastiaens, PIH, Zhu, H., Snyder, M. & Fields, S. (2003) Análisis de proteínas en una escala
proteómica. Naturaleza 422: 208–215. [Revisa todos los aspectos de la proteómica].
Ramsay, G. (1998) Chips de ADN: estado del arte. Biotecnología de la naturaleza, 16, 40–44.
Stoughton, RB (2005) Aplicaciones de micromatrices de ADN en biología. Revisión anual de bioquímica, 74,
53–82.
Velculescu, VE, Vogelstein, B. & Kinzler, KW (2000) Análisis de transcriptomas desconocidos
con SALVIA. Tendencias en genética, 16, 423–425.
Wach, A., Brachat, A., Pohlmann, R. y Philippsen, P. (1994) Nuevos módulos heterólogos para alteraciones
genéticas clásicas o basadas en PCR en Saccharomyces cerevisiae. Levadura, 10, 1793–1808.
[Inactivación de genes por recombinación homóloga.]
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PARTE III
Las aplicaciones de los genes
Clonación y Análisis de ADN
en Biotecnología

13 | Producción de proteína a partir de genes clonados 225

14 | Clonación de genes y análisis de ADN en medicina 245

15 | Clonación de genes y análisis de ADN en agricultura 264

16 | Clonación de genes y análisis de ADN en ciencia forense y

Arqueología 282
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Capítulo 13
Producción de proteína a
partir de genes clonados

Contenido del capítulo

CONTENIDO DEL CAPÍTULO

13.1 Vectores especiales para la expresión de genes foráneos en E.

coli 13.2 Problemas generales con la producción de proteína recombinante en E. coli
13.3 Producción de proteína recombinante por células eucariotas

Ahora que hemos cubierto las técnicas básicas involucradas en la clonación de genes y el
análisis de ADN y examinado cómo se utilizan estas técnicas en la investigación, podemos
pasar a considerar cómo se aplica la tecnología de ADN recombinante en biotecnología. Este no
es un tema nuevo, aunque la biotecnología ha recibido mucha más atención durante los últimos
años que nunca en el pasado. La biotecnología se puede definir como el uso de procesos
biológicos en la industria y la tecnología. Según los arqueólogos, la industria biotecnológica
británica se remonta a 4000 años atrás, a finales del período Neolítico, cuando se introdujeron
por primera vez en este país los procesos de fermentación que utilizan células vivas de levadura
para producir cerveza y aguamiel. Ciertamente, la elaboración de cerveza estaba bien establecida
en la época de la invasión romana.
Durante el siglo XX, la biotecnología se expandió con el desarrollo de una variedad de usos
industriales para los microorganismos. El descubrimiento por Alexander Fleming en 1929 de que
el moho Penicillium sintetiza un potente agente antibacteriano condujo al uso de hongos y
bacterias en la producción a gran escala de antibióticos. Al principio, los microorganismos se
cultivaban en grandes recipientes de cultivo de los que se purificaba el antibiótico después de
retirar las células (Figura 13.1a), pero este método de cultivo por lotes ha sido reemplazado en
gran medida por técnicas de cultivo continuo , haciendo uso de un fermentador, de cuyas
muestras de medio se pueden tomar continuamente, proporcionando un suministro continuo del
producto (Figura 13.1b). Este tipo de proceso no se limita a la producción de antibióticos y
también se ha utilizado para obtener grandes cantidades de otros compuestos producidos por
microorganismos (Cuadro 13.1).
Una de las razones por las que la biotecnología ha recibido tanta atención durante las últimas
tres décadas es la clonación de genes. Aunque muchos productos útiles pueden ser

Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010 225
por Blackwell Publishing.
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226 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 13.1 Dos (a) Cultivo por lotes

sistemas diferentes para el crecimiento

de microorganismos: (a) cultivo
discontinuo; (b) cultivo continuo.

Centrífugo Preparar
producto a partir
de medio o
células.

Recipiente de cultivo cerrado Pellet de células

(b) Cultura continua

agitador

Medio Medio +
fresco en celdas fuera

preparar
producto

cultivo de gran
volumen

Tabla 13.1
Algunos de los compuestos producidos por cultivo de microorganismos a escala industrial.

COMPUESTO MICROORGANISMO

antibióticos

Cefalosporinas Cephalosporium spp.

Cloranfenicol, estreptomicina Streptomyces spp.
Gramicidinas, polimixinas Bacillus spp.
penicilinas Penicillium spp.
Enzimas
invertasa Saccharomyces cerevisiae
proteasas, amilasas Bacillus spp., Aspergillus spp.
Otros

Acetona, butanol Clostridium spp.

Alcohol S. cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis Bacteria
Ácido butírico del ácido butírico Aspergillus niger Leuconostoc spp.
Ácido cítrico
dextrano

Glicerol S. cerevisiae S.

Vinagre cerevisiae, bacterias del ácido acético

obtenidos a partir de cultivos microbianos, la lista en el pasado se ha limitado a aquellos compuestos

sintetizados naturalmente por microorganismos. Muchos productos farmacéuticos importantes, que
no son producidos por microbios sino por organismos superiores, no podrían obtenerse de esta manera.
Esto ha cambiado con la aplicación de la clonación de genes a la biotecnología. La capacidad de
clonar genes significa que ahora se puede tomar un gen para una proteína animal o vegetal importante
de su huésped normal, insertarlo en un vector de clonación e introducirlo en una bacteria (Figura
13.2). Si las manipulaciones se realizan correctamente, el gen será
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Capítulo 13 Producción de proteínas a partir de genes clonados 227

Célula animal Figura 13.2 Un

posible esquema para la producción
de una proteína animal por una
bacteria. ARNm = ARN mensajero.

cromosomas

Gen que codifica

proteína animal

Vector portador de
genes animales

proteína animal ARNm

Bacteria modificada genéticamente que

sintetiza la proteína animal

expresada y la proteína recombinante sintetizada por la célula bacteriana. Entonces puede ser
posible obtener grandes cantidades de la proteína.
Por supuesto, en la práctica, la producción de proteína recombinante no es tan fácil como parece.
Se necesitan tipos especiales de vector de clonación y, a menudo, es difícil obtener rendimientos
satisfactorios de proteína recombinante. En este capítulo veremos los vectores de clonación para la
síntesis de proteínas recombinantes y examinaremos algunos de los problemas asociados con su uso.

13.1 Vectores especiales para la expresión de

genes foráneos en E. coli
Si un gen extraño (es decir, no bacteriano) se liga simplemente en un vector estándar y se clona en
E. coli, es muy poco probable que se sintetice una cantidad significativa de proteína recombinante.
Esto se debe a que la expresión depende de que el gen esté rodeado por una colección de señales
que la bacteria pueda reconocer. Estas señales, que son secuencias cortas de nucleótidos, anuncian
la presencia del gen y proporcionan instrucciones para el aparato de transcripción y traducción de la
célula. Las tres señales más importantes para los genes de E. coli son las siguientes (Figura 13.3):

l El promotor, que marca el punto en el que debe comenzar la transcripción del gen. En E. coli,
el promotor es reconocido por la subunidad g de la enzima transcriptora ARN polimerasa.
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228 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 13.3 Las Sitio de

Promotor unión al ribosoma terminador
tres señales más importantes para la
expresión génica en E. coli. Gene
ADN

Transcripción de ARN

Punto en el que un ribosoma se

une al ARNm

(a) E.coli
................... Caja TTGACA ..................... TATAAT ............. Gene
–35 –10 caja

(b) Animales
...................varias señales ..................... Caja TATA A .............
Gene
AT –25

Figura 13.4
Secuencias típicas de promotores de E. coli y genes animales.

l El terminador, que marca el punto al final del gen donde debe detenerse la transcripción. Un
terminador suele ser una secuencia de nucleótidos que puede aparearse consigo misma para
formar una estructura de bucle de tallo . l El sitio de unión al ribosoma, una secuencia de
nucleótidos corta reconocida por el
ribosoma como el punto en el que debe unirse a la molécula de ARNm. El codón de
iniciación del gen siempre está unos pocos nucleótidos aguas abajo de este sitio.

Los genes de organismos superiores también están rodeados de señales de expresión, pero sus
secuencias de nucleótidos no son las mismas que las versiones de E. coli . Esto se ilustra comparando
los promotores de E. coli y los genes humanos (Figura 13.4). Hay similitudes, pero es poco probable
que una ARN polimerasa de E. coli pueda unirse a un promotor humano. Un gen extraño está inactivo
en E. coli, simplemente porque la bacteria no reconoce sus señales de expresión.

Una solución a este problema sería insertar el gen extraño en el vector de tal manera que se
coloque bajo el control de un conjunto de señales de expresión de E. coli . Si esto se puede lograr,
entonces el gen debe transcribirse y traducirse (Figura 13.5). Los vectores de clonación que
proporcionan estas señales y, por lo tanto, pueden usarse en la producción de proteína recombinante,
se denominan vectores de expresión.

13.1.1 El promotor es el componente crítico de un vector

de expresión
El promotor es el componente más importante de un vector de expresión. Esto se debe a que el
promotor controla la primera etapa de la expresión génica (unión de una enzima ARN polimerasa al
ADN) y determina la velocidad a la que se sintetiza el ARNm. La cantidad de proteína recombinante
obtenida depende por tanto en gran medida de la naturaleza del promotor portado por el vector de
expresión.

El promotor debe elegirse con cuidado . Las

dos secuencias que se muestran en la figura 13.4a son secuencias consenso, promedios de todas las
secuencias de promotores de E. coli que se conocen. Aunque la mayoría de los promotores de E. coli no
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Capítulo 13 Producción de proteínas a partir de genes clonados 229

Señales de expresión de E. Figura 13.5 El

coli : P = promotor R = sitio de
uso de un vector de expresión para lograr la expresión
unión al ribosoma T = terminador
PAG
de un gen extraño en E. coli.

T Sitio de
restricción único

vector de
expresión

Insertar un gen extraño en el

sitio de restricción único

PAG

Gen extraño

Transformar E. coli

PAG

T
ARNm

El gen extraño se Proteína

expresa en E. coli

difieren mucho de estas secuencias consenso (p. ej., TTTACA en lugar de TTGACA), una pequeña
variación puede tener un efecto importante en la eficiencia con la que el promotor puede dirigir la
transcripción. Los promotores fuertes son aquellos que pueden sostener una alta tasa de
transcripción; los promotores fuertes generalmente controlan genes cuyos productos de traducción
son requeridos en grandes cantidades por la célula (Figura 13.6a). En contraste, los promotores
débiles, que son relativamente ineficientes, dirigen la transcripción de genes cuyos productos se
necesitan solo en pequeñas cantidades (Figura 13.6b). Claramente, un vector de expresión debe
llevar un promotor fuerte, de modo que el gen clonado se transcriba a la tasa más alta posible.
Un segundo factor a considerar cuando se construye un vector de expresión es si será posible
regular el promotor de alguna forma. Se reconocen dos tipos principales de regulación génica en E.
coli: inducción y represión. Un gen inducible es aquel cuya transcripción se activa mediante la
adición de una sustancia química al medio de cultivo; a menudo, esta sustancia química es uno de los
sustratos de la enzima codificada por el gen inducible (figura 13.7a). Por el contrario, un gen reprimible
se desactiva mediante la adición de la sustancia química reguladora (Figura 13.7b)).

La regulación génica es un proceso complejo que solo involucra indirectamente al propio promotor.
Sin embargo, muchas de las secuencias importantes para la inducción y la represión se encuentran
en la región que rodea al promotor y, por lo tanto, también están presentes en un vector de expresión.
Por lo tanto, puede ser posible extender la regulación al vector de expresión, de modo que la sustancia
química que induce o reprime el gen normalmente controlado por el promotor también puede regular
la expresión del gen clonado. Esto puede ser una clara ventaja en la producción de proteína
recombinante. Por ejemplo, si la proteína recombinante tiene un
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230 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 13.6 (a) Un fuerte promotor (b) Un promotor débil

Promotores fuertes y débiles. Gene Gene

Promotor
fuerte Transcripción promotor débil Transcripción

Relativamente pocas
Numerosas transcripciones transcripciones

Traducción
Traducción

Numerosas Bajo número de

moléculas de proteína moléculas de proteína

(a) Un gen inducible

Sustancia química
Gen reguladora... ...
normalmente apagado enciende el gen

Gene

Promotor

Transcripciones
sin transcripción

(b) Un gen reprimible

Producto químico reglamentario...
Gen ... apaga el
normalmente encendido gen

Figura 13.7
Ejemplos de los dos tipos principales de regulación génica que ocurren en las bacterias: (a) un gen inducible; (b) un gen reprimible.

efecto nocivo sobre la bacteria, entonces su síntesis debe ser monitoreada cuidadosamente para
prevenir la acumulación de niveles tóxicos: esto puede lograrse mediante el uso juicioso de la
sustancia química reguladora para controlar la expresión del gen clonado. Incluso si la proteína
recombinante no tiene efectos nocivos en la célula huésped, la regulación del gen clonado sigue
siendo deseable, ya que un alto nivel continuo de transcripción puede afectar la capacidad de
replicación del plásmido recombinante, lo que conduce a su eventual pérdida del cultivo.
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Capítulo 13 Producción de proteínas a partir de genes clonados 231

(a) El promotor lac IPTG

lacZ
Transcripción
–35 –10

(b) El promotor trp ácido 3-ÿ-indolacrílico triptófano

trpA
Transcripción sin
–35 –10
transcripción

(c) El promotor tac IPTG

Transcripción
–35 –10

(d) promotor ÿPL

<30°C
sin transcripción >30°C
–35 –10

Transcripción

(e) promotor T7 IPTG

ARN polimerasa T7

Transcripción
–35 –10

Figura 13.8 Cinco

promotores usados frecuentemente en vectores de expresión. Los promotores lac y trp se muestran aguas arriba de los genes
que normalmente controlan en E. coli.

Ejemplos de promotores usados en vectores de

expresión Varios promotores de E. coli combinan las características deseadas de fuerza y
facilidad de regulación. Los más utilizados en los vectores de expresión son los siguientes:

l El promotor lac (Figura 13.8a) es la secuencia que controla la transcripción de

el gen lacZ que codifica la b-galactosidasa (y también el fragmento del gen lacZ' portado
por los vectores pUC y M13mp; pág. 79). El promotor lac es inducido por
isopropiltiogalactósido (IPTG, p. 80), por lo que la adición de esta sustancia química al
medio de crecimiento activa la transcripción de un gen insertado cadena abajo del promotor
lac transportado por un vector de expresión.
l El promotor trp (Figura 13.8b) normalmente se encuentra aguas arriba del grupo de
genes que codifican varias de las enzimas involucradas en la biosíntesis del
aminoácido triptófano. El promotor trp es reprimido por el triptófano, pero es más
fácilmente inducido por el ácido 3-b-indoleacrílico. l El promotor tac (Figura 13.8c) es
un híbrido entre los promotores trp y lac .
Es más fuerte que cualquiera de los dos, pero aún así es inducido por IPTG.

l El promotor EPL (Figura 13.8d) es uno de los promotores responsables de la

transcripción de la molécula de ADN e. ePL es un promotor muy fuerte que es
reconocido por la ARN polimerasa de E. coli , que es subvertida por e para
transcribir el ADN del bacteriófago. El promotor es reprimido por el producto del gen ecI .
Los vectores de expresión que portan el promotor ePL se utilizan con un huésped E. coli
mutante que sintetiza una forma sensible a la temperatura de la proteína cI (pág. 40). A
baja temperatura (menos de 30°C) esta proteína mutante cI es capaz de
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232 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

reprime el promotor ePL , pero a temperaturas más altas la proteína se inactiva, lo que da
como resultado la transcripción del gen clonado.
l El promotor T7 (Figura 13.8e) es específico para la ARN polimerasa codificada por el
bacteriófago T7. Esta ARN polimerasa es mucho más activa que la ARN polimerasa de
E. coli (pág. 93), lo que significa que un gen insertado aguas abajo del promotor T7 se
expresará a un nivel alto. El gen de la polimerasa de ARN T7 normalmente no está presente
en el genoma de E. coli , por lo que se necesita una cepa especial de E. coli que sea lisogénica
para el fago T7. Recuerde que un lisógeno contiene una copia insertada del ADN del fago en
su genoma (pág. 19). En esta cepa particular de E. coli, el ADN del fago ha sido alterado
colocando una copia del promotor lac cadena arriba de su gen para la ARN polimerasa T7. Por
lo tanto, la adición de IPTG al medio de crecimiento activa la síntesis de la polimerasa de ARN
T7, que a su vez conduce a la activación del gen transportado por el vector de expresión T7.

13.1.2 Cassettes y fusiones de genes

Un vector de expresión eficiente requiere no solo un promotor fuerte y regulable, sino también una
secuencia de unión al ribosoma de E. coli y un terminador. En la mayoría de los vectores, estas
señales de expresión forman un casete, llamado así porque el gen extraño se inserta en un sitio
de restricción único presente en el medio del grupo de señales de expresión (Figura 13.9).
Por lo tanto, la ligadura del gen extraño en el casete lo coloca en la posición ideal con respecto a
las señales de expresión.
Con algunos vectores de casete, el sitio de clonación no está inmediatamente adyacente a la
secuencia de unión a ribosome, sino que está precedido por un segmento desde el comienzo de
un gen de E. coli (Figura 13.10). La inserción del gen foráneo en este sitio de restricción debe
realizarse de forma que se fusionen los dos marcos de lectura, produciendo un gen híbrido que
comienza con el segmento de E. coli y progresa sin interrupción hacia los codones del gen
foráneo. El producto de la expresión génica es, por lo tanto, una proteína híbrida o de fusión,
que consta del péptido corto codificado por el marco de lectura de E. coli fusionado con el extremo
amino terminal de la proteína extraña. Este sistema de fusión tiene cuatro ventajas:

l La traducción eficiente del ARNm producido a partir del gen clonado depende no solo de la
presencia de un sitio de unión al ribosoma, sino que también se ve afectada por la
secuencia de nucleótidos al comienzo de la región codificante. Esto probablemente se
deba a que las estructuras secundarias resultantes de pares de bases intracatenarias
podrían interferir con la unión del ribosoma a su sitio de unión (Figura 13.11). Esta
posibilidad se evita si la región pertinente está compuesta en su totalidad por E. coli natural
secuencias.

Gen extraño
Gen extraño PAG insertado en
R el casete
PAG

Casete R

T Sitio de
restricción único T

Figura 13.9 Un
vector de casete típico y la forma en que se usa. P = promotor, R = sitio de unión al ribosoma, T = terminador.
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Capítulo 13 Producción de proteínas a partir de genes clonados 233

Comienzo de Sitio de Figura 13.10 La

un gen de E. coli restricción único
construcción de un gen híbrido y la síntesis
relaciones públicas T de una proteína de fusión.

Insertar un

gen extraño

Gen extraño

relaciones públicas T

Fusión Fusión
correcta incorrecta

......GGA GCT ATA TTA...... ......GGA GCATA TTA......

E. coli Se traducirá el gen El gen extraño no se

extraño traducirá

Expresión
segmento
de E. coli

Granel de polipéptido
extraño
N término

Término C

5' Figura 13.11

Emparejamiento de bases
Problema causado por la estructura secundaria
al comienzo de un ARNm.
3'

El sitio de unión al
ribosoma está oscurecido

l La presencia del péptido bacteriano al comienzo de la proteína de fusión puede estabilizar la

molécula y evitar que la célula huésped la degrade. Por el contrario, las proteínas extrañas
que carecen de un segmento bacteriano a menudo son destruidas por el huésped. l El
segmento bacteriano puede constituir un péptido señal, responsable de dirigir la proteína de E.
coli a su posición correcta en la célula. Si el péptido señal se deriva de una proteína que es
exportada por la célula (p. ej., los productos de los genes ompA o malE ), la proteína
recombinante puede exportarse por sí misma, ya sea al medio de cultivo o al espacio
periplásmico entre el interior y el exterior. membranas celulares externas. La exportación
es deseable ya que simplifica el problema de la purificación de la proteína recombinante del
cultivo. l El segmento bacteriano también puede ayudar a la purificación al permitir que la
proteína de fusión
recuperar por cromatografía de afinidad. Por ejemplo, las fusiones que involucran la
proteína glutatión-S-transferasa de E. coli se pueden purificar mediante adsorción en perlas
de agarosa que contienen glutatión unido (Figura 13.12).

La desventaja de un sistema de fusión es que la presencia del segmento de E. coli puede

alterar las propiedades de la proteína recombinante. Por lo tanto, se necesitan métodos para
eliminar el segmento bacteriano. Por lo general, esto se logra tratando la proteína de fusión
con una sustancia química o enzima que escinde la cadena polipeptídica en o cerca de la unión
entre los dos componentes. Por ejemplo, si hay una metionina en la unión, la proteína de fusión
se puede escindir con bromuro de cianógeno, que corta los polipéptidos.
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234 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Agregar proteína de fusión glutatión-S-

transferasa

Lavar con Eluir con

tampón glutatión
Glutatión perlas

de agarosa

Proteína de fusión unida al

glutatión a través del componente
glutatión-S-transferasa
GG
GRAMO

GRAMO

GRAMO

Moléculas de glutatión adheridas

GRAMO
GRAMO
Proteína de
a la superficie de la perla
GRAMO
GRAMO
fusión pura
GRAMO

Cuenta de
agarosa

Figura 13.12 El uso

de la cromatografía de afinidad para purificar una proteína de fusión glutatión-S-transferasa .

Figura 13.13 Un péptido de E. coli

método para la recuperación del polipéptido extraño de una Proteína

proteína de fusión. El residuo de metionina en la unión de animal o vegetal

Residuo de
fusión debe ser el único presente en todo el polipéptido: si
metionina
hay otros presentes, el bromuro de cianógeno escindirá la
proteína de fusión en más de dos fragmentos.
Tratar con

bromuro de cianógeno

Escisión específicamente en el
residuo de metionina

específicamente en los residuos de metionina (Figura 13.13). Como alternativa, pueden usarse
enzimas como la trombina (que se escinde junto a los residuos de arginina) o el factor Xa (que
corta después de la arginina de Gly-Arg). La consideración importante es que las secuencias de
reconocimiento para el agente de escisión no deben ocurrir dentro de la proteína recombinante.

13.2 Problemas generales con la producción

de proteína recombinante en E. coli
A pesar del desarrollo de vectores de expresión sofisticados, aún existen numerosas dificultades
asociadas con la producción de proteínas a partir de genes extraños clonados en E. coli. Estos
problemas se pueden agrupar en dos categorías: los que se deben a la secuencia del gen extraño
y los que se deben a las limitaciones de E. coli como huésped para la síntesis de proteínas
recombinantes.
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Capítulo 13 Producción de proteínas a partir de genes clonados 235

13.2.1 Problemas derivados de la secuencia del gen

foráneo
Hay tres formas en que la secuencia de nucleótidos podría impedir la expresión eficiente de un
gen extraño clonado en E. coli:

l El gen extraño podría contener intrones. Este sería un gran problema, ya que los genes de E.
coli no contienen intrones y, por lo tanto, la bacteria no posee la maquinaria necesaria para
eliminar los intrones de las transcripciones (Figura 13.14a). l El gen extraño podría contener
secuencias que actúan como señales de terminación en E. coli (Figura 13.14b). Estas secuencias
son perfectamente inocuas en la célula huésped normal, pero en la bacteria dan como
resultado una terminación prematura y una pérdida de la expresión génica. l El sesgo de
codón del gen puede no ser ideal para la traducción en E. coli. Como se describe en la pág. 209,
aunque virtualmente todos los organismos usan el mismo código genético, cada uno

(a) E. coli no puede extirpar intrones Figura 13.14 Tres

intrón
de los problemas que podrían surgir cuando se
expresan genes extraños en E. coli: (a) los intrones
no se eliminan en E. coli; (b) terminación prematura
Transcripción de la transcripción; (c) un problema con el sesgo de
codones.

Intrón presente en el ARNm

Traducción

Se sintetiza un polipéptido
incorrecto.

(b) Terminación prematura de la transcripción

relaciones públicas T
T

Secuencia que se asemeja a

un terminador de E. coli dentro
del gen extraño
No se transcribe todo
el gen.

(c) Sesgo de codón

gen humano

Aprox. CCA CCT CCC

La mayoría de los codones de

, CCT o CCC
prolina son CCA

gen de E. coli

CCG CCG CCG

La mayoría de los codones de prolina son CCG

Resultado: E. coli tiene dificultad para traducir los

codones de prolina en un gen humano
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236 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

organismo tiene un sesgo hacia los codones preferidos. Este sesgo refleja la eficiencia con la que
las moléculas de tRNA en el organismo son capaces de reconocer los diferentes codones. Si un
gen clonado contiene una alta proporción de codones desfavorecidos, los ARNt de E. coli pueden
encontrar dificultades para traducir el gen, lo que reduce la cantidad de proteína que se sintetiza
(Figura 13.14c).

Estos problemas generalmente se pueden resolver, aunque las manipulaciones necesarias pueden
llevar mucho tiempo y ser costosas (una consideración importante en un proyecto industrial). Si el gen
contiene intrones, su ADN complementario (ADNc), preparado a partir del ARNm (pág. 133) y, por lo
tanto, carece de intrones, podría utilizarse como alternativa. Entonces podría emplearse la mutagénesis
in vitro para cambiar las secuencias de los posibles terminadores y reemplazar los codones desfavorecidos
con los preferidos por E. coli. Una alternativa con genes que tienen menos de 1 kb de longitud es hacer
una versión artificial (p. 204). Esto implica sintetizar un conjunto de oligonucleótidos superpuestos que se
ligan entre sí, y las secuencias de los oligonucleótidos se diseñan para garantizar que el gen resultante
contenga los codones de E. coli preferidos y que los terminadores estén ausentes.

13.2.2 Problemas causados por E. coli

Algunas de las dificultades encontradas cuando se usa E. coli como huésped para la síntesis de proteínas
recombinantes provienen de las propiedades inherentes de la bacteria. Por ejemplo:

l Es posible que E. coli no procese correctamente la proteína recombinante. Las proteínas de la mayoría
de los organismos se procesan después de la traducción, mediante la modificación química de los
aminoácidos dentro del polipéptido. A menudo, estos eventos de procesamiento son esenciales para
la correcta actividad biológica de la proteína. Desafortunadamente, las proteínas de las bacterias y
los organismos superiores no se procesan de manera idéntica. En particular, algunas proteínas
animales están glicosiladas, lo que significa que tienen grupos de azúcar unidos a ellas después de
la traducción. La glicosilación es extremadamente poco común en bacterias y las proteínas
recombinantes sintetizadas en E. coli nunca se glicosilan correctamente.
l Es posible que E. coli no pliegue la proteína recombinante correctamente y, por lo general, no puede
sintetizar los enlaces disulfuro presentes en muchas proteínas animales. Si la proteína no toma su
estructura terciaria plegada correctamente, por lo general es insoluble y forma un cuerpo de
inclusión dentro de la bacteria (Figura 13.15). La recuperación de la proteína del cuerpo de inclusión
no es un problema, pero convertir la proteína en su forma plegada correctamente puede ser difícil o
imposible en el tubo de ensayo. Bajo estas circunstancias, la proteína es, por supuesto, inactiva.

Figura 13.15 célula de E. coli cuerpo de inclusión

Cuerpos de inclusión.

nucleoide
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Capítulo 13 Producción de proteínas a partir de genes clonados 237

l E. coli podría degradar la proteína recombinante. No se sabe exactamente cómo E. coli puede reconocer
la proteína extraña y, por lo tanto, someterla a un recambio preferencial.

Estos problemas son menos fáciles de resolver que los problemas de secuencia descritos en la sección
anterior. La degradación de las proteínas recombinantes puede reducirse usando como huésped una cepa
de E. coli mutante que sea deficiente en una o más de las proteasas responsables de la degradación de
proteínas. También se puede promover el plegamiento correcto de las proteínas recombinantes eligiendo
una cepa huésped especial, en este caso una que sintetice en exceso las proteínas chaperonas que se cree
que son responsables del plegamiento de proteínas en la célula. Pero el principal problema es la ausencia
de glicosilación. Hasta ahora esto ha resultado insuperable, limitando E. coli a la síntesis de proteínas
animales que no necesitan ser procesadas de esta manera.

13.3 Producción de proteína recombinante

por células eucariotas
Los problemas asociados con la obtención de altos rendimientos de proteínas recombinantes activas a partir
de genes clonados en E. coli han llevado al desarrollo de sistemas de expresión para otros organismos. Ha
habido algunos intentos de utilizar otras bacterias como anfitriones para la síntesis de proteínas
recombinantes y se han logrado algunos avances con Bacillus subtilis, pero las principales alternativas a E.
coli son los eucariotas microbianos. El argumento es que un eucariota microbiano, como una levadura o un
hongo filamentoso, está más estrechamente relacionado con un animal y, por lo tanto, puede tratar la
síntesis de proteínas recombinantes de manera más eficiente que E. coli. Las levaduras y los hongos se
pueden cultivar con la misma facilidad que las bacterias en cultivo continuo, y pueden expresar un gen
clonado de un organismo superior y procesar la proteína resultante de una manera más parecida a la que
ocurre en el propio organismo superior.

13.3.1 Proteína recombinante de levadura y hongos filamentosos

En gran medida, se ha realizado el potencial de los eucariotas microbianos y estos organismos ahora se
están utilizando para la producción rutinaria de varias proteínas animales.
Todavía se requieren vectores de expresión porque resulta que los promotores y otras señales de expresión
para genes animales, en general, no funcionan de manera eficiente en estos eucariotas inferiores. Los
vectores mismos se basan en los descritos en el Capítulo 7.

Saccharomyces cerevisiae como huésped para la síntesis de proteínas recombinantes La

levadura Saccharomyces cerevisiae es actualmente el eucariota microbiano más popular para la producción
de proteínas recombinantes. Los genes clonados a menudo se colocan bajo el control del promotor GAL
(Figura 13.16a), que normalmente está aguas arriba del gen que codifica la galactosa epimerasa, una
enzima involucrada en el metabolismo de la galactosa. El promotor GAL es inducido por galactosa, lo que
proporciona un sistema sencillo para regular la expresión de un gen extraño clonado. Otros promotores
útiles son PHO5, que está regulado por el nivel de fosfato en el medio de cultivo, y CUP1, que es inducido
por cobre. La mayoría de los vectores de expresión de levadura también llevan una secuencia de terminación
de un gen de S. cerevisiae , porque las señales de terminación de animales no funcionan de manera eficaz
en la levadura.
Los rendimientos de proteína recombinante son relativamente altos, pero S. cerevisiae no puede
glicosilar correctamente las proteínas animales y, a menudo, agrega demasiadas unidades de azúcar
("hiperglucosilación"), aunque esto se puede prevenir o al menos reducir mediante el uso de una cepa huésped mutante.
S. cerevisiae también carece de un sistema eficiente para secretar proteínas en el medio de cultivo.
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238 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

(a) El promotor GAL galactosa

PAG
GAL10
Transcripción

(b) El promotor AOX

metanol
Gen de
PAG la alcohol oxidasa
Transcripción

(c) El promotor de la glucoamilasa

Almidón Xilosa
gen de la
PAG glucoamilasa
Transcripción sin
transcripción

(d) El promotor de celobiohidrolasa

Celulosa
Gen de celobiohidrolasa
PAG

Transcripción

Figura 13.16 Cuatro

promotores usados frecuentemente en vectores de expresión para eucariotas microbianos. P = promotor.

En ausencia de secreción, las proteínas recombinantes se retienen en la célula y, en consecuencia, son

menos fáciles de purificar. El sesgo de codones (pág. 209) también puede ser un problema.
A pesar de estos inconvenientes, S. cerevisiae sigue siendo el eucariota microbiano utilizado con
mayor frecuencia para la síntesis de proteínas recombinantes, en parte porque se acepta como un
organismo seguro para la producción de proteínas para su uso en medicamentos o alimentos, y en parte
debido a la gran cantidad de conocimientos acumulados. a lo largo de los años con respecto a la
bioquímica y la genética de S. cerevisiae, lo que significa que es relativamente fácil idear estrategias
para minimizar las dificultades que se presentan.

Otras levaduras y hongos

Aunque S. cerevisiae conserva la lealtad de muchos biólogos moleculares, existen otros eucariotas
microbianos que podrían ser igual o más efectivos en la síntesis de proteínas recombinantes. En
particular, Pichia pastoris, una segunda especie de levadura, es capaz de sintetizar grandes cantidades
de proteína recombinante (hasta el 30% de la proteína celular total) y sus capacidades de glicosilación
son muy similares a las de las células animales. Las estructuras de azúcar que sintetiza no son
exactamente las mismas que las versiones animales (Figura 13.17), pero las diferencias son relativamente
triviales y probablemente no tendrían un efecto significativo sobre la actividad de una proteína
recombinante. Es importante destacar que es poco probable que las proteínas glicosiladas producidas
por P. pastoris induzcan una reacción antigénica si se inyectan en el torrente sanguíneo, un problema
que se encuentra con frecuencia con las proteínas sobreglucosiladas sintetizadas por S. cerevisiae. Los
vectores de expresión para P. pastoris utilizan el promotor de alcohol oxidasa (AOX) (Figura 13.16b),
que es inducido por metanol. El único problema importante con P. pastoris es que a veces degrada las
proteínas recombinantes antes de que puedan purificarse, pero esto puede controlarse mediante el uso
de medios de cultivo especiales. Otras levaduras que se han utilizado para la síntesis de proteínas
recombinantes incluyen Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica y Kluveromyces lactis. Esta última
tiene el atractivo de que puede cultivarse sobre residuos de la industria alimentaria.

Los dos hongos filamentosos más populares son Aspergillus nidulans y Trichoderma reesei. Las
ventajas de estos organismos son sus buenas propiedades de glicosilación y
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Capítulo 13 Producción de proteínas a partir de genes clonados 239

Figura 13.17
Comparación entre una estructura típica de
glicosilación encontrada en una proteína
animal y las estructuras sintetizadas por P.
pastoris y S. cerevisiae.

Azúcares

– Asn– – Asn– – Asn–

Humano P. pastoris S. cerevisiae

su capacidad para secretar proteínas en el medio de crecimiento. Esta última es una característica
particularmente fuerte del hongo de la pudrición de la madera T. reesei, que en su hábitat natural secreta
enzimas celulolíticas que degradan la madera en la que vive. Las características de secreción significan
que estos hongos pueden producir proteínas recombinantes en una forma que ayuda a la purificación. Los
vectores de expresión de A. nidulans suelen llevar el promotor de la glucoamilasa (Figura 13.16c), inducido
por el almidón y reprimido por la xilosa; los de T. reesei utilizan el promotor de la celobiohidrolasa (Figura
13.16d), que es inducido por la celulosa.

13.3.2 Uso de células animales para la producción de proteínas recombinantes

Las dificultades inherentes a la síntesis de una proteína animal completamente activa en un huésped
microbiano han llevado a los biotecnólogos a explorar la posibilidad de utilizar células animales para la
síntesis de proteínas recombinantes. Para proteínas con estructuras de glicosilación complejas y esenciales,
una célula animal podría ser el único tipo de huésped dentro del cual se puede sintetizar la proteína activa.

Producción de proteínas en células de mamíferos

Los sistemas de cultivo para células animales han existido desde principios de la década de 1960, pero
solo durante los últimos 20 años se han puesto a disposición métodos para el cultivo continuo a gran escala.
Un problema con algunas líneas de células animales es que requieren una superficie sólida sobre la que
crecer, lo que añade complicaciones al diseño de los recipientes de cultivo. Una solución es llenar el interior
del recipiente con placas, proporcionando una gran superficie, pero esto tiene la desventaja de que la
mezcla completa y continua del medio dentro del recipiente se vuelve muy difícil. Una segunda posibilidad
es utilizar un recipiente estándar pero proporcionando a las células pequeñas partículas inertes (p. ej.,
perlas de celulosa) sobre las que crecer. Las tasas de crecimiento y las densidades celulares máximas son
mucho menores para las células animales en comparación con los microorganismos, lo que limita el
rendimiento de la proteína recombinante, pero esto puede tolerarse si es la única forma de obtener la
proteína activa.
Por supuesto, la clonación de genes puede no ser necesaria para obtener una proteína animal a partir
de un cultivo de células animales. Sin embargo, los vectores de expresión y los genes clonados todavía se
utilizan para maximizar los rendimientos, colocando el gen bajo el control de un promotor que es más fuerte.
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240 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 13.18 Cuerpos

de inclusión cristalinos en los núcleos de células de insecto

infectadas con un baculovirus. Citoplasma

Membrana
nuclear

Cuerpos de
inclusión

que aquel al que normalmente está unido. Este promotor a menudo se obtiene de virus como el SV40 (pág. 123), el
citomegalovirus (CMV) o el virus del sarcoma de Rous (RSV).
Se han utilizado líneas celulares de mamíferos derivadas de seres humanos o hámsteres en la síntesis de varias proteínas
recombinantes y, en la mayoría de los casos, estas proteínas se han procesado correctamente y no se pueden distinguir
de las versiones no recombinantes. Sin embargo, este es el enfoque más costoso para la producción de proteínas
recombinantes, especialmente porque la posible purificación conjunta de virus con la proteína significa que se deben
emplear procedimientos rigurosos de control de calidad para garantizar que el producto sea seguro.

Producción de proteínas en células de insectos

Las células de insectos proporcionan una alternativa a las células de mamíferos para la producción de proteínas animales.
Las células de insecto no se comportan en cultivo de forma diferente a las células de mamífero pero tienen la gran ventaja
de que, gracias a un sistema de expresión natural, pueden proporcionar altos rendimientos de proteína recombinante.

El sistema de expresión se basa en los baculovirus, un grupo de virus que son comunes en los insectos pero que
normalmente no infectan a los vertebrados. El genoma del baculovirus incluye el gen de la poliedrina, cuyo producto se
acumula en la célula del insecto como grandes cuerpos de inclusión nuclear hacia el final del ciclo de infección (Figura
13.18). El producto de este único gen constituye con frecuencia más del 50% de la proteína celular total. También se
producen niveles similares de producción de proteínas si el gen normal se reemplaza por uno extraño. Los vectores de
baculovirus se han utilizado con éxito en la producción de varias proteínas de mamíferos, pero desafortunadamente las
proteínas resultantes no se glicosilan correctamente. En este sentido, el sistema de baculovirus no ofrece ninguna ventaja
en comparación con S. cerevisiae o P. pastoris. Sin embargo, las deficiencias en el proceso de glicosilación de insectos
pueden evitarse usando un baculovirus modificado que lleva un promotor de mamífero para expresar genes directamente
en células de mamífero. La infección no es productiva, lo que significa que el genoma del virus no puede replicarse, pero
los genes clonados en uno de los vectores BacMam , como se les llama, se mantienen estables en las células de los
mamíferos durante el tiempo suficiente para que se produzca la expresión. Esta expresión va acompañada de las propias
actividades de procesamiento postraduccional de la célula de mamífero, por lo que la proteína recombinante está
correctamente glicosilada y, por lo tanto, debería estar completamente activa.

Por supuesto, en la naturaleza, los baculovirus infectan insectos vivos, no cultivos celulares. Por ejemplo, uno de los
baculovirus más populares utilizados en la clonación es el nucleopolihedrovirus Bombyx mori (BmNPV), que es un patógeno
natural del gusano de seda. Existe una enorme industria convencional basada en el cultivo de gusanos de seda para la
producción de seda, y esta experiencia ahora se está aprovechando para la producción de proteínas recombinantes,
utilizando vectores de expresión basados en el genoma BmNPV. Además de ser un medio fácil y económico de obtener
proteínas, los gusanos de seda tienen la ventaja adicional de no ser infectados por
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Capítulo 13 Producción de proteínas a partir de genes clonados 241

virus que son patógenos para los humanos. Por lo tanto, se evita la posibilidad de que se
copurifiquen virus peligrosos con la proteína recombinante.

13.3.3 Pharming: proteína recombinante de animales y plantas vivos El uso de

gusanos de seda para la producción de proteínas recombinantes es un ejemplo del

proceso que a menudo se denomina pharming, en el que un organismo transgénico actúa

como huésped para la síntesis de proteínas. Pharming es una innovación reciente y controvertida
en la clonación de genes.

Pharming en animales
Un animal transgénico es aquel que contiene un gen clonado en todas sus células. Los ratones
knockout (pág. 214), utilizados para estudiar la función de los genes humanos y de otros
mamíferos, son ejemplos de animales transgénicos. Con ratones, se puede producir un animal
transgénico mediante microinyección del gen que se clonará en un óvulo fertilizado (pág. 85).
Aunque esta técnica funciona bien con ratones, la inyección de células fertilizadas es ineficaz o
imposible con muchos otros mamíferos, y la generación de animales transgénicos para la
producción de proteínas recombinantes suele implicar un procedimiento más sofisticado llamado
transferencia nuclear (Figura 13.19). Esto implica la microinyección del gen de la proteína
recombinante en una célula somática, que es un proceso más eficiente que la inyección en un
óvulo fertilizado. Debido a que la célula somática por sí misma no se diferenciará en un animal,
su núcleo, después de la microinyección, debe transferirse a un ovocito cuyo propio núcleo haya
sido removido. Después de la implantación en una madre adoptiva, la célula modificada conserva
la capacidad del ovocito original para dividirse y diferenciarse en un animal, que contendrá el
transgén en cada célula. Este es un procedimiento largo y, por lo tanto, los animales transgénicos
son costosos de producir, pero la tecnología es rentable porque una vez que se ha creado un
animal transgénico, puede reproducirse y transmitir su gen clonado a su descendencia de
acuerdo con los principios mendelianos estándar.
Aunque se han producido proteínas en la sangre de animales transgénicos y en los huevos
de pollos transgénicos, el enfoque más exitoso ha sido usar animales de granja como ovejas o
cerdos, con el gen clonado unido al promotor de la b-lactoglobulina del animal. gene. Este
promotor está activo en el tejido mamario, lo que significa que la proteína recombinante se
secreta en la leche (Figura 13.20). La producción de leche puede ser

Figura 13.19
Transferencia del núcleo de una célula somática
transgénica a un ovocito.
ovocito Célula
somatica solución de ADN

Eliminar Eliminar
núcleo núcleo

Implante en
madre adoptiva
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242 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 13.20 Gen para

proteína recombinante
Producción de proteína recombinante en la leche
de una oveja transgénica.
Clonar en una
promotor de ÿ-
lactoglobulina oveja transgénica

Proteína recombinante
secretada en la leche.

continua durante la vida adulta del animal, lo que resulta en un alto rendimiento de la proteína.
Por ejemplo, la vaca promedio produce unos 8000 litros de leche por año, lo que produce entre 40 y 80 kg
de proteína. Debido a que la proteína se secreta, la purificación es relativamente fácil. Lo más importante
es que las ovejas y los cerdos son mamíferos, por lo que las proteínas humanas producidas de esta manera
se modifican correctamente. Por lo tanto, la producción de proteínas farmacéuticas en animales de granja
ofrece una promesa considerable para la síntesis de proteínas humanas correctamente modificadas para
su uso en medicina.

Proteínas recombinantes de plantas Las

plantas brindan la posibilidad final para la producción de proteína recombinante. Las plantas y los animales
tienen actividades de procesamiento de proteínas similares, aunque existen ligeras diferencias en las vías
de glicosilación. El cultivo de células vegetales es una tecnología bien establecida que ya se utiliza en la
síntesis comercial de productos vegetales naturales. Alternativamente, las plantas intactas se pueden
cultivar a una alta densidad en los campos. El último enfoque para la producción de proteínas recombinantes
se ha utilizado con una variedad de cultivos, como maíz, tabaco, arroz y caña de azúcar. Una posibilidad
es colocar el transgén junto al promotor de un gen específico de la semilla, como la b-faseolina, que codifica
la principal proteína de la semilla del frijol Phaseolus vulgaris. Por lo tanto, la proteína recombinante se
sintetiza específicamente en las semillas, que acumulan naturalmente grandes cantidades de proteínas y
son fáciles de cosechar y procesar. También se han sintetizado proteínas recombinantes en hojas de
tabaco y alfalfa y en tubérculos de patatas. En todos estos casos, la proteína tiene que ser purificada de la
compleja mezcla bioquímica que se produce cuando se trituran las semillas, hojas o tubérculos. Una forma
de evitar este problema es expresar la proteína recombinante como una fusión con un péptido señal que
dirige la secreción de la proteína por las raíces. Aunque esto requiere que las plantas se cultiven en
sistemas hidropónicos en lugar de en campos, la disminución en el rendimiento se ve compensada, al
menos en parte, por el bajo costo de la purificación.

Cualquiera que sea el sistema de producción que se utilice, las plantas ofrecen un medio económico y
de baja tecnología para la producción en masa de proteínas recombinantes. Se ha producido una variedad
de proteínas en sistemas experimentales, incluidos importantes productos farmacéuticos como las
interleucinas y los anticuerpos. Esta es un área de investigación intensiva en la actualidad, con varias
empresas de biotecnología vegetal desarrollando sistemas que han alcanzado o están cerca de la
producción comercial. Una posibilidad muy prometedora es que las plantas podrían usarse para sintetizar
vacunas, proporcionando la base para un programa de vacunación económico y eficiente (Capítulo 14).
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Capítulo 13 Producción de proteínas a partir de genes clonados 243

Preocupaciones éticas planteadas por

pharming Con nuestra discusión sobre pharming hemos entrado en una de las áreas de la clonación de
genes que causa preocupación entre el público. Ningún estudiante de clonación de genes y análisis de ADN
debería ignorar las controversias suscitadas por la manipulación genética de animales y plantas pero,
igualmente, ningún libro de texto sobre el tema debería intentar enseñar la respuesta “correcta” a estas
preocupaciones éticas. Usted debe tomar su propia decisión sobre tales asuntos.
Con los animales transgénicos, uno de los temores es que los procedimientos utilizados puedan causar
sufrimiento. Estas preocupaciones no se centran en la proteína recombinante, sino en las manipulaciones
que resultan en la producción del animal transgénico. Los animales producidos por transferencia nuclear
sufren una frecuencia relativamente alta de malformaciones congénitas, y algunos de los que sobreviven no
sintetizan adecuadamente la proteína requerida, por lo que este tipo de pharming va acompañado de un alto
“desperdicio”. Incluso los animales sanos parecen sufrir un envejecimiento prematuro, como lo ilustró de
manera más famosa la "oveja Dolly" que, aunque no era transgénica, fue el primer animal producido por
transferencia nuclear. La mayoría de las ovejas de su raza viven hasta 12 años, pero Dolly desarrolló artritis
a la edad de 5 años y fue sacrificada un año después porque se descubrió que padecía una enfermedad
pulmonar terminal, que normalmente se encuentra solo en ovejas viejas. Se ha especulado que este
envejecimiento prematuro estaba relacionado con la edad de la célula somática cuyo núcleo dio origen a
Dolly, ya que esta célula procedía de una oveja de seis años y Dolly tenía efectivamente seis cuando nació.
Aunque la tecnología ha avanzado dramáticamente desde que nació Dolly en 1997, los problemas de
bienestar relacionados con los animales transgénicos no se han resuelto, y los problemas más amplios
relacionados con el uso de la transferencia nuclear para “clonar” animales (es decir, para producir
descendencia idéntica, en lugar de que clonar genes individuales) permanecen a la vanguardia de la

conciencia.

El cultivo de plantas plantea un conjunto completamente diferente de preocupaciones éticas, relacionadas

en parte con el impacto que los cultivos manipulados genéticamente podrían tener en el medio ambiente.
Estas preocupaciones se aplican a todos los cultivos transgénicos, no solo a los utilizados para la agricultura,
y volveremos a ellos en el Capítulo 15 después de haber examinado los usos más generales de la clonación
de genes en la agricultura.

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
de Boer, HA, Comstock, LJ & Vasser, M. (1983) El promotor tac : un híbrido funcional derivado de los
promotores trp y lac . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los EE. UU., 80, 21–25.

Borisjuk, NV, Borisjuk, LG, Logendra, S. et al. (1999) Producción de proteínas recombinantes en
exudados de raíces de plantas. Biotecnología de la naturaleza, 17, 466–469.
Gellissen, G. & Hollenberg, CP (1997) Aplicaciones de levaduras en estudios de expresión génica:
una comparación de Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha y Kluveromyces lactis:
una revisión. Gene, 190, 87–97.
Hannig, G. y Makrides, SC (1998) Estrategias para optimizar la expresión de proteínas heterólogas
sión en Escherichia coli. Tendencias en Biotecnología, 16, 54–60.
Hellwig, S., Drossard, J., Twyman, RM y Fischer, R. (2004) Cultivos de células vegetales para la
producción de proteínas recombinantes. Biotecnología de la naturaleza, 22, 1415–1422. s
Machine Translated by Google
244 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

s
Houdebine, L.-M. (2009) Producción de proteínas farmacéuticas por animales transgénicos.
Inmunología comparativa, microbiología y enfermedades infecciosas, 32, 107–121.
Ikonomou, L., Schneider, YJ & Agathos, SN (2003) Cultivo de células de insectos para la producción industrial
de proteínas recombinantes. Microbiología aplicada y biotecnología, 62, 1–20.
Kaiser, J. (2008) ¿Se acabó la sequía para la industria farmacéutica? Ciencia, 320, 473–475.
Kind, A. & Schnieke, A. (2008) Animal pharming, dos décadas después. Investigación transgénica, 17, 1025–
1033. [Revisa el progreso y las controversias con la cría de animales.]
Kost, TA, Condreay, JP y Jarvis, DL (2005) Baculovirus como vectores versátiles para la expresión de proteínas
en células de insectos y mamíferos. Biotecnología de la naturaleza, 23, 567–575.
Remaut, E., Stanssens, P. & Fiers, W. (1981) Vectores de plásmidos para expresión de alta eficiencia controlada
por el promotor PL de colifago. Gene, 15, 81–93. [Construcción de un vector de expresión.]

Robinson, M., Lilley, R., Little, S. y col. (1984) El uso de codones puede afectar la eficiencia de la traducción de
genes en Escherichia coli. Investigación de ácidos nucleicos, 12, 6663–6671.
Sørensen, HP & Mortensen, KK (2004) Estrategias genéticas avanzadas para la expresión de proteínas
recombinantes en Escherichia coli. Revista de Biotecnología, 115, 113–128. [Una revisión general del uso
de E. coli para la producción de proteínas recombinantes.]
Sreekrishna, K., Brankamp, RG, Kropp, KE et al. (1997) Estrategias para la síntesis y secreción óptimas de
proteínas heterólogas en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. Gene, 190, 55–62.

Stoger, E., Ma, JK-C., Fischer, R. & Christou, P. (2005) Sembrando las semillas del éxito: proteínas farmacéuticas
de plantas. Opinión actual en biotecnología, 16, 167–173.
Thomson, AJ & McWhir, J. (2004) Aplicaciones biomédicas y agrícolas de animales
transgénesis. Biotecnología Molecular, 27, 231–244.
Wiebe, MG (2003) Producción estable de proteínas recombinantes en hongos filamentosos: problemas y mejoras.
Micólogo, 17, 140–144.
Wilmut, I., Schnieke, AE, McWhir, J. et al. (1997) Descendencia viable derivada de células fetales y de mamíferos
adultos. Naturaleza, 385, 810–813. [El método utilizado para producir la oveja Dolly.]

Wurm, F. (2004) Producción de productos terapéuticos de proteínas recombinantes en mamíferos cultivados

células. Biotecnología de la naturaleza, 22, 1393–1398.
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capitulo 14
Clonación de genes y ADN
Análisis en Medicina

Contenido del capítulo

CONTENIDO DEL CAPÍTULO

14.1 Producción de fármacos recombinantes 14.2

Identificación de genes responsables de enfermedades humanas
14.3 Terapia génica

La medicina ha sido y seguirá siendo una de las principales beneficiarias de la revolución del
ADN recombinante, y se podría escribir un libro entero sobre este tema. Más adelante en este
capítulo veremos cómo se utilizan las técnicas de ADN recombinante para identificar genes
responsables de enfermedades hereditarias y diseñar nuevas terapias para estos trastornos.
Primero, continuaremos con el tema desarrollado en el último capítulo y examinaremos las
formas en que los genes clonados se utilizan en la producción de fármacos recombinantes.

14.1 Producción de productos farmacéuticos recombinantes

Varios trastornos humanos pueden atribuirse a la ausencia o el mal funcionamiento de una
proteína que normalmente se sintetiza en el cuerpo. La mayoría de estos trastornos pueden
tratarse suministrando al paciente la versión correcta de la proteína, pero para que esto sea
posible, la proteína relevante debe estar disponible en cantidades relativamente grandes. Si el
defecto puede corregirse solo administrando la proteína humana, entonces obtener cantidades
suficientes será un problema importante a menos que la sangre donada pueda usarse como
fuente. Por lo tanto, las proteínas animales se usan siempre que son efectivas, pero no hay
muchos trastornos que puedan tratarse con proteínas animales, y siempre existe la posibilidad
de efectos secundarios, como una respuesta alergénica.
Aprendimos en el Capítulo 13 que la clonación de genes se puede utilizar para obtener
grandes cantidades de proteínas humanas recombinantes. ¿Cómo se aplican estas técnicas a la
producción de proteínas para uso farmacéutico?

Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010 245
por Blackwell Publishing.
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246 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

14.1.1 Insulina recombinante

La insulina, sintetizada por las células B de los islotes de Langerhans en el páncreas, controla el
nivel de glucosa en la sangre. Una deficiencia de insulina se manifiesta como diabetes mellitus, un
complejo de síntomas que puede conducir a la muerte si no se trata. Afortunadamente, muchas
formas de diabetes pueden aliviarse mediante un programa continuo de inyecciones de insulina, lo
que complementa la cantidad limitada de hormonas sintetizadas por el páncreas del paciente.
La insulina utilizada en este tratamiento se obtuvo originalmente del páncreas de cerdos y vacas
sacrificados para la producción de carne. Aunque la insulina animal es generalmente satisfactoria,
pueden surgir problemas en su uso para tratar la diabetes humana. Un problema es que las ligeras
diferencias entre las proteínas animales y humanas pueden provocar efectos secundarios en
algunos pacientes. Otra es que los procedimientos de purificación son difíciles y los contaminantes
potencialmente peligrosos no siempre se pueden eliminar por completo.
La insulina presenta dos características que facilitan su producción mediante técnicas de ADN
recombinante. La primera es que la proteína humana no se modifica después de la traducción por
la adición de moléculas de azúcar (pág. 236): por lo tanto, la insulina recombinante sintetizada por
una bacteria debería ser activa. La segunda ventaja se refiere al tamaño de la molécula. La insulina
es una proteína relativamente pequeña que consta de dos polipéptidos, uno de 21 aminoácidos (la
cadena A) y uno de 30 aminoácidos (la cadena B; figura 14.1). En los humanos estas cadenas son

La molécula de insulina

30 aminoácidos
cadena B

Una cadena
21 aminoácidos

Líder B C A

preproinsulina (Proinsulina = BCA–sin líder)

Plegado espontáneo

L B
S S
S S
A

Escote

B
S S
S S
A Insulina

Figura 14.1
Estructura de la molécula de insulina y resumen de su síntesis por procesamiento a partir de preproinsulina.
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Capítulo 14 Clonación de genes y análisis de ADN en medicina 247

sintetizada como un precursor llamado preproinsulina, que contiene los segmentos A y B unidos por
una tercera cadena (C) y precedidos por una secuencia líder. La secuencia líder se elimina después
de la traducción y la cadena C se escinde, dejando los polipéptidos A y B unidos entre sí por dos
enlaces disulfuro.
Se han utilizado varias estrategias para obtener insulina recombinante. Uno de los primeros
proyectos, que implica la síntesis de genes artificiales para las cadenas A y B, seguida de la producción
de proteínas de fusión en E. coli, ilustra una serie de técnicas generales utilizadas en la producción
de proteínas recombinantes.

Síntesis y expresión de genes artificiales de insulina A

finales de la década de 1970, la idea de fabricar un gen artificial fue extremadamente innovadora.
La síntesis de oligonucleótidos estaba en su infancia en ese momento, y los métodos disponibles para
hacer moléculas de ADN artificiales eran mucho más engorrosos que las técnicas automatizadas
actuales. Sin embargo, los genes que codifican las cadenas A y B de la insulina se sintetizaron ya en
1978.
El procedimiento utilizado fue sintetizar trinucleótidos que representaban todos los codones
posibles y luego unirlos en el orden dictado por las secuencias de aminoácidos de las cadenas A y B.
Los genes artificiales no tendrían necesariamente las mismas secuencias de nucleótidos que los
segmentos de genes reales que codifican las cadenas A y B, pero aun así especificarían los
polipéptidos correctos. Se construyeron dos plásmidos recombinantes, uno con el gen artificial de la
cadena A y otro con el gen de la cadena B.
En cada caso, el gen artificial se ligó a un marco de lectura lacZ' presente en un vector de tipo
pBR322 (Figura 14.2a). Por lo tanto, los genes de la insulina estaban bajo el control del fuerte promotor
lac (pág. 231) y se expresaban como proteínas de fusión, que constan de los primeros aminoácidos
de la b-galactosidasa seguidos de los polipéptidos A o B (Figura 14.2b). Cada gen se diseñó de modo
que sus segmentos de b-galactosidasa e insulina estuvieran separados por un residuo de metionina,
de modo que los polipéptidos de insulina pudieran separarse de los segmentos de b-galactosidasa
mediante tratamiento con bromuro de cianógeno (pág. 233). A continuación, las cadenas A y B
purificadas se unieron entre sí mediante la formación de enlaces disulfuro en el tubo de ensayo.

El paso final, que implica la formación de enlaces disulfuro, es en realidad bastante ineficaz. Una
mejora posterior fue sintetizar no los genes A y B individuales, sino todo el marco de lectura de la
proinsulina, especificando cadena B-cadena C-cadena A (ver Figura 14.1).
Aunque esta es una propuesta más desalentadora en términos de síntesis de ADN, la prohormona
tiene la gran ventaja de plegarse espontáneamente en la estructura correcta de enlaces disulfuro. El
segmento de la cadena C puede entonces escindirse con relativa facilidad mediante escisión proteolítica.

14.1.2 Síntesis de hormonas de crecimiento humano en E. coli

Casi al mismo tiempo que la insulina recombinante se producía por primera vez en E. coli, otros
investigadores estaban trabajando en proyectos similares con las hormonas de crecimiento humano
somato estatina y somatotropina. Estas dos proteínas actúan en conjunto para controlar los procesos
de crecimiento en el cuerpo humano, y su mal funcionamiento conduce a trastornos dolorosos e
incapacitantes como la acromegalia (crecimiento óseo descontrolado) y el enanismo.
La somatostatina fue la primera proteína humana que se sintetizó en E. coli. Al ser una proteína
muy corta, de sólo 14 aminoácidos de longitud, era ideal para la síntesis artificial de genes. La
estrategia utilizada fue la misma que la descrita para la insulina recombinante, que implicaba la
inserción del gen artificial en un vector lacZ' (Figura 14.3), la síntesis de una proteína de fusión y la
escisión con bromuro de cianógeno.
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248 248 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 14.2 La (a) Los genes artificiales

lacZ'
síntesis de insulina recombinante a partir de
promotor de laca Un gen gen B
genes de cadena A y B artificiales.

Vector portador del gen Vector portador del gen

A artificial B artificial

(b) Síntesis de la proteína insulina

E. coli transformada
sintetiza proteínas
de fusión A y B

A B

segmento de ÿ-
galactosidasa Una cadena cadena B

de de

bromuro de
cianógeno
Proteínas de fusión
escindidas

Purificar cadenas A y B, unir por

puentes disulfuro

Insulina

Figura 14.3 lacZ'

promotor de laca Gen
Producción de somatostatina recombinante.
artificial de la somatostatina

Transformar E. coli
segmento de ÿ-
galactosidasa

Proteína de fusión
de
somatostatina

bromuro de
cianógeno

somatostatina
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Capítulo 14 Clonación de genes y análisis de ADN en medicina 249

(a) Preparación del fragmento de ADNc de somatotropina Figura 14.4

0 24 191 Producción de somatotropina recombinante.
Codones
Bandera III

Restringir con HaeIII

0 24 24 191

Retener

Desechar

(b) Expresión
0 24 191

Líder sintético ADNc

Insertar en un
vector de expresión

promotor de laca

Transformar E. coli

La somatotropina
se sintetiza

La somatotropina presentó un problema más difícil. Esta proteína tiene una longitud de 191
aminoácidos, equivalente a casi 600 pb, una perspectiva imposible para las capacidades de
síntesis de ADN de finales de la década de 1970. De hecho, se utilizó una combinación de
síntesis de genes artificiales y clonación de ADN complementario (ADNc) para obtener una cepa
de E. coli productora de somatotropina. El ARN mensajero se obtuvo de la hipófisis, la glándula
que produce somatotropina en el cuerpo humano, y se preparó una biblioteca de ADNc. El cDNA
de somatotropina contenía un solo sitio para la endonucleasa de restricción HaeIII, que por lo
tanto corta el cDNA en dos segmentos (Figura 14.4a). El segmento más largo, que consta de los
codones 24 a 191, se retuvo para su uso en la construcción del plásmido recombinante. El
segmento más pequeño fue reemplazado por una molécula de ADN artificial que reprodujo el
comienzo del gen de la somatotropina y proporcionó las señales correctas para la traducción en
E. coli (Figura 14.4b). A continuación, el gen modificado se ligó en un vector de expresión que
llevaba el promotor lac .

14.1.3 Factor VIII recombinante

Aunque se han obtenido varios compuestos farmacéuticos importantes a partir de genes
clonados en E. coli, los problemas generales asociados con el uso de bacterias para sintetizar
proteínas extrañas (pág. 234) han llevado en muchos casos a que estos organismos sean
reemplazados por eucariotas. Un ejemplo de un fármaco recombinante producido en células
eucariotas es el factor VIII humano, una proteína que juega un papel central en la coagulación
de la sangre. La forma más común de hemofilia en humanos resulta de la incapacidad para sintetizar el factor VIII,
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250 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

(a) El gen del factor VIII

exones intrones

20 KB

(b) Procesamiento postraduccional del factor VIII

ABC
Producto de traducción primario
(2351 aminoácidos)

Eventos de
procesamiento

A
C Proteína madura del factor VIII

Figura 14.5 El
gen del factor VIII y su producto de traducción.

lo que lleva a una ruptura en la ruta de coagulación de la sangre y los síntomas bien conocidos
asociados con la enfermedad.
Hasta hace poco, la única forma de tratar la hemofilia era mediante la inyección de proteína de
factor VIII purificada, obtenida de sangre humana proporcionada por donantes. La purificación del
factor VIII es un procedimiento complejo y el tratamiento es costoso. Más críticamente, la purificación
está plagada de dificultades, en particular en la eliminación de partículas de virus que pueden estar
presentes en la sangre. La hepatitis y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) pueden
transmitirse y se han transmitido a los hemofílicos a través de inyecciones de factor VIII. El factor
VIII recombinante, libre de problemas de contaminación, sería un logro significativo para la biotecnología.
El gen del factor VIII es muy grande, de más de 186 kb de longitud, y se divide en 26 exones y
25 intrones (Figura 14.5a). El ARNm codifica un polipéptido grande (2351 aminoácidos), que se
somete a una serie compleja de eventos de procesamiento postraduccional, lo que finalmente da
como resultado una proteína dimérica que consta de una subunidad grande, derivada de la región
aguas arriba del polipéptido inicial, y una pequeña subunidad del segmento aguas abajo (Figura
14.5b). Las dos subunidades contienen un total de 17 enlaces disulfuro y varios sitios glicosilados.
Como podría anticiparse para una proteína tan grande y compleja, no ha sido posible sintetizar una
versión activa en E. coli.
Por lo tanto, los intentos iniciales para obtener el factor VIII recombinante involucraron células
de mamífero. En los primeros experimentos que se llevaron a cabo, todo el ADNc se clonó en
células de hámster, pero los rendimientos de proteína fueron decepcionantemente bajos. Esto
probablemente se debió a que los eventos postraduccionales, aunque se llevaron a cabo
correctamente en células de hámster, no convirtieron todo el producto inicial en una forma activa, lo
que limitó el rendimiento general. Como alternativa, se usaron dos fragmentos separados del ADNc,
un fragmento que codifica el polipéptido de la subunidad grande y el segundo la subunidad pequeña.
Cada fragmento de ADNc se ligó en un vector de expresión, aguas abajo del promotor Ag (un
híbrido entre las secuencias de b-actina de pollo y b-globina de conejo) y aguas arriba de una señal
de poliadenilación del virus SV40 (Figura 14.6). El plásmido se introdujo en una línea celular de
hámster y se obtuvo la proteína recombinante. Los rendimientos fueron más de diez veces mayores
que los de las células que contenían el ADNc completo, y la proteína del factor VIII resultante no se
distinguía de la forma nativa en términos de función.
Pharming (pág. 241) también se ha utilizado para la producción de factor VIII recombinante. El
ADNc humano completo se ha unido al promotor de la proteína ácida del suero.
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Capítulo 14 Clonación de genes y análisis de ADN en medicina 251

ADNc del factor VIII

promotor agrícola Secuencia de poliadenilación

SV40

Figura 14.6 Las

señales de expresión utilizadas en la producción de factor VIII recombinante. El promotor es un híbrido artificial de las
secuencias de ÿ-actina de pollo y ÿ-globina de conejo, y la señal de poliadenilación (necesaria para el procesamiento correcto
del ARNm antes de la traducción a proteína) se obtiene del virus SV40.

Tabla 14.1
Algunas de las proteínas humanas que se han sintetizado a partir de genes clonados en bacterias y/o células eucariotas o mediante pharming.

PROTEÍNA UTILIZADO EN EL TRATAMIENTO DE

u1-antitripsina Enfisema

Desoxirribonucleasa Fibrosis quística

Factor de crecimiento epidérmico Úlceras

eritropoyetina Anemia

Factor VIII Hemofilia

Factor IX enfermedad de navidad

factor de crecimiento de fibroblastos Úlceras

Hormona estimuladora folicular Tratamiento de infertilidad

Factor estimulante de colonias de granulocitos Cánceres

Insulina Diabetes

factor de crecimiento similar a la insulina 1 Trastornos del crecimiento

interferón-u Leucemia y otros cánceres

interferón-v Cánceres, SIDA

interferón-x Cánceres, artritis reumatoide

interleucinas Cánceres, trastornos inmunológicos

Proteína surfactante pulmonar Dificultad respiratoria

relajante Se utiliza para ayudar en el parto.

Albúmina de suero Utilizado como un suplemento de plasma

somatostatina Trastornos del crecimiento

somatotrofina Trastornos del crecimiento

Superóxido dismutasa Daño de los radicales libres en los trasplantes de riñón

Activador tisular del plasminógeno Infarto de miocardio

Factor de necrosis tumoral Cánceres

gen del cerdo, que conduce a la síntesis del factor VIII humano en el tejido mamario del cerdo y
la posterior secreción de la proteína en la leche. El factor VIII producido de esta manera parece
ser exactamente el mismo que la proteína nativa y es totalmente funcional en los ensayos de
coagulación sanguínea.

14.1.4 Síntesis de otras proteínas humanas recombinantes

La lista de proteínas humanas sintetizadas por tecnología recombinante continúa creciendo (Tabla
14.1). Además de las proteínas utilizadas para tratar trastornos mediante el reemplazo o la
complementación de las versiones disfuncionales, la lista incluye varios factores de crecimiento
(p. ej., interferones e interleucinas) con usos potenciales en la terapia del cáncer. Estas proteínas
se sintetizan en cantidades muy limitadas en el cuerpo, por lo que la tecnología recombinante es
el único medio viable para obtenerlas en las cantidades necesarias para fines clínicos. Otras
proteínas, como la albúmina sérica, se obtienen más fácilmente, pero se necesitan en cantidades
tan grandes que la producción en microorganismos sigue siendo una opción más atractiva.
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252 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 14.7 El
Proteínas aisladas
principio detrás del uso de una preparación de
de la cubierta del virus
proteínas de cubierta de virus aisladas como vacuna.

Inyectar en el torrente
sanguíneo

Anticuerpos específicos de la
proteína de la cubierta

Infección posterior por un

virus completo

Los anticuerpos pueden

unirse al virus

completo.

14.1.5 Vacunas recombinantes

La categoría final de proteína recombinante es ligeramente diferente de los ejemplos dados en la Tabla 14.1.
Una vacuna es una preparación antigénica que, tras su inyección en el torrente sanguíneo, estimula el sistema
inmunitario para que sintetice anticuerpos que protegen al organismo frente a infecciones. El material antigénico
presente en una vacuna normalmente es una forma inactivada del agente infeccioso. Por ejemplo, las vacunas
antivirales a menudo consisten en partículas de virus que han sido atenuadas por calentamiento o un tratamiento
similar. En el pasado, dos problemas han dificultado la preparación de vacunas virales atenuadas:

l El proceso de inactivación debe ser 100% eficiente, ya que la presencia en una vacuna de una sola
partícula de virus vivo podría resultar en infección. Este ha sido un problema con las vacunas para la
fiebre aftosa del ganado.

l Las grandes cantidades de partículas de virus que se necesitan para la producción de vacunas
generalmente se obtienen de cultivos de tejidos. Desafortunadamente, algunos virus, en particular el
virus de la hepatitis B, no crecen en cultivos de tejidos.

Producción de vacunas como proteínas recombinantes

El uso de la clonación de genes en este campo se centra en el descubrimiento de que a veces se sintetizan
anticuerpos específicos de virus en respuesta no sólo a la partícula vírica completa, sino también a componentes
aislados del virus. Esto es particularmente cierto en el caso de las preparaciones purificadas de las proteínas
presentes en la cubierta del virus (Figura 14.7). Si los genes que codifican las proteínas antigénicas de un virus
particular pudieran identificarse e insertarse en un vector de expresión, los métodos descritos anteriormente
para la síntesis de proteínas animales podrían emplearse en la producción de proteínas recombinantes que
podrían usarse como vacunas.
Estas vacunas tendrían la ventaja de que estarían libres de partículas virales intactas y podrían obtenerse en
grandes cantidades.
El mayor éxito con este enfoque ha sido con el virus de la hepatitis B. La hepatitis B es endémica en muchas
partes tropicales del mundo y provoca enfermedad hepática y posiblemente, después de una infección crónica,
cáncer de hígado. Una persona que se recupera de la hepatitis B es inmune a futuras infecciones porque su
sangre contiene anticuerpos contra la hepatitis B.
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Capítulo 14 Clonación de genes y análisis de ADN en medicina 253

antígeno de superficie (HBsAg), que es una de las proteínas de la cubierta del virus. Esta proteína se ha sintetizado
tanto en Saccharomyces cerevisiae, utilizando un vector basado en el plásmido 2 fm (pág. 105), como en células
de ovario de hámster chino (CHO). En ambos casos, la proteína se obtuvo en cantidades razonablemente altas y,
cuando se inyectó en animales de prueba, proporcionó protección contra la hepatitis B.

La clave del éxito del HbsAg recombinante como vacuna la proporciona una característica inusual del proceso
de infección natural del virus. El torrente sanguíneo de las personas infectadas no solo contiene partículas intactas
del virus de la hepatitis B, que tienen un diámetro de 42 nm, sino también esferas más pequeñas de 22 nm
compuestas completamente de moléculas de proteína HBsAg. El ensamblaje de estas esferas de 22 nm ocurre
durante la síntesis de HbsAg tanto en células de levadura como de hámster y es casi seguro que estas esferas, en
lugar de moléculas individuales de HbsAg, son el componente eficaz de la vacuna recombinante. Por lo tanto, la
vacuna recombinante imita parte del proceso de infección natural y estimula la producción de anticuerpos, pero
como las esferas no son virus viables, la vacuna por sí misma no causa la enfermedad. Tanto las vacunas de
levadura como las de células de hámster han sido aprobadas para su uso en humanos, y la Organización Mundial
de la Salud está promoviendo su uso en los programas nacionales de vacunación.

Vacunas recombinantes en plantas transgénicas El

advenimiento del pharming (pág. 241) ha llevado a la posibilidad de utilizar plantas transgénicas como huéspedes
para la síntesis de vacunas recombinantes. La facilidad con la que se pueden cultivar y cosechar plantas significa
que esta tecnología podría ser aplicable en partes del mundo en desarrollo donde los enfoques más costosos para
la producción de proteínas recombinantes podrían ser difíciles de sostener. Si la vacuna recombinante es efectiva
después de la administración oral, entonces la inmunidad podría adquirirse simplemente comiendo parte o la
totalidad de la planta transgénica. Sería difícil imaginar un medio más simple y económico de llevar a cabo un
programa de vacunación masiva.

La viabilidad de este enfoque se ha demostrado mediante ensayos con vacunas como HbsAg y las proteínas de
la cubierta del virus del sarampión y el virus respiratorio sincitial. En cada caso, la inmunidad se confirió alimentando
la planta transgénica a animales de prueba. También se están haciendo intentos para diseñar plantas que expresen
una variedad de vacunas, de modo que la inmunidad contra una variedad de enfermedades pueda adquirirse de
una sola fuente. El principal problema al que se enfrentan actualmente las empresas que desarrollan esta tecnología
es que la cantidad de proteína recombinante sintetizada por la planta suele ser insuficiente para estimular una
inmunidad completa frente a la enfermedad diana. Para que sea completamente eficaz, el rendimiento de la vacuna
debe representar entre el 8 y el 10 % del contenido de proteínas solubles de la parte de la planta que se come, pero
en la práctica los rendimientos son mucho menores, normalmente no más del 0,5 %.

La variabilidad en los rendimientos entre diferentes plantas en un solo cultivo también es una preocupación. Se
proporciona una solución parcial colocando el gen clonado en el genoma del cloroplasto en lugar del núcleo de la
planta (pág. 119), ya que esto generalmente da como resultado rendimientos mucho más altos de proteína
recombinante. Sin embargo, las proteínas producidas en el cloroplasto no están glicosiladas y, por lo tanto, aquellas
vacunas que requieren una modificación postraduccional serán inactivas si se producen de esta manera. Estos
incluyen la mayoría de las proteínas de la cubierta viral relevantes, pero no las proteínas de la superficie bacteriana,
como la subunidad B de Vibrio cholerae , que se puede utilizar para conferir inmunidad contra enfermedades como
el cólera. Esta proteína se ha sintetizado en plantas transgénicas de tabaco, tomate y arroz y se ha demostrado que
provoca una respuesta inmunitaria contra el cólera cuando se alimenta a ratones con hojas, frutos o semillas.

Vacunas de virus vivos recombinantes

El uso del virus vaccinia vivo como vacuna contra la viruela se remonta a 1796, cuando Edward
Jenner se dio cuenta por primera vez de que este virus, inofensivo para los humanos, podría estimular la inmunidad.
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254 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

vaccinia Gen del antígeno de

Figura 14.8 La
promotor superficie principal de la hepatitis B
justificación detrás del uso potencial
de un virus vaccinia recombinante.

Genoma de
vaccinia recombinante

Inyectar partículas de vaccinia

recombinante en el torrente sanguíneo

Proteína de la
hepatitis B

virus
vaccinia

El sistema inmunitario sintetiza

anticuerpos contra vaccinia y
hepatitis B

Anti-hepatitis B

Antivacunas

contra el mucho más peligroso virus de la viruela. El término “vacuna” proviene de vaccinia; su
uso resultó en la erradicación mundial de la viruela en 1980.
Una idea más reciente es que los virus vaccinia recombinantes podrían usarse como vacunas
vivas contra otras enfermedades. Si un gen que codifica una proteína de la cubierta del virus, por
ejemplo, HBsAg, se liga al genoma de vaccinia bajo el control de un promotor de vaccinia,
entonces el gen se expresará (Figura 14.8). Después de la inyección en el torrente sanguíneo, la
replicación del virus recombinante da como resultado no solo nuevas partículas de vaccinia, sino
también cantidades significativas del principal antígeno de superficie. El resultado sería inmunidad
contra la viruela y la hepatitis B.
Esta notable técnica tiene un potencial considerable. Se han construido virus vaccinia
recombinantes que expresan varios genes extraños y se ha demostrado que confieren inmunidad
contra las enfermedades relevantes en animales de experimentación (Tabla 14.2). La posibilidad
de vacunas de amplio espectro surge por la demostración de que una sola vaccinia recombinante,
que expresa los genes de la hemaglutinina del virus de la influenza, HBsAg y glicoproteína del
virus del herpes simple, confiere inmunidad contra cada enfermedad en los monos. Los estudios
de virus vaccinia que expresan la glicoproteína de la rabia han demostrado que la eliminación del
gen vaccinia para la enzima timidina quinasa evita que el virus se replique. Esto evita la posibilidad
de que los animales tratados con la vacuna viva desarrollen cualquier forma de viruela bovina, la
enfermedad causada por la vaccinia normal. Esta vacuna de virus vivos en particular ahora se
está utilizando en el control de la rabia en Europa y América del Norte.
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Capítulo 14 Clonación de genes y análisis de ADN en medicina 255

Cuadro 14.2

Algunos de los genes extraños que se han expresado en virus vaccinia recombinantes.

GENE

Plasmodium falciparum (parásito de la malaria) antígeno de superficie

Proteínas de la cubierta del virus de la influenza

Proteína G del virus de la rabia

Antígeno de superfície para la hepatitis B

Glicoproteínas del herpes simple

Proteínas de la envoltura del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)

Proteínas de la cubierta de la somatitis vesicular

Proteínas del virus Sindbis

14.2 Identificación de genes responsables de

enfermedades humanas
Una segunda área importante de la investigación médica en la que la clonación de genes está teniendo un
impacto es la identificación y el aislamiento de los genes responsables de las enfermedades humanas. Una
enfermedad genética o hereditaria es aquella que es causada por un defecto en un gen específico (Tabla
14.3), los individuos portadores del gen defectuoso están predispuestos a desarrollar la enfermedad en
algún momento de sus vidas. Con algunas enfermedades hereditarias, como la hemofilia, el gen está
presente en el cromosoma X, por lo que todos los hombres que portan el gen expresan el estado de la
enfermedad; las hembras con un gen defectuoso y un gen correcto están sanas pero pueden transmitir la
enfermedad a su descendencia masculina. Los genes para otras enfermedades están presentes en los
autosomas y, en la mayoría de los casos, son recesivos, por lo que ambos cromosomas del par deben
tener una versión defectuosa para que ocurra la enfermedad. Algunas enfermedades, incluida la corea de
Huntington, son autosómicas dominantes, por lo que una sola copia del gen defectuoso es suficiente para
provocar el estado de la enfermedad.
Con algunas enfermedades genéticas, los síntomas se manifiestan temprano en la vida, pero con otras
la enfermedad puede no manifestarse hasta que el individuo es de mediana edad o anciano.

Tabla 14.3
Algunas de las enfermedades genéticas más comunes en el Reino Unido.

FRECUENCIA
ENFERMEDAD SÍNTOMAS (NACIMIENTOS POR AÑO)

Cáncer de mama hereditario Cáncer 1 en 300 mujeres 1 en

Fibrosis quística Enfermedad pulmonar 2000 1 en 2000 1 en

corea de Huntington neurodegeneración 3000 hombres 1 en

Distrofia muscular de Duchenne Debilidad muscular progresiva 4000 hombres 1 en

hemofilia A Desorden sanguineo 10,000 1 en 12,000 1

Anemia falciforme Desorden sanguineo en 20,000 1 en 20,000

Fenilcetonuria v- Retraso mental 1 en 25,000 hombres

Talasemia Desorden sanguineo 1 en 200,000

retinoblastoma Cáncer del ojo

Hemofilia B Desorden sanguineo

Enfermedad de Tay-Sachs Ceguera, pérdida del control motor

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256 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

La fibrosis quística es un ejemplo de la primera, y las enfermedades neurodegenerativas como el

Alzheimer y la enfermedad de Huntington son ejemplos de la segunda. Con una serie de enfermedades
que parecen tener un componente genético, los cánceres en particular, el síndrome general es complejo
y la enfermedad permanece latente hasta que se desencadena por algún estímulo metabólico o
ambiental. Si se puede diagnosticar la predisposición a estas enfermedades, el factor de riesgo se
puede reducir mediante un manejo cuidadoso del estilo de vida del paciente para minimizar las
posibilidades de que se desencadene la enfermedad.
Las enfermedades genéticas siempre han estado presentes en la población humana pero su
importancia ha aumentado en las últimas décadas. Esto se debe a que los programas de vacunación,
los antibióticos y la mejora del saneamiento han reducido la prevalencia de enfermedades infecciosas
como la viruela, la tuberculosis y el cólera, que fueron las principales causas de muerte hasta mediados
del siglo XX. El resultado es que una mayor proporción de la población ahora muere por una enfermedad
que tiene un componente genético, especialmente las enfermedades de aparición tardía que ahora son
más comunes debido al aumento de la esperanza de vida. La investigación médica ha tenido éxito en el
control de muchas enfermedades infecciosas: ¿puede tener el mismo éxito con las enfermedades genéticas?
Hay una serie de razones por las que la identificación del gen responsable de un
La enfermedad es importante:

l La identificación de genes puede proporcionar una indicación de la base bioquímica de la

enfermedad, lo que permite diseñar terapias.
l La identificación de la mutación presente en un gen defectuoso se puede utilizar para diseñar un
programa de detección para que el gen mutante se pueda identificar en personas que son
portadoras o que aún no han desarrollado la enfermedad. Los portadores pueden recibir
asesoramiento sobre las posibilidades de que sus hijos hereden la enfermedad. La identificación
temprana en individuos que aún no han desarrollado la enfermedad permite tomar las
precauciones adecuadas para reducir el riesgo de que la enfermedad se manifieste.

l La identificación del gen es un requisito previo para la terapia génica (pág. 259).

14.2.1 Cómo identificar un gen para una enfermedad genética

No existe una estrategia única para la identificación de genes que causan enfermedades, el mejor
enfoque depende de la información que se tenga sobre la enfermedad. Para comprender los principios
de este tipo de trabajo, consideraremos el escenario más común y más difícil. Esto es cuando todo lo
que se sabe sobre la enfermedad es que ciertas personas la tienen. Incluso con un punto de partida tan
poco prometedor, las técnicas de ADN pueden localizar el gen relevante.

Localización de la posición aproximada del gen en el genoma humano Si no hay

información sobre el gen deseado, ¿cómo se puede localizar en el genoma humano? La respuesta es
utilizar la genética básica para determinar la posición aproximada del gen en el mapa genético humano.
El mapeo genético generalmente se lleva a cabo mediante un análisis de ligamiento, en el que el
patrón de herencia del gen objetivo se compara con los patrones de herencia de los loci genéticos cuyas
posiciones en el mapa ya se conocen. Si dos loci se heredan juntos, deben estar muy cerca en el mismo
cromosoma. Si no están muy juntos, los eventos de recombinación y la segregación aleatoria de los
cromosomas durante la meiosis darán como resultado que los loci muestren diferentes patrones de
herencia (Figura 14.9). La demostración de la vinculación con uno o más loci genéticos mapeados es,
por lo tanto, la clave para comprender la posición cromosómica de un gen no mapeado.
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Capítulo 14 Clonación de genes y análisis de ADN en medicina 257

(a) Los genes están vinculados Figura 14.9 Patrones

A de herencia para genes vinculados y no

B abdominales

vinculados. Se muestran tres familias, los

círculos representan a las mujeres y los cuadrados
a los hombres. (a) Dos genes estrechamente
relacionados casi siempre se heredan juntos. (b) Dos
A A genes en diferentes cromosomas muestran
abdominales B B abdominales

segregación aleatoria. (c) Dos genes que están muy

separados en un solo cromosoma a menudo se heredan
juntos, pero la recombinación puede desvincularlos.
(b) Los genes están en diferentes (c) Los genes están en el mismo
cromosomas cromosomas, pero muy separados

A a A a
B b B b

A a A a A a A a
b b b B B b cama y desayuno

*
Producto de
recombinación

Con humanos no es posible llevar a cabo programas de mejoramiento dirigidos dirigidos a

determinar la posición en el mapa de un gen deseado. En cambio, el mapeo de los genes de la
enfermedad debe hacer uso de los datos disponibles del análisis genealógico, en el que se examina
la herencia del gen en familias con una alta incidencia de la enfermedad que se estudia. Es importante
poder obtener muestras de ADN de al menos tres generaciones de cada familia, y cuantos más
miembros de la familia haya, mejor, pero a menos que la enfermedad sea muy poco común,
generalmente es posible encontrar pedigríes adecuados. Podría estudiarse la vinculación entre la
presencia/ausencia de la enfermedad y la herencia de otros genes, pero a medida que se analizan
las muestras de ADN, la vinculación con los marcadores de ADN suele probarse con más frecuencia (pág. 180).
Para ilustrar cómo se usa el análisis de ligamiento, veremos brevemente la forma en que se
cartografió uno de los genes que confieren susceptibilidad al cáncer de mama humano. El primer
avance en este proyecto se produjo en 1990 como resultado de los análisis de enlace del
polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) llevados a cabo por un grupo de
la Universidad de California en Berkeley. Este estudio mostró que en familias con una alta incidencia
de cáncer de mama, un número significativo de mujeres que padecían la enfermedad poseían la
misma versión de un RFLP llamado D17S74. Este RFLP se había mapeado previamente en el brazo
largo del cromosoma 17 (Figura 14.10): el gen buscado, BRCA1 , por lo tanto, también debe estar
ubicado en el brazo largo del cromosoma 17.
Este resultado de vinculación inicial fue extremadamente importante, ya que indicaba en qué
región del genoma humano se encontraba este gen de susceptibilidad al cáncer de mama, pero
estaba lejos del final de la historia. De hecho, se cree que más de 1000 genes se encuentran en este
tramo particular de 20 Mb del cromosoma 17. Por lo tanto, el siguiente objetivo era llevar a cabo más
estudios de ligamiento para tratar de identificar BRCA1 con mayor precisión. Esto se logró
examinando primero la región que contiene BRCA1 en busca de repeticiones cortas en tándem
(STR) (p. 181), que son útiles para el mapeo a escala fina porque muchas de ellas existen en tres o
más formas alélicas, en lugar de solo los dos alelos que son posible para un RFLP. Por lo tanto,
varios alelos de un STR pueden estar presentes dentro de un solo árbol genealógico, lo que permite
realizar un mapeo más detallado. El mapeo de enlaces STR redujo el tamaño de la región BRCA1
de 20 Mb a solo 600 kb (Figura 14.10). Este enfoque para localizar un gen se denomina clonación
posicional.
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258 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 14.10 Mapeo

del gen del cáncer de mama. Inicialmente, el gen se asignó a un
segmento de 20 Mb del cromosoma 17 (región resaltada en el dibujo
de la izquierda). Experimentos de mapeo adicionales redujeron esto D17S1321
a una región de 600 kb flanqueada por dos loci previamente
mapeados, D17S1321 y D17S1325 (dibujo del medio). Después de
examinar las secuencias expresadas, finalmente se identificó un
BRCA1
fuerte candidato para BRCA1 (dibujo de la derecha).

D17S74

D17S1325

cromosoma 17
(80 MB)

Identificación de candidatos para el gen de la enfermedad

Uno podría imaginar que una vez que se ha determinado la ubicación en el mapa del gen de la
enfermedad, el siguiente paso es simplemente referirse a la secuencia del genoma para identificar el gen.
Desafortunadamente aún queda mucho trabajo por hacer. El mapeo genético, incluso en su forma
más precisa, solo brinda una indicación aproximada de la ubicación de un gen. En el proyecto de
cáncer de mama, los investigadores tuvieron la suerte de poder reducir el área de búsqueda a solo
600 kb; a menudo, se deben examinar 10 Mb o más de la secuencia de ADN.
Tramos tan grandes de ADN podrían contener muchos genes: la región de cáncer de mama de 600
kb contenía más de 60 genes, cualquiera de los cuales podría haber sido BRCA1.
Se puede usar una variedad de enfoques para identificar cuál de los genes en una región mapeada
es el gen de la enfermedad:

l Los perfiles de expresión de los genes candidatos se pueden examinar mediante análisis de
hibridación o reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) (pág. 161)
de ARN de diferentes tejidos. Por ejemplo, se esperaría que BRCA1 se hibridara con ARN
preparado a partir de tejido mamario, y también con ARN de tejido ovárico, asociándose
frecuentemente el cáncer de ovario con el cáncer de mama hereditario. l El análisis de hibridación
Southern (pág. 142) se puede realizar con ADN de
diferentes especies (estos se llaman manchas de zoológico). La razón es que un gen
humano importante tendrá casi con certeza homólogos en otros mamíferos, y que este homólogo,
aunque tenga una secuencia ligeramente diferente de la versión humana, será detectable por
hibridación con una sonda adecuada.
l Las secuencias de genes podrían examinarse en individuos con y sin la enfermedad para ver si los
genes de los individuos afectados contienen mutaciones que podrían explicar por qué tienen la
enfermedad.
l Para confirmar la identidad de un gen candidato, podría ser posible preparar un ratón knockout
(pág. 214) que tenga una versión inactiva del gen de ratón equivalente. Si el ratón knockout
muestra síntomas compatibles con la enfermedad humana, es casi seguro que el gen
candidato sea el correcto.
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Capítulo 14 Clonación de genes y análisis de ADN en medicina 259

Cuando se aplicaron a la región del cáncer de mama, estos análisis dieron como resultado la identificación
de un gen de aproximadamente 100 kb, compuesto por 22 exones y que codificaba una proteína de 1863
aminoácidos, que era un fuerte candidato para BRCA1. Las transcripciones del gen fueron detectables en
tejidos de mama y ovario, y los homólogos estaban presentes en ratones, ratas, conejos, ovejas y cerdos, pero
no en pollos. Lo que es más importante, los genes de cinco familias susceptibles contenían mutaciones (como
mutaciones de cambio de marco y sin sentido) que probablemente conduzcan a una proteína que no funciona.
Aunque circunstancial, la evidencia a favor del candidato fue lo suficientemente abrumadora como para
identificar este gen como BRCA1. Investigaciones posteriores han demostrado que tanto este gen como
BRCA2, un segundo gen asociado con la susceptibilidad al cáncer de mama, están involucrados en la
regulación de la transcripción y la reparación del ADN, y que ambos actúan como genes supresores de
tumores, inhibiendo la división celular anormal.

14.3 Terapia génica

La aplicación final de la tecnología del ADN recombinante en medicina que consideraremos es la terapia
génica. Este es el nombre que se le dio originalmente a los métodos que tienen como objetivo curar una
enfermedad hereditaria proporcionando al paciente una copia correcta del gen defectuoso.
La terapia génica ahora se ha extendido para incluir intentos de curar cualquier enfermedad mediante la
introducción de un gen clonado en el paciente. Primero examinaremos las técnicas utilizadas en la terapia
génica y luego intentaremos abordar las cuestiones éticas.

14.3.1 Terapia génica para enfermedades hereditarias

Hay dos enfoques básicos para la terapia génica: la terapia de línea germinal y la terapia de células somáticas.
En la terapia de línea germinal, un óvulo fertilizado recibe una copia de la versión correcta del gen relevante y
se reimplanta en la madre. Si tiene éxito, el gen está presente y se expresa en todas las células del individuo
resultante. La terapia de línea germinal generalmente se lleva a cabo mediante microinyección de una célula
somática seguida de transferencia nuclear a un ovocito (pág. 241), y teóricamente podría usarse para tratar
cualquier enfermedad hereditaria.
La terapia con células somáticas implica la manipulación de células, que pueden extraerse del organismo,
transfectarse y luego volver a colocarse en el cuerpo, o transfectarse in situ sin retirarlas. La técnica es más
prometedora para las enfermedades hereditarias de la sangre (p. ej., hemofilia y talasemia), con genes que se
introducen en las células madre de la médula ósea, lo que da lugar a todos los tipos de células especializadas
en la sangre. La estrategia es preparar un extracto óseo que contenga varios miles de millones de células,
transfectarlas con un vector basado en retrovirus y luego volver a implantar las células. La posterior replicación
y diferenciación de transfectantes conduce a que el gen agregado esté presente en todas las células
sanguíneas maduras (Figura 14.11). La ventaja de un retrovirus es que este tipo de vector tiene una frecuencia
de transfección extremadamente alta, lo que permite que una gran proporción de las células madre en un
extracto de médula ósea reciban el nuevo gen.

La terapia con células somáticas también tiene potencial en el tratamiento de enfermedades pulmonares
como la fibrosis quística, ya que el ADN clonado en vectores de adenovirus (pág. 123) o contenido en
liposomas (pág. 85) es absorbido por las células epiteliales de los pulmones después de la introducción en las
vías respiratorias a través de un inhalador. Sin embargo, la expresión génica se produce sólo durante unas
pocas semanas y, hasta el momento, no se ha desarrollado como un medio eficaz para tratar la fibrosis quística.
En aquellas enfermedades genéticas en las que el defecto surge porque el gen mutado no codifica una
proteína funcional, todo lo que se necesita es proporcionar a la célula la versión correcta del gen: la eliminación
de los genes defectuosos es innecesaria. La situación
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260 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 14.11
Célula
La diferenciación de una célula madre transfectada conduce a
madre aislada
que el nuevo gen esté presente en todas las células sanguíneas
maduras.
Nuevo gen
Transfectar

Replantar

Diferenciación

célula T Célula B Basófilo Eosinófilo Neutrófilo Monocitos

Todas las células

maduras contienen el nuevo gen.

es menos fácil con las enfermedades genéticas dominantes (p. 255), ya que en estas es el producto
del gen defectuoso en sí mismo el responsable del estado de la enfermedad, por lo que la terapia
debe incluir no solo la adición del gen correcto sino también la eliminación del gen defectuoso.
versión. Esto requiere un sistema de administración de genes que promueva la recombinación
entre las versiones cromosómicas y transmitidas por vectores del gen, de modo que la copia
cromosómica defectuosa sea reemplazada por el gen del vector. La técnica es compleja y poco
fiable, y todavía no se han desarrollado procedimientos ampliamente aplicables.

14.3.2 Terapia génica y cáncer

Los usos clínicos de la terapia génica no se limitan al tratamiento de enfermedades hereditarias.
También ha habido intentos de utilizar la clonación de genes para interrumpir los ciclos de infección
de patógenos humanos como el virus del SIDA. Sin embargo, el área más intensa de la investigación
actual se refiere al uso potencial de la terapia génica como tratamiento para el cáncer.
La mayoría de los cánceres resultan de la activación de un oncogén que conduce a la formación
de tumores, o de la inactivación de un gen que normalmente suprime la formación de un tumor. En
ambos casos podría contemplarse una terapia génica para tratar el cáncer. La inactivación de un
gen supresor de tumores podría revertirse mediante la introducción de la versión correcta del gen
mediante uno de los métodos descritos anteriormente para la enfermedad hereditaria. Sin embargo,
la inactivación de un oncogén requeriría un enfoque más sutil, ya que el objetivo sería evitar la
expresión del oncogén, no reemplazarlo con una copia no defectuosa. Una forma posible de hacer
esto sería introducir en un tumor un gen que especifique una versión antisentido del
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Capítulo 14 Clonación de genes y análisis de ADN en medicina 261

(a) Síntesis de un ARN antisentido Figura 14.12

Gen en la orientación El ARN antisentido se puede utilizar para silenciar un
correcta
ARNm celular.

Promotor Transcripción

ARNm

Gen en la orientación
inversa

Promotor Transcripción

ARN antisentido
(complemento inverso
del ARNm)

(b) Modo de acción del ARN antisentido

ARNm

ARN antisentido

Hibridación
ARNm
ARN antisentido

Degradado por
ribonucleasas celulares

ARNm transcrito del oncogén (Figura 14.12a). Un ARN antisentido es el complemento inverso
de un ARN normal y puede impedir la síntesis de la proteína codificada por el gen contra el que
se dirige, probablemente mediante la hibridación con el ARNm que produce una molécula de
ARN de doble cadena que se degrada rápidamente por las ribonucleasas celulares (Figura
14.12b). Por lo tanto, el objetivo está inactivo.
Una alternativa sería introducir un gen que elimine selectivamente las células cancerosas o
promueva su destrucción mediante fármacos administrados de manera convencional. Esto se
llama terapia génica suicida y se considera un enfoque general efectivo para el tratamiento
del cáncer, porque no requiere una comprensión detallada de la base genética de la enfermedad
particular que se está tratando. Se conocen muchos genes que codifican proteínas tóxicas, y
también hay ejemplos de enzimas que convierten precursores no tóxicos de fármacos en
formas tóxicas. La introducción del gen de una de estas proteínas o enzimas tóxicas en un
tumor debería provocar la muerte de las células cancerosas, ya sea inmediatamente o después
de la administración del fármaco. Obviamente, es importante que el gen introducido se dirija
con precisión a las células cancerosas, para que las células sanas no mueran. Esto requiere un
sistema de administración muy preciso, como la inoculación directa en el tumor, o algún otro
medio para garantizar que el gen se exprese solo en las células cancerosas. Una posibilidad es
colocar el gen bajo el control del promotor de la telomerasa humana, que solo está activo en tejidos cancerosos.
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262 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Otro enfoque consiste en utilizar la terapia génica para mejorar la destrucción natural de las células
cancerosas por parte del sistema inmunitario del paciente, quizás con un gen que haga que las células
tumorales sinteticen antígenos fuertes que el sistema inmunitario reconozca con eficacia. Todos estos
enfoques, y muchos que no se basan en la terapia génica, se están probando actualmente en la lucha
contra el cáncer.

14.3.3 Las cuestiones éticas que plantea la terapia génica

¿Debe utilizarse la terapia génica para curar enfermedades humanas? Como con muchas preguntas éticas,
no hay una respuesta simple. Por un lado, seguramente no podría haber una objeción justificable a la
aplicación rutinaria a través de un inhalador respiratorio de versiones correctas del gen de la fibrosis
quística como medio para controlar esta enfermedad. De manera similar, si los trasplantes de médula ósea
son aceptables, entonces es difícil argumentar en contra de las terapias génicas dirigidas a la corrección
de trastornos sanguíneos a través de la transfección de células madre. Y el cáncer es una enfermedad tan
terrible que la negación de regímenes de tratamiento efectivos por motivos morales podría criticarse como inmoral.
La terapia de línea germinal es un tema más difícil. El problema es que las técnicas utilizadas para la
corrección de la línea germinal de enfermedades hereditarias son exactamente las mismas técnicas que
podrían usarse para la manipulación de la línea germinal de otras características hereditarias. De hecho,
el desarrollo de esta técnica con animales no ha sido motivado por ningún deseo de curar enfermedades
genéticas, sino que los objetivos son “mejorar” los animales de granja, por ejemplo, mediante cambios
genéticos que resulten en un menor contenido de grasa. Este tipo de manipulación, en la que la constitución
genética de un organismo se cambia de forma dirigida y hereditaria, es claramente inaceptable con los
seres humanos. En la actualidad, los problemas técnicos significan que la manipulación de la línea germinal
humana sería difícil. Antes de que se resuelvan estos problemas, debemos asegurarnos de que el deseo
de hacer el bien no suscite la posibilidad de hacer un daño tremendo.

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Brocher, B., Kieny, MP, Costy, F. et al. (1991) Erradicación a gran escala de la rabia utilizando
vacuna vacuna recombinante contra la rabia. Naturaleza, 354, 520–522.
Broder, CC y Earl, PL (1999) Virus vaccinia recombinantes: diseño, generación y
aislamiento. Biotecnología Molecular, 13, 223–245.
Goeddel, DV, Heyneker, HL, Hozumi, T et al. (1979) Expresión directa en Escherichia coli de una secuencia
de ADN que codifica la hormona del crecimiento humana. Naturaleza, 281, 544–548.
[Producción de somatotropina recombinante.]
Goeddel, DV, Kleid, DG, Bolivar, F et al. (1979) Expresión en Escherichia coli de genes sintetizados
químicamente para la insulina humana. Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados
Unidos de América, 76, 106–110.
Itakura, K., Hirose, T., Crea, R. et al. (1977) Expresión en Escherichia coli de un gen sintetizado
químicamente para la hormona somatostatina. Ciencia, 198, 1056–1063.
Kaufman, RJ, Wasley, LC y Dorner, AJ (1988) Síntesis, procesamiento y secreción del factor VIII humano
recombinante expresado en células de mamífero. Revista de Química Biológica, 263, 6352–6362.
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Capítulo 14 Clonación de genes y análisis de ADN en medicina 263

Liu, MA (1998) Desarrollos de vacunas. Medicina natural, 4, 515–519. [Describe el desarrollo de vacunas
recombinantes.]
Miki, Y., Swensen, J., Shattuck Eidens, D. et al. (1994) Un fuerte candidato para el gen de susceptibilidad al
cáncer de mama y ovario BRCA1. Ciencia, 266, 66–71.
Paleyanda, RK, Velander, WH, Lee, TK et al. (1997) Los cerdos transgénicos producen
factor VIII humano en la leche. Biotecnología de la naturaleza, 15, 971–975.
Schepelmann, S., Ogilvie, LM, Hedley, D. et al. (2007) Terapia génica suicida de xenoinjertos de carcinoma de
colon humano utilizando un adenovirus oncolítico armado que expresa carboxipeptidasa G2. Investigación
del cáncer, 67, 4949–4955. [Un ejemplo de terapia génica suicida que utiliza el promotor de la telomerasa
y una enzima que convierte un profármaco no tóxico en la forma tóxica.]

Smith, KR (2003) Terapia génica: conceptos teóricos y bioéticos. Archivos de Medicina

Investigación, 34, 247–268.
Tiwari, S., Verma, PC, Sing, PK & Tuli, R. (2009) Plantas como biorreactores para la producción
de antígenos vacunales. Avances en biotecnología, 27, 449–467.
van Deutekom, JCT & van Ommen, GJB (2003) Avances en la terapia génica de la distrofia muscular de
Duchenne. Nature Reviews Genetics, 4, 774–783. [Un ejemplo del uso de la terapia génica.]
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Capítulo 15

Clonación de genes y ADN

Análisis en Agricultura
Contenido del capítulo
CONTENIDO DEL CAPÍTULO

15.1 El enfoque de adición de genes a la ingeniería genética de plantas

15.2 Sustracción de genes 15.3 Problemas con plantas modificadas
genéticamente

La agricultura, o más específicamente el cultivo de plantas, es la biotecnología más antigua del

mundo, con una historia ininterrumpida que se remonta a por lo menos 10.000 años. A lo largo de
este período, los humanos han buscado constantemente variedades mejoradas de sus plantas de
cultivo: variedades con mejores cualidades nutricionales, mayores rendimientos o características que
ayuden al cultivo y la cosecha. Durante los primeros milenios, las mejoras en los cultivos ocurrieron
de manera esporádica, pero en los últimos siglos se han obtenido nuevas variedades mediante
programas de mejoramiento cada vez más sofisticados. Sin embargo, el programa de mejoramiento
más sofisticado aún conserva un elemento de azar, ya que depende de la combinación aleatoria de
características parentales en la descendencia híbrida que se produce. El desarrollo de una nueva
variedad de planta de cultivo, que muestre una combinación precisa de las características deseadas,
es un proceso largo y difícil.
La clonación de genes proporciona una nueva dimensión al mejoramiento de cultivos al permitir
que se realicen cambios dirigidos al genotipo de una planta, eludiendo los procesos aleatorios
inherentes al mejoramiento convencional. Se han utilizado dos estrategias generales:

l Adición de genes, en la que se utiliza la clonación para alterar las características de una planta
proporcionarle uno o más genes nuevos;
l Sustracción de genes, en la que se utilizan técnicas de ingeniería genética para inactivar
uno o más de los genes existentes de la planta.

Se están llevando a cabo una serie de proyectos en todo el mundo, muchos de ellos por parte de
empresas de biotecnología, destinados a explotar el potencial de la adición y sustracción de genes
en la mejora de cultivos. En este capítulo investigaremos una selección representativa de

264 Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010
por Blackwell Publishing.
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Capítulo 15 Clonación de genes y análisis de ADN en la agricultura 265

estos proyectos, y analice algunos de los problemas que deben resolverse si se quiere que la
ingeniería genética de plantas gane una amplia aceptación en la agricultura.

15.1 El enfoque de adición de genes a la ingeniería

genética de plantas
La adición de genes implica el uso de técnicas de clonación para introducir en una planta uno o más
genes nuevos que codifican una característica útil de la que carece la planta. Un buen ejemplo de la
técnica lo proporciona el desarrollo de plantas que resisten el ataque de insectos mediante la síntesis
de insecticidas codificados por genes clonados.

15.1.1 Plantas que elaboran sus propios insecticidas

Las plantas están sujetas a la depredación de prácticamente todos los demás tipos de organismos
(virus, bacterias, hongos y animales), pero en entornos agrícolas los mayores problemas los causan
los insectos. Para reducir las pérdidas, los cultivos se rocían regularmente con insecticidas. La
mayoría de los insecticidas convencionales (p. ej., piretroides y organofosforados) son venenos
relativamente inespecíficos que matan un amplio espectro de insectos, no solo los que comen el
cultivo. Debido a su alta toxicidad, varios de estos insecticidas también tienen efectos secundarios
potencialmente dañinos para otros miembros de la biosfera local, incluidos, en algunos casos, los
humanos. Estos problemas se ven exacerbados por la necesidad de aplicar insecticidas
convencionales a las superficies de las plantas por pulverización, lo que significa que no se puede
controlar el movimiento posterior de los productos químicos en el ecosistema. Además, los insectos
que viven dentro de la planta, o en la superficie inferior de las hojas, a veces pueden evitar por completo los efectos tóxicos.
¿Qué características tendría el insecticida ideal? Evidentemente, debe ser tóxico para los insectos
contra los que se dirige, pero si es posible esta toxicidad debe ser muy selectiva, de modo que el
insecticida sea inocuo para otros insectos y no sea venenoso para los animales y los seres humanos.
El insecticida debe ser biodegradable, de modo que cualquier residuo que quede después de la
cosecha del cultivo, o que sea arrastrado fuera del campo por el agua de lluvia, no persista lo
suficiente como para dañar el medio ambiente. Y debería ser posible aplicar el insecticida de tal
manera que todas las partes del cultivo, no solo las superficies superiores de las plantas, estén
protegidas contra el ataque de insectos.
Aún no se ha descubierto el insecticida ideal. Lo más cercano que tenemos son las c-endotoxinas
producidas por la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis.

Las 4-endotoxinas de Bacillus thuringiensis Los

insectos no sólo comen plantas: las bacterias también forman parte ocasional de su dieta. En
respuesta, varios tipos de bacterias han desarrollado mecanismos de defensa contra la depredación
de insectos, un ejemplo es B. thuringiensis que, durante la esporulación, forma cuerpos cristalinos
intracelulares que contienen una proteína insecticida llamada c-endotoxina.
La proteína activada es altamente venenosa para los insectos, unas 80.000 veces más tóxica que
los insecticidas organofosforados, y es relativamente selectiva, diferentes cepas de la bacteria
sintetizan proteínas efectivas contra las larvas de diferentes grupos de insectos (Cuadro 15.1).

La proteína c-endotoxina que se acumula en la bacteria es un precursor inactivo.

Después de la ingestión por el insecto, esta protoxina es escindida por proteasas, lo que da como
resultado versiones más cortas de la proteína que muestran la actividad tóxica, al unirse al interior de la
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266 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Tabla 15.1
La gama de insectos envenenados por los diversos tipos de endotoxinas ÿ de B. thuringiensis .

TIPO Z-ENDOTOXINA EFECTIVO CONTRA

lloro Larvas de lepidópteros (polilla y mariposa)

llorar Larvas de lepidópteros y dípteros (moscas de dos alas)
llorariii Larvas de lepidópteros

LlorarIV Larvas de dípteros

llorar gusanos nematodos

Llorar VI gusanos nematodos

gen de la endotoxina ÿ
Figura 15.1
Modo de acción de una endotoxina ÿ.

Expresión - en
la bacteria

Proteína inactiva

Digestión de proteinasa - en
el intestino del insecto

Toxina activa

Daña las células

epiteliales del intestino

intestino del insecto y dañando el epitelio superficial, de modo que el insecto no puede alimentarse y, en
consecuencia, muere de hambre (Figura 15.1). La variación en la estructura de estos sitios de unión en
diferentes grupos de insectos es probablemente la causa subyacente de las altas especificidades mostradas
por los diferentes tipos de c-endotoxina.
Las toxinas de B. thuringiensis no son descubrimientos recientes, la primera patente para su uso en la
protección de cultivos se concedió en 1904. A lo largo de los años ha habido varios intentos de comercializarlos
como insecticidas ecológicos, pero su biodegradabilidad actúa como una desventaja porque significa que
deben volver a aplicarse a intervalos regulares durante la temporada de crecimiento, aumentando los costos
del agricultor. Por lo tanto, la investigación se ha dirigido a desarrollar c-endotoxinas que no requieran una
aplicación regular. Un enfoque es a través de la ingeniería de proteínas (pág. 206), modificando la estructura
de la toxina para que sea más estable. Un segundo enfoque es diseñar el cultivo para sintetizar su propia
toxina.

Clonación de un gen de 4-endotoxinas en el

maíz El maíz es un ejemplo de una planta de cultivo que no funciona bien con los insecticidas convencionales.
Una plaga importante es el barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilialis), que penetra en la planta desde
los huevos puestos en la superficie inferior de las hojas, evadiendo así los efectos de los insecticidas
aplicados por aspersión. El primer intento de contrarrestar esta plaga mediante la ingeniería.
Machine Translated by Google
Capítulo 15 Clonación de genes y análisis de ADN en la agricultura 267

(a) Síntesis de un gen artificial de ÿ-endotoxina

1 1155

Gen de B. thuringiensis
1 gen artificial 648

Codones preferidos y
Contenido de GC para maíz

(b) Unión de un promotor y señal de poliadenilación

secuencia promotora

Secuencia de poliadenilación

(c) Análisis PCR de plantas maduras

123

1. Marcadores de tamaño de ADN

2. Resultado de PCR con ADN de

una planta transformada

3. Resultado de PCR con ADN de

una planta no transformada

Figura 15.2 Pasos

importantes en el procedimiento utilizado para obtener plantas de maíz modificadas genéticamente que expresan un gen artificial de ÿ-
endotoxina.

plantas de maíz para sintetizar c-endotoxina fue hecho por biotecnólogos de plantas en
1993, trabajando con la versión CryIA(b) de la toxina. La proteína CryIA(b) tiene una
longitud de 1155 aminoácidos y la actividad tóxica reside en el segmento de los aminoácidos 29–607.
En lugar de aislar el gen natural, se hizo una versión abreviada que contenía los primeros
648 codones mediante síntesis de genes artificiales. Esta estrategia permitió introducir
modificaciones en el gen para mejorar su expresión en plantas de maíz. Por ejemplo, los
codones que se usaron en el gen artificial eran los preferidos por el maíz, y el contenido
general de GC del gen se fijó en 65 %, en comparación con el 38 % de contenido de GC
de la versión bacteriana nativa del gen. (Figura 15.2a). El gen artificial se ligó en un vector
de casete (pág. 232) entre un promotor y una señal de poliadenilación del virus del mosaico
de la coliflor (Figura 15.2b), y se introdujo en embriones de maíz mediante bombardeo con
microproyectiles recubiertos de ADN (pág. 85). Los embriones se convirtieron en plantas
maduras y los transformantes se identificaron mediante análisis PCR de extractos de ADN,
utilizando cebadores específicos para un segmento del gen artificial (Figura 15.2c).
El siguiente paso fue utilizar una prueba inmunológica para determinar si las plantas
transformadas sintetizaban c-endotoxina. Los resultados mostraron que el gen artificial sí
estaba activo, pero que las cantidades de c-endotoxina que se producían variaban de una
planta a otra, entre 250 y 1750 ng de toxina por mg de proteína total. Estas
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268 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 15.3 A

Efectos posicionales.
Gen insertado en el punto A
– pobremente expresado
B

Gen insertado en el punto B -

altamente expresado

Cromosoma

las diferencias probablemente se debieron a efectos posicionales, el nivel de expresión de un

gen clonado en una planta (o animal) a menudo está influenciado por la ubicación exacta del gen
en los cromosomas del huésped (Figura 15.3).
¿Fueron las plantas transformadas capaces de resistir las atenciones de los barrenadores del
maíz? Esto se evaluó mediante ensayos de campo en los que plantas de maíz transformadas y
normales se infestaron artificialmente con larvas y se midieron los efectos de la depredación
durante un período de 6 semanas. Los criterios que se utilizaron fueron la cantidad de daño sufrido
por el follaje de las plantas infestadas y la longitud de los túneles producidos por las larvas
perforando las plantas. En ambos aspectos las plantas transformadas dieron mejores resultados
que las normales. En particular, la longitud promedio de los túneles de las larvas se redujo de 40,7
cm para los controles a solo 6,3 cm para las plantas modificadas. En términos reales, este es un
nivel muy significativo de resistencia.

Clonación de genes de 4-endotoxinas en

cloroplastos Una objeción que se ha planteado al uso de cultivos GM es la posibilidad de que el
gen clonado pueda escapar de la planta manipulada y establecerse en una especie de maleza.
Desde un punto de vista biológico, este es un escenario poco probable ya que el polen producido
por una planta generalmente solo puede fertilizar el ovario de una planta de la misma especie, por
lo que la transferencia de un gen de un cultivo a una maleza es muy poco probable. Sin embargo,
una forma de hacer totalmente imposible tal transferencia sería colocar el gen clonado no en el
núcleo sino en los cloroplastos de la planta. Un transgén ubicado en el genoma del cloroplasto no
puede escapar a través del polen por la sencilla razón de que el polen no contiene cloroplastos.
La síntesis de proteína c-endotoxina en cloroplastos transgénicos se ha logrado en un sistema
experimental con tabaco. Se utilizó el gen CryIIA(a2), que codifica para una proteína que tiene un
espectro de toxicidad más amplio que las toxinas CryIA, matando las larvas de moscas de dos
alas y lepidópteros (ver Tabla 15.1). En el genoma de B. thuringiensis , el gen CryIIA(a2) es el
tercer gen en un operón corto, cuyos dos primeros genes codifican proteínas que ayudan a plegar
y procesar la endotoxina c (Figura 15.4). Una ventaja de usar cloroplastos como sitios de síntesis
de proteínas recombinantes es que la maquinaria de expresión génica de los cloroplastos, al estar
relacionada con la de las bacterias (porque los cloroplastos alguna vez fueron procariotas de vida
libre), es capaz de expresar todos los genes en un operón. Por el contrario, cada gen que se
coloca en el genoma nuclear de una planta (o animal) debe clonarse individualmente, con su
propio promotor y otras señales de expresión, lo que dificulta mucho la introducción de dos o más
genes al mismo tiempo.
Se utilizó biolística (pág. 85) para introducir el operón CryIIA(a2) en células de hojas de tabaco.
La inserción en el genoma del cloroplasto se aseguró mediante la unión del ADN del cloroplasto

Figura 15.4 El Proteínas auxiliares CryIIA (a2)

operón CryIIA(a2).
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Capítulo 15 Clonación de genes y análisis de ADN en la agricultura 269

secuencias al operón (pág. 119) y seleccionando rigurosamente el marcador de resistencia a la kanamicina

colocando segmentos de hoja en agar que contiene kanamicina durante un máximo de 13 semanas.
Los brotes transgénicos que crecían fuera de los segmentos de hojas se colocaron luego en un medio que
inducía la formación de raíces y las plantas crecieron.
Las cantidades de proteína CryIIA(a2) producidas en los tejidos de estas plantas GM fueron bastante
notables, la toxina representó más del 45 % de la proteína soluble total, más de lo que se logró previamente
en cualquier experimento de clonación de plantas. Es casi seguro que este alto nivel de expresión se deba
a los efectos combinados del alto número de copias del transgén (hay muchos genomas de cloroplastos por
célula, en comparación con solo dos copias del genoma nuclear) y la presencia en los cloroplastos de las
dos proteínas auxiliares. codificado por los otros genes en el operón CryIIA(a2). Como era de esperar, las
plantas demostraron ser extremadamente tóxicas para las larvas de insectos susceptibles. Cinco días
después de ser colocadas en las plantas GM, todas las larvas del gusano cogollero del algodón y del
gusano cogollero de la remolacha estaban muertas, con daños apreciables visibles solo en las hojas de las
plantas expuestas a los gusanos cogolleros, que tienen una resistencia natural relativamente alta a las c-
endotoxinas. La presencia de grandes cantidades de toxina en los tejidos de las hojas no pareció afectar a
las plantas en sí, siendo el tabaco GM indistinguible de las plantas no GM cuando se consideraron factores
como las tasas de crecimiento, el contenido de clorofila y el nivel de fotosíntesis.

Los intentos de repetir este experimento con maíz, algodón y otros cultivos más útiles se han visto
obstaculizados por las dificultades para lograr la transformación de los cloroplastos con plantas distintas del
tabaco (ver pág. 119).

Contrarrestar la resistencia de los insectos a los cultivos de 4-

endotoxinas Durante mucho tiempo se ha reconocido que los cultivos que sintetizan c-endotoxinas pueden
volverse ineficaces después de algunas temporadas debido a la acumulación de resistencia entre las
poblaciones de insectos que se alimentan de los cultivos. Esta sería una consecuencia natural de la
exposición de estas poblaciones a grandes cantidades de toxinas y, por supuesto, podría hacer que las
plantas GM no sean mejores que las versiones no GM después de unos pocos años. Se han propuesto
varias estrategias para prevenir el desarrollo de insectos resistentes a la endotoxina c. Uno de los primeros
que se sugirió fue desarrollar cultivos que expresaran los genes CryI y CryII, con la razón de que, dado que
estas toxinas son bastante diferentes, sería difícil que una población de insectos desarrollara resistencia a
ambos tipos (Figura 15.5a). Aún no está claro si este es un argumento sólido o no. La mayoría de los
ejemplos de resistencia a la endotoxina c que se han documentado no han sido de amplio espectro: por
ejemplo, las plantas de tabaco CryIIA(a2) descritas anteriormente fueron igualmente venenosas para los
gusanos de los cogollos de algodón que eran o no resistentes a CryIA(b). Sin embargo, algunas cepas de
larvas de polilla de la harina expuestas a plantas que contienen la toxina CryIA(c) han adquirido una
resistencia que también brinda protección contra las toxinas CryII. En cualquier caso, sería arriesgado basar
una estrategia de contrarresistencia en supuestas limitaciones del potencial genético de las plagas de
insectos.
Una alternativa podría ser diseñar la producción de toxinas de tal manera que la síntesis ocurra solo en
aquellas partes de la planta que necesitan protección. Por ejemplo, en un cultivo como el maíz, se podría
tolerar algún daño en las partes de la planta que no producen frutos si esto no afectara la producción de
mazorcas (Figura 15.5b). Si la expresión de la toxina solo ocurriera al final del ciclo de vida de la planta,
cuando las mazorcas se están desarrollando, entonces la exposición general de los insectos a la toxina
podría reducirse sin que disminuya el valor de la cosecha. Sin embargo, esta estrategia podría retrasar la
aparición de la resistencia, pero es poco probable que la evite por completo.

Una tercera estrategia es mezclar plantas transgénicas con no transgénicas, de modo que cada campo
contenga plantas de las que los insectos puedan alimentarse sin estar expuestos a la toxina producida por el
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270 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

(a) Producción de dos toxinas (b) Control temporal sobre la

síntesis de toxinas

lloro

Sin síntesis
de toxinas Síntesis de toxinas
llorar

c) Plantación mixta

Figura 15.5 Tres

Protegido
estrategias para contrarrestar el desarrollo de resistencia
Refugio de
insectos de los insectos a los cultivos de ÿ-endotoxina.

versiones diseñadas (Figura 15.5c). Estas plantas no transgénicas actuarían como refugio para los
insectos, asegurando que la población de insectos incluya continuamente una alta proporción de
individuos no resistentes. Como todos los fenotipos de resistencia a la endotoxina c encontrados
hasta ahora son recesivos, los heterocigotos que surgen de un apareamiento entre un insecto
susceptible y una pareja resistente serían ellos mismos susceptibles, diluyendo continuamente la
proporción de insectos resistentes en la población. Se han llevado a cabo ensayos y se han
examinado modelos teóricos para identificar las estrategias de plantación mixta más eficaces. En la
práctica, el éxito o el fracaso dependería en gran medida de los agricultores que cultivan los cultivos,
debiendo estos agricultores adherirse a la estrategia de plantación precisa dictada por los científicos,
a pesar de la consiguiente pérdida de productividad debido al daño sufrido por los no -Plantas
modificadas genéticamente. Una vez más, esto introduce un elemento de riesgo. El éxito de los
proyectos GM con plantas depende claramente de mucho más que la inteligencia de los ingenieros
genéticos.

15.1.2 Cultivos resistentes a herbicidas

Aunque la producción de c-endotoxina ha sido manipulada en cultivos tan diversos como el maíz, el
algodón, el arroz, la patata y el tomate, estas plantas no son los cultivos transgénicos más difundidos
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Capítulo 15 Clonación de genes y análisis de ADN en la agricultura 271

Figura 15.6 El piruvato de Mírate

fosfenol
glifosato compite con el piruvato de
Competir
fosfoenol en la síntesis catalizada por EPSPS
EPSPS de enolpiruvilshikimato-3-fosfato y,
por lo tanto, inhibe la síntesis de triptófano, glifosato
tirosina y fenilalanina. Enolpiruvilshikimato
3-fosfato

triptófano tirosina Fenilalanina

crecido hoy. En términos comerciales, las plantas transgénicas más importantes son aquellas
que han sido manipuladas para resistir el herbicida glifosato. Este herbicida, muy utilizado por
agricultores y horticultores, es respetuoso con el medio ambiente, ya que no es tóxico para los
insectos ni para los animales y tiene un tiempo de residencia corto en los suelos,
descomponiéndose en unos pocos días en productos inocuos. Sin embargo, el glifosato mata
todas las plantas, tanto las malas hierbas como las especies de cultivos, por lo que debe
aplicarse a los campos con mucho cuidado para evitar el crecimiento de malas hierbas sin dañar
el propio cultivo. Los cultivos transgénicos que son capaces de resistir los efectos del glifosato
son, por lo tanto, deseables, ya que permitirían seguir un régimen de aplicación de herbicidas
menos riguroso y, por lo tanto, menos costoso.

Cultivos “Roundup Ready”

Los primeros cultivos diseñados para resistir al glifosato fueron producidos por Monsanto Co. y
se denominaron “Roundup Ready”, lo que refleja el nombre comercial del herbicida. Estas
plantas contienen genes modificados para la enzima enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa
(EPSPS), que convierte el shikimato y el fosfoenolpiruvato (PEP) en enolpiruvilshikimato-3-
fosfato, un precursor esencial para la síntesis de los aminoácidos aromáticos triptófano, tirosina
y fenilalanina. (Figura 15.6). El glifosato compite con la PEP por unirse a la superficie de la
enzima, lo que inhibe la síntesis de enolpiruvilshikimato-3-fosfato y evita que la planta produzca
los tres aminoácidos. Sin estos aminoácidos, la planta muere rápidamente.

Inicialmente, la ingeniería genética se utilizó para generar plantas que producían cantidades
superiores a las normales de EPSPS, con la expectativa de que pudieran soportar dosis más
altas de glifosato que las plantas no modificadas. Sin embargo, este enfoque no tuvo éxito
porque, aunque se obtuvieron plantas modificadas genéticamente que producían hasta 80 veces
la cantidad normal de EPSPS, el aumento resultante en la tolerancia al glifosato no fue suficiente
para proteger a estas plantas de la aplicación de herbicidas en el campo.
Por lo tanto, se llevó a cabo una búsqueda de un organismo cuya enzima EPSPS sea
resistente a la inhibición del glifosato y cuyo gen EPSPS, por lo tanto, podría usarse para conferir
resistencia a una planta de cultivo. Después de probar los genes de varias bacterias, así como
formas mutantes de Petunia que mostraban resistencia al glifosato, se eligió el gen EPSPS de la
cepa CP4 de Agrobacterium , debido a su combinación de alta actividad catalítica y alta
resistencia al herbicida. EPSPS se encuentra en los cloroplastos de la planta, por lo que el gen
Agrobacterium EPSPS se clonó en un vector Ti como una proteína de fusión con una secuencia
líder que dirigiría la enzima a través de la membrana del cloroplasto hacia el orgánulo. Se utilizó
biolística para introducir el vector recombinante en cultivo de callo de soja. Después de la
regeneración, se descubrió que las plantas modificadas genéticamente tenían una resistencia a
los herbicidas tres veces mayor.
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272 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

(a) Desintoxicación de glifosato por GAT (b) Evolución dirigida para producir una enzima GAT altamente activa

LA LA
H
3 nativo
C n+ PAG

genes GAT
– El C C LA-
LA- 11 rondas de
H
barajado multigénico

AGUJERO

Nuevo gen GAT

LA
CH3
LA C La enzima es 10 000
veces más activa
C n+ PAG

– El C C LA-
LA-
H

Figura 15.7 Uso de

glifosato N-acetiltransferasa para generar plantas que desintoxican el glifosato. (a) GAT desintoxica el glifosato agregando un
grupo acetilo (mostrado en azul). (b) Creación de una enzima GAT altamente activa mediante barajado multigénico.

Una nueva generación de cultivos resistentes al

glifosato Se han producido versiones Roundup Ready de una variedad de cultivos en los últimos
años, y varios de estos, en particular la soja y el maíz, se cultivan de manera rutinaria en los EE. UU.
y otras partes del mundo. Sin embargo, estas plantas en realidad no destruyen el glifosato, lo que
significa que el herbicida puede acumularse en los tejidos de la planta. El glifosato no es venenoso
para los humanos ni para otros animales, por lo que el uso de tales plantas como alimento o forraje
no debe ser una preocupación, pero la acumulación del herbicida puede interferir con la reproducción
de la planta. También se ha descubierto que el grado de resistencia que muestran los cultivos
Roundup Ready es demasiado bajo para proporcionar un beneficio económico importante con algunos
cultivos, especialmente el trigo.
Hasta hace poco, había solo unos pocos informes dispersos de organismos capaces de degradar
activamente el glifosato. Sin embargo, las búsquedas en colecciones microbianas han revelado que
esta propiedad es relativamente común entre las bacterias del género Bacillus, que poseen una
enzima, ahora llamada glifosato N-acetiltransferasa (GAT), que desintoxica el glifosato al unir un
grupo acetilo a la molécula del herbicida (Figura 15.7a). El desintoxicante más activo que se conoce
es una cepa de B. licheniformis, pero incluso esta bacteria desintoxica el glifosato a tasas que son
demasiado bajas para ser de valor si se transfiere a un cultivo transgénico.
¿Es posible aumentar la actividad del GAT sintetizado por B. licheniformis? El descubrimiento de
que la bacteria posee tres genes relacionados para esta enzima señaló un camino a seguir. Se utilizó
un tipo de evolución dirigida llamada barajado multigénico .
La mezcla multigénica implica tomar partes de cada miembro de una familia multigénica y volver a
ensamblar estas partes para crear nuevas variantes genéticas. En cada etapa del proceso, los genes
más activos se identifican clonando todas las variantes en E. coli y analizando las colonias
recombinantes para detectar actividad GAT. Los genes más activos se utilizan luego como sustratos
para la siguiente ronda de barajado. Después de 11 rondas, se obtuvo un gen que especificaba un
GAT con 10 000 veces la actividad de las enzimas presentes en la cepa original de B. licheniformis
(Figura 15.7b). Este gen se introdujo en el maíz y se descubrió que las plantas GM resultantes
toleraban niveles de glifosato seis veces más altos que la cantidad que normalmente usan los
agricultores para controlar las malezas, sin ninguna reducción en la productividad de la planta. Esta
nueva forma de diseñar la resistencia al glifosato se está examinando actualmente con mayor detalle
para determinar si presenta una alternativa real a los cultivos Roundup Ready.
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Capítulo 15 Clonación de genes y análisis de ADN en la agricultura 273

Tabla 15.2
Ejemplos de proyectos de adición de genes con plantas.

CARACTERÍSTICA
CONFERIDO A
GEN PARA ORGANISMO FUENTE PLANTAS MODIFICADAS

w-endotoxina B. thuringiensis Resistencia a los insectos

Inhibidores de proteinasa Varias leguminosas Resistencia a los insectos

quitinasa Arroz Alfalfa Cebada Resistencia fúngica

Glucanasa Pseudomonas Resistencia fúngica
Proteína inactivadora de ribosomas syringae Patata Resistencia fúngica
ornitina carbamiltransferasa enrollada luteovirus Varios virus Resistencia bacteriana

ARN polimerasa, helicasa Varios virus Rata Nicotiana Resistencia a virus

ARN satélite tabacum Agrobacterium spp. Resistencia a virus

Proteínas de la cubierta del virus Resistencia a virus

2ÿ–5ÿ-Oligoadenilato sintetasa Resistencia a virus

Acetolactato sintasa Resistencia a herbicidas

Enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa Resistencia a herbicidas

Glifosato oxidorreductasa Ochrobactrum anthropi B. Resistencia a herbicidas

Glifosato N-acetiltransferasa licheniformis Klebsiella ozaenae Resistencia a herbicidas

Nitrilasa Streptomyces spp. Resistencia a herbicidas

Fosfinotricina acetiltransferasa Resistencia a herbicidas

Fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol Maíz Tolerancia a la sequía

Inhibidor de la ribonucleasa barnasa Bacillus amyloliquefaciens E. coli esterilidad masculina

ADN adenina metilasa Nueces de Brasil Varios Bacteriófago esterilidad masculina

Proteína rica en metionina T3 Thaumatococcus danielli T. Contenido de azufre mejorado

Desaminasa del ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico danielli Umbellularia californica Maduración modificada de frutos

S-adenosilmetionina hidrolasa Glycine max Varias plantas con Maduración modificada de frutos
de Monelli flores Varias plantas con flores Dulzura
taumatina Dulzura

Tioesterasa de proteína portadora de acilo Contenido de grasa/aceite modificado

Delta-12 desaturasa Contenido de grasa/aceite modificado

Dihidroflavanol reductasa Color de la flor modificado

Flavonoide hidroxilasa Color de la flor modificado

15.1.3 Otros proyectos de adición de genes

Los cultivos transgénicos que sintetizan c-endotoxinas o enzimas de resistencia al glifosato no son de
ninguna manera los únicos ejemplos de plantas modificadas mediante la adición de genes. En la Tabla
15.2 se enumeran ejemplos de otros proyectos de adición de genes. Estos proyectos incluyen un medio
alternativo para conferir resistencia a los insectos, usando genes que codifican inhibidores de proteinasa,
pequeños polipéptidos que interrumpen las actividades de las enzimas en el intestino de los insectos,
previniendo o ralentizando el crecimiento. Los inhibidores de proteinasa son producidos de forma natural
por varios tipos de plantas, en particular las leguminosas como el caupí y los frijoles comunes, y sus
genes se han transferido con éxito a otros cultivos que normalmente no producen cantidades significativas
de estas proteínas. Los inhibidores son particularmente efectivos contra las larvas de escarabajos que se
alimentan de semillas y, por lo tanto, pueden ser una mejor alternativa que la c-endotoxina para plantas
cuyas semillas se almacenan durante períodos prolongados. Otros proyectos están explorando el uso de
la modificación genética para mejorar la calidad nutricional de las plantas de cultivo, por ejemplo,
aumentando el contenido de aminoácidos esenciales o cambiando la bioquímica de la planta para que
los humanos o los animales puedan utilizar una mayor cantidad de los nutrientes disponibles durante la
digestión. . Finalmente, en una esfera diferente de actividad comercial, las plantas ornamentales con colores de flores inusuales
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274 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

se producen mediante la transferencia de genes de enzimas involucradas en la producción de pigmentos

de una especie a otra.

15.2 Sustracción de genes

La segunda forma de cambiar el genotipo de una planta es por sustracción de genes. Este término es
un nombre inapropiado, ya que la modificación no implica la eliminación real de un gen, simplemente su
inactivación. Hay varias estrategias posibles para inactivar un solo gen elegido en una planta viva,
siendo la más exitosa hasta ahora en términos prácticos el uso de ARN antisentido (pág. 260).

15.2.1 ARN antisentido e ingeniería de maduración de frutos

en tomate
Para ilustrar cómo se ha utilizado el ARN antisentido en la ingeniería genética de plantas, examinaremos
cómo se han producido tomates con maduración tardía. Este es un ejemplo importante de modificación
genética de plantas, ya que resultó en uno de los primeros productos alimenticios GM en ser aprobado
para la venta al público en general.
Los tomates cultivados comercialmente y otras frutas blandas generalmente se recolectan antes de
que estén completamente maduros, para dar tiempo a que las frutas se transporten al mercado antes
de que comiencen a estropearse. Esto es esencial para que el proceso sea económicamente viable,
pero existe el problema de que la mayoría de las frutas inmaduras no desarrollan todo su sabor si se
extraen de la planta antes de que estén completamente maduras. El resultado es que los tomates
producidos en masa a menudo tienen un sabor suave, lo que los hace menos atractivos para el consumidor.
La tecnología antisentido se ha utilizado de dos maneras para modificar genéticamente las plantas de
tomate para que el proceso de maduración de la fruta sea más lento. Esto permite que el productor deje
las frutas en la planta hasta que maduren hasta la etapa en que el sabor se haya desarrollado por
completo, aún hay tiempo para transportar y comercializar la cosecha antes de que se eche a perder.

Uso de ARN antisentido para inactivar el gen de la poligalacturonasa La

escala de tiempo para el desarrollo de una fruta se mide como el número de días o semanas después
de la floración. En el tomate, este proceso toma aproximadamente ocho semanas de principio a fin, y
los cambios de color y sabor asociados con la maduración comienzan después de unas seis semanas.
En este momento se activan una serie de genes implicados en las últimas etapas de la maduración,
incluido uno que codifica la enzima poligalacturonasa (Figura 15.8). Esta enzima descompone lentamente
el componente de ácido poligalacturónico de las paredes celulares del pericarpio de la fruta, lo que da
como resultado un ablandamiento gradual. El ablandamiento hace que la fruta sea apetecible, pero si se
lleva demasiado lejos resulta en un tomate blando y estropeado, atractivo solo para estudiantes con
recursos financieros limitados.
La inactivación parcial del gen de la poligalacturonasa debería aumentar el tiempo entre el desarrollo
del sabor y el deterioro de la fruta. Para probar esta hipótesis, se obtuvo un fragmento de restricción de
730 pb de la región 5' del gen de la poligalacturonasa normal, que representa poco menos de la mitad
de la secuencia codificante (Figura 15.9). Se invirtió la orientación del fragmento, se ligó un promotor del
virus del mosaico de la coliflor al comienzo de la secuencia y se unió una señal de poliadenilación
vegetal al final. A continuación, la construcción se insertó en el vector de plásmido Ti pBIN19 (pág. 116).
Una vez dentro de la planta, la transcripción del promotor del virus del mosaico de la coliflor debe dar
como resultado la síntesis de un ARN antisentido complementario a la primera mitad del ARNm de la
poligalacturonasa.
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Capítulo 15 Clonación de genes y análisis de ADN en la agricultura 275

100 Figura 15.8 El

aumento en la expresión del gen de la poligalacturonasa observado

durante las últimas etapas de maduración del fruto del tomate.

poligalacturonasa
expresión
Cantidad
relativa
génica
de
de

50

0
6 7 8
Semanas después de la floración

Gen de la poligalacturonasa
Figura 15.9

Construcción de un “gen” de poligalacturonasa

R R antisentido. R = sitio de restricción.

Restricción, ligadura a
secuencias de control en
la orientación inversa

Señal de
Promotor poliadenilación

Gen de
poligalacturonasa
antisentido

Experimentos previos con ARN antisentido habían sugerido que esto sería suficiente para reducir o
incluso prevenir la traducción del ARNm diana.
La transformación se llevó a cabo introduciendo las moléculas recombinantes de pBIN19 en la
bacteria Agrobacterium tumefaciens y luego permitiendo que la bacteria infectara los segmentos del
tallo del tomate. Se analizó la capacidad de crecimiento de pequeñas cantidades de material de callo
recolectado de las superficies de estos segmentos en un medio de agar que contenía kanamicina
(recuerde que pBIN19 porta un gen de resistencia a la kanamicina; vea la Figura 7.14).
Se identificaron transformantes resistentes y se les permitió desarrollarse en plantas maduras.
El efecto de la síntesis de ARN antisentido sobre la cantidad de ARNm de poligalacturonasa en
las células de frutos en maduración se determinó mediante hibridación Northern con una sonda de
ADN monocatenario específica para el ARNm sentido. Estos experimentos mostraron que la fruta en
maduración de plantas transformadas contenía menos ARNm de poligalacturonasa que las frutas de
plantas normales. Las cantidades de enzima poligalacturonasa producidas en los frutos en maduración
de las plantas transformadas se estimaron luego a partir de las intensidades de las bandas relevantes
después de la separación de las proteínas de los frutos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
y midiendo directamente las actividades enzimáticas en los frutos. Los resultados mostraron que se
sintetizó menos enzima en las frutas transformadas (Figura 15.10). Lo que es más importante, las
frutas transformadas, aunque experimentan un ablandamiento gradual, pueden almacenarse durante
un período prolongado antes de comenzar a estropearse. Esto indicó que el ARN antisentido no
había inactivado completamente el gen de la poligalacturonasa, pero no obstante había producido
una reducción suficiente en la expresión génica para retrasar el proceso de maduración como se deseaba. Él
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276 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 15.10 Las 100

diferencias en la actividad de poligalacturonasa en frutos

de tomate normales y en frutos que expresan el gen de
poligalacturonasa antisentido.

poligalacturonasa
actividad
Cantidad
relativa
de
50

plantas normales
plantas transformadas

0
6 7 8

Semanas después de la floración

Los tomates transgénicos, comercializados con el nombre comercial “FlavrSavr”, fueron una de las primeras
plantas modificadas genéticamente en ser aprobadas para la venta al público, apareciendo por primera vez
en los supermercados en 1994.

Utilización de ARN antisentido para inactivar la síntesis de etileno

El principal desencadenante que activa los genes implicados en las últimas etapas de la maduración del
tomate es el etileno que, a pesar de ser un gas, actúa como hormona en muchas plantas. Por lo tanto, una
segunda forma de retrasar la maduración de la fruta sería modificar las plantas para que no sinteticen etileno.
Las frutas de estas plantas se desarrollarían normalmente durante las primeras seis semanas, pero no podrían
completar el proceso de maduración. Por lo tanto, la fruta inmadura podría transportarse al mercado sin
peligro de que la cosecha se estropee.
Antes de la venta al consumidor, o la conversión en pasta o algún otro producto, se induciría la maduración
artificial rociando los tomates con etileno.
El penúltimo paso en la vía de síntesis del etileno es la conversión de la S-adenosil metionina en ácido 1-
aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), que es el precursor inmediato del etileno. Este paso es catalizado
por una enzima llamada ACC sintasa. Al igual que con la poligalacturonasa, la inactivación de la ACC sintasa
se logró mediante la clonación en tomate de una versión truncada del gen de la ACC sintasa normal, insertado
en el vector de clonación en la orientación inversa, de modo que la construcción dirigiera la síntesis de una
versión antisentido del ARNm de la ACC sintasa. Después de la regeneración, las plantas modificadas se
cultivaron hasta la etapa de fructificación y se encontró que producían solo el 2% de la cantidad de etileno
producido por las plantas no modificadas. Esta reducción fue más que suficiente para evitar que la fruta
completara el proceso de maduración. Estos tomates se han comercializado como la variedad “Endless
Summer”.

15.2.2 Otros ejemplos del uso de ARN antisentido en

ingeniería genética vegetal
En términos generales, las aplicaciones de la sustracción de genes en la ingeniería genética de plantas son
probablemente menos amplias que las de la adición de genes. Es más fácil pensar en las características
útiles de las que carece una planta y que podrían introducirse mediante la adición de genes, que identificar
las características desventajosas que la planta ya posee y que podrían eliminarse mediante la sustracción de
genes. Sin embargo, hay un número creciente de plantas
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Capítulo 15 Clonación de genes y análisis de ADN en la agricultura 277

Tabla 15.3
Ejemplos de proyectos de sustracción de genes con plantas.

GEN OBJETIVO CARACTERÍSTICA MODIFICADA

poligalacturonasa Retraso del deterioro de la fruta en tomate

Ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico sintasa Maduración modificada de frutos en tomate

polifenol oxidasa Prevención de la decoloración en frutas y verduras.

Almidón sintasa Reducción del contenido de almidón en vegetales
Delta-12 desaturasa Alto contenido de ácido oleico en la soja
Calcona sintasa Modificación del color de la flor en diversas plantas decorativas.
1D-mio-inositol 3-fosfato sintasa Reducción del contenido de fósforo no digerible de los granos de arroz

proyectos de biotecnología basados en la sustracción de genes (Cuadro 15.3), y es probable que el

enfoque aumente en importancia a medida que se resuelvan gradualmente las incertidumbres que
rodean los principios subyacentes de la tecnología antisentido.

15.3 Problemas con las plantas genéticamente modificadas

Los tomates de maduración retardada producidos por sustracción de genes estuvieron entre los
primeros alimentos integrales genéticamente modificados que se aprobaron para su comercialización.
En parte debido a esto, la ingeniería genética de plantas ha proporcionado el campo de batalla en el que
los biotecnólogos y otras partes interesadas han luchado por los problemas éticos y de seguridad que
surgen de nuestra capacidad para alterar la composición genética de los organismos vivos. Algunas de
las preguntas más importantes no se relacionan directamente con los genes y la experiencia necesaria
para responderlas no se encontrará en este libro. Por ejemplo, no podemos discutir con autoridad el
posible impacto, bueno o no, que los cultivos transgénicos podrían tener en las prácticas agrícolas
locales en el mundo en desarrollo. Sin embargo, podemos, y debemos, mirar las cuestiones biológicas.

15.3.1 Preocupaciones de seguridad con marcadores seleccionables

Una de las principales áreas de preocupación que surgen del debate sobre los tomates modificados
genéticamente son los posibles efectos nocivos de los genes marcadores utilizados con los vectores de
clonación de plantas. La mayoría de los vectores de plantas llevan una copia de un gen de resistencia a
la kanamicina, lo que permite identificar las plantas transformadas durante el proceso de clonación. El
gen kanR , también llamado nptII, es de origen bacteriano y codifica para la enzima neomicina
fosfotransferasa II. Este gen y su enzima producto están presentes en todas las células de una planta
modificada. El temor de que la neomicina fosfotransferasa pueda ser tóxica para los humanos se ha
disipado mediante pruebas con modelos animales, pero quedan otros dos problemas de seguridad:

l ¿Podría el gen kanR contenido en un alimento modificado genéticamente transmitirse a bacterias

en el intestino humano, haciéndolas resistentes a la kanamicina y los antibióticos relacionados?

l ¿Se podría transmitir el gen kanR a otros organismos en el medio ambiente y esto causaría daño al
ecosistema?

Ninguna pregunta puede ser respondida completamente con nuestro conocimiento actual. Se puede
argumentar que los procesos digestivos destruirían todos los genes kanR en un alimento modificado
genéticamente antes de que pudieran llegar a la flora bacteriana del intestino y que, incluso si un gen evitara
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278 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 15.11 Secuencias diana para Cre

Escisión de ADN por la enzima Cre recombinasa.

molécula de adn
Recombinación
catalizada por Cre

El fragmento flanqueado por

las secuencias objetivo ahora se extirpa

destrucción, las posibilidades de que se transfiera a una bacteria serían muy pequeñas.
Sin embargo, el factor de riesgo no es cero. De manera similar, aunque los experimentos sugieren
que el crecimiento de plantas genéticamente modificadas tendría un efecto insignificante en el medio
ambiente, dado que los genes kanR ya son comunes en los ecosistemas naturales, la futura
ocurrencia de algún evento dañino e imprevisto no puede considerarse una imposibilidad absoluta.
Los temores que rodean el uso de kanR y otros genes marcadores han llevado a los biotecnólogos
a idear formas de eliminar estos genes del ADN de la planta después de que se haya verificado el
evento de transformación. Una de las estrategias utiliza una enzima del bacteriófago P1, llamada Cre,
que cataliza un evento de recombinación que escinde fragmentos de ADN flanqueados por secuencias
de reconocimiento específicas de 34 pb (Figura 15.11). Para utilizar este sistema, la planta se
transforma con dos vectores de clonación, el primero que lleva el gen que se añade a la planta junto
con su gen marcador seleccionable kanR rodeado por las secuencias diana Cre, y el segundo que
lleva el gen Cre. Después de la transformación, la expresión del gen Cre da como resultado la escisión
del gen kanR del ADN de la planta.
¿Qué pasa si el gen Cre es en sí mismo peligroso de alguna manera? Esto es irrelevante ya que
los dos vectores utilizados en la transformación probablemente integrarían sus fragmentos de ADN
en diferentes cromosomas, por lo que la segregación aleatoria durante la reproducción sexual daría
como resultado plantas de primera generación que contenían un fragmento integrado pero no el otro.
Por tanto, se puede obtener una planta que no contiene ni el gen Cre ni el marcador seleccionable
kanR , pero que contiene el gen importante que deseábamos añadir al genoma de la planta.

15.3.2 La tecnología del terminador

El sistema de recombinación Cre también es la base de uno de los aspectos más controvertidos de la
ingeniería genética de plantas, la llamada tecnología de terminación. Este es uno de los procesos
mediante los cuales las empresas que comercializan cultivos transgénicos intentan proteger su
inversión financiera asegurándose de que los agricultores deben comprar semillas nuevas cada año,
en lugar de simplemente recolectar semillas del cultivo y sembrar esta semilla de segunda generación
al año siguiente. En realidad, incluso con cultivos convencionales, se han ideado mecanismos para
garantizar que los agricultores no puedan cultivar semillas de segunda generación, pero las
controversias generales en torno a los cultivos transgénicos han puesto la tecnología Terminator en el ojo público.
La tecnología Terminator se centra en el gen de la proteína inactivadora de ribosomas (RIP). La
proteína que inactiva los ribosomas bloquea la síntesis de proteínas cortando una de las moléculas
de ARN ribosómico en dos segmentos (Figura 15.12a). Cualquier célula en la que la proteína que
inactiva los ribosomas esté activa morirá rápidamente. En las plantas GM que utilizan el sistema
terminador, el gen RIP se coloca bajo el control de un promotor que está activo solo durante el
desarrollo del embrión. Por lo tanto, las plantas crecen normalmente pero las semillas que producen
son estériles.
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Capítulo 15 Clonación de genes y análisis de ADN en la agricultura 279

(a) El gen RIP Figura 15.12 La

gen RIP tecnología terminador. (a) El gen RIP codifica

una proteína que bloquea la síntesis de proteínas.
(b) El sistema que se utiliza para permitir la
Proteína Bloquea la síntesis
producción de semillas de primera generación.
inactivadora de ribosomas de proteínas

(b) El sistema de terminación

Bloqueo de ADN
Cre Cre Gen de la recombinasa
Cre

promotor promotor de
de embriones tetraciclina
tetraciclina

Cre recombinasa

Gene funcional RIP

creado

Crecimiento
de plantas maduras

El promotor
se activa
Se sintetiza proteína
inactivadora de ribosomas

¿Cómo se obtienen las semillas de primera generación, las que se venden a los agricultores?
Para empezar, el gen RIP no es funcional porque está interrumpido por un segmento de ADN que no
es RIP (Figura 15.12b). Sin embargo, este ADN está flanqueado por secuencias de reconocimiento
de 34 pb para la recombinasa Cre. En estas plantas, el gen de la recombinasa Cre se coloca bajo el
control de un promotor que se activa mediante tetraciclina. Una vez obtenidas las semillas, el
proveedor activa la recombinasa Cre colocando las semillas en una solución de tetraciclina. Esto
elimina el ADN bloqueador del gen RIP, que se vuelve funcional pero permanece silencioso hasta
que su propio promotor se activa durante la embriogénesis.

15.3.3 La posibilidad de efectos nocivos sobre el medio ambiente

Una segunda área de preocupación con respecto a las plantas genéticamente modificadas es que
sus nuevas combinaciones de genes podrían dañar el medio ambiente de alguna manera. Estas
preocupaciones deben abordarse individualmente para cada tipo de cultivo GM, ya que diferentes
genes modificados genéticamente pueden tener diferentes impactos. Examinaremos el trabajo que
se ha llevado a cabo para evaluar si es posible que las plantas resistentes a los herbicidas, uno de
los dos ejemplos de adición de genes que estudiamos anteriormente en este capítulo, puedan tener
un efecto dañino. Como estos son los cultivos transgénicos más cultivados, han sido objeto de
algunos de los estudios ambientales más completos. En particular, en 1999, el gobierno del Reino
Unido encargó una investigación independiente sobre cómo los cultivos resistentes a los herbicidas,
cuyo crecimiento en el Reino Unido no estaba permitido en ese momento, podrían afectar la
abundancia y diversidad de la vida silvestre de las tierras agrícolas.
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280 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Después de demoras debido a que los activistas intentaron evitar que se llevara a cabo el
trabajo, el equipo de investigación del Reino Unido informó sobre sus hallazgos en 2003. El
estudio involucró 273 pruebas de campo en Inglaterra, Gales y Escocia, e incluyó remolacha
azucarera resistente al glifosato, así como maíz y colza de primavera diseñada para resistir a un
segundo herbicida, glufosinato de amonio. Los resultados, tal como se resumen en el informe
oficial (ver Burke (2003) en Lecturas adicionales), fueron los siguientes:

El equipo encontró que había diferencias en la abundancia de vida silvestre entre los campos de cultivo GM y los
campos de cultivo convencionales. El cultivo convencional de remolacha y colza era mejor para muchos grupos
de vida silvestre que el cultivo de remolacha y colza transgénica. Había más insectos, como mariposas y abejas,
dentro y alrededor de los cultivos convencionales porque había más maleza para proporcionar alimento y
cobertura. También había más semillas de malas hierbas en los cultivos convencionales de remolacha y colza
que en sus homólogos modificados genéticamente. Tales semillas son importantes en la dieta de algunos
animales, en particular de algunas aves. Por el contrario, el cultivo de maíz transgénico fue mejor para muchos
grupos de vida silvestre que el maíz convencional. Había más malas hierbas dentro y alrededor de los cultivos
transgénicos, más mariposas y abejas en ciertas épocas del año y más semillas de malas hierbas. Los
investigadores subrayan que las diferencias que encontraron no surgen solo porque los cultivos hayan sido
modificados genéticamente. Surgen porque estos cultivos transgénicos brindan a los agricultores nuevas opciones
para el control de malezas. Es decir, usan diferentes herbicidas y los aplican de manera diferente. Los resultados
de este estudio sugieren que el cultivo de tales cultivos transgénicos podría tener implicaciones para la biodiversidad
de las tierras agrícolas en general. Sin embargo, otros temas afectarán los impactos a mediano y largo plazo, como
las áreas y la distribución de la tierra involucrada, cómo se cultiva la tierra y cómo se gestionan las rotaciones de
cultivos. Esto hace que sea difícil para los investigadores predecir con certeza los efectos a mediana y gran escala
de los cultivos transgénicos. Además, otras decisiones de gestión tomadas por los agricultores que cultivan cultivos
convencionales seguirán teniendo un impacto en la vida silvestre.

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Burke, M. (2003) Cultivos transgénicos: efectos en la vida silvestre de las tierras agrícolas. Producido por el
Equipo de Investigación de Evaluaciones a Gran Escala y el Comité Directivo Científico. ISBN: 0-85521-035-4.
[Para una descripción más detallada de este trabajo, consulte Philosophical Transactions of the Royal
Society, Biological Sciences, 358, 1775–1889 (2003).]
Castle, LA, Siehl, DL & Gorton, R. (2004) Descubrimiento y evolución dirigida de un gen de tolerancia al
glifosato. Ciencia, 304, 1151–1154. [Clonación del gen GAT en maíz.]
De Cosa, B., Moar, W., Lee, SB et al. (2001) La sobreexpresión del operón Bt cry2Aa2 en los cloroplastos
conduce a la formación de cristales insecticidas. Biotecnología de la naturaleza, 19, 71–74.
Feitelson, JS, Payne, J. & Kim, L. (1992) Bacillus thuringiensis: insectos y más allá.
Biotecnología, 10, 271–275. [Detalles de las d-endotoxinas y su potencial como insecticidas convencionales
y en ingeniería genética.]
Fischhoff, DA, Bowdish, KS, Perlak, FJ et al. (1987) Plantas de tomate transgénicas tolerantes a insectos.
Biotecnología, 5, 807–813. [La primera transferencia de un gen de d-endotoxina a una planta.]
Groot, AT & Dicke, M. (2002) Plantas transgénicas resistentes a insectos en un contexto multitrófico.
Revista de plantas, 31, 387–406. [Examina el impacto de las plantas de d-endotoxina en la cadena
alimentaria ecológica.]
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Capítulo 15 Clonación de genes y análisis de ADN en la agricultura 281

Koziel, MG, Beland, GL, Bowman, C. et al. (1993) Desempeño de campo de plantas de maíz transgénicas
élite que expresan una proteína insecticida derivada de Bacillus thuringiensis.
Biotecnología, 11, 194–200. [Clonación de un gen de d-endotoxina en maíz.]
Matas, AJ, Gapper, NE, Chung, M.-Y., Giovannoni, JJ & Rose, JKC (2009) Biología e ingeniería genética de
la maduración de frutas para mejorar la calidad y la vida útil. Opinión actual en biotecnología, 20, 197–203.

Miki, B. & McHugh, S. (2003) Genes marcadores seleccionables en plantas transgénicas: aplicaciones,
alternativas y bioseguridad. Revista de Biotecnología, 107, 193–232.
Shade, RE, Schroeder, HE, Pueyo, JJ et al. (1994) Las semillas de guisantes transgénicas que expresan el
inhibidor de a-amilasa del frijol común son resistentes a los escarabajos brúquidos.
Biotecnología, 12, 793–796. [Un segundo enfoque para las plantas resistentes a los insectos.]
Shelton, AM, Zhao, JZ & Roush, RT (2002) Consecuencias económicas, ecológicas, de seguridad alimentaria
y sociales del despliegue de plantas transgénicas Bt. Revisión anual de entomología, 47, 845–881. [Varios
temas relacionados con las plantas de d-endotoxina.]
Smith, CJS, Watson, CF, Ray, J. et al. (1988) Inhibición del ARN antisentido de la expresión génica de la
poligalacturonasa en tomates transgénicos. Naturaleza, 334, 724–726.
Tabashnik, BE, Gassmann, AJ, Crowder, DW & Carriére, Y. (2008) Resistencia de insectos a cultivos Bt :
evidencia versus teoría. Biotecnología de la naturaleza, 26, 199–202. [Discute la eficacia de los refugios
para reducir la resistencia de los insectos a los cultivos de d-endotoxina.]
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capitulo 16
Clonación de genes y
Análisis de ADN en
Ciencias Forenses
y Arqueología

Contenido del capítulo

CONTENIDO DEL CAPÍTULO

16.1 Análisis de ADN en la identificación de sospechosos de delitos

16.2 Estudio del parentesco mediante perfiles de ADN 16.3
Identificación de seis mediante análisis de ADN 16.4 Arqueogenética:
uso del ADN para estudiar la prehistoria humana

La ciencia forense es el área final de la biotecnología que consideraremos. Difícilmente pasa una semana
sin que la prensa nacional informe sobre otro crimen de alto perfil que se ha resuelto gracias al análisis de
ADN. Las aplicaciones de la biología molecular en la medicina forense se centran en gran medida en la
capacidad del análisis de ADN para identificar a un individuo a partir de cabellos, manchas de sangre y
otros elementos recuperados de la escena del crimen. En los medios de comunicación populares, estas
técnicas se denominan huellas genéticas, aunque el término más preciso para los procedimientos que se
utilizan hoy en día es perfilado de ADN. Comenzamos este capítulo examinando los métodos utilizados
en la toma de huellas dactilares genéticas y el perfil de ADN, incluido su uso tanto en la identificación de
individuos como para establecer si los individuos son miembros de una sola familia. Esto nos conducirá a
una exploración de las formas en que se utilizan las técnicas genéticas en arqueología.

282 Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción. 6ª edición. Por TA Brown. Publicado en 2010
por Blackwell Publishing.
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Capítulo 16 Clonación de genes y análisis de ADN en ciencia forense y arqueología 283

16.1 Análisis de ADN en la identificación de

sospechosos de delitos
Probablemente sea imposible que una persona cometa un delito sin dejar un rastro de su ADN.
Cabellos, manchas de sangre e incluso huellas dactilares convencionales contienen rastros de ADN,
suficientes para ser estudiados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El análisis no
tiene que hacerse de inmediato, y en los últimos años se han resuelto una serie de delitos pasados,
los llamados "casos sin resolver", y el delincuente ha sido llevado ante la justicia debido a las pruebas
de ADN que se han llevado a cabo en el material archivado. . Entonces, ¿cómo funcionan estos
poderosos métodos?
La base para la toma de huellas genéticas y el perfil de ADN es que los gemelos idénticos son los
únicos individuos que tienen copias idénticas del genoma humano. Por supuesto, el genoma humano
es más o menos el mismo en todos: los mismos genes estarán en el mismo orden con los mismos
tramos de ADN intergénico entre ellos. Pero el genoma humano, así como el de otros organismos,
contiene muchos polimorfismos, posiciones en las que la secuencia de nucleótidos no es la misma
en todos los miembros de la población. Ya hemos encontrado el más importante de estos sitios
polimórficos anteriormente, porque estas secuencias variables son las mismas que se utilizan como
marcadores de ADN en el mapeo del genoma (pág. 180). Incluyen polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción (RFLP), repeticiones cortas en tándem (STR) y polimorfismos de un solo
nucleótido (SNP). Los tres pueden ocurrir dentro de los genes, así como en las regiones intergénicas,
y en total hay varios millones de estos sitios polimórficos en el genoma humano, siendo los SNP los
más comunes.

16.1.1 Huellas genéticas por sondeo de hibridación

El primer método para usar el análisis de ADN para identificar individuos fue desarrollado a mediados
de la década de 1980 por Sir Alec Jeffreys de la Universidad de Leicester. Esta técnica no se basó
en ninguno de los tipos de sitios polimórficos enumerados anteriormente, sino en un tipo diferente de
variación en el genoma humano llamado secuencia repetitiva dispersa hipervariable. Como su
nombre lo indica, esta es una secuencia repetida que ocurre en varios lugares ("dispersos") en el
genoma humano. La característica clave de estas secuencias es que sus posiciones genómicas son
variables: están ubicadas en diferentes posiciones en los genomas de diferentes personas (Figura
16.1a).
La repetición particular que se usó inicialmente en la toma de huellas genéticas contiene la
secuencia GGGCAGGANG (donde N es cualquier nucleótido). Para preparar una huella dactilar, se
digiere una muestra de ADN con una endonucleasa de restricción, los fragmentos se separan
mediante electroforesis en gel de agarosa y se prepara una transferencia Southern (pág. 142). La
hibridación con la transferencia de una sonda marcada que contiene la secuencia repetida revela una
serie de bandas, cada una de las cuales representa un fragmento de restricción que contiene la
repetición (Figura 16.1b). Debido a que los sitios de inserción de la secuencia repetida son variables,
el mismo procedimiento llevado a cabo con una muestra de ADN de una segunda persona dará un
patrón diferente de bandas. Estas son las huellas genéticas de esos individuos.

16.1.2 Perfil de ADN por PCR de repeticiones cortas en tándem Estrictamente

hablando, la huella genética se refiere únicamente al análisis de hibridación de secuencias repetidas

dispersas. Esta técnica ha sido valiosa en el trabajo forense, pero adolece de tres limitaciones:
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284 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 16.1 Huella (a) Secuencias repetidas polimórficas en el genoma humano

genética. (a) Las posiciones de repeticiones Primero

polimórficas, como secuencias repetitivas persona
Cromosómico
dispersas hipervariables, en los genomas de dos ADN
individuos. En los segmentos cromosómicos que se Segundo
muestran, la segunda persona tiene una secuencia persona
Posiciones de
repetida adicional. (b) Una autorradiografía que muestra
secuencias repetidas
las huellas dactilares genéticas de dos individuos.

(b) Dos huellas digitales genéticas

Carriles 1 y 2:
1 2
ADN de dos
individuos

l Se necesita una cantidad relativamente grande de ADN porque la técnica depende de

análisis de hibridación. La toma de huellas dactilares no se puede utilizar con las diminutas cantidades de ADN
en el cabello y las manchas de sangre.

l La interpretación de la huella dactilar puede ser difícil debido a las variaciones en la

intensidades de las señales de hibridación. En un tribunal de justicia, las diferencias menores en la intensidad
de la banda entre una huella dactilar de prueba y la de un sospechoso pueden ser suficientes para absolver al
sospechoso. l Aunque los sitios de inserción de las secuencias repetidas son hipervariables, existe una

límite a esta variabilidad y, por lo tanto, una pequeña posibilidad de que dos personas no relacionadas puedan
tener las mismas huellas dactilares, o al menos muy similares. Una vez más, esta consideración puede llevar a
la absolución cuando se lleva un caso ante los tribunales.

La técnica más poderosa de perfilado de ADN evita estos problemas. La elaboración de perfiles hace uso de las
secuencias polimórficas llamadas STR. Como se describe en la pág. 181, un STR es una secuencia corta, de 1 a 13
nucleótidos de longitud, que se repite varias veces en una matriz en tándem. En el genoma humano, el tipo más
común de STR es la repetición de dinucleótido [CA]n, donde “n”, el número de repeticiones, suele estar entre 5 y 20
(Figura 16.2a).
El número de repeticiones en un STR particular es variable porque las repeticiones se pueden agregar o, con
menos frecuencia, eliminar por errores que ocurren durante la replicación del ADN. En la población como un todo,
puede haber hasta diez versiones diferentes de un STR en particular, cada uno de los alelos caracterizado por un
número diferente de repeticiones. En el perfilado de ADN, se identifican los alelos de un número seleccionado de
STR diferentes. Esto se puede lograr rápidamente y con cantidades muy pequeñas de ADN mediante PCR con
cebadores que se hibridan con las secuencias de ADN a ambos lados de una repetición (consulte la Figura 10.19).
Después de la PCR, los productos pueden examinarse mediante electroforesis en gel de agarosa. El tamaño de la
banda o bandas que se ven en el gel indican el alelo o alelos presentes en la muestra de ADN que se ha analizado
(Figura 16.2b). Dos alelos de un STR pueden estar presentes en una sola muestra de ADN porque
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Capítulo 16 Clonación de genes y análisis de ADN en ciencia forense y arqueología 285

(a) Dos alelos de un STR

....LO QUE ES.... norte = 5

....CACACACACACA.... norte = 6

(b) Los resultados de PCR

12 3 4

B 1 marcadores de tamaño de ADN

2, 3 PCR de un solo STR

C en dos individuos
4 PCR multiplex de tres
STR (A–C)

(c) Análisis de los resultados de PCR multiplex por electroforesis en gel capilar

C BA

100 150 200

Tamaño (pb)

Figura 16.2 Perfil

de ADN. (a) El perfil de ADN utiliza STR que tienen unidades de repetición variables. (b) Un gel obtenido después del perfilado
de ADN. En los carriles 2 y 3 se ha examinado el mismo STR en dos individuos. Estas dos personas tienen perfiles diferentes, pero
tienen una banda en común. El carril 4 muestra el resultado de una PCR multiplex en la que se han escrito tres STR en una sola PCR.
(c) La electroforesis en gel capilar se puede utilizar para determinar los tamaños de los productos de PCR multiplex.

hay dos copias de cada STR, una en el cromosoma heredado de la madre y otra en el
cromosoma del padre.
Debido a que se utiliza PCR, el perfil de ADN es muy sensible y permite obtener resultados
con cabellos y otras muestras que contienen trazas de ADN. Los resultados son inequívocos y,
por lo general, se acepta una coincidencia entre los perfiles de ADN como prueba en un ensayo.
La metodología actual, llamada CODIS (Combined DNA Index System), hace uso de 12 STR
con suficiente variabilidad para dar solo una posibilidad en 1015 de que dos personas, que no
sean gemelos idénticos, tengan el mismo perfil. Dado que la población mundial es de alrededor
de 6 × 109, la probabilidad estadística de que dos individuos en el planeta compartan el mismo
perfil es tan baja que se considera inverosímil cuando se presenta evidencia de ADN en un
tribunal de justicia. Cada STR se tipifica mediante PCR con cebadores que están marcados con
fluorescencia y que hibridan a ambos lados de la región de repetición variable. A continuación,
se tipifican los alelos presentes en el STR determinando los tamaños de los amplicones mediante
electroforesis en gel capilar. Dos o más STR se pueden tipificar juntos en una PCR multiplex si
los tamaños de sus productos no se superponen, o si los pares de cebadores individuales están
marcados con diferentes marcadores fluorescentes, lo que permite distinguir los productos en el
gel capilar (Figura 16.2c).
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286 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 16.3
Herencia de alelos STR dentro de una familia.
10 8
11 12 Femenino

Masculino

10 STR repetir
11 tamaños

10 8 11 10
12 11 12 12

16.2 Estudiar el parentesco mediante perfiles de ADN

Además de la identificación de delincuentes, el perfil de ADN también se puede utilizar para inferir si dos o
más personas son miembros de la misma familia. Este tipo de estudio se denomina análisis de parentesco
y su principal aplicación en el día a día es en las pruebas de paternidad.

16.2.1 Las personas emparentadas tienen perfiles de ADN similares Su perfil de

ADN, como todos los demás aspectos de su genoma, se hereda en parte de su madre y en parte de su
padre. Por lo tanto, las relaciones dentro de una familia se hacen evidentes cuando los alelos de un STR
en particular se marcan en el árbol genealógico de la familia (Figura 16.3). En este ejemplo, vemos que 3
de los 4 hijos heredaron el alelo de 12 repeticiones del padre. Esta observación en sí misma no es suficiente
para deducir que estos tres niños son hermanos, aunque la posibilidad estadística sería bastante alta si el
alelo de 12 repeticiones fuera poco común en la población en general. Para aumentar el grado de certeza,
se tendrían que escribir más ROS pero, al igual que con la identificación de individuos, el análisis no tiene
por qué ser interminable, porque una comparación de 12 ROS da una probabilidad aceptable de que las
relaciones que se observan son reales.

16.2.2 Perfiles de ADN y los restos de los Romanov Un ejemplo interesante del uso de

perfiles de ADN en un estudio de parentesco lo proporciona el trabajo realizado durante la década de 1990
en los huesos de los Romanov, los últimos miembros de la familia gobernante rusa. Los Romanov y sus
descendientes gobernaron Rusia desde principios del siglo XVII hasta la época de la Revolución Rusa,
cuando el zar Nicolás II fue depuesto y él y su esposa, la zarina Alexandra, y sus cinco hijos fueron
encarcelados.
El 17 de julio de 1918, los siete, junto con su médico y tres sirvientes, fueron asesinados y sus cuerpos
fueron desechados en una tumba poco profunda al borde de la carretera cerca de Ekaterimburgo en los Urales.
En 1991, tras la caída del comunismo, los restos fueron recuperados con la intención de darles un entierro
más digno.

Análisis STR de los huesos de los Romanov

Aunque se sospechaba que los huesos recuperados eran de hecho los de los Romanov, no se podía
descartar la posibilidad de que pertenecieran a algún otro desafortunado grupo de personas. Se habían
encontrado nueve esqueletos en la tumba: seis adultos y tres niños; el examen de los huesos sugería que
cuatro de los adultos eran hombres y dos mujeres, y los tres niños eran todos mujeres. Si estos eran los
restos de los Romanov, entonces su hijo Alexei y una de sus hijas estaban, por alguna razón, ausentes.

Los cuerpos mostraban signos de violencia, consistentes con informes de su trato durante
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Capítulo 16 Clonación de genes y análisis de ADN en ciencia forense y arqueología 287

(a) El árbol genealógico de los Romanov

Zar Nicolás II Zarina Alexandra

Alexéi Maria Tatiana Olga Anastasia

(b) El análisis
STR
STR
VOZ/31 THO1 F13A1 FES/FPS ACTBP2

Niño 1 15, 16 8, 10 5, 7 12, 13 11, 32

niño 2 15, 16 7, 8 5, 7 12, 13 11, 36
niño 3 15, 16 8, 10 3, 7 12, 13 32, 36

Hembra adulta 1 15, 16 8, 8 3, 5 12, 13 32, 36

Mujer adulta 2 16, 17 6, 6 6, 7 11, 12 no hecho

Macho adulto 1 14, 20 9, 10 6, 16 10, 11 no hecho

Macho adulto 2 17, 17 6, 10 5, 7 10, 11 11, 30
Macho adulto 3 15, 16 7, 10 7, 7 12, 12 11, 32
Hombre adulto 4 15, 17 6, 9 5, 7 8, 10 no hecho

Figura 16.4 Análisis

repetido en tándem corto de los huesos de Romanov. (a) El árbol genealógico de los Romanov. (b) Los resultados del análisis STR.
Datos tomados de Gill et al. (1994) (ver lecturas adicionales).

y después de la muerte, y al menos algunos de los restos eran claramente aristocráticos ya que
sus dientes estaban llenos de porcelana, plata y oro, la odontología estaba mucho más allá de los
medios del ruso promedio de principios del siglo XX.
Se extrajo ADN de los huesos de cada individuo y se tipificaron cinco STR por PCR para probar
la hipótesis de que los tres niños eran hermanos y que dos de los adultos eran sus padres, como
sería el caso si estos fueran los Romanov. Los resultados mostraron de inmediato que los tres
niños podrían ser hermanos, ya que tienen genotipos idénticos para los STR llamados VWA/31 y
FES/FPS y comparten alelos en cada uno de los otros tres loci (Figura 16.4). Los datos de THO1
muestran que la mujer adulta 2 no puede ser la madre de los niños porque solo posee el alelo 6,
que ninguno de los niños tiene. La hembra adulta 1, sin embargo, tiene el alelo 8, que tienen los
tres hijos. El examen de los otros STR confirma que ella podría ser la madre de cada uno de los
niños, por lo que se la identifica como la zarina. Los datos de THO1 excluyen al adulto masculino 4
como posible padre de los niños, y los resultados de SWA/31 excluyen a los adultos masculinos 1
y 2. Cuando se toman en cuenta todos los STR, el adulto masculino 3 podría ser el padre de los
niños y, por lo tanto, es identificado como el zar. Tenga en cuenta que todas estas conclusiones se
pueden extraer simplemente de los resultados de TH01 y VWA/31: los otros datos de STR
simplemente proporcionan evidencia que los corrobora.

Se usó ADN mitocondrial para vincular los esqueletos de los Romanov con parientes vivos .
El análisis STR mostró que los esqueletos incluían un grupo familiar como se esperaba, si estos
eran realmente los huesos de los Romanov. Pero, ¿podrían ser los restos de algún
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288 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 16.5 Árbol

genealógico que muestra la relación matrilineal entre el príncipe Gran Duque princesa alicia
Felipe, duque de Edimburgo y la princesa Victoria de Hesse, Luis
hermana de la zarina. Los machos se muestran como cuadros
azules y las hembras como círculos rojos.

mi sistema Princesa Victoria de

Hesse

Alicia de
Battenburg

Príncipe Felipe,
Duque de Edimburgo

otro desafortunado grupo de personas? Para abordar este problema, el ADN de los huesos se
comparó con muestras de ADN de parientes vivos de los Romanov. Este trabajo incluyó
estudios de ADN mitocondrial, los pequeños círculos de ADN de 16 kb contenidos en las
mitocondrias de las células generadoras de energía. El ADN mitocondrial contiene polimorfismos
que se pueden usar para inferir relaciones entre individuos, pero el grado de variabilidad no es
tan grande como el que muestran los STR, por lo que el ADN mitocondrial rara vez se usa para
estudios de parentesco entre individuos estrechamente relacionados, como los de un solo grupo familiar. .
Pero el ADN mitocondrial tiene la importante propiedad de ser heredado únicamente a través
de la línea femenina, el ADN mitocondrial del padre se pierde durante la fertilización y no
contribuye al contenido de ADN del hijo o la hija. Este patrón de herencia materna hace que
sea más fácil distinguir las relaciones cuando los individuos que se comparan son parientes
más distantes, como fue el caso de los parientes vivos de los Romanov.
Por lo tanto, se hicieron comparaciones entre las secuencias de ADN mitocondrial obtenidas
de los esqueletos y la del príncipe Felipe, duque de Edimburgo, cuya abuela materna era la
princesa Victoria de Hesse, hermana de la zarina Alexandra (Figura 16.5).
Las secuencias de ADN mitocondrial de cuatro de los esqueletos femeninos —los tres niños y
la mujer adulta identificada como la zarina— eran exactamente iguales a las del príncipe Felipe,
fuerte evidencia de que las cuatro mujeres eran miembros del mismo linaje. También se hicieron
comparaciones con dos descendientes matrilineales vivos de la abuela del zar Nicolás, Luisa
de Hesse-Cassel. Este análisis fue más complicado, ya que había dos secuencias presentes
entre los clones del producto de PCR obtenido del macho adulto que se cree que es el zar.
Estas secuencias diferían en una sola posición que era una C o una T, la primera cuatro veces
más frecuente que la última. Esto podría indicar que la muestra estaba contaminada con el
ADN de otra persona, pero en cambio se interpretó como que el ADN mitocondrial del zar era
heteroplásmico, una situación poco frecuente en la que coexisten dos ADN mitocondriales
diferentes dentro de las mismas células.
Los dos descendientes de la abuela del zar tenían la versión del ADN mitocondrial con una T
en esta posición, lo que sugiere que la mutación que produce la variante C había ocurrido muy
recientemente en el linaje del zar. Posteriormente, el análisis del ADN del hermano del zar, el
gran duque George Alexandrovich, que murió en 1899, proporcionó apoyo para esta hipótesis,
y mostró que también mostraba heteroplasmia en la misma posición en su ADN mitocondrial.
En general, la evidencia sugería que los restos del zar habían sido identificados correctamente.
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Capítulo 16 Clonación de genes y análisis de ADN en ciencia forense y arqueología 289

Los niños desaparecidos

Sólo tres niños fueron encontrados en la tumba de los Romanov. Faltaban Alexei, el único niño, y
una de las cuatro niñas. Durante las décadas medias del siglo XX, varias mujeres afirmaron ser
una princesa Romanov, porque incluso antes de que se recuperaran los huesos había rumores de
que una de las niñas, Anastasia, había escapado de las garras de los bolcheviques y había huido
a Occidente. . Una de las más famosas de estas demandantes fue Anna Anderson, cuyo caso fue
ampliamente publicitado por primera vez en la década de 1920. Anna Anderson murió en 1984
pero dejó una muestra de tejido archivada cuyo ADN mitocondrial no coincide con el de la zarina
y sugiere una mujer de origen polaco. También ha habido varias personas que afirman ser
descendientes del zarevich Alexei. Pero es casi seguro que estas historias son romances, ya que
ahora se ha demostrado que los cuerpos parcialmente cremados de otros dos niños encontrados
cerca de Ekaterimburgo en 2007 tienen secuencias de ADN mitocondrial que sugieren que son
niños Romanov desaparecidos.

16.3 Identificación del sexo por análisis de ADN

El análisis de ADN también se puede utilizar para identificar el sexo de un individuo. La diferencia
genética entre los sexos es la posesión de un cromosoma Y por parte de los machos, por lo que
la detección de ADN específico para el cromosoma Y permitiría distinguir machos y hembras. Los
científicos forenses ocasionalmente tienen que lidiar con cuerpos que están tan dañados que el
análisis de ADN es la única forma de identificar su sexo.
Las pruebas de ADN también se pueden utilizar para identificar el sexo de un feto. Averiguar si
un feto es niño o niña generalmente se demora hasta que se hayan desarrollado las diferencias
anatómicas y se pueda identificar el sexo mediante escaneo, pero en algunas circunstancias es
deseable una indicación más temprana del sexo. Un ejemplo es cuando el árbol genealógico de la
familia indica que un varón por nacer podría sufrir una enfermedad hereditaria y los padres desean
tomar una decisión temprana sobre si continuar con el embarazo.
Una tercera aplicación de la identificación del sexo basada en el ADN, y la que ha sido
responsable de muchos de los avances en este campo, es el análisis de especímenes
arqueológicos. Los esqueletos masculinos y femeninos se pueden distinguir si los huesos clave,
como el cráneo o la pelvis, están intactos, pero con restos fragmentados, o los de niños pequeños,
no hay suficientes diferencias anatómicas específicas del sexo para hacer una identificación
segura. Si el ADN antiguo se conserva en los huesos, un método basado en el ADN puede
decirles a los arqueólogos si se trata de un hombre o una mujer.

16.3.1 PCR dirigidas a secuencias específicas del cromosoma Y

La forma más sencilla de usar el análisis de ADN para identificar el sexo es diseñar una PCR
específica para una región del cromosoma Y. La PCR debe diseñarse con cuidado, porque los
cromosomas X e Y no son completamente diferentes, ya que algunos segmentos se comparten
entre los dos. Pero hay muchas regiones únicas dentro del cromosoma Y. En particular, hay varias
secuencias repetidas que solo se encuentran en el cromosoma Y, estas secuencias repetidas
actúan como objetivos múltiples para la PCR y, por lo tanto, brindan una mayor sensibilidad, una
consideración importante si se trata de un cuerpo muy dañado o un hueso antiguo.

Una PCR dirigida a secuencias de ADN específicas de Y daría un producto con ADN masculino
pero sin banda si la muestra proviene de una mujer (Figura 16.6). Esta es una clara distinción
entre las dos alternativas y, por lo tanto, un sistema perfectamente satisfactorio para la mayoría.
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290 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 16.6 12 3 4
Identificación del sexo por PCR de una secuencia de
ADN específica de Y. El ADN masculino da un
producto de PCR (carril 2), pero el ADN femenino no
(carril 3). El problema es que una PCR fallida (carril 4)
da el mismo resultado que el ADN femenino.

1 marcadores de ADN
2 ADN masculino
3 ADN femenino
4 PCR fallida

aplicaciones Pero, ¿qué sucede si la muestra no contiene ADN, o si el ADN está demasiado
degradado para funcionar en la PCR, o si la muestra también contiene inhibidores de la polimerasa
Taq que impiden que la enzima lleve a cabo la PCR? Todas estas posibilidades podrían ocurrir con
especímenes arqueológicos, especialmente aquellos que han sido enterrados en el suelo y se
contaminan con ácidos húmicos y otros compuestos conocidos por inhibir muchas de las enzimas
utilizadas en la investigación de biología molecular. Ahora la prueba se vuelve ambigua porque un
espécimen que no puede dar un producto de PCR por una de estas razones podría identificarse
erróneamente como hembra. El resultado sería exactamente el mismo: ninguna banda en el gel.

16.3.2 PCR del gen de la amelogenina

La falta de discriminación entre "mujer" y "PCR fallida" que ocurre cuando se estudian secuencias
específicas de Y ha llevado al desarrollo de pruebas de ADN más sofisticadas para la identificación
del sexo, que dan resultados inequívocos tanto para hombres como para mujeres. El más utilizado de
estos implica PCR que amplifican el gen de la amelogenina.
El gen de la amelogenina codifica una proteína que se encuentra en el esmalte dental. Es uno de
los pocos genes que están presentes en el cromosoma Y y, como muchos de estos genes, también
hay una copia en el cromosoma X. Pero las dos copias están lejos de ser idénticas, y cuando las
secuencias de nucleótidos se alinean, se ven varios indeles, posiciones en las que un segmento de
ADN se insertó en una secuencia o se eliminó de la otra secuencia (Figura 16.7a). Si los cebadores
para una PCR hibridan ambos lados de un indel, los productos obtenidos de los cromosomas X e Y
tendrían tamaños diferentes. El ADN femenino daría una sola banda cuando se examinan los
productos, porque las mujeres solo tienen el cromosoma X, mientras que los hombres darían dos
bandas, una del cromosoma X y otra del Y (Figura 16.7b). Si la muestra no contiene ADN o la PCR
falla por alguna otra razón, no se obtendrá ninguna banda: no hay confusión entre la falla y un
resultado masculino o femenino.

El desarrollo del sistema de amelogenina para la identificación del sexo está teniendo un impacto
importante en la arqueología. Ya no es necesario asignar el sexo a los huesos enterrados sobre la
base de vagas diferencias en las estructuras de los huesos. La mayor confianza que permiten las
pruebas de sexo basadas en el ADN está dando como resultado algunos descubrimientos inesperados.
En particular, los arqueólogos ahora están revisando sus ideas preconcebidas sobre el significado de
los objetos enterrados en una tumba junto con el cuerpo. Se pensaba que si un cuerpo iba
acompañado de una espada, entonces debía ser masculino, o si la tumba contenía cuentas, entonces
el cuerpo era femenino. Las pruebas de ADN han demostrado que estos estereotipos no siempre son
correctos y que los arqueólogos deben tener una visión más amplia del vínculo entre el ajuar funerario y el sexo.
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Capítulo 16 Clonación de genes y análisis de ADN en ciencia forense y arqueología 291

(a) Parte del gen de la amelogenina Figura 16.7

cromosoma Y Identificación del sexo por PCR de parte
del gen de la amelogenina. (a) Un indel en el gen de
cromosoma X
la amelogenina. (b) Los resultados de PCR que abarcan el indel.
El ADN masculino da dos productos de PCR, de 106
Deleción de 6 pb
en la secuencia del y 112 pb en el sistema estándar utilizado en medicina

cromosoma X forense y arqueología biomolecular. El ADN femenino da

solo el producto más pequeño. Una PCR fallida no arroja
(b) Resultados de PCR productos y, por lo tanto, se distingue claramente de los
12 3 4 dos tipos de resultados positivos.

marcadores de ADN
1 ADN masculino
2 ADN femenino
34 PCR fallida

16.4 Arqueogenética: uso del ADN para estudiar la

prehistoria humana
La identificación del sexo y los estudios de parentesco no son las únicas formas en que la clonación
de genes y el análisis de ADN se aplican en arqueología. Al examinar las secuencias de ADN en
humanos vivos y muertos, los arqueólogos han comenzado a comprender los orígenes evolutivos
de los humanos modernos y las rutas seguidas por los pueblos prehistóricos cuando colonizaron
el planeta. Esta área de investigación se llama arqueogenética.

16.4.1 Los orígenes de los humanos modernos Los

paleontólogos creen que los humanos se originaron en África porque es aquí donde se han
encontrado todos los fósiles prehumanos más antiguos. La evidencia fósil revela que los homínidos
emigraron por primera vez fuera de África hace más de un millón de años, pero estos no eran
humanos modernos. En cambio, fue una especie anterior llamada Homo erectus, que fueron los
primeros homínidos que se dispersaron geográficamente y finalmente se extendieron a todas
partes del Viejo Mundo.
Los eventos que siguieron a la dispersión de H. erectus son controvertidos. A partir de estudios
de fósiles, muchos paleontólogos creen que las poblaciones de H. erectus que se ubicaron en
diferentes partes del Viejo Mundo dieron origen a las poblaciones modernas de Homo sapiens que
se encuentran en esas áreas hoy (Figura 16.8a). Este proceso se denomina evolución
multirregional. Puede haber habido una cierta cantidad de mestizaje entre humanos de diferentes
regiones geográficas pero, en gran medida, estas diversas poblaciones permanecieron separadas
a lo largo de su historia evolutiva.

El análisis de ADN ha desafiado la hipótesis multirregional Las

dudas sobre la hipótesis multirregional surgieron en 1987 cuando los genetistas comenzaron a
usar el análisis de ADN para hacer preguntas sobre la evolución humana. En uno de los muy
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292 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

a) Evolución multirregional (b) La hipótesis de Fuera de África

Europa África Asia Europa África Asia

hombre hombre
de pie de pie

Evolución
paralela

Desplazamiento Desplazamiento

hombre sabio moderno hombre sabio moderno

Figura 16.8 Dos

hipótesis sobre los orígenes de los humanos modernos: (a) evolución multirregional; (b) la hipótesis de Fuera de África.

primeros proyectos de arqueogenética, se midieron polimorfismos de longitud de fragmentos de

restricción (RFLP) en muestras de ADN mitocondrial tomadas de 147 humanos, de todas partes
del mundo. Los datos resultantes luego se usaron para construir un árbol filogenético que muestra
las relaciones evolutivas entre diferentes poblaciones humanas. De este árbol se hicieron varias
deducciones:

l La raíz del árbol representa a una mujer (recuerde, el ADN mitocondrial es

heredado solo a través de la línea femenina) cuyo genoma mitocondrial es ancestral de
todos los 147 ADN mitocondriales modernos que se probaron. Esta mujer ha sido llamada
Eva mitocondrial. Por supuesto, ella no era equivalente al personaje bíblico y de ninguna
manera era la única mujer viva en ese momento: simplemente era la persona que portaba
el ADN mitocondrial ancestral que dio origen a todos los ADN mitocondriales que existen
hoy.
l La Eva mitocondrial vivió en África. Esto se dedujo porque los ancestrales

La secuencia dividió el árbol en dos segmentos, uno de los cuales estaba compuesto
únicamente por ADN mitocondrial africano. Debido a esta división, se infirió que el antepasado
también se encontraba en África.
l La Eva mitocondrial vivió hace entre 140.000 y 290.000 años. Se llegó a esta conclusión
aplicando el reloj molecular al árbol filogenético. El reloj molecular es una medida de la
velocidad a la que se produce el cambio evolutivo en las secuencias de ADN mitocondrial y
se calibra a partir de la velocidad a la que se sabe que se acumulan las mutaciones en el
ADN mitocondrial. Al comparar la secuencia inferida del ADN mitocondrial de Eve con las
secuencias de los 147 ADN modernos, se calculó el número de años necesarios para que se
produjeran todos los cambios evolutivos necesarios.

El hallazgo clave de que la Eva mitocondrial vivió en África no antes de hace 290.000 años no
concuerda con la sugerencia de que todos descendemos de poblaciones de H. erectus que
abandonaron África hace más de un millón de años. Por lo tanto, se ideó una nueva hipótesis
para los orígenes humanos, llamada Memorias de África. Según esta hipótesis, los humanos
modernos, H. sapiens, evolucionaron específicamente a partir de las poblaciones de H. erectus
que permanecieron en África. Los humanos modernos luego se mudaron al resto del Viejo Mundo
hace entre 100 000 y 50 000 años, desplazando a los descendientes de H. erectus que
encontraron (Figura 16.8b).
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Capítulo 16 Clonación de genes y análisis de ADN en ciencia forense y arqueología 293

Al principio, los resultados de Eve mitocondrial fueron fuertemente criticados. Se hizo evidente que
el análisis informático utilizado para construir el árbol filogenético tenía fallas, principalmente porque
los algoritmos utilizados para comparar los datos de RFLP no eran lo suficientemente sólidos para
manejar esta enorme cantidad de información. Sin embargo, las críticas ahora se han desvanecido ya
que los resultados de estudios de ADN mitocondrial más extensos, utilizando secuencias de ADN
reales en lugar de RFLP y analizadas con computadoras modernas y potentes, han confirmado los
hallazgos del primer proyecto. Para tomar un ejemplo, cuando se compararon las secuencias del
genoma mitocondrial completo de 53 personas, nuevamente de todo el mundo, se obtuvo una fecha
de 220 000 a 120 000 años para la Eva mitocondrial. Un complemento interesante lo han aportado los
estudios del cromosoma Y que, por supuesto, desciende exclusivamente por línea masculina. Este
trabajo ha revelado que el “cromosoma Y Adam” también vivió en África hace entre 40.000 y 140.000
años.

El análisis de ADN muestra que los neandertales no son los ancestros de los europeos modernos .
Los neandertales son homínidos extintos que vivieron en Europa hace entre 300.000 y 30.000 años.
Descendían de las poblaciones de H. erectus que abandonaron África hace aproximadamente un
millón de años y, según la hipótesis de Fuera de África, fueron desplazadas cuando los humanos
modernos llegaron a Europa hace unos 50.000 años. Por lo tanto, una predicción de la hipótesis de
Memorias de África es que los neandertales no son los ancestros de los europeos modernos. El
análisis de ADN antiguo de huesos de neandertal se ha utilizado para probar esta predicción.

El primer espécimen neandertal seleccionado para el estudio fue el espécimen tipo, que se había
encontrado en Alemania en el siglo XIX. Este fósil no ha sido fechado con precisión pero tiene entre
30.000 y 100.000 años. Esto lo coloca en los límites mismos de la supervivencia del ADN antiguo, ya
que se cree que los procesos de degradación natural descomponen el ADN que sobrevive en los
huesos, de modo que queda muy poco después de unos 50 000 años, incluso en especímenes que se
mantienen muy fríos, por ejemplo, al enterrarlos. en permafrost. El espécimen de neandertal no se
había conservado en condiciones particularmente frías, pero aun así fue posible obtener una pequeña
parte de la secuencia de ADN mitocondrial de este individuo.
Esto se logró mediante la realización de nueve PCR superpuestas, cada una de las cuales amplificó
menos de 170 pb de ADN pero juntas dieron una longitud total de 377 pb.
Se construyó un árbol filogenético para comparar la secuencia obtenida del hueso neandertal con
las secuencias de seis de las principales variantes de ADN mitocondrial (llamadas haplogrupos)
presentes en los europeos modernos. La secuencia neandertal se colocó en una rama propia,
conectada a la raíz del árbol pero no vinculada directamente a ninguna de las secuencias humanas
modernas (Figura 16.9). Esta fue la primera evidencia que sugería que los neandertales no son
ancestros de los europeos modernos.

neanderthal Figura 16.9 El

análisis filogenético del ADN antiguo sugiere que los

neandertales no están directamente relacionados con los humanos modernos.

humanos modernos
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294 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

A continuación, la secuencia neandertal se alineó con las secuencias equivalentes de 994

humanos modernos. Las diferencias eran llamativas. La secuencia neandertal difería de las
secuencias modernas en un promedio de 27,2 ± 2,2 posiciones de nucleótidos, mientras que las
secuencias modernas, que procedían de todo el mundo, no solo de Europa, diferían entre sí en
solo 8,0 ± 3,1 posiciones. Este grado de diferencia es incompatible con la idea de que los europeos
modernos descienden de los neandertales. Se obtuvieron resultados similares cuando se examinó
el ADN mitocondrial de un segundo esqueleto de neandertal. Por lo tanto, los resultados
proporcionan una prueba independiente de la hipótesis de Fuera de África y muestran que, al
menos para Europa, el modelo multirregional es incorrecto.

16.4.2 El ADN también se puede utilizar para estudiar las migraciones humanas
prehistóricas Los humanos modernos que desplazaron a los neandertales llegaron a
Europa hace unos 40.000 años. Esto está claro a partir de los registros fósiles y arqueológicos.
Pero, ¿fueron estos humanos desplazados por poblaciones más nuevas que emigraron a Europa
más recientemente?

La expansión de la agricultura en Europa

Algunos arqueólogos han sugerido que nuevas poblaciones de humanos podrían haberse mudado
a Europa durante los últimos 10.000 años, y que estos humanos trajeron la agricultura al continente.
La transición de la caza y la recolección a la agricultura se produjo en el suroeste de Asia hace
unos 10.000 años, cuando los primeros pobladores del Neolítico comenzaron a cultivar cultivos
como el trigo y la cebada. Después de establecerse, la agricultura se extendió a Asia, Europa y el
norte de África. A través de la búsqueda en yacimientos arqueológicos de restos de plantas
cultivadas o de aperos de labranza, se han trazado dos vías por las que la agricultura se extendió
por Europa. Una de estas trayectorias siguió la costa mediterránea hasta España y finalmente
hasta Gran Bretaña, y la segunda pasó por los valles del Danubio y el Rin hasta el norte de Europa
(Figura 16.10).
Una explicación para la expansión de la agricultura es que los agricultores se trasladaron de un
lugar a otro, llevándose consigo sus implementos, animales y cultivos, y desplazando a las
comunidades indígenas preagrícolas que estaban presentes en Europa en ese momento.
Este modelo de ola de avance fue apoyado inicialmente por arqueogenéticos, ya que concuerda
con los resultados de un gran estudio filogenético, realizado en la década de 1990, de las
frecuencias alélicas de 95 genes nucleares en poblaciones de toda Europa. Este conjunto de datos
se analizó mediante una técnica utilizada a menudo en genética de poblaciones, denominada
análisis de componentes principales, que intenta identificar patrones en la distribución geográfica
de los alelos, patrones que posiblemente sean indicativos de migraciones de población pasadas.
El patrón más sorprendente dentro del conjunto de datos europeo, que representa alrededor del
28 % de la variación genética total, es una gradación de frecuencias de alelos que va de sureste a
noroeste en todo el continente (Figura 16.11). Este patrón sugiere que se produjo una migración
de personas del sureste al noroeste de Europa, o en la dirección opuesta. Debido a que la migración
anterior coincide con la expansión de la agricultura, como lo revela el registro arqueológico, se
consideró que este primer componente principal proporcionaba un fuerte apoyo para el modelo de
ola de avance.

Uso del ADN mitocondrial para estudiar pasadas migraciones humanas a

Europa El análisis de componentes principales tiene un punto débil cuando se aplica a pasadas
migraciones humanas. Es difícil determinar cuándo se produjo una migración identificada de esta manera.
Esto significa que el vínculo entre el primer componente principal y la propagación de
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Capítulo 16 Clonación de genes y análisis de ADN en ciencia forense y arqueología 295

5000 aC

hR i
norte
y

Da en
norte
by
5400 aC

5000 aC

6500 aC

6200 aC
TT T Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti Ti _

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Yhastah
ramano
antes de Cristo
800
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80
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0
000
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80
0000
800
000
80
800
80
080
0000
00
0000 0

Figura 16.10 La

expansión de la agricultura desde el suroeste de Asia hacia Europa. El área sombreada en el suroeste de Asia es el Creciente
Fértil, donde crecen las versiones silvestres del trigo y la cebada, y donde los agricultores cultivaron estas plantas por primera vez
hace unos 10.000 años.

la agricultura se basa únicamente en el patrón de la gradación de alelos, no en ninguna evidencia

complementaria relacionada con el período en que se estableció esta gradación.
Se ha realizado un segundo estudio de poblaciones humanas europeas, que sí incluye una
dimensión temporal, utilizando ADN mitocondrial. Para empezar, se comparó la distribución de las
variaciones de la secuencia del ADN mitocondrial en 821 individuos de poblaciones de toda
Europa. Los datos no dieron evidencia de una gradación de las frecuencias alélicas y, en cambio,
sugirieron que las poblaciones europeas se han mantenido relativamente estáticas durante los
últimos 20.000 años. Este resultado planteó importantes dudas sobre el modelo de ola de avance.
Entonces, ¿cómo se extendió la agricultura en Europa?
Estudios más sofisticados de las variaciones del ADN mitocondrial en las poblaciones europeas
modernas apuntan hacia un nuevo modelo para la expansión de la agricultura. Se ha descubierto
que los genomas mitocondriales presentes entre los europeos modernos se pueden agrupar en
11 clases principales de secuencias, o haplogrupos, cada uno de los cuales muestra variaciones
distintivas en la secuencia de nucleótidos. Para cada uno de estos haplogrupos, el reloj molecular
se puede utilizar para deducir una fecha de origen, que se cree que se corresponde con la fecha
en que el haplogrupo entró en Europa (Figura 16.12). El haplogrupo más antiguo, llamado U,
apareció por primera vez en Europa hace unos 50.000 años, coincidiendo con el período en el
que, según el registro arqueológico, los primeros humanos modernos se trasladaron al continente
cuando las capas de hielo se retiraron hacia el norte a finales del siglo XIX. última gran glaciación.
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296 Parte III Las Aplicaciones de la Clonación de Genes y el Análisis de ADN en Biotecnología

Figura 16.11 El análisis

de componentes principales revela un gradiente de sureste a noroeste de frecuencias alélicas humanas en toda Europa.

Origen de la agricultura

En (5,7%)
HV (5,4%)
yo (1,7%)
U4 (3,0%)
H (37,7%)
H-16304 (3.9%)
T (2,2%)
k (4,6%)
T2 (2,9%)
S (6,1 %) J (6,1 %)

TI (2,2%) TI (2,2%)

0 10 000 20 000 30 000 40 000 50 000

Años antes del presente

Figura 16.12 Los

tiempos deducidos de llegada a Europa de los 11 principales haplogrupos de ADN mitocondrial que se encuentran en las poblaciones modernas.
Los haplogrupos cuya llegada coincide con la expansión de la agricultura se muestran en rojo.

Los haplogrupos más jóvenes, J y T1, que con 9000 años de edad podrían corresponder a los orígenes
de la agricultura, los posee solo el 8,3% de la población europea moderna, lo que confirma que la
expansión de la agricultura en Europa no fue la gran ola de avance indicado por el estudio de componentes
principales. En cambio, ahora se piensa que la agricultura fue traída a Europa por un grupo más pequeño
de "pioneros" que se cruzaron con las comunidades pre-agrícolas existentes en lugar de desplazarlas.

La arqueogenética realmente ilustra cuán amplio es el impacto de la clonación de genes y el ADN.

análisis han tenido sobre la ciencia.
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Capítulo 16 Clonación de genes y análisis de ADN en ciencia forense y arqueología 297

Otras lecturas
OTRAS LECTURAS
Cann, RL, Stoneking, M. & Wilson, AC (1987) ADN mitocondrial y evolución humana.
Naturaleza, 325, 31–36. [El primer artículo que propone la hipótesis de la Eva mitocondrial.]
Cavalli-Sforza, LL (1998) La revolución del ADN en la genética de poblaciones. Tendencias en genética, 14, 60–
65. [El uso del análisis de componentes principales para estudiar las frecuencias de alelos nucleares en
Europa.]
Coble, MD, Loreille, OM, Wadhams, MJ et al. (2009) Misterio resuelto: la identificación de los dos niños Romanov
desaparecidos mediante análisis de ADN. PLoS ONE, 4, e4838.
Gill, P., Ivanov, PL, Kimpton, C. et al. (1994) Identificación de los restos de los Romanov
familia por análisis de ADN. Genética de la naturaleza, 6, 130–135.
Jeffreys, AJ, Wilson, V. & Thein, LS (1985) Huellas dactilares individuales específicas del ADN humano.
Naturaleza, 314, 67–73. [Huellas genéticas por análisis de repeticiones dispersas.]
Jobling, MA & Gill, P. (2004) Evidencia codificada: ADN en análisis forense. Reseñas de la naturaleza
Genética, 5, 739–751.
Krings, M., Stone, A., Schmitz, RW y col. (1997) Secuencias de ADN neandertal y el origen de los humanos
modernos. Celda, 90, 19–30.
Nakahori , Y. , Hamano , K. , Iwaya , M. & Nakagome , Y. ( 1991 ) Identificación del sexo por reacción en
cadena de la polimerasa utilizando un cebador homólogo X-Y . Revista estadounidense de genética médica,
39, 472–473. [El método de la amelogenina.
Richards, M., Macauley, V., Hickey, E. y col. (2000) Rastreo de linajes de fundadores europeos en el grupo de
ADNmt del Cercano Oriente. Revista estadounidense de genética humana, 67, 1251–1276.
[Uso del ADN mitocondrial para estudiar las migraciones humanas a Europa.]