LA PCR

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 INTRODUCCIÓN

¿Qué es la tecnología del ADN?

Muchos ejemplos de biotecnología moderna se basan en la capacidad de analizar,

manipular, cortar y pegar fragmentos de ADN. Las tecnologías para secuenciar y manipular el
ADN a menudo se denominan tecnologías de ADN.

Por ejemplo, para el ensayo de terapia génica de la fibrosis quística, los investigadores
utilizaron técnicas de manipulación del ADN para insertar el gen del canal de cloruro en un
fragmento de ADN del vector (un vector) que permitió expresarlo en células pulmonares
humanas. La tecnología del ADN es importante en biología básica y aplicada (práctica). Por
ejemplo, una técnica para hacer múltiples copias de una secuencia de ADN, llamada reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), se usa en muchas pruebas de diagnóstico médico y
aplicaciones forenses, así como en la investigación básica de laboratorio.

Ejemplos de tecnología de ADN:

Veamos algunos ejemplos de análisis de ADN y técnicas de manipulación que se utilizan

habitualmente en la biología molecular moderna. Puede encontrar más detalles sobre estas
tecnologías utilizando los enlaces a continuación.

Clonación de ADN. En la clonación de ADN, un investigador "clona" (hace muchas copias de)
un segmento de ADN de interés, como un gen. En muchos casos, la clonación de ADN implica
insertar un gen de interés en una molécula de ADN circular llamada plásmido. Los plásmidos
pueden replicarse en bacterias para producir muchas copias de un gen de interés. En algunos
casos, el gen también se expresa en bacterias y produce proteínas (como la insulina que usan
los diabéticos).

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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción en cadena de la polimerasa es otra
técnica de manipulación del ADN ampliamente utilizada, con aplicaciones en casi todas las
áreas de la biología moderna. Una reacción de PCR produce muchas copias de una secuencia
de ADN diana a partir de un fragmento de ADN molde. Esta técnica se puede usar para hacer
muchas copias diminutas de ADN (por ejemplo, en una gota de sangre en la escena de un
crimen).

Electroforesis en gel. La electroforesis en gel es una técnica utilizada para visualizar (observar
directamente) fragmentos de ADN. Por ejemplo, los investigadores pueden analizar los
resultados de una reacción de PCR examinando los fragmentos de ADN producidos en la
reacción en un gel. La electroforesis en gel separa fragmentos de ADN según su tamaño y
luego tiñe los fragmentos con un tinte para que los investigadores puedan verlos.

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La PCR es una técnica poderosa de amplificación de fragmentos de ADN, que permite sintetizar
en pocas horas millones de copias de un segmento de ADN a partir de una muestra muy
pequeña.

Como dato curioso fue desarrollada por Kary B. Mullis en 1983 impulsando así el desarrollo de
numerosos campos científicos.

Para poder llevarla a cabo son necesarios los siguientes elementos:

1. El ADN que se requiera amplificar, del cual se deben conocer los extremos, ya que para
iniciar su copia se requieren cebadores.
2. Grandes cantidades de nucleótidos trifosfato
3. Moléculas de ARN cebador o “premiers”
4. Una enzima de ADN- polimerasa, que actúa a una temperatura muy elevada (72º)

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Una de las cosas que he mencionado y que necesitamos son los cebadores los cuales sabemos
que son fragmentos cortos de ADN monocatenario utilizado para distintas técnicas de
laboratorio, como es el caso de la PCR.

Una vez tenemos los componentes, nuestra reacción constaría de 3 pasos:

1. Cambio de sexo. Esto se hará elevando la temperatura del tubo de reacción a 94ºC, por
ejemplo, durante un minuto (este tiempo puede variar entre ½ minuto y 2 minutos).

2. Alineación. Bajar la temperatura a una temperatura que pueda oscilar entre 40 ºC y 60 ºC

(dependiendo de varios parámetros como las secuencias de los cebadores, su especificidad...).
La duración de este paso puede variar de ½ minuto a 2 minutos.

3. Extender. Vuelva a aumentar la temperatura a 72 ºC y deje actuar la Taq polimerasa durante

1 o 2 minutos.

Estos tres pasos constituyen un ciclo. La repetición de este ciclo unas 40 veces, por ejemplo,
permite obtener, como resultado de un experimento de amplificación, millones de copias del
fragmento de interés.

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En general, el objetivo de la PCR es generar suficiente ADN de una región de interés para que
pueda analizarse o usarse de otra manera. Por ejemplo, el ADN amplificado por PCR se puede
secuenciar, visualizar mediante electroforesis en gel o clonar en plásmidos para experimentos
posteriores.

La PCR se utiliza en muchos campos de la biología y la medicina, como la investigación en

biología molecular, el diagnóstico médico e incluso en algunas ramas de la ecología.

Una vez tenemos claro como se lleva a cabo un PCR veremos las modalidades/variantes de la
misma:

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PCR anidada: variante de la PCR convencional que implica dos rondas de amplificación con un
par de cebadores diferentes en cada ronda para aumentar la sensibilidad y la especificidad de
la detección. Primero, se realiza una reacción con un cebador externo para amplificar una
región más grande de ADN que contiene el fragmento de interés. Este producto de
amplificación luego se usa como plantilla para una segunda PCR usando cebadores internos
para amplificar regiones específicas.

PCR in situ: el ARN o ADN monocatenario llamado sonda se marca y se permite que se
empareje con su secuencia complementaria en el ARN o ADN presente en una muestra
cromosómica o de tejido. La sonda está etiquetada con un marcador químico o radiactivo para
que se pueda ver su unión.

La PCR de inicio en caliente es una alternativa de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

convencional donde ya casi ni necesitaremos productos no deseados y de cebadores debido a
la amplificación no específica del ADN a temperaturas ambiente (o más frías). La PCR de inicio
en caliente es un método que evita la extensión de la ADN polimerasa a temperaturas más
bajas para evitar la unión no específica y minimizar la pérdida de rendimiento. La PCR de inicio
en caliente reduce la cantidad de unión no específica a través de reactivos limitadores hasta
los pasos de calentamiento de la PCR: limite la reacción de manera temprana al limitar la ADN
polimerasa Taq en una reacción. La unión no específica a menudo conduce a cebadores y
dianas cebadas incorrectamente / cebadas falsamente. Estos pueden rectificarse mediante
métodos modificados como:

• Adición tardía de la ADN polimerasa Taq

• Adición tardía de la ADN polimerasa Taq

La PCR de Alta Fidelidad es un tipo de PCR que posee una tasa de errores muy baja y
lógicamente da como reslutado un alto grado de precisión en la replicación del ADN de interés.

Cuando hablamos de fidelidad, nos referimos a su capacidad para insertar la base correcta
durante la PCR. Se refiere a su capacidad para insertar las bases correctas durante la PCR.

Esto implica múltiples etapas:

• Capacidad para leer cadenas de plantilla

• Selección de nucleósidos trifosfato apropiados

• Inserte el nucleótido correcto en el extremo 3' del cebador

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 Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es una técnica que separa fragmentos de ADN según el tamaño y la
carga. La electroforesis consiste en aplicar una corriente eléctrica a través de un gel que
contiene moléculas de interés. Dependiendo de su tamaño y carga, las moléculas se moverán a
través del gel en diferentes direcciones oa diferentes velocidades, alejándose unas de otras.

¿Qué es un gel?

Como sugiere su nombre, la electroforesis en gel implica un gel: una pieza de material similar a
la gelatina. Los geles que se usan para separar el ADN generalmente están hechos de un
polisacárido llamado agarosa, que viene en copos de polvo seco. Cuando la agarosa se calienta
y se enfría en una solución tamponada (agua mezclada con un poco de sal), forma un gel sólido
ligeramente blando. A nivel molecular, el gel es una matriz de moléculas de agarosa que se
mantienen unidas por enlaces de hidrógeno y forman pequeños poros.

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Un extremo del gel tiene muescas en forma de hendidura llamadas pozos, que son donde se
coloca la muestra de ADN: el gel debe colocarse en la cámara antes de que se pueda agregar la
muestra de ADN. Un extremo de la cámara está conectado al polo positivo y el otro extremo
está conectado al polo negativo. El cuerpo principal de la cámara donde se coloca el gel se
llena con una solución tampón que contiene sales que conducen la corriente eléctrica. Si bien
es posible que no pueda verlo en la imagen de arriba (gracias a mis increíbles habilidades
artísticas), la solución tampón llena la cámara hasta un nivel que apenas cubre el gel.

El extremo del gel con agujeros se coloca hacia el electrodo negativo. El extremo sin pozo
(donde migrarán los fragmentos de ADN) se coloca hacia el electrodo positivo.

¿Cómo se mueven los fragmentos de ADN a través de un gel?

Una vez que el gel está en la cámara, cada muestra de ADN que queramos analizar (por
ejemplo, cada reacción de PCR o cada plásmido de restricción) se transfiere cuidadosamente a
uno de los pocillos. Un pozo está reservado para marcadores de peso molecular, un estándar
de referencia que contiene fragmentos de ADN de longitud conocida. Los marcadores de ADN
comerciales cubren diferentes rangos de tamaño, por lo que intentaremos usar marcadores
que tengan una buena "cobertura" en el rango de tamaño que esperamos encontrar
fragmentos. Luego se aplica energía a la cámara y la corriente eléctrica comienza a fluir a
través del gel. Los grupos fosfato en su columna vertebral de fosfato de azúcar dotan a las
moléculas de ADN de una carga negativa, por lo que comienzan a moverse a través de la
matriz de gel hacia el polo positivo.

Se dice que un gel está funcionando cuando el sistema está encendido y la electricidad pasa a
través del gel.

¿Qué voltaje usar para ejecutar el gel?

Cargue la muestra de ADN en el pozo al final del gel más cercano al electrodo negativo. Se
enciende y los fragmentos de ADN migran a través del gel (hacia el electrodo positivo).
Después de correr el gel, los fragmentos se separan por tamaño. Los fragmentos más grandes
están cerca de la parte superior del gel (electrodo negativo, donde comienzan) y los
fragmentos más pequeños están cerca del fondo (electrodo positivo). Después de que el gel
haya corrido por un tiempo, los fragmentos de ADN más cortos estarán más cerca del extremo
positivo del gel, mientras que los fragmentos más largos permanecerán cerca de los pocillos.

Si lo dejamos funcionar durante demasiado tiempo, fragmentos muy pequeños de ADN

pueden salirse del gel (definitivamente es un error)

Puntos más importantes:

•La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN según su
tamaño.

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•Las muestras de ADN se cargan en pozos (ranuras) en un extremo de un gel y se aplica una
corriente eléctrica para arrastrarlas a través del gel.

•Los fragmentos tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el electrodo positivo.
Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa, los
fragmentos pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes.

•Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN, los fragmentos de ADN pueden
verse como bandas, las cuales representan un grupo de fragmentos de ADN del mismo
tamaño.

Visualización de los fragmentos de ADN

Una vez separados los fragmentos podemos examinar el gel y saber el tamaño de las bandas
que se encuentran en él. Cuando el gel se tiñe con un colorante que se une al ADN y se expone
a la luz ultravioleta, los fragmentos de ADN brillan, lo que nos permite ver el ADN en varios
lugares del gel.

El pb al lado de cada número en el marcador indica cuántos pares de bases tiene el fragmento
de ADN.

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Las "líneas" bien definidas de ADN en un gel se denominan bandas. Cada banda contiene una
gran cantidad de fragmentos de ADN del mismo tamaño que se mueven juntos en la misma
ubicación. Los fragmentos de ADN individuales (o incluso pequeños grupos de fragmentos de
ADN) no son visibles en los geles.

Al comparar una banda en una muestra con el marcador de peso molecular, podemos
determinar su tamaño aproximado. Por ejemplo, la banda brillante del gel anterior tiene un
tamaño aproximado de 700 pares de bases (pb).

Mediante espectrofotometría se puede determinar la concentración y la pureza de una

muestra de ADN basándose en la capacidad de absorbancia de un compuesto presente en una
solución a una longitud de onda determinada.

De este modo la concentración de la muestra de ADN se calcula teniendo en cuenta el valor de

absorbancia obtenido a una longitud de onda de 260nm. Mientras que la relación de
absorbancias 260/280 y 260/230 se utilizan para evaluar la pureza de las muestras. La relación
260/280 es muy estable y se considera que un ADN de pureza óptima tiene un valor entre 1.8-
2.0. Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una relación 260/280 > 1.6. Un valor
260/280 < 1.6 indica una posible contaminación por compuestos aromáticos como fenoles y
proteínas. Un radio 260/280 > 2.1 podría deberse a la presencia de ARN en la muestra.

APLICACIONES DIAGNOSTICAS Y FORENSE DE LAS TECNICAS DE PCR

Entre las muchas áreas de aplicación de PCR están: la arqueología, la medicina forense,
pruebas de paternidad, genética, investigación biológica y el diagnóstico clínico.

Huella digital genética

* Es una técnica forense que permite identificar a una persona comparando su DNA con el de
una muestra obtenida, por ejemplo, de la escena de un crimen. Como la muestra puede ser

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muy escasa, la PCR permite aumentar la cantidad de DNA amplificando ciertos segmentos
polimórficos (variables en la población), para luego separarlos mediante electroforesis, lo que
se conoce como DNA fingerprint o huella digital.

Test de Paternidad

Amplificando por PCR fragmentos polimórficos de DNA de la madre, del niño y de él o los
presuntos padres, y separándolo mediante electroforesis, se puede visualizar una serie de
segmentos que tiene el niño, que debe compartir con la madre y padre biológicos.

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Detección de Enfermedades Hereditarias
• Cada gen en estudio puede ser amplificado fácilmente por PCR, con los partidores
adecuados, y luego ser secuenciado, para así determinar si un individuo porta alguna
mutación que explica la presencia de una enfermedad o su. Aparición en el futuro, la
que puede ser heredada a sus hijos.

Clonamiento de Genes
• La PCR es habitualmente usada para amplificar un determinado gen o un mRNA
(representado por un cDNA), que puede introducirse en vector Y luego en un
organismo al duplicarse también duplicará el gen que nos interesa. Así podemos tener
una cantidad suficiente de un gen o cDNA, por ejemplo, para secuenciarlo o producir a
gran escala la proteína ye este gen codifica.

Análisis de DNA antiguo

• Con la PCR se puede analizar DNA que tiene miles de años de antigüedad, lo que ha
permitido estudiar muestras obtenidas desde momias y de restos de animales
extintos, como algunos ejemplos.

Mutagénesis

• Con variaciones en la secuencia de los partidores, se puede producir un segmento de

DNA que presente diferencia en una o más bases respecto al DNA original. Así se
puede alterar una proteína para estudiar o anular su función. Esta mutación puede ser

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 en un sitio determinado de un gen (sitio dirigida) o en un lugar al azar de un gen o
genoma.

CONCLUSIÓN

Mi conclusión a la hora de realizar este trabajo han sido descubrir las numerosas aplicaciones
que tiene la PCR como las pruebas de paternidad, el diagnostico de enfermedades o
mutaciones. Conocía esta técnica, pero jamás hubiese imaginado las variedades que tiene este
método por no hablar de la electroforesis la cual es una técnica que ya conocía pero que
responde preguntas importantes que no tenia en cuenta antes de hacer este trabajo.

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 Referencia bibliográficas

1. Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A.,

Minorsky, P. V. y Jackson, R. B. (2011). The DNA toolbox (El kit
de herramientas de ADN). En Campbell biology (10° ed., págs.
408-409). San Francisco, CA: Pearson.

2. Reece, J. B., Taylor, M. R., Simon, E. J. y Dickey, J. L. (2012).

Figura 12.13. Gel electrophoresis of DNA (Electroforesis en gel
de ADN). En Campbell biology: Concepts & connections (7° ed.,
pág. 243).

3. Gel electrophoresis. (Electroforesis en gel; 2014). En Scitable.

Consultado en http://www.nature.com/scitable/definition/gel-
electrophoresis-286(Se abre en una ventana nueva)

4. ^ ABC de Paul N, Shum J, Le T (2010). "PCR de arranque en

caliente". Protocolos de RT-PCR . Métodos en Biología
Molecular. 630 . Prensa Humana. págs. 301-18. doi : 10.1007 /
978-1-60761-629-0_19 . ISBN 9781607616283. PMID
20301005 .

5. ^ a b Green, Michael R .; Sambrook, Joseph (mayo de 2018).

"Reacción en cadena de la polimerasa de inicio en caliente
15
 (PCR)". Protocolos de Cold Spring Harbor . 2018 (5):
pdb.prot095125. doi : 10.1101 / pdb.prot095125 . ISSN
1940-3402 . PMID 29717052 .

6. 1) Ignacio Ramos Díaz, Eduardo Juan López Felices, Maria

Valdivia Giménez y Diego Carrión Martínez, Profesorado de
“BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA”- Programación
del módulo Departamento de Sanidad. (2020/2021)

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